JP4733337B2 - ヒトのウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子の遺伝子を含む組換えウイルスベクターおよび非ウイルスベクター、および肝線維症、腎線維症、肺線維症、膵線維症、心臓線維症などのさまざまなタイプの線維症、および肥厚性瘢痕の治療におけるその有用性 - Google Patents
ヒトのウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子の遺伝子を含む組換えウイルスベクターおよび非ウイルスベクター、および肝線維症、腎線維症、肺線維症、膵線維症、心臓線維症などのさまざまなタイプの線維症、および肥厚性瘢痕の治療におけるその有用性 Download PDFInfo
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Description
肝硬変の疫学および生理病理学
肝硬変は、重大な死亡原因であり世界的な健康問題の1つである。肝硬変は、通常慢性的なアルコール摂取およびC型肝炎感染によって引き起こされる末期の病気であり、成人がなった場合、完全に治療できる方法は存在しない。米国では約1400万人の人々がアルコール依存症に冒されており、この数字はメキシコでも同等である(Mariani、S.、Birmingham、K.及び Novak、K.「アルコール障害をノックアウトする」 Nature Med.1999:5(11):1243)。肝硬変は、それが労働人口における死因の4番目であり100%有効な治療法は存在しないために、メキシコでは深刻な健康問題であるとみなされている。さらに肝硬変は、胆道閉塞の結果として子供の死因でもある。しかしながらこの場合は、発病率は非常に低く、Kasaiシャントを介した外科手術的手法によって、数ヶ月の間は病気が緩和される。しかしながら、前記外科手術を受ける子供たちの50%は数ヶ月以内に死亡してしまい、シャントの効果がいくらかでもあった残りの子供たちは、できれば肝臓移植へと向かう。現在、他の慢性変性疾患には遺伝子治療のプロトコルは存在するが、今日まで、遺伝子治療を使用して肝硬変を治すプロトコルは報告されていない。したがって本発明では、この遺伝子治療プロトコルを前臨床レベルで開発したものである。ヒトにこれを使用するには、主要な送達法であるウイルスベクター、非ウイルスベクター、プラスミドベクター、および合成ベクターを使用して、硬変の進んだ肝臓中へ、治療用タンパク質をコードする遺伝子をうまく安全に送達できるかどうかによる。この目的のために、すでに前臨床的研究を行って、肝硬変ウィスターラットにおいて、遺伝子lacZをレポーター遺伝子として有するアデノウイルスベクターの安全性、形質導入効率、毒性および生体内分布を測定した(メキシコ特許出願第998515号、係属中)。肝臓の機能を著しく悪化させることなく、ダメージを受けた肝臓に外来性遺伝子を送達するためのアデノウイルスベクターが使える可能性を証明してから、硬変肝臓に対する「治療用遺伝子」の影響を評価した。
この技術を実施するために本発明ではウイルスベクターとして、第1世代、第2世代、第3世代および/または第4世代のアデノウイルスベクター、「中抜き」アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターを使用するが、それに限定されない。非ウイルスベクターは、プラスミド、リン脂質成分、および特定のレセプター用の種々のリガンドと合体した種々の構造のリポソーム(カチオン性およびアニオン性)で構成されてよい。合成ベクターは、huPA cDNAおよびTGF−βタイプII端部切断レセプターのcDNAと、種々の起源のプラスミドおよび調節および/または誘導プロモーターの構築体・結合体からなる。プロトコルの多くは、レトロウイルスベクターを使用して、肝細胞中に遺伝子を導入している(Douglas J.T.、及び Curiel D.T.「遺伝子治療のためのベクターとしてのアデノウイルス」Science 及び Medicine March/April 1997 44−53)。しかしながら、これらのベクターは自己複製可能なウイルスを生じる可能性があるので、予防措置を講じなければならない。これらのベクターの利点の1つは、ベクターにはそのゲノムを安定にホスト細胞の染色体に組み込む能力があるので、レトロウイルス中にクローン化された治療用トランス遺伝子が無期限に発現する可能性を与えることである。一方、使用するウイルスが自己複製できない場合、レトロウイルスを組み込むことにより癌遺伝子に挿入あるいは活性化が起こって突然変異が生じたことを報告している研究はいままではない。しかし、遺伝子を肝臓に形質導入するためにレトロウイルスベクターを使用することには、以下に述べるような理由で制限がある:1)これらのベクターは活発に分裂する細胞にのみ感染する、および2)これらのウイルスを増幅させるために使用するパッケージング細胞株では、非常に低いウイルス粒子力価しか得られない(Graham F.L.及び Van Der Eb AJ.「ヒトアデノウイルスの感染性アッセイの新しい技術 5 DNA」Virology 1973、52:456−467)。この2つの限界は、肝細胞増殖因子を使用することや、部分的な肝切除すなわち肝臓塊の70%を除去する手術によってin vivoでの残存肝細胞の分裂を誘導することによって、他の遺伝子治療プロトコルでは克服されてきている。上記限界をいくらかでも克服するために、レンチウイルスベクターを使用することが認められている。なぜなら、レンチウイルスベクターは、実際には分裂していない細胞に形質導入することができるからである。
肝硬変は肝臓の慢性的な病気であり、広汎な細胞壊死および限られた実質肝細胞の再生のため、結合組織が増加し、肝小葉構造の変形を引き起こし、血流力学の変化を誘発する。したがって、肝硬変を治療するための戦略には、線維形成の予防および/または回復、肝臓での細胞分裂の刺激、および肝臓組織の構造の再編成などが考えられる。本発明と関連がある現行技術文献について以下引用文献としてだけ記載する。
本発明では、アデノウイルスベクターを使用することを決めているが、この技術を実施するために使用するウイルスベクターは、非制限的に、第1世代、第2世代、第3世代および/または第4世代のアデノウイルスベクター、「中抜き」アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターであってもよいことを強調しておく。非ウイルスベクターは、プラスミド、リン脂質成分、特定のレセプター用の種々のリガンドと合体した種々の構造の(カチオン性およびアニオン性)リポソームで構成されることができる。合成ベクターは、huPA cDNAおよびTGF−βタイプII端部切断レセプター(遺伝子)と、種々の起源のプラスミド、および調節および/または誘導プロモーターの構築体および結合体から作製される。
本明細書では以下に本発明の目的および利点を示す。
本発明の目的は、適切なアデノウイルスベクター中にhuPA改変cDNAをクローン化することによって、組換えアデノウイルスベクターAdΔhuPAを作製するための手順、さらに「中抜き」ベクターやアデノ随伴ウイルスベクター中へのhuPaのクローン化、およびリポソームとリン脂質成分の複合体の形成を提供することである。
本発明の他の目的は、肝線維症が完全に解決され、肝細胞の増殖が劇的に刺激され、これによって肝硬変動物の肝臓機能の回復が得られる結果を得ることである。
多くの報告が、組換えアデノウイルスベクター(AdR)を健康な実験動物に全身的に投与することによって、これらのベクターの肝臓に対する特異的なホーミングおよび非常に優先的な親和性が観察されることを示している。本発明の発明者は、肝実質組織全体、主に中心静脈および門脈の周辺で慢性化した線維症のために器官の小葉構造が変化していても、硬変肝臓はアデノウイルスベクターの好ましい標的であることを示している。
細胞外マトリックス(ECM)のタンパク質分解カスケードの主要なイニシエーターの1つとして、プラスミノーゲンおよび肝細胞増殖因子(HGF)のアクチベーターとして、よく知られているuPAの機能を考慮して(Kim、T.H.、Mars、W.M.、Stolz、D.B.、Peterson、B.E.、及び Michalopoulos、G.K.「肝再生の初期における細胞外マトリックス再構築」Hepatology 1997:26:896−904;Mars、W.M.Zarnegar、R.およびMichalopoulos、G.K.「プラスミノーゲン活性化因子のuPAおよびtPAによる肝細胞増殖因子の活性化」Am.J.pathol.1993:143:949−958.(35);及び Roselli、HT.、Su、M.、Washington、K.、Kerins、D.M.、Vaughan、D.E.及び Russel W.E.「ウロキナーゼ欠損マウスでは肝再生は一過性に障害される」Am.J.Phisiol.1998:275:G1472−G1479)、ヒトuPAを使用して特に硬変肝臓中で酵素活性を誘導し、線維症の回復におけるその効果を試験することを決定した。しかしながら、huPA分泌の結果としての出血の危険を回避するために、我々はアミノ末端およびカルボキシ末端が改変された非分泌huPA形を使用して、血流内に分泌されるのを最大限可能な限り予防した(図3Aおよび3B)。
そのプラスミノゲン活性化の役割に加えて、huPAは、細胞外マトリックスの分解と関係があるメタロプロテアーゼのカスケードの活性化をもたらす、主要なイニシエーターの1つであるとみなされている(Kim、T.H.、Mars、W.M.、Stolz、D.B.、Petersen、B.E.、及び Michalopoulos、G.K.「ラットにおける肝再生の初期段階における細胞外マトリックスのリモデリング」Hepatology 1997:26:896−904)。プラスミノゲンをプラスミンに活性化させた後、uPAはプロコラゲナーゼ、およびプロコラゲナーゼを初期段階で活性形に転換させる他のメタロプロテアーゼ(MMP)もおそらく活性化させる(Steler−Stevenson、W.G.「細胞外マトリックスの病理学的リモデリングにおけるマトリックス代謝回転の動力学」Am.J.Pathol.1996:148:1345−1350.(33))。したがって我々は、マッソン(Masson)染色した硬変肝臓の線維症の段階を最初に測定した。多数の領域のコンピュータ支援形態計測分析によって、pAd.PGK−ΔNΔC−huPAで治療したラットは、治療の初期の線維症レベルと比べて、およびpAd.GFPと生理食塩水のみを与えた肝硬変動物と比べて(図4AおよびA’)、第10日までに劇的な線維症の減少を示した(85%)(図4BおよびB’)ことが示された。前記発見は、肝臓ホモジェネート中のメタロプロテアーゼ−2(MMP−2)の活性を特異的なELISAアッセイによって定量的に測定した、図4CおよびC’で示したデータと一致する。前記アッセイは、活性MMP−2のレベルを検出し(Verheijen、JH、Nieuwenbroek、NM、Beekman B、Hanemaijer、R、Verspaget HW、Ronday HK、Bakker AH.「タンパク質分解酵素の人工基質としての、修飾プロ酵素:修飾プロウロキナーゼを用いた細菌コラゲナーゼおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ活性の比色分析」Biochem J.1997:323(Pt3):603−609)、MMP−2はIV型コラーゲンを特異的に分解し、程度は低くなるが他のコラーゲンも分解する(Corcoran、ML、Hewitt、RE、Kleiner、DE Jr.、Stetler−Stevenson、WG.「MMP−2:発現、活性化および阻害」Enzyme protein 1996:49(1−3):7−19;Nogase、H.、Ogata、Y、Suzuki、K、Enghild、JJ、Salvensen G.「マトリックスメタロプロテイナーゼの基質特異性および活性化機構」Biochem.Soc.Trans.1991(3)715−8)。huPAを投与した4日後には、正常なラットと比べてMMP−2の6倍の増加(11.5ng/mlを超える)が見られ、対照の肝硬変動物と比べては3倍の増加が観察された。一方、特異的なhuPAコラゲナーゼの誘導およびコラーゲン分解活性の生理学的重要性とは別に、I型、II型およびIV型内在性コラーゲンの遺伝子の発現を半定量的RT−PCRによって評価した。それによりこれらの遺伝子の基線レベルの具体的な変化が検出可能になった。pAd.PGK−ΔNΔC−huPAを投与したラットでは、無関係なアデノウイルスpAd−GEPを与えたラットと比べて、IV型コラーゲンの遺伝子の発現は第6日までに約5分の1まで低下し、I型コラーゲンの遺伝子の発現は第10日までに約4分の1まで低下した。III型コラーゲンの発現は、pAd−GEPと比べて、huPAアデノウイルスベクターを注入した第10日に約2分の1まで低下した(図5AおよびB)。前記データによって、ヒトhuPAの過剰発現が、ECMタンパク質をコードする前記遺伝子の発現停止を誘導することが強く示唆される。重度の線維症である硬変肝臓中では、肝臓星状細胞(HSC、主要なコラーゲン生成細胞)が線維症領域で増加し、それらの大部分は、α−平滑筋アクチン(α−SMA)を特異的に発現する活性型HSCへとその表現型を変える(Nyberg−Hoffman、C.、Shabram、P.、Li、W.、Giroux、D.及び Aguilar−Cordova、E.「アデノウイルス感染性力価測定における感度と再現性」Nature Med.1997:3(7):808−11)。ラットの肝臓中のα−SMAの発現を免疫組織化学法によって調べた結果、この発現は肝実質組織全体に沈着した過剰なECMの分布と相関関係があり、線維症である組織の%と一致する結果となった。α−SMA陽性細胞の数は、大幅に減少する(治療後第2日の43.2%と比べて、第10日には8.9%)(図6AおよびB)。HSCがはっきりと目に見える代表的な線維症領域を拡大して示す(図6C)。
プロセスの最初の半分を解決したので、我々は、細胞外マトリックス(ECM)分解を行った後の、「空きスペースを補充するのに必要な」肝臓の再生レベルを決定することへと進んだ。図7は、おそらくはin situでのHGFの活性化によって刺激される、肝臓中の有糸分裂の動態を示す(Locaputo、S.、Carrick、T.L 及び Bezerra、J.A.Zona 「ウロキナーゼトランスジェニックマウスの肝再生中の遺伝子発現の制御」Hepatology 1999:291106−1113)。肝細胞の増殖は、増殖細胞核抗原(PCNA)に対する特異抗体で染色された細胞のパーセンテージとして測定した。PCNA陽性肝細胞の数は、pAd−GEPで治療したラットの肝臓および正常な肝臓と比べて、pAd.PGK−ΔNΔC−huPAで治療したラットの肝臓中では劇的に多くなった(10倍)(図7A)。スコアから、約55%の肝細胞が、pAd.PGK−ΔNΔC−huPAを注射した2日後に門脈周囲領域(図7B)および小葉中心領域(図7C)の両方において、抗PCNA抗体によって陽性染色されたこと、(Hattori、N.、Sisson、T.H.、Xu、Y.、及び Simon R.H.「ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲンアクチベーター遺伝子をアデノウイルスを介してインビトロ及びインビボで肺の細胞に伝達することによるフィブリン分解の上方制御」 Hum.Gene Ther.1999:10:215−222)および多数の有糸分裂の様子および二核肝細胞を示した(図7A)。40%のスコアが、アデノウイルスベクター投与の8日後でも検出された(図7BおよびC)。第10日までに検出された陽性細胞は機能性のある肝臓塊の再建を示し、このことは、肝機能検査(AST、ALT、ビリルビンおよびプロトロンビン時間)により示される明らかな正常化傾向によって確認された(表1および図8A)。
a)ヒトの肝硬変を模倣した実験動物
このモデルは、CCl4慢性中毒にした動物からなっており(Armendariz−Borunda J.Seyer、J.M.、Kang A.H.及び Ranghow R.「四塩化炭素中毒のラット肝臓におけるTGF遺伝子発現の制御」 FASEB J.1990:4:215−221)、この動物の肝硬変はCCl4を腹膜内投与した第6週から確立され(図3D)、アルコールの乱用または慢性のC型肝炎ウイルス感染によって誘発されるヒトの肝硬変と似ている。体重80gの動物に、最初の1週間はCCl4と鉱油が1:6の混合物、第2週目は1:5の混合物、第3週目は1:4の混合物、4〜8週の間は1:3の混合物を、週に3回腹腔内に投与した。対照として使用するためにラットは対にし、これらには担体のみを同様に注射した。実験方法はすべて以前に記載されており(Garcia−Banuelos J、Siller Lopez、F、Aguilar−Cordova、E.及び Armendariz−Borunda J.「肝硬変ラット肝臓へのアデノウイルスを介した遺伝子送達:遺伝子治療の強力な手段」Gene Ther.及び Mol.Biol.Accepted 2000)、アデノウイルスの施用はすべて、腸骨静脈を通して行った(図3C)。
Ad5−βGalアデノウイルスベクター(図2A)は、細菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子(lac−Z)を挿入したpΔE1sp1Bに由来する。β−Gal活性の視覚化は、β−ガラクトシダーゼ酵素の存在下で無色から青色に変わるX−gal試薬を用いて行った。同時に、同じAd5−βGalバッチを、CCl4中毒の5および8週間後に、健康なラット(n=5)および肝硬変ラット(n=5)に投与した。Ad5−βGal投与の72時間後に、動物を殺した。組換えアデノウイルスによってコードされているβ−ガラクトシダーゼ(β−gal)タンパク質の組織学的分析および発現の測定用に、異なる器官:肝臓、脾臓、心臓、肺、腎臓、脳、精巣および回腸を摘出した。前記器官を−30℃で凍結し、クリオスタットで切断して8μmの切片を得た。これらの切片を16〜18時間の間X−gal試薬に暴露し、ニュートラルレッドで対比染色した。形質導入された細胞のパーセンテージは、いくつかの領域のコンピュータによる画像分析によって決定した。肝硬変ラット肝臓の切片も作成し、前記切片をパラフィンに浸し、切断し、コラーゲンを特異的に染色するシリウスレッドで染色した。
完全機能性非分泌型ヒトウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子をコードするcDNAを挿入することによって、アデノウイルスベクター(pAd.PGK−ΔNΔC−huPA)を構築した。小胞体(RE)への保持シグナルをタンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端に加えて、huPAが分泌されることに伴う出血の危険を防止した。一般に、分泌されるタンパク質は、まず小胞体膜を通って移動し、次いで小胞に入ってゴルジ装置まで運ばれる。uPAの場合、小胞体膜を介しての移動は、前駆体タンパク質のアミノ末端の特徴的なシグナルによって活性化される。前記シグナルペプチドは、膜を通ってポリペプチドが移動する最中にシグナルペプチダーゼによって切断される。体循環へのuPA分泌を抑制または低下するために、小胞体からのタンパク質の輸送が起こらないように、タンパク質を改変した。pGEM3中のXbaI/Asp718部位でクローン化されたヒトのuPA cDNA(1,326bp)(図3A)をカルボキシ末端で改変し、KDELシグナルをコードする配列(RE内腔中に存在する可溶性タンパク質に特徴的な高度保存配列)、およびPCRによって生成した75ヌクレオチドの上流残基をクローン化した(図3B)。アミノ末端を改変するには、プレuPAペプチドシグナルを含むアミノ末端の25個のアミノ酸を、アミノ末端保持シグナル(RR)とPCRで得られた膜貫通IIタンパク質Iip33に由来しペプチドスペーサー(31アミノ酸)によって分けられている膜貫通領域(TM)中の「アンカー」とに置換した(図3B)。RR配列は膜アンカー領域(TM)の近くに位置するアルギニン残基MHRRRSRによって構成されており、不可逆鎖タンパク質Iip33のようなII型膜貫通タンパク質中に存在する。この生成した改変型huPA遺伝子を、アデノウイルスプラスミドpAd.ΔNΔC−huPA中にクローン化し組換えアデノウイルスベクターを生成させた。前記アデノウイルスベクターの作製を監視して、マイコプラズマ汚染および内毒素を除いた。このベクターを使用する理由は、このベクターはhuPAを分泌しないので、肝硬変動物の主なこの傷害である凝血性低下または突発性の出血を引き起こすことがないという、利点のためである。ここで使用するPAd−GFPベクターは、前に記載したE1およびE3領域が欠失している非増殖性のアデノウイルスベクターである(Nyberg−Hoffman、C.、Shabram、P.、Li、W.、Giroux、D.及び Aguilar−Cordova、E.「アデノウイルス感染性力価測定における感度と再現性」Nature Med.1997:3(7):808−11)。これら2つのベクターは完全に性質の特徴付けられたベクターを得るために、無菌実験室条件下で作製した。ベクターには名称をつけ特徴付けし(Nyberg−Hoffman、C.、Shabram、P.、Li、W.、Giroux、D.及び Aguilar−Cordova、E.「アデノウイルス感染性力価測定における感度と再現性」Nature Med.1997:3(7):808−11)、ウイルス粒子(vp)と感染単位(IU)のタイターの比が30以上であるバッチを得た。
ラットを図3Dに示すように殺し、以下の文献に記載されているように肝臓ホモジェネートを150mgの組織から調製し、−70℃に保った(Gao、C.、Jokers、R.、Gondipalli、P.、Cai、S.H.、Kennedy S.及び Ponder K.P.Intramuscular of an hepatic transduction with a retroviral vector in mice.Hum.Gene Ther.1999:10:911−922)。同時に、血清サンプルを得て、−20℃に保った。要約すると、huPAに関しては、プロテアーゼ阻害剤の存在下、150mgの肝臓を400μlのホモジェネート緩衝液(0.05M Tris−HCl、0.15M NaCl、0.01M HEPES、2mM CaCl2、0.01% Tween80、1mM フェニルメチルスルホニルフオリド(PMSF)、pH8.5)中で摩砕した。ホモジェネートを12,000×gで15分間遠心分離し、市販のキット(Biopool、Sweden)を使用して、ELISAによって上澄み中のhuPAレベルを測定した。これはヒトのuPAを定量測定するための特異的酵素イムノアッセイからなる。アッセイ感度はuPA抗原の基線レベルを0〜5ng/mLの直線範囲で検出する。総タンパク質レベルは、ブラドフォードのタンパク質定量法(Bradford、M.M 「タンパク質-染料結合の原理を利用した、マイクログラム程度のタンパク質を定量する迅速かつ高感度の方法」Anal.Biochem.1976:72:248−54)を使用して測定した。MMP−2のアッセイに関しては、ホモジェナイザー(Politron RT3000、Kinematica AG、Brinkman、スイス)を使用し、4℃において4mlの0.15M NaCl中で、8,000×gで5分間、サンプルを均質化した。3サイクルの凍結解凍の後、4℃で1分間、1秒当たり21キロサイクルでサンプルを2回超音波処理し、4℃で10分間8,000×gで遠心分離し、分注して、−70℃に保った。市販のキット(Biotrak、Amersham)を使用してELISAによって、前記上澄み中のMMP−2レベルを測定した。
時間を決めて動物から血液を採取し、自動装置(Synchron Cx7)で血清の肝臓機能検査(ALT、AST、アルカリホスファターゼおよびビリルビン)を行った。自動装置(ACL−3000)によって血漿のプロトロンビン時間を分析し、自動装置(Cell−Dyn 3500R)によって血液分析を行った。
pAd.PGK−ΔNΔC−huPAを投与した第2、4、6、8および10日後に、ラットを殺した(図3D)。pAd−GFP(無関係なアデノウイルス)を与えた肝硬変動物のグループ、および生理食塩水を与えた肝硬変動物のグループを、それぞれ対照グループとして使用した。各グループは、少なくとも5匹のラットからなっていた。組織学的な研究用に、リン酸緩衝液(PBS)中10%ホルムアルデヒドに浸して、得られた肝臓を即座に固定し、エチルアルコール中で脱水し、パラフィンに浸した。厚さ5μの切片を、ヘマトキシリン/エオシン、シリウスレッドおよびマッソントリクローム染色で染色した。この最後の実験では、コンピュータ制御の画像解析装置(Qwin Leica)を使用して、スライド当たり10の領域をランダムに分析し、肝臓領域全体と結合組織の比を計算することによって、冒された肝臓中の線維症のパーセンテージを測定した。免疫組織化学に関しては、肝臓切片をそれぞれシラン化スライド上に載せ、パラフィンを除去し、無水メタノール中の0.03%H2O2で、内在性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。これらをそれぞれ、PBSで1/20に希釈した抗PCNA(増殖細胞核抗原)モノクローナル抗体、PBSで1/50希釈した抗α−平滑筋アクチンモノクローナル抗体(Boehringer Mannheim、Ger)、およびPBSで1/400希釈した抗ヒトuPAヤギポリクローナル抗体(Chemicon International、USA)と室温で一晩インキュベートした。反応は、ペルオキシダーゼ標識したウサギまたはヤギポリクローナル抗体を用いて検出し、ジアミノベンジジンで発色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。定量化の目的で、小葉内領域および門脈周囲領域中の4つの領域をランダムに評価した。自動式画像解析装置(Qwin、Leica)を用いて陽性および陰性細胞を計数し、陽性細胞のパーセンテージとしてデータを表した。2人の有資格の病理学者による別々に行われた組織病理学的な分析は、差異5%の許容範囲であると解釈された。
決まった時間に肝臓を取り出し、ChomczynskiおよびSacchiの方法(Chomczynski、P.及び Sacchi、N.「グアジニウム酸-チオイソシアネート-フェノール-クロロホルム抽出による1段階RNA単離法」Anal.Biochem 1987:162:156−159)に従って、すべてのRNAを即座に単離した。トリゾルの存在下でポリトロン装置によって肝臓組織を均質化し、次いでクロロホルムを加え、水性相を得て、イソプロパノールを用いてRNAを沈殿させた。260/280nmでの分光測定法によって、RNA量を測定した。1%アガロースゲルおよびホルムアルデヒド電気泳動によって、RNAの性質を確認した。
遺伝子 プライマー 増幅させた断片
HGF (センス)5'ATGCTCATTGGACCCTGGT3' 700bp
(アンチセンス)5'GCCTGGCAAGCTTCATTA3'
c−met (センス)5'CAGTGATGATCTCAATGGGCAAT3' 726bp
(アンチセンス)5'AATGCCCTCTTCCTATGACTTC3'
コラーゲンI (センス)5'CAAGAATGGCGACCGTGGTGA3' 1043bp
(アンチセンス)5'GGTGTGACTCGTGCAGCCATC3'
コラーゲンII (センス)5'AGATGGATCAAGTGGACATC3 449bp
(アンチセンス)5'CATGTTTCTCCGGTTTCCAT3'
Claims (26)
- アデノウイルスベクター中にヒトウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子の改変型遺伝子のcDNAが外来プロモーターの制御下に発現可能にクローン化されているヒトを含めた哺乳動物の肝臓の線維症の治療のための組換えアデノウイルスベクターであって、前記遺伝子が前記プロモーターの下で発現することにより、ヒトウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子の血液流中への分泌を防ぐため、小胞体(RE)におけるアミノ末端およびカルボキシ末端保持シグナルを改変して非分泌huPA形となるように、ヒトウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子遺伝子cDNAが改変されている組換えアデノウイルスベクター。
- 遺伝子発現がサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターによって制御される、請求項1に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 投与されると肝臓へ送達されるものである、請求項1に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 前記投与経路が静脈内である、請求項3に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 静脈が腸管静脈である、請求項4に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- ウイルス粒子の形態である、請求項1から5に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- アデノウイルスベクターが、第1世代、第2世代、第3世代および/または第4世代のアデノウイルスベクター、「中抜き」アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターから選択される、請求項1に記載の組換えベクター。
- アデノウイルスベクターがオープンリーディングフレームE1とE3の少なくともどちらかを欠損しているが、インビトロで増殖するのには十分な配列を有しているものである、請求項1に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- クローン化されたhuPAのcDNAがカルボキシ末端で改変されており、KDELシグナルをコードする配列、およびPCRで生成した75個のヌクレオチドのクローン化により上流の残基も加えられている、請求項1に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- プレuPAペプチドシグナルを含むアミノ末端の25個のアミノ酸を、PCRで得た膜貫通IIタンパク質Iip33からの31個のアミノ酸のスペーサーペプチドによって分けられている膜貫通領域(TM)中の、アンカーの隣のアミノ末端保持シグナル(RR)に置換した、請求項9に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- RR配列が、富アルギニン残基MHRRRSRによって構成されている、請求項10に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 主な標的器官が硬変肝臓である、請求項11に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 請求項1−12のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターを製造する方法であって、ヒトウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子の改変型遺伝子のcDNAをアデノウイルスベクター中にクローニングすることを含んでなる方法。
- ヒトを含めた哺乳動物の肝臓の線維症を治療するための医薬組成物であって、アデノウイルスベクター中にヒトウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子の改変型遺伝子のcDNAが外来プロモーターの制御下に発現可能にクローン化されていることを特徴とし、ヒトウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子の血液流中への分泌を防ぐため、小胞体(RE)におけるアミノ末端およびカルボキシ末端保持シグナルを改変して非分泌huPA形となるように、ヒトウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子遺伝子cDNAが改変されている組換えアデノウイルスベクターおよび医薬として許容される担体とを含む医薬組成物。
- 遺伝子発現が普遍的サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターによって制御される、請求項14に記載の医薬組成物。
- 投与されると肝臓へ送達されるものである、請求項14に記載の医薬組成物。
- 前記投与経路が静脈内である、請求項16に記載の医薬組成物。
- 静脈が腸管静脈である、請求項17に記載の医薬組成物。
- 組換えアデノウイルスベクターがウイルス粒子の形態である、請求項14から18に記載の医薬組成物。
- アデノウイルスベクターが、第1世代、第2世代、第3世代および/または第4世代のアデノウイルスベクター、「中抜き」アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターから選択される、請求項14に記載の医薬組成物。
- アデノウイルスベクターがオープンリーディングフレームE1とE3の少なくともどちらかを欠損しているが、インビトロで増殖するのには十分な配列を有しているものである、請求項14に記載の医薬組成物。
- クローン化されたhuPAのcDNAがカルボキシ末端で改変されており、KDELシグナルをコードする配列、およびPCRで生成した75個のヌクレオチドのクローン化により上流の残基も加えられている、請求項14に記載の医薬組成物。
- プレuPAペプチドシグナルを含むアミノ末端の25個のアミノ酸を、PCRで得た膜貫通IIタンパク質Iip33からの31個のアミノ酸のスペーサーペプチドによって分けられている膜貫通領域(TM)中の、アンカーの隣のアミノ末端保持シグナル(RR)で置換した、請求項21または請求項22に記載の医薬組成物。
- RR配列が、富アルギニン残基MHRRRSRによって構成されている、請求項23に記載の医薬組成物。
- 線維症が肝硬変である、請求項14記載の医薬組成物。
- 1回投与用量が線維症の個体あたり約107〜1014個のウイルス粒子である、請求項14―25のいずれかに記載の医薬組成物。
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