JP2003265176A - ヒト腫瘍壊死因子δおよびε - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、ヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεポリ
ペプチド、それらのポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド、それらの産生方法等を提供することを目的と
する。 【解決手段】 本発明は、以下からなる群から選択され
るメンバーに対して少なくとも７０％の同一性を有する
ポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチ
ド： （ａ）配列番号２に示されたアミノ酸配列を含むポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号４に示されたアミノ酸配列を含むポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号２のアミノ酸３９〜アミノ酸２３３を含
むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチ
ドに相補的であるポリヌクレオチド；および （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のポリヌ
クレオチドの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチ
ドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド；それらのポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの改変体または誘導体；
それらのポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならび
にそれらの改変体および誘導体を作製するためのプロセ
ス；それらのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴ
ニスト；ならびにそれらのポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、改変体、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニス
トの使用に部分的に関する。特に、これらおよび他の点
に関して、本発明は、ヒト腫瘍壊死因子δおよびεのポ
リヌクレオチドおよびポリペプチド（本明細書中以下で
時々「ＴＮＦδ」および「ＴＮＦε」と呼ばれる）に関
する。 【０００２】 【従来の技術】ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およ
びβ（ＴＮＦ−βまたはリンホトキシン）は、ポリペプ
チド媒介物の広範なクラスのメンバーに関連し、これ
は、インターフェロン、インターロイキンおよび成長因
子を含み、集合的にサイトカインと呼ばれる（Ｂｅｕｔ
ｌｅｒ， Ｂ．およびＣｅｒａｍｉ， Ａ．， Ａｎｎ
ｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ７：６２５−６５
５， １９８９）。 【０００３】腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−
β）は、最初、その抗腫瘍活性の結果として発見された
が、今日では、いくつかの形質転換細胞株のアポトーシ
ス、細胞活性化および増殖の媒介を含む多数の生物学的
活性を可能とする多面的なサイトカインとして、そして
さらに免疫調節および炎症において重要な役割を演じる
と認識されている。 【０００４】今日までに、ＴＮＦ−リガンドスーパーフ
ァミリーの９つの既知のメンバー、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ
−β（リンホトキシン−α）、ＬＴ−β、ＯＸ４０Ｌ、
ＦＡＳＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ４０Ｌおよび
４−１ＢＢＬが存在する。ＴＮＦリガンドスーパーファ
ミリーのリガンドは、細胞外ドメインにおいて約２０％
の配列相同性（範囲；１２〜３６％）を有する酸性のＴ
ＮＦ様分子であり、そして主として膜結合形態として存
在し、生物学的活性形態はトリマー／マルチマー複合体
である。ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの可溶性形
態はこれまで、ＴＮＦ、ＬＴα、およびＦＡＳＬに関し
てのみ同定されている（一般的な総説については、Ｇｒ
ｕｓｓ， Ｈ．およびＤｏｗｅｒ， Ｓ．Ｋ．， Ｂｌ
ｏｏｄ，８５ （１２）：３３７８−３４０４ （１９
９５）（これは、その全体が参考として本明細書中に援
用される）を参照のこと）。 【０００５】これらのタンパク質は、細胞生存またはア
ポトーシスまたは細胞傷害性による細胞死の制御を含
む、細胞増殖、活性化、および分化の調節に関与する
（Ａｒｍｉｔａｇｅ， Ｒ．Ｊ．， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ
ｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６：４０７ （１９９４）お
よびＳｍｉｔｈ， Ｃ．Ａ．， Ｃｅｌｌ， ７５：９
５９ １９９４）。 【０００６】ＴＮＦは、単球、繊維芽細胞、Ｔ細胞、ナ
チュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む多数の細胞タイプに
よって産生され、そして活性化マクロファージによって
優勢に産生される。ＴＮＦ−αは、腫瘍の迅速な壊死、
免疫刺激、自己免疫疾患、移植片拒絶、寄生体に対する
耐性、抗ウイルス応答の産生、敗血症性ショック、成長
調節、血管内皮影響および代謝性影響において役割を有
することが報告されている。ＴＮＦ−αはまた、ＰＡＦ
−１、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−６を含む、
種々の因子を分泌するように内皮細胞をトリガーし、細
胞増殖を促進する。さらに、ＴＮＦ−αは、Ｅ−セレク
チン、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１のような種々の
細胞接着分子をアップレギュレートする。 【０００７】ＴＮＦリガンドスーパーファミリーのメン
バーによって媒介される種々の細胞性応答の誘導におけ
る最初の工程は、特定の細胞表面レセプターへのそれら
の結合である。ＴＮＦレセプタースーパーファミリー
は、現在は１０の既知の膜タンパク質およびＴＮＦＲ関
連分子をコードするいくつかのウイルスのオープンリー
ディングフレームを含む。ｐ７５低親和性神経成長因子
（ＮＧＦ）レセプターは、このファミリーの最初にクロ
ーン化されたレセプターであった（Ｊｏｈｎｓｏｎ，
Ｄ．ら、Ｃｅｌｌ， ４７：５４５ （１９８６））。
引き続いて、ＴＮＦに対する２つの特定のレセプターの
クローニングは、それらがＮＧＦレセプターに関連した
ことを示す（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ， Ｈ．ら、Ｃｅｌ
ｌ， ６１：３５１ （１９９０））。近年、新規のＩ
型膜貫通ＴＮＦレセプタースーパーファミリーが確立さ
れている。このファミリーは、ｐ７５神経成長因子レセ
プター、ｐ６０ ＴＮＦＲ−１、ｐ８０ ＴＮＦＲ−Ｉ
Ｉ、ＴＮＦＲ−ＲＰ／ＴＮＦＲ−ＩＩＩ、ＣＤ２７、Ｃ
Ｄ３０、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、およびＦＡ
Ｓ／ＡＰＯ−１を含む。さらに、可溶性ＴＮＦレセプタ
ーをコードするいくつかのウイルスのオープンリーディ
ングフレームが同定されている（例えば、Ｓｈｏｐｅ線
維腫ウイルスのＳＦＶ−Ｔ２（Ｓｍｉｔｈ， Ｃ．Ａ．
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍｕｎ．， １７６：３３５， １９９１）およびワ
クシニアウイルスのＶａ５３またはＳａＩＦ１９Ｒ（Ｈ
ｏｗａｒｄ． Ｓ．Ｔ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １８
０：６３３， １９９１））。これらのレセプターは、
細胞外（アミノ末端）ドメイン中の複数のシステインリ
ッチドメインによって特徴付けられ、これはリガンド結
合に関与することが示されている。ヒトファミリーメン
バー間のシステインリッチ細胞外領域における平均相同
性は、２５〜３０％の範囲にある。 【０００８】明白に、正常および異常細胞の活性化およ
び分化を調節する因子に関する必要性が存在する。それ
ゆえ、正常および疾患状態の両方の細胞の活性化および
分化を調節するそのような因子の同定および特徴付けに
関する必要性が存在する。特に、形質転換細胞株のアポ
トーシスを制御し、細胞活性化および増殖を媒介し、そ
して免疫調節および炎症応答の一次媒介物として機能的
に関連し、そしてとりわけ、機能障害または疾患を予
防、改善または矯正することにおいて役割を演じ得る、
ＴＮＦリガンドスーパーファミリーのメンバーに類似し
たさらなるＴＮＦリガンドを単離し、そして特徴付ける
必要性が存在する。 【０００９】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒトＴＮＦ
δおよびＴＮＦεポリペプチド、それらのポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチド
を産生する方法（特にそれらのポリヌクレオチドを発現
させることによって）、ならびにそれらのポリペプチド
のアゴニストおよびアンタゴニストに関する。本発明
は、さらに、このようなポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、アゴニスト、およびアンタゴニストを応用に利用す
る方法に関する。この応用は、部分的に研究、診断、お
よび臨床技術に関する。従って、本発明は、ヒトＴＮＦ
δおよびＴＮＦεポリペプチド、それらのポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチド
を産生する方法、ならびにそれらのポリペプチドのアゴ
ニストおよびアンタゴニストを提供することを目的とす
る。 【００１０】 【課題を解決するための手段】１つの局面において、本
発明は、以下からなる群から選択されるメンバーに対し
て少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド
を含む、単離されたポリヌクレオチド： （ａ）配列番号２に示されたアミノ酸配列を含むポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号４に示されたアミノ酸配列を含むポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号２のアミノ酸３９〜アミノ酸２３３を含
むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチ
ドに相補的であるポリヌクレオチド；および （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のポリヌ
クレオチドの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチ
ドを提供する。 【００１１】１つの実施形態において、本発明の上記ポ
リヌクレオチドは、ＤＮＡであり得る。 【００１２】１つの実施形態において、本発明の上記ポ
リヌクレオチドは、ＲＮＡであり得る。 【００１３】１つの実施形態において、本発明の上記ポ
リヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡであり得る。 【００１４】好ましい実施形態において、本発明の上記
ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸を含むポリ
ペプチドをコードし得る。 【００１５】より好ましい実施形態において、本発明の
上記ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸３９〜
アミノ酸２３３を含むポリペプチドをコードし得る。 【００１６】さらに好ましい実施形態において、本発明
の上記ポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸を含
むポリペプチドをコードし得る。 【００１７】なお好ましい実施形態において、本発明の
上記ポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸１〜１
８８を含むポリペプチドをコードし得る。 【００１８】１つの局面において、本発明は、以下から
なる群から選択されるメンバーに対して少なくとも７０
％同一であるポリヌクレオチドを含む、単離されたポリ
ヌクレオチド： （ａ）ＡＴＣＣ受託番号第９７３７７号に含まれるヒト
ｃＤＮＡによって発現されるアミノ酸配列を有する成熟
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第９７４５７号に含まれるヒト
ｃＤＮＡによって発現されるアミノ酸配列を有する成熟
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）の上記ポリヌクレオチドに相
補的であるポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の上記ポリヌクレ
オチドの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドを
提供する。 【００１９】１つの実施形態において、本発明の上記ポ
リヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド４４７〜
ヌクレオチド１７１７を含み得る。 【００２０】好ましい実施形態において、本発明の上記
ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド３３２
〜ヌクレオチド１７１７を含み得る。 【００２１】より好ましい実施形態において、本発明の
上記ポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド１
〜ヌクレオチド５６４を含み得る。 【００２２】さらなる実施形態において、本発明のベク
ターは、上記ＤＮＡを含み得る。 【００２３】１つの実施形態において、本発明の宿主細
胞は、上記ベクターを含み得る。 【００２４】１つの実施形態において、本発明は、上記
宿主細胞から上記ＤＮＡによりコードされるポリペプチ
ドを発現させる工程を包含する、ポリペプチドを産生す
るためのプロセスを提供する。 【００２５】他の実施形態において、本発明は、上記ベ
クターを用いて細胞を遺伝子操作する工程を包含し、そ
れによって上記ベクターに含まれるヒトｃＤＮＡによっ
てコードされるポリペプチドを発現する、細胞を産生す
るためのプロセスを提供する。 【００２６】１つの局面において、本発明は、以下から
なる群から選択されるメンバーを含むポリペプチド： （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド；および （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸３９〜２３３を含む
ポリペプチド； （ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸１〜１８８を含むポ
リペプチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のポリペプ
チドに少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド
を提供する。 【００２７】１つの実施形態において、本発明のポリペ
プチドは、配列番号２のアミノ酸１〜アミノ酸２３３を
含み得る。 【００２８】好ましい実施形態において、本発明のポリ
ペプチドは、配列番号２のアミノ酸３９〜アミノ酸２３
３を含み得る。 【００２９】より好ましい実施形態において、本発明の
ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１〜アミノ酸１
８８を含み得る。 【００３０】他の実施形態において、本発明は、上記ポ
リペプチドの活性化を阻害する化合物を提供する。 【００３１】１つの局面において、本発明は、ＴＮＦδ
の必要を有する患者の処置のための方法であって、上記
ポリペプチドの治療有効量を上記患者に投与する工程を
包含する方法を提供する。 【００３２】１つの局面において、本発明は、ＴＮＦε
の必要を有する患者の処置のための方法であって、請求
項１７に記載のポリペプチドの治療有効量を上記患者に
投与する工程を包含する方法を提供する。 【００３３】１つの実施形態において、本発明は、上記
ポリペプチドの前記治療有効量が、上記ポリペプチドを
コードするＤＮＡを上記患者に提供する工程およびイン
ビボで上記ポリペプチドを発現する工程によって投与さ
れる上記方法を提供する。 【００３４】他の実施形態において、本発明は、上記ポ
リペプチドの前記治療有効量が、上記ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡを上記患者に提供する工程およびインビ
ボで上記ポリペプチドを発現する工程によって投与され
る上記方法を提供する。 【００３５】１つの局面において、本発明は、ＴＮＦδ
ポリペプチドを阻害する必要を有する患者の処置のため
の方法であって、上記化合物の治療有効量を上記患者に
投与する工程を包含する方法を提供する。 【００３６】１つの局面において、本発明は、ＴＮＦε
ポリペプチドを阻害する必要を有する患者の処置のため
の方法であって、上記化合物の治療有効量を上記患者に
投与する工程を包含する方法を提供する。 【００３７】１つの局面において、本発明は、上記ポリ
ペプチドの過小発現に関連する疾患または疾患に対する
感受性を診断するためのプロセスであって、上記ポリペ
プチドをコードする核酸配列中の変異を決定する工程を
包含するプロセスを提供する。 【００３８】１つの局面において、本発明は、宿主由来
のサンプル中の上記ポリペプチドの存在を分析する工程
を包含する診断プロセスを提供する。 【００３９】１つの局面において、本発明は、上記ポリ
ペプチドに結合し、そしてその活性化を阻害する化合物
を同定するための方法であって、上記ポリペプチドに対
するレセプターであって、上記レセプターが化合物の上
記レセプターへの結合に応答して検出可能なシグナルを
提供し得る第２の成分と会合する、レセプターをその表
面に発現する細胞と、分析的に検出可能なＴＮＦδポリ
ペプチドおよび化合物とを上記レセプターに結合し得る
条件下で接触させる工程；およびＴＮＦδと上記レセプ
ターとの相互作用から産生されるシグナルの非存在を検
出することによって、上記化合物が上記レセプターに結
合し、そして阻害するか否かを決定する工程を包含する
方法を提供する。 【００４０】 【発明の実施の形態】（発明の要旨）これらおよび他の
目的に向かって、新規のＴＮＦδおよびＴＮＦεと呼ば
れる、図１および図２に示されるアミノ酸配列とヒトＴ
ＮＦαおよびＴＮＦβのような腫瘍壊死因子ファミリー
中の他のタンパク質の既知のアミノ酸配列との間の相同
性によって腫瘍壊死因子リガンドであると仮説的に同定
されている新規のポリペプチドを提供することが本発明
の目的である。 【００４１】本発明のポリペプチドは、構造的および生
物学的類似性に基づいてＴＮＦリガンドスーパーファミ
リーの新規メンバーとして同定されている。 【００４２】さらに、ＴＮＦδおよびＴＮＦεをコード
するポリヌクレオチド、特に本明細書中でＴＮＦδおよ
びＴＮＦεと命名されたポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドを提供することが本発明のさらなる目的で
ある。 【００４３】本発明のこの局面の特に好ましい実施態様
において、ポリヌクレオチドは、図１および図２に示さ
れる配列中のヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεをコードする
領域を含む。 【００４４】本発明のこの局面に従って、ｍＲＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含む、ヒトＴＮＦδをコードす
る単離された核酸分子が提供され、そして本発明のこの
局面のさらなる実施態様において、生物学的、診断的、
臨床的、または治療的に有用なその改変体、アナログ、
または誘導体、あるいはそれらのフラグメント（改変
体、アナログおよび誘導体のフラグメントを含む）が提
供される。 【００４５】本発明のこの局面の特に好ましい実施態様
には、ヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεの天然に存在する対
立遺伝子改変体が含まれる。 【００４６】本発明のこの局面に従って、１９９５年１
２月８日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号第９７３７７号
に含まれるヒトｃＤＮＡによって発現される成熟ヒトＴ
ＮＦδポリペプチドおよび１９９６年３月１日に寄託さ
れたＡＴＣＣ受託番号第９７４５７号に含まれるヒトｃ
ＤＮＡによって発現される成熟ヒトＴＮＦεポリペプチ
ドをコードする単離された核酸分子が提供される。 【００４７】いくつかの形質転換細胞株を破壊し、細胞
活性化および増殖を媒介し、そして免疫調節および炎症
応答の一次媒介物として機能的に関連するＴＮＦδポリ
ペプチド、特にヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチ
ドを提供することがまた、本発明の目的である。 【００４８】本発明のこの局面に従って、本明細書中で
ＴＮＦδおよびＴＮＦεと呼ばれるヒト起源の新規のポ
リペプチド、ならびに生物学的、診断的、または治療的
に有用なそのフラグメント、改変体、および誘導体、そ
のフラグメントの改変体および誘導体、ならびに前記こ
れらのアナログが提供される。 【００４９】本発明のこの局面の特に好ましい実施態様
には、ヒトＴＮＦδおよびＴＮＦε遺伝子の天然に存在
する対立遺伝子によってコードされるヒトＴＮＦδおよ
びＴＮＦεの改変体が存在する。 【００５０】前述のポリペプチド、ポリペプチドフラグ
メント、改変体および誘導体、改変体および誘導体のフ
ラグメント、ならびに前記これらのアナログを産生する
ためのプロセスを提供することが本発明の別の目的であ
る。本発明のこの局面の好ましい実施態様において、前
述のＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチドを産生する方
法が提供される。この方法は、そこに発現可能に組み込
まれた外因性由来ヒトＴＮＦδコードポリヌクレオチド
およびＴＮＦεコードポリヌクレオチドを有する宿主細
胞を、宿主中でのヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεの発現の
ための条件下で培養する工程、次いで発現されたポリペ
プチドを回収する工程を包含する。 【００５１】本発明の別の目的に従って、とりわけ、研
究、生物学的、診断的、および治療的目的のために前述
のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する、産
物、組成物、プロセス、および方法が提供される。 【００５２】本発明のこの局面の特定の好ましい実施態
様に従って、産物、組成物、およびとりわけ以下の方法
が提供される：ＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチドま
たはＴＮＦδコードｍＲＮＡまたはＴＮＦεコードｍＲ
ＮＡポリペプチドを決定することによって、細胞におけ
るＴＮＦδおよびＴＮＦε発現を評価する方法；ＴＮＦ
δおよびＴＮＦε遺伝子における欠損のような遺伝的変
異および異常をアッセイする方法；ならびにＴＮＦδま
たはＴＮＦε機能を増大するかまたはＴＮＦδまたはＴ
ＮＦε機能障害を治療するために、ＴＮＦδまたはＴＮ
Ｆεポリペプチドまたはポリヌクレオチドを生物に投与
する方法。 【００５３】本発明のこの局面および他の局面の特定の
好ましい実施態様に従って、ヒトＴＮＦδまたはＴＮＦ
ε配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドおよび特
にプローブが提供される。 【００５４】本発明のこの局面の特定のさらなる好まし
い実施態様において、ＴＮＦδまたはＴＮＦεポリペプ
チドに対する抗体が提供される。この点に関して特定の
特に好ましい実施態様において、抗体は、ヒトＴＮＦδ
またはＴＮＦεに対して高度に選択的である。 【００５５】本発明の別の局面に従って、ＴＮＦδまた
はＴＮＦεアゴニストが提供される。好ましいアゴニス
トには、ＴＮＦδ結合分子またはレセプター分子あるい
はＴＮＦε結合分子またはレセプター分子に結合する、
ＴＮＦδまたはＴＮＦεを模倣する分子、およびＴＮＦ
δ誘導またはε誘導応答を誘発するかまたは増大する分
子が存在する。さらに、好ましいアゴニストには、ＴＮ
ＦδおよびＴＮＦεまたはＴＮＦδおよびＴＮＦεポリ
ペプチド、あるいはＴＮＦδ活性の他のモジュレーター
と相互作用し、それによってＴＮＦδおよびＴＮＦεの
効果または１つより多いＴＮＦδおよびＴＮＦεの効果
を増強または増大する分子がある。 【００５６】本発明のさらに別の局面に従って、ＴＮＦ
δおよびＴＮＦεアンタゴニストが提供される。好まし
いアンタゴニストには、ＴＮＦδおよびＴＮＦεレセプ
ターまたは結合分子に結合するが、ＴＮＦδおよびＴＮ
Ｆε誘導応答または１つより多いＴＮＦδおよびＴＮＦ
ε誘導応答を誘発しないようにＴＮＦδおよびＴＮＦε
を模倣するアンタゴニストがある。さらに、好ましいア
ンタゴニストには、ＴＮＦδおよびＴＮＦεの効果ある
いは１つより多いのＴＮＦδおよびＴＮＦεの効果を阻
害するようにＴＮＦδおよびＴＮＦεに結合または相互
作用するか、またはＴＮＦδおよびＴＮＦεの発現を防
止する分子がある。 【００５７】アゴニストおよびアンタゴニストは、ＴＮ
ＦδおよびＴＮＦεポリペプチドの作用を模倣するか、
増大するか、または阻害するために使用され得る。それ
らは、例えば、敗血症性ショック、炎症、大脳マラリ
ア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植片宿主拒絶、骨吸
収、慢性関節リウマチ、および悪液質を防止するために
用いられ得る。 【００５８】本発明のさらなる局面では、インビトロ、
エキソビボおよびインビボでの細胞への投与、または多
細胞生物への投与のためのＴＮＦδおよびＴＮＦεポリ
ヌクレオチドまたはＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチ
ドを含有する組成物が提供される。本発明のこの局面の
特定の特に好ましい実施態様において、組成物は、疾患
の処置のための宿主生物におけるＴＮＦδおよびＴＮＦ
εポリペプチドの発現のためのＴＮＦδおよびＴＮＦε
ポリヌクレオチドを含有する。この点に関して特に好ま
しいのは、ＴＮＦδおよびＴＮＦεの異常な内在性の活
性と関連する機能障害の処置のためのヒト患者における
発現である。 【００５９】本発明の他の目的、特徴、利点、および局
面は、以下の記載から当業者に明らかになる。しかし、
以下の記載および特定の実施例は、本発明の好ましい実
施態様を示すが、説明のためのみに示されることを理解
されるべきである。開示される本発明の精神および範囲
内の種々の変化および修飾が、以下の記載を読むことか
ら、そして本開示の他の部分を読むことから当業者に容
易に明らかになる。 【００６０】以下の例示的説明は、本明細書中、特に実
施例で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にする
ために提供される。この説明は、便宜のために提供さ
れ、本発明を限定しない。 【００６１】用語ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡの特定の
配列にのみ作用する制限酵素でのＤＮＡの触媒性切断を
いう。本明細書中で言及される種々の制限酵素は市販さ
れており、そして使用のための反応条件、コファクター
および他の必要なものは、当業者に公知であり、そして
日常的である。 【００６２】分析目的では、代表的には１μｇのプラス
ミドまたはＤＮＡフラグメントが、約２０μｌの反応緩
衝液中で約２ユニットの酵素で消化される。プラスミド
構築のためにＤＮＡフラグメントを単離する目的では、
代表的に５〜５０μｇのＤＮＡが、比例してより大きな
容量中で２０〜２５０ユニットの酵素で消化される。 【００６３】特定の制限酵素に関する適切な緩衝液およ
び基質量は、下記に引用されるような標準的な研究室マ
ニュアルに記載されており、そしてそれらは、商業的供
給者によって特定される。 【００６４】３７℃で約１時間のインキュベーション時
間が通常用いられるが、条件は、標準的手順、供給者の
指示および反応の特殊性に従って変化し得る。消化の
後、反応が分析され得、そしてフラグメントは、当業者
にとって日常的である周知の方法を用いて、アガロース
またはポリアクリルアミドゲルを通す電気泳動によって
精製され得る。 【００６５】用語「遺伝因子」は、一般に、ポリペプチ
ドをコードする領域を含むポリヌクレオチド、あるいは
転写もしくは翻訳または宿主細胞におけるポリペプチド
の発現に重要である他のプロセスを調節する領域を含む
ポリヌクレオチド、あるいはポリペプチドをコードする
領域およびそれに作動可能に連結された発現を調節する
領域の両方を含むポリヌクレオチドを意味する。 【００６６】遺伝因子は、エピソーム因子として複製す
るベクター内に含まれ得る；すなわち、宿主細胞ゲノム
と物理的に独立した分子である。それらは、真核細胞に
おけるメトトレキセート選択によるトランスフェクトさ
れたＤＮＡの増幅の間に生じるような、ミニ染色体内に
含まれ得る。遺伝因子はまた、宿主細胞ゲノム内に；そ
れらの天然の状態ではなく、むしろ操作（例えば、単
離、クローニングおよび宿主細胞への導入）の後の精製
されたＤＮＡまたはとりわけベクター内の形態で含まれ
得る。 【００６７】用語「単離された」は、天然の状態から
「人間の手によって」変化したことを意味する；すなわ
ち、それが天然に存在する場合、それは、本来の環境か
ら変化されるか、または取り出されるか、あるいは両方
である。この用語が本明細書中で用いられるように、例
えば、天然に存在するポリヌクレオチドまたは生存する
動物において天然に存在するポリペプチドは、「単離さ
れて」いないが、その天然の状態の共存する物質から分
離された同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、「単離されて」いる。例えば、ポリヌクレオチドに
関して、用語単離されたは、それが天然に存在する染色
体および細胞から分離されていることを意味する。 【００６８】単離の一部として、または単離の後に、こ
のようなポリヌクレオチドは、例えば、変異誘発のた
め、融合タンパク質を形成するため、そして宿主におけ
る伝播または発現のために他のポリヌクレオチドに結合
され得る。単離されたポリヌクレオチド（単独またはベ
クターのような他のポリヌクレオチドと結合された）
は、培養物または生物全体の宿主細胞に導入され得、こ
の用語が本明細書中で用いられるように、この後でもこ
のようなＤＮＡは依然として単離されている。なぜな
ら、それらは、天然に存在する形態または環境ではない
からである。 【００６９】同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、天然に存在する組成物ではなく、そして、本明
細書中で用いられるようなその用語の意味内の単離され
たポリヌクレオチドまたはポリペプチドをそこに残存す
る、例えば、細胞へのポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドの導入のための培地処方物、溶液のような組成物、
例えば、化学または酵素反応のための組成物または溶液
のような組成物中に存在し得る。 【００７０】用語「連結」は、２以上のポリヌクレオチ
ド（しばしば、２本鎖ＤＮＡである）間にホスホジエス
テル結合を形成するプロセスをいう。連結のための技術
は、当該分野で周知であり、そして連結に関するプロト
コルは、標準的研究室マニュアルおよび参考文献（例え
ば、以下で引用されるような、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）およびＭａｎｉａｔｉ
ｓら、１４６頁）に記載されている。 【００７１】用語「オリゴヌクレオチド」は、比較的短
いポリヌクレオチドをいう。しばしばこの用語は、１本
鎖デオキシリボヌクレオチドをいう。しかし、同様に、
とりわけ、１本鎖または２本鎖リボヌクレオチド、ＲＮ
Ａ：ＤＮＡハイブリッドおよび２本鎖ＤＮＡを意味し得
る。 【００７２】オリゴヌクレオチド（例えば、１本鎖ＤＮ
Ａプローブオリゴヌクレオチド）は、自動化オリゴヌク
レオチド合成機において実行されるような化学法によっ
てしばしば合成される。しかし、オリゴヌクレオチド
は、種々の他の方法（インビトロ組換えＤＮＡ媒介技術
を含む）ならびに細胞および生物におけるＤＮＡの発現
によって作製され得る。 【００７３】最初に、化学的に合成されたＤＮＡは、代
表的には、５’ホスフェートを伴わないで得られる。こ
のようなオリゴヌクレオチドの５’末端は、組換えＤＮ
Ａ分子を形成させるために代表的に用いられるＤＮＡリ
ガーゼを使用する連結反応によるホスホジエステル結合
形成のための基質ではない。このようなオリゴヌクレオ
チドの連結が所望される場合、ホスフェートが、キナー
ゼおよびＡＴＰを使用するような標準的技術によって付
加され得る。 【００７４】化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの
３’末端は、一般に遊離ヒドロキシル基を有し、そして
リガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）の存在下
で、別のポリヌクレオチド（例えば、別のオリゴヌクレ
オチド）の５’ホスフェートとともにホスホジエステル
結合を容易に形成する。周知であるように、この反応
は、所望である場合、連結の前に他のポリヌクレオチド
の５’ホスフェートを除去することによって、選択的に
阻止され得る。 【００７５】プラスミドは、本明細書中で一般に、当業
者に馴染み深い標準的な命名慣習に従って、先行する小
文字のｐおよび／またはそれに続く大文字および／また
は数字によって命名される。本明細書中に開示される開
始プラスミドは、商業的に入手可能であるか、非制限的
原則において公然に入手可能であるか、または周知の公
開された手順の日常的な適用によって入手可能なプラス
ミドから構築され得るかのいずれかである。本発明に従
って用いられ得る多くのプラスミドならびに他のクロー
ニングおよび発現ベクターは、当業者に周知であり、そ
して容易に入手可能である。さらに、当業者は、本発明
における使用に適する任意の数の他のプラスミドを容易
に構築し得る。本発明における、このようなプラスミ
ド、ならびに他のベクターの特性、構築および使用は、
本開示から当業者に容易に明白である。 【００７６】用語「ポリヌクレオチド」は、一般に、任
意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌク
レオチドをいう。これは、未改変のＲＮＡまたはＤＮＡ
あるいは改変されたＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。従
って、例えば、本明細書中で用いられるポリヌクレオチ
ドは、とりわけ、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖お
よび２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖および２
本鎖ＲＮＡ、ならびに１本鎖および２本鎖領域の混合物
であるＲＮＡ、１本鎖またはより代表的には、２本鎖あ
るいは１本鎖および２本鎖領域の混合物であり得るＤＮ
ＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子をいう。さら
に、本明細書中で用いられるポリヌクレオチドは、ＲＮ
ＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含
む３本鎖領域をいう。このような領域における鎖は、同
じ分子または異なる分子に由来し得る。これらの領域
は、１以上の分子の全てを含み得るが、より代表的に
は、いくつかの分子の領域のみを含む。３重らせん領域
の分子の１つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。 【００７７】本明細書中で用いる用語ポリヌクレオチド
は、１以上の改変塩基を含む上記のようなＤＮＡまたは
ＲＮＡを含む。従って、安定性または他の理由のために
改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、この用
語が本明細書中で意図されるような「ポリヌクレオチ
ド」である。さらに、ほんの２つの例を挙げれば、イノ
シンのような通常ではない塩基、またはトリチル化塩基
のような改変塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、この用
語が本明細書中で用いられるようなポリヌクレオチドで
ある。 【００７８】種々の改変が、当業者に公知の多くの有用
な目的に役立つＤＮＡおよびＲＮＡに行われていること
が理解される。本明細書中で用いられるような用語ポリ
ヌクレオチドは、このような化学的、酵素学的または代
謝的に改変された形態のポリヌクレオチド、ならびにと
りわけウイルスおよび細胞（単細胞および多細胞を含
む）に特徴的である化学形態のＤＮＡおよびＲＮＡを含
む。 【００７９】本明細書中で用いられる用語「ポリペプチ
ド」は、下記のようなポリペプチドの全てを含む。ポリ
ペプチドの基本構造は、周知であり、そして当該分野の
無数の教科書および他の刊行物に記載されている。これ
に関連して、この用語は、本明細書中では、ペプチド結
合によって直鎖状に互いに結合した２以上のアミノ酸を
含む任意のペプチドまたはタンパク質を意味するように
用いられる。本明細書中で用いられるように、この用語
は、短い鎖（これはまた、当該分野で一般に、例えばペ
プチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと呼ばれる）
および長い鎖（これは当該分野で一般にタンパク質と呼
ばれ、多くの型が存在する）の両方をいう。 【００８０】ポリペプチドが、２０の天然に存在するア
ミノ酸と一般に呼ばれる２０のアミノ酸以外のアミノ酸
をしばしば含有すること、および多くのアミノ酸（末端
のアミノ酸を含む）が、天然のプロセス（例えば、プロ
セシングおよび他の翻訳後改変）、ならびに当該分野で
周知である化学的改変技術のいずれかによって所定のポ
リペプチドにおいて改変され得ることが理解される。ポ
リペプチドにおいて天然に存在する一般的な改変でさ
え、余りにも多くて本明細書中に完全に列挙し得ない
が、それらは、基本的教科書、およびより詳細な論文、
ならびに多数の研究文献に十分に記載されており、そし
てそれらは当業者に周知である。本発明のポリペプチド
中に存在し得る既知の改変の中には、少数の例を挙げれ
ば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミ
ド化、フラビンの共有結合性の付着、ヘム部分の共有結
合性の付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の
共有結合性の付着、脂質または脂質誘導体の共有結合性
の付着、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏ
ｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合性の付着、架
橋、環化、ジスルフィド結合形成、共有結合性架橋の形
成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミ
ル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアン
カー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル
化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、
プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパ
ク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介性付加
（例えば、アルギニル化）、およびユビキチン結合が存
在する。 【００８１】このような改変は当業者に周知であり、そ
して科学文献に非常に詳細に記載されている。数種の特
に一般的な改変、例えば、グリコシル化、脂質付着、硫
酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、水酸
化，およびＡＤＰ−リボシル化が、ほとんどの基本的教
科書（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉ
ｅｓ， 第２版、Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，
Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３））に記載されてい
る。この表題で多くの詳細な総説が入手可能である（例
えば、Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔ
ｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎｓ： Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔｓ， １〜１２頁、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔ
ｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎ
ｓｏｎ， 編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ （１９８３）： Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆ
ａｃｔｏｒｓ． Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８
２： ６２６−６４６ （１９９０）およびＲａｔｔａ
ｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｐｏｓ
ｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．， ６６３：４８−６２ （１９９
２）により提供される総説）。 【００８２】周知であり、そして上記のように、ポリペ
プチドは、必ずしも完全に直鎖ではないことが理解され
る。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン結合の結果と
して分枝状であり得、そしてそれらは、一般に翻訳後事
象（天然のプロセシング事象、および天然に生じないヒ
ト操作によりもたらされる事象）の結果として分枝を有
するかまたは有さない環状であり得る。環状、分枝状、
および分枝した環状ポリペプチドは、同様に非翻訳の天
然のプロセスおよび完全な合成法によって合成され得
る。 【００８３】改変は、ポリペプチドの任意の場所に存在
し得、これはペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ
末端またはカルボキシル末端を含む。実際、共有結合的
改変による、ポリペプチドにおけるアミノ基またはカル
ボキシル基あるいは両方の妨害は、天然に存在するポリ
ペプチドおよび合成ポリペプチドに共通であり、そして
このような改変は、同様に、本発明のポリペプチド中に
存在し得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて作製された
ポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク質分解性プ
ロセシングの前には、ほとんど必ずＮ−ホルミルメチオ
ニンである。 【００８４】ポリペプチド中に存在する改変は、しばし
ば、それがどのように作製されるかに相関している。宿
主においてクローン化された遺伝子を発現することによ
って作製されるポリペプチドに関して、例えば、大部分
の改変の特性および程度は、宿主細胞の翻訳後改変能力
およびポリペプチドアミノ酸配列中に存在する改変シグ
ナルによって決定される。例えば、周知であるように、
グリコシル化は、しばしば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌
宿主において存在しない。従って、グリコシル化が所望
である場合、ポリペプチドは、グリコシル化する宿主
（一般に真核細胞）において発現されるべきである。昆
虫細胞は、しばしば、哺乳動物細胞と同じ翻訳後グリコ
シル化を実行する。この理由のために、昆虫細胞発現系
は、とりわけ、グリコシル化の天然のパターンを有する
哺乳動物のタンパク質を効率的に発現させるために開発
されている。同様の考慮が他の改変に適用される。同じ
型の改変が、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部
位で同じまたは異なる程度で存在し得る。さらに、所定
のポリペプチドは、多くの型の改変を含有し得る。一般
に、本明細書中で用いられるように、用語ポリペプチド
は、このような改変の全て、特に宿主細胞中でポリヌク
レオチドを発現することによって合成されるポリペプチ
ド中に存在する改変を含む。 【００８５】本明細書中で用いられるポリヌクレオチド
またはポリペプチドの用語「改変体」は、それぞれ、基
準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドである。この意味に
おける改変体は、以下に記載されており、そして本開示
中の他の場所で非常に詳細に記載されている。 【００８６】ポリヌクレオチド改変体は、ヌクレオチド
配列において、別の基準ポリヌクレオチドとは異なるポ
リヌクレオチドである。一般に、差異は、基準と改変体
とのヌクレオチド配列が全体にわたって緊密に類似して
おり、そして多くの領域で同一であるように限定され
る。以下に記載されるように、改変体のヌクレオチド配
列における変化は、サイレントであり得る。すなわち、
それらは、ポリヌクレオチドによってコードされるアミ
ノ酸を変化し得ない。変化が、この型のサイレント変化
に限定される場合、改変体は、基準と同じアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードする。以下に記載される
ように、改変体のヌクレオチド配列における変化は、基
準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列を変化し得る。このようなヌクレオチド
変化は、以下に考察されるように、基準配列によってコ
ードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、
欠損、融合および切断を生じ得る。 【００８７】ポリペプチド改変体は、アミノ酸配列にお
いて、別の基準ポリペプチドとは異なるポリペプチドで
ある。一般に、差異は、基準と改変体との配列が、全体
に亘って緊密に類似しており、そして多くの領域で同一
であるように限定される。改変体および基準ポリペプチ
ドは、１以上の置換、付加、欠損、融合および切断によ
ってアミノ酸配列において異なり得、これらは任意の組
み合わせで存在し得る。 【００８８】本明細書中で用いられる用語「レセプター
分子」は、本発明のＴＮＦδまたはＴＮＦεポリペプチ
ドと特異的に結合または相互作用する分子をいい、これ
には、古典的レセプター（これらが好ましい）のみなら
ず、本発明のポリペプチドと特異的に結合または相互作
用する他の分子もまた含まれる（これらはまた、それぞ
れ、「結合分子」および「相互作用分子」、そして「Ｔ
ＮＦδ結合分子」および「ＴＮＦδ相互作用分子」また
は「ＴＮＦε結合分子」および「ＴＮＦε相互作用分
子」と呼ばれる）。本発明のポリペプチドとこのような
分子（レセプターあるいは結合分子または相互作用分子
を含む）との間の結合は、本発明のポリペプチドに独占
的であり得る（これは非常に高度に好ましい）か、また
は本発明のポリペプチドに対して高度に特異的であり得
る（これは高度に好ましい）か、または本発明のポリペ
プチドを含むタンパク質の群に高度に特異的であり得る
（これは好ましい）か、または少なくとも１つの群が本
発明のポリペプチドを含む、タンパク質のいくつかの群
に特異的であり得る。 【００８９】（発明の詳細な説明）本発明は、とりわ
け、以下に非常に詳細に記載されるような、新規のＴＮ
ＦδおよびＴＮＦεポリペプチドに関する。特に、本発
明は、アミノ酸配列相同性によってＴＮＦリガンドスー
パーファミリーに関連するポリペプチドおよびポリヌク
レオチドに関する。本発明は、特に、図１に示されるヌ
クレオチドおよびアミノ酸配列を有するＴＮＦδ、およ
びＡＴＣＣ受託番号９７３７７のヒトｃＤＮＡのＴＮＦ
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関する。本発明はま
た、特に、図２に示されるヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を有するＴＮＦε、およびＡＴＣＣ受託番号９７４
５７のヒトｃＤＮＡのＴＮＦεヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列に関する。これらの寄託物は、本明細書中で以
降、寄託クローンまたは「寄託クローンのｃＤＮＡ」と
呼ばれる。図１および２に示されたヌクレオチドおよび
アミノ酸配列が、寄託クローンのヒトｃＤＮＡを配列決
定することによって得られたことが理解される。従っ
て、これらの２つの間の任意の矛盾に関しては、寄託ク
ローンの配列が支配しており、そして図１および２の配
列に対する任意の言及は、寄託クローンのヒトｃＤＮＡ
の配列に対する言及を含む。 【００９０】本発明の１つの局面に従って、図１および
２の推定アミノ酸配列を有するＴＮＦδおよびＴＮＦε
ポリペプチドをコードする単離されたポリペプチドが提
供される。 【００９１】図１に示されるポリヌクレオチド配列のよ
うな本明細書中に提供される情報を用いて、ヒトＴＮＦ
δポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチド
は、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順
（例えば、開始物質としてヒト組織の細胞由来のｍＲＮ
Ａを用いてｃＤＮＡをクローニングするための手順）を
用いて入手され得る。本発明の実例として、図１に示さ
れるポリヌクレオチドは、ヒト心臓組織の細胞に由来す
るｃＤＮＡライブラリーにおいて発見された。 【００９２】本発明のヒトＴＮＦδは、寄託されたクロ
ーンにおけるヒトＴＮＦδをコードするｃＤＮＡの配列
決定の結果によって示されるように、ＴＮＦリガンドス
ーパーファミリーの他のタンパク質に構造的に関連す
る。このようにして得られたｃＤＮＡ配列を、図１に示
す。これは、推定分子量約２５．８７１ｋＤａを有する
約２３３アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープ
ンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、公
知のタンパク質のうち、ＴＮＦαに最も高い相同性を示
す。図１のＴＮＦδの全アミノ酸配列は、ＴＮＦαのア
ミノ酸配列に対して約３８％の同一性を有する。 【００９３】ヒトＴＮＦεポリぺプチドをコードする本
発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよ
びスクリーニング手順（例えば、開始物質としてのヒト
組織の細胞由来のｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡをクローニ
ングするためのもの）を用いて得られ得る。本発明の例
示として、図２に示されるポリヌクレオチドは、ヒト心
臓組織の細胞由来のｃＤＮＡライブラリーから発見され
た。 【００９４】本発明のヒトＴＮＦεは、寄託されたクロ
ーンにおけるヒトＴＮＦεをコードするｃＤＮＡの配列
決定の結果によって示されるように、ＴＮＦリガンドス
ーパーファミリーの他のタンパク質に構造的に関連す
る。このようにして得られたｃＤＮＡ配列を、図２に示
す。ＴＮＦε配列は、図１に示されるＴＮＦδの配列と
ほとんど同一であり、最初の５０アミノ酸およびアミノ
酸８６からアミノ酸９２を含むＴＮＦδの領域を含まな
い。従って、ＴＮＦεは、ＴＮＦδのスプライシング改
変体である。ＴＮＦεは、１６８アミノ酸残基を含み、
そして図２の配列は、Ｎ−末端疎水性領域を全く含まな
いＴＮＦεの成熟タンパク質を示す。このタンパク質
は、ＴＮＦαに対して最も高い相同性を示す。図２のＴ
ＮＦεは、ＴＮＦαのアミノ酸配列に対して約２０％の
同一性を有する。 【００９５】本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの
ようなＲＮＡの形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ク
ローニングによって得られるか、または化学合成技術に
よって産生されるか、あるいはそれらの組合せによるｃ
ＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であり得る。ＤＮＡ
は、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡは、
コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、
またはそれは非コード鎖（アンチセンス鎖ともいわれ
る）であり得る。 【００９６】ポリぺプチドをコードするコード配列は、
図１および２に示すポリヌクレオチドのコード配列に同
一であり得る。これはまた、遺伝子コードの縮退（縮
重）の結果として、図１および図２のＤＮＡのポリヌク
レオチドをコードする異なる配列を有するポリヌクレオ
チドであり得る。 【００９７】図１および図２のポリぺプチドをコードす
る本発明のポリヌクレオチドは、以下を含み得るがこれ
らに限定されない：成熟ポリペプチドのコード配列それ
自体；成熟ポリぺプチドのコード配列およびさらなるコ
ード配列（例えば、プレ−またはプロ−またはプレプロ
−タンパク質配列のようなリーダー配列または分泌配列
をコードする配列）；前述のさらなるコード配列を含む
かまたは含まない成熟ポリぺプチドのコード配列、なら
びにさらなる非コード配列（例えば、イントロンならび
に転写、ｍＲＮＡプロセシング（例えば、スプライシン
グおよびポリアデニル化シグナルを含む）、リボソーム
結合、およびｍＲＮＡの安定性において役割を果たす転
写された非翻訳配列のような非コード５’および３’配
列；さらなる機能性を提供するアミノ酸のようなさらな
るアミノ酸をコードするさらなるコード配列。 【００９８】従って、例えば、ポリぺプチドはペプチド
のようなマーカー配列に融合され得、これにより、融合
されたポリぺプチドの精製を容易にする。本発明のこの
局面の特定の好ましい実施態様において、マーカー配列
は、とりわけｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎ
ｃ．）において提供されるタグのようなヘキサヒスチジ
ンペプチドであり、その多くが市販されている。Ｇｅｎ
ｔｚら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ．， ＵＳＡ， ８６：８２１−８２４ （１９８
９）に記載されるように、例えばヘキサヒスチジンは、
融合タンパク質の簡便な精製を提供する。ＨＡタグは、
例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ， ３７：７６７
（１９８４）に記載されているインフルエンザヘマグル
チニンタンパク質に由来するエピトープに対応する。 【００９９】上記に従って、本明細書中で用いられる用
語「ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド」は、
本発明のポリぺプチド、特に図１および図２に示すアミ
ノ酸配列を有するヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεをコード
する配列を含むポリヌクレオチドを包含する。この用語
は、コードおよび／または非コード配列をもまた含み得
るさらなる領域とともに、（例えば、イントロンによっ
て中断された）ポリぺプチドをコードする単一の連続す
る領域または非連続的領域を含むポリヌクレオチドを包
含する。 【０１００】本発明は、図１および２の推定アミノ酸配
列を有するポリぺプチドのフラグメント、アナログ、お
よび誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオ
チドの改変体にさらに関する。ポリヌクレオチドの改変
体は、天然に存在する対立遺伝子改変体のような天然に
存在する改変体であり得るか、または天然に存在するこ
とが知られていない改変体であり得る。このような天然
に存在しないポリぺプチドの改変体は、ポリヌクレオチ
ド、細胞、または生物に適用される技術を含む変異誘発
技術によってなされ得る。 【０１０１】この点に関する改変体には、上記のポリヌ
クレオチドとはヌクレオチド置換、欠失、または付加に
おいて異なる改変体がある。置換、欠失、または付加
は、１つ以上のヌクレオチドを包含し得る。改変体はコ
ードもしくは非コード領域またはその両方における変更
であり得る。コード領域における変更は、保存的もしく
は非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を生成し得
る。 【０１０２】この点に関して本発明の特に好ましい実施
態様には、図１および２に示すＴＮＦδおよびＴＮＦε
のアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードするポリ
ヌクレオチド；その改変体、アナログ、誘導体、および
フラグメント、ならびに改変体、アナログ、および誘導
体のフラグメントがある。 【０１０３】この点に関してさらに特に好ましいもの
は、数個の、いくつかの、５〜１０個の、１〜５個の、
１〜３個の、２個の、１個の、または０個のアミノ酸残
基が、任意の組合せで置換、欠失、または付加されてい
る、図１および図２のＴＮＦδおよびＴＮＦεポリぺプ
チドのアミノ酸配列を有するＴＮＦδおよびＴＮＦεを
コードするポリヌクレオチドである。これらのうちで特
に好ましいものは、サイレント置換、付加、および欠失
であり、これらはＴＮＦδおよびＴＮＦεの特性および
活性を変更しない。この点に関してまた特に好ましいも
のは、保存的置換である。最も高度に好ましいものは、
図１および図２のアミノ酸配列を置換無しで有するポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明
のさらに好ましい実施態様は、図１および２に示すアミ
ノ酸配列を有するＴＮＦδおよびＴＮＦεポリぺプチド
をコードするポリヌクレオチドに少なくとも７０％同一
であるポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌク
レオチドに相補的なポリヌクレオチドである。あるい
は、最も高度に好ましいものは、ＴＮＦδおよびＴＮＦ
εポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドに少なく
とも８０％同一である領域を含むポリヌクレオチド、お
よびそれに相補的なポリヌクレオチドである。この点に
関して、ＴＮＦδおよびＴＮＦεポリぺプチドをコード
するポリヌクレオチドに少なくとも９０％同一であるポ
リヌクレオチドが特に好ましく、これらの特に好ましい
ポリヌクレオチドのうち、少なくとも９５％の同一性を
有するものが特に好ましい。さらに、少なくとも９５％
の同一性を有するもののうち、少なくとも９７％同一性
を有するものが高度に好ましく、そしてこれらのうち少
なくとも９８％および少なくとも９９％同一性を有する
ものが特に高度に好ましく、少なくとも９９％同一性を
有するものがより特に好ましい。 【０１０４】この点に関する特に好ましい実施態様は、
さらに、図１および２のｃＤＮＡによってコードされる
成熟ポリぺプチドと実質的に同一の生物学的機能または
活性を保持するポリぺプチドをコードするポリヌクレオ
チドである。 【０１０５】本発明はさらに、本明細書中上記の配列に
ハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点
に関して、本発明は特に、ストリンジェントな条件下で
本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズす
るポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる
ように、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリ
ダイゼーションが、配列間の塩基の少なくとも９５％そ
して好ましくは少なくとも９７％が相補的（例えば、
Ｇ：Ｃ； Ａ：Ｔ）である場合に起こることを意味す
る。 【０１０６】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
て本明細書中においてさらに議論されるように、例え
ば、上述の本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよ
びゲノムＤＮＡについてのハイブリダイゼーションプロ
ーブとして、ＴＮＦδおよびＴＮＦεをコードする全長
ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するため、そして
ヒトＴＮＦδおよびＴＮＦε遺伝子に対して高い配列類
似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクロー
ンを単離するために用いられ得る。このようなプローブ
は一般に少なくとも１５個の塩基を含む。好ましくは、
このようなプローブは少なくとも３０塩基を有し、そし
て少なくとも５０塩基を有し得る。 【０１０７】例えば、ＴＮＦδおよびＴＮＦε遺伝子の
コード領域は、オリゴヌクレオチドプローブを合成する
ために、公知のＤＮＡ配列を用いたスクリーニングによ
って単離され得る。次いで、本発明の遺伝子の配列に相
補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドは、
ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡのライブ
ラリーをスクリーニングするために用いられ、ライブラ
リーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするか
が決定される。 【０１０８】本発明のポリヌクレオチドおよびポリぺプ
チドは、特に本明細書中でポリヌクレオチドアッセイに
関してさらに議論されるように、ヒト疾患に対する処置
および診断の発見のための研究試薬および材料として利
用され得る。 【０１０９】ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質であ
るポリぺプチドおよびさらなるアミノ末端もしくはカル
ボキシル末端アミノ酸、または成熟ポリぺプチドに対し
て内部のアミノ酸（例えば、成熟形態が１つより多いポ
リぺプチド鎖を有している場合）をコードし得る。この
ような配列は、とりわけ、前駆体から成熟形態までのタ
ンパク質のプロセシングにおいて役割を果たし得るか、
タンパク質トラフィッキングを容易にし得るか、タンパ
ク質の半減期を延長もしくは短縮し得るか、またはアッ
セイもしくは産生のためのタンパク質の操作を容易にし
得る。インサイチュの場合に一般的であるが、さらなる
アミノ酸が、細胞性酵素によって成熟タンパク質とは離
れてプロセシングされ得る。 【０１１０】１つ以上のプロ配列に融合したポリぺプチ
ドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は、ポリぺプチ
ドの不活性な形態であり得る。プロ配列が除去される場
合、このような不活性な前駆体は、一般に活性化され
る。プロ配列のいくつかまたは全ては、活性化前に除去
され得る。一般に、このような前駆体はプロタンパク質
と呼ばれる。 【０１１１】まとめると、本発明のポリヌクレオチド
は、成熟タンパク質、成熟タンパク質およびリーダー配
列（これは、プレタンパク質と呼ばれ得る）、プレタン
パク質のリーダー配列ではない１つ以上のプロ配列を有
する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列およ
び１つ以上のプロ配列（これらは一般に、ポリぺプチド
の活性でかつ成熟した形態を産生するプロセシング工程
の間に除去される）を有するプレプロタンパク質（これ
はプロタンパク質に対する前駆体である）をコードし得
る。 【０１１２】ヒトＴＮＦδおよびヒトＴＮＦεｃＤＮＡ
を含有する寄託物は、上記のように、アメリカンタイプ
カルチャーコレクションに寄託されている。また上記の
ように、ｃＤＮＡ寄託物は、本明細書中で「寄託された
クローン」または「寄託されたクローンのｃＤＮＡ」と
いわれる。クローンは１９９５年１２月８日および１９
９６年３月１日にアメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン、１２３０１ Ｐａｒｋ Ｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２
ＵＳＡに寄託され、そしてそれぞれＡＴＣＣ受託番号
第９７３７７号および第９７４５７号を割り当てられ
た。寄託された物質は、全長ＴＮＦδおよびＴＮＦεヒ
トｃＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）
プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ， ＣＡ）である。 【０１１３】寄託は、特許手順の目的のための微生物の
寄託の国際的認識の上にＢｕｄａｐｅｓｔ条約の規約の
下になされた。株は、特許権の発行と同時に、変更不能
にそして制限または条件なしに公衆に開放される。寄託
物は、単に当業者に対する利便性としてのみ提供され、
寄託物が米国特許法第１１２条のもとに要求されるよう
な特許可能性のために要求されるという許可ではない。
寄託された物質に含まれるポリヌクレオチドの配列、お
よびそれによりコードされるポリぺプチドのアミノ酸配
列は、本明細書中の配列の任意の記載とのいかなる対立
の事象においても管理される。寄託された物質を作製し
たり、使用したり、または販売するためには、ライセン
スが必要とされ得、そしていかなるこのようなライセン
スもここでは与えられない。 【０１１４】本発明はさらに、図１および２の推定アミ
ノ酸配列を有するヒトＴＮＦδおよびＴＮＦεポリぺプ
チドに関する。本発明のポリぺプチドは、組換えポリぺ
プチド、天然のポリぺプチド、または合成ポリぺプチド
であり得る。特定の好ましい実施態様において、それは
組換えポリぺプチドである。 【０１１５】本発明はまた、これらのポリぺプチドのフ
ラグメント、アナログ、および誘導体に関する。用語
「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」
は、図１および２のポリぺプチドをいう場合、このよう
なポリぺプチドと本質的に同一の生物学的機能または活
性を保持するポリぺプチドを意味する。従って、アナロ
グは、プロタンパク質部分の切断によって活性化され、
活性な成熟ポリぺプチド産生し得るプロタンパク質を含
む。 【０１１６】図１および２のポリぺプチドのフラグメン
ト、誘導体、またはアナログは、以下のものであり得
る：（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存されたアミ
ノ酸残基もしくは非保存的アミノ酸残基（好ましくは、
保存されたアミノ酸残基）で置換され、そしてこのよう
な置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによってコード
されたものであり得るかもしくはあり得ないもの、ある
いは（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むも
の、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリぺプチドがポリぺプチ
ドの半減期を増大させる化合物（例えば、ポリエチレン
グリコール）のような別の化合物に融合されたもの、あ
るいは（ｉｖ）さらなるアミノ酸が成熟ポリぺプチド
（例えば、リーダー配列、もしくは分泌配列、または成
熟ポリぺプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に使
用される配列）に融合されたもの。このようなフラグメ
ント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示か
ら当業者の技術範囲内にあると考えられる。 【０１１７】この点に関して本発明の特に好ましい実施
態様には、図１および２に示されるＴＮＦδおよびＴＮ
Ｆεのアミノ酸配列を有するポリぺプチド、その改変
体、アナログ、誘導体、およびフラグメント、ならびに
そのフラグメントの改変体、アナログ、および誘導体が
ある。あるいは、この点に関して特に好ましい本発明の
実施態様は、寄託されたクローンにおけるヒトｃＤＮＡ
のＴＮＦδおよびＴＮＦεのアミノ酸配列を有するポリ
ぺプチド、その改変体、アナログ、誘導体、およびフラ
グメント、ならびにそのフラグメントの改変体、アナロ
グ、および誘導体である。 【０１１８】好ましい改変体には、保存的アミノ酸置換
が参照と異なる改変体がある。このような置換は、ポリ
ぺプチドの所定のアミノ酸を類似の特性を有する別のア
ミノ酸で置換する置換である。保存的置換として代表的
に観察されるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、
Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間での互いの置換；ヒドロキシ
ル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換、酸性残基Ａｓｐおよ
びＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間での
置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに
芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間での置換である。 【０１１９】この点に関してさらに特に好ましいもの
は、図１および２のＴＮＦδおよびＴＮＦεポリぺプチ
ドのアミノ酸配列、または寄託されたクローンにおける
ｃＤＮＡのアミノ酸配列を有する改変体、アナログ、誘
導体、およびフラグメント、ならびにそのフラグメント
の改変体、アナログ、および誘導体であり、ここでは数
個の、いくつかの、５〜１０個の、１〜５個の、１〜３
個の、２個の、１個の、または０個のアミノ酸残基が任
意の組合せで置換されたり、欠失されたり、または付加
されている。これらのうちで特に好ましいものは、ＴＮ
ＦδおよびＴＮＦεの特性および活性を変更しないサイ
レント置換、付加、および欠失である。この点に関して
また特に好ましいものは、保存的置換である。最も高度
に好ましいものは、置換なしで図１および２のアミノ酸
配列を有するポリぺプチドである。 【０１２０】本発明のポリぺプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして
好ましくは均一にまで精製される。 【０１２１】本発明のＴＧＦδポリぺプチドは、配列番
号２のポリぺプチド（特に成熟ポリぺプチド）ならびに
配列番号２のポリぺプチドに少なくとも７０％の類似性
（好ましくは少なくとも７０％の同一性）、そしてより
好ましくは配列番号２のポリぺプチドに少なくとも９０
％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一
性）、そしてなお好ましくは配列番号２のポリぺプチド
に少なくとも９５％の類似性（より好ましくは少なくと
も９５％の同一性）を有するポリぺプチドを含み、そし
てまたこのようなポリぺプチドの部分であって、ポリぺ
プチドのこのような部分が、一般に少なくとも３０アミ
ノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含
有するものを含む。 【０１２２】本発明のＴＧＦεポリぺプチドは、配列番
号４のポリぺプチド（特に成熟ポリぺプチド）ならびに
配列番号４のポリぺプチドに少なくとも７０％の類似性
（好ましくは少なくとも７０％の同一性）、そしてより
好ましくは配列番号４のポリぺプチドに少なくとも９０
％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一
性）、そしてなお好ましくは配列番号４のポリぺプチド
に少なくとも９５％の類似性（より好ましくは少なくと
も９５％の同一性）を有するポリぺプチドを含み、そし
てまたこのようなポリぺプチドの部分であって、ポリぺ
プチドのこのような部分が、一般に少なくとも３０アミ
ノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含
有するものを含む。 【０１２３】当該分野で公知のように、２つのポリぺプ
チドの間の「類似性」は、１つのポリぺプチドのアミノ
酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第二のポリ
ぺプチドの配列と比較することによって決定される。 【０１２４】本発明のポリぺプチドのフラグメントまた
は部分は、対応する全長ポリぺプチドをペプチド合成に
よって産生するために使用され得る；それゆえ、フラグ
メントは、全長ポリぺプチドを産生するための中間体と
して使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグ
メントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを
合成するために用いられ得る。 【０１２５】フラグメントは、前述のＴＮＦδおよびＴ
ＮＦεポリぺプチドおよびそれらの改変体または誘導体
のアミノ酸配列の部分であるが全てではない配列に完全
に同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドであ
る。このようなフラグメントは、「フリースタンディン
グ」（すなわち他のアミノ酸またはポリぺプチドの一部
ではなくまたは融合されていない）であり得、またはそ
れらは、それらが一部もしくは領域を形成するより大き
なポリぺプチド内に含まれ得る。より大きなポリぺプチ
ド内に含まれた場合、現在議論されているフラグメント
は、最も好ましくは単一の連続する領域を形成する。し
かし、いくつかのフラグメントは単一のより大きなポリ
ぺプチド内に含まれ得る。例えば、特定の好ましい実施
態様は、異種プレおよびプロポリぺプチド領域がＴＮＦ
δおよびＴＮＦεフラグメントのアミノ酸末端に融合さ
れ、そしてさらなる領域がそのフラグメントのカルボキ
シル末端に融合された、宿主内での発現のために設計さ
れた前駆体ポリぺプチド内に含まれる本発明のＴＮＦδ
およびＴＮＦεポリぺプチドのフラグメントに関する。
それゆえ、本明細書中で意図する意味の１つの局面にお
けるフラグメントは、ＴＮＦδおよびＴＮＦεに由来す
る融合ポリぺプチドまたは融合タンパク質の部分をい
う。 【０１２６】本発明のポリぺプチドフラグメントの代表
的な例として、約３０〜約２３３アミノ酸を有するフラ
グメントが言及され得る。この文脈において、「約」
は、特に示された範囲、および数個、いくつか、５、
４、３、２、または１個のアミノ酸だけいずれかの極限
でまたは両方の極限でより大きいかまたはより小さい範
囲を含む。例えば、この文脈での約１００〜２３３アミ
ノ酸は、１００±数個、いくつか、５、４、３、２、ま
たは１個のアミノ酸から２３３±数個、いくつか、５、
４、３、２、または１個のアミノ酸残基（すなわち１０
０マイナス数個のアミノ酸〜２３３プラス数個のアミノ
酸までの広さから、１００プラス数個のアミノ酸〜２３
３マイナス数個のアミノ酸までの狭さまで）のポリぺプ
チドフラグメントを意味する。 【０１２７】この点において非常に好ましいのは、いず
れかまたは両方の端の値（ｅｘｔｒｅｍｅ）に５アミノ
酸程度の増減を含む示した範囲（ｒｅｃｉｔｅｄ ｒａ
ｎｇｅ）である。特に非常に好ましいのは、いずれかま
たは両方の端の値に３アミノ酸程度の増減を含む示した
範囲である。とりわけ特に非常に好ましいのは、いずれ
かまたは両方の端の値に１アミノ酸の増減を含む示した
範囲、あるいは付加または欠失を伴わない示した範囲で
ある。この点においてとりわけ最も非常に好ましいの
は、約１５〜約２３３アミノ酸のフラグメントである。 【０１２８】本発明のとりわけ好ましいフラグメントの
中には、ＴＮＦδおよびＴＮＦεの切断変異体がある。
切断変異体は、アミノ末端を含む連続する一連の残基
（すなわち、連続する領域、一部、または部分）または
カルボキシル末端を含む連続する一連の残基の欠失、あ
るいは、二重切断変異体のように、２つの連続する一連
の残基（１つはアミノ末端を含み、そして１つはカルボ
キシル末端を含む）の欠失を除く、図１もしくは２のア
ミノ酸を有するＴＮＦδおよびＴＮＦεポリペプチド、
またはその改変体もしくは誘導体を包含する。上記サイ
ズ範囲を有するフラグメントもまた、切断フラグメント
の好ましい実施態様であり、これは一般的にフラグメン
トの中でとりわけ好ましい。 【０１２９】また、本発明のこの局面において好ましい
のは、ＴＮＦδおよびＴＮＦεの構造または機能属性に
よって特徴づけられるフラグメントである。この点にお
いて本発明の好ましい実施態様では、ＴＮＦδおよびＴ
ＮＦεのαヘリックスおよびαヘリックス形成領域
（「α領域」）、βシートおよびβシート形成領域
（「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ター
ン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領
域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β
両親媒性領域、可動部、表面形成領域、ならびに高抗原
性指標領域を含むフラグメントを包含する。 【０１３０】これらの点における特定の好ましい領域
は、ＴＮＦδについては図４およびＴＮＦεについては
図５に示され、図１および２に示されるアミノ酸配列の
分析によって同定された前述の型の領域を含むが、これ
に限定されない。図４および５に示されるように、この
ような好ましい領域は、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ
α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域、Ｃｈｏ
ｕ−Ｆａｓｍａｎ α領域、β領域およびターン領域、
Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ 親水性領域および親水
性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ αおよびβ両親媒性領
域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ 可動部、Ｅｍｉｎ
ｉ表面形成領域、ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ
高抗原性指標領域を包含する。 【０１３１】この点において非常に好ましいフラグメン
トの中には、いくつかの構造的特徴（例えば、上記に示
されるいくつかの特徴）を組み合わせるＴＮＦδおよび
ＴＮＦεの領域を含むものがある。この点において、図
１、２、４、および５のシグナルペプチド領域に続く残
基によって規定される領域（これらは全て、ターン領
域、親水性領域、可動部、表面形成領域、および高抗原
性指標領域に非常に特徴のあるアミノ酸組成によって特
徴づけられる）は、とりわけ非常に好ましい領域であ
る。このような領域は、より大きなポリペプチド内に含
まれ得るか、または上記で議論されたように、本発明の
好ましいフラグメント自身であり得る。この段落（ｐａ
ｒａｇｒａｐｈ）で用いられる用語「約（ａｂｏｕ
ｔ）」は、一般的に、フラグメントに関して上述の意味
を有すると理解される。 【０１３２】さらに好ましい領域は、ＴＮＦδおよびＴ
ＮＦε活性を媒介するものである。この点において最も
非常に好ましいのは、ＴＮＦδおよびＴＮＦεの化学
的、生物学的、または他の活性を有するフラグメントで
あり、これは、同様の活性もしくは改良された活性、ま
たは減少した所望でない活性を有するものを含む。この
点において非常に好ましいのは、配列もしくは位置また
は両方の配列において、そして関連したポリペプチド
（例えば、図３に示される関連したポリペプチド）の活
性領域に対して相同である領域を含むフラグメントであ
り、これは、ヒトＴＮＦαおよびβを含む。この点にお
いて特に好ましいフラグメントの中には、上記のような
切断変異体がある。 【０１３３】本発明はまた、とりわけ、前述のフラグメ
ントをコードするポリヌクレオチド、フラグメントをコ
ードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌ
クレオチド（特に、ストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズするもの）、およびフラグメントをコードする
ポリヌクレオチドを増幅するためのポリヌクレオチド
（例えば、ＰＣＲプライマー）に関することが理解され
る。これらの点において、好ましいポリヌクレオチド
は、上述のような好ましいフラグメントに相当するもの
である。 【０１３４】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作される
宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチ
ドの産生に関する。 【０１３５】宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを
組み込み、そして本発明のポリペプチドを発現するよう
に遺伝子操作され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、
感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベク
ション、および形質転換の周知技術を用いて、宿主細胞
に導入され得る。ポリヌクレオチドは、単独または他の
ポリヌクレオチドと組み合わせて導入され得る。このよ
うな他のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチ
ドに独立して導入され得るか、同時導入され得るか、ま
たは結合させて導入され得る。従って、例えば、本発明
のポリヌクレオチドは、例えば、哺乳動物細胞における
同時トランスフェクションおよび選択のための標準的な
技術を用いて、選択可能なマーカーをコードする別の別
個のポリヌクレオチドとともに宿主細胞にトランスフェ
クトされ得る。この場合、ポリヌクレオチドは、一般的
に、宿主細胞ゲノムに安定して組み込まれる。 【０１３６】あるいは、ポリヌクレオチドは、宿主中で
増殖するための選択可能なマーカーを含むベクターに結
合され得る。ベクター構築物は、前述の技術によって宿
主細胞に導入され得る。一般的には、プラスミドベクタ
ーは、沈殿物（例えば、リン酸カルシウム沈殿）または
荷電した脂質との複合体におけるＤＮＡとして導入され
る。エレクトロポレーションもまた、ポリヌクレオチド
を宿主に導入するために用いられ得る。ベクターがウイ
ルスである場合、インビトロで封入され得るかまたはパ
ッケージング細胞に導入され得、そして封入されたウイ
ルスは、細胞に形質導入され得る。本発明のこの局面に
従って、ポリヌクレオチドを作製するため、および細胞
にポリヌクレオチドを導入するために適切な広範な種々
の技術は当業者に周知であり、そして日常的である。こ
のような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）に完全に
概説され、これはこれらの技術を詳述する多くのラボラ
トリーマニュアルの説明である。本発明のこの局面に従
って、ベクターは、例えば、プラスミドベクター、一本
鎖もしくは二本鎖ファージベクター、一本鎖もしくは二
本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターであり得る。
このようなベクターは、細胞にＤＮＡおよびＲＮＡを導
入するための周知技術によって、ポリヌクレオチド（好
ましくは、ＤＮＡ）として細胞に導入され得る。ベクタ
ー（ファージおよびウイルスベクターの場合）はまた、
感染および形質導入のための周知技術によって、封入さ
れたまたはキャプシド化されたウイルスとして細胞に導
入され得、そして好ましくは導入される。ウイルスベク
ターは、複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。
後者の場合、ウイルス増殖は一般的に、相補宿主細胞に
おいてのみ生じる。 【０１３７】ベクターの中で好ましいのは、特定の点に
おいて、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド
の発現のためのものである。一般的には、このようなベ
クターは、発現されるポリヌクレオチドに作動可能に連
結された、宿主における発現に有効なシス作用制御領域
を含む。適切なトランス作用因子は、宿主によって供給
されるか、相補ベクターによって供給されるか、または
宿主への形質導入の際のベクター自身によって供給され
るかのいずれかである。 【０１３８】この点において特定の好ましい実施態様で
は、ベクターは、特定の発現を提供する。このような特
定の発現は、誘導性発現または細胞の特定の型において
のみの発現、あるいは誘導性および細胞特異的の両方で
あり得る。誘導性ベクターの中で特に好ましいのは、操
作が容易な周囲の要因（例えば、温度および栄養添加
物）によって発現が誘導され得るベクターである。本発
明のこの局面に適切な種々のベクターは、原核生物およ
び真核生物宿主における使用のための構成性および誘導
性発現ベクターを含み、これは、当業者に周知であり、
そして日常的に使用される。 【０１３９】操作された宿主細胞は、従来の栄養培地で
培養され得、これは、特に、プロモーターを活性化する
こと、形質転換体を選択すること、または遺伝子を増幅
することに適切なように改変され得る。発現について選
択された宿主細胞で以前に使用された培養条件（例え
ば、温度、ｐＨなど）は、一般的に、当業者に明らかな
ように、本発明のポリペプチドの発現に適切である。 【０１４０】非常に種々の発現ベクターは、本発明のポ
リペプチドを発現させるために用いられ得る。このよう
なベクターは、染色体、エピソーム、およびウイルス由
来ベクターを包含する。例えば、細菌プラスミド由来、
バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母染
色体エレメント由来、バキュロウイルス、ＳＶ４０のよ
うなパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウ
イルス、ニワトリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイル
ス、およびレトロウイルスのようなウイルス由来のベク
ター、およびそれらの組合せ由来のベクター（例えば、
コスミドまたはファージミドのようなプラスミドおよび
バクテリオファージの遺伝エレメント由来のもの）。こ
れらは全て、本発明のこの局面による発現のために用い
られ得る。一般的には、宿主においてポリペプチドを発
現するためのポリヌクレオチドを、維持するか、増殖さ
せるか、または発現するのに適切な任意のベクターが、
この点において発現のために用いられ得る。 【０１４１】適切なＤＮＡ配列は、任意の種々の周知お
よび日常的な技術によって、ベクターに挿入され得る。
一般的には、発現のためのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列お
よび発現ベクターを１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ
で切断し、次いで、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて共に
制限フラグメントに結合することによって、発現ベクタ
ーに結合される。この目的に用いられ得る制限および連
結のための手順は、当業者に周知であり日常的である。
この点における適切な手順、および別の技術を用いて発
現ベクターを構築するための適切な手順（これらもま
た、当業者に周知であり日常的である）は、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら（本明細書中の他に引用される）に非常に詳細
に示されている。 【０１４２】発現ベクターのＤＮＡ配列は、適切な発現
制御配列（単数または複数；例えば、ｍＲＮＡ転写を指
向するプロモーターを含む）に作動可能に連結される。
このようなプロモーターの代表としては、λファージＰ
Ｌプロモーター、Ｅ． ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐおよ
びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモ
ーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター
が挙げられ、周知のプロモーターのうちほんの少数を挙
げる。本発明のこの局面に用いられるのに適切である、
述べられていない多数のプロモーターが周知であり、そ
して本明細書中の議論および実施例によって例示される
様式で当業者によって容易に使用され得ることが理解さ
れる。 【０１４３】一般的には、発現構築物は、転写開始およ
び終止のための部位を含み、そして転写領域において、
翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物によっ
て発現される成熟転写物のコード部分は、開始部に転写
開始ＡＵＧ、および翻訳されるポリペプチドの末端に適
切に位置した終止コドンを含む。 【０１４４】さらに、構築物は、発現を調節ならびに発
生させる制御領域を含み得る。一般的には、多くの通常
実施される手順に従って、このような領域は転写を制御
することによって作動する（例えば、特に、リプレッサ
ー結合部位およびエンハンサー）。 【０１４５】増殖および発現のためのベクターは、一般
的に、選択可能なマーカーを含む。このようなマーカー
はまた、増幅に適切であり得るか、またはこのベクター
は、この目的のためのさらなるマーカーを含み得る。こ
の点において、発現ベクターは、好ましくは、１つ以上
の選択可能なマーカー遺伝子を含み、形質転換された宿
主細胞の選択のための表現型特性を提供する。好ましい
マーカーとしては、真核生物細胞培養物のためのジヒド
ロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、および
Ｅ． ｃｏｌｉおよび他の細菌を培養するためのテトラ
サイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられ
る。 【０１４６】本明細書中の他に記載のような適切なＤＮ
Ａ配列、ならびに適切なプロモーター、および他の適切
な制御配列を含むベクターは、所望のポリペプチドのそ
の中における発現に適切な種々の周知技術を用いて、適
切な宿主に導入され得る。適切な宿主の代表例として
は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、および
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞の
ような細菌細胞；酵母細胞のような真菌細胞；Ｄｒｏｓ
ｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９
細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、およびＢｏｗ
ｅｓ黒色腫細胞のような動物細胞；および植物細胞が挙
げられる。種々の発現構築物のための宿主は周知であ
り、そして当業者は、本開示によって、本発明のこの局
面に従うポリペプチドを発現するための宿主を容易に選
択し得る。 【０１４７】より詳細には、本発明はまた、発現構築物
のような組換え構築物を含み、これは、上記の配列の１
つ以上を含む。構築物は、プラスミドまたはウイルスベ
クターのようなベクターを含み、これは、本発明のこの
ような配列に挿入される。配列は、正方向または逆方向
に挿入され得る。この点において特に好ましい実施態様
では、構築物は、配列に作動可能に連結された調節配列
（例えば、プロモーターを含む）をさらに含む。多数の
適切なベクターおよびプロモーターは、当業者に公知で
あり、そして本発明における使用に適切な多くの市販の
ベクターが存在する。 【０１４８】以下のベクターは、市販されており、実施
例として提供される。細菌における使用に好ましいベク
ターの中には、Ｑｉａｇｅｎから入手可能なｐＱＥ７
０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
から入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐ
ｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８
Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；およ
びＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、
ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、
ｐＲＩＴ５がある。好ましい真核生物ベクターの中に
は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥ
Ｏ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐ
ＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳ
ＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬがある。
これらのベクターは、多くの市販および周知のベクター
の例示として単独で列挙され、本発明のこの局面による
使用のために当業者には利用可能である。例えば、宿主
における本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
の導入、維持、増殖、または発現に適切ないかなる他の
プラスミドまたはベクターもが、本発明のこの局面にお
いて使用され得ることが理解される。 【０１４９】プロモーター領域は、プロモーター領域を
欠くレポーター転写単位（例えば、クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ（「ｃａｔ」）転写単
位）を、候補プロモーターフラグメント（すなわち、プ
ロモーターを含み得るフラグメント）を導入するための
制限部位（単数または複数）の下流に含むベクターを用
いて任意の所望の遺伝子から選択され得る。周知のよう
に、ｃａｔ遺伝子の上流の制限部位のプロモーター含有
フラグメントのベクターへの導入は、ＣＡＴ活性の産生
を発生させ、これは、標準的なＣＡＴアッセイによって
検出され得る。この目的に適切なベクターは、周知であ
り、そして容易に入手可能である。このような２つのベ
クターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。従
って、本発明のポリヌクレオチドの発現のためのプロモ
ーターは、周知で容易に入手可能なプロモーターだけで
なく、前述の技術によって、レポーター遺伝子を用いて
容易に得られ得るプロモーターもまた含む。 【０１５０】本発明によるポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの発現に適切な公知の細菌プロモーターの中に
は、Ｅ． ｃｏｌｉ ｌａｃＩおよびｌａｃＺおよびプ
ロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロ
モーター、λＰＲ、ＰＬプロモーター、ならびにｔｒｐ
プロモーターがある。この点において適切な公知の真核
生物プロモーターの中には、ＣＭＶ即時初期プロモータ
ー、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および
後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（「Ｒ
ＳＶ」）のようなレトロウイルスＬＴＲのプロモータ
ー、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター
のようなメタロチオネインプロモーターがある。宿主細
胞における発現のための適切なベクターおよびプロモー
ターの選択は、周知の手順であり、そしてベクター構築
物の発現、宿主へのベクターの導入、および宿主におけ
る発現のために不可欠な技術は、当業者には日常的であ
る。 【０１５１】本発明はまた、上記で議論された上記の構
築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細
胞のような高等真核生物細胞、または酵母細胞のような
下等真核生物細胞であり得るか、あるいは宿主細胞は、
細菌細胞のような原核生物細胞であり得る。 【０１５２】宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カル
シウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン
媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トラン
スフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、
感染、または他の方法によって行われ得る。このような
方法は、多くの標準的な実験室マニュアル（例えば、Ｄ
ａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９８６））に
記載される。宿主細胞中の構築物は、組換え配列によっ
てコードされる遺伝子産物を産生する従来の方法におい
て使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、
従来のペプチドシンセサイザーによって合成的に産生さ
れ得る。 【０１５３】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞中で、適切なプロモーターの制御
下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮ
Ａ構築物由来のＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を
産生するために使用され得る。原核生物および真核生物
宿主での使用のための適切なクローニングおよび発現ベ
クターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（１９８９）によ
って記載される。 【０１５４】一般的には、組換え発現ベクターは、複製
起点、下流の構造配列の転写を指向する高発現遺伝子由
来のプロモーター、およびベクターに曝露した後のベク
ター含有細胞の単離を可能にする選択可能なマーカーを
含む。適切なプロモーターの中には、特に、糖化酵素
（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（「ＰＧ
Ｋ」））、ａ−因子、酸ホスファターゼ、および熱ショ
ックタンパク質をコードする遺伝子由来のものがある。
選択可能なマーカーは、Ｅ． ｃｏｌｉのアンピシリン
耐性遺伝子およびＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｔｒｐ
１遺伝子を包含する。 【０１５５】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することによって増大され得る。エンハンサ
ーは、通常は約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用エ
レメントであり、与えられた宿主細胞型におけるプロモ
ーターの転写活性を増大させるように作用する。エンハ
ンサーの例としては、ＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１０
０〜２７０位の複製起点の後期側に位置する）、サイト
メガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起
点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウ
イルスエンハンサーが挙げられる。 【０１５６】本発明のポリペプチドの異種構造配列をコ
ードする本発明のポリヌクレオチドは、一般的に、それ
が発現のためのプロモーターに作動可能に連結されるよ
うに、標準的な技術を使用してベクターに挿入される。
ポリヌクレオチドは、転写開始部位がリボソーム結合部
位の５’に適切に位置されるように、配置される。リボ
ソーム結合部位は、発現されるべきポリペプチドの翻訳
を開始するＡＵＧの５’である。一般的に、開始コドン
（通常、ＡＵＧ）で開始する他のオープンリーディング
フレームは存在せず、そしてリボソーム結合部位と開始
ＡＵＧとの間に位置される。また、一般的に、ポリペプ
チドの末端に翻訳停止コドンが存在し、そして転写され
た領域の３’末端に適切に配置されたポリアデニル化シ
グナルおよび転写末端シグナルが存在する。 【０１５７】小胞体の内腔、周辺腔、または細胞外環境
への翻訳されたタンパク質の分泌のために、適切な分泌
シグナルが、発現されるポリペプチドへ組み込まれ得
る。シグナルはポリペプチドに対して内因性であり得る
か、またはそれらは異種のシグナルであり得る。 【０１５８】ポリペプチドは、改変された形態（例え
ば、融合タンパク質）で発現され、そして分泌シグナル
だけでなくさらなる異種の機能性領域も含み得る。従っ
て、例えば、さらなるアミノ酸（特に変更されたアミノ
酸）の領域は、精製の間またはその後の取扱いおよび保
管の間の、宿主細胞における安定性および持続性を改良
するためにポリペプチドのＮ末端に付加され得る。ま
た、領域は、精製を容易にするためにポリペプチドに添
加され得る。このような領域は、ポリペプチドの最終調
製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を引
き起こすため、安定性を改良するため、および精製を容
易にするための、ポリペプチドへのペプチド部分の付加
は、当該分野において、良く知られておりかつ日常的な
技術である。 【０１５９】本発明に従う、増殖、維持、またはポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの発現に適切な原核生物
宿主には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが挙げられる。Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、および
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの種々の種は、この点に
おいて適切な宿主である。さらに、当業者に公知である
多くの他の宿主もまた、この点において使用され得る。 【０１６０】代表的であるが非限定的な例として、細菌
の使用のための有用な発現ベクターは、周知のクローニ
ングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の
遺伝因子を含む市販のプラスミドに由来する選択マーカ
ーおよび細菌性の複製起点を含み得る。このような市販
のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕｐｐ
ｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ， Ｕ
ＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「骨格（ｂ
ａｃｋｂｏｎｅ）」部分は、適切なプロモーターおよび
発現されるべき構造配列と組み合わされる。 【０１６１】以下の適切な宿主株の形質転換および適切
な細胞密度までの宿主株の増殖（ここで、選択されたプ
ロモーターは、誘導性である）は、適切な手段（例え
ば、温度シフトまたは化学的誘導剤への曝露）により誘
導され、そして細胞はさらなる期間培養される。次い
で、細胞は、代表的には、遠心分離により収集され、物
理的または化学的手段により破壊され、そして得られた
粗抽出物はさらなる精製のために維持される。タンパク
質の発現において使用される微生物細胞は、任意の簡便
な方法（凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破
壊、または細胞溶解剤の使用を含む）により破壊され
得、これらの方法は当業者に周知である。 【０１６２】種々の哺乳動物細胞培養系が、同様に発現
のために使用され得る。哺乳動物発現系の例には、Ｇｌ
ｕｚｍａｎら、Ｃｅｌｌ，２３：１７５（１９８１）に
記載されるサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株が挙げら
れる。適合性のベクターを発現し得る他の細胞株には、
例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎
臓２９３およびＢＨＫ細胞株が挙げられる。 【０１６３】哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切
なプロモーターおよびエンハンサーを含み、そしてまた
任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部
位、スプライスドナー、およびアクセプター部位、転写
終結配列、ならびに５’隣接非転写配列（これらは発現
のために必要である）を含む。この点における特定の好
ましい実施態様において、ＳＶ４０スプライス部位由来
のＤＮＡ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化部位は、こ
れらのタイプの必要とされる非転写の遺伝的エレメント
のために使用される。 【０１６４】本発明のポリペプチドは回収され、そして
周知の方法（硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、
酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互
作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーお
よびレクチンクロマトグラフィーを含む）により組換え
細胞培養物から精製される。最も好ましくは、高速液体
クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために使
用される。タンパク質のリフォールディングのための周
知の方法は、ポリペプチドが単離および精製の間に変性
された場合に、活性コンフォメーションを再生するため
に使用され得る。 【０１６５】本発明のポリペプチドには、天然の精製産
物、化学的合成手順の産物、および組換え技術により原
核生物または真核生物宿主（例えば、細菌、酵母、高等
植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から産生される産物
が挙げられる。組換え産生手順において使用される宿主
に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化さ
れてもよいし、またはグリコシル化されなくてもよい。
さらに、本発明のポリペプチドはまた、宿主媒介性プロ
セスの結果のようないくつかの場合において、開始改変
メチオニン残基を含み得る。 【０１６６】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、種々の適用（特にＴＮＦδおよびＴＮＦεの化
学的および生物学的特性を利用する適用）のために本発
明に従って使用され得る。これらには、形質転換細胞株
のアポトーシス、細胞活性化および増殖の媒介、ならび
に免疫調節抗菌剤、抗ウイルス剤、および病原に対する
炎症応答感受性の一次メディエーターにおける適用があ
る。さらなる適用は、細胞、組織および生物の障害の診
断および処置に関する。本発明のこれらの局面は、以下
の考察によりさらに説明される。 【０１６７】本発明はまた、相補的なポリヌクレオチド
を検出するための本発明のポリヌクレオチドの使用（例
えば、診断試薬としての）に関する。機能障害に関連す
る本発明のポリペプチドの変異形態の検出は、本発明の
ポリペプチドの過小発現、過剰発現、または変化した発
現から生じる疾患（例えば、腫瘍のような新生物形成）
または疾患への感受性の診断を加えるかまたは規定し得
る診断ツールを提供する。 【０１６８】本発明の遺伝子に変異を有する個体は、種
々の技術によってＤＮＡレベルで検出され得る。診断用
の核酸は、患者の細胞（血液、尿、唾液、組織生検、お
よび剖検材料）から得られ得る。ゲノムＤＮＡは、直接
検出に用いられ得るか、またはＰＣＲを用いて分析前に
酵素的に増幅され得る。ＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔ
ｕｒｅ， ３２４：１６３−１６６ １９８６）。ＲＮ
ＡまたはｃＤＮＡもまた、同様に用いられ得る。一例と
して、ＴＮＦδまたはＴＮＦεをコードする核酸に相補
的であるＰＣＲプライマーは、ＴＮＦδまたはＴＮＦε
の発現および変異を同定および分析するために用いられ
得る。例えば、欠失および挿入は、増幅された産物の正
常遺伝子型に比較した場合のサイズの変化によって検出
され得る。点変異は、増幅されたＤＮＡを放射性標識さ
れたＴＮＦδまたはＴＮＦεのＲＮＡあるいは放射性標
識されたＴＮＦδまたはＴＮＦεのアンチセンスＤＮＡ
配列にハイブリダイズさせることにより同定され得る。
完全に適合した配列は、ＲＮａｓｅ Ａ消化によりまた
は融解温度の差により、ミスマッチした二重鎖から識別
され得る。 【０１６９】基準の遺伝子と変異を有する遺伝子との間
の配列の相違はまた、直接的ＤＮＡ配列決定法により明
らかにされ得る。さらに、クローン化ＤＮＡセグメント
は、特定のＤＮＡセグメントを検出するためのプローブ
として用いられ得る。このような方法の感度は、ＰＣＲ
または別の増幅方法の適切な使用により大きく増強され
得る。例えば、配列決定プライマーは、改変ＰＣＲによ
って生成された二本鎖ＰＣＲ産物または一本鎖鋳型分子
と共に使用される。配列決定は、放射能標識されたヌク
レオチドを用いる従来の手順により、または蛍光タグを
用いる自動配列決定手順により行われる。 【０１７０】ＤＮＡ配列の差異に基づいた遺伝子試験
は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるＤＮＡ
フラグメントの電気泳動移動度における変化の検出によ
り達成され得る。小さな配列欠失および挿入は、高分解
能ゲル電気泳動によって視覚化され得る。異なる配列の
ＤＮＡフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲルにお
いて識別され得る。ここでゲル中の異なるＤＮＡフラグ
メントの移動度は、それらの特異的融解温度または部分
的融解温度に従って異なる位置でゲル内で遅れる（例え
ば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０：１２４
２ （１９８５）を参照のこと）。 【０１７１】特定の位置での配列の変化はまた、ヌクレ
アーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護およびＳ
１保護または化学的切断法（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８３：４３
９７−４４０１ （１９８５）））により明らかにされ
得る。従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダ
イゼーション、ＲＮａｓｅ保護、化学的切断、直接的Ｄ
ＮＡ配列決定、または制限酵素の使用（例えば、制限断
片長多型（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブ
ロッティングのような方法によって達成され得る。より
従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、
変異はまた、インサイチュ分析によって検出され得る。 【０１７２】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
である。配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特
異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし得
る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必
要性がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際
の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識化試薬
はほとんどない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッ
ピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子との相
関付けにおいて重要な第１工程である。 【０１７３】この点における特定の実施態様において、
本明細書中に開示されるｃＤＮＡは、本発明の遺伝子の
ゲノムＤＮＡをクローニングするために使用される。こ
れは、種々の周知の技術および一般に市販されているラ
イブラリーを使用して達成され得る。ゲノムＤＮＡは、
この目的のための周知の技術を使用してインサイチュ染
色体マッピングのために使用される。代表的には、染色
体マッピングの日常的な手順に従う、いくつかの試みお
よび誤りが、良好なインサイチュハイブリダイゼーショ
ンシグナルを与えるゲノムプローブを同定するために必
要であり得る。 【０１７４】いくつかの場合において、さらに、配列
は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜
２５ｂｐ）を調製することにより染色体にマップされ得
る。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター解析が、
ゲノムＤＮＡ内で１より多いエキソンにまたがらず、従
って増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選
択するために使用される。次いで、これらのプライマー
は、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣ
Ｒスクリーニングに使用される。プライマーに対応する
ヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメント
を生じる。 【０１７５】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
本発明と共に使用して、特定の染色体由来のフラグメン
トのパネルまたは類似の様式での大きなゲノムクローン
のプールを用いて、部分的局在性の決定（ｓｕｂｌｏｃ
ａｌｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップ
するために同様に使用され得る他のマッピングストラテ
ジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識し
てフロー選別した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体を
用いるプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮ
Ａライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーショ
ンによる予備選択を包含する。 【０１７６】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「ＦＩ
ＳＨ」）は、１工程で正確な染色体位置を提供するため
に使用され得る。この技術は、５０または６０ほどの短
いｃＤＮＡを用いて使用され得る。この技術の総説につ
いては、Ｖｅｒｍａら， Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓ
ｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）を参照のこと。 【０１７７】一旦配列が正確な染色体位置にマップされ
ると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝子地図の
データと相関させ得る。このようなデータは、例えば、
Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ， Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈ
ｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎＭａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋ
ｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ＷｅｌｃｈＭｅｄｉ
ｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能であ
る）において見出される。次いで、同じ染色体領域にマ
ップされる遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物
理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。 【０１７８】次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤ
ＮＡ配列またはゲノム配列における差異を決定する必要
がある。変異がいくつかまたは全ての罹患個体に観察さ
れるが、いずれの正常な個体にも観察されない場合、こ
の変異は疾患の原因因子であるようである。 【０１７９】物理的マッピング技術および遺伝子マッピ
ング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領
域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００と
の間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、
１メガベースのマッピング解像度、および２０ｋｂあた
り１遺伝子と仮定する）。 【０１８０】本発明はまた、診断的アッセイ（例えば、
細胞および組織における本発明のタンパク質のレベルを
検出する（正常レベルおよび異常レベルの決定を含む）
ための定量的および診断的アッセイ）に関する。従っ
て、例えば、正常コントロール組織サンプルと比較した
本発明のＴＮＦタンパク質の過剰発現を検出するため
の、本発明に従う診断的アッセイは、例えば、新生物形
成の存在を検出するために使用され得る。宿主由来のサ
ンプルにおいてタンパク質（例えば、本発明のタンパク
質）のレベルを決定するために使用され得るアッセイ技
術は、当業者に周知である。このようなアッセイ方法と
しては、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウ
エスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡアッセイが挙
げられる。これらの中でＥＬＩＳＡがしばしば好まれ
る。ＥＬＩＳＡアッセイは、まず、本発明のタンパク質
に特異的な抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を
調製する工程を包含する。さらに、モノクローナル抗体
に結合するレポーター抗体が、一般的に調製される。レ
ポーター抗体は、検出試薬（例えば、放射性、蛍光性、
または酵素的であり、本実施例においては西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ酵素）に付着される。 【０１８１】ＥＬＩＳＡアッセイを実施するために、サ
ンプルが宿主から取り出され、そしてサンプル中でタン
パク質と結合する固相支持体（例えば、ポリスチレンデ
ィッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッ
シュ上の任意のフリーのタンパク質結合部位が、非特異
的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）とインキ
ュベートすることにより覆われる。次に、モノクローナ
ル抗体が、モノクローナル抗体がポリスチレンディッシ
ュに付着した本発明の任意のタンパク質に付着する時間
の間、ディッシュ中でインキュベートされる。非結合の
モノクローナル抗体が、緩衝液で洗い出される。西洋ワ
サビペルオキシダーゼに結合したレポーター抗体がディ
ッシュ中に置かれ、本発明のタンパク質に結合した任意
のモノクローナル抗体へのレポーター抗体の結合が生じ
る。次いで、付着していないレポーター抗体が洗い出さ
れる。次いで、ペルオキシダーゼ活性のための試薬（比
色定量基質が含まれる）がディッシュに添加される。一
次および二次抗体を介して本発明のタンパク質に結合し
た固定されたペルオキシダーゼは、有色の反応産物を産
生する。所定の時間において発色した色の量は、サンプ
ル中に存在する本発明のタンパク質の量を示す。定量的
な結果は、代表的には、検量線を参考にして得られる。 【０１８２】競合アッセイが使用され得、ここで、固相
支持体に付着した本発明のタンパク質に特異的な抗体お
よび本発明の標識されたタンパク質ならびに宿主由来の
サンプルが、固相支持体を通され（ｐａｓｓ ｏｖｅ
ｒ）、そして固相支持体に付着して検出された標識の量
がサンプル中の本発明のタンパク質の量と相関され得
る。 【０１８３】ポリペプチド、それらのフラグメント、も
しくは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいは
それらを発現する細胞が、それらに対する抗体を産生す
るための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、
例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であ
り得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、および
ヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａ
ｂ発現ライブラリーの産物を含む。当該分野で公知の種
々の方法が、このような抗体およびフラグメントの産生
のために使用され得る。 【０１８４】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドの動物への直接注
入か、またはポリペプチドの動物（好ましくは、非ヒ
ト）への投与により得られ得る。次いで、そのように得
られた抗体は、ポリペプチド自体へ結合する。このよう
に、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列
でさえ、ネイティブなポリペプチド全体に結合する抗体
を生成するために使用され得る。次いで、このような抗
体は、ポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを
単離するために使用され得る。 【０１８５】モノクローナル抗体を調製するために、連
続的な細胞株培養により産生される抗体を提供する任意
の技術が使用され得る。例には、ハイブリドーマ技術
（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、
Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５−４９７（１９７
５））、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞
ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ４：７２（１９８３））、およ
びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハ
イブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ、７７−９６頁， Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．（１９８５））が挙げられる。 【０１８６】単鎖抗体の産生について記載される技術
（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を産生するため
に適合化され得る。また、トランスジェニックマウスま
たは他の動物のような他の生物は、本発明の免疫原性ポ
リペプチド産物に対するヒト化抗体を発現するために使
用され得る。 【０１８７】上記の抗体は、ポリペプチドを発現するク
ローンを単離するためかもしくは同定するために、また
はアフィニティークロマトグラフィーによる単離および
／または精製のための固相支持体へ抗体を吸着させるこ
とにより、本発明のポリペプチドを精製するために使用
され得る。 【０１８８】従って、本発明のポリペプチドは、新生物
形成（例えば、腫瘍細胞増殖）を阻害するために使用さ
れ得る。本発明のポリペプチドは、アポトーシスおよび
特定の細胞への細胞障害性を介して腫瘍の破壊を担い得
る。本発明のポリペプチドはまた、接着細胞（例えば、
ＬＦＡ−１）のアップレギュレーションを誘導し、それ
ゆえ、創傷治癒のために使用され得る。本発明のポリペ
プチドはまた、増殖促進活性を必要とする疾患（例え
ば、再狭窄）の処置のために使用され得る。なぜなら、
本発明のポリペプチドは、内皮起源の細胞における増殖
効果を有するからである。それゆえ、本発明のポリペプ
チドはまた、内皮細胞発達において血管新生を調節する
ために使用され得る。 【０１８９】本発明のポリペプチドはまた、Ｔ細胞の活
性化を刺激し、それゆえ、種々の寄生虫感染、細菌感
染、およびウイルス感染に対する免疫応答を刺激するた
めに使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、この
点において、自己免疫疾患を処置および／または予防す
るために自己応答性のＴ細胞を排除するために使用され
得る。自己免疫疾患の例には、Ｉ型糖尿病が挙げられ
る。 【０１９０】本発明はまた、本発明のタンパク質を結合
するレセプター分子のような分子を同定する方法を提供
する。本発明のタンパク質に結合するタンパク質（例え
ば、レセプタータンパク質）をコードする遺伝子は、当
業者に公知である多数の方法（例えば、リガンドパニン
グおよびＦＡＣＳソーティング）により同定され得る。
このような方法は、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ １（２）：第５章（１９９１）のような多くの
研究室マニュアルに記載される。 【０１９１】例えば、発現クローニングがこの目的のた
めに使用され得る。このために、ポリアデニル化ＲＮＡ
は本発明のタンパク質に応答性の細胞から調製され、ｃ
ＤＮＡライブラリーはこのＲＮＡから作製され、このラ
イブラリーはプールに分割され、このプールは本発明の
タンパク質に応答性でない細胞へ個々にトランスフェク
トされる。次いで、トランスフェクト細胞は、本発明の
標識されたタンパク質へ曝される。本発明のタンパク質
は、種々の周知の技術（放射性ヨウ素化または部位特異
的タンパク質キナーゼに対する認識部位の包含の標準的
方法を含む）により標識され得る。曝露に続いて、この
細胞は固定され、そしてサイトスタチン（ｃｙｔｏｓｔ
ａｔｉｎ）の結合が決定される。これらの手順は、スラ
イドガラス上で簡便に実施される。 【０１９２】ＴＮＦδまたはＴＮＦε結合細胞を産生し
たｃＤＮＡのプールが同定される。サブプールは、これ
らの陽性物（ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）から調製され、上記
のように宿主細胞へトランスフェクトされ、そしてスク
リーニングされる。繰り返しのサブプーリング（ｓｕｂ
−ｐｏｏｌｉｎｇ）および再スクリーニングプロセスを
使用して、推定の結合分子（例えば、レセプター分子）
をコードする一つ以上の単一のクローンが単離され得
る。 【０１９３】あるいは、標識されたリガンドは、それが
結合する分子（例えば、レセプター分子）を発現する細
胞から調製された細胞抽出物（例えば、膜または膜抽出
物）に光親和性結合され得る。架橋物質は、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）により分離さ
れ、そしてＸ線フィルムに曝される。リガンド−レセプ
ターを含む標識複合体が切除され、ペプチドフラグメン
トに分解され、そしてタンパク質ミクロシーケンシング
に供され得る。ミクロシーケンシングにより得られたア
ミノ酸配列は、推定のレセプター分子をコードする遺伝
子を同定するためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングするための、独特のまたは縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａ
ｔｅ）オリゴヌクレオチドプローブを設計するために使
用され得る。 【０１９４】本発明のポリペプチドはまた、細胞中また
は無細胞調製物中でのＴＮＦδまたはＴＮＦε結合分子
（例えば、レセプター分子）のＴＮＦδまたはＴＮＦε
結合能力を評価するために使用され得る。 【０１９５】本発明はまた、細胞上のＴＮＦδまたはＴ
ＮＦεの作用（例えば、レセプター分子のようなＴＮＦ
δまたはＴＮＦε結合分子との相互作用）を増強または
ブロックする化合物を同定するために化合物をスクリー
ニングする方法を提供する。アゴニストは、本発明のポ
リペプチドの天然の生物学的機能を上昇させるか、また
は本発明のポリペプチドと類似の様式で機能する化合物
であり、一方、アンタゴニストは、このような機能を減
少させるかまたは排除する。 【０１９６】例えば、細胞コンパートメント（例えば、
膜または膜調製物のようなその調製物）は、ＴＮＦδま
たはＴＮＦεに結合する分子（例えば、ＴＮＦδまたは
ＴＮＦεにより変調されるシグナル伝達経路または調節
性経路の分子）を発現する細胞から調製され得る。この
調製物は、ＴＮＦδまたはＴＮＦεのアゴニストまたは
アンタゴニストであり得る候補分子の非存在下または存
在下において、標識されたＴＮＦδまたはＴＮＦεと共
にインキュベートされる。候補分子の結合分子に結合す
る能力は、標識リガンドの結合の減少を反映する。無償
で（すなわち、ＴＮＦδまたはＴＮＦε結合分子に結合
することにおける、ＴＮＦδまたはＴＮＦεの効果を誘
導することなく）結合する分子は、おそらく良好なアン
タゴニストである。十分に結合し、そしてＴＮＦδまた
はＴＮＦεと同一であるかまたは密接に関連する効果を
導き出す分子は、アゴニストである。 【０１９７】潜在的なアゴニストおよびアンタゴニスト
のＴＮＦδまたはＴＮＦε様の効果は、例えば、候補分
子の細胞または適切な細胞調製物との相互作用に続くセ
カンドメッセンジャー系の活性を測定すること、および
この効果とＴＮＦδまたはＴＮＦεあるいはＴＮＦδま
たはＴＮＦεと同じ効果を導き出す分子の効果とを比較
することにより測定され得る。この点において有用であ
り得るセカンドメッセンジャー系には、ＡＭＰグアニル
酸シクラーゼ、イオンチャネル、またはホスホイノシチ
ド加水分解のセカンドメッセンジャー系が挙げられる
が、これらには限定されない。 【０１９８】ＴＦＮδまたはＴＦＮεアンタゴニストに
ついてのアッセイの別の例は、ＴＦＮδまたはＴＦＮε
および潜在的アンタゴニストと、膜結合ＴＦＮδまたは
ＴＦＮεレセプター分子または組換えＴＦＮδまたはＴ
ＦＮεレセプター分子とを競合阻害アッセイに適切な条
件下で組み合わせる競合アッセイである。ＴＦＮδまた
はＴＦＮεは、レセプター分子に結合したＴＦＮδまた
はＴＦＮε分子の数が決定され、潜在的アンタゴニスト
の有効性を正確に評価し得るように放射能などにより標
識され得る。 【０１９９】潜在的アンタゴニストは、小有機分子、ペ
プチド、ポリペプチド、および本発明のポリペプチドに
結合しそれによりその活性を阻害するか消失させる抗体
を含む。潜在的アンタゴニストはまた、小有機分子、ペ
プチド、ＴＦＮδまたはＴＦＮε誘導活性を誘導するこ
となしにレセプター分子のような結合分子上の同じ部位
に結合し、それにより本発明のポリペプチドの作用をそ
のレセプターへの結合から排除することにより防止する
密接に関連したタンパク質または抗体のようなポリペプ
チドであり得る。 【０２００】別の潜在的アンタゴニストは、ＴＦＮδま
たはＴＦＮεに結合しそして膜結合ＴＦＮδまたはＴＦ
Ｎεレセプターとの相互作用からそれを防止するＴＦＮ
δまたはＴＦＮεレセプターの可溶性形態である。この
様式において、レセプターはそのリガンドにより刺激さ
れない。 【０２０１】潜在的アンタゴニストは、ポリペプチドの
結合部位に結合しそして占有し、それにより正常な生物
学的活性が防止されるようにレセプター分子のような細
胞性結合分子に結合することを防止する小分子を含む。
小分子の例は、小有機分子、ペプチド、または非ペプチ
ドアンタゴニストを含むが、これらに限定されない。 【０２０２】他の潜在的アンタゴニストはアンチセンス
分子を含む。アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡ
またはＲＮＡを通じてまたは三重らせん形成を通じて遺
伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス
技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈ
ｅｍ．， ５６：５６０， １９９１； Ｏｌｉｇｏｄ
ｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅ
ｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ， ＦＬ （１９８８）において議論され
る。三重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６：３０７３
（１９７９）； Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２４１：４５６ （１９８８）；およびＤｅｒｖａｎ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１：１３６０（１９９１）
において議論される。これらの方法は、ポリヌクレオチ
ドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例え
ば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドの５’コード部分は、約１０〜４０塩基対の長さ
のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するた
めに使用され得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写
に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計さ
れ、それによりＴＦＮδまたはＴＦＮεの転写および産
生を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド
は、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍ
ＲＮＡ分子のＴＦＮδまたはＴＦＮεポリペプチドへの
翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはま
た、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現
されて本発明のポリペプチドの産生を阻害するように細
胞に送達され得る。 【０２０３】アンタゴニストは、薬学的に受容可能なキ
ャリア（例えば、本明細書中以下に記載のような）を有
する組成物において用いられ得る。 【０２０４】アンタゴニストは、例えば、ＴＦＮδまた
はＴＦＮεにより抑制されるリポタンパク質リパーゼの
全身性欠失から生じる脂質除去欠損である悪液質を処置
するために用いられ得る。アンタゴニストはまた、本発
明のポリペプチドが病因性役割を果たしているようであ
る大脳性マラリアを処置するために用いられ得る。アン
タゴニストはまた、ＴＦＮδまたはＴＦＮε誘導性炎症
性サイトカイン（例えば、滑膜細胞におけるＩＬ１）の
産生を阻害することにより慢性関節炎リウマチを処置す
るために用いられ得る。関節炎を処置する場合、本発明
のポリペプチドは好ましくは関節内注入される。 【０２０５】アンタゴニストはまた、移植片の存在にお
ける免疫系の刺激を防止することにより、移植片−宿主
拒絶を予防するために用いられ得る。 【０２０６】アンタゴニストはまた、骨吸収を阻害する
ため、従って、骨粗鬆症を処置および／または予防する
ために用いられ得る。 【０２０７】アンタゴニストはまた、抗炎症性因子とし
て、および内毒素ショックを処置するために用いられ得
る。この重要な症状は、細菌性および他の型の感染に対
する過度な応答から生じる。 【０２０８】本発明はまた、上記のポリヌクレオチドも
しくはポリペプチドまたはアゴニストもしくはアンタゴ
ニストを含む組成物に関する。従って、本発明のポリペ
プチドは、細胞、組織または器官で使用するための非滅
菌または滅菌キャリア（単数または複数）（例えば、被
験体に投与するために適切な薬学的キャリア）と組み合
わせて用いられ得る。このような組成物は、例えば、添
加媒液または治療的有効量の本発明のポリペプチドおよ
び薬学的に受容可能なキャリアまたは添賦剤を含む。こ
のようなキャリアは、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、
デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およ
びこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。処
方は投与の様式に適するべきである。 【０２０９】本発明はさらに、本発明の上記の組成物の
１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む、薬
学的パックおよびキットに関する。このような容器に、
薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規
制する政府機関により処方された形態での注意書であっ
て、ヒトへの投与のための製品の製造、使用、または販
売の機関による認可を反映する注意書が付随し得る。 【０２１０】本発明のポリペプチドおよび他の化合物
は、単独または他の化合物（例えば、治療的化合物）と
組み合わせて用いられ得る。 【０２１１】薬学的組成物は、任意の効果的、便利な様
式（例えば、なかでも、局所的、経口、経肛、経膣、静
脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経
路）で投与され得る。 【０２１２】薬学的組成物は一般に、特定の病徴（単数
または複数）の処置または予防のための有効量で投与さ
れる。一般に、組成物は少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体
重の量で投与される。ほとんどの場合、これは１日当た
り約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与される。好ま
しくは、ほとんどの場合、用量は１日約１０μｇ／ｋｇ
〜約１ｍｇ／ｋｇ体重である。最適な投与は、各処置の
様式および病徴について、病徴、重篤度、投与の経路、
症状の複雑さなどを考慮して、標準的な方法により決定
されることが理解される。 【０２１３】本発明のポリペプチドであるポリヌクレオ
チド、ポリペプチド、アゴニスト、およびアンタゴニス
トは、このようなポリペプチドのインビボ発現により、
「遺伝子治療」としばしばいわれる処置様式において本
発明に従って用いられ得る。 【０２１４】従って、例えば、患者由来の細胞はポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド（例えばＤＮＡま
たはＲＮＡ）でエクスビボで操作され得、次いで操作さ
れた細胞はポリペプチドで処置されるべき患者に提供さ
れ得る。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコー
ドするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクター
の使用によりエクスビボで操作され得る。このような方
法は当該分野で周知であり、そして本発明におけるこの
使用は本明細書中の教示から明らかである。 【０２１５】同様に、細胞は、当該分野で公知の手順に
よりインビボでのポリペプチドの発現のためにインビボ
で操作され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチド
は、上記のように、複製欠損レトロウイルスベクターに
おける発現のために操作され得る。次いで、レトロウイ
ルス発現構築物は、単離され得、そして本発明のポリペ
プチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラス
ミドベクターで、形質導入されたパッケージング細胞に
導入され得、その結果、パッケージング細胞は今や目的
の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する。これら
のプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作しそし
てインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与
され得る。このような方法により本発明のポリペプチド
を投与するためのこれらおよび他の方法は、本発明の教
示から当業者には明らかである。 【０２１６】本明細書中上記のレトロウイルスプラスミ
ドベクターが由来し得るレトロウイルスには、モロニー
マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫
ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルスのようなレトロウイル
ス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、
ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉
腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスが含まれる
が、これらに限定されない。１つの実施態様において、
レトロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス白
血病ウイルスに由来する。 【０２１７】このようなベクターは、ポリペプチドを発
現するために１つ以上のプロモーターを含む。用いられ
得る適切なプロモーターは、レトロウイルスＬＴＲ；Ｓ
Ｖ４０プロモーター；およびＭｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ７：９８０−９９０（１９８
９）に記載されるヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
プロモーター、または任意の他のプロモーター（例え
ば、ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、およびβ−
アクチンプロモーターを含むが、これらに限定されない
真核生物細胞性プロモーターのような細胞性プロモータ
ー）を含むが、これらに限定されない。用いられ得る他
のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモータ
ー、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ
１９パルボウイルスプロモーターを含むが、これらに限
定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中
に含まれる教示から、当業者には明白である。 【０２１８】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適切なプロモーターの制御下に置かれる。用いら
れ得る適切なプロモーターは、アデノウイルス主要後期
プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター：ま
たはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのよ
うな異種プロモーター；、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳ
Ｖ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネ
インプロモーターのような誘導性プロモーター；熱ショ
ックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡ
Ｉプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘル
ペスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチ
ミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ
（本明細書中に上記の改変レトロウイルスＬＴＲを含
む）；β−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホル
モンプロモーターを含むが、これらに限定されない。プ
ロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を
制御する天然のプロモーターであり得る。 【０２１９】レトロウイルスプラスミドベクターは、パ
ッケージング細胞株を形質導入して、プロデューサー細
胞株を形成するために使用される。トランスフェクトさ
れ得るパッケージング細胞の例は、Ｍｉｌｌｅｒ，
Ａ．， Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ， １：
５−１４ （１９９０）に記載のＰＥ５０１、ＰＡ３１
７、Ｙ−２、Ｙ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、Ｖ
Ｔ−１９−１７−Ｈ２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋
Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株
を含むが、これらに限定されない。ベクターは、当該分
野に公知の任意の手段を通じてパッケージング細胞に形
質導入され得る。このような手段は、エレクトロポレー
ション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ_４沈殿を含
むが、これらに限定されない。１つの代替として、レト
ロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム内にカプ
セル化されるか、または脂質に結合され、次いで宿主に
投与され得る。 【０２２０】プロデューサー細胞株は、ポリペプチドを
コードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクタ
ー粒子を生じる。次いで、このようなレトロウイスルベ
クター粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで
真核生物細胞を形質導入するために用いられ得る。形質
導入される真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする
核酸配列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞
は、胚幹細胞、胚性癌腫細胞、ならびに造血幹細胞、肝
細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細
胞、および気管支上皮細胞を含むが、これらに限定され
ない。 【０２２１】本発明は、以下の実施例によってさらに説
明される。実施例は、特定の実施態様に参照することに
より本発明を例示するためにのみ提供される。これらの
例示は、本発明の特定の局面を例示しているが、開示さ
れる発明の範囲の限定または制限を表現するものではな
い。 【０２２２】全ての実施例は、別に詳細に記載されてい
るところを除いて、当業者に周知かつ日常的である標準
的技術を用いて実施された。以下の実施例の日常的分子
生物学技術は、標準的研究参考書（例えば、「Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ」として本明細書中でいわれる、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ＡＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、； Ｃｏ
ｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）に記載されるように実
施され得る。 【０２２３】別に特定される場合を除いて、以下の実施
例中に示される全ての部または量は重量による。別に述
べられない場合、以下の実施例においてフラグメントの
サイズ分離は、Ｓａｍｂｒｏｏｋおよび他の多数の参照
（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．， ８：４０５７ （１９８０））にお
けるアガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動
（「ＰＡＧＥ」）の標準的な技術を用いて実施される。
別に記載されない場合、連結は、標準的緩衝液、インキ
ュベーション温度および時間を用いて（０．５μｇのＤ
ＮＡ当たり、ほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラ
グメントおよび約１０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」））が達成された。 【０２２４】 【実施例】（実施例１） （細菌を用いた可溶形態のヒトＴＦＮδおよびＴＦＮε
の発現および精製） 寄託されたポリヌクレオチドにおい
てヒトＴＮＦδまたはＴＮＦεをコードするＤＮＡ配列
を、ヒトＴＮＦδまたはＴＮＦεタンパク質のアミノ酸
カルボキシル末端配列に特異的なそして遺伝子の３’側
のベクター配列に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて増幅した。クローニングを容易にする
ための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、それぞ
れ５’および３’配列に添加する。 【０２２５】５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配
列５’ ＧＣＧ ＧＧＡ ＴＣＣＣＡＧ ＡＧＣ ＣＴ
Ｃ ＡＣＣ ＡＣＡ Ｇ ３’を有し、これは下線を付
した制限部位、それに続くＡＴＧコドンの１１５番目の
塩基で始まる図に示される１６ヌクレオチドのコード配
列を含む。 【０２２６】３’プライマーは、配列５’ ＣＧＣ Ａ
ＡＧ ＣＴＴ ＡＣＡ ＡＴＣ ＡＣＡ ＧＴＴ ＴＣ
Ａ ＣＡＡ ＡＣ ３’は、下線を付したＨｉｎｄＩＩ
Ｉ制限部位、続いてストップコドンを含む図１および２
に示すコード配列の最後の１３ヌクレオチドに相補的な
２０ヌクレオチドを含む。 【０２２７】制限部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ−９
の制限酵素部位に対して便利であり、これらの実施例に
おいて細菌発現のために使用された（Ｑｉａｇｅｎ，
Ｉｎｃ． Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）。ｐＱＥ−
９は、アンピシリン抗生物質耐性（Ａｍｐ^ｒ）をコード
し、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ誘導プロモー
ター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、６−Ｈｉｓ
タグ、および制限酵素部位をコードする。 【０２２８】増幅されたヒトＴＮＦδＤＮＡおよびベク
ターｐＱＥ−９の両方をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化し、次いで消化されたＤＮＡは一緒に連結され
た。ＴＮＦδＤＮＡのｐＱＥ−９制限ベクターへの挿入
は、ＴＮＦδコード領域を、ベクターのＩＰＴＧ誘導プ
ロモーターの下流に、これに作動可能に連結するよう
に、そしてＴＮＦδの翻訳のために適切に位置された開
始ＡＵＧにインフレームに配置した。 【０２２９】連結混合物を、標準的な手順を用いて、コ
ンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。このよ
うな手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８
９）に記載されている。プラスミドｐＲＥＰ４の多数の
コピーを含有するＥ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（こ
れは、ｌａｃリプレッサーを発現し、そしてまたカナマ
イシン耐性（Ｋａｎ^ｒ）を付与する）を本明細書中に記
載の例示的な実施例を行うにあたって使用した。この株
（これは、ＴＮＦδを発現するために適切である多くの
内の唯一である）は、Ｑｉａｇｅｎから市販されてい
る。形質転換体をアンピシリンの存在下でＬＢプレート
上で増殖するそれらの能力により同定した。プラスミド
ＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてクローン化Ｄ
ＮＡの同定を制限分析により確認した。 【０２３０】所望の構築物を含むクローンを、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）とカナマイシン（２５μｇ／
ｍｌ）との両方を補充したＬＢ培地における液体培養で
一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖させた。Ｏ／Ｎ培養物を用いて
約１：１００〜１：２５０の希釈で大規模な培養物に接
種する。細胞を、０．４と０．６との間の６００ｎｍで
の光学密度（ＯＤ_６００）にまで増殖させた。次いで、
イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「Ｉ
ＰＴＧ」）を加えて１ｍＭの最終濃度にし、ｌａｃＩリ
プレッサーを不活性化することにより、ｌａｃリプレッ
サー感受性プロモーターからの転写を誘導した。細胞を
さらに３〜４時間引き続きインキュベートした。次い
で、細胞を遠心分離により収集し、標準的方法によって
破壊した。日常的な収集技術を用いて破壊した細胞から
封入体を精製し、タンパク質を封入体から８Ｍ尿素中へ
可溶化した。可溶化したタンパク質を含む８Ｍ尿素溶液
を、２×リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）中でＰ
Ｄ−１０カラムを通し、それによって尿素を除去し、緩
衝液を交換し、そしてタンパク質を再び折り畳んだ。タ
ンパク質をクロマトグラフィーのさらなる工程によって
精製してエンドトキシンを除去した。次いで、滅菌濾過
した。滅菌濾過したタンパク質調製物を、９５μｇ／ｍ
Ｌの濃度で２×ＰＢＳ中で保存した。 【０２３１】ポリアクリルアミドゲル電気泳動の標準的
方法によるＴＮＦδの調製物の分析によって、調製物が
約２０．８ｋＤａの予想された分子量を有する約８０％
のモノマーを含んでいることが明らかになった。 【０２３２】タンパク質を、ニッケルキレートカラム上
で６−ＨＩＳタグを含むタンパク質による型結合を可能
にする条件下でクロマトグラフィーによって精製する。
タンパク質を、６モルグアニジンＨＣｌ（ｐＨ５．０）
中でカラムから溶出し、再生する。 【０２３３】（実施例２） （バキュロウイルス発現系における可溶性ヒトＴＦＮδ
およびＴＦＮεのクローニングおよび発現） 寄託された
クローンにおける全長のヒトＴＮＦδまたはＴＮＦεタ
ンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の
５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いて増幅する：５’プライマーは、配
列５’ ＧＣＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＣＡ ＧＡＧ Ｃ
ＣＴ ＣＡＣ ＣＡＣ ＡＧ ３’を有し、下線を付し
たＢａｍＨＩ制限酵素部位、それに続く図１および２の
ＴＮＦδまたはＴＮＦεの配列の１６塩基を含有する。
発現ベクター中に挿入されて、以下に記載のように、ヒ
トＴＮＦδまたはＴＮＦεをコードする増幅されたフラ
グメントの５’末端は、効率的なシグナルペプチドを提
供する。真核生物細胞における翻訳の開始のための効率
的なシグナルは、Ｋｏｚａｋ， Ｍ．， Ｊ． Ｍｏ
ｌ． Ｂｉｏｌ． １９６： ９４７−９５０ （１９
８７）によって記載されるように、構築物のベクター部
分に適切に位置される。 【０２３４】３’プライマーは、配列５’ ＣＧＣ Ｔ
ＣＴ ＡＧＡ ＡＣＡ ＡＴＣ ＡＣＡ ＧＴＴ ＴＣ
Ａ ＣＡＡ ＡＣ ３’を有し、下線を付したＸｂａＩ
制限部位、続いて終結コドンを含んで、図１および２に
示すＴＮＦδまたはＴＮＦεコード配列の最後の１３ヌ
クレオチドに相補的なヌクレオチドを含む。 【０２３５】増幅されたフラグメントを、市販のキット
（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」 ＢＩＯ１０１ Ｉｎｃ．，
Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ．）を用いて、１％アガロ
ースゲルより単離する。次いで、このフラグメントをＢ
ａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、そして１％アガ
ロースゲルで再び精製する。このフラグメントを、本明
細書中でＦ２と命名する。 【０２３６】ベクターｐＡ２ＧＰを用いて、ＴＮＦδま
たはＴＮＦεタンパク質をバキュロウイルス発現系にお
いて、標準的な方法（例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃ
ｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅ
ｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ
ｓ， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
Ｎｏ． １５５５（１９８７）に記載される方法）を
用いて発現する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａ
ｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス
（ＡｃＭＮＰＶ）の強いポリヘドリンプロモーター、そ
れに続く便利な制限部位を含む。ＡｃＭＮＰＶ ｇｐ６
７のシグナルペプチド（Ｎ末端メチオニンを含む）は、
ＢａｍＨＩ部位のちょうど上流に位置する。サルウイル
ス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率
的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを
容易に選択するために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβガラクト
シダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同方向に
挿入し、その後ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シ
グナルが続く。ポリヘドリン配列を、野生型ウイルスＤ
ＮＡとの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列で
両端で隣接させ、クローン化ポリヌクレオチドを発現す
る生存可能なウイルスを生成する。 【０２３７】当業者が容易に理解するように、構築が転
写、翻訳、トラフィッキングなどのために適切に位置し
たシグナル（例えば、インフレームのＡＵＧおよび必要
ならばシグナルペプチド）を提供するならば、多くの他
のバキュロウイルスベクターが、ｐＡ２−ＧＰの代わり
に用いられ得る。例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４
１、およびｐＡｃＩＭ１である。このようなベクター
は、とりわけ、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，
１７０：３１−３９に記載される。 【０２３８】当該分野で公知の日常的な手順を用いて、
プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩおよＸｂａＩで消化
し、次いで仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化
する。次いで、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」
ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃ
ａ）を用いてＤＮＡを１％アガロースゲルより単離す
る。このベクターＤＮＡを、本明細書中で「Ｖ２」と命
名する。 【０２３９】フラグメントＦ２および脱リン酸化プラス
ミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を連結混合物で形質転換
し、そして培養プレート上に広げる。ＢａｍＨＩおよび
ＸｈａＩを用いて個々のコロニーからのＤＮＡを消化
し、次いでゲル電気泳動によって消化産物を分析するこ
とによって、ヒトＴＮＦδまたはＴＮＦε遺伝子を有す
るプラスミドを含む細菌を同定する。クローン化フラグ
メントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認する。この
プラスミドを本明細書中でｐＢａｃＴＮＦδを命名す
る。 【０２４０】５μｇのプラスミドｐＢａｃＴＮＦδを、
Ｆｅｌｇｎｅｒら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４：７４１３−７４１７
（１９８７）によって記載されるリポフェクション法
を用いて、１．０μｇの市販の線状化したバキュロウイ
ルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^ＴＭ ｂａｃｕｌ
ｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）とともに同時トランスフ
ェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^{Ｔ Ｍ}ウイル
スＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＴＮＦδ
を、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ， ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの無
菌ウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポフェク
チンおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混合し、
そして室温にて１５分間インキュベートする。次いで、
そのトランスフェクション混合物を、無血清グレース培
地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プレート内に播種さ
れたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に
滴下する。プレートを、新たに添加した溶液を混合する
ために、前後に振盪する。次いでプレートを、２７℃で
５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェク
ション溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎
児血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加す
る。プレートをインキュベーターに戻し、そして２７℃
で４日間培養を続ける。 【０２４１】４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅ
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）に記載されるようにプラ
ークアッセイを行う。青く染色されたプラークを産生す
るｇａｌ発現クローンの容易な同定および単離を可能に
するために、「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ）を有するアガロースゲルを用いる。（このタイ
プの「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細胞培養およびバキ
ュロウイルス学の使用者ガイド（９〜１０頁）において
も見い出され得る）。 【０２４２】連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に添加
する。適切なインキュベーションの後、青く染色された
プラークをエッペンドルフピペットのチップで拾う。次
いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌのグレ
ース培地を含むエッペンドルフチューブに再懸濁する。
寒天を、短時間の遠心分離により除去し、そして組換え
バキュロウイルスを含む上清を、３５ｍｍディッシュに
播種されたＳｆ９細胞に感染するために用いる。４日
後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いでそ
れらを４℃で保存する。適切に挿入されたＴＮＦδまた
はＴＮＦεを含むクローンを、制限マッピングおよび配
列決定を含むＤＮＡまたはＴＮＦε分析によって同定す
る。これを、本明細書中でＶ−ＴＮＦδと命名する。 【０２４３】Ｓｆ９細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳを補
充したグレース培地中で増殖させる。細胞を、約２（約
１〜約３）の感染多重度（ＭＯＩ）で組換えバキュロウ
イルスＶ−ＴＮＦδで感染させる。６時間後、その培地
を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いた
ＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇから入
手可能）に置き換える。４２時間後、５μＣｉの^３５Ｓ
−メチオニンおよび５μＣｉの^３５Ｓシステイン（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに
１６時間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離によ
り収集し、溶解し、そして標識されたタンパク質をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより可視
化する。 【０２４４】（実施例３） （ＴＦＮδ発現の組織分布） ヒト組織におけるＴＦＮδ
の発現レベルを調べるために、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏ
ｋら（前出）によって記載される方法を用いて、ノーザ
ンブロット分析を行った。全細胞ＲＮＡサンプルをＲＮ
Ａｚｏｌ^ＴＭ Ｂシステム（ＢｉｏｔｅｃｘＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． ６０２３ Ｓｏｕｔｈ
ＬｏｏｐＥａｓｔ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ ７７０
３３）で単離する。 【０２４５】約１０μｇの全ＲＮＡを組織サンプルから
単離した。ＲＮＡを、１％アガロースゲルを通じて強度
の変性条件下で電気泳動によりサイズ分離した。ＲＮＡ
をゲルからナイロンフィルター上にブロットし、次いで
フィルターを検出可能に標識したポリヌクレオチドプロ
ーブへのハイブリダイゼーションのために調製した。 【０２４６】ＴＦＮδをコードするｍＲＮＡを検出する
ためのプローブとして、寄託されたクローンのｃＤＮＡ
インサートのコード領域のアンチセンス鎖を、高い比活
性で標識した。ｃＤＮＡを、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキット
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）を用いてプライ
マー伸張により標識した。反応を、５０ｎｇのｃＤＮＡ
を用いて、供給者によって推奨される標準的な反応プロ
トコルに従って行った。標識ポリヌクレオチドを、Ｓｅ
ｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラム（５６０３ Ａｒａｐａｈｏ
ｅ Ｒｏａｄ， Ｂｏｕｌｄｅｒ， ＣＯ ８０３０３
の５−Ｐｒｉｍｅ−３−Ｐｒｉｍｅ， Ｉｎｃ． から
入手）を用いて、他の標識反応成分からカラムクロマト
グラフィーにより精製した。 【０２４７】標識プローブを、１，０００，０００ｃｐ
ｍ／ｍｌの濃度で、７％ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＰ
Ｏ_４、ｐＨ７．４の小用量において、６５℃にて一晩フ
ィルターにハイブリダイズした。 【０２４８】その後、プローブ溶液を捨て、フィルター
を室温にて２回洗浄し、そして０．５×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳで２回、６０℃で洗浄する。次いでフィルター
を乾燥させ、そして増感スクリーンを用いて−７０℃で
一晩フィルムに感光させる。 【０２４９】オートラジオグラフィーは、心臓におい
て、次いで胎盤および腎臓において最も高い発現を有し
て、ＴＦＮδのｍＲＮＡが１６個全ての組織において検
出されたことを示す。 【０２５０】（実施例４） （ヒトＴＦＮδまたはＴＦＮεの遺伝子治療的発現） 線
維芽細胞は皮膚生検により被験体から得る。得られた組
織を組織培養培地に置き、そして小片に分離する。組織
の小さな塊を、組織培養フラスコの湿った表面に置き、
それぞれのフラスコには約１０個の塊を置く。フラスコ
を逆さまにし、きつく閉め、そして室温に一晩放置す
る。室温で２４時間後、フラスコを逆さまにし、そして
組織の塊をフラスコの底に固定したままで、そして新鮮
な培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、およびス
トレプトマイシンを含むＨａｍのＦ１２培地）を加え
る。次いで、この組織を３７℃で約一週間インキュベー
トする。この時点で、新鮮な培地を添加し、そして数日
おきに次々に交換する。培養でのさらに２週間後、線維
芽細胞の単層が現れる。単層をトリプシン処理し、そし
てより大きいフラスコに移す。 【０２５１】遺伝子治療用のベクターを、発現されるべ
きフラグメントをクローニングするために制限酵素で消
化する。消化ベクターを、自己連結を防止するために仔
ウシ小腸ホスファターゼで処理する。脱リン酸化した直
線状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そして精製
する。 【０２５２】活性ＴＦＮδまたはＴＦＮεを発現し得る
ｃＤＮＡを単離する。必要な場合、ベクターへのクロー
ニングのためにフラグメントの端を修飾する。例えば、
５’オーバーハングを、ＤＮＡポリメラーゼで処理して
平滑末端を作製し得る。３’オーバーハング末端を、Ｓ
１ヌクレアーゼを用いて除去し得る。リンカーをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで平滑末端に連結し得る。等量のモロニー
マウス白血病ウイルス線形骨格およびＴＦＮδまたはＴ
ＦＮεフラグメントを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを
用いて連結する。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転
換するのに使用し、次いでこの細菌をカナマイシン含有
寒天上にプレートする。カナマイシン表現型および制限
分析は、ベクターが適切に挿入された遺伝子を有するこ
とを確認する。 【０２５３】パッケージング細胞を、組織培養中で、１
０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリン、およびストレプ
トマイシン添加Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地
（ＤＭＥＭ）中、コンフルエント濃度にまで増殖させ
る。標準的技術によりパッケージング細胞にＴＦＮδま
たはＴＦＮε遺伝子を含むベクターを形質導入する。パ
ッケージング細胞から回収されるＴＦＮδまたはＴＦＮ
ε遺伝子を含む感染性ウイルス粒子は、ここでプロデュ
ーサー細胞と呼ばれる。 【０２５４】新鮮な培地をプロデューサー細胞に加え、
適切なインキュベーション時間の後に培地をコンフルエ
ントプロデューサー細胞のプレートから回収する。培地
（感染性ウイルス粒子を含む）を、ミリポアフィルター
を通じて濾過し、剥離したプロデューサー細胞を除去す
る。次いでこの濾過した培地を線維芽細胞を感染させる
のに使用する。培地を線維芽細胞のサブコンフルエント
のプレートから除去し、そして即座に濾過した培地と交
換する。ポリブレン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を形質導入を容
易にするために培地に含ませ得る。適切なインキュベー
ションの後この培地を除去し新鮮な培地と交換する。ウ
イルス力価が高い場合、実質的にすべての線維芽細胞が
感染しており、選択は必要でない。力価が低い場合は、
拡大のための形質導入細胞を選択するためにｎｅｏやｈ
ｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベク
ターを使用する必要がある。 【０２５５】次いで、操作された線維芽細胞を、単独で
か、またはサイトデックス３ビーズのようなマイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントにまで増殖させた後の
いずれかでラットに注入し得る。注入された線維芽細胞
はＴＦＮδまたはＴＦＮε産物を産生し、そしてタンパ
ク質の生物学的作用は宿主に伝達される。 【０２５６】上述の説明および実施例において特に記載
された以外にも、本発明は実施され得ることが明らかで
ある。本発明の多くの改変および変形が上記の教示を考
慮すれば可能であり、従って添付の請求の範囲の範囲内
にある。 【０２５７】 【発明の効果】本発明は、ヒトＴＮＦδおよびＴＮＦε
ポリペプチド、それらのポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド、それらのポリペプチドを産生する方法
（特にそれらのポリヌクレオチドを発現させることによ
って）、ならびにそれらのポリペプチドのアゴニストお
よびアンタゴニストに関する。本発明は、さらに、この
ようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト、
およびアンタゴニストを応用に利用する方法に関する。
この応用は、部分的に研究、診断、および臨床技術に関
する。従って、本発明により、ヒトＴＮＦδおよびＴＮ
Ｆεポリペプチド、それらのポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド、それらのポリペプチドを産生する方
法、ならびにそれらのポリペプチドのアゴニストおよび
アンタゴニストが提供される。

【図面の簡単な説明】 以下の図面は本発明の特定の実施態様を示す。それら
は、例に過ぎず、本明細書に他に開示される本発明を限
定しない。 【図１Ａ】図１Ａは、ヒトＴＮＦδのヌクレオチドおよ
び推定されるアミノ酸配列を示す。 【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトＴＮＦδのヌクレオチドおよ
び推定されるアミノ酸配列を示す。 【図２Ａ】図２Ａは、ヒトＴＮＦεのヌクレオチドおよ
び推定されるアミノ酸配列を示す。 【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒトＴＮＦεのヌクレオチドおよ
び推定されるアミノ酸配列を示す。 【図３Ａ】図３Ａは、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＮＦδお
よびＴＮＦεポリペプチドのアミノ酸配間の類似性の領
域（アラインメント報告）を示す。 【図３Ｂ】図３Ｂは、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＮＦδお
よびＴＮＦεポリペプチドのアミノ酸配間の類似性の領
域（アラインメント報告）を示す。 【図４Ａ】図４Ａは、アミノ酸配列の関数としての、示
された技術によって推定されるＴＮＦδの構造的および
機能的特徴を示す。 【図４Ｂ】図４Ｂは、アミノ酸配列の関数としての、示
された技術によって推定されるＴＮＦδの構造的および
機能的特徴を示す。 【図５Ａ】図５Ａは、アミノ酸配列の関数としての、示
された技術によって推定されるＴＮＦεの構造的および
機能的特徴を示す。 【図５Ｂ】図５Ｂは、アミノ酸配列の関数としての、示
された技術によって推定されるＴＮＦεの構造的および
機能的特徴を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 597018381 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ, Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ニ ジアン アメリカ合衆国 メリーランド 20853, ロックビル， マノーフィールド ロー ド 5502 (72)発明者 ユ ゴ−リエン アメリカ合衆国 メリーランド 20878, ダーネスタウン， ストロー ベール レーン 13524 (72)発明者 レイナー エル． ジェンツ アメリカ合衆国 メリーランド 20904, シルバー スプリング， フェアランド パーク ドライブ 13404 (72)発明者 パトリック ジェイ． ディロン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92009, カールズバッド， スナイプ コート 1055 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA28 CA01 CA04 CA06 CA11 CA12 DA02 DA06 EA02 EA04 FA01 FA02 FA04 FA08 FA10 GA11 GA13 GA18 GA19 HA03 HA17

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 以下からなる群から選択されるメンバー
   に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレ
   オチドを含む、単離されたポリヌクレオチド： （ａ）図１に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド
   をコードするポリヌクレオチド； （ｂ）図２に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド
   をコードするポリヌクレオチド； （ｃ）図１のアミノ酸３９〜アミノ酸２３３を含むポリ
   ペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチ
   ドに相補的であるポリヌクレオチド；および （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のポリヌ
   クレオチドの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチ
   ド。