JP2006213724A - アンジオスタチンおよび血管形成の抑制におけるその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】内皮形成インヒビターは、血液または尿から単離され、高速液体クロマトグラフィーのC4逆相から単一のピークとして溶出されるタンパク質であり、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用した測定でおよそ38キロダルトン〜45キロダルトンの分子量を有し、マウスのプラスミーゲン分子のアミノ酸番号98から始まるマウスのプラスミノーゲンフラグメントと非常に似たアミノ酸配列を有するタンパク質を含むアンジオスタチン。
【選択図】なし
Description
本出願は、1994年4月26日に出願された米国出願の部分継続出願である、1994年10月20日に出願された米国出願第08/326,785号の部分継続出願である。
本発明は、アンジオスタチン(angiostatin)と称され、可逆的に内皮細胞の増殖を阻害する内皮形成インヒビターに関する。さらに詳細には、本発明は、血液や尿などの体液から単離できる、または、組換えを使用する方法、酵素を使用する方法もしくは化学的方法により合成できるアンジオスタチンタンパク質に関する。アンジオスタチンは、血管形成関連性疾患を抑制でき、また血管形成プロセスを調節できる。さらに本発明は、アンジオスタチン測定のための診断アッセイおよびキット、アンジオスタチンの位置特定(localization)のための組織化学検査キット、アンジオスタチンおよびアンジオスタチンの生合成をモニターする分子プローブをコードするDNA配列、アンジオスタチンに特異的な抗体、アンジオスタチンレセプターに対するペプチドアゴニストおよびアンタゴニストの開発、抗アンジオスタチンレセプター特異的抗体アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにアンジオスタチンペプチドに結合した細胞毒性物質に関する。
本明細書で使用する、血管形成という用語は、組織や器官内で新しい血管が発生することを意味する。通常の生理学的条件下では、ヒトおよび動物は、非常に限定された状況においてのみ血管形成を行う。たとえば、通常、傷の治癒、胎児または胚の発達、ならびに黄体、子宮内膜および胎盤の形成時において観察される。内皮(endothelium)とは、漿液腔(serous cavity)、リンパ管および血管の内側にある扁平な上皮細胞の薄い層のことである。
本発明は、血管形成を調節し、および望まれない血管形成、特に腫瘍の成長に関連する血管形成を抑制するに有効な組成物および方法を提供するものである。本発明は、アンジオスタチンと称され、インビトロにおいてbFGFなどの内因性の成長因子の血管形成作用を克服する能力と、プラスミノーゲンのアミノ酸番号98付近から始まるプラスミノーゲン内の一部分とのアミノ酸配列および構造的類似性を特徴とするタンパク質を含む。アンジオスタチンは、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用した測定でおよそ38キロダルトン〜45キロダルトンの分子量を有し、マウスの完全なプラスミーゲン分子のアミノ酸番号98から始まるマウスのプラスミノーゲンフラグメントと非常に類似したアミノ酸配列を有するタンパク質からなる(配列番号2)。
本発明は、血管形成が介在するまたは血管形成を伴う疾患およびプロセスの検出および治療のための組成物および方法を包含する。前記組成物は、アンジオスタチンであり、アンジオスタチンは、血清、尿および腹水を含むがこれらに限定されない体液から単離し、または化学的または生物学的方法(たとえば、細胞培養、組換え遺伝子発現、ペプチド合成、および活性なアンジオスタチンを生じるプラスミノーゲンまたはプラスミンのインビトロ酵素分解)によって合成することができる。組換え法には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用するDNA源からの遺伝子増幅、および逆転写酵素/PCRを使用するRNA源からの遺伝子増幅が含まれる。アンジオスタチンは、未血管形成または血管形成腫瘍などの組織内への血管成長を抑制する。
(i)腫瘍を有するヒトおよび動物に抗血管形成療法として投与され、
(ii)予後観察のマーカーとして、ヒトおよび動物の血清、尿、または組織においてモニターされ、
(iii)同じような血管形成抑制(angiostatic)分子について、癌患者の血清および尿を分析する基準として使用される。
その腫瘍自体の転移を抑制する能力のある様々なマウスの腫瘍をスクリーニングして、一次腫瘍が最も有効に肺転移を抑制するルイス肺癌を選択した。同系C57BI6/Jの6週齢オスのマウスに1×106の腫瘍細胞を注射(背部皮下)した。肉眼で確認できる腫瘍が始めて出現したのは、3〜4日後であった。腫瘍の大きさが約1,500mm3に達した時、マウスを2つのグループに無作為に分けた。第1のグループでは腫瘍を完全に切除し、第2のグループでは疑手術をおこなって腫瘍は無傷(intact)で残した。転移腫瘍の成長を抑制するのは、大きさ500〜3,000mm3の腫瘍であるが、高い生存率で局所再発を起こさずに安全に切除できる一次腫瘍の大きさは、最大で1,500mm3である。
実施例1のひとつのグループのマウスのLLC−Low細胞系から、ルイス肺癌の転移性の高い変異種が自然発生的に生じた。これを実施例1に記載の方法にしたがって単離し、再度移植した。この腫瘍(LLC−High)は、一次腫瘍の有無に関係なく30箇所以上の肉眼で確認できる肺転移腫瘍を形成した。
全ての実験において、C57BI6/J6マウスを使用した。マウスの皮下に、LLC−Low細胞を接種し、14日後に半数のマウスの一次腫瘍を切除した。腫瘍切除から5、10、15日後にマウスを屠殺した。肺転移腫瘍の組織学的切片を得た。一次腫瘍を無傷で残したマウスには、肺に血管形成のない微小転移腫瘍があった。これらの転移腫瘍は、直径が12〜15細胞層以内で、腫瘍切除から15日後でさえも有意なサイズの増大はなかった。これに対して、一次腫瘍を切除したマウスでは、手術後5日ですでに血管形成のある大きな転移腫瘍が出現していた。これらの転移腫瘍は、腫瘍除去後15日目には、(肺重量および組織学的検査に反映されるように)さらに4倍に大きくなった。一次腫瘍を切除したマウスのうちおよそ50%が、実験が終了する前に肺腫瘍転移で死亡した。一次腫瘍を無傷のままにしたマウスはすべて、実験の終了まで生存していた。
肺転移腫瘍における血管形成の程度を測定するために、フォン・ヴィレブランド(von Willebrand)因子(内皮に特異的なマーカー、ダコ社カーペンテリア、カリフォルニアから入手可能)に対する抗体で組織を染色した。無傷の一次腫瘍を有する動物の転移腫瘍は、既存の肺血管の周囲に薄カフス様(8〜12の腫瘍細胞層)に形成されていた。血管の内側を覆う内皮細胞を除いて、フォン・ヴィレブランド因子に対して陽性な細胞はほんのわずかか、または存在しなかった。これと反対に、一次腫瘍切除後5日目の動物における肺転移腫瘍は、大きいばかりでなく、フォン・ヴィレブランド因子で強く染色された内皮細胞を含む毛管肉芽で浸潤されていた。
0.25から0.5mm2のルイス肺癌(LLC−Low)を、第0日にマウスの角膜に移植した(Muthukkaruppan Vr.,et al.,Angiogenesis in the mouse cornea.Science 205:1416-1418,1979)。一次腫瘍は、角膜への移植の4または7日前;角膜への移植の日;角膜への移植の4または7日後のいすれかに、1x106個のLLC−Low細胞を背部の皮下に接種して形成させた。対照マウスは、角膜への移植を行ったが、皮下腫瘍ではない細胞を移植した。他の対照マウスは、角膜への移植と角膜への移植の4日前に背部にLLC−High腫瘍細胞の接種をおこなった。角膜は、角膜腫瘍の成長(接眼マイクロメーターで測定した)および角膜縁の端からの新しい毛細血管の成長について、スリットランプ立体顕微鏡で毎日検査した。
実施例5および6に記載の実験は、一次腫瘍が、二次転移腫瘍中における血管形成を抑制することを示しているが、これらの研究は、一次腫瘍が、(i)直接、内皮増殖(または血管形成)を抑制している、または(ii)転移腫瘍細胞の血管形成活性を低下調節することにより間接的にそれを抑制している、のいずれであるのかを明らかにしていない。これらの二つの可能性の違いを明確にするために、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を含有するマトリゲル(matrigel)の移植により、皮下血管形成の病巣を誘導した(Passaniti A,et al.,A simple,quantitative method for assessing angiogenesis and anti-angiogenic agent using reconstituted basement membrane,heparin and fibroblast grwoth factor.Lab.Invest.67:519,1992)。
マウスにルイス肺癌を上記のように移植した。15日後、腫瘍の大きさが約1,500mm3の時、マウスを無作為に4つのグループに分けた。3つのグループでは、一次腫瘍を外科的に完全に切除し、一つのグループでは(偽手術手順を行った後)腫瘍を無傷で残した。3つの切除グループのマウスは、その後、毎日、生理食塩水、正常で腫瘍を有さないマウスから得た血清、または1,500mm3のルイス肺癌を有するマウスから得た血清の腹腔内注射を受けた。腫瘍を無傷で残したマウスのグループは、生理食塩水の腹腔内注射を受けた。全てのマウスは、21日間処置後、安楽死させ、肺転移腫瘍を計数した(表2)。
BCE細胞は、9継代から14継代の間のもののみ使用される。0日目に、BCE細胞を、ゼラチン処理(PBS中1.5%ゼラチン、37℃、10%CO2で24時間、その後0.5mlのPBSで洗浄)24ウェルプレートに、12,500細胞/ウェルの濃度で撒く。細胞数の計数には、ヘモサイトメーターを使用する。細胞は、10%の加熱不活性化(56℃、20分間)子ウシ血清と1%グルタミン−ペン−ストレップ(GPS)を含有する500μlのDMEM中で培養される。
72時間増殖アッセイにおいて、ウシ毛細血管内皮細胞は、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF1ng/ml)により刺激を受けた。これらの培養物に添加した、腫瘍を有するマウスから得た血清は、用量依存的および可逆的に内皮細胞の成長を抑制した。正常血清は抑制性がなかった(図5)。内皮細胞の増殖は、腫瘍を有するnu/nuマウスおよびSCIDマウスから得られた血清によっても同様に(対照と比較して)阻害された。一次腫瘍を除去すると、3〜5日目までにアンジオスタチン活性は血清から消失した。
LLC−Highの一次腫瘍を有するマウスの血清は、対照に比較して、bFGFの刺激するウシ毛細血管内皮細胞の増殖を有意に抑制しなかった。また、この血清は、精製の始めの二段階(ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーおよびゲル濾過)終了後には、どの画分にもアンジオスタチン活性が見られなくなる。
LLC−LowまたはLLC−High腫瘍細胞(106)のいずれかをマウスの腹腔内に注入すると、1週間後、10〜20匹のマウスのそれぞれより、1〜2mlの血液の混ざった腹水が得られた。小さい腸間腫瘍が見られた。次いでマウスを安楽死させた。心臓穿刺により血清を得た。対照として、正常の、腫瘍を有さないマウスから血清を得た。血清と腹水から遠心分離により細胞を除去し、上清をbFGF(1ng/ml)により刺激されたウシ毛細血管内皮細胞においてアッセイした(実施例9を参照)。双方のタイプの腫瘍から得た腹水は、72時間後において、対照に比較して、毛細血管内皮細胞の増殖を有意に刺激した(たとえば、100%増殖)(図6)。反対に、低転移性マウスから得た血清は、内皮細胞増殖を抑制した(対照の79%抑制)。高転移の細胞系から得た血清は、200%の刺激をした。
アンジオスタチンを精製するために、腫瘍を有するマウスの血清をプールした。上記のインビトロ抑制因子活性アッセイによりアッセイされた抑制活性を、ヘパリン−セファロース、バイオゲルA0.5mmアガロースゲル、および数サイクルのC4逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して、逐次、クロマトグラフィーを行った。内皮抑制活性を有するHPLC画分のSDS−PAGEは、見かけの還元分子量で38,000ダルトンの明確なバンドを示し、これは約2X107の比活性にまで、およそ100万倍(表3参照)精製された。精製の各段階で、プールされた画分を、既知の内皮インヒビター存在について特異的な抗体を使用して検査した。部分精製または精製画分中に、血小板因子4、トロンボスポジンまたはトランスフォーミング成長因子βは検出されなかった。
血清からの内皮細胞インヒビターの精製は、各マウスから得られる血清が少量なこと、および、血清中のタンパク質が多量なことにより、妨害される。
実施例9に記載の方法に従って内皮抑制作用がアッセイされた。アンジオスタチンは、シンクロパック(Synchropak)HPLC C4カラムで単離された(シンクロコム社、ラフィエット、インディアナ州)。インヒビターは、30〜35%のアクリロニトリルグラジエントにおいて溶出された。ドデシル硫酸ナトリウムポリアルリルアミドゲル電気泳動(PAGE)の還元条件のゲル(β−メルカプトエタノール(5%v/v))において、活性を有するタンパク質バンドは38キロダルトンの位置に溶出された。非還元条件においては、活性を有するタンパク質バンドは28キロダルトンの位置に溶出された。最初のサンプルが尿または血清から単離されたもののどちらであっても、活性は同じポイントに検出された。他のバンドには活性は検出されなかった。
プラスミノーゲンリジン結合サイト1は、シグマケミカル社より入手した。この調製物は、エラスターゼで消化したヒトプラスミノーゲンの精製物である。この方法で得たリジン結合サイトIは、プラスミンA鎖(クリングル1+2+3)中の少なくとも始めの3つのループ構造(番号1〜3)を凝集体の状態で含有するペプチドの集まりである(Sotrrup-Jensen,L.,et al.,in Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis,Vol.3,191,Davidson,J.F.,et al.,eds.Raven Press,New York 1978およびWiman,B.,et al.,Biochemlca et Biophysica Acta,579,142(1979))。プラスミノーゲンリジン結合サイト1(シグマケミカル社、セントルイス、ミズリー州)は、水に再懸濁し、HPLCグレードの水/0.1%TFAで予め平衡化したC4逆相カラムにアプライされた。カラムを水/0.1%TFAからアセトニトリル/0.1%TFAまでのグラジエントで溶出し、画分をポリプロピレン製試験管に回収した。各画分の一部をスピードパック(speed vac)で蒸発させ、水に再懸濁し、増殖アッセイにおいてBCEに添加した。抑制活性のある画分について、同様の溶出グラジエントを用いて、この手順を2回繰り返した。抑制活性は、最終のC4カラム精製において30〜35%アセトニトリルにおいて溶出された。抑制活性のある画分のSDS−PAGEでは、見かけの還元分子量が40、42.5、45キロダルトンの3つの明瞭なバンドが示された。非還元条件のSDS−PAGEでは、30、32.5、35キロダルトンの分子量のバンドがそれぞれ示された。
ヒトプラスミノーゲン由来の精製物から得た活性を有する精製画分を、非変性条件下においてSDS−PAGEで分析した。隣のレーンでは同じサンプルを泳動させて銀染色を施しておき、そのバンドに相当する部分のゲルを切り出し、ポリプロピレン製試験管に入れて、1mlのリン酸緩衝生理食塩水中、4℃、12時間インキュベートした。上清を除去し、生理食塩水中で6時間の透析を2回(MWCO=6−8000)、蒸留水中で6時間の透析を2回行った。透析物は、真空遠心分離にて乾燥させた。生成物は生理食塩水中に再懸濁し、1ng/mlの塩基性線維芽成長因子の刺激を与えたウシ毛細血管内皮細胞に添加して72時間アッセイをおこなった。3つのバンドのそれぞれから抽出されたタンパク質は、毛細血管内皮細胞を抑制した。
マウスにルイス肺癌を移植し、腫瘍が1,500〜2,000mm3になった時に切除する。手術の日に、マウスを6匹づつ、6つのグループに無作為に割り振った。マウスには、ヒトプラスミノーゲンの精製された抑制活性のある3種のフラグメント、完全なヒトプラスミノーゲン、腫瘍を有する動物の尿、正常マウスの尿、または生理食塩水のいずれかを毎日腹腔内投与した。偽手術のみを行った腫瘍を有するマウスの1グループには、生理食塩水の注射をおこなった。一次腫瘍の切除直後、ローディング(loading)投与として、24μg(1.2mg/kg/日/マウス)の抑制活性を有するフラグメントをマウスに腹腔内投与した。その後、実験期間を通して、毎日12μg(0.6mg/kg/日/マウス)の抑制活性を有するプラスミノーゲンフラグメントをマウスに腹腔内投与した。対照マウスには、腫瘍の切除後、同じ用量の完全なプラスミノーゲン分子を投与した。尿処置については、正常なまたは腫瘍を有するマウスの尿を濾過、十分に透析、凍結乾燥し、そして滅菌水に再懸濁して250倍の濃縮液を作成した。一次腫瘍の切除の日にローディング投与として、腫瘍を有するマウスまたは正常マウスから得た透析尿濃縮液0.8mlを2回の腹腔内注射としてマウスに投与した。その後、実験の期間中、透析濃縮尿0.4mlを毎日マウスに腹腔内投与した。処置は13日間おこない、13日目に全てのマウスを屠殺して剖検した。
マウス尿から単離されたアンジオスタチンおよびヒトのリジン結合サイトIフラグメント調製物のアミノ酸配列を、アプライドバイオシステムモデル477Aタンパク質シークエンサーを使用して決定した。フェニルチオヒダントインアミノ酸画分を、オンラインのABIモデル120A HPLCによって同定した。マウスおよび人間のアンジオスタチンのN末端配列およびトリプシン消化物から決定したアミノ酸配列から、アンジオスタチンのアミノ酸配列は、マウスのプラスミノーゲンのアミノ酸番号98から始まる配列に類似していることが示唆される。従って、アンジオスタチンは、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して約38キロダルトン〜45キロダルトンの分子量を有するタンパク質から成り、マウスの完全なプラスミノーゲン分子のアミノ酸番号98のアミノ酸から始まるマウスのプラスミノーゲンフラグメントと実質的に同様のアミノ酸配列を有する分子である。マウスアンジオスタチンのアミノ酸配列の始めを、図1に示す(配列番号2)。アミノ酸配列の長さは、図1に示されるものよりも少し長いまたは短い可能性もある。
大腸菌における真核生物の遺伝子の翻訳の効率を高めるために、pTrcHisAベクター(インビトロゲン社製)(図10)を使用して、trcプロモーターからの高いレベルの転写を得た。金属との親和性を有する樹脂を使用した一段階の精製のためにN末端にニッケル結合性ポリヒスチジンテイルを融合した状態で、アンジオスタチンを発現させた。発現後、融合ペプチド中のエンテロキナーゼ分解認識サイトを利用して、精製した組換えタンパク質からN末端ヒスチジン融合ペプチドを除去できる。組換えヒトアンジオスタチンタンパク質は、リジンと結合することが判明しており、クリングル領域1、2および3に対して特異的なモノクローナル抗体と交差反応性があり、インビトロにおいてbFGFの誘導する内皮細胞増殖を抑制する。
C57BL6/Jマウスにルイス肺癌細胞(1x106)を皮下接種後、大きさ約1.5cm3の一次腫瘍が出現した。一次腫瘍の外科的切除または偽手術をマウスに施した。手術後5、10および15日目にマウスを屠殺し、肺の組織学的検査を行った。一次腫瘍を切除したマウスでは、偽手術をおこなった対照と比較して、かなり大きな転移腫瘍の増殖が見られた(図14)。転移腫瘍の増大とともに肺重量が有意に増大していた。
アンジオスタチンは、上記の実施例15に記載されるように、ヒトのプラスミノーゲンを制限的にエラスターゼ消化して精製した。アンジオスタチンをリン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁して、6週齢オスC57BI6/Jマウスに投与した。ルイス肺癌またはT241線維肉腫の細胞のいすれか1x106個をマウスの皮下に移植した。4日後、腫瘍の大きさが80〜160mm3になった時にアンジオスタチンによる治療を開始した。アンジオスタチンの40mg/kgの単回投与、または80mg/kgの2回投与を、腹腔内(ip)または皮下(sc)注射でおこなった。治療を19日間継続し、マウスは各時点で屠殺された。
2種類のヒト腫瘍細胞系、すなわち、ヒト前立腺癌PC−3とヒト乳癌MDA−MBに対するアンジオスタチンの作用を調べた。免疫不全SCIDマウスにヒトの腫瘍細胞を移植し、実施例21に記載のように、マウスに50mg/kgのアンジオスタチンを基本的に12時間毎に投与した。その結果、本発明のアンジオスタチンタンパク質が、ヒトの腫瘍細胞の成長の強力なインヒビターであることが示された。図22は、ヒトの前立腺癌PC−3に関し、24日目において、アンジオスタチンを投与したマウスの平均腫瘍容積は、投与をおこなわない対照マウスのわずか2%であることを示している。図23は、ヒトの乳癌MDA−MBに関するもので、24日目において、アンジオスタチンを投与したマウスの平均腫瘍容積は、投与をおこなわない対照マウスのわずか8%であることを示している。
マウスのプラスミノーゲンのアミノ酸番号1〜460をコードする、マウスのプラスミノーゲンcDNA(American Type Culture Collection(ATCC)より入手)に由来する、アンジオスタチンをコードする1380塩基対のDNA配列を、PCRを使用して作成し、発現ベクターに挿入した。この発現ベクターをT241線維肉腫細胞に導入し、DNA導入細胞をマウスに移植した。対照マウスには、非DNA導入T241、または、ベクターのみを導入したT241(すなわち、アンジオスタチンを発現しない導入細胞)を移植した。3種類のアンジオスタチン発現DNA導入細胞のクローンを、実験で使用した。平均腫瘍容積を、経時的に測定した。その結果、非DNA導入および非発現の対照細胞に比較して、アンジオスタチン発現細胞クローンのマウスにおいて平均腫瘍容積の驚くべきかつ劇的な低下が示された。
1.T241細胞を60cm2の組織培養皿で成長させる(血清を添加した適当な成長培地2ml中に約1〜2x105細胞を接種)。
インビボにおけるアンジオスタチンタンパク質の発現部位の位置特定をするために、ルイス肺癌(マウス)、T241線維肉腫(マウス)およびブルキット(Burkitt)のリンパ腫細胞(ヒト)の種々の細胞型に由来する全RNAを、腫瘍細胞から直接採取したものおよび数継代後の細胞培養によるものについて分析してアンジオスタチン転写物の存在を確認した。サンプルをノーザン分析した結果、マウスのプラスミノーゲンに相当する約2.4kbの単一シグナルが示された正常マウスの肝臓RNA以外のすべてのサンプルでは、thn配列とのシグナルハイブリダイゼーションがないことが判明した。ヒトのサンプルのノーザン分析の結果、ヒトのプラスミノーゲンに相当する約2.4kbの単一シグナルが示された正常ヒト肝臓RNA以外では、ヒトのアンジオスタチン配列とのシグナルハイブリダイゼーションがないことが判明した。
ヒトのプラスミノーゲンのアミノ酸93〜470をコードする遺伝子フラグメントを、酵母(Pichia pastoris)中のPHO1分泌シグナルを利用してタンパク質の分泌発現を可能とする、pHIL−SI(Invitrogen)のXhoI/EcoRIサイト中にクローン化した。同様に、ヒトのプラスミノーゲンのアミノ酸93〜470をコードする遺伝子フラグメントを、酵母菌(Pichia pastoris)中のα因子分泌シグナルを利用してタンパク質の分泌発現を可能とする、pPIC9(Invitrogen)中のSnaBI/EcoRIサイト中にクローン化した。これらのシステムで発現されたヒトアンジオスタチンタンパク質には、タンパク質プロセッシング、タンパク質ホールディング、およびグリコシル化などの翻訳後の修飾など、大腸菌での発現システムにはない多くの利点がある。
アンジオスタチン遺伝子転写物を発現するウシまたはブタ科などのトランスジェニック動物を作成する。トランスジェニック動物は、たとえば、これらの動物の乳中にアンジオスタチンタンパク質を発現する。さらに、アンジオスタチン遺伝子転写物を発現する食用のトランスジェニック植物を作成する。
Claims (29)
- アンジオスタチン。
- 還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定値でおよそ38キロダルトン〜45キロダルトンの分子量を有し、マウスのプラスミノーゲン分子のアミノ酸番号98付近から始まるマウスのプラスミノーゲンフラグメントのアミノ酸配列と実質的に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質を含む請求の範囲第1項に記載のアンジオスタチン。
- 前記アミノ酸配列が、ヒトのプラスミノーゲン、マウスのプラスミノーゲン、ウシのプラスミノーゲン、アカゲザルのプラスミノーゲンまたはブタのプラスミノーゲンに由来するプラスミノーゲンフラグメントである請求の範囲第2項に記載のアンジオスタチン。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、および配列番号6からなるグループから選ばれる請求の範囲第3項に記載のアンジオスタチン。
- 前記タンパク質が血管形成を抑制できる請求の範囲第1項に記載のアンジオスタチン。
- 前記プラスミノーゲンフラグメントが内皮抑制活性を有する請求の範囲第3項に記載のアンジオスタチン。
- 前記タンパク質が血管形成性疾患を抑制できる請求の範囲第1項に記載のアンジオスタチン。
- 前記血管形成性疾患が癌である請求の範囲第1項に記載のアンジオスタチン。
- 還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定値でおよそ38キロダルトン〜45キロダルトンの分子量を有し、リジンと結合でき、且つ血管形成を抑制できるタンパク質を含む請求の範囲第1項に記載のアンジオスタチン。
- 血管形成性疾患を有するヒトまたは動物に有効量のアンジオスタチンを投与することを含む、血管形成性疾患を有するヒトまたは動物を治療する方法。
- 前記アンジオスタチンが、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定値でおよそ38キロダルトン〜45キロダルトンの分子量を有し、マウスのプラスミノーゲン分子のアミノ酸番号98から始まるマウスのプラスミノーゲンフラグメントのアミノ酸配列と実質的に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質である請求の範囲第10項に記載の方法。
- 前記アミノ酸配列が、ヒトのプラスミノーゲン、マウスのプラスミノーゲン、ウシのプラスミノーゲン、アカゲザルのプラスミノーゲンまたはブタのプラスミノーゲンに由来するプラスミノーゲンフラグメントである請求の範囲第11項に記載の方法。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、および配列番号6からなるグループから選ばれる請求の範囲第11項に記載の方法。
- 前記血管形成性疾患が、癌、関節炎、黄斑変性および糖尿性網膜症からなるグループから選ばれる請求の範囲第10項に記載の方法。
- 還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定値でおよそ38キロダルトン〜45キロダルトンの分子量を有し、リジンと結合でき、且つ血管形成を抑制できるタンパク質を含む請求の範囲第1項に記載のアンジオスタチン。
- 還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定値でおよそ38キロダルトン〜45キロダルトンの分子量を有し、マウスのプラスミノーゲン分子のアミノ酸番号98から始まるマウスのプラスミノーゲンフラグメントのアミノ酸配列と実質的に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質の濃度を測定するステップを含む、血管形成性疾患の診断または疾患の予後の測定方法。
- 前記疾患が癌である請求の範囲第16項に記載の方法。
- アンジオスタチンをコードする単離DNA配列を含む組成物。
- 前記DNA配列が、配列番号2と実質的に類似するアミノ酸配列をコードし、前記アミノ酸配列がマウス腫瘍モデルにおいて抗血管形成活性を有する請求の範囲第18項に記載の組成物。
- 前記DNA配列が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、および配列番号6からなるグループから選ばれるアミノ酸配列をコードする請求の範囲第18項に記載の組成物。
- さらに、前記のアンジオスタチンをコードするDNA配列を結合したベクターを含み、前記ベクターは細胞中に存在するときにアンジオスタチンを発現できる請求の範囲第18項に記載の組成物。
- ベクターを含有する細胞を含む組成物であって、前記ベクターはアンジオスタチンをコードするDNA配列を含有し、前記ベクターは細胞中に存在するときにアンジオスタチンを発現できる該組成物。
- 前記DNA配列が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、および配列番号6からなるグループから選ばれるアミノ酸配列をコードする請求の範囲第22項に記載の組成物。
- ヒトまたは非ヒト動物中に、ベクターを含有する細胞を移植することを含む方法であって、前記ベクターはアンジオスタチンをコードするDNA配列を含有し、前記ベクターは細胞内に存在するときにアンジオスタチンを発現できる該方法。
- 前記DNA配列が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、および配列番号6からなるグループから選ばれるアミノ酸配列をコードする請求の範囲第24項に記載の組成物。
- アンジオスタチンおよび薬学的に許容される賦形剤を含む組成物。
- 徐放性マトリックスをさらに含む請求の範囲第26項に記載の組成物。
- 前記アンジオスタチンが、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定値でおよそ38キロダルトン〜45キロダルトンの分子量を有し、マウスのプラスミノーゲン分子のアミノ酸番号98から始まるマウスのプラスミノーゲンフラグメントのアミノ酸配列と実質的に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質である請求の範囲第26項に記載の組成物。
- アンジオスタチンと特異的に結合し、プラスミノーゲンと結合しない抗体を含む組成物。
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