ES2226597T1 - Vectores recombinantes virales y no virales que contienen el gen humano de urokinasa del activador del plasminogeno y su utilizacion en el tratamiento de varios tipos de fibrosis hepatica, renal, pulmonar, pancreatica y cardiaca y cicatrices hipertroficas. - Google Patents

Vectores recombinantes virales y no virales que contienen el gen humano de urokinasa del activador del plasminogeno y su utilizacion en el tratamiento de varios tipos de fibrosis hepatica, renal, pulmonar, pancreatica y cardiaca y cicatrices hipertroficas.

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Abstract

La presente invención describe vectores adenovirales recombinantes en los cuales se ha deleccionado los marcos de lectura El y/o E3, que contienen un gen terapéutico que se selecciona entre el gen del activador del plasminógeno derivado de la uroquinasa humano (huPA), el gen del receptor truncado tipo II de TGF-beta y el gen del factor de crecimiento para hepatocitos (HGF) entre otros. La invención también describe métodos de preparación de los vectores, composiciones realizadas con los vectores y el uso de los mismos en terapia génica para la cirrosis y otros tipos de fibrosis.

Claims (65)

1. Procedimiento para preparar vectores recombinantes adenoviral y no adenoviral mediante la clonación de genes informadores y la codificación de ADNc para proteínas terapéuticas destinadas al tratamiento de fibrosis hepática, pulmonar, renal, miocárdica y pancreática, cicatrices hipertróficas y queloides, en mamíferos, incluyendo seres humanos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el gen informador se selecciona de entre un gen beta-galactosidasa bacteriano (lac-Z).
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el gen terapéutico se selecciona de entre el gen humano de urokinasa salvaje y/o modificada derivada del activador del plasminógeno; y del gen del receptor truncado de tipo II para TGF-\beta que codifica para las proteínas terapéuticas que degradan y/o previenen la síntesis y la deposición del exceso de proteínas colágenas depositadas en los órganos cirróticos.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la proteína codificada por el ADNc modificado del gen humano de urokinasa derivada del activador del plasminógeno huPA activa las colagenasas latentes del hígado y las metaloproteinasas de la matriz (MMP) para facilitar la degradación in situ de los componentes de colágeno de la matriz extracelular (ECM) en el espacio de Disse o perisinusoide.
5. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la proteína codificada por el ADNc del gen humano de urokinasa derivada del activador del plasminógeno huPA restablece además la masa funcional del hígado induciendo a los hepatocitos remanentes a producir réplicas, repoblando así la parenquimia hepática para obtener la regeneración y curación del hígado dañado.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el gen terapéutico consiste en una secuencia de ADNc seleccionada de entre el factor de crecimiento del hepatocito HGF que codifica para la proteína que estimula la regeneración del hígado restableciendo así el funcionamiento normal del hígado y de otros órganos afectados por la misma patología.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la regeneración del hígado, tras la degradación extracelular (ECM) estimulada por la activación in situ del gen del factor de crecimiento del hepatocito HGF fue medido según el porcentaje de células marcadas con un anticuerpo específico frente a la proliferación de antígenos celulares nucleares (PCNA).
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el número de hepatocitos positivos PCNA fue diez veces superior en los hígados de ratas tratados con el vector adenoviral recombinante pAd.PGK-\DeltaN\Delta-huPA que en los hígados normales y en los hígados de ratas tratados con pAd-GFP y normal.
9. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el marcaje mostró que aproximadamente el 55% de los hepatocitos fueron marcados positivamente por anticuerpos anti-PCNA, tanto en zonas periportales como centrilobulares dos días después de haber inyectado el vector adenoviral recombinante pAd.PGK-\DeltaN\DeltaC-hUPA.
10. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la célula positiva detectada al día 10 muestra el restablecimiento de la masa funcional del hígado, que fue confirmada mediante la clara tendencia en las pruebas funcionales del hígado tales como AST, ALT, Bilirrubina y tiempos de protrombina.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los vectores recombinantes virales se seleccionan de entre vectores adenovirales de primera, segunda, tercera y/o cuarta generación, "destripados", vectores adenovirales, vectores retrovirales y vectores adenoasociados.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los vectores no virales recombinantes están constituidos por componentes fosfolípidos, liposomas de diferentes estructuras y combinados con diferentes ligandos para receptores específicos.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que los vectores no virales se seleccionan de entre plásmidos y liposomas catiónicos y aniónicos.
14. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los vectores recombinantes virales o no virales están preparados mediante la construcción y acoplamiento del ADNc del gen humano de urokinasa salvaje y/o modificada derivada del activador del plasminógeno huPA, y del ADNc del gen de tipo II para TGF-\beta del receptor truncado y del ADNc del factor de crecimiento del hepatocito HGF con plásmidos procedentes de diferentes orígenes y con promotores regulables y/o inducibles.
15. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el vector adenoviral recombinante es pAd.PGK-\DeltaN\DeltaC-huPA.
16. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la entrega de genes terapéuticos o de secuencias de ADN que codifican para proteínas terapéuticas destinadas al tratamiento de la fibrosis en hígados cirróticos.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la entrega de genes terapéuticos es conducida en otros órganos afectados por fibrosis generalizada.
18. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la administración de genes terapéuticos también se realiza mediante el reconocimiento específico de los genes terapéuticos en los órganos fibróticos mediante la ruta de administración utilizada y mediante el tropismo natural de los hígados cirróticos del vector recombinante utilizado.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la ruta de administración es endovenosa.
20. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que los órganos fibróticos se seleccionan de entre el hígado, el pulmón, el corazón, los riñones, el páncreas, la piel y las cicatrices hipertróficas, en mamíferos, incluyendo seres humanos.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que el principal órgano objetivo es el hígado.
22. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la entrega de genes terapéuticos es conducida mediante la utilización de vectores virales o no virales.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que los vectores virales se seleccionan de entre vectores adenovirales de primera, segunda, tercera y/o cuarta generación, "destripados", vectores adenovirales, vectores retrovirales y vectores adenoasociados.
24. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que los vectores no virales están constituidos por componentes fosfolípidos, liposomas de diferentes estructuras y combinados con diferentes ligandos para receptores específicos.
25. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que los vectores virales y no virales están preparados mediante la construcción y acoplamiento del ADNc del gen humano de urokinasa salvaje y/o modificada derivada del activador del plasminógeno huPA, y del ADNc del gen de tipo II para TGF-\beta del receptor truncado con plásmidos procedentes de diferentes orígenes y con promotores regulables y/o inducibles.
26. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que los vectores no virales se seleccionan de entre plásmidos y liposomas catiónicos y aniónicos.
27. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la entrega eficiente del gen humano de urokinasa derivada del activador del plasminógeno huPA en el hígado cirrótico puede causar la degradación del colágeno mediante la sobreexpresión de metaloproetasa.
28. Procedimiento según las reivindicaciones 16 a 27, caracterizado porque se utiliza para el tratamiento de fibrosis cirrótica, pulmonar, renal, miocárdica y pancreática así como cicatrices hipertróficas y queloides.
29. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la expresión del gen humano terapéutico huPA administrado a animales cirróticos puede detectarse mediante pruebas de ELISA e inmunoquímica a través de la expresión de la proteína humana correspondiente.
30. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la expresión de los genes de colágenos endógenos de tipo I, III y IV fue evaluada mediante RT-PCR semicuantitativos, que permitieron la detección de cambios específicos en los niveles de línea de base de dichos genes.
31. Procedimiento según la reivindicación 30, en el que la expresión del colágeno de tipo I descendió cuatro veces el día 10, la expresión del colágeno de tipo III descendió aproximadamente dos veces el día 10, y la expresión del colágeno del tipo IV descendió aproximadamente cinco veces el día 6, en ratas tratadas con el vector adenoviral recombinante pAd.PGK-\DeltaN\DeltaC-huPA comparado con ratas tratadas con adenovirus pAd-GFP irrelevantes.
32. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que la sobreexpresión de huPA induce la interrupción de los genes de los colágenos endógenos de tipo I, III y IV que codifican para proteínas EMC.
33. Vector adenoviral recombinante obtenido mediante el procedimiento según la reivindicación 1, que contiene un genoma adenoviral del que se han eliminado los marcos de lectura abiertos E1 y/o E3, pero reteniendo una secuencia suficiente para hacer que el vector adenoviral produzca réplicas in vitro, caracterizado porque dicho vector contiene un gen terapéutico o una secuencia de ADN de interés regulada por promotores ubicuos y/o promotores tisulares específicos, o promotores inducibles y/o regulables que codifican para proteínas terapéuticas útiles en el tratamiento de la fibrosis.
34. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 33, en el que el promotor es un promotor del citomegalovirus (CMV).
35. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 33, en el que el gen terapéutico o la secuencia de ADN clonada en dicho vector adenoviral se selecciona de entre el gen humano de urokinasa huPA salvaje y/o modificada derivada del activador del plasminógeno y de gen del tipo II para TGF-beta del receptor truncado que codifica para las proteínas terapéuticas que degradan y/o evitan la síntesis y deposición del exceso de proteínas colágenas depositadas en los órganos cirróticos.
36. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 33, en el que el gen terapéutico es una secuencia de ADN seleccionada de entre el gen de Factor de Crecimiento del Hepatocito (HGF), que codifica para las proteínas destinadas a estimular la regeneración hepática con el fin de restablecer las funciones normales del hígado.
37. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 33, en el que las proteínas terapéuticas destinadas al tratamiento de la fibrosis son la urokinasa humana salvaje y/o modificada derivada del activador del plasminógeno; el receptor truncado de tipo II para TGF-beta y el factor de crecimiento del hepatocito HGF.
38. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 33, que contiene además la entrega de genes terapéuticos o de secuencias de ADN que codifican para proteínas terapéuticas destinadas al tratamiento de la fibrosis en hígados cirróticos.
39. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 38, en el que la entrega de genes terapéuticos se realiza en otros órganos con fibrosis generalizada.
40. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 38, en el que la entrega de genes terapéuticos también es conducida mediante el reconocimiento de tejido específico de los genes terapéuticos en los órganos fibróticos mediante la vía de administración utilizada y mediante el tropismo natural de un hígado cirrótico de los vectores recombinantes utilizados.
41. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 40, en el que la vía de administración es endovenosa.
42. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 39, en el que los órganos con fibrosis se seleccionan de entre el hígado, el pulmón, el corazón, el riñón, el páncreas, la piel, y las cicatrices hipertróficas, en mamíferos, incluyendo seres humanos.
43. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 42, en el que el principal órgano objetivo es el hígado.
44. Vector adenoviral recombinante según las reivindicaciones 33 a 43, que es pAd.PGK-\DeltaN\DeltaC-huPA.
45. Vector recombinante según la reivindicación 38, en el que la transmisión de genes terapéuticos es conducida mediante la utilización de vectores virales y no virales.
46. Vector recombinante según la reivindicación 45, en el que los vectores virales se seleccionan de entre la primera, segunda, tercera y/o cuarta generación de vectores adenovirales, "destripados", vectores adenovirales, vectores retrovirales y vectores adenoasociados.
47. Vector recombinante según la reivindicación 45, en el que los vectores no virales pueden estar constituidos por fosfolípidos, liposomas de diferentes estructuras y combinados con diferentes ligandos para receptores específicos.
48. Vector recombinante según la reivindicación 45, en el que los vectores virales y no virales están preparados mediante la construcción y acoplamiento del ADNc del gen humano de urokinasa salvaje y/o modificada derivada del activador del plasminógeno y del ADN del gen tipo TGF-beta del receptor truncado con plásmidos de diferentes orígenes y con promotores regulables y/o inducibles.
49. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 47, en el que los vectores virales se seleccionan de entre plásmidos y liposomas catiónicos y no catiónicos.
50. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 38, en el que la entrega eficiente del gen humano de urokinasa derivada del activador del plasminógeno huPA en el hígado puede inducir la degradación del colágeno mediante la sobreexpresión de metaloproteasas.
51. Vector adenoviral recombinante según las reivindicaciones 33 a 50, caracterizado porque se utiliza para el tratamiento de fibrosis hepática, pulmonar, renal, miocárdica y pancreática, cicatrices hipertróficas y queloides, sin inducir toxicidad letal en mamíferos, incluyendo seres humanos.
52. Vector adenoviral recombinante según las reivindicaciones 33 a 51, en el que la ventaja adicional de utilizar dichos vectores recombinantes consiste en que, dado que no segregan una cantidad importante de huPA, no causan hipercoagulación o hemorragia espontánea, que constituye la principal desventaja en animales cirróticos.
53. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 52, en el que una forma de huPA no segregado con modificación de signos de retención en el retículo endoplásmico (RE) en los terminales amino o terminales carboxi se utiliza para prevenir en la medida de lo posible su segregación en la corriente sanguínea.
54. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 53, en el que el ADNc de huPA clonado en pGEM3 en 718 sitios de Xba I-Asp se modifica en la terminal carboxi añadiendo una secuencia que codifica para la señal KDEL, y también deja residuos corriente arriba mediante la clonación de nucleótidos generados 75 PCR.
55. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 54, en el que la terminal amino 25 de aminoácidos que incluye la señal peptídica pre-uPA se sustituyó por la señal de retención de la terminal amino (RR) próxima al ancla en la región transmembránica (TM) separada por un péptido espaciador de 31 aminoácidos de una transmembrana II de la proteína lip 33 obtenida por PCR.
56. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 55, en el que la secuencia de RR está constituida por un residuo de arginina MHRRRSR localizado cerca de la región de anclaje de la transmembrana (TM) y está presente en las proteínas de transmembrana de tipo II tales como la proteína de cadena invariable lip 33.
57. Vector adenoviral recombinante según la reivindicación 53, en el que el gen huPA modificado es clonado en el plásmido adenoviral pAd.\DeltaN\DeltaC-huPA para la producción del vector adenoviral recombinante.
58. Composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva, con un régimen de dosis unitaria, de partículas virales de los vectores adenovirales recombinantes según las reivindicaciones 33 a 57, para el tratamiento de fibrosis cirrótica, pulmonar, renal, miocárdica y pancreática, cicatrices hipertróficas y queloides, combinada con un portador farmacéuticamente aceptable.
59. Composición farmacéutica según la reivindicación 58, en la que la dosis unitaria contiene aproximadamente entre 10^{7} y 10^{14} de partículas virales por individuo fibrótico.
60. Utilización de vectores adenovirales recombinantes, y otros vectores virales y no virales según las reivindicaciones 33 a 57, para preparar un fármaco que contenga un cantidad terapéuticamente efectiva, con un régimen de dosis unitaria, de partículas virales para el tratamiento de fibrosis cirrótica, pulmonar, renal, miocárdica y pancreática, cicatrices hipertróficas y queloides, sin inducir toxicidad letal, en mamíferos incluyendo seres humanos.
61. Utilización según la reivindicación 60, en el que la dosis unitaria contiene aproximadamente entre 10^{7} y 10^{14} de partículas virales por individuo fibrótico.
62. Procedimiento para el tratamiento de fibrosis cirrótica, pulmonar, renal, miocárdica y pancreática, cicatrices hipertróficas y queloides, en mamíferos, incluyendo seres humanos, que consiste en la administración de un vector adenoviral recombinante según las reivindicaciones 33 a 57.
63. Procedimiento para el tratamiento de fibrosis cirrótica, pulmonar, renal, miocárdica y pancreática, cicatrices hipertróficas y queloides, en mamíferos, incluyendo seres humanos, que consiste en la administración de una composición farmacéutica según las reivindicaciones 58 a 59.
64. Procedimiento según las reivindicaciones 62 ó 64, en el que la vía de administración es endovenosa.
65. Procedimiento según las reivindicaciones 62 ó 63, en el que la dosis unitaria contiene aproximadamente entre 10^{7} y 10^{14} de partículas virales por individuo fibrótico.
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