JPH11505712A - 新規のアポリポタンパク質ａ−ｉ変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、１５１位にシステインを含むヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉの変異体、対応する核酸、及びこの核酸を含むベクター、並びに、前記要素を含む医薬組成物及び特に遺伝子治療におけるその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規のアポリポタンパク質Ａ−Ｉ変異体 本発明は新規のアポリポタンパク質Ａ−Ｉ変異体に関する。また、この新規変 異体をコードする任意の核酸にも関する。更に、治療目的でのこれらのタンパク 質又は核酸の使用にも関する。より詳細には、本発明は特に１５１位に突然変異 を含むアポリポタンパク質Ａ−Ｉの新規変異体に関する。 アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）は、コレステロール、リン脂質及び トリグリセリドから構成される高分子複合体である高密度リポタンパク質（ＨＤ Ｌ）の主成分である。アポＡ−Ｉは２４３アミノ酸から構成されるタンパク質で あり、２６７残基のプレプロタンパク質として合成され、２８，０００ダルトン の分子量をもつ。プレプロ形態のアポＡ−Ｉはヒトでは肝臓と脳で合成される。 その後、この形態のタンパク質はプロタンパク質に分解され、血漿中に分泌され る。その後、プロアポＡ−Ｉは血管コンパートメント内でカルシウム依存性プロ テアーゼの作用により成熟タンパク質（２４３アミノ酸）に変換される。アポＡ −Ｉはリポタンパク質の代謝において構造と活性の役割をもち、アポＡ−Ｉは特 に血漿コレステロールのエ ステル化に関与するレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡ Ｔ）の補因子である。 ＨＤＬフラクションに含まれるコレステロール量とアポＡ−Ｉの血漿濃度はヒ トにおけるアテローム性動脈硬化症の発症の負の危険因子である。実際に疫学的 研究により、ＨＤＬコレステロール及びアポＡ−Ｉの濃度と心臓血管病の発症と の間の逆相関が立証されている（Ｅ．Ｇ．Ｍｉｌｌｅｒら，Ｌａｎｃｅｔ，１９ ７７：９６５−９６８）。他方、長寿は高レベルのＨＤＬコレステロールに関係 するらしい。最近では、ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉを発現するトランスジェ ニックマウスのモデルでアポＡ−Ｉの防御機能が立証されている（Ｒｕｂｉｎら ，Ｎａｔｕｒｅ）。また、ウサギにＨＤＬを注入すると病変の退行が誘導される （Ｂａｄｉｍｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５，１２３４−４１，１ ９９０）。ＨＤＬの防御効果と、特にコレステロールの逆輸送におけるＨＤＬの 役割（Ｆｒｕｃｈａｒｔら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８７：２２−２７，１９ ９３）及びＨＤＬの酸化防止作用（Ｆｏｒｔｅ Ｔ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉ ｎｉｏｎ ｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌｏｇｙ，５：３５４−３６４，１９９４）を説 明するために、種々のメカニズムが報 告されている。 アポＡ−Ｉをコードする遺伝子は単離され、配列決定されている（Ｓｈａｒｐ ｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（９） （１９８４） ３９ １７）。この遺伝子は長さ１８６３ｂｐであり、４個のエキソンと３個のイント ロンを含む。アポＡ−ＩをコードするｃＤＮＡも報告されている（Ｌａｗら，Ｐ ＮＡＳ ８１ （１９８４） ６６）。このｃＤＮＡは８４０ｐｂを含む（配列 番号１参照）。野生型のアポＡ−Ｉ以外に、野生型タンパク質に対して下表に示 す変異をもつ種々の天然変異株が従来技術に記載されている。 本発明は一連の新規のアポリポタンパク質Ａ−Ｉの変異体の同定に基づく。こ の一連の変異体は特に１５１位のアルギニン残基がシステイン残基で置換されて いる。本発明によるアポＡ−Ｉ変異体は顕著な治療特性をもつ。特に、非常に高 い抗粥腫形成防御性をもつ。例えばＨＤＬフラクション中のコレステロール濃度 が過度に低い状態は高トリグリセライド血症に結びつけられるが、このような状 態でこの変異体が存在するとアテローム性動脈硬化症の発症が防止されるため、 この突然変異アポＡ−Ｉは非常に強力な固有の防御機能をもつと考えられる。更 に、本発明によるとアポＡ−Ｉにシステインが存在するため、ジスルフィド架橋 を介して結合した二量体及び他の複合体の形成が生じる。このアポＡ−Ｉは血漿 中に遊離形態で生じ、それ自身二量体として結合しているか、又はＨＤＬに関連 する別の重要なタンパク質であり且つ同様にその配列中にシステインをもつアポ リポタンパク質Ａ−ＩＩと結合している。また、この突然変異体は１５１位にア ルギニンに関わる電荷をもたないため、血漿タンパク質の等電点電気泳動とそれ に続くアポＡ−Ｉのイムノアッセイにより可視化される。 本発明によるこの新規タンパク質は特に顕著な抗粥腫形成性 をもつため、心臓血管病の治療と予防に重要な治療上の利点を提供する。 従って、本発明の第１の主題は、１５１位にシステインを含むヒトアポリポタ ンパク質Ａ−Ｉの一連の変異体に関する。基本アポＡ−Ｉのアミノ酸配列は文献 に記載されている（前出のＬａｗ参照）。プレプロ領域（残基１〜２４）を含む この配列を配列番号１に示す。従って、本発明による変異体の１つの特徴は、基 本配列に存在するアルギニンを置換することにより、成熟アポＡ−Ｉの１５１位 （配列番号１の１７５位に対応）にシステインが存在する点である。本発明によ る好ましい変異体は配列番号２のペプチド配列を含み、更に好ましくは、ペプチ ド配列は配列番号１の配列の残基６８〜２６７を含み、残基１７５はシステイン により置換されている。 本発明による変異体は、天然アポＡ−Ｉに比較して１５１位にシステインをも つアポＡ−Ｉという意味で特にアポＡ−Ｉパリと呼ばれる。本発明による変異体 は更に、基本アポリポタンパク質Ａ−Ｉに比較して他の構造改変、特に他の突然 変異、欠失及び／又は付加も含んでいてもよい。特定実施態様によると、本発明 の変異体は残基のシステイン置換を導く他の突然変異も 含む。例えば別の特定変異体は変異体アポＡ−ＩパリとアポＡ−Ｉミラノに存在 する突然変異を兼備する。アポＡ−Ｉの性質を有意に変えないものであれば残基 に他の突然変異も存在していてもよい。これらの変異体の活性は特にコレステロ ール放出試験により確認することができる。 本発明による変異体は種々の方法で得られる。まずペプチド合成装置を使用す る当業者に公知の技術により化学的に合成することができる。基本アポＡ−Ｉを 突然変異させることによっても得られる。後述するように対応する核酸を細胞宿 主で発現させることにより得られる組換えタンパク質を利用すると有利である。 上述のように、本発明による変異体は単量体形態でも二量体形態でもよい。本 発明による変異体の配列には少なくともシステインが存在するので、実際にジス ルフィド結合により二量体を形成することができる。本発明による変異体２個か らなる二量体であるホモダイマー（例えばジアポＡ−Ｉパリ）でもよいし、本発 明による変異体と遊離システインをもつ別の分子とからなる二量体であるヘテロ ダイマー（例えばアポＡ−Ｉパリ：アポＡＩＩ）でもよい。 本発明の別の主題は、上記のようなアポリポタンパク質Ａ−Ｉ変異体をコード する核酸である。本発明の核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（Ｒ ＮＡ）でもよい。ＤＮＡとしては、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ ｇＤＮＡ）、ハイブリッド配列、合成配列又は半合成配列が挙げられる。更に、 例えばヌクレアーゼ耐性、細胞浸透性もしくは細胞ターゲッティング、治療効能 等を増すように化学的に改変した核酸でもよい。これらの核酸はヒト、動物、植 物、細菌、ウイルス、合成等に由来するものであり得る。これらの核酸は当業者 に公知の任意の技術により得られ、特にライブラリーのスクリーニング、化学的 合成、又はライブラリーのスクリーニングにより得られた配列の化学的もしくは 酵素的改変を含む混合法により得られる。 核酸はｃＤＮＡ又はｇＤＮＡが有利である。 本発明による核酸は配列番号２の配列を含むものが好ましい。配列番号１０の 配列を含むと更に好ましい。 本発明による核酸は標的細胞又は生物内で機能する転写プロモーター領域と、 ３’位に配置され、転写終結シグナルを表す領域と、ポリアデニル化部位を含む と有利である。これらの要 素の組合わせが発現カセットを構成する。プロモーター領域については、該当細 胞又は生物で機能できるという条件で、アポＡ−Ｉ又はアポＡ−Ｉの変異体の遺 伝子の発現に天然に関与するプロモーター領域が挙げられる。別の起源の領域で もよい（他のタンパク質の発現に関与する領域でもよいし、合成領域でもよい） 。特に、真核又はウイルス遺伝子のプロモーター配列が挙げられる。例えば、標 的細胞のゲノムに由来するプロモーター配列が挙げられる。真核プロモーターの うちでは、遺伝子の転写を特異的又は非特異的、誘導的又は非誘導、強く又は弱 く促進又は抑制する任意のプロモーター又は誘導された配列を使用することがで きる。特に、偏在プロモーター（ＨＰＲＴ、ＰＧＫ、ビメンチン、α−アクチン 、チューブリン等の遺伝子のプロモーター）、治療遺伝子プロモーター（例えば ＭＤＲ、ＣＦＴＲ、ＶＩＩＩ因子等の遺伝子のプロモーター）、組織特異的プロ モーター（例えばピルビン酸キナーゼ、ビリン、脂肪酸結合脳タンパク質、平滑 筋α−アクチン等の遺伝子のプロモーター）、更には刺激応答プロモーター（ス テロイドホルモンのレセプター、レチノイン酸のレセプター等）が挙げられる。 更に、ウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列でもよく、 例えばアデノウイルスのＥ１Ａ及びＭＬＰ遺伝子のプロモーター、ＣＭＶの初期 プロモーター、ＲＳＶのＬＴＲプロモーター等が挙げられる。更に、これらのプ ロモーター領域に活性化配列、調節配列、又は組織特異的もしくは優勢発現を可 能にする配列を付加して改変してもよい。 更に、核酸は標的細胞の分泌経路に合成産物を導くシグナル配列も含んでいて もよい。このシグナル配列はアポＡ−Ｉの天然シグナル配列でもよいが、他の任 意の機能的シグナル配列でもよいし、人工シグナル配列でもよい。 本発明による核酸は組換え宿主細胞で発現させてアポＡ−Ｉの組換え変異体を 作製するため、又は遺伝子もしくは細胞治療の適用で医薬として直接使用するこ とができる。 本発明による組換え変異体を作製するためには、自律又は組込み複製型のいず れでもよいプラスミド又はウイルスベクターに核酸を組込むと有利である。その 後、このベクターを使用して選択細胞集団にトランスフェクト又は感染させる。 こうして得られたトランスフェクト又は感染された細胞を、核酸の発現を可能に する条件で培養し、本発明によるアポＡ−Ｉの組換え変異体を単離する。組換え により本発明の変異体を作製するた めに使用可能な細胞宿主は真核宿主でも原核宿主でもよい。好都合な真核宿主と しては、動物細胞、酵母又は真菌類を挙げることができる。特に、酵母としては Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓ ｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ又はＨａｎｓｅｎｕｌａ属の酵母が挙げられる。動 物細胞としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＣＩ２７、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞等が挙げられ る。真菌類としては、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ亜種又はＴｒｉｃｈｏｄｅｒ ｍａ亜種が挙げられる。原核宿主としては、大腸菌、バチラス又はストレプトミ セスの細菌を使用するのが好ましい。こうして単離した変異体をその後、治療に 利用できるように包装し得る。 特に有利な実施態様によると、本発明による核酸は遺伝子又は細胞治療の適用 で医薬として直接使用する。このためには、治療しようとする部位に注射したり 、投与の目的で細胞と共にインキュベートする等の方法で使用することができる 。実際に、特定ベクターを用いずに裸の核酸を細胞に導入することができるとい う報告もある。しかし、本発明に関しては、（ｉ）細胞浸透効率、（ｉｉ）ター ゲッティング、（ｉｉｉ）細胞外及び細胞内安定性を改善することが可能な投与 ベクターを使用する ほうが有利である。 従って、特定実施態様によると、本発明は上記のような核酸を含むベクターに も関する。 種々の型のベクターを使用することができる。ベクターはウイルスベクターで も非ウイルスベクターでもよい。 好適実施態様によると、本発明のベクターはウイルスベクターである。 ウイルスベクターの使用は、ウイルスの天然トランスフェクション性に拠る。 従って、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイ ルス又はワクチンウイルスを使用することができる。これらのベクターはトラン スフェクションの点で特に有効である。 特にアデノウイルスについては、構造と性質が少しずつ異なる種々の血清型が 特性決定されている。これらの血清型のうち、本発明に関しては２もしくは５型 ヒトアデノウイルス（Ａｄ２又はＡｄ５）又は動物由来のアデノウイルス（国際 公開第ＷＯ９４／２６９１４号参照）を使用するのが好ましい。本発明に関して 使用可能な動物由来のアデノウイルスのうちでは、イヌ、ウシ、マウス（例えば Ｍａｖ１，Ｂｅａｒｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５ （１９９０） ８１）、ヤギ、ブタ、トリ又はサル（例えばＳＡＶ）由来 のアデノウイルスを挙げることができる。好ましくは、動物由来のアデノウイル スはイヌアデノウイルス、より好ましくはアデノウイルスＣＡＶ２［例えばマン ハッタン株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）］である。好ましくは 、本発明に関してはヒトもしくはイヌ由来又は混合起源のアデノウイルスを使用 する。 好ましくは、本発明の欠陥型アデノウイルスは、ＩＴＲと、パッケージングを 可能にする配列と、着目核酸を含む。より好ましくは、本発明のアデノウイルス のゲノムにおいて、少なくともＥ１領域は非機能的である。着目ウイルス遺伝子 は当業者の公知の任意の方法、特に全体的除去、置換、部分欠失、又は該当遺伝 子への１個以上の塩基の付加により非機能的にすることができる。このような改 変は、例えば遺伝子工学技術又は突然変異誘発物質で処理することによりｉｎ ｖｉｔｒｏ（単離したＤＮＡで）又はｉｎ ｓｉｔｕで得られる。特にＥ３（Ｗ Ｏ９５／０２６９７）、Ｅ２（ＷＯ９４／２８９３８）、Ｅ４（ＷＯ９４／２８ １５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７）及びＬ５（ＷＯ９５／ ０２６９７）等の他の領域 も改変してもよい。特に好ましい実施態様によると、本発明ではＥ１及びＥ４領 域の全部又は一部を欠失する組換えアデノウイルスを使用する。この型のベクタ ーは実際に特に有利な安全性を提供する。 本発明による欠陥型組換えアデノウイルスは当業者に公知の任意の技術により 作製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ １０１ （１９９１） １９５，ヨーロッパ特許第１８５５７３号； Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ Ｊ．３ （１９８４）２９１７）。特に、アデノウイルスと特に本発明の核酸又はカセッ トをもつプラスミドとの相同的組換えにより作製することができる。相同的組換 えは適当な細胞系に前記アデノウイルスとプラスミドを同時トランスフェクショ ン後に生じる。使用する細胞系は、好ましくは（ｉ）前記要素により形質転換可 能であり、（ｉｉ）組換えの危険を避けるために好ましくは組込み形態で欠陥ア デノウイルスのゲノムの部分を相補することが可能な配列を含んでいるべきであ る。細胞系の例としては、特にアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左側部分（１２ ％）をそのゲノムに組込んだヒト胎児腎細胞系２９３（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇ ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６ （１９７７） ５９）を挙げるこ とができる。他の系は国際公開第ＷＯ９４／２６９１４号及びＷＯ９５／０２６ ９７号に記載されている。 その後、増殖したアデノウイルスを実施例に記載するように標準分子生物学技 術により回収及び精製する。 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、比較的小寸法のＤＮＡをもつウイルスであ り、これに感染する細胞のゲノムに安定且つ部位特異的に組込まれる。アデノ随 伴ウイルスは細胞増殖、形態又は分化に影響することなく広範な細胞に感染する ことができる。また、ヒトで疾病に関与しないと思われる。ＡＡＶのゲノムは既 にクローニングされ、配列及び特性を決定されている。前記ゲノムは約４７００ 塩基を含み、ウイルスの複製起点として機能する約１４５塩基の逆方向反復領域 （ＩＴＲ）各末端に含む。ゲノムの残余はパッケージング機能をもつ２つの必須 領域に分けられ、ゲノムの左側部分はウイルス複製とウイルス遺伝子の発現に関 与するｒｅｐ遺伝子を含み、ゲノムの右側部分はウイルスのキャプシドタンパク 質をコードするｃａｐ遺伝子を含む。 ＡＡＶから誘導されるベクターを遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖ ｏ導入に利用することは文献に記載されてい る（特に国際公開第ＷＯ９１／１８０８８号、ＷＯ９３／０９２３９号、米国特 許第４，７９７，３６８号、５，１３９，９４１号、ヨーロッパ特許第４８８５ ２８号参照）。これらの文献は、ＡＡＶから誘導され、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ 遺伝子を欠失し、着目遺伝子で置換された種々の構築物と、前記着目遺伝子を（ 培養細胞に）ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は（生物に直接）ｉｎ ｖｉｖｏ導入するため のその使用について記載している。本発明による欠陥型組換えＡＡＶは、ヒトヘ ルパーウイルス（例えばアデノウイルス）に感染させた細胞系に、ＡＡＶの２つ の逆方向反復領域（ＩＴＲ）で挟まれた本発明の核酸又はカセットを含むプラス ミドと、ＡＡＶのパッケージング遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）をもつプラ スミドを同時トランスフェクトすることにより作製することができる。生成した 組換えＡＡＶをその後、慣用技術（特に国際公開第ＷＯ９５／０６７４３号参照 ）により精製する。 ヘルペスウイルスとレトロウイルスに関しては、組換えベクターの構築につい て文献に広く記載されており、特にＢｒｅａｋｆｉｅｌｄら，Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ ｏｇｉｓｔ ３ （１９９１） ２０３； ヨーロッパ特許第４５３２４２号及 び１７８２２０号、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７ （１９８ ５） ２３５； ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３ （１９８ ５） ６８９等を参照されたい。特に、レトロウイルスは分裂細胞に選択的に感 染する組込みウイルスである。従って、癌に適用するのに有利なベクターである 。レトロウイルスのゲノムは主に２つのＬＴＲと、パッケージング配列と、３つ のコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を含む。レトロウイルスから 誘導される組換えベクターでは、一般にｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子が完全 又は部分的に欠失しており、着目異種核酸配列で置換されている。これらのベク ターは種々の型のレトロウイルスから作製することができ、特にＭｏＭｕＬＶ（ 「モロニーマウス白血病ウイルス」、別称ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＶ（「モロニーマ ウス肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベー肉腫ウイルス」）、ＳＮＶ（「脾 臓壊死ウイルス」）、ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）又はフレンドウイルス 等のレトロウイルスから得られる。 本発明の核酸又はカセットを含む組換えレトロウイルスを構築するためには、 特にＬＴＲとパッケージング配列と核酸又はカセットを含むプラスミドを構築し た後、このプラスミドを使用して、欠陥レトロウイルス機能をプラスミドにトラ ンス導入 することが可能なパッケージング系と呼ばれる細胞系にトランスフェクトする。 従って、一般にパッケージング系はｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を発現させ ることができる。このようなパッケージング系は従来技術に記載されており、特 にＰＡ３１７系（米国特許第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣＲＩＰ系（ＷＯ ９０／０２８０６）及びＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２系（ＷＯ８９／０７１５０）が 挙げられる、更に、組換えレトロウイルスは転写活性を抑制するようにＬＴＲに 改変を含んでいてもよいし、ｇａｇ遺伝子の一部を含む伸長されたパッケージン グ配列を含んでいてもよい（Ｂｅｎｄｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１ （１９８ ７） １６３９）。生成した組換えレトロウイルスをその後、慣用技術により精 製する。 本発明を実施するには、欠陥型組換えアデノウイルス又はレトロウイルスを使 用すると特に有利である。これらのベクターは実際にアポリポタンパク質をコー ドする遺伝子を導入するために特に有利な性質をもつ。本発明によるアデノウイ ルスベクターは、精製懸濁液の直接ｉｎ ｖｉｖｏ投与、又は移植の目的で特に 自律細胞のｅｘ ｖｉｖｏ形質転換に特に有利である。更に、本発明によるアデ ノウイルスベクターは、特に感染効率 が非常に高く、少量のウイルス懸濁液から感染させることができるなどの重要な 利点がある。 この点で、本発明は好ましくは上記のようなアポリポタンパク質Ａ−Ｉの変異 体をコードするＤＮＡをゲノムに挿入した欠陥型組換えアデノウイルスに関する 。 本発明の特に有利な別の実施態様によると、アポＡ−Ｉの変異体をコードする 配列を含むレトロウイルスベクターの産生系をｉｎ ｖｉｖｏ移植に使用する。 このために使用可能な系は、特に本発明によるアポＡ−Ｉの変異体をコードする 核酸を含むレトロウイルスを産生できるように改変されたＰＡ３１７（米国特許 第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣｒｉｐ（ＷＯ９０／０２８０６）及びＧＰ ＋ｅｎｖＡｍ−１２（米国特許第５，２７８，０５６号）細胞である。 本発明の別の態様によると、使用するベクターは化学的ベクターである。本発 明によるベクターは実際に真核細胞への核酸の導入及び発現を助長することが可 能な非ウイルス物質でもよい。化学的又は生化学的ベクターは、特に便利で安全 であり、トランスフェクトしようとするＤＮＡの大きさに関して理論的に制限が ないという理由で天然ウイルスの代替物として有利で ある。 これらの合成ベクターは、トランスフェクトしようとする核酸を導入可能とし 、その細胞への結合と形質膜及び場合により２つの核膜の通過を助長するという ２つの主要な機能をもつ。核酸のポリアニオン性を緩和するために、非ウイルス 性ベクターは全てポリカチオン電荷をもつ。 開発されている合成ベクターのうちでは、ポリリジン、（ＬＫＬＫ）ｎ、（Ｌ ＫＫＬ）ｎ、ポリエチレンイミン及びＤＥＡＥデキストラン型のカチオンポリマ ー、又はカチオンもしくは脂質リポフェクタントが最も有利である。これらのベ クターはＤＮＡを導入可能とし、細胞膜との結合を助長する性質をもつ。これら の合成ベクターのうちでは、リポポリアミン（リポフェクタミン、トランスフェ クタム等）及び種々のカチオン又は中性脂質（ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ 等）を挙げることができる。より最近では、レセプターにより仲介される標的指 向性トランスフェクションの概念が生まれており、これは、グラフトしたい細胞 型の表面に存在する膜レセプターのリガンドとカチオンポリマーとの化学結合に よる膜と複合体との結合を導きながら、カチオンポリマーによりＤＮＡを移入す る原理を利 用するものである。例えば、トランスフェリンレセプター、インスリンレセプタ ー又は肝細胞のアシアログリコプロテインレセプターのターゲッティングが報告 されている。 本発明は、上記のようなアポリポタンパタ質Ａ−Ｉの変異体をコードする核酸 の挿入により遺伝的に改変された任意の細胞にも関する。有利には、ｉｎ ｖｉ ｖｏ投与又は移植することが可能な哺乳動物細胞に関する。特に、繊維芽細胞、 筋芽細胞、肝細胞、角化細胞、内皮細胞、上皮細胞、グリア細胞等が挙げられる 。細胞はヒトに由来するものが好ましい。患者から採取し、治療特性を与えるよ うに本発明による核酸でｅｘ ｖｉｖｏ改変した後、患者に再投与する自律細胞 が特に有利である。 本発明による細胞は一次培養物から得られる。一次培養物は当業者に公知の任 意の技術により採取した後、その増殖を可能にする条件で培養する。特に繊維芽 細胞は、例えばＨａｍ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１ａ（１９８ ０）２５５］により記載されている方法に従って生検から容易に得ることができ る。これらの細胞を直接使用して（ウイルス又は化学的ベクターにより）本発明 の核酸を挿入してもよいし、その後の使用の目的で自律バンクを樹立するために 例えば凍結に より保存してもよい。本発明による細胞は例えば予め樹立されたバンクから得ら れる二次培養物でもよい（例えばヨーロッパ特許第２２８４５８号、２８９０３ ４号、４０００４７号、４５６６４０号参照）。 特に培養細胞に本発明の組換えウイルスを感染させると、生物学的に活性なア ポＡ−Ｉの変異体を生産する能力を与えることができる。感染は当業者に公知の 技術によりｉｎ ｖiｔｒｏで実施される。特に、使用する細胞の種類と細胞１ 個当たりの所望のウイルスコピー数に応じて、当業者は感染多重度と場合により 実施する感染サイクル数を調整できる。当然のことながら、細胞をｉｎ ｖｉｖ ｏ投与に用いる場合には適当な滅菌条件下でこれらの段階を実施しなければなら ない。細胞感染に使用する組換えウイルスの量は所期目的に応じて当業者により 調整することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ投与について上述した条件はｉｎ ｖｉ ｔｒｏ感染にも当てはまる。レトロウイルスを感染させるには、感染させたい細 胞と本発明による組換えレトロウイルスの産生細胞を同時培養してもよい。こう すると、レトロウイルスの精製を省略できる。 本発明の別の主題は、上記核酸の挿入により遺伝的に改変さ れた哺乳動物細胞と細胞外マトリックスを含む移植片に関する。好ましくは、本 発明による移植片は１０⁵〜１０¹⁰個の細胞を含む。より好ましくは、１０⁶〜１ ０⁸個の細胞を含む。細胞は、上記核酸をゲノムに挿入した組換えウイルスの産 生細胞でもよい。 より詳細には、本発明の移植片において細胞外マトリックスはゲル化剤化合物 と場合により細胞のアンカリングを可能にする支持体を含む。 本発明による移植片を作製するには、種々のゲル化剤を使用することができる 。ゲル化剤を使用してゲルの構成をもつマトリックスに細胞を封入し、場合によ り支持体への細胞のアンカリングを助長する。従って、種々の細胞接着物質をゲ ル化剤として使用することができ、例えば、特にコラーゲン、ゼラチン、グリコ サミノグリカン、フィブロネクチン、レクチン等を使用できる。本発明ではコラ ーゲンを使用するのが好ましい。ヒト、ウシ又はマウス由来のコラーゲンが挙げ られる。Ｉ型コラーゲンを使用すると特に好ましい。 上述のように、本発明による組成物は細胞のアンカリングを可能にする支持体 を含むと有利である。アンカリングなる用語 は、細胞の支持体への接着及び／又は結合をもたらす任意の形態の生物学的及び ／又は化学的及び／又は物理的相互作用を意味する。また、使用する支持体を細 胞で覆ってもよいし、この支持体の内部に細胞を取り込んでもよいし、その両方 でもよい。本発明では非毒性及び／又は生体適合性の固体支持体を使用するのが 好ましい。特に、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）繊維又は生物由来の 支持体（サンゴ、骨、コラーゲン等）を使用することができる。 本発明による移植片は生物の種々の部位に移植できる。特に、移植は腹腔内、 皮下組織内（恥骨領域、周骨窩、鼠蹊窩等）、臓器内、筋肉内、腫瘍内、中枢神 経系内、又は粘膜下で実施できる。本発明による移植片は生物体内へのアポＡ− Ｉ変異体の放出を制御できるという点で特に有利である。まず感染多重度と移植 細胞数により放出を決定する。次に、移植片を取出して処置を最終的に停止する か、又は治療遺伝子の発現を誘導もしくは抑制することができる調節可能な発現 系を使用することにより放出を制御できる。 本発明の変異体の特に顕著な抗粥腫形成性により、核酸は心臓血管病（アテロ ーム性動脈硬化症、再発狭窄症等）の治療及 び予防における新規医薬を構成する。 この点で、本発明は上記のようなアポリポタンパク質Ａ−Ｉの変異体及び／又 は核酸及び／又はベクター及び／又は遺伝的に改変された細胞を含む任意の医薬 組成物に関する。 従って、本発明は特に心筋梗塞、アンギナ、突然死、再発狭窄症、心臓代償不 全及び脳血管発作等の心臓血管病の分野でリポタンパク異常血症に関連する疾病 の新規治療又は予防手段を提供する。より一般には、このアプローチはアポリポ タンパク質Ａ−Ｉの遺伝的又は代謝的特性の欠陥の改善が必要とされる各症例に 非常に有望な治療処置手段を提供する。 以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は非限定的な 例示とみなすべきである。図面の説明 図１はプラスミドＰＸＬ２１１６の制限地図である。 図２は患者のエキソン４をもつファージＭ１３の構築図である。 図３は突然変異ＰＸＬ２１１６をもつベクターの構築図である。 図４は温度の関数として比濁分析結果を示す。 図５はゲル濾過プロフィールを示す。 図６は異なる複合体についてトリプトファンの蛍光と各フラクション中のリン 脂質濃度を示す。実施例 実施例１：アポＡ−Ｉ変異体の同定 特定脂質バランスにより選択した患者から変異体アポＡ−Ｉパリを同定単離し た。より詳細には、以下の脂質バランスを示す患者を選択した（サンプル種：血 清）。 予期しないことであったが、この患者はＨＤＬ濃度が非常に低く高トリグリセ ライド血症であったにも拘わらず、アテロー ム性動脈硬化症の徴候を全く示さなかった。このため、本発明者らはこの防御の 原因を追及することにした。血漿からアポＡ−Ｉパリを含むＨＤＬの単離 一晩絶食後にアポＡ−Ｉパリの遺伝子をもつ被検者から採血する。血液を４℃ で低速遠心分離（２０００ｇ，３０分）して血漿を調製する。密度１．０６３〜 １．２１ｇ／ｍｌの連続超遠心により高密度リポタンパク質を調製する（Ｈａｖ ｅｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４： １３４５−５４，１９５５）。次 に、ＨＤＬを含むフラクションを緩衝液１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１ ％ナトリウムアジド（ｐＨ７．４）で透析する。アポＡ−Ｉパリの二量体の同定 透析したＨＤＬフラクションをジエチルエーテル／エタノール（３／１ｖ／ｖ ）混合物で脱脂し、Ｌｏｗｒｙ法（Ｌｏｗｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， １９３：２６５−７５，１９５１）によりタンパク質濃度を推定する。ＨＤＬフ ラクションのタンパク質を非還元条件下でＳＤＳの存在下にポリアクリルアミド ゲル上で泳動させる。この泳動により患者のＨＤＬの種々のタンパク質のサイズ を同定できる。この分析の結果、正常サイズ のアポＡ−Ｉ及びアポＡ−ＩＩに対応するタンパク質の存在以外に、アポＡ−Ｉ の二量体と、アポＡ−Ｉ及びアポＡ−ＩＩの複合体とに対応する高分子量のタン パク質の存在が判明する。これらの複合体にアポＡ−ＩとアポＡ−ＩＩが存在す ることは、特異的イムノアッセイにより確認した。突然変異アポＡ−Ｉの電荷差の実証 以下のプロトコール（Ｍｅｎｚｅｌ，Ｈ．Ｊ．とＵｔｅｒｍａｎｎ，Ｇ．，Ｅ ｌｅｃｔｒｏｆｏｒｅｓｉｓ，７： ４９２−４９５，１９８６）に従い、血漿 から突然変異アポＡ−Ｉの直接的検出を実施した。即ち血漿２０μｌをエタノー ル／エーテル混合物で一晩脱脂し、緩衝液に再懸濁する。５μｌのアリコートを 等電点電気泳動ゲル（ｐＨ４〜６．５、Ｐｈａｒｍｏｌｙｔｅ）で電気泳動させ 、次いでタンパク質をナイロンメンブレンに移す。ヒト抗アポＡ−Ｉ抗体を用い る免疫反応によりアポＡ−Ｉに対応するバンドを検出する。 ＨＤＬタンパク質から突然変異アポＡ−Ｉを検出することもできる。透析した ＨＤＬフラクションをジエチルエーテル／エタノール（３／１，ｖ／ｖ）で脱脂 し、Ｌｏｗｒｙ法（Ｌｏｗｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３：２６５ −７５，１９５１）に よりタンパク質濃度を推定する。タンパク質約１００μｇを等電点電気泳動ゲル （ｐＨ４〜６．５、Ｐｈａｒｍｏｌｙｔｅ）で電気泳動させた後、クーマシーブ ルー染色によりタンパク質を検出する。この方法によると、突然変異をもつ患者 のアポＡ−Ｉのイソ形の大半はアノード側に移動することが判明し、これは正常 アポＡ−Ｉの電荷に対して−１の電荷差に対応する。実施例２：遺伝子及び突然変異の同定 Ｍａｄｉｓｅｎら（Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ，２７： ３７９−３ ９０，１９８７）の方法により全血から患者のゲノムＤＮＡを単離した。次に、 アポＡ−Ｉの遺伝子をＰＣＲ技術により増幅した。このために、 −１０×緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３；５００ｍＭ Ｋ Ｃｌ； １５ｍＭ ＭｇＣｌ₂； ０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）１０μｌ、 −２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）１０μｌ、 −各プライマー２０ｐｍｏｌ、 −Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）２．５Ｕ、 −Ｈ₂Ｏ 全体で１００μｌとなるまでの適量 の混合物に精製ゲノムＤＮＡ １μｇを導入して増幅反応を実施した。 増幅に使用したプライマーは以下の通りである。 プライマーＳｑ５４９０及びＳｑ５４９１はアポＡ−Ｉの遺伝子のエキソン２ 及び３に対応する５０８ｐｂフラグメントを増幅し、プライマーＳｑ５４９２及 びＳｑ５４９３はこの遺伝子のエキソン４に対応する６６４ｐｂフラグメントを 増幅する。 次に増幅産物（５０８及び６６４ｐｂの２つのＰＣＲフラグメント）を配列決 定した。このために、ＰＣＲフラグメント配列決定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ） を使用して直接配列決定する第１の方法を使用した。配列決定に使用したプライ マーはＰＣＲプライマーであるが、フラグメントの内部プライマーを使用しても よい（下記プライマーＳ４、Ｓ６及びＳ８参照）。 ＰＣＲフラグメントをベクターＭ１３ ｍｐ２８にクローニ ングする第２の配列決定方法も実施した。Ｍ１３の２本鎖ＤＮＡをＥｃｏＲＶに より開裂した後、脱リン酸化した。ＰＣＲフラグメントをＫｌｅｎｏｗで処理し 、リン酸化し、ベクターＭ１３に連結した。次に白色プラークを取り出し、増幅 後に触媒（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）上で精製した１本鎖ＤＮＡを −２０蛍光プライマー（ＰＲＩＳＭ染料プライマーキット及びプロトコール番号 ４０１３８６、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）又は配向後のフラグメン トの内部プライマーにより配列決定した。その後、蛍光ジデオキシヌクレオチド 法を使用する（キットＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ及びプロトコール 番号４０１３８８、Ａｐｐｌｉeｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）。 次に、数個のクローンからの配列をまとめ、アポＡ−Ｉの配列と比較した。成 熟アポＡ−Ｉのアミノ酸１４８〜１５４の配列（配列番号１の配列の残基１７２ 〜１７８に対応）を下記に示す。 配列決定したクローンの一部でアミノ酸１５１をコードするコドンの最初の塩 基に突然変異Ｃ→Ｔが検出され、システインをコードしていることが判明した（ 下記配列番号２の配列参照）。従って、この突然変異は選択した患者ではヘテロ 接合状態で存在している。 本発明による変異体アポＡ−ＩパリをコードするｃＤＮＡ全体を配列決定した 。この配列の一部を配列番号１０に示す。実施例３：プラスミド発現ベクター（突然変異ｐＸＬ２１１６）の構築 アポＡ−Ｉパリは患者のアポＡ−Ｉの遺伝子のエキソン４の配列に位置する点 突然変異をもつ。発現ベクターの構築ストラテジーは、アポＡ−Ｉの発現ベクタ ー（ベクターｐＸＬ２１１６、図１）で患者の遺伝子からのエキソン４に対応す る領域に置換 することからなる。 ３．１．Ｍ１３中にクローニングした患者のエキソン４の使用 患者の細胞から精製したＤＮＡからＰＣＲによりエキソン４を調製し、ファー ジＭ１３ｍｐ２８のポリリンカーのＥｃｏＲＶ部位に挿入した（図２）。 アポＡ−Ｉのフラグメントを突然変異をもつＭ１３からのフラグメントで置換 することにより突然変異を誘発する。従って、消化後のｐＸＬ２１１６からのベ クターと消化後の２本鎖Ｍ１３からのインサートに付着末端が形成されるように ２つのベクターに適切な酵素を選択しなければならない。 ３．２．制限酵素の選択 −Ｂｓｕ３６１はＭ１３及びｐＸＬ２１１６に突然変異の上流に唯一の制限部 位をもつ。 −クローニング技術によりアポＡ−Ｉの３’末端に唯一の制限部位をもつと共 にＭ１３のポリリンカーに制限部位をもつＢａｍＨＩで消化すると、 １）ｐＸＬ２１１６からのベクターとＭ１３からのインサートを連結することが でき、 ２）これは、Ｍ１３からの突然変異フラグメントの挿入を酵素 消化により確認するために有効なポリリンカーフラグメントを組込むことにより 実施できる。 このポリリンカーフラグメントは停止コドンの後に位置するので、アポＡ−Ｉ のコーディング配列を全く変化させないことに留意すべきである。 従って、アポＡ−Ｉの５’末端にヌクレオチド配列がクローニングされたヒス チジンに富むポリペプチドも合成されよう。 ３．３．ベクターの構築（図３） −２本鎖にしたＭ１３をＢｓｕ３６１／ＢａｍＨＩで消化し、消化産物をゲル にロードする。こうして生成されたインサートは十分な量で回収され、ちょうど １Ｄｂのサイズをもつ。 −ｐＸＬ２１１６を同一酵素で消化するが、精製はしない。 消化産物の再連結を避けるように、フラグメントＢｓｕ３６１／ＢａｍＨＩの 内部の２つの制限部位を認識するＸｈｏＩにより消化を行う。 実際には、まず脱リン酸化を試みたが、ペトリ皿での結果は非常に不良で、試 験した２４個のクローンのうちで陽性クローンは皆無であった。 連結に最適なベクターとインサートの量を調べた処、ベクタ ー５０ｎｇ、インサート１５ｎｇであった。 ＤＨ５ａ株を以下の３種の連結の産物： −Ｂｓｕ３６１とＢａｍＨＩで消化したベクター、但しリガーゼを加えない（陰 性連結対照）、 −消化産物＋リガーゼ −消化産物＋インサート＋リガーゼ で形質転換させる。 コンピテント細胞もｐＵＣ１９で形質転換させ、形質転換効率を試験する。 ＬＢ培地、クロラムフェニコール（ＢＬ２１株の選択）、アンピシリン（プラ スミドを組込んだ株の選択）を加えた培養皿で形質転換させた細胞の結果を以下 に示す。 ペトリ皿４から４８個のクローンを再単離する。 陽性クローン（即ちＭ１３の突然変異フラグメントを挿入したクローン）を識 別するために、４８個のクローンの各々について精製により得られたプラスミド ＤＮＡを酵素ＮｄｅＩで消化する。 Ｍ１３からのインサートが確かに挿入されている場合には、ゲル上に４．５ｋ ｂと１ｋｂの２つのフラグメントが検出される。 連結が全く生じていない場合には、数個のバンドが得られるか、単に直鎖化プ ラスミドが得られる（一般的な場合）。 ゲルの結果によると、クローン７、８、１３、１６、２６は適正と思われる。 明白な結果を与えるクローンを選択する。 選択したクローンの配列を完全に確認するように、酵素消化を６回行う。 こうしてポリリンカー、従ってインサートの存在を確認するが、連結が生じた ことも確認しなければならない。 当然のことながら、プラスミドのサイズが正しく、即ちｐＸＬ２１１６のサイ ズに等しいならば、連結は期待通りである。 突然変異の頻度が非常に低い場合を除き、新規にクローニン グされたアポＡ−Ｉの配列は正しい筈である。 従って、クローン８は正しく突然変異したプラスミドｐＸＬ２１１６をもつ。実施例４：組換えアポＡ−Ｉ変異体の発現 本実施例は組換えアポＡ−Ｉ変異体の作製方法に関する。この方法は細菌で実 施した。このために他の発現系（酵母、動物細胞等）も使用可能である。 ４．１．原理 Ｔ７プロモーター及びターミネーターの制御下にプラスミドを細菌で発現させ た。ラクトースオペロンのインデューサーであるイソプロピル−ｂ−チオガラク トピラノシド（ＩＰＴＧ）はこの系にＴ７ＲＮＡポリメラーゼの合成を誘導し、 このＲＮＡはその後、Ｔ７プロモーターに特異的に結合し、組換えタンパク質の 遺伝子の転写を開始する。ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ターミネーターにより停止 し、転写が着目配列の下流を超えて進行するのを妨げる。 リファンピシンは大腸菌の内因性ＲＮＡポリメラーゼ活性を阻害する抗生物質 である。従って、細菌タンパク質の合成を阻害し、即ちプロテアーゼの合成を阻 害して着目タンパク質の分 解を制限すると同時に、汚染性細菌タンパク質の合成を阻害して着目タンパク質 の発現を増幅する。 ４．２．プロトコール 発現に使用した菌株は大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＬｙｓ Ｓである。プラス ミドＤＮＡを慣用技術に従って形質転換により大腸菌に導入する。培養物を２５ ％グリセロールの存在下に−２０℃で凍結懸濁液として保存し、５００μｌフラ クションずつに小分けする。 Ｍ９アンピシリン培地１０ｍｌに凍結懸濁液数滴を加えて前培養を開始した後 、３７℃で一晩インキュベートする。１リットル容エルレンマイヤーフラスコに 前培養物を接種し、６１０ｎｍで０．５〜１のＯＤが得られるまで３７℃の震盪 機に入れておく。次に最終濃度１ｍＭまでＩＰＴＧ（Ｂａｃｈｅｍ ｒｅｆ Ｑ −１２８０）を加える。３７℃で１５分間インキュベーション後に、最終濃度１ ００μｇ／ｍｌまでリファンピシン（Ｓｉｇｍａ）を加える。次に、１時間培養 後、細胞を遠心分離（１５分間、８０００ｒｐｍ）により回収し、１５％アクリ ルアミドゲル上で変性条件下の電気泳動とイムノブロットにより発現を確認する 。 得られた結果によると、突然変異タンパク質は良好な発現率で発現し、抗アポ Ａ−Ｉポリクローナル抗体により有効に検出される。実施例５：組換えアポＡ−Ｉ変異体の精製 本実施例は、本発明による組換えアポＡ−Ｉ変異体を精製できる有効な方法に 関する。他の方法も当然使用できる。 タンパク質は大腸菌の細胞質で発現されるので、その抽出にはまず細胞溶解を 行い、次いで核酸を除去することが必要である。 ５．１．細菌溶解 培養物の遠心分離後、プロテアーゼ阻害剤とβ−メルカプトエタノールの存在 下に静かに撹拌しながら細菌沈渣を溶解用緩衝液に再懸濁する。 β−メルカプトエタノールは２個のシステイン残基の間に形成されるジスルフ ィド架橋を開裂する還元剤である。大腸菌の細胞質にジスルフィド架橋は形成さ れないが、一旦タンパク質を抽出すると還元剤の存在が必要になる。実際に、溶 解用緩衝液にβ−メルカプトエタノールを加えると、細菌タンパク質のシステイ ン残基と組換えタンパク質のシステイン残基の間の架 橋の形成を避けることができる。 細胞溶解は氷中３×５分間の音波処理（Ｖｉｒａｃｅｌｌｓ振動子材料、パル スモード、出力制御５）により得られ、その後、１００００ｒｐｍで遠心分離（ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１Ｍ／Ｅ、ローターＪＡ１０で４℃で１時間）して細 胞破片を除去する。タンパク質定量はＢｒａｄｆｏｒｄの比色分析法により上清 で実施する。 ５．２．核酸沈殿 核酸沈殿は４℃で１時間磁気撹拌下に１０％硫酸ストレプトマイシン溶液をタ ンパク質１０ｇ当たり１０ｍｌの割合で用いて溶解上清上で実施する。１０００ ０ｒｐｍで遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１ Ｍ／Ｅ、ローターＪＡ１０ で４℃で１時間）して核酸を除去し、上清のタンパク質濃度を比色定量により測 定する。 これらの２段階後に、着目核酸を含む全ての細胞内タンパク質を含む既知濃度 のタンパク質溶液が得られる。この溶液をクロマトグラフィー技術により精製す る（→ゲル濾過クロマトグラフィー→アフィニティークロマトグラフィー）。 ５．３．ゲル濾過クロマトグラフィー この段階の目的は、アフィニティークロマトグラフィーに必要な条件に有害な 分子であるＥＤＴＡを除去することである。このために、Ｔｒｉｓ−アクリルＧ Ｆ ０５（Ｓｅｐｒａｃｏｒ）担体を用いた。このゲルは分子量（ＭＭ）３００ 〜２５００ダルトンの分子を分離し、ＭＭが２５００ダルトンを上回る分子（タ ンパク質を含む）を排除することができる。このゲルは良好な耐圧性をもつとい う利点もあり、分離能を変えずに高流速で操作することができる。細菌溶解物の クロマトグラフィーはｐＨ８のリン酸緩衝液で実施する。排除容量中のタンパク 質濃度を測定し、最終的にｐＨ８のリン酸緩衝液で希釈して４ｍｇ／ｍｌとする 。 この段階の代わりにＰＢＳ２×１０リットルで透析してもよい。その後、タン パク質−タンパク質相互作用の低下により次の精製段階を助長する洗剤である２ ５ｍＭ Ｈｅｃａｍｅｇの存在下にタンパク質溶液をおく。 ５．４．アフィニティークロマトグラフィー原理 組換えタンパク質は、６個の連続ヒスチジン残基の存在によりニッケルイオン （Ｎｉ²⁺）に対して特に高い親和性をもつ （１５）。これらのＮｉ²⁺イオンをニトリロ酢酸（ＮＴＡ）によりアガロースマ トリックスに結合する。ヒスチジンのイミダゾールとニッケルイオンの間に金属 キレート結合が生じ、この結合はイオン結合よりも強く、共有結合よりも弱い。プロトコール アガロースＮｉＮＴＡゲル（Ｑｉａｇｅｎ）の結合能はゲル１ｍｌ当たりタン パク質２ｍｇである。２５ｍＭ Ｈｅｃａｍｅｇを添加した緩衝液（ｐＨ８）で このゲルを平衡化する。汚染性細菌タンパク質はｐＨ８で保持されず、又はｐＨ ６で除去され、着目タンパク質はｐＨ５で回収される。これらの段階は２５ｍＭ Ｈｅｃａｍｅｇの存在下で実施する。 ｐＨ５で溶出するフラクション（２ｍｌ）に１Ｍ ＮａＯＨ ６０μｌ（中和 ）、０．２Ｍ ＰＭＳＦ １０μｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ ４０μｌを加える。 溶出タンパク質の濃度及び純度に従ってフラクションをプールする。これらの 特徴を電気泳動により分析する（１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。 ｐＨ５で溶出し、Ｎｉ²⁺−ＮＴＡ結合に作用することにより、ニッケルに結合 したタンパク質が脱着する。従って、このカチ オンを組換えタンパク質から解離することが必要である。この段階は５０ｍＭヒ スチジンの存在下に４℃で１時間温和な磁気撹拌下にインキュベートすることに より競合的に実施される。 ５．５．透析 透析によりヒスチジンとニッケルを除去することができる。サンプルを４℃で ５時間、次いで一晩、緩衝液２ｍＭ ＥＤＴＡ−ＰＢＳ １０リットルで２回透 析する（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ膜、ＭＷＣＯ １２−１４０００ダルトン）。 最終的にタンパク質の定量を行う。 この方法により、汚染性タンパク質をほぼ除去した精製形のタンパク質アポＡ −Ｉパリを得ることができる。実施例６：組換えアポＡ−Ｉパリ及び組換え正常アポＡ−Ｉの物理化学的性質 ６．１．比濁分析 ６．１．１．温度の関数としての比濁分析 アポＡ−Ｉの存在下に３２５ｎｍでＤＭＰＣ小胞の吸光度を測定することによ り、小寸法のディスク状脂質−タンパク質複合体の形成を試験する。１９〜２８ ℃の温度変化の分析の結果、リン脂質の遷移温度（２３℃）付近の吸光度の低下 が認められ、 複合体が形成されたことが分かる。図４（二量体の形成を避けるためにＧｄｎＨ ＤＬの存在下又は不在下）は組換え正常アポＡ−Ｉ、組換えアポＡ−Ｉパリ及び 天然アポＡ−Ｉを用いたこれらの複合体の比較を示す。これらの３種のタンパク 質はかなり似通った挙動を示すが、アポＡ−Ｉパリはそれ自身結合して二量体を 形成する傾向が認められる。 ６．１．２．時間の関数としての比濁分析 アポＡ−Ｉのインキュベーション後のＤＭＰＣ小胞の濁度の低下をＧｄｎＨＤ Ｌの存在下又は不在下に時間の関数として所与の温度でモニターした。時間の定 数（初期濁度の５０％の低下に対応する１／ｔ１／２）を１／Ｔ（ケルビン温度 ）の関数として評価する。結合速度は天然アポＡ−Ｉが速く、組換えアポＡ−Ｉ 、特にアポＡ−Ｉパリは遅い。更に、ＧｄｎＨＤＬを添加するとタンパク質−脂 質結合が増す。これは組換えアポＡ一Ｉ、特にアポＡ−Ｉパリで非常に顕著であ る。 ６．２．トリプトファンの蛍光スペクトル 波長３００〜４００ｎｍ（２９５ｎｍで励起）で種々のアポＡ−Ｉにおけるト リプトファンの蛍光スペクトルを測定した。アポＡ−ＩとアポＡ−Ｉ／コレステ ロール／ＰＯＰＣ複合体の 最大発光を下表１に示す。種々のアポＡ−Ｉ及び複合体におけるトリプトファン の最大蛍光発光は同等であり、トリプトファンが３種のタンパク質で同一環境に あることを示す。 ６．３．アポＡ−Ｉ／脂質複合体の単離及び特性決定 コール酸法によりアポＡ−ＩとＰＯＰＣとの複合体を調製した。複合体をＳｕ ｐｅｒｏｓｅ ６ＰＧカラムでゲル濾過クロマトグラフィーにより遊離アポＡ− Ｉから分離し、その組成を分析した。ゲル濾過プロフィールを図５に示す。天然 アポＡ−Ｉから調製した複合体では単一の均一ピークが得られるが、組換えアポ Ａ−Ｉを用いた場合には不均一な集団が観察される。遊離アポＡ−Ｉはフラクシ ョン２０〜２４中に溶出する。図６ は、異なる複合体のフラクション毎のリン脂質濃度とトリプトファン蛍光を示す 。実施例７：突然変異アポＡ−Ｉの発現用アデノウイルスベクターの構築 成熟アポＡ−Ｉの１５１位に突然変異Ａｒｇ→Ｃｙｓを含む本発明による変異 体をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより得る。下記プライマー： を使用する。プライマーＡｌｍ１及びＡｌｍ４は夫々ｃＤＮＡの５’末端にＣｌ ａＩ部位と３’末端にＳａｌＩ部位を導入し、相補的なプライマーＡｌｍ２及び Ａｌｍ３は突然変異を導入する。まず最初に非突然変異アポＡ−ＩのｃＤＮＡで プライマー対Ａｌｍ１−Ａｌｍ２及びＡｌｍ３−Ａｌｍ４によりＰＣＲ反応を実 施する。次いでこれらのＰＣＲからのフラグメントをプライマーＡｌｍ１及びＡ ｌｍ４の存在下で第３のＰＣＲに再導 入して８２２ｐｂフラグメントを生成した後、これをｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒ ｏｇｅｎ）にクローニングしてその配列を確認する。次に、ＲＳＶＬＴＲプロモ ーターの制御下にウシ成長ホルモンポリアデニル化部位と共にＬＰＬのｃＤＮＡ を含むシャトルベクターｐＸＬ−ＲＳＶ−ＬＰＬに突然変異ｃＤＮＡを含むフラ グメントＣｌａＩ／ＳａｌＩを同一制限部位を介して導入し、ＬＰＬのｃＤＮＡ を置換する（ＦＲ９４０６７５９）。他の任意のシャトルベクターも当然使用で きる。次に、得られたベクターを直鎖化し、２９３に同時トランスフェクトして 組換えアデノウイルスを得る。こうして得られたアデノウイルスをプラーク増殖 し、（特に塩化セシウムにより）精製した後、例えばグリセロール中で凍結保存 してもよい。治療に用いる場合には、医薬的に許容可能な任意のキャリヤーと組 み合わせてもよい。キャリヤーとしては特に、滅菌等張塩類溶液（リン酸一ナト リウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム 、塩化マグネシウム等、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水 もしくは生理的食塩水を加えて注射可能な溶質を構成し得る乾燥（特に凍結乾燥 ）組成物が挙げられる。リポタンパク異常血症に関連する疾病の 治療に用いる場合には、本発明による欠陥型組換えアデノウイルスは種々の方法 で投与でき、特に静脈内注射により投与すればよい。門脈に注射するのが好まし い。注射に使用するウイルスの量は種々のパラメーター、特に使用する投与方法 、該当疾病又は必要な治療期間に応じて調整できる。一般に、本発明による組換 えウイルスは、１０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌの用量で調合及び投与される。ＡＡ Ｖ及びアデノウイルスも、１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの用量を使用すればよい 。ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）なる用語はビリオン懸濁液の感染能に対応し 、適当な培養細胞の感染により測定され、一般に４８時間後の感染細胞プラーク 数を表す。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の測定方法は文献に詳細に記載されている 。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年１１月２９日 【補正内容】 図面の説明 図１はプラスミドＰＸＬ２１１６の制限地図である。 図２は患者のエキソン４をもつファージＭ１３の構築図である。 図３は突然変異ＰＸＬ２１１６をもつベクターの構築図である。 図４は温度の関数として比濁分析結果を示す。 ４ａ：ＧｎｄＨＣｌの不在下の種々のアポＡ−ＩとＤＰＭＣの結合の比濁分析 （−■−対照、−◆−組換え体、−◇−血漿、−□−パリ）。 ４ｂ：ＧｎｄＨＣｌの存在下の種々のアポＡ−ＩとＤＰＭＣの結合の比濁分析 （−■−対照、−◆−組換え体、−◇−血漿、−□−パリ）。 ４ｃ：アポＡ−ＩパリとＤＰＭＣの結合の比濁分析（−■−ＧｎｄＨＣｌの不 在下、−□−ＧｎｄＨＣｌ（０．５Ｍ）の存在下）。 ４ｄ：組換えアポＡ−ＩとＤＰＭＣの結合の比濁分析（−■−ＧｎＨＣｌの不 在下、−□−ＧｎＨＣｌ（０．５Ｍ）の存在下）。 ４ｅ：血漿アポＡ−ＩとＤＰＭＣの結合の比濁分析（−■−ＧｎｄＨＣｌの不 在下、−□−ＧｎｄＨＣｌ（０．５Ｍ）の存在下）。 ４ｆ：アポＡ−Ｉ／ＤＰＭＣの結合に及ぼすＧｎｄＨＣｌ（０．５Ｍ）の作用 （−■−ＧｎｄＨＣｌの不在下、−□−ＧｎｄＨＣｌの存在下）。 図５はＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ＰＧのフラクションの相対蛍光を示す（−■−Ｐ ＯＰＣ／ＡＩパリ、−□−ＰＯＰＣ／組換えＡＩ、−◆−ＰＯＰＣ／血漿ＡＩ） 。 図６：６ａ：ＰＯＰＣ／ＡＩパリ複合体のトリプトファン蛍光とリン脂質濃度 （−■−相対蛍光、−□−リン脂質）。 ６ｂ：ＰＯＰＣ／組換えＡＩ複合体のトリプトファン蛍光とリン脂質濃 度（−■−相対蛍光、−□−リン脂質）。 【図１】 【図２】 【図３】 【図４】 【図４】 【図４】 【図５】 【図６】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 アスマン，ゲルト ドイツ国、デー−48161・ミユンスター、 ニユニングベーク・49 (72)発明者 ブノワ，パトリツク フランス国、エフ−75014・パリ、リユ・ ジヨンケ、24 (72)発明者 ブリユケール，エリツク フランス国、エフ−92190・ムードン、リ ユ・ドユ・プロフエツスール−カルメツ ト、６ (72)発明者 ドネフル，パトリス フランス国、エフ−94100・サン−モー、 アブニユ・デ・フユジエ−ドウ−シヤトー ブリアン、45 (72)発明者 ドユベルジエ，ニコラ フランス国、エフ−75010・パリ、リユ・ マルテル、１ (72)発明者 フリユシヤール，ジヤン−シヤルル フランス国、エフ−59130・ランベルサー ル、リユ・ドウ・ラ・カルノワ、50、ドメ ーヌ・ドユ・ジヤンゴ (72)発明者 リユツク，ジエラール フランス国、エフ−59700・マル−カン− バロイユ、リユ・ドユ・エノー、５ (72)発明者 テユルパン，ジエラール フランス国、エフ−75006・パリ、リユ・ ドウ・セーブル、99 (72)発明者 フンケ，ハラルト ドイツ国、デー−48145・ミユンスター、 ゲルハルトシユトラーセ・13

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１５１位にシステインを含むヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉの変異体。 ２．配列番号２のペプチド配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の変異体 。 ３．アポＡ−Ｉパリであることを特徴とする請求項１又は２に記載の変異体。 ４．組換えタンパク質であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に 記載の変異体。 ５．二量体形態である請求項１から４のいずれか一項に記載の変異体。 ６．ホモダイマーであることを特徴とする請求項５に記載の変異体。 ７．請求項１から６のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質Ａ−Ｉの変異体 をコードする核酸。 ８．ｃＤＮＡであることを特徴とする請求項７に記載の核酸。 ９．ｇＤＮＡであることを特徴とする請求項７に記載の核酸。 １０．ＲＮＡであることを特徴とする請求項７に記載の核酸。 １１．配列番号２の核酸配列を含むことを特徴とする請求項７から９のいずれか 一項に記載の核酸。 １２．請求項７から１１のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。 １３．ウイルスベクターであることを特徴とする請求項１１に記載のベクター。 １４．化学的ベクターであることを特徴とする請求項１１に記載のベクター。 １５．請求項１に記載のアポリポタンパク質Ａ−Ｉの変異体をコードするＤＮＡ がゲノムに挿入されて含む欠陥型組換えアデノウイルス。 １６．請求項７に記載の核酸の挿入により遺伝子的に改変された細胞。 １７．請求項７に記載の核酸の挿入により遺伝子的に改変された哺乳動物細胞と 細胞外マトリックスを含む移植片。 １８．請求項１から６のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質Ａ−Ｉの変異 体、及び／又は請求項７に記載の核酸、及び／又は請求項１２に記載のベクター 及び／又は請求項１６に記載の遺伝子的に改変された細胞を含む医薬組成物。