JPH09511240A

JPH09511240A - 動脈平滑筋細胞増殖の抑制

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Publication number: JPH09511240A
Application number: JP7524653A
Authority: JP
Inventors: ネイベル，エリザベス，ジー．; ネイベル，ゲイリー，ジェイ．
Original assignee: リージェンツオブザユニバーシティオブミシガン
Priority date: 1994-03-21
Filing date: 1995-03-01
Publication date: 1997-11-11
Anticipated expiration: 2021-05-24
Also published as: DE69526853D1; US6979677B1; EP0752002A1; CA2184065A1; US6780406B1; JP3778930B2; EP0752002B1; ATE218164T1; DE69526853T2; WO1995025807A1; CA2184065C

Abstract

(57)【要約】血管の機械的損傷に伴う再狭窄の抑制方法。例えばチミジンキナーゼのような自殺遺伝子をコードするアデノウイルスベクターを損傷した血管に直接投与した後、ヌクレオチドアナログで処置する。このアナログはリン酸化されそして自殺遺伝子生成物によりサイトトキシンに転化されて、急速分裂中の新内膜細胞の破壊をもたらす。

Description

【発明の詳細な説明】動脈平滑筋細胞増殖の抑制発明の分野本発明は「自殺(suicide)」遺伝子をコードするポリヌクレオチドを使用する血管平滑筋細胞増殖の抑制に関する。細胞内で発現されそして第二の化合物により刺激されると、自殺遺伝子の生成物は増殖中の細胞を死滅させる。発明の背景生体内の動脈損傷に対する応答には内皮および平滑筋細胞を含む複雑な一連の細胞の相互作用が介在している。動脈壁の損傷後に、成長因子およびサイトカインが局部的に放出され、自己分泌および傍分泌機構により細胞増殖を誘発する。そのような損傷を与える一般的および臨床的に意義ある処置は、アテローム硬化症沈着物により狭くなった血管を膨張可能なバルーンを用いて拡げるバルーン血管形成である。閉塞した血管の拡張が反応性細胞増殖応答をもたらし、それが動脈内腔が再び狭くなること（再狭窄）をもたらす。血液流は動脈の内膜（内腔に隣接する）層の肥厚と細胞外マトリックス成分の沈着とによって影響を受ける。再狭窄は冠動脈血管形成の約３０％において起こり、そのため心血管疾病の処置の成功に対して主要な障害となっている。アンギオテンシン転化酵素（ＡＣＥ）阻害剤および細胞サイクル調節蛋白質に対するアンチセンスＲＮＡなど、血管形成後の平滑筋細胞増殖を制御するために、種々試みられている（Rakugi et al.,(1994)J.Clin.Invest.,93:339-346;Simo ns et al.,(1992)Nature,359:67-70）。これらの薬理学的方法はラットの頸動脈モデルにおけるバルーン血管形成に伴う新内膜肥厚（neointimal hyperplasia）の予防においてある程度有効であったが、これらの方法のヒト疾病に対する適用は成功を収めていない。複製欠損アデノウイルスベクターが、遺伝子治療の多くの見込みのある方法において使用されている。Lemarchand et al.は、アデノウイルスベクターを使用するヒツジの正常な動脈および静脈の内皮中へのβ−ガラクトシダーゼおよびα₁ −アンチトリプシン遺伝子の導入を示している（Circulation Res.，5:1132-11 38,1993;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:6482-6486,1992）。Lee et al.（Circulat ion Res.,73:797-807，1993）はバルーンで損傷したラットの頸動脈中へのβ− ガラクトシダーゼ遺伝子のアデノウイルスベクター介在性導入を示した。これらのベクターは生体内でマウス肝細胞に形質導入するためにも使用された（Stratford-Perric audet et al.,(1990),Hum.Gene Ther.,1:241-256）。さらに、組換え体β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現もウサギの冠動脈中へのアデノウイルスベクターの注入後に観察されている（Barr et al.,(1994)Gene Therapy,1:51-58）。 Culver et al.（Science,256:1550-1552,1992）は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子を発現するネズミの腺維芽細胞を脳の神経膠腫を有するラットに注入した。次いでラットにヌクレオシドアナログであるガンシクロビル（ＧＣＶ）を与えた。ＧＣＶがＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を発現する細胞に入ると、それは新たに発現されたチミジンキナーゼによりリン酸化された。細胞のキナーゼはＧＣＶもリン酸化し、それが複製ＤＮＡの中に取り込まれ（Smit h et al.,(1982)Antimicrob.Agents Chemother.,22:55-61）、そして未成熟連鎖終結を起こす。この方法はＤＮＡ複製を阻害するため、活発に分裂する細胞だけが死滅する。この実験では神経膠腫は顕微鏡的および肉眼的に完全に退行していた。チミジンキナーゼにより修飾可能な他のヌクレオシドアナログ、例えばアシクロビル（Elion et al.,(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74:5716-5720）が細胞複製の自殺抑制のための標的として使用されている。 Moolten et al.（Hum.Gene Ther.,1:125-134,1990）はＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を有するトランスジェニックマウスにおいてアベルソン白血病ウイルスでリンパ腫を誘発させた。ＧＣＶによる１２匹のマウスの処置後に、１１匹が完全な腫瘍退行を示した。 Plautz et al.（NewBiologist,3:709-715,1990）はＨＳＶ−ｔｋ遺伝子でトランスフェクションされそしてＧＣＶで処置された移植可能なネズミの腺癌の生体内での退行を示した。これらの同じ実験において、分裂していないウサギの動脈細胞中のＨＳＶ−ｔｋ−β−ガラクトシダーゼ構築体の発現はＧＣＶ処置により影響を受けておらず、静止（quiescent）細胞の維持および生体内での急速分裂中の細胞の排除というこの方法の選択性を示した。平滑筋細胞への自殺遺伝子の導入の効果についてはこれまでに示されていない。このため、機械的な血管損傷後の新内膜肥厚を抑制する安全で有効な方法に関する要望がある。本発明はこの要望を満足させるものである。発明の概要本発明の１つの態様は、機械的処置後の哺乳動物の血管にチミジンキナーゼ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入し、血管の細胞内でチミジンキナーゼ遺伝子を発現させてチミジンキナーゼ蛋白質を産生させ、次いで哺乳動物にチミジンキナーゼ蛋白質によりリン酸化可能な有効量のＤＮＡ複製を阻害するヌクレオシドアナログを投与して、それによりリン酸化されたアナログが増殖中の細胞のＤＮＡの中に優先的に取り込ませ、そしてそれにより増殖中の細胞を死滅させることを含む、哺乳動物における血管の機械的処置に伴う再狭窄を抑制する方法である。好ましくは、機械的処置はバルーン血管形成（baloon angioplasty）、レーザー、アテローム切除（atheroectomy）装置またはステント移植であり、チミジンキナーゼ遺伝子は真核生物発現ベクターの中にある。より好ましくは、発現ベクターはウイルスベクターである。最も好ましくは、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。この好ましい態様の他の面では、チミジンキナーゼ遺伝子の上流にポリオーマウイルスエンハンサーが配置される。好適には、ポリオーマウイルスエンハンサーは、アデノウイルスベクターエンハンサー要素、カプシド化（encapsidation）シグナルおよび複製開始点も含む。特に好適な態様では、アデノウイルスベクターはＡｄ.ＨＳＶ−ｔｋである。本発明の他の面では、チミジンキナーゼ遺伝子を含有する発現ベクターは非ウイルスベクターと複合化されている。好ましくは、この非ウイルスベクターはリポソームまたは受容体リガンドである。有利には、ヌクレオシドアナログはガンシクロビルまたはアシクロビルである。この好ましい態様の他の面では、リン酸化された化合物はさらに細胞内酵素によりリン酸化されそして急速分裂中の細胞のＤＮＡの中に優先的に取り込まれる。本発明の他の態様は、機械的処置後の哺乳動物の血管にシトシンデアミナーゼ遺伝子を含むポリヌクレオチドを導入し、血管の細胞内でシトシンデアミナーゼ遺伝子を発現させてシトシンデアミナーゼ蛋白質を産生させ、次いて該哺乳動物にシトシンデアミナーゼ蛋白質によりリン酸化可能な有効量のＤＮＡ複製を阻害するヌクレオシドアナログを投与し、リン酸化されたアナログを増殖中の細胞のＤＮＡの中に優先的に取り込ませ、それにより増殖中の細胞を死滅させることを含む、哺乳動物における血管の機械的処置に伴う再狭窄を抑制する方法である。好ましくは、ヌクレオシドアナログは５−フルオロシトシンである。本発明はまた、Ｅ３領域および約９交差単位（map unit）が欠失した野生型アデノウイルスと、プロモーター、エンハンサー、カプシド化シグナルおよび複製開始点の要素に作用可能に結合されている単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を含む、欠失部に挿入されたＨＳＶ−ｔｋ発現カセットとを含む、組換え体アデノウイルスベクターＡｄ.ＨＳＶ−ｔｋも提供する。好ましくは、野生型アデノウイルスは５型アデノウイルスでありそしてこれらの要素はポリオーマウイルスおよびアデノウイルス由来である。本発明の他の面では、哺乳動物の血管に機械的処置後に自殺蛋白質をコードする自殺遺伝子を含むポリヌクレオチドを導入し、血管の細胞内で自殺遺伝子を発現させて自殺蛋白質を産生させ、哺乳動物に自殺化合物を投与して、自殺蛋白質による自殺化合物の修飾の結果として増殖中の細胞を死滅させることを含む、哺乳動物における血管の機械的処置に伴う再狭窄を抑制する方法が提供される。この態様の他の面では、機械的処置は、バルーン血管形成法、レーザー、アテローム切除装置またはステント移植である。好ましくは、自殺遺伝子はチミジンキナーゼ遺伝子でありそして自殺蛋白質はチミジンキナーゼである。有利には、チミジンキナーゼ遺伝子は真核生物発現ベクター、好適にはウイルスベクター、内に含有される。本発明の好ましい態様の他の面では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであり、最も好適にはアデノウイルスベクターである。本発明の他の面では、自殺遺伝子を含有する真核生物発現ベクターは例えばリポソームまたは受容体リガンドのような非ウイルスベクターと複合化されていてもよい。好適な態様では、自殺化合物はガンシクロビルまたはアシクロビルでありそしてチミジンキナーゼによりリン酸化される。特に好ましい態様では、リン酸化されたガンシクロビルが急速分裂中の細胞のＤＮＡの中に優先的に取り込まれる。図面の簡単な説明図１は、組換え体Ａｄ.ＨＳＶ−ｔｋアデノウイルスベクターの構築を示す。複製欠損アデノウイルスへ挿入される、アデノウイルス５′逆位末端反復（ＩＴＲ）、複製開始点、カプシド化シグナルおよびＥ１ａエンハンサーを含むＨＳＶ −ｔｋ発現カセットが示されている。図２は、ブタの腸骨大腿骨動脈中のバルーン損傷後の種々の時間における増殖中の新内膜細胞の百分率を示す。損傷後の日数がｘ軸に示され、増殖中の細胞の百分率がｙ軸に示されている。図３は、組換え体Ａｄ.ＨＳＶ−ｔｋアデノウイルスベクターでトランスフェクションされたブタの腸骨大腿骨動脈中の血管平滑筋細胞増殖の抑制を示す。ＧＣＶ処置の有無がｘ軸に示され、血管平滑筋細胞増殖の指標である内膜／中膜比がｙ軸に示されている。発明の詳細な説明本発明はバルーン血管形成後に起きる新内膜肥厚（再狭窄）を抑制する方法を提供する。この方法は自殺遺伝子を動脈内腔中に直接導入することにより実施される。導入された遺伝子は取り込まれそして近くの血管平滑筋および内皮細胞の中で発現する。遺伝子の発現だけでは細胞機構に影響を有さないはずである。自殺遺伝子が発現されると、哺乳動物は自殺化合物で処置される。自殺遺伝子生成物および自殺化合物が増殖中の細胞中で一緒になると、その細胞が死滅する。従って、この方法は平滑筋細胞の再狭窄を特異的に抑制する有効な処置を与える。増殖していない細胞は自殺遺伝子により死滅しないため、この方法は他の細胞型の集団における急速成長中の平滑筋細胞を特異的に死滅させるために使用することができる。ここで使用されている「機械的処置」という語は閉塞した血管を拡げる手段を示す。これはバルーン血管形成、レーザー処置、アテローム切除装置処置およびステント移植を含むが、それらに限定されない。「機械的損傷」という語は「機械的処置」の結果を指す。「自殺遺伝子」という語は、その蛋白質生成物が自殺化合物を細胞内で有毒生成物に転化させうる遺伝子を指す。好適な態様では、自殺遺伝子は真核生物発現ベクター中にある。特に好適な態様では、発現ベクターは複製欠損アデノウイルスベクターの中にある。これらのベクターは増殖していない細胞に形質導入することができ、新生物形質転換を誘発することが示されてなく、７.５キロベースより多いＤＮＡを担持することができ、そしてワクチン処置および遺伝子治療用に使用されている一般的なヒト病原体である。自殺遺伝子を送達するために広範囲のビヒクルを利用できる。自殺遺伝子を含むアデノウイルスベクターを機械的損傷部位に送達する好適な方法は、溶液にしてカテーテルによるものである。或いは、遺伝子を例えばリポソームのような非ウイルスベクターと複合化させて、血管の内面にある内皮細胞および平滑筋細胞の細胞膜との融合を促進させてもよい。リポソーム製造方法の一つは、例えば、 Lipofectin^TM試薬（メリーランド州、ガイサーズブルグのギブコ−ＢＲＬ）の使用を含む。この遺伝子は例えばトランスフェリンのような受容体リガンドと複合していてもよく、それが遺伝子を細胞表面に送達しそして受容体介在エンドサイトーシスによる細胞中への導入を促進する（Curiel et al.,(1991)Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA,88:8850-8854）。他の好適な態様では、自殺遺伝子はＨＳＶ−ｔｋ蛋白質をコードする。この遺伝子はウイルス蛋白質であるチミジンキナーゼをコードし、それは通常はヘルペスウイルスが感染した細胞内での核酸前駆体の合成において重要である。この酵素は、この基質に対して作用しない細胞チミジンキナーゼ遺伝子を含有する未感染細胞とは対照的に、グアノシンアナログであるＧＣＶをリン酸化して、ＧＣＶモノホスフェートを生成する。ＧＣＶモノホスフェートは次いで細胞内蛋白質キナーゼによりリン酸化され、ＨＳＶ−ｔｋを含有する細胞内でＧＣＶ−トリホスフェートが生成される。ＧＣＶトリホスフェートは優先的に急速分裂中の細胞のＤＮＡの中に取り込まれるが、その化学構造のために新生ＤＮＡのさらなる延長を進めることはできず、連鎖終結および細胞の死滅が生ずる。ＧＣＶは全身的または経口的に投与できる。生体内で発現されるときに無毒化合物を有毒化合物に修飾可能ないずれの自殺遺伝子も本発明の範囲内である。例えば、細菌酵素であるシトシンデアミナーゼは通常は無毒のヌクレオシドアナログである５−フルオロシトシンを細胞毒性の５−フルオロウラシルに転化させる。自殺遺伝子としてのβ−グルコシダーゼ遺伝子の使用も考えられる。アデノウイルスＨＳＶ−ｔｋ構築体の静脈内または動脈内投与は機械的な血管損傷直後にまたはまもなく行われる。好適な態様では、投与されるアデノウイルスベクターの量は約１０⁶プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌ〜１０¹²ｐｆｕ／ｍｌである。特に好適な態様では、投与されるベクターの量は１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌである。他の好適な態様では、ｔｋ遺伝子のトランスフェクションおよび発現をさせるためのレトロウイルスベクターの投与から約２４〜４８時間後に、ＧＣＶが約４〜約８日間にわたり１日に２回全身的に投与される。特に好適な態様では、ベクターの投与から３６時間後にＧＣＶが６日間の期間にわたり投与される。投与されるＧＣＶの量は狭窄の程度、患者の健康状態、並びに他の要素に依存するが、一般的には約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好適には約２５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子をコードするアデノウイルスベクターは以下の実施例に記載されているようにして構築される。実施例１ＨＳＶ−ｔｋアデノウイルスベクターの構築野生型アデノウイルス５型（Ａｄ５）の左端部のＥ３領域および９.２交差単位を欠失させそしてこの端位にプラスミドｐＡｄ−ＨＳＶ−ｔｋからのＨＳＶ− ｔｋ発現カセットを加えることにより、複製欠損組換え体アデノウイルスベクターＡｄ.ＨＳＶ−ｔｋを構築した（図１）。この発現カセットは、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子、ポリオーマウイルスエンハンサー、およびアデノウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）、カプシド化シグナルおよびＥ１ａエンハンサー領域を含有する。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子（Mansour et al.,(1988)Nature,336:348-352）をｐＡｄ −ＢｇｌII（Davidson et al.,(1993)Nature Genet.,3:219-223）のＢｇｌII部位に導入することにより、プラスミドｐＡｄ−ＨＳＶ−ｔｋを構築した。ＨＳＶｔｋ遺伝子をコードする種々のＤＮＡ構築体はメリーランド州、ロックヴィルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手でき、それらにはＡＴＣＣ３９３７１、ＡＴＣＣ３９３６９およびＶＲ−２０３６等がある。組換え体アデノウイルスベクターＡｄ.ＨＳＶ−ｔｋを構築するためには、ｐＡｄ−ＨＳＶ−ｔｋをＮｈｅｌで消化しそしてＸｂａｌおよびＣｌａｌでプレカットしたＳｕｂ３６０ＤＮＡ（Davidson et al.、上記文献）を用いてヒト胚腎臓細胞系２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）に同時トランスフェクションした。感染性ウイルスをプラーク精製により単離しそしてｔｋ遺伝子を発現するクローンをＧＣＶ処理により選択した。Ａｄ.ＨＳＶ−ｔｋおよびＡｄ５のウイルスの大量製造用には、Ｅ１ａおよびＥ１ｂ欠失突然変異体Ａｄ.△Ｅ１ａおよび△Ｅ１ｂを２９３細胞中で増殖させ、次に塩化セシウムグラジエントの中で超遠心により精製した。プラスミドｐＡｄ.ＨＳＶ−ｔｋおよびＡｄ.５ゲノムＤＮＡの間での２９３細胞中の相同組換えにより、組換え体アデノウイルスを構築した。簡単に述べると、２９３細胞を５μｇの線状化されたｐＡｄ.ＨＳＶ−ｔｋおよび５μｇの消化したＡｄ.５ＤＮＡを用いて同時トランスフェクションした。寒天を重層し３７ ℃において１０日間培養した後に、組換え体アデノウイルスを含有するプラークを取り出しそしてｔｋ活性に関してスクリーニングした。組換え体ウイルスストックを２９３細胞で調製した。細胞ペレットを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の中に再懸濁させ、３回の凍結−解凍により溶解しそして１,５００×ｇで２０分間遠心した。粗ウイルス上清を５０,０００×ｇで２時間、塩化セシウムグラジエントの中で遠心した。無傷のウイルス粒子を第２回目の塩化セシウム精製にかけて、２６０ｎｍにおける吸収により測定して５００〜７００μｌ中３〜６×１０¹³個のウイルス粒子を得た。濃縮ウイルスストックを、ＨａｍｓＦ１２培地中でのセファデックスＧ−５０によるゲル濾過により脱塩して、１〜２×１０¹²個のウイルス粒子／ｍｌの最終的な精製ストックを得た。ウイルス力価が０ .２〜２×１０¹²ｐｆｕ／ｍｌからの範囲のストックが得られた。全てのストックを、１０の感染多重度においてＨｅＬａ細胞に感染させ３０日間にわたって細胞を継代培養することによって複製コンピテントアデノウイルスの存在に関して評価した。これらの細胞内で細胞変性効果が観察されなかったため、複製コンピテントウイルスは存在しなかった。実施例２試験管内(in vitro)での平滑筋細胞に対するＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の効果ＧＣＶへの暴露後のブタの血管平滑筋細胞に対するＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の効果を評価するために、これらの細胞に試験管内でアデノウイルスベクターを感染させそしてＧＣＶに暴露した。ｔｋ遺伝子を欠失する対照アデノウイルスベクター（Ａｄ.△Ｅ１Ａ）を用いてトランスフェクションされた細胞はＧＣＶに対して完全に抵抗性であったが、Ａｄ.ＨＳＶ−ｔｋでトランスフェクションされた細胞は４８時間以内に完全に生育不能となった。形質導入された細胞と形質導入されなかった細胞との混合物では、２５％程度の少ない細胞がＡｄ.ＨＳＶ−ｔｋで形質導入されたときには、トランスフェクションされなかった細胞もＧＣＶ処置により影響を受けた。従って、種々の悪性腫瘍でこれまでに示されていたこのいわゆる「傍観者効果(bystander effect)」は試験管内での血管平滑筋細胞の抑制において有効であった。この効果はブタの内皮細胞並びにヒトの血管平滑筋および内皮細胞でも見られた。内膜平滑筋細胞の増殖は以下に記載されているように損傷したブタの動脈で測定された。実施例３ブタの動脈における平滑筋細胞増殖に対するバルーン損傷の効果家畜のヨークシャー（Yorkshire）ブタ（１２〜１５ｋｇ）に、２.２ｍｇ／ｋｇ（ＩＭ）のロンプン（rompum）と組合わされた６.０ｍｇ／ｋｇのゾラゼパミン（zolazepamin）／チレタミン（tiletamine）と１％の亜酸化窒素で麻酔をかけ、挿管しそして腸骨大腿骨動脈を無菌的手術で露出させた。二重バルーンカテーテル（Ｃ.Ｒ.バード・インコーポレーテッド）を腸骨大腿骨動脈の中に挿入した。近位バルーンを５００ｍｍＨｇの圧力で５分間にわたり膨張させた。動物を損傷から１、２、４、７、１４、２１および６０日後に屠殺した（ｎ＝１群当たり２匹の動物）。全ての動物は屠殺の１時間前に２５ｍｇ／ｋｇの総用量の５− ブロモ−２′−デオキシシチジン（ＢｒｄＣ）ミズーリ州、セントルイスのシグマ）の静脈内注入を受けた。チミジンアナログであるＢｒｄＣは複製中のＤＮＡの中に取り込まれ、これは細胞分裂の標識となる。抗ＢｒｄＣモノクローナル抗体を使用する免疫組織化学法を行って増殖中の細胞の核に標識をつけた。動脈断片をメチルカルノイ（Carnoy)溶液中で固定し、パラフィンに包埋し、６μｍの切片にし、キシレン中（３回交換）で脱パラフィン処理し、そして１００％、９５％および７５％エタノールの中で再生（rehydr ate）した。内因性ペルオキシダーゼを０.３％過酸化水素中での５分間にわたる予備インキュベーションによりブロックした。これらの切片を、１％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の中で、１：１０００の希釈度の抗ＢｒｄＣモノクローナル抗体（イリノイ州アーリントンハイツのアメルシャム）と共に室温において６０分間インキュベーションした。これらの切片をトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）の中ですすぎそして１：４００の希釈度のビオチン化されたウマの抗マウスＩｇＧ₂抗体（カリフォルニア州サウスサンフランシスコのジメド）と共に３０分間にわたり室温でインキュベーションした。検査試料をＴＢＳの中ですすぎそして１：５０００の希釈度のストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（カリフォルニア州、バーリンガムのベクター・ラボラトリーズ）を用いて３０分間にわたり室温で染色した。ＴＢＳ中での最終的すすぎ後に、これらの切片を１０分間にわたり室温で０.０４５％の塩化ニッケル中のジアミノベンジジン基質（シグマ）の中でインキュベーションして灰黒色の反応生成物を生成させた。メチルグリーン核対比染色法も行った。顕微鏡を基にしたビデオ像分析システム（ペンシルバニア州、ウエストチェスターのユニバーサル・イメージングのイメージ−１システム）を使用して標識されたおよび標識されなかった核の数を全ての動脈の断面において計数することにより、内膜平滑筋細胞の増殖を評価した。損傷した腸骨大腿骨動脈および損傷しなかった頸動脈を同一動物で試験した。これらの結果は、動脈内膜における細胞増殖が腸骨大腿骨動脈に対するバルーン損傷から約２４〜４８時間後に最初に現れたことを示した（図２）。細胞増殖は４日目にピークとなり、損傷後約７日間続きそして１４日までに減退した。動脈内膜の膨張は細胞増殖なしで損傷後２１日間までマトリックスの沈着の増加により続いた。この後には、増殖応答および内膜膨張はひどくなくなった。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子をコードする組換え体アデノウイルスベクターを次に以下に記載されているように機械的に損傷したブタの腸骨大腿骨動脈に形質導入した。実施例４ブタの動脈のバルーン損傷およびアデノウイルス形質導入家畜のヨークッシャーブタを実施例３に記載されている通りにして麻酔をかけそしてカテーテル処置をした。近位バルーンの膨張後に、バルーンをしぼませそしてカテーテルを、近位および末端バルーンの間の中心空間が先のバルーン損傷部を占めるように進めた。両バルーンを膨張させそしてその動脈部分をヘパリン加（heparinized）食塩水で灌流した。群１（ｎ＝２、４つの動脈）および群２（ｎ＝２、４つの動脈）の動物に、実施例１に記載された組換え体アデノウイルスベクターＡｄ.ＨＳＶ−ｔｋを２０分間にわたりカテーテルの中心空間中に入れた（１０¹⁰pfu/ｍl）。カテーテルを取り出しそしてアンチグレード血液流を回復させた。最も活発な新内膜増殖はバルーン損傷後の１日目と７日目の間で起きるため（図２）、バルーン損傷および形質導入後３６時間から始まる６日間にわたりカテーテルを内頚静脈（７.５ｍｌの合計容量）中に内在させることにより群１の動物に１日２回２５ｍｇ／ｋｇのＧＣＶを投与した。群２の動物は群１と等しい、体重に対し調節された量の静脈食塩水が投与された。追加の対照実験は群３および４の動物を含んでおり、そこではブタの腸骨大腿骨動脈のバルーン損傷を行い、その後にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含有しないＥ１ａ −欠失アデノウイルス（Ａｄ.△Ｅ１ａ）でトランスフェクションを行った。群１および２と等しい用量で、群４には食塩水が投与され、群３の動物にもＧＣＶが投与された。動物を２１日目に屠殺しそして動脈部を切除した。新内膜肥厚（neointimal hyperplasia）の抑制を以下の実施例に記載されているようにして評価した。実施例５新内膜肥厚の評価各々の腸骨大腿骨動脈を５つの断面片に切断した。２つの切片をメチルカルノイ液の中で固定したが、２つの切片はホルマリンの中で固定した。４つの片全てをパラフィンに包埋した。ＤＮＡ単離用に、１つの切片を液体窒素の中で凍結しそして−８０℃で保存した。平滑筋細胞は増殖の際に中膜から内膜に移動するため、内膜／中膜の厚さの比の測定がバルーン損傷後に起きる肥厚の程度を示す。内膜および中膜の面積の測定は盲験方式で測定された。動脈試料のスライドを顕微鏡を基にしたビデオ像分析システム（ペンシルバニア州、ウエストチェスターのユニバーサル・イメージングのイメージ−１システム）を使用して試験した。像をデジタル化し、内膜および中膜の領域をトレースしそして面積を計算した。各々の動脈中で、４つの断面を計算しそして内膜および中膜の厚さの比を計算した。４つの動物群の間の、内膜および中膜の厚さ並びに内膜対中膜比の比較をダンネットテストによる偏差分析により行った。統計学的有意さが９５％の信頼水準で認められた。群１〜４からの動脈試料の定量的な形態計分析は、Ａｄ.ＨＳＶ−ｔｋ−ＧＣＶ動物（群２）、Ａｄ.△Ｅ１ａ＋ＧＣＶ（群３）およびＡｄ.△Ｅ１ａ−ＧＣＶ（群４）の動物に比べて、Ａｄ.ＨＳＶ−ｔｋ＋ＧＣＶ動物（群１）における内膜対中膜の厚さの比の有意の減少を示した（全てｐ＜０.０５）。これらの結果は、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のアデノウイルストランスフェクションおよびＧＣＶを用いる処置が生体内で内膜平滑筋細胞増殖の５０％抑制を生じたことを示した（Ａｄ.ＴＫ−ＧＣ対ＡＤ.ＴＫ＋ＧＣ、図３）。アンペアドツーテイル（unpaired two-tailed)Ｔ−テストが０.０１のＰ値を示したため、これらの値は有意である。対照的に、Ｅ１ａ−欠失アデノウイルスベクターが投与された動物の間では、それらがＧＣＶで処置されたかどうかとは無関係に、差は見られなかった。ブタの動脈におけるアデノウイルスベクターの毒性を評価するために、Ｅ１ａ −欠失アデノウイルスを以下に記載されているように未損傷のブタの動脈にトランスフェクションした。実施例６ブタの動脈におけるアデノウイルスベクターの毒性Ｅ１ａ欠失アデノウイルスを未損傷のブタの動脈に１０⁹ｐｆｕ／ｍｌ（ｎ＝２）および１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌ（ｎ＝２）で実施例４に記載されている通りにしてトランスフェクションした。光学顕微鏡による３週間目の動脈断面の分析は、炎症または壊死の兆候を示さなかった。定量的形態計測による評価では、内膜および中膜肥厚は未処置の対照と比べて存在しなかった。脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、骨格筋、卵巣および睾丸を含むこれらの動物からのトランスフェクションされなかった組織を器官病理学に関して光学顕微鏡によりそして酵素異常に関して血清生化学分析により分析した。これらのパラメーターでは変化は見られなかった。さらに、ポリメラーゼ連鎖反応による検査で、アデノウイルスＤＮＡはこれらの組織中で観察されなかった。それ故、この処置のために使用された動脈内に投与された量のアデノウイルスベクターの生体内毒性は最少であった。実施例７ヒトにおける新内膜肥厚の予防バルーン血管形成法を受けた後に、患者に実施例１に記載されたＡｄ.ＨＳＶ −ｔｋアデノウイルスベクターを、動脈内にカテーテルを通して入れられる１０⁸ 〜１０¹²ｐｆｕ／ｍｌの注入により投与する。３６時間後に、患者に静脈注射で１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇのＧＣＶを１２時間間隔で４〜８日間にわたり投与する。ブタの内膜肥厚化はヒトのものと非常に良く似ているが、バルーン損傷に関連する内膜の肥厚化はブタの動脈中とは異なる速度で進行するかもしれないため、ＧＣＶ投与の日数を調節する必要があるかもしれない。処置の効果は処置数カ月後に血管造影で評価する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年３月２６日【補正内容】［１３〜１４頁の翻訳文］１５．機械的処置後の哺乳動物の血管にシトシンデアミナーゼ遺伝子を含むポリヌクレオチドを導入し、前記血管の細胞内で前記シトシンデアミナーゼ遺伝子を発現させてシトシンデアミナーゼ蛋白質を産生させ、次いで前記哺乳動物に、前記シトシンデアミナーゼ蛋白質によりリン酸化可能な有効量のＤＮＡ複製を阻害するヌクレオシドアナログを投与し、前記リン酸化されたアナログを増殖中の細胞のＤＮＡの中に優先的に取り込ませ、それにより前記増殖中の細胞を死滅させることを含む、哺乳動物における血管の機械的処置に伴う再狭窄を抑制する方法。１６．前記ヌクレオシドアナログが５−フルオロシトシンである請求の範囲第１５項記載の方法。１７．チミジンキナーゼ遺伝子と、該チミジンキナーゼ遺伝子がコードするチミジンキナーゼタンパク質によりリン酸化可能な有効量のＤＮＡ複製を阻害するヌクレオシドアナログとを組み合わせて含むポリヌクレオチドの、哺乳動物の血管の機械的処置に伴う再狭窄の治療用医薬の製造における使用。１８．前記ヌクレオシドアナログがガンシクロビルまたはアシクロビルである請求の範囲第１７項記載の使用。１９．前記チミジンキナーゼ遺伝子が真核生物発現ベクターの中にある請求の範囲第１７項記載の使用。２０．前記発現べクタベンチーがウイルスベクターである請求の範囲第１９項記載の使用。２１．前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである請求の範囲第２０項記載の使用。２２．さらに前記チミジンキナーゼ遺伝子の上流にポリオーマウイルスエンハンサーも含む請求の範囲第１９項記載の使用。２３．さらにアデノウイルスベクターエンハンサー要素、カプシド化シグナル、および複製開始点も含む請求の範囲第２２項記載の使用。２４．前記アデノウイルスがＡｄ.ＨＳＶ−ｔｋである請求の範囲第２１項記載の使用。２５．前記チミジンキナーゼ遺伝子を含有する前記発現ベクターが非ウイルスベクターと複合化されている請求の範囲第１９項記載の使用。２６．前記非ウイルスベクターがリポソームである請求の範囲２５項記載の使用。２７．前記非ウイルスベクターが受容体リガンドでありそして前記発現ベクター −リガンド複合体が受容体に結合する請求の範囲第２５項記載の使用。２８．前記機械的処置が、バルーン血管形成法、レーザー、アテローム切除装置またはステント移植である請求の範囲第１７項記載の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 35/76 9283−4ＣＡ６１Ｋ 35/76 38/45 9359−4ＢＣ１２Ｎ 9/12 38/48 9282−4Ｂ 15/00 ＡＣ１２Ｎ 9/12 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/547 15/09 9051−4Ｃ 37/52 //(Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者ネイベル，ゲイリー，ジェイ. アメリカ合衆国，48105 ミシガン，アンアーバー，アンドーバーロード 3390 番地

Claims

【特許請求の範囲】１．機械的処置後の哺乳動物の血管にチミジンキナーゼ遺伝子を含むポリヌクレオチドを導入し、前記血管の細胞内で前記チミジンキナーゼ遺伝子を発現させてチミジンキナーゼ蛋白質を産生させ、次いで前記哺乳動物に、前記チミジンキナーゼ蛋白質によりリン酸化可能な有効量のＤＮＡ複製を阻害するヌクレオシドアナログを投与して、それにより前記リン酸化されたアナログを増殖中の細胞のＤＮＡの中に優先的に取り込ませ、そしてそれにより前記増殖中の細胞を死滅させることを含む、哺乳動物における血管の機械的処置に伴う再狭窄を抑制する方法。２．前記機械的処置が、バルーン血管形成、レーザー、アテローム切除装置またはステント移植である請求の範囲第１項記載の方法。３．前記チミジンキナーゼ遺伝子が真核生物発現ベクターの中にある請求の範囲第１項記載の方法。４．前記発現ベクターがウイルスベクターの中にある請求の範囲第３項記載の方法。５．前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである請求の範囲第４項記載の方法。６．さらに前記チミジンキナーゼ遺伝子の上流にポリオーマウイルスエンハンサーも含む請求の範囲第３項記載の方法。７．さらにアデノウイルスベクターエンハンサー要素、カプシド化シグナルおよび複製開始点も含む請求の範囲第６項記載の方法。８．前記アデノウイルスベクターがＡｄ.ＨＳＶ−ｔｋである請求の範囲第５項記載の方法。９．前記チミジンキナーゼ遺伝子を含有する前記発現ベクターが非ウイルスベクターと複合化されている請求の範囲第３項記載の方法。１０．前記非ウイルスベクターがリポソームである請求の範囲第９項記載の方法。１１．前記非ウイルスベクターが受容体リガンドでありそして前記発現ベクター −リガンド複合体が受容体に結合する請求の範囲第９項記載の方法。１２．前記ヌクレオシドアナログがガンシクロビルまたはアシクロビルである請求の範囲第１項記載の方法。１３．前記リン酸化されたアナログがさらに細胞内酵素によりリン酸化される請求の範囲第１項記載の方法。１４．前記リン酸化された化合物が急速分裂中の細胞のＤＮＡの中に優先的に取り込まれる請求の範囲第１３項記載の方法。１５．機械的処置後の哺乳動物の血管にシトシンデアミナーゼ遺伝子を含むポリヌクレオチドを導入し、前記血管の細胞内で前記シトシンデアミナーゼ遺伝子を発現させてシトシンデアミナーゼ蛋白質を産生させ、次いで前記哺乳動物に、前記シトシンデアミナーゼ蛋白質によりリン酸化可能な有効量のＤＮＡ複製を阻害するヌクレオシドアナログを投与し、前記リン酸化されたアナログを増殖中の細胞のＤＮＡの中に優先的に取り込ませ、それにより前記増殖中の細胞を死滅させることを含む、哺乳動物における血管の機械的処置に伴う再狭窄を抑制する方法。１６．前記ヌクレオシドアナログが５−フルオロシトシンである請求の範囲第１５項記載の方法。１７．Ｅ３領域および約９交差単位が欠失した野生型アデノウイルスと、プロモーター、エンハンサー、カプシド化シグナルおよび複製開始点の要素に作用可能に結合されている単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を含む、前記欠失部に挿入されたＨＳＶ−ｔｋ発現カセットとを含む組換え体アデノウイルスベクターＡｄ.ＨＳＶ−ｔｋ。１８．前記野生型アデノウイルスが５型である請求の範囲第１７項記載のベクター。１９．前記要素がポリオーマウイルスおよびアデノウイルス由来である請求の範囲第１８項記載のベクター。２０．機械的処置後の哺乳動物の血管にチミジンキナーゼ遺伝子を含むポリヌクレオチドを導入し、前記血管の細胞内で前記チミジンキナーゼ遺伝子を発現させてチミジンキナーゼ蛋白質を産生させ、次いで前記哺乳動物に、前記チミジンキナーゼ蛋白質によりリン酸化可能な有効量のＤＮＡ複製を阻害するヌクレオシドアナログを投与して、それにより前記リン酸化されたアナログを増殖中の細胞のＤＮＡの中に優先的に取り込ませ、そしてそれにより前記増殖中の細胞を死滅させることを含む、哺乳動物における血管の機械的処置に伴う再狭窄を抑制するための、チミジンキナーゼ遺伝子を含むポリヌクレオチドの使用。２１．前記機械的処置が、バルーン血管形成法、レーザー、アテローム切除装置またはステント移植である請求の範囲第２０項記載の方法。２２．前記チミジンキナーゼ遺伝子が真核生物発現ベクターの中にある請求の範囲第２０項記載の方法。２３．前記発現ベクターがウイルスベクターである請求の範囲第２２項記載の方法。２４．前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである請求の範囲第２３項記載の方法。２５．さらに前記チミジンキナーゼ遺伝子の上流にポリオーマウイルスエンハンサーも含む、請求の範囲第２２項記載の方法。２６．さらにアデノウイルスベクターエンハンサー要素、カプシド化シグナル、および複製開始点も含む請求の範囲第２５項記載の方法。２７．前記アデノウイルスがＡｄ.ＨＳＶ−ｔｋである請求の範囲第２４項記載の方法。２８．前記チミジンキナーゼ遺伝子を含有する前記発現ベクターが非ウイルスベクターと複合化されている請求の範囲第２２項記載の方法。２９．前記非ウイルスベクターがリポソームである請求の範囲２８項記載の方法。３０．前記非ウイルスベクターが受容体リガンドでありそして前記発現ベクター −リガンド複合体が受容体に結合する請求の範囲第２８項記載の方法。３１．前記ヌクレオシドアナログがガンシクロビルまたはアシクロビルである請求の範囲第２０項記載の方法。３２．前記リン酸化されたアナログがさらに細胞内酵素によりリン酸化される請求の範囲第２０項記載の方法。３３．前記リン酸化された化合物が急速に分裂する細胞のＤＮＡの中に優先的に取り込まれる請求の範囲第３２項記載の方法。