JP2004527224A - ヒトのウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子の遺伝子を含む組換えウイルスベクターおよび非ウイルスベクター、および肝線維症、腎線維症、肺線維症、膵線維症、心臓線維症などのさまざまなタイプの線維症、および肥厚性瘢痕の治療におけるその有用性 - Google Patents
ヒトのウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子の遺伝子を含む組換えウイルスベクターおよび非ウイルスベクター、および肝線維症、腎線維症、肺線維症、膵線維症、心臓線維症などのさまざまなタイプの線維症、および肥厚性瘢痕の治療におけるその有用性 Download PDFInfo
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Description
【0001】
本発明は、クロ−ン化されたヒトのウロキナーゼ由来プラスミノゲン活性化因子の遺伝子の相補的DNA(本明細書では以後huPA cDNA)を有する、組換えウイルスベクター、非ウイルスベクター、プラスミドベクター、および合成ベクター作製に関する。本発明はまた、TGF−βタイプIIの端部切断レセプター遺伝子の使用にも関する。ウイルスベクターは、第1世代、第2世代、第3世代および/または第4世代のアデノウイルスベクター、「中抜き」(gutless)アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが使用できるが、これらに限定されない。非ウイルスベクターは、リン脂質成分、および特定のレセプター用の種々のリガンドと合体した種々の構造のリポソームからなる。合成ベクターは、huPA cDNAおよびTGF−βタイプII端部切断レセプター(遺伝子)と、種々の起源のプラスミドと制御プロモーターからなる構築体/結合体であることができる。huPA cDNAは、肝硬変および広汎性の線維症(たとえば腎線維症、肺線維症、膵線維症、心臓線維症、肥厚性瘢痕およびケロイド(皮膚瘢痕))および/または繊維症になりやすい他の標的器官)の治療や回復に有用な治療用タンパク質をコードする。本発明は、治療用huPA遺伝子を慢性的線維症になっている器官に送達することによる、病変細胞のin vivoでの組織特異的な認識の機構にも関する。
【0002】
さらに本発明は、本明細書において特許請求する組換えベクターを使用することによる線維症を治療するための有効な方法、およびこれらのベクターの作製に関する方法、これらのベクターを含む薬剤組成物、治療法、および線維症の治療におけるその治療上の使用を提供する。これは製薬産業における商業上の将来性が高く、線維症を特徴とする慢性変性疾患の治療に関する実験的な遺伝子治療の重要な選択肢でもあり、現代医学の分野で重要な治療用途がある
【0003】
緒言
肝硬変の疫学および生理病理学
肝硬変は、重大な死亡原因であり世界的な健康問題の1つである。肝硬変は、通常慢性的なアルコール摂取およびC型肝炎感染によって引き起こされる末期の病気であり、成人がなった場合、完全に治療できる方法は存在しない。米国では約1400万人の人々がアルコール依存症に冒されており、この数字はメキシコでも同等である(Mariani、S.、Birmingham、K.及び Novak、K.「アルコール障害をノックアウトする」 Nature Med.1999:5(11):1243)。肝硬変は、それが労働人口における死因の4番目であり100%有効な治療法は存在しないために、メキシコでは深刻な健康問題であるとみなされている。さらに肝硬変は、胆道閉塞の結果として子供の死因でもある。しかしながらこの場合は、発病率は非常に低く、Kasaiシャントを介した外科手術的手法によって、数ヶ月の間は病気が緩和される。しかしながら、前記外科手術を受ける子供たちの50%は数ヶ月以内に死亡してしまい、シャントの効果がいくらかでもあった残りの子供たちは、できれば肝臓移植へと向かう。現在、他の慢性変性疾患には遺伝子治療のプロトコルは存在するが、今日まで、遺伝子治療を使用して肝硬変を治すプロトコルは報告されていない。したがって本発明では、この遺伝子治療プロトコルを前臨床レベルで開発したものである。ヒトにこれを使用するには、主要な送達法であるウイルスベクター、非ウイルスベクター、プラスミドベクター、および合成ベクターを使用して、硬変の進んだ肝臓中へ、治療用タンパク質をコードする遺伝子をうまく安全に送達できるかどうかによる。この目的のために、すでに前臨床的研究を行って、肝硬変ウィスターラットにおいて、遺伝子lacZをレポーター遺伝子として有するアデノウイルスベクターの安全性、形質導入効率、毒性および生体内分布を測定した(メキシコ特許出願第998515号、係属中)。肝臓の機能を著しく悪化させることなく、ダメージを受けた肝臓に外来性遺伝子を送達するためのアデノウイルスベクターが使える可能性を証明してから、硬変肝臓に対する「治療用遺伝子」の影響を評価した。
【0004】
肝硬変は、肝臓柔組織全体、主に中心静脈および門脈の周辺で、肝臓の星状細胞によって合成される細胞外マトリックスのタンパク質(特にI、IVおよびIII型コラーゲン)が蓄積する線維形成の増大が特徴である(Arthur、M.J.P.「コラゲナーゼと肝臓繊維症」J.Hepatology 1995:22:43−48;Kim、T.H.Mars、W.M.、Stolz、D.B.、Petersen、B.E.、及び Michalopoulos、G.K.「ラットにおける肝再生の初期段階における細胞外マトリックスのリモデリング」Hepatology 1997:26:896−904;及び Olaso、E.及び Friedman、S.L.「肝臓繊維形成の分子制御」J.Hepatology 1998:29:836−847)、その蓄積によって洞様血管と肝細胞の間の栄養分の自由な交換を遮断する障壁が形成され、機能の低下がもたらされる(図1A)(Arthur、M.J.P.「コラゲナーゼと肝臓繊維症」J.Hepatology 1995:22:43−48;及び Kim、T.H.Mars、W.M.、Stolz、D.B.、Petersen、B.E.、及び Michalopoulos、G.K.「ラットにおける肝再生の初期段階における細胞外マトリックスのリモデリング」Hepatology 1997:26:896−904)。したがって、本発明の発明者は、組換えウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを遺伝子治療に使用して、硬変肝臓の主徴である悪化した線維形成を元に戻し、次いで肝臓細胞の増殖を促進する遺伝子を誘導することによって、機能的な肝臓塊の早急な再建を促進するという理論を提示している。この目的のために、前記ベクター中にヒトのウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子(huPA)の改変型DNAをクローン化するが、これは一連の事象のカスケードを活性化し(図1Bの下部)、潜在性の肝臓コラゲナーゼまたはマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)を活性化して、類洞周囲腔すなわちディッセ腔中の過剰な細胞外マトリックス(ECM)のin situでの分解を促進する。沈着した過剰な細胞外マトリックスは、肝細胞間の栄養分の交換および血液の循環を遮断するので肝臓の機能が悪くなる。huPAは残存肝細胞の複製を誘導して肝臓塊が再建され、このようにして肝臓実質が再び増える(図1B)。前記組換えベクターを使用する理由は、これらのベクターは多量のhuPAを分泌しないので、肝硬変動物での主な傷害である凝血性低下または突発性の出血を引き起こすことがないという、さらなる利点があるためである。このように、有益な事象である2つの異なるカスケードを誘導するので、改変型huPA cDNAによる治療は、肝硬変を治療するために非常に有用な可能性がある。今日まで、100%の効率で肝臓コラーゲンの累進的な蓄積を元に戻すかつ/あるいは妨げる治療剤は記載されていない。
【0005】
肝硬変において起こるこのような生理病理学的変化は一定で、特に肺、心臓、腎臓、膵臓および皮膚などの、線維症を起こす他の器官にも共通であり、本発明の保護範囲を限定するものではない。したがって、ここに示す肝硬変を治療するための方法は、線維症になりやすい、あるいは線維症になった器官にも適用することができよう。
【0006】
肝臓の遺伝子治療におけるウイルスベクターおよび非ウイルスベクター
この技術を実施するために本発明ではウイルスベクターとして、第1世代、第2世代、第3世代および/または第4世代のアデノウイルスベクター、「中抜き」アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターを使用するが、それに限定されない。非ウイルスベクターは、プラスミド、リン脂質成分、および特定のレセプター用の種々のリガンドと合体した種々の構造のリポソーム(カチオン性およびアニオン性)で構成されてよい。合成ベクターは、huPA cDNAおよびTGF−βタイプII端部切断レセプターのcDNAと、種々の起源のプラスミドおよび調節および/または誘導プロモーターの構築体・結合体からなる。プロトコルの多くは、レトロウイルスベクターを使用して、肝細胞中に遺伝子を導入している(Douglas J.T.、及び Curiel D.T.「遺伝子治療のためのベクターとしてのアデノウイルス」Science 及び Medicine March/April 1997 44−53)。しかしながら、これらのベクターは自己複製可能なウイルスを生じる可能性があるので、予防措置を講じなければならない。これらのベクターの利点の1つは、ベクターにはそのゲノムを安定にホスト細胞の染色体に組み込む能力があるので、レトロウイルス中にクローン化された治療用トランス遺伝子が無期限に発現する可能性を与えることである。一方、使用するウイルスが自己複製できない場合、レトロウイルスを組み込むことにより癌遺伝子に挿入あるいは活性化が起こって突然変異が生じたことを報告している研究はいままではない。しかし、遺伝子を肝臓に形質導入するためにレトロウイルスベクターを使用することには、以下に述べるような理由で制限がある:1)これらのベクターは活発に分裂する細胞にのみ感染する、および2)これらのウイルスを増幅させるために使用するパッケージング細胞株では、非常に低いウイルス粒子力価しか得られない(Graham F.L.及び Van Der Eb AJ.「ヒトアデノウイルスの感染性アッセイの新しい技術 5 DNA」Virology 1973、52:456−467)。この2つの限界は、肝細胞増殖因子を使用することや、部分的な肝切除すなわち肝臓塊の70%を除去する手術によってin vivoでの残存肝細胞の分裂を誘導することによって、他の遺伝子治療プロトコルでは克服されてきている。上記限界をいくらかでも克服するために、レンチウイルスベクターを使用することが認められている。なぜなら、レンチウイルスベクターは、実際には分裂していない細胞に形質導入することができるからである。
【0007】
発明の背景
肝硬変は肝臓の慢性的な病気であり、広汎な細胞壊死および限られた実質肝細胞の再生のため、結合組織が増加し、肝小葉構造の変形を引き起こし、血流力学の変化を誘発する。したがって、肝硬変を治療するための戦略には、線維形成の予防および/または回復、肝臓での細胞分裂の刺激、および肝臓組織の構造の再編成などが考えられる。本発明と関連がある現行技術文献について以下引用文献としてだけ記載する。
【0008】
米国特許第5,240,846号は、塩素チャンネルの調節を安定的に補正することができる「CFTR」と呼ばれる遺伝子治療の使用に関する。この欠陥は上皮細胞に存在する。前記発明では、アデノウイルス組換えベクター、およびプラスミドベクターを使用する。しかしながら前記発明は、本発明の治療用遺伝子とは何の関係もない。同様に、米国特許第5,910,487号は、治療用分子を送達するためのプラスミドベクターの使用を記載しているが、本明細書に示す野生型および/または改変型huPA遺伝子、またはTGF−β(トランスフォーミング増殖因子β)タイプII端部切断レセプター遺伝子の送達との関連はない。米国特許第5,827,703号では、遺伝子を送達するためのアデノウイルスベクターおよび改変型アデノウイルスベクターの使用を言及しているが、しかしながら、これらのベクターはいずれも、線維症を治療するための本発明で使用する遺伝子は含んでいない。
【0009】
米国特許第5,770,442号は、「ファイバー」と呼ばれるタンパク質、または「ファイバーキメラ」と呼ばれるタンパク質の発現を指示する遺伝子を含む、組換えアデノウイルスの使用を特許請求している。しかしながら前記特許は、どれが治療用遺伝子であるかは具体的に述べていない。さらに、このようなアデノウイルスの使用、およびこのような組換えアデノウイルスを作るための転移ベクターを含む、遺伝子治療の方法が示されている。しかしながら、本発明で使用する組換えアデノウイルスベクター中にクローン化され挿入された治療用遺伝子を線維症である肝臓中、あるいは腎臓、肺などの他の標的器官、および肥厚性瘢痕などにおいて使用することに関しては、何も述べられていない。これらの治療用遺伝子は、本発明で特許請求されている野生型および/または改変型huPA活性化因子、またはTGF−β(トランスフォーミング増殖因子β)タイプII端部切断レセプターをコードする遺伝子である。示した遺伝子のファミリーの他のメンバーも含まれる。
【0010】
米国特許第5,166,320号は、哺乳動物の肝細胞中に外来性の遺伝子を導入するための、標的送達系の使用に言及している。しかしながら、線維症の肝臓、腎臓、肺、または他の線維症の器官に直接送達しようとする遺伝子とは何の関係もない。
【0011】
米国特許第5,872,154号は、アデノウイルス組換えベクターにより誘導される免疫応答を低下させるために、組換えアデノウイルスベクターとともに、選択した免疫調節物質を併用投与する方法を記載している。この調節物質は中和抗体の形成を阻害するおよび/またはウイルスに感染した細胞の死を減らすように機能するものである。米国特許第5,871,982号は、アデノウイルスの一部、および選択したトランス遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターの一部からなるハイブリッドベクターに関する。単一の粒子を形成する、ポリカチオンとアデノ随伴ウイルスベクターの遺伝子網との結合体の組み合わせからなる、ハイブリッドウイルスも記載されている。これは、ハイブリッドウイルスを使用せずアデノウイルスベクターのみを使用する、本発明とは対照的である。さらに、前述の特許中には、使用する遺伝子、トランス遺伝子または治療用遺伝子は述べられていない。米国特許第5,856,152号は、アデノ随伴ウイルスおよび選択した遺伝子と組み合わせて、アデノウイルスベクターの一部を含むハイブリッドベクターの作製を対象としており、これによって多量の組換えベクターが作られるが、これらのベクターは本発明において記載したクローン化された治療用遺伝子を保有していない。本発明では、肝線維症、腎線維症、膵線維症、心臓線維症、およびケロイドおよび肥厚性瘢痕を治療するために、特異的な治療用遺伝子を使用する。米国特許第5,547,932号は、真核細胞にトランスフェクトするための、核酸複合体の組成物を特許請求している。これらの複合体は、核酸および核酸に親和性がある他の物質、および任意に、複合体を形成できるウイルスまたはウイルスの成分などの内在化因子によって形成される。この特許では、特異的なアデノウイルスベクターの成分、またはAd2またはAd5などの特異的なウイルスも使用しているが、細胞の細胞質内、最終的にはこれらの真核細胞の核中に内在化するべき遺伝子については述べていない。同様に、米国特許第5,521,291号は、抗体を介して核酸と親和性がある物質に結合した、結合型アデノウイルスに関する。このようにして、組換え遺伝子は真核細胞の内部に運ばれる。これらの結合型複合体および核酸は細胞中に内在化するが、送達することができる遺伝子が具体的に述べられているわけではない。前記特許中には、本発明中に記載されていることとは対照的に、肝線維症または肝硬変、または他の任意の線維症を治療するためにこのようなアデノウイルスを使用することは述べられていない。
【0012】
米国特許第5,585,362号は、改良型アデノウイルスベクター、およびそのようなベクターを得るための方法、およびそのようなベクターの使用に関する。前記特許中ではアデノウイルスベクターの用途は述べられていないが、本発明中に記載したアデノウイルスベクターが治療用遺伝子を送達するためのベクターとして使用された。
【0013】
米国特許第5,756,086号は、「ファイバー」と呼ばれるタンパク質を特徴とするアデノウイルスを特許請求している。このアデノウイルスは、特定のタイプの細胞上に位置するレセプターに特異的なリガンドも有する。このアデノウイルスは、「ファイバー」と呼ばれるこのタンパク質の少なくとも一部を有することができ、このタンパク質は除去することができるか、あるいは肝細胞などの特定の細胞上のレセプターに特異的なリガンドに置き換えることができる。これらのアデノウイルスは、治療剤をコードする遺伝子を含むことができる。前の記述に基づく当分野の技術水準と比べた本発明の顕著な技術的な違いは、さまざまな線維症の治療における、野生および/または改変型huPAおよびTGF−βタイプII端部切断レセプターの治療剤としての特異性である。
【0014】
米国特許第5,895,759号は、ダメージを受けた肝臓に遺伝子を送達するために使用することができる、遺伝子治療用の組織(肝臓)特異的ベクターを特許請求している。これらのベクターは化学的に、あるいは酵素によってプロモーターに結合し、ポリペプチドのエンベロープ中にパッケージングされた抗体に結合することもできる。さらに、アッセイするベクターまたはウイルスは、B型肝炎ウイルスである。したがって、この特許中に記載されたダメージを受けた肝臓への遺伝子の送達は、本発明の系とは完全に異なる系を利用するものであり、線維症または肝硬変が治療されるプロセスとは何の関係もない。米国特許第5,559,099号は、ペントンと呼ばれるアデノウイルスのキメラタンパク質を含むアデノウイルス組換えベクターを記載しており、これは非ペントン配列および治療用遺伝子を含む。この特許はこのようなアデノウイルスを使用した遺伝子治療法、このような治療遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクターを作るための伝達用アデノウイルスベクターを含む。さらに、米国特許第5,885,808号は、異なる細胞に対する結合分子を有するアデノウイルスの使用を特許請求しており、その分子は、アデノウイルスベクターを使用する米国特許第5,846,782号および米国特許第5,712,136号中と同様に改変されており、その分子は改変されて異なるペプチドドメインを含んでいる。
【0015】
最後に、米国特許第5,670,488号は、嚢胞性線維症に特に有用な、遺伝子治療用のベクターに関するものであり、この特許は、これらのベクターを使用するための方法の開発も述べている。本発明と言及した先行技術の考えられる関連は、改変することができるアデノウイルスベクターを使用すること、およびこれらのアデノウイルスベクター中に挿入される遺伝子の発現を制御する誘導プロモーターを使用することである。しかしながら、本発明の技術的な特徴は、肝線維症、腎線維症、肺線維症、膵線維症、心臓線維症などの異なるタイプの線維症、ケロイド、および肥厚性瘢痕を治療するための、治療用遺伝子の特異的な使用に焦点を合わせていることである。
【0016】
前述の文書中に記載された現況技術に対し、本発明の重要性は、本発明の技術的な特徴そのもの、およびそこから生じる追加的な利点に基づくものであり、これらは以下でより詳細に記載する。
【0017】
アデノウイルスベクター
本発明では、アデノウイルスベクターを使用することを決めているが、この技術を実施するために使用するウイルスベクターは、非制限的に、第1世代、第2世代、第3世代および/または第4世代のアデノウイルスベクター、「中抜き」アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターであってもよいことを強調しておく。非ウイルスベクターは、プラスミド、リン脂質成分、特定のレセプター用の種々のリガンドと合体した種々の構造の(カチオン性およびアニオン性)リポソームで構成されることができる。合成ベクターは、huPA cDNAおよびTGF−βタイプII端部切断レセプター(遺伝子)と、種々の起源のプラスミド、および調節および/または誘導プロモーターの構築体および結合体から作製される。
【0018】
アデノウイルスベクターを、いくつかの考慮事項に基づいて最初に選択した:1)これらのベクターは、非常に高い力価で(109−1010/ml)感染粒子を生成することができる;2)これらのベクターは非常にさまざまな細胞に感染するが、これらを静脈内に投与すると、その大部分は肝臓器官中に位置する;3)これらのベクターは、分裂していない細胞に遺伝子を効率的に伝達する、かつ;4)これらのベクターは、ホストゲノムに組み込まれることはほとんどなく、これによって挿入突然変異誘発によって細胞が形質転換される危険が回避される(Douglas J.T.及び Curiel D.T.「遺伝子治療のためのベクターとしてのアデノウイルス」Science 及び Medicine、March/April 1997.44−53 及び Zern AM、及び Kresina TF.「肝臓薬送達および遺伝子治療」(Hepatology 1997、Vol.25、No.2、484−491))。
【0019】
アデノウイルスはおそらく、ヒトの遺伝子治療のプロトコルにおいて、遺伝子を送達するための最も有望な媒体すなわちベクターである。なぜならアデノウイルスには、アデノウイルスを血液流中に投与した場合に、それ自体に高度な安定性を与える特有の性質があるからである。この特別な性質があるため、臨床試験でアデノウイルスを患者に優しい静脈投与によって、効率よく使用することができる(Douglas J.T.及び Curiel D.T.「遺伝子治療のためのベクターとしてのアデノウイルス」Science 及び Medicine、March/April、1997、44−53)。
【0020】
アデノウイルスは二本鎖DNAウイルスである。アデノウイルスは二十面体構造を有しており、非常にさまざまなタイプの哺乳動物細胞に感染するが、これは未同定の特異的なレセプターが細胞表面に普遍的に発現していることを反映している。アデノウイルスの細胞への結合は、アデノウイルスキャプシドのタンパク質成分によって起こり、レセプターを介したエンドサイトーシスによってウイルスは細胞内に入る。
【0021】
40を超える、異なるヒト血清型のアデノウイルスが同定されており、その中でタイプ2(Ad2)および5(Ad5)がより広く研究されてきており、したがって、遺伝子治療用のベクターとしてより広く使用されている。これら2つのAd血清型の非常に重要な特性の1つは、これらがヒトでの悪性進行とは全く関係がないことである。
【0022】
組換えアデノウイルスを作製するための戦略は、アデノウイルスゲノムの構成に基づくものである。アデノウイルス遺伝子の発現は、アデノウイルスゲノムの複製の時期によって定義される2つの期、初期および後期で起こる。初期の遺伝子は、4つの異なる転写単位をコードする。E1、E2およびE4は、アデノウイルスDNAの複製を誘導する必須調節タンパク質をコードする。遺伝子E3は、非必須遺伝子である。後期の遺伝子の産物は、特有のプロモーターから転写される、キャプシドの主要タンパク質を含む(Graham F.L.、及び Van Der Eb AJ.「ヒトアデノウイルスの感染性をアッセイするための新しい技術 5 DNA」Virology 1973、52:456−467)。
【0023】
組換えアデノウイルスは、外来性遺伝子または関心のあるDNA配列を、ウイルスの複製に必要とされるアデノウイルスのゲノム領域の代わりに導入することによって生成させる。アデノウイルス組換えベクターは、E1およびE3ゲノム領域に欠失がある。組換えアデノウイルスの生成は、E1またはE3領域を外来遺伝子と置き換えることによって、あるいはアデノウイルスゲノムのE4領域と最右部の間に外来性遺伝子を挿入することによって行う。アデノウイルスゲノムの最右部への外来性遺伝子の挿入に基づくベクター、またはE3領域の置換によるベクターは、その複製能力を維持している。反対に、初期領域E1を置換すると、その複製能力に欠陥があるベクターができるが、このベクターは、置換された機能しないアデノウイルス領域を「トランス」で供給できる細胞系、あるいはヘルパーウイルスが存在する細胞系中でのみ増殖できる。これらの中で、遺伝子運搬用ベクターとして最も一般的に使用されるのは、非増殖性アデノウイルスである(Douglas J.T.、及び Curiel D.T.「遺伝子治療のためのベクターとしてのアデノウイルス」Science 及び Medicine、March/April、1997、44−53)。
【0024】
アデノウイルスベクターの作製、および線維症を治療するためのベクターのその施用は、本明細書に以後記載する実施例中に示す。
【0025】
発明の目的
本明細書では以下に本発明の目的および利点を示す。
本発明の目的は、適切なアデノウイルスベクター中にhuPA改変cDNAをクローン化することによって、組換えアデノウイルスベクターAdΔhuPAを作製するための手順、さらに「中抜き」ベクターやアデノ随伴ウイルスベクター中へのhuPaのクローン化、およびリポソームとリン脂質成分の複合体の形成を提供することである。
【0026】
本発明の他の目的は、線維症になりやすい標的器官の広汎性線維症の治療において有用である、治療用タンパク質をコードする当該の外来性遺伝子またはDNA配列を有する、アデノウイルス組換えベクター(本発明において前述したものすべて)を提供することである。このような遺伝子は、非制限的に、野生型および/または改変型huPA遺伝子、TGF−β(トランスフォーミング増殖因子β)II型端部切断レセプター遺伝子である。
【0027】
本発明では、広汎性線維症の処置に治療効果のある量の組換えウイルスベクター、非ウイルスベクター、プラスミドベクターを含む薬剤組成物(または他の組成物)、および治療法、線維症の処置におけるその使用と治療的施用も提供する。
【0028】
広汎性線維症、特に肝硬変の治療において非常に重要な利点は、治療用遺伝子の送達が、投与経路により、組織特異的な認識、すなわち使用する組換えベクターが本来有する硬変肝臓に対する親和性により行われることである。
【0029】
もともと肝硬変の治療を対象とする本発明の治療的使用には、ヒトを含めた哺乳動物における、線維症になりやすい他の標的器官の広汎性線維症を治療できるというもう1つの利点がある。具体的には肝線維症、肺線維症、心臓線維症、皮膚線維症、腎線維症、膵線維症の治療であるが、これに限定されない。
【0030】
他の目的は、四塩化炭素(CCl4)および一般的な胆道閉塞によって肝硬変にした動物の肝臓に、まず効率よく遺伝子を送達するための技術設計である。このタイプの肝硬変実験モデルは、メキシコおよび世界の他の国において通常ヒトを冒す2つのタイプの肝硬変とよく似ている(アルコール性肝硬変、C型肝炎ウイルスによって引き起こされる慢性的な感染、および続発性胆汁性肝硬変)。
【0031】
線維症の治療の結果生じる他の利点は、使用する組換えアデノウイルス(および他の例示アデノウイルスベクターすべて)は、このベクターを注入された動物中で致死的な毒性を惹き起こさないことである。
本発明の他の目的は、肝線維症が完全に解決され、肝細胞の増殖が劇的に刺激され、これによって肝硬変動物の肝臓機能の回復が得られる結果を得ることである。
【0032】
この技術設計の他の利点は、肝硬変の動物に送達されるヒトuPA治療用遺伝子の発現が、対応するヒトタンパク質の発現をELISAアッセイや免疫組織化学法によって検出できるという事実である。したがって我々は、内生ラットタンパク質と治療的に誘導されるタンパク質産物とを区別することができる。これにより我々は、そのラットの異なる器官におけるin vivo形質導入を調べることができ、ベクターの投与が充分であるかどうか、発現が標的器官にとどまっているかどうかが分かる。
【0033】
最後に、これらすべての証拠から、我々の系は、過剰なコラーゲンを分解および/またはその沈着を防ぎ、肝臓の再生を刺激するタンパク質を生成する治療用遺伝子、野生型および/または改変型huPA、およびTGF−β(トランスフォーミング増殖因子β)タイプII端部切断レセプターなどを肝硬変ラットの肝臓または同じ症状に冒された他の器官に送達して正常な機能を回復させるための、効率の良い適切な輸送手段からなるということができる。
【0034】
したがって本発明では、組換えウイルスベクター、および他のウイルス性および非ウイルス性である前述のベクターを作製するための方法、薬剤化合物、治療法、線維症の治療のため、特に肝硬変の治療のためにそれを使用すること、および治療法を提供する。
【0035】
本発明の他の独自性および利点は、好ましい目的および実施形態の以下の詳細な記載から、同封の特許請求の範囲から、添付した図面すなわち図から明らかであろう。
【0036】
発明の詳細な説明
多くの報告が、組換えアデノウイルスベクター(AdR)を健康な実験動物に全身的に投与することによって、これらのベクターの肝臓に対する特異的なホーミングおよび非常に優先的な親和性が観察されることを示している。本発明の発明者は、肝実質組織全体、主に中心静脈および門脈の周辺で慢性化した線維症のために器官の小葉構造が変化していても、硬変肝臓はアデノウイルスベクターの好ましい標的であることを示している。
【0037】
したがって本発明では、以下のような仮説を立てた:ヒトのウロキナーゼ由来活性化因子(huPA)遺伝子の改変cDNAを使用して、ダメージを受けた肝臓において、潜在性MMPを活性化することによって細胞外マトリックスの過剰なコラーゲン成分のin situでの分解を促進し、洞様血管と肝細胞の間でのマクロ分子の自由な交換を回復し、肝細胞の増殖を誘導して冒された肝細胞の機能性を回復させると、肝実質組織を増やし、ダメージを受けた肝臓を再生し治癒することができる。
【0038】
本明細書で特許請求する本発明の進展に伴い、肝臓に遺伝子を送るための有効な輸送手段を確立することによって、ヒトの慢性変性疾患、具体的には肝硬変の治療の代替法として遺伝子治療を行う研究路線が開始する。ここでその遺伝子は肝臓の正常な機能の回復を助ける治療用タンパク質をつくるものであり(図1および4を参照)、huPA遺伝子を適切な方式で効果的に送達して、huPAタンパク質の過剰発現によって、沈着した過剰なコラーゲンの分解を得る方法が示される。
【0039】
図2Bの左側のパネルには、X−galで染色した凍結切片を示す。図2Bの右側のパネルには、X−gal測定を行ったのと同じ肝臓の組織を示すが、前記組織は切断前にパラフィン中に浸し、シリウスレッド(Sirius Red)で染色して、線維症の段階を視覚化した。形質導入段階は、正常なラットでの84%と比べて、肝硬変ラットでは約40%であった(図2C)。用量応答アッセイによって、合計のウイルス粒子3×1011という用量が確立され(図2D、E、およびF)、図2Hはアデノウイルスベクターの生体内分布を示し、このグラフで健康なラットおよびCCL4の慢性的な投与を受けたラットの両方で、主な標的器官は肝臓であることを見ることができる。脾臓および腎臓は、1%未満の形質導入度を示した。アデノウイルスベクターの生体内分布はPCRによって確認し、使用したプライマーは、アデノウイルスの領域およびレポーター遺伝子Lac−Zの領域を増幅させ、異なる器官においてX−gal反応について見られた分布に対応するバンドを得た(図2−I)。最後に、3×1012というウイルス粒子用量を使用すると、約50%の動物は播種性血管内凝固によって死ぬことが見出された。
【0040】
生成された改変型huPAは細胞内に存在する
細胞外マトリックス(ECM)のタンパク質分解カスケードの主要なイニシエーターの1つとして、プラスミノーゲンおよび肝細胞増殖因子(HGF)のアクチベーターとして、よく知られているuPAの機能を考慮して(Kim、T.H.、Mars、W.M.、Stolz、D.B.、Peterson、B.E.、及び Michalopoulos、G.K.「肝再生の初期における細胞外マトリックス再構築」Hepatology 1997:26:896−904;Mars、W.M.Zarnegar、R.およびMichalopoulos、G.K.「プラスミノーゲン活性化因子のuPAおよびtPAによる肝細胞増殖因子の活性化」Am.J.pathol.1993:143:949−958.(35);及び Roselli、HT.、Su、M.、Washington、K.、Kerins、D.M.、Vaughan、D.E.及び Russel W.E.「ウロキナーゼ欠損マウスでは肝再生は一過性に障害される」Am.J.Phisiol.1998:275:G1472−G1479)、ヒトuPAを使用して特に硬変肝臓中で酵素活性を誘導し、線維症の回復におけるその効果を試験することを決定した。しかしながら、huPA分泌の結果としての出血の危険を回避するために、我々はアミノ末端およびカルボキシ末端が改変された非分泌huPA形を使用して、血流内に分泌されるのを最大限可能な限り予防した(図3Aおよび3B)。
【0041】
硬変を誘導するために、6〜8週間の間、1週間あたり3回、ラットに腹膜内にCCl4を与えた(図3D)。CCl4の6週間の投与の後、対照として使用する、pAd−GFPまたは生理食塩水を注射した肝硬変動物のさまざまな肝臓切片を分析し、ヒトの硬変に似たさまざまなサイズの結節を観察した。結節の周辺で太い線維症のバンドおよび細い線維症のバンドを、および明らかな実質組織の陥没、および門脈管と中心静脈を連結する典型的なコラーゲン架橋パターンを観察した。壊死性および膨張性肝細胞は、線維症のバンドとしばしば関連があった(図4A)。そこで、重度の線維症を回復させ、かつ肝細胞の再生を刺激するためpAd.PGK−ΔNΔC−huPAを使用して動物を治療した。以前の観察に基づいて(Garcia−Banuelos J、Siller Lopez、F、Aguilar−Cordova、E 及び Armendariz−Borunda J.「アデノウイルスを介した肝硬変ラット肝臓への遺伝子の送達:遺伝子治療に強力な手段」Gene Ther.及び Mol.Biol.Accepted 2000)、1kg当たりウイルス粒子6×1011というpAd.PGK−ΔNΔC−huPAアデノウイルスベクターの用量を決め、6週間のCCl4硬変中毒の終わりに腸骨静脈を介して1回投与した(Armendariz−Borunda、J.Katai H.、Jones、C.M.、Seyer J.M.、Kang J.M.及び Ragliow R.「CCl4処理後の肝再生中の決定的段階でトランスフォーミング増殖因子βは一過性に活性化される」 Lab Invest.1993:69:283−294)。アデノウイルスベクターを投与してから2日以降に殺したラットではCCl4の投与は継続していたことを述べておくことは重要である(図3D)。言い換えると、第8日および第10日に殺したラットは、他の動物と比べて、肝毒性剤を3回多く注射されている。ただ1回のpAd.PGK−ΔNΔC−huPA注射の後、ELISAアッセイを行って、肝臓ホモジェネートおよび血清中のhuPAタンパク質の存在を測定した(図3G)。この結果により、多量の改変型huPAタンパク質が、血清中で検出された濃度に比べて組織抽出物中で多量に検出されることが示された。血清中での検出は生成したタンパク質が損傷を受けた肝細胞から離れるという事実により説明することができる。重要なことに、前記実験で生成したhuPAのレベルは非常に高かった(〜5ng/ml)[類似の実験モデルの他のタンパク質誘導系と比べて100倍高い(Schirmacher、P.、Geerts、A.、Jung.、W.、Pietrangelo、A.、Rogler、C.E.、Dienes、H.P.「HGF−SFの肝臓での生合成におけるIto細胞の役割」EXS 1993:65:285−299).(43)]。無関係なアデノウイルスであるpAd−GFPを注射した対照動物において発現がなかったのにたいし、huPAのレベルは第2日まで上昇し、その後低下はしたが検出可能なレベルを示した(図3G)。さらに、特異抗体を用いてhuPAの免疫組織化学法によって検出を行うと、改変型huPAが細胞内に存在する証拠があり、硬変肝臓中での前記タンパク質の誘導が示され確認される(図3EおよびF)。対照として使用した正常なラットの肝臓組織および肝硬変ラットの肝臓組織には、huPA抗体を用いて染色される肝細胞が時折現れる(〜3.5%)。この発見とは対照的に、pAd.PGK−ΔNΔC−huPAで処理した動物は、第2日までにhuPAで免疫染色された肝細胞が相当に増加し(46%)(図3EおよびF)、第6日後にはピークに達し、そこでは80%を超える細胞が陽性であった。さらに、クッパ−細胞および胆管上皮細胞も、免疫反応性を示した。
【0042】
ベクターを施用すると、組織学的に変性した肝細胞の出現が誘導され、pAd−ΔNΔC−huPA処理後の第1日目に重大な血清中のトランスアミナーゼの増大があったが(表1)、前記増大は一時的なものであり、結果的に肝不全で死んだ動物でアデノウイルス肝炎を併発したものはなかった。生理食塩水(n=5)および無関係なアデノウイルス調製物(pAd−GFP)(n=5)を与えた肝硬変対照動物と比べて、pAd.PGK−ΔNΔC−huPAを注射した動物は、肝機能検査において顕著な改善点を示した(表1)。全体的に、最終日に殺したラットは、プロトロンビン時間(PT)が第2日、第4日および第6日の24秒と比べて、アデノウイルス投与後第8日および第10日目には14秒であった(正常値に非常に類似する)(図8A)。重要なことに、貧血は観察されなかったが、pAd.PGK−ΔNΔC−huPAを与えた動物において、血小板の一時的なわずかな減少が見られた(表2)。この点に関しては、正常な動物にアデノウイルスベクターを注射することによって、一時的な血小板の減少が誘導されることが以前に報告されている(Brann、T.、Kayda、D.、Lyons、R.M.、Shirley、P.、Ruy、S.、Kaleko、M.、及び Smith、T.「アデノウイルスベクターを介した、ヒトでない霊長類におけるヒト第VIII因子の生理学的レベルの発現」 Hum.Gene Ther.1999:10:2999−3011)。
【0043】
【表1】
【0044】
【表2】
【0045】
肝臓中でのhuPAの過剰発現は、線維症の回復を誘導する
そのプラスミノゲン活性化の役割に加えて、huPAは、細胞外マトリックスの分解と関係があるメタロプロテアーゼのカスケードの活性化をもたらす、主要なイニシエーターの1つであるとみなされている(Kim、T.H.、Mars、W.M.、Stolz、D.B.、Petersen、B.E.、及び Michalopoulos、G.K.「ラットにおける肝再生の初期段階における細胞外マトリックスのリモデリング」Hepatology 1997:26:896−904)。プラスミノゲンをプラスミンに活性化させた後、uPAはプロコラゲナーゼ、およびプロコラゲナーゼを初期段階で活性形に転換させる他のメタロプロテアーゼ(MMP)もおそらく活性化させる(Steler−Stevenson、W.G.「細胞外マトリックスの病理学的リモデリングにおけるマトリックス代謝回転の動力学」Am.J.Pathol.1996:148:1345−1350.(33))。したがって我々は、マッソン(Masson)染色した硬変肝臓の線維症の段階を最初に測定した。多数の領域のコンピュータ支援形態計測分析によって、pAd.PGK−ΔNΔC−huPAで治療したラットは、治療の初期の線維症レベルと比べて、およびpAd.GFPと生理食塩水のみを与えた肝硬変動物と比べて(図4AおよびA’)、第10日までに劇的な線維症の減少を示した(85%)(図4BおよびB’)ことが示された。前記発見は、肝臓ホモジェネート中のメタロプロテアーゼ−2(MMP−2)の活性を特異的なELISAアッセイによって定量的に測定した、図4CおよびC’で示したデータと一致する。前記アッセイは、活性MMP−2のレベルを検出し(Verheijen、JH、Nieuwenbroek、NM、Beekman B、Hanemaijer、R、Verspaget HW、Ronday HK、Bakker AH.「タンパク質分解酵素の人工基質としての、修飾プロ酵素:修飾プロウロキナーゼを用いた細菌コラゲナーゼおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ活性の比色分析」Biochem J.1997:323(Pt3):603−609)、MMP−2はIV型コラーゲンを特異的に分解し、程度は低くなるが他のコラーゲンも分解する(Corcoran、ML、Hewitt、RE、Kleiner、DE Jr.、Stetler−Stevenson、WG.「MMP−2:発現、活性化および阻害」Enzyme protein 1996:49(1−3):7−19;Nogase、H.、Ogata、Y、Suzuki、K、Enghild、JJ、Salvensen G.「マトリックスメタロプロテイナーゼの基質特異性および活性化機構」Biochem.Soc.Trans.1991(3)715−8)。huPAを投与した4日後には、正常なラットと比べてMMP−2の6倍の増加(11.5ng/mlを超える)が見られ、対照の肝硬変動物と比べては3倍の増加が観察された。一方、特異的なhuPAコラゲナーゼの誘導およびコラーゲン分解活性の生理学的重要性とは別に、I型、II型およびIV型内在性コラーゲンの遺伝子の発現を半定量的RT−PCRによって評価した。それによりこれらの遺伝子の基線レベルの具体的な変化が検出可能になった。pAd.PGK−ΔNΔC−huPAを投与したラットでは、無関係なアデノウイルスpAd−GEPを与えたラットと比べて、IV型コラーゲンの遺伝子の発現は第6日までに約5分の1まで低下し、I型コラーゲンの遺伝子の発現は第10日までに約4分の1まで低下した。III型コラーゲンの発現は、pAd−GEPと比べて、huPAアデノウイルスベクターを注入した第10日に約2分の1まで低下した(図5AおよびB)。前記データによって、ヒトhuPAの過剰発現が、ECMタンパク質をコードする前記遺伝子の発現停止を誘導することが強く示唆される。重度の線維症である硬変肝臓中では、肝臓星状細胞(HSC、主要なコラーゲン生成細胞)が線維症領域で増加し、それらの大部分は、α−平滑筋アクチン(α−SMA)を特異的に発現する活性型HSCへとその表現型を変える(Nyberg−Hoffman、C.、Shabram、P.、Li、W.、Giroux、D.及び Aguilar−Cordova、E.「アデノウイルス感染性力価測定における感度と再現性」Nature Med.1997:3(7):808−11)。ラットの肝臓中のα−SMAの発現を免疫組織化学法によって調べた結果、この発現は肝実質組織全体に沈着した過剰なECMの分布と相関関係があり、線維症である組織の%と一致する結果となった。α−SMA陽性細胞の数は、大幅に減少する(治療後第2日の43.2%と比べて、第10日には8.9%)(図6AおよびB)。HSCがはっきりと目に見える代表的な線維症領域を拡大して示す(図6C)。
【0046】
HuPAは、活発な肝硬変肝細胞の再生を誘導する
プロセスの最初の半分を解決したので、我々は、細胞外マトリックス(ECM)分解を行った後の、「空きスペースを補充するのに必要な」肝臓の再生レベルを決定することへと進んだ。図7は、おそらくはin situでのHGFの活性化によって刺激される、肝臓中の有糸分裂の動態を示す(Locaputo、S.、Carrick、T.L 及び Bezerra、J.A.Zona 「ウロキナーゼトランスジェニックマウスの肝再生中の遺伝子発現の制御」Hepatology 1999:291106−1113)。肝細胞の増殖は、増殖細胞核抗原(PCNA)に対する特異抗体で染色された細胞のパーセンテージとして測定した。PCNA陽性肝細胞の数は、pAd−GEPで治療したラットの肝臓および正常な肝臓と比べて、pAd.PGK−ΔNΔC−huPAで治療したラットの肝臓中では劇的に多くなった(10倍)(図7A)。スコアから、約55%の肝細胞が、pAd.PGK−ΔNΔC−huPAを注射した2日後に門脈周囲領域(図7B)および小葉中心領域(図7C)の両方において、抗PCNA抗体によって陽性染色されたこと、(Hattori、N.、Sisson、T.H.、Xu、Y.、及び Simon R.H.「ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲンアクチベーター遺伝子をアデノウイルスを介してインビトロ及びインビボで肺の細胞に伝達することによるフィブリン分解の上方制御」 Hum.Gene Ther.1999:10:215−222)および多数の有糸分裂の様子および二核肝細胞を示した(図7A)。40%のスコアが、アデノウイルスベクター投与の8日後でも検出された(図7BおよびC)。第10日までに検出された陽性細胞は機能性のある肝臓塊の再建を示し、このことは、肝機能検査(AST、ALT、ビリルビンおよびプロトロンビン時間)により示される明らかな正常化傾向によって確認された(表1および図8A)。
【0047】
HGFは最も強力な肝細胞分裂促進物質の1つであり(Michalopoulos、G.K.「肝再生および腫瘍進行におけるHGF」Prog Clin.Biol.Res.1995:391:179−185)、c−metは、そのシグナルを伝達する対応チロシンキナーゼレセプターである。図7Dは、huPAで治療した動物でのHGF遺伝子の過剰発現、肝硬変対照動物およびpAd−GFPで治療した動物でのごくわずかなHGF発現を示す。この遺伝子過剰発現は、c−metではhuPA投与の2日後に最も顕著であり、このことは、肝細胞の増殖がこの機構によって調節されていることを示唆している。
【0048】
最後に、動物の体重に対する肝臓重量を、動物を殺した際に測定し、制御不能な増殖を起こしていないかどうか判定した(図8B)。みてわかるように、第10日までにこの器官の重量増加はごくわずかであり、このことは、「異常な」細胞増殖制御機構は関係していないことを示唆している。
【0049】
本発明を適用するための好ましい方法は、本発明の組換えアデノウイルスベクター(または治療用遺伝子を含む任意の前述のベクター)の静脈内投与であり、この投与では、肝硬変患者に好都合な単位用量投薬計画で、治療有効量を投与する。この用法は、病状の程度にしたがって調整することができる。一般に、1個体当たり約107〜1014個のウイルス粒子という単位用量が使用される。
【0050】
本発明のアデノウイルス組換えベクターを含む薬剤化合物の調製は、デンプン、グルコース、ラクトース、サッカロース、ゲル、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリル粉末、NaCl、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを非制限的に含めた、現況技術に記載された任意の薬剤として許容される担体と組み合わせて、当業者に非常によく知られている標準的な技法を使用することによって行うことができる。これらの化合物は、溶液、懸濁液、ピル、錠剤、カプセル、粉末および遅放出性の調合物などの薬剤形をとることができる。
【0051】
前の記述および以下の実施例は、本発明の個々の実施形態を例示することを目的とするものであり、これらを本特許の範囲を制限するものとしてみなすべきではない。
【実施例】
【0052】
線維症の回復および肝臓再生の刺激に対するhuPAの活性を実証するための方法論
a)ヒトの肝硬変を模倣した実験動物
このモデルは、CCl4慢性中毒にした動物からなっており(Armendariz−Borunda J.Seyer、J.M.、Kang A.H.及び Ranghow R.「四塩化炭素中毒のラット肝臓におけるTGF遺伝子発現の制御」 FASEB J.1990:4:215−221)、この動物の肝硬変はCCl4を腹膜内投与した第6週から確立され(図3D)、アルコールの乱用または慢性のC型肝炎ウイルス感染によって誘発されるヒトの肝硬変と似ている。体重80gの動物に、最初の1週間はCCl4と鉱油が1:6の混合物、第2週目は1:5の混合物、第3週目は1:4の混合物、4〜8週の間は1:3の混合物を、週に3回腹腔内に投与した。対照として使用するためにラットは対にし、これらには担体のみを同様に注射した。実験方法はすべて以前に記載されており(Garcia−Banuelos J、Siller Lopez、F、Aguilar−Cordova、E.及び Armendariz−Borunda J.「肝硬変ラット肝臓へのアデノウイルスを介した遺伝子送達:遺伝子治療の強力な手段」Gene Ther.及び Mol.Biol.Accepted 2000)、アデノウイルスの施用はすべて、腸骨静脈を通して行った(図3C)。
【0053】
b)レポーター遺伝子を含む発現ベクター
Ad5−βGalアデノウイルスベクター(図2A)は、細菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子(lac−Z)を挿入したpΔE1sp1Bに由来する。β−Gal活性の視覚化は、β−ガラクトシダーゼ酵素の存在下で無色から青色に変わるX−gal試薬を用いて行った。同時に、同じAd5−βGalバッチを、CCl4中毒の5および8週間後に、健康なラット(n=5)および肝硬変ラット(n=5)に投与した。Ad5−βGal投与の72時間後に、動物を殺した。組換えアデノウイルスによってコードされているβ−ガラクトシダーゼ(β−gal)タンパク質の組織学的分析および発現の測定用に、異なる器官:肝臓、脾臓、心臓、肺、腎臓、脳、精巣および回腸を摘出した。前記器官を−30℃で凍結し、クリオスタットで切断して8μmの切片を得た。これらの切片を16〜18時間の間X−gal試薬に暴露し、ニュートラルレッドで対比染色した。形質導入された細胞のパーセンテージは、いくつかの領域のコンピュータによる画像分析によって決定した。肝硬変ラット肝臓の切片も作成し、前記切片をパラフィンに浸し、切断し、コラーゲンを特異的に染色するシリウスレッドで染色した。
【0054】
c)huPA治療用遺伝子を含むアデノウイルスベクター
完全機能性非分泌型ヒトウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子をコードするcDNAを挿入することによって、アデノウイルスベクター(pAd.PGK−ΔNΔC−huPA)を構築した。小胞体(RE)への保持シグナルをタンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端に加えて、huPAが分泌されることに伴う出血の危険を防止した。一般に、分泌されるタンパク質は、まず小胞体膜を通って移動し、次いで小胞に入ってゴルジ装置まで運ばれる。uPAの場合、小胞体膜を介しての移動は、前駆体タンパク質のアミノ末端の特徴的なシグナルによって活性化される。前記シグナルペプチドは、膜を通ってポリペプチドが移動する最中にシグナルペプチダーゼによって切断される。体循環へのuPA分泌を抑制または低下するために、小胞体からのタンパク質の輸送が起こらないように、タンパク質を改変した。pGEM3中のXbaI/Asp718部位でクローン化されたヒトのuPA cDNA(1,326bp)(図3A)をカルボキシ末端で改変し、KDELシグナルをコードする配列(RE内腔中に存在する可溶性タンパク質に特徴的な高度保存配列)、およびPCRによって生成した75ヌクレオチドの上流残基をクローン化した(図3B)。アミノ末端を改変するには、プレuPAペプチドシグナルを含むアミノ末端の25個のアミノ酸を、アミノ末端保持シグナル(RR)とPCRで得られた膜貫通IIタンパク質Iip33に由来しペプチドスペーサー(31アミノ酸)によって分けられている膜貫通領域(TM)中の「アンカー」とに置換した(図3B)。RR配列は膜アンカー領域(TM)の近くに位置するアルギニン残基MHRRRSRによって構成されており、不可逆鎖タンパク質Iip33のようなII型膜貫通タンパク質中に存在する。この生成した改変型huPA遺伝子を、アデノウイルスプラスミドpAd.ΔNΔC−huPA中にクローン化し組換えアデノウイルスベクターを生成させた。前記アデノウイルスベクターの作製を監視して、マイコプラズマ汚染および内毒素を除いた。このベクターを使用する理由は、このベクターはhuPAを分泌しないので、肝硬変動物の主なこの傷害である凝血性低下または突発性の出血を引き起こすことがないという、利点のためである。ここで使用するPAd−GFPベクターは、前に記載したE1およびE3領域が欠失している非増殖性のアデノウイルスベクターである(Nyberg−Hoffman、C.、Shabram、P.、Li、W.、Giroux、D.及び Aguilar−Cordova、E.「アデノウイルス感染性力価測定における感度と再現性」Nature Med.1997:3(7):808−11)。これら2つのベクターは完全に性質の特徴付けられたベクターを得るために、無菌実験室条件下で作製した。ベクターには名称をつけ特徴付けし(Nyberg−Hoffman、C.、Shabram、P.、Li、W.、Giroux、D.及び Aguilar−Cordova、E.「アデノウイルス感染性力価測定における感度と再現性」Nature Med.1997:3(7):808−11)、ウイルス粒子(vp)と感染単位(IU)のタイターの比が30以上であるバッチを得た。
【0055】
d)huPA治療用タンパク質の生成とメタロプロテアーゼ活性を検出するための、肝臓ホモジェネートの調製
ラットを図3Dに示すように殺し、以下の文献に記載されているように肝臓ホモジェネートを150mgの組織から調製し、−70℃に保った(Gao、C.、Jokers、R.、Gondipalli、P.、Cai、S.H.、Kennedy S.及び Ponder K.P.Intramuscular of an hepatic transduction with a retroviral vector in mice.Hum.Gene Ther.1999:10:911−922)。同時に、血清サンプルを得て、−20℃に保った。要約すると、huPAに関しては、プロテアーゼ阻害剤の存在下、150mgの肝臓を400μlのホモジェネート緩衝液(0.05M Tris−HCl、0.15M NaCl、0.01M HEPES、2mM CaCl2、0.01% Tween80、1mM フェニルメチルスルホニルフオリド(PMSF)、pH8.5)中で摩砕した。ホモジェネートを12,000×gで15分間遠心分離し、市販のキット(Biopool、Sweden)を使用して、ELISAによって上澄み中のhuPAレベルを測定した。これはヒトのuPAを定量測定するための特異的酵素イムノアッセイからなる。アッセイ感度はuPA抗原の基線レベルを0〜5ng/mLの直線範囲で検出する。総タンパク質レベルは、ブラドフォードのタンパク質定量法(Bradford、M.M 「タンパク質-染料結合の原理を利用した、マイクログラム程度のタンパク質を定量する迅速かつ高感度の方法」Anal.Biochem.1976:72:248−54)を使用して測定した。MMP−2のアッセイに関しては、ホモジェナイザー(Politron RT3000、Kinematica AG、Brinkman、スイス)を使用し、4℃において4mlの0.15M NaCl中で、8,000×gで5分間、サンプルを均質化した。3サイクルの凍結解凍の後、4℃で1分間、1秒当たり21キロサイクルでサンプルを2回超音波処理し、4℃で10分間8,000×gで遠心分離し、分注して、−70℃に保った。市販のキット(Biotrak、Amersham)を使用してELISAによって、前記上澄み中のMMP−2レベルを測定した。
【0056】
e)肝臓および血液機能検査の生化学的評価
時間を決めて動物から血液を採取し、自動装置(Synchron Cx7)で血清の肝臓機能検査(ALT、AST、アルカリホスファターゼおよびビリルビン)を行った。自動装置(ACL−3000)によって血漿のプロトロンビン時間を分析し、自動装置(Cell−Dyn 3500R)によって血液分析を行った。
【0057】
f)肝臓切片の組織学的および免疫組織化学的評価
pAd.PGK−ΔNΔC−huPAを投与した第2、4、6、8および10日後に、ラットを殺した(図3D)。pAd−GFP(無関係なアデノウイルス)を与えた肝硬変動物のグループ、および生理食塩水を与えた肝硬変動物のグループを、それぞれ対照グループとして使用した。各グループは、少なくとも5匹のラットからなっていた。組織学的な研究用に、リン酸緩衝液(PBS)中10%ホルムアルデヒドに浸して、得られた肝臓を即座に固定し、エチルアルコール中で脱水し、パラフィンに浸した。厚さ5μの切片を、ヘマトキシリン/エオシン、シリウスレッドおよびマッソントリクローム染色で染色した。この最後の実験では、コンピュータ制御の画像解析装置(Qwin Leica)を使用して、スライド当たり10の領域をランダムに分析し、肝臓領域全体と結合組織の比を計算することによって、冒された肝臓中の線維症のパーセンテージを測定した。免疫組織化学に関しては、肝臓切片をそれぞれシラン化スライド上に載せ、パラフィンを除去し、無水メタノール中の0.03%H2O2で、内在性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。これらをそれぞれ、PBSで1/20に希釈した抗PCNA(増殖細胞核抗原)モノクローナル抗体、PBSで1/50希釈した抗α−平滑筋アクチンモノクローナル抗体(Boehringer Mannheim、Ger)、およびPBSで1/400希釈した抗ヒトuPAヤギポリクローナル抗体(Chemicon International、USA)と室温で一晩インキュベートした。反応は、ペルオキシダーゼ標識したウサギまたはヤギポリクローナル抗体を用いて検出し、ジアミノベンジジンで発色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。定量化の目的で、小葉内領域および門脈周囲領域中の4つの領域をランダムに評価した。自動式画像解析装置(Qwin、Leica)を用いて陽性および陰性細胞を計数し、陽性細胞のパーセンテージとしてデータを表した。2人の有資格の病理学者による別々に行われた組織病理学的な分析は、差異5%の許容範囲であると解釈された。
【0058】
g)RNA抽出および半定量的RT−PCR
決まった時間に肝臓を取り出し、ChomczynskiおよびSacchiの方法(Chomczynski、P.及び Sacchi、N.「グアジニウム酸-チオイソシアネート-フェノール-クロロホルム抽出による1段階RNA単離法」Anal.Biochem 1987:162:156−159)に従って、すべてのRNAを即座に単離した。トリゾルの存在下でポリトロン装置によって肝臓組織を均質化し、次いでクロロホルムを加え、水性相を得て、イソプロパノールを用いてRNAを沈殿させた。260/280nmでの分光測定法によって、RNA量を測定した。1%アガロースゲルおよびホルムアルデヒド電気泳動によって、RNAの性質を確認した。
【0059】
HGF(肝細胞増殖因子)、c−met(HGF細胞レセプター)およびコラーゲンの遺伝子の発現分析を、半定量的RT−PCRによって行った。我々の研究室において開発され、およびDelgado−Rizo他(Delgado−Rizo、V.、Salazr、A、A.P及びuro、A.、Armendariz−Borunda、J.「抗トランスフォーミング増殖因子β抗体処理はラット傷害肝臓における変化したサイトカイン遺伝子の発現パターンに影響を与える」Biochem.Biophys、Acta 1998:1442:20−27)中に記載された方法を使用した。手短に言うと、それぞれのグループにおいて少なくとも3匹の動物の肝臓を処理した。同様に3種の異なるRT−PCR反応をそれぞれの肝臓について行い、定量的なデンシトメトリーによるそれらの平均値の結果を示す。
【0060】
増幅させた遺伝子は以下のものであった:
【0061】
単離しておいたRNAを酵素(M−MLV)によって逆転写し、得られたcDNAをサーマルサイクラー中において以下の条件:94℃で5分間、60℃で1分間、および72℃で1.5分間を30サイクルで増幅させた。すべての転写物の発現レベルを、HPRT構成発現遺伝子に関して標準化した。
【0062】
肝細胞増殖因子(HGF)は、細胞増殖、細胞運動および細胞分化を含めて、多機能の活性を有している(Kim、T.H.、Mars、W.M.、Stolz、D.B.Petersen、B.E.、及び Michalopoulos、G.K.「ラットにおける肝再生の初期段階における細胞外マトリックスのリモデリング」Hepatology 1997:26:896−904;及び Michalopoulos、G.K.DeFrances M.C.liver regeneration.Science 1997:276:60−66)。正常な肝臓では、HGFは肝臓星状細胞(HSC)によって生成され(Schirmacher、P.、Geerts、A.、Jung、W.、Pietrangelo、A.、Rogler、C.E.、Dienes、H.P.「HGF−SFの肝臓での生合成におけるIto細胞の役割」EXS 1993:65:285−299)、細胞外マトリックス(ECM)中に封鎖される(Liu、M.L.Mars、W.M.、Zarnegar、R.Michalopoulos、G.K.、「成体ラットの正常および再生肝臓における肝細胞増殖因子の取り込みと分布」Am.J.Pathol.1994:144:129−140)。さらにHGFは、胎盤、肺および脳によっても生成される(Schirmacher、P.Geerts、A.、Jung、W.、Pietrangelo、A.、Rogler、C.E.、Dienes、H.P.「HGF−SFの肝臓での生合成におけるIto細胞の役割」EXS 1993:65:285−299 及び Wolf、H.K.、Zarnegar、R.Michalopoulos、G.K.「ヒトおよびラット組織における肝細胞増殖因子の局在化:免疫組織学的研究」Hepatology 1991:14488−494)。uPAは単鎖HGF(scHGF、不活性形)、二本鎖HGF(tcHGF、活性形)を活性化させることができることが報告されている(Schirmacher、P.Geerts、A.、Jung、W.、Pietrangelo、A.、Rogler、C.E.、Dienes、H.P.「HGF−SFの肝臓での生合成におけるIto細胞の役割」EXS 1993:65:285−299 及び Wolf、H.K.、Zarnegar、R.Michalopoulos、G.K.「ヒトおよびラット組織における肝細胞増殖因子の局在化:免疫組織学的研究」Hepatology 1991:14488−494)。このようにして、我々の実験モデルでは、残存する機能的肝細胞による改変ヒトuPAの驚異的な生産が、in situでのHGFを強力に活性化し、HGFはそのc−metレセプターに結合し、肝臓中、実質組織全体および門脈周囲領域の両方で早い細胞増殖を誘導する(図7A、B、CおよびD)。一方、正常なラットの肝臓にHGFを投与した場合は、門脈周囲領域の肝細胞のみ、肝細胞の増殖を刺激することが知られているが(Liu、M.L.Mars、W.M.、Zarnegar、R.Michalopoulos、G.K.「成体ラット肝臓におけるコラゲナーゼ前処理および肝細胞増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子αの細胞分裂誘発効果」Hepatology 1994:19:1521−152 及び Liu、M.L.Mars、W.M.、Zarnegar、R.Michalopoulos、G.K.「成体ラットの正常および再生肝臓における肝細胞増殖因子の取り込みと分布」Am.J.Pathol.1994:144:129−140)、正常なラットをコラゲナーゼで予め処理したときは、DNA合成の劇的な増大が小葉領域の肝細胞において観察されている(Liu、M.L.Mars、W.M.、Zarnegar、R.Michalopoulos、G.K.「成体ラット肝臓におけるコラゲナーゼ前処理および肝細胞増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子αの細胞分裂誘発効果」Hepatology 1994:19:1521−152)。要するに、ここに示した証拠を組み合わせて、活発なECM分解、およびc−met上方調節、HGF同期活性化、対応するレセプターへのHGFの結合によって、肝細胞の増殖が活性化されることが示唆される。uPAを注入した肝硬変動物において観察される強い増殖応答(約60%)は、誘導されるHGFの肝細胞に対する直接的作用、および肝細胞がより効果的に増殖因子に応答できるようなMMPの肝細胞に対する作用が加算的に働くことの反映と考えられる(Kim、T.H.Mars、W.M.、Stolz、D.B.、Petersen、B.E.、及び Michalopoulos、G.K.「ラットにおける肝再生の初期段階における細胞外マトリックスのリモデリング」Hepatology 1977:26:896−904)。
【0063】
プラスミノゲン活性化におけるその働きに加えて、uPAは、マトリックス分解に係わるメタロプロテアーゼのカスケードの活性化をもたらす、主なイニシエーターの1つであるとみなされている(Kim、T.H.Mars、W.M.、Stolz、D.B.、Petersen、B.E.、及び Michalopoulos、G.K.「ラットにおける肝再生の初期段階における細胞外マトリックスのリモデリング」Hepatology 1977:26:896−904)。uPAによるプラスミノゲンのプラスミンへの活性化の後、このプラスミンは、プロコラゲナーゼ、およびおそらく他のメタロプロテアーゼ(MMP)をそれらの活性形に、初期段階で活性化させる(Kim、T.H.Mars、W.M.、Stolz、D.B.、Petersen、B.E.、及び Michalopoulos、G.K.「ラットにおける肝再生の初期段階における細胞外マトリックスのリモデリング」Hepatology 1977:26:896−904)。これらの酵素のin situでの作用によって、ECM固有成分が分解され、変化した器官構造が再建され、新生血管が出現する(血管形成)(データ示さず)。改変型uPAの過剰生産が、これまで観察されたように迅速なECM再構成を活性化することは明らかであるが、これはまだ解明されていない機構によって調節されている可能性がある。しかし特異的なMMP−2誘導は前記機構の一部である。
【0064】
したがって、マトリックス再構成を開始させるuPA/プラスミン系に加えて、膜型マトリックスメタロプロテアーゼ群(MT−MMPs)は、我々のECM再構成系において同定しなければならない、別の誘導性プロテイナーゼであろう。なぜなら、MT1−MMP群がプロMMP2の活性化を開始させることができたことが報告されているからである。したがって、我々の研究室で行った研究の付随的な目的は、huPA誘導型肝臓線維症の回復におけるMMP群の機能を解明することである。
【0065】
最後に、このタイプの治療方法は肝硬変のヒトに使用する前に、ラットより上位である動物で測定および評価が行われているところである。我々は、ビーグル犬および/またはヒト以外の霊長類におけるその評価のために、対応するプロトコルを統合している最中である。
【0066】
本記載中に示されていない本発明の他の実施形態が考えられ、それらが本発明の範囲および精神内のものであることは、当業者には明らかであるに違いない。したがって本発明は、本記載中に示した実施形態には限られず、本発明は以下の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【0067】
【図1】図1は、(A)で肝硬変の細胞の生理病理学を、および(B)で、遺伝子治療がどのように働いて線維症の進行を元に戻すかについての概念的証拠、および肝細胞の再生をもたらすhuPA cDNAによって誘導されるカスケード事象を示す。
【図2】(A)はレポーター遺伝子LacZを含むアデノウイルスベクター地図の概要を示す。(B〜I)はこのベクターを使用して測定した数匹の正常な実験用ラットおよび肝硬変実験用ラットの器官内の、外来性遺伝子の用量応答性、安全性、毒性、および生物学的分布を示す。
【図3】(A〜D)はヒトuPA cDNAの遺伝的改変、およびAd−ΔNΔC−huPA(治療用)対応アデノウイルスベクターの形成、腸骨静脈を介した投与を示す概略図である。(E〜G)には対応する免疫組織化学アッセイおよびELISAアッセイによる、肝硬変ラット中でのヒトhuPA治療用タンパク質の発現レベルの測定を示す。
【図4】6週間CCl4で処理したラットに治療用ベクターを注射した後異なる日に得た肝臓の組織化学的切片を示す図である。無関係なベクターであるAd−GFP(A)、および治療用ベクターであるAd−ΔNΔC−huPA(B)。それぞれの場合の、形態計測分析による線維症の程度の定量的測定、およびメタロプロテアーゼ−2(MMP−2)活性の同時誘導も示す(CおよびC’)。in vivoでの形質導入の適切な対照として、緑色蛍光遺伝子のタンパク質産物の発現も示す。
【図5】アデノウイルスベクターAd−ΔNΔC−huPA、Ad−GFP、または生理食塩水のみで処置した肝硬変ラットの肝臓の、I型、III型およびIV型コラーゲンに対するメッセンジャーRNAを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)で半定量的に分析した図である。これらの遺伝子に対応して増幅されたPCR産物を(A)に、それぞれのデンシトメトリーの測定値を構成的に発現される遺伝子の発現と比べたものを(B)に示す。
【図6】Ad−ΔNΔC−huPA治療用ベクターを送達した後の、抗α−SMA(α−平滑筋アクチン)抗体によるラットの硬変肝臓の免疫組織化学染色(A)、およびコンピュータ支援の形態計測分析により定量的に計算したα−SMA陽性細胞の割合(B)である。
【図7】図7は、肝細胞の増殖を評価するために、Ad−ΔNΔC−huPAアデノウイルスベクター、Ad−GFPまたは生理食塩水のみを投与した後の肝硬変ラットの肝臓切片を抗−PCNA(増殖細胞抗原)抗体により組織化学的染色を行ったものである(A)。(B)および(C)は、自動画像分析装置による、それぞれ門脈周囲領域および小葉領域において免疫染色された細胞の割合を示す図である。(D)は、異なるベクターを投与した後の、肝細胞増殖因子(HGF)、c−metおよびhuPAの半定量的RT−PCR測定を示す図であり、これらの遺伝子に対応するPCR増幅産物を示す。
【図8】(A)は、生理食塩水のみで処理したかあるいはAd−ΔNΔC−huPAベクターを投与した後に異なる日に殺した、ラットのプロトロンビン時間を示す図である。さらに(B)は、これらの肝臓の過形成および/または肥大を検出するための、肝臓重量/身体重量×100の比の評価を示す図である。
Claims (65)
- ヒトを含めた哺乳動物の肝線維症、肺線維症、腎線維症、心臓線維症、膵線維症、ケロイド、および肥厚性瘢痕を治療するための治療用タンパク質をコードするcDNAおよびレポーター遺伝子をクローン化することを特徴とする、組換えアデノウイルスベクターおよび非アデノウイルスベクターを作製する方法。
- レポーター遺伝子を細菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子(lac−Z)から選択することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 治療用遺伝子を、硬変器官中に沈着した過剰なコラーゲンタンパク質の合成および沈着を低下させ、かつ/あるいは予防する治療用タンパク質をコードする遺伝子である、ウロキナーゼ由来プラスミノゲン活性化因子の野生型および/または改変型ヒト遺伝子、およびTGF−βタイプIIの端部切断レセプターの遺伝子から選択することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- ヒトのウロキナーゼ由来プラスミノゲン活性化因子遺伝子(huPA)の改変cDNAにコードされているタンパク質が、肝臓の潜在性コラゲナーゼおよびマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)を活性化して、ディッセ腔すなわち類洞周囲腔中の細胞外マトリックス(ECM)の過剰なコラーゲン成分のin situでの分解を促進するものであることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- ヒトのウロキナーゼ由来プラスミノゲン活性化因子huPAの遺伝子のcDNAにコードされているタンパク質が、残存肝細胞の複製を誘導し、肝臓実質組織を再増殖させることによって、障害を受けた肝臓の再生および治療を実現する際に、機能性肝臓塊も回復させるものであることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 治療用遺伝子が、肝臓の再生を刺激して肝臓および同じ病状の他の器官の正常な機能を回復させるタンパク質をコードする、肝細胞増殖因子HGFから選択されるcDNA配列であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 肝細胞増殖因子HGFの遺伝子がin situ活性化でECMの細胞外分解を刺激し、肝臓再生が増殖細胞核抗原(PCNA)に対する特異抗体で染色される細胞のパーセンテージとして測定されることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- PCNA陽性肝細胞の数が、正常な肝臓中およびpAd−GFPで治療した肝臓中よりも、組換えアデノウイルスベクターpAd.PGK−ΔNΔ−huPAで治療したラットの肝臓中では10倍多いことを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 標識によって、組換えアデノウイルスベクターpAd.PGK−ΔNΔC−huPAを注入した2日後に門脈周囲領域および小葉中心領域の両方において、約55%の肝細胞が抗PCNA抗体によって陽性染色されることが判明した、請求項7に記載の方法。
- 第10日までに検出されたPCNA陽性細胞は肝臓塊の回復を示し、その回復がAST、ALT、ビリルビンおよびプロトロンビン時間などの肝機能検査における明確な傾向によって確認されることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- ウイルス組換えベクターを、第1世代、第2世代、第3世代および/または第4世代のアデノウイルスベクター、「中抜き」(gutless)アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターから選択することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 非ウイルス組換えベクターが、リン脂質成分、および特定のレセプター用の種々のリガンドと合体した種々の構造のリポソームで構成されていることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 非ウイルスベクターを、プラスミドおよびカチオン性リポソームおよびアニオン性リポソームから選択することを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- ウイルス組換えベクターおよび非ウイルス組換えベクターを、野生型および/または改変型ウロキナーゼ誘導プラスミノゲン活性化因子huPAのヒト遺伝子のcDNAの構築および結合によって、ならびにTGF−βタイプII端部切断レセプターの遺伝子のcDNAから、および肝細胞増殖因子HGFのcDNAから種々の起源のプラスミドおよび調節性および/または誘導プロモーターと共に作製することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 組換えアデノウイルスベクターがpAd.PGK−ΔNΔC−huPAであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 硬変肝臓の繊維症を治療するための治療用タンパク質をコードする治療用遺伝子またはDNA配列の送達を包含する、請求項1に記載の方法。
- 治療用遺伝子の送達を広汎性繊維症によって冒された他の器官において行う、請求項16に記載の方法。
- 治療用遺伝子の送達が、なんらかの方法で投与された治療用遺伝子の繊維症器官に対する組織特異的な認識、すなわち使用する組換えベクターの硬変肝臓に対する本来の親和性によって行われることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 投与経路が静脈内である、請求項18に記載の方法。
- ヒトを含めた哺乳動物において、繊維症器官が肝臓、肺、心臓、腎臓、膵臓、皮膚および肥厚性瘢痕から選択される、請求項17に記載の方法。
- 主な標的器官が肝臓である、請求項20に記載の方法。
- 治療用遺伝子の送達をウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用することによって行う、請求項16に記載の方法。
- ウイルスベクターを、第1世代、第2世代、第3世代および/または第4世代のアデノウイルスベクター、「中抜き」アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターから選択する、請求項22に記載の方法。
- 非ウイルスベクターがリン脂質成分、および特定のレセプター用の種々のリガンドと合体した種々の構造のリポソームから構成されている、請求項22に記載の方法。
- ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを、野生型および/または改変型ウロキナーゼ誘導プラスミノゲン活性化因子huPAのヒト遺伝子のcDNA、TGF−βタイプII端部切断レセプターの遺伝子のcDNAおよび種々の起源のプラスミド、および調節性および/または誘導プロモーターの構築および結合によって作製する、請求項22に記載の方法。
- 非ウイルスベクターをプラスミドおよびカチオン性リポソームおよびアニオン性リポソームから選択する、請求項24に記載の方法。
- ウロキナーゼ誘導プラスミノゲン活性化因子huPAのヒト遺伝子の硬変肝臓への効果的な送達によって、メタロプロテアーゼの過剰発現によるコラーゲン分解を引き起こすことができる、請求項16に記載の方法。
- 肝線維症、肺線維症、腎線維症、心臓線維症、膵線維症、およびケロイド、および肥厚性瘢痕を治療するために使用されるので特徴付けられる、請求項16乃至27のいずれか1項に記載の方法。
- 肝硬変動物に投与されるhuPAヒト治療用遺伝子の発現を、対応するヒトタンパク質の発現のELISAアッセイおよび免疫組織化学アッセイにより検出することができる、請求項1に記載の方法。
- I型、III型およびIV型内在性コラーゲンの遺伝子の発現を、前記遺伝子の基線レベルの特異的変化の検出を可能にした半定量的RT−PCRによって評価した、請求項1に記載の方法。
- 無関係なアデノウイルスpAd−GFPで治療したラットと比べて、組換えアデノウイルスベクターpAd.PGK−ΔNΔC−huPAで治療したラットにおいて、I型コラーゲンの発現が第10日に4倍低下し、III型コラーゲンの発現が第10日に約2倍低下し、IV型コラーゲンの発現が第6日に約5倍低下した、請求項30に記載の方法。
- huPAの過剰発現が、ECMタンパク質をコードするI型、III型およびIV型内在性コラーゲンの遺伝子の発現停止を誘導する、請求項31に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって得られる組換えアデノウイルスベクターであって、オープンリーディングフレームE1および/またはE3が欠失しているが、in vitroでアデノウイルスベクターを複製させることができる充分な配列は保持しているアデノウイルスゲノムを含み、前記ベクターが、遍在性プロモーターおよび/または組織特異的プロモーターまたは誘導および/または調節プロモーターによって調節され線維症の治療において有用な治療用タンパク質をコードする治療用遺伝子またはDNA配列を含むことを特徴とする、組換えアデノウイルスベクター。
- プロモーターがサイトメガロウイルス(CMV)からのプロモーターである、請求項33に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- アデノウイルスベクター中にクローン化されている治療用遺伝子またはDNA配列が、肝硬変器官に沈着した過剰なコラーゲンタンパク質の合成および沈着を低下および/または予防する治療用タンパク質をコードする、ヒトの野生型および/または改変型huPAウロキナーゼ由来プラスミノゲン活性化因子遺伝子およびTGF−βタイプII端部切断レセプター遺伝子から選択されるものである、請求項33に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 治療用遺伝子が、肝臓の正常な機能を回復させるために肝臓の再生を刺激するタンパク質をコードする、肝細胞増殖因子(HGF)遺伝子から選択されるDNA配列である、請求項33に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 線維症を治療するための治療用タンパク質が、野生型および/または改変型huPAウロキナーゼ由来プラスミノゲン活性化因子、TGF−βタイプII端部切断レセプター、肝細胞増殖因子HGFである、請求項33に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 硬変肝臓の線維症の治療を目的とする治療用タンパク質をコードする治療用遺伝子またはDNA配列を送達する、請求項33に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 治療用遺伝子を広汎性線維症である他の器官に送達する、請求項38に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 治療用遺伝子の送達を、投与される治療用遺伝子の繊維症器官に対する組織特異的な認識、および使用する組換えベクターの硬変肝臓に対する本来の親和性によって行うものである、請求項38に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 投与経路が静脈内である、請求項40に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- ヒトを含めた哺乳動物において、繊維症器官が肝臓、肺、心臓、腎臓、膵臓、皮膚および肥厚性瘢痕から選択される、請求項39に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 主な標的器官が肝臓である、請求項42に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- pAd.PGK−ΔNΔC−huPAである、請求項33乃至43のいずれか1項に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 治療用遺伝子の送達をウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを使用することによって行う、請求項38に記載の組換えベクター。
- ウイルスベクターを、第1世代、第2世代、第3世代および/または第4世代のアデノウイルスベクター、「中抜き」アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターから選択する、請求項45に記載の組換えベクター。
- 非ウイルスベクターが、リン脂質成分、および特定のレセプター用の種々のリガンドと合体した種々の構造のリポソームから構成されている、請求項45に記載の組換えベクター。
- ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを、野生型および/または改変型ウロキナーゼ誘導プラスミノゲン活性化因子のヒト遺伝子のcDNA、TGF−βタイプ端部切断レセプターのcDNAおよび種々の起源のプラスミド、および調節性および/または誘導プロモーターの構築および結合によって作製する、請求項45に記載の組換えベクター。
- 非ウイルスベクターをプラスミドおよびカチオン性リポソームおよびアニオン性リポソームから選択する、請求項47に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- ウロキナーゼ誘導プラスミノゲン活性化因子huPAのヒト遺伝子の肝臓への効果的な送達によって、メタロプロテアーゼの過剰発現によるコラーゲン分解を引き起こすことができる、請求項38に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- ヒトを含めた哺乳動物において、肝線維症、肺線維症、腎線維症、心臓線維症、膵線維症、ケロイド、および肥厚性瘢痕を治療するために使用され、致死的な毒性を誘導することがないので使用されることを特徴とする、請求項33乃至50のいずれか1項に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 前記組換えベクターを使用する追加的な利点が、これらのベクターは多量のhuPAを分泌せず、肝硬変動物の主な傷害である、凝血性低下または突発性の出血を引き起こすことがないためであるという、請求項33乃至51のいずれか1項に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 血液流中への分泌を可能な限り妨げるため、小胞体(RE)中のアミノ末端およびカルボキシ末端で保持シグナルを改変して非分泌huPA形とした、請求項52に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- pGEM3中のXbaI/Asp718部位でクローン化されたhuPAのcDNAがカルボキシ末端で改変されており、KDELシグナルをコードする配列、およびのPCRで生成した75個のヌクレオチドのクローン化により上流の残基も加えられている、請求項53に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- プレuPAペプチドシグナルを含むアミノ末端の25個のアミノ酸を、PCRで得た膜貫通IIタンパク質Iip33からの31個のアミノ酸のスペーサーペプチドによって分けられている膜貫通領域(TM)中の、アンカーの隣のアミノ末端保持シグナル(RR)に置換した、請求項54に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- RR配列が膜貫通領域(TM)のアンカー領域の隣に位置するアルギニン残基MHRRRSRによって構成されており、不可逆鎖タンパク質Iip33などのタイプII膜貫通タンパク質中に存在する、請求項55に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 改変型huPA遺伝子を、組換えアデノウイルスベクターを生成させるためにアデノウイルスプラスミドpAd.ΔNΔC−huPA上にクローン化する、請求項53に記載の組換えアデノウイルスベクター。
- 肝線維症、肺線維症、腎線維症、心臓線維症、膵線維症、ケロイド、および肥厚性瘢痕を治療するために、薬剤として許容される担体と組み合わせて、請求項33乃至57のいずれか1項に記載の組換えアデノウイルスベクターのウイルス粒子を単位用法に関して治療的に有効な量含む、薬剤組成物。
- 単位用量が肝硬変1個体当たり約107〜1014個のウイルス粒子を含む、請求項58に記載の薬剤組成物。
- 請求項33乃至57のいずれか1項に記載の組換えアデノウイルスベクター、および他のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの使用であって、ヒトを含めた哺乳動物の肝線維症、肺線維症、腎線維症、心臓線維症、膵線維症、ケロイド、および肥厚性瘢痕を治療するために、ウイルス粒子を単位用法に関して治療的に有効な量含む薬剤を調製するための使用。
- 単位用量が肝硬変1個体当たり約107〜1014個のウイルス粒子を含む、請求項60に記載の使用。
- ヒトを含めた哺乳動物の肝線維症、肺線維症、腎線維症、心臓線維症、膵線維症、ケロイド、および肥厚性瘢痕を治療するための方法であって、請求項33乃至57のいずれか1項に記載の組換えアデノウイルスベクターを投与することからなる方法。
- ヒトを含めた哺乳動物の肝線維症、肺線維症、腎線維症、心臓線維症、膵線維症、ケロイド、および肥厚性瘢痕を治療するための方法であって、請求項58乃至59のいずれか1項に記載の薬剤組成物を投与することからなる方法。
- 投与の経路が静脈内である、請求項62または64に記載の方法。
- 単位用量が肝硬変1個体当たり約107〜1014個のウイルス粒子を含む、請求項62または63に記載の方法。
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