KR19990008029A

KR19990008029A - 안기오스타틴 단편과 안기오스타틴 응집체 및 이의 이용방법

Info

Publication number: KR19990008029A
Application number: KR1019970707553A
Authority: KR
Inventors: 폭크만엠.쥬다; 오레일리마이클에스.; 카오이하이; 린지
Original assignee: 윌리엄 뉴; 더칠드런즈메디칼센터코포레이션
Priority date: 1995-04-26
Filing date: 1996-04-26
Publication date: 1999-01-25
Also published as: EP1867721A1

Abstract

단편 및 응집체 형태의 내피 세포 증식 억제 인자 및 그 이용 방법이 제공된다. 내피 세포 억제 인자는 플라스미노겐으로부터 유도되는 단백질, , 또는 보다 상세하게는 안기오스타틴 단편이다. 안기오스타틴 단편은 일반적으로 내피 세포 증식 억제 인자 내에 일어나는 크링글 구조에 상응한다. 안기오스타틴은 또한 응집체 형태로 제조된다. 안기오스타틴 단편 및 안기오스타틴 응집체의 내피 세포 억제 활성은 종양의 맥관 형성 억제 및 맥관 형성-개재 질환을 치료하기 위한 수단을 제공한다.

Description

안기오스타틴 단편과 안기오스타틴 응집체 및 이의 이용방법

본원에서 사용되는 용어 맥관 형성은 조직 또는 기관 내의 신규 혈관 생성을 의미한다. 정상적인 생리적 조건 하에서, 인간 또는 동물은 매우 특정 제한적 상황에서만 맥관 형성을 경험한다. 예를 들면, 상처 치료, 태아 또는 배아 발달 및 황체, 자궁내막 및 태반 형성 시에, 맥관 형성이 일반적으로 관측된다. 내피라는 용어는 장액 공동, 림프관 및 혈관을 따라 늘어서는 평-내피 세포의 박층을 의미한다.

조절 및 비조절된 맥관 형성은 유사한 방식으로 수행되는 것으로 간주된다. 내피 세포 및 주세포는 기저막으로 둘러싸여 모세 혈관을 형성한다. 내피 세포 및 백혈구에 의하여 방출된 효소에 의하여 기저막이 부식됨과 동시에, 맥관 형성이 시작된다. 혈관 구경을 따라 늘어서는 내피 세포는 기저막을 통과하여 돌출된다. 맥관 형성 자극 인자는 내피 세포로 하여금 부식된 기저막을 통과하여 이동하도록 유도한다. 이동하는 세포는 모 혈관 밖으로 싹을 형성하며, 여기서 내피 세포가 핵분열 및 증식한다. 내피의 싹은 상호 통합되어, 신규 혈관을 창출하면서, 모세관계망을 형성한다.

다수의 질환 상태, 종양 전이 및 내피 세포에 의한 비정상적 성장 시, 영속적이며 비조절된 맥관 형성이 발생되며, 이러한 상황에서 나타나는 병리학적 손상을 뒷받침한다. 비조절된 맥관 형성이 존재하는 다양한 병리학적 질환 상태는 맥관 형성-의존성 또는 맥관 형성-관련 질환으로 분류되어 왔다.

종양 성장이 맥관 형성-의존성이라는 가설은 1971년에 처음 제안되었다[참고문헌: Folkman J., Tumor angiogenesis: Theraputic implications., N. Engl. Jour. Med. 285:1182 1186, 1971]. 이는 가장 단순한 용어로 다음과 같이 진술한다: 일단 종양 테이크가 발생되면, 모든 종양 세포군의 증가에는 종양에 집중되는 신규 모세관의 증가가 반드시 선행된다. 종양 테이크라는 용어는 평방 밀리미터 용적을 점유하며 백만 세포를 초과하지 않는 종양 세포군이 존재하는 숙주 미세관 상에서 생존할 수 있는 종양 성장의 예비 혈관 단계를 가리키는 것으로 현재 이해된다. 이러한 단계를 넘어선 종양 용적의 증가는 신규 모세혈관의 도입을 필요로 한다. 예를 들면, 쥐 내의 초기 예비 혈관 단계에서의 폐동맥의 미세전이는 조직학적 부위 상에서 고성능 현미경 검사법에 의한 경우를 제외하고 검출될 수 없다.

상기를 뒷받침하는 간접적 증거의 예는 하기를 포함한다:

(1) 쥐의 피하의 투명 체임버 내에 이식된 종양의 성장율은 혈관신생 이전에 느리고 선-함수이며, 혈관신생 이후에 신속하고 지수-함수이다. [참고문헌: Algrie GH, et al. Vascular reactions of normal and malignant tumors in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normal and neoplastic transplants. J. Natl. Cancer Inst. 6:73-85, 1945].

(2) 혈관이 증식하지 않는 분리 확산된 기관 내에서 성장한 종양은 1 내지 2 mm³으로 한정되는 반면, 이들이 쥐로 이식되어 혈관신생되면 이 용적의 1000 배 이상으로 신속히 팽창한다. [참고문헌: Folkman J, et al., Tumor behavior in isolated perfused organs: In vivo growth and metastasis of biopsy material in rabbit thyroid and canine intestinal segments. Annals of Surgery 164:491-502, 1996]

(3) 구혈 각막 내의 종양 성장은 서서히 선적 비율로 진행되나, 혈관신생 이후 지수적 성장으로 변화된다. [참고문헌: Gimbrone, M.A., Jr. et al., Tumor growth and neovascularization: An experimental model using the rabbit cornea J. Natl. Cancer Institute 52:41-427, 1974]

(4) 토끼 눈의 전실의 수성 액 내에 현탁된 종양은 생존가능하고, 구혈관인 체로 유지되며, 크기에 있어 1 mm³미만으로 제한된다. 일단 이들이 이리스 혈관층 상으로 이식되면, 혈관신생되어, 신속히 성장하여, 2 주 이내에 그들의 본래 용적의 16,000 배에 도달한다. [참고문헌: Gimbrone MA Jr., et al., Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136:261-276]

(5) 종양이 병아리 배아 융모요막 상으로 이식되면, 이들은 72 시간 미만의 구혈 단계 동안 서서히 성장하며, 평균 직경이 0.93±0.29 mm를 초과하지 않는다. 혈관신생의 개시 이후 24 시간 이내에 급속한 종양 팽창이 일어나며, 7 일 까지 이들 혈관화된 종양은 평균 직경 8.0±2.5 mm에 도달한다. [참고문헌: Knighton D., Avascular and vascular phase of tumor growth in the chick embryo. British J. Cancer, 35:347-356, 1977]

(6) 토끼 간 내의 전이 혈관 원주는 전이의 규모에 있어서 이질임을 드러내나, 혈과화가 존재하는 지점의 규모에 있어 비교적 균일성을 보인다. 종양은 일반적으로 직경 1 mm 이하의 구혈관이나, 상기 직경을 넘으면 혈관신생된다. [참고문헌: Lien W., et al., The blood supply of experimental liver metastases. II. A microcirculatory study of normal and tumor vessels of the liver with the use of perfused silicone rubber. Surgery 68:334-340, 1970]

(7) 췌장 섬의 베타 세포 내에 암이 발달하는 트렌스제닉 마우스 내에, 예비-혈관 과형성 섬은 그 크기에 있어 1 mm 미만으로 제한된다. 6 내지 7 주 후에, 4 내지 10%의 섬이 혈관신생되며, 이러한 섬으로부터 예비-혈관 섬의 용적의 1000 배인 큰 혈관화된 종양이 일어난다. [참고문헌: Folkman J, et al., Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia, Nature 339:58-61, 1989]

(8) VEGF(혈관 내피 성장 인자)에 대한 특정 항체는 미세혈관 밀도를 감소시키며, 맥관 형성의 유일한 조정 인자로서 VEGF에 의존하는 세 가지 인간 종양의 상당하거나 극적인 성장 억제를 일으킨다(털없는 쥐 내에서). 항체는 시험관 내에서의 종양 세포의 성장을 억제하지 않는다. [참고문헌: Kim K J, et al., Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nature 362:841-844, 1993].

(9) 항-bFGF 단일 클론성 항체는 맥관 형성의 유일한 조정 인자로서 bFGF 분비에 의존하는 쥐 종양 성장의 70% 억제를 유도한다. 이 항체는 시험관 내에서의 종양 세포의 성장을 억제하지 않는다. [참고문헌: Hori A, et al., Suppression of solid tumor growth by immunoneutralizing monoclonal antibody against human basic fibroblast growth factor. Cancer Research, 51:6180-6184, 1991]

(10) bFGF의 복막 내 주입은 종양 내의 모세관 내피 세포의 성장을 자극함으로써, 1차 종양의 성장 및 그 전이를 촉진시킨다. 종양 세포 스스로는 bFGF 에 대한 수용체가 결여되어 있으며, bFGF는 시험관 내에서 종양 세포에 대한 유사분열물질이 아니다. [참고문헌: Gross JL, et al. Modulation of solid tumor growth in vivo by bFGF. Proc. Amer. Assoc. Canc. Res. 31:79-1990]

(11) 특정 맥관 형성 억제 인자(AGM-1470)는 생체 내에서의 종양 성장 및 전이를 억제하나, 시험관 내에서 종양 세포 증식을 억제하는 데에는 훨씬 덜 활성이다. 이는 종양 세포 증식을 억제하는 것보다 반-최대로 4 로그 저 농도로 혈관 내피 세포 증식을 억제한다. [참고문헌: Ingber D, et al., Angioinhibins: Synthetic analogues of fumagillin which inhibit angiogenesis and suppress tumor growth. Nature, 48:555-557, 1990]. 종양 성장이 맥관 형성 의존성이라는 간접적인 임상적 증거가 또한 존재한다.

(12) 초자체 전이성 인간 망막아종은 생존 가능함에도 불구하고 1 mm³미만으로 제한되는 구혈 회전타원면 내로 발달하며,³H-티미딘을 통합한다(적출된 눈으로부터 제거되어 시험관 내에서 분석될 때).

(13) 난소의 종양은 작은 구혈 흰색 씨앗으로서(1 내지 3 mm³) 복막 막으로 전이한다. 이러한 이식은 그들 중 하나 이상이 혈관신생될 때 까지 크게 성장하지 않는다.

(14) 유방암[참고문헌: Weidner N, et al., Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive breast carcinoma. N. Engl. J. mED. 324:1-8, 1991 및 Weidner N, et al., Tumor angiogenesis: A new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma, JH Natl. Cancer Inst. 84:1875-1887, 1991]및 전립선암[참고문헌: Weidner N, Carroll PR, Flax J, Blumenfeld W, Folkman J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. American Journal of Pathology, 143(2):401-409, 1993]에서의 신생혈관 강도는 장래 전이와 매우 관련이 있다.

(15) 인간 피부 흑색종으로부터의 전이는 혈관신생 이전에는 드물다. 혈관신생의 개시는 병변의 두께를 증가시키며, 전이의 위험을 증가시킨다. [참고문헌: Srivastava A, et al., The prognostic significance of tumor vascularity in intermediate thickness (0.76 내지 4.0 mm 두께) skin melanoma. Amer. J. Pathol. 133:419-423, 1988]

(16) 방광암에서, 맥관 형성 단백질 bFGF의 뇨 수준은 세포진단학보다 민감한 질환 상태 및 정도의 지표이다. [참고문헌: Nguyen M, et al., Elevated levels of an angiogenic protein, basic fibroblast growth factor, in urine of bladder cancer patients. J. Natl. Cancer Inst. 85:241-242, 1993]

따라서, 맥관 형성이 종양의 전이에 있어 주요한 역할을 함이 명백하다. 이러한 맥관 형성 활성이 억제 또는 제거될 수 있다면, 종양이 존재함에도 성장하지 않을 것이다. 질환 상태에서, 맥관 형성의 예방은 신규 미세혈관계의 침입에 의하여 야기되는 손상을 피할 수 있을 것이다. 맥관 형성 과정의 조정에 집중된 치료는 이러한 질환을 제거 또는 완화시킬 것이다.

따라서, 특히 종양 내로 바람직하지 않은 혈관의 성장을 억제시킬 수 있는 조성물 및 방법이 요구된다. 또한 조성물을 검출, 측정 및 국재시키는 방법이 요구된다. 조성물은 예비-전이 종양 내에서 내인성 성장 인자의 활성을 극복하고, 종양 내에서의 모세관 형성을 예방함으로써, 종양의 성장을 억제할 수 있어야 한다. 조성물, 조성물 단편 및 조성물 특이성 항체 또한 상처 치료 및 재생과 같은 기타 맥관 형성 과정에서 모세관 형성을 조정할 수 있어야 한다. 맥관 형성을 억제하는 조성물 및 방법은 바람직하게는 비독성이어야 하며, 부작용을 일으키나 않아야 한다. 조성물의 생합성 영역뿐 아니라 조성물에 대한 결합 영역을 검출, 측정 및 국재시키는 방법 또한 요구된다. 조성물 및 조성물 단편은 방사성 및 비-방사성 표지 목적을 위하여, 기타 분자에 결합될 수 있어야 한다.

발명의 개요

본 발명에 의하면, 맥관 형성을 조절하고, 바람직하지 않은, 특히 종양 성장 관련 맥관 형성을 억제시키는데 효율적인 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명은 시험관 내에서 bFGF와 같은 내인성 성장 인자의 맥관 형성 활성을 극복할 수 있는 능력, 및 대략 플라스미노겐 아미노산 98에서 시작하는 플라스미노겐의 내부와 유사한 구조 및 아미노산 서열의 상동으로 정의되는 안기오스타틴이라 명명되는 단백질을 포함한다. 안기오스타틴은 환원성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 측정시 대략 38 kDa 내지 45 kDa의 분자량을 가지며, 비손상 쥐의 플라스미노겐 분자의 아미노산 98(서열번호 2)에서 시작하는 쥐의 플라스미노겐 단편과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함한다.

안기오스타틴의 아미노산 서열은 종에 따라 약간 변화한다. 예를 들면, 인간 안기오스타틴의 경우, 활성 인간 안기오스타틴 서열은 비손상 인간 플라스미노겐 아미노산 서열의 아미노산 번호 97 또는 99에서 시작하나, 아미노산 서열은 상기한 쥐의 플라스미노겐 단편과 실질적으로 유사하다. 더욱이, 인간 플라스미노겐 단편은 쥐 종양 표본에서 나타나는 바와 유사한 항-맥관 형성 활성을 가진다. 활성 안기오스타틴분자 내의 아미노산 수는 변화하는 것으로 이해되며, 내피 억제 활성을 지니는 모든 아미노산 서열은 본 발명에 포함되는 것으로 간주된다.

본 발명은, 실질적으로 정제된 안기오스타틴, 안기오스타틴 유도체, 안기오스타틴 단편 또는 안기오스타틴 응집체를 함유하는 조성물을 맥관 형성을 억제하기에 충분한 투여량으로 인간 또는 동물에게 투여함으로써, 비바람직하고 비조절된 맥관 형성 개재 질환 및 과정을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 종양의 성장을 억제 또는 치료하는 데에 특히 유용하다. 안기오스타틴을 예비-혈관신생 전이된 종양을 가지는 인간 또는 동물에게 투여하면, 이러한 종양의 팽창 또는 성장을 예방할 수 있다.

본 발명은 또한 안기오스타틴을 암호화하는 DNA서열, 안기오스타틴을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터 및 안기오스타틴을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터를 하나 이상 함유하는 세포를 포함한다. 본 발명은 안기오스타틴을 암호화하는 DNA 서열이 환자에게 주입되어 생체 내의 안기오스타틴 수준을 변화시키는 유전자 치료법을 추가로 포함한다.

본 발명은 생물학적 유체 및 조직 내의 안기오스타틴의 검출 및 측정, 조직 및 세포 내에서의 안기오스타틴의 국재를 위한 도구 및 진단 방법을 포함한다. 진단 방법 및 도구는 당업자에게 공지된 임의의 형태일 수 있다. 본 발명은 안기오스타틴 분자 및 그 부분 특이성 항체, 및 안기오스타틴 특이성 항체에의 결합을 억제하는 항체를 또한 포함한다. 이들 항체는 다-클론성 항체 또는 단일 클론성 항체일 수 있다. 암 또는 기타 맥관 형성 개재 질환의 발발 또는 재발발에 대한 특징 또는 예후가 되는 안기오스타틴의 존재 및 양을 검출하기 위한 진단 도구에, 안기오스타틴 특이성 항체가 사용될 수 있다. 안기오스타틴 특이성 항체는 인간 또는 동물에게 투여되어, 인간 또는 동물을 안기오스타틴에 대하여 수동적으로 면역화함으로써, 맥관 형성 억제를 감소시킬 수 있다.

본 발명은 체액 내의 안기오스타틴에 결합하는 항체의 존재 및 양을 검출하기 위한 진단 방법 및 도구를 포함한다. 진단 방법 및 도구는 당업자에게 공지된 임의의 형태일 수 있다.

본 발명은, 안기오스타틴 수용체에 결합하고 적절한 시그널을 세포에 전달하며 동근 또는 길항근으로서 작용하는 항-안기오스타틴 수용체 특이성 항체를 포함한다.

본 발명은 또한 동위 원소 또는 기타 분자로 표지될 수 있는 단백질 단편 및 동족체, 또는 양전자 발산 단면촬영법, 방사선 자동 사진법, 유동 혈구계산, 방사선 수용체 결합 분석 및 면역학적 조직화학을 포함하는 기술을 이용하는 안기오스타틴 결합 영역의 검출 및 구상화에 이용되는 단백질을 포함한다.

상기 안기오스타틴 단백질 및 동족체는 또한 안기오스타틴 수용체에서 동근 및 길항근으로서 작용함으로써, 안기오스타틴의 생물학적 활성을 강화 또는 방해한다. 이러한 단백질은 안기오스타틴 수용체의 분리에 사용된다.

본 발명은 또한 치료 및 연구용 세포 독성 시약 관련 안기오스타틴, 안기오스타틴 단편, 안기오스타틴 항혈청 또는 안기오스타틴 수용체 동근 및 안기오스타틴 수용체 길항근을 포함한다. 더욱이, 안기오스타틴, 안기오스타틴 단편, 안기오스타틴 항혈청, 안기오스타틴 수용체 동근 및 안기오스타틴 수용체 길항근은 약학적으로 허용되는 부형제 및 임의로 생분해 가능한 중합체와 같은 유지-방출 화합물 또는 조성물과 결합되어, 치료 조성물을 형성한다.

본 발명은 안기오스타틴의 전사 및 해독에 요구되는 리보핵산 및 디옥시리보핵산에 대한 분자 탐침을 포함한다. 이들 분자 탐침은 조직 및 세포 내에서의 안기오스타틴 생합성을 검출 및 측정하기 위한 수단을 제공한다.

따라서, 본 발명의 목적은 안기오스타틴을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 맥관형성 개재 과정 및 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 체액 또는 조직 내의 안기오스타틴의 존재 및 양을 검출하기 위한 진단 또는 예후 방법 및 도구를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 혈관종, 충실성종양, 혈종, 백혈병, 전이, 모세관확장증, 건선, 공피증, 화농성 육아종, 심근 맥관형성, Crohn's 질환, 플라그 혈관신생, 관상 병립, 뇌 병립, 동정맥 기형, 허혈성 지절 맥관 형성, 각막염, 피부 조홍, 혈관신생 녹내장, 당뇨성 망막증, 후수정체 섬유증식증, 관절염, 당뇨성 혈관신생, 반점성 퇴화, 상처 치료, 소화성 궤양, Helicobacter 관련 질환, 골절, 해족종, 맥관형성, 조혈, 배란, 월경, 태반형성 및 묘조열을 포함하는, 맥관형성 개재 과정 및 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 암의 성장을 억제 또는 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 생체 내 또는 시험관 내에서 안기오스타틴을 생산하는 효소의 활성 또는 생성을 조정 또는 모방하는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 안기오스타틴 DNA를 안기오스타틴 또는 항-안기오스타틴 항체를 필요로 하는 인간 또는 동물 내로 주입함으로써 안기오스타틴 또는 항-안기오스타틴 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 체액 내에 안기오스타틴 특이성 항체의 존재를 검출 또는 정량하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 플라스미노겐을 인식하지 않는 안기오스타틴 분자의 특정 영역에 대하여 선택적인 안기오스타틴에 대한 항체로 구성되는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 암에 대한 예후 또는 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 생체 내 또는 시험관 내에서 안기오스타틴 결합 영역을 시각화 및 정량에 사용하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 안기오스타틴 생합성의 검출 및 정량에 사용하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 최소의 부작용을 가지는 암 치료법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 암의 성장을 억제 또는 치료하기 위한 세포독성 시약에 연결된 안기오스타틴 단백질 또는 안기오스타틴을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 안기오스타틴 관련 조성물을 특정 위치로 표적 운반하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 맥관형성 과정의 조절을 위한 유전자 치료에 유용한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

상기 및 기타 본 발명의 목적, 특징 및 이점들이 하기의 개시된 구체예에 의한 상세한 설명 및 청구항을 검토한 후 명백하여질 것이다.

본 발명은, 내피 세포의 증식을 가역적으로 억제하는 안기오스타틴이라 명명되는 내피의 억제 인자에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 혈액 또는 뇨와 같은 체액으로부터 분리되거나, 재조합, 효소적 또는 화학적 방법에 의하여 합성될 수 있는 안기오스타틴 단백질에 관한 것이다. 안기오스타틴은 맥관 형성 관련 질환을 억제할 수 있으며, 맥관 형성 과정을 조정할 수 있다. 더욱이, 본 발명은 안기오스타틴 측정을 위한 도구 및 진단 분석, 안기오스타틴의 국재(localization)를 위한 조직화학적 도구, 안기오스타틴을 암호화하는 DNA 서열 및 안기오스타틴 생합성을 조정하기 위한 분자 탐침, 안기오스타틴에 특이적인 항체, 안기오스타틴 수용체에 대한 단백질 동근 및 길항근의 개발, 항-안기오스타틴 수용체-특이성 항체 동근 및 길항근, 및 안기오스타틴 단백질에 연결되는 세포독성 시약에 관한 것이다.

도 1은 전체 쥐의 플라스미노겐의 아미노산 서열인 서열번호 1을 나타낸다.

도 2는 쥐에 대한 안기오스타틴의 초기 서열(서열번호 2)을 나타내며, 쥐의 서열을 상응하는 인간(서열번호 3), 붉은털 원숭이(서열번호 4), 돼지(서열번호 5) 및 소(서열번호 6)의 플라스미노겐 단백질 단편과 비교한다. 쥐, 인간, 붉은털 원숭이, 돼지 및 소의 순서로 기재되어 있다.

도 3은 1차 종양의 존재 또는 부재하에 종양 세포의 지표를 표지하는 BrdU를 보여준다.

도 4는 gFGF에 의하여 유도되는 생체 내에서의 맥관형성에 대한 루이스 폐 1차 종양의 영향의 Matrigel 분석을 나타낸다.

도 5는 루이스 페암(LLC-Low)을 가지는 쥐로부터 유도되는 혈청 대 정상적인 쥐 혈청의 투여량 반응곡선을 도시한다. 소의 모세관 내피 세포가 bFGF-유도 72 시간 증식 분석으로 분석된다.

도 6은 고저의 전이성 종양이 복수 내에 내피의 유사분열 활성을 함유하나, 저 전이성 종양 라인만이 혈청 내에 내피 억제 활성을 가짐을 보인다.

도 7은 부분적으로 정제된 혈청 또는 종양을 가지는 동물의 뇨의 C4 역 상 크로마토그래피 프로필을 나타낸다.

도 8은 비손상 플라스미노겐 분자, 라이신 결합 영역 I로부터의 활성 단편, 종양을 가지는 쥐로부터의 농축 뇨 및 정상적인 쥐로부터의 농축 뇨로 쥐를 처리한 후 13 일 후의 표면 폐 전이를 나타낸다.

도 9는 손상 플라스미노겐 분자, 라이신 결합 영역 I로부터의 활성 단편, 종양을 가지는 쥐로부터의 농축 뇨 및 정상적인 쥐로부터의 농축 뇨로 쥐를 처리한 후 13 일 후의 폐 중량을 나타낸다.

도 10은 pTrcHis 벡터의 대략적인 대표도이다.

도 11은 인간 플라스미노겐 크링글 영역 1-3에 대한 단일 클론성 항체로 탐침된 10L 증가 발효로부터의 이. 콜라이 발현 인간 안기오스타틴의 면역블랏을 도시한다. A)는 0.2 M 아미노 카프로익 산으로 용출된 재조합 안기오스타틴을; B)는 라이신 컬럼의 1 X PBS를 이용한 마지막 세척을; 및 C)는 균열된 세포로부터의 정제된 용해질을 나타낸다.

도 2는 성장하는 소의 모세관 내피 세포의 억제율을 원액의 희석에 대한 함수로서 도시하는 그래프이다; A1, A2, B1, B2 및 E는 인간 안기오스타틴 항-맥관 형성 활성을 발현하는 재조합 클론이다; C1, C2, D1 및 D2 대조군은 안기오스타틴을 암호화하는 인간 DNA 서열없이 벡터만을 함유하는 음성 대조 클론이다.

도 13은 시험관 내에서 소의 모세관 내피 세포 상의 재조합 인간 안기오스타틴의 증식에 대한 억제 활성을 나타낸다.

도 14는 1차 종양의 제거 및 식염 또는 항-맥관 형성 활성을 가지는 푸마길린 동족체로의 처리 후의 성장 증식 지수 및 아팝토시스 지수를 나타낸다.

도 15는 쥐 내에서의 생체 내의 40 mg/kg/일 단일 주입을 이용한 인간 안기오스타틴 처리에 의한 T241 1차 종양의 성장의 억제를 나타낸다.

도 16은 쥐 내에서의 생체 내의 투여 당 40 mg/kg으로 두 번의 투약(80 mg/kg/일)을 이용한 인간 안기오스타틴 처리에 의한 LLC-LM 1차 종양의 성장 억제를 나타낸다.

도 17은 루이스 폐암 1차 종양의 제거의 폐 전이 성장에 대한 효과를 나타낸다.

도 18은 종양 절제 후 성장 증식 및 아팝토시스지수를 나타낸다.

도 19는 전체 종양 부피에 대한 이식된 T241 섬유육종 세포를 가지는 쥐에게의 안기오스타틴 단백질 투여의 효과를 시간의 함수로서 나타낸다.

도 20은 전체 종양 부피에 대한 이식된 루이스 페암(LM) 세포를 가지는 쥐에게의 안기오스타틴 투여의 효과를 시간의 함수로서 나타낸다.

도 21은 전체 종양 부피에 대한 이식된 세망세포 육종 세포를 가지는 쥐에게의 안기오스타틴 단백질 투여의 효과를 시간의 함수로서 나타낸다.

도 22는 전체 종양 부피에 대한 이식된 인간 전립선암 PC-3을 가지는 면역결핍 SCID 쥐에게의 안기오스타틴 단백질 투여의 효과를 24일의 기간에 걸쳐 시간의 함수로서 나타낸다.

도 23은 전체 종양 부피에 대한 이식된 인간 유방암 MDA-MB 세포룰 가지는 면역결핍 SCID 쥐에게의 안기오스타틴 단백질 투여의 효과를 24 일의 기간에 걸쳐 시간의 함수로서 나타낸다.

도 24는 쥐 플라스미노겐 cDNA로부터 유도된 쥐 안기오스타틴 단백질을 암호화하는 쥐 DNA 서열의 클로닝에 대한 대략적인 대표도이다. 쥐 안기오스타틴은 쥐 플라스미노겐 크링글 영역 1-4를 포함한다. PCR은 중합효소 체인반응을 의미한다; P1은 PCR에 대한 5'-말단 올리고뉴클레오티드 프라이머이다; P2는 PCR에 대한 3'-말단 올리고뉴클레오티드 프라이머이다; SS는 시그널 서열을 의미한다; ATG는 해독 억제 코돈이다; TAA는 해독 중단 코돈이다; HA는 혈구응집소 에피토프 택(YPYDVPDYASL)이다; K1, K2, K3 및 K4는 쥐의 플라스미노겐 크링글 영역 1, 2, 3 및 4를 각각 나타낸다. CMV는 세포거대바이러스 프로모터이다; T7은 박테리아 파지 프로모터이다; PA는 예비-활성 단백질이다; SP6은 Sp 6 프로모터이다.

도 25는 비형질감염된 세포(모조);안기오스타틴을 암호화하는 DNA 서열및 두 개의 안기오스타틴 발현 클론(AST 31 및 AST 37)없이 벡터(벡터 5)만으로 형질감염된 세포에 대하여 날짜의 함수로서 세포 수를 도시한다. 판넬(a)는 T241 세포의 형질감염의 결과를 나타낸다. 판넬 (b)는 LL2 세포의 결과를 나타낸다.

도 26은 안기오스타틴 클론을 함유하는 이. 콜라이 세포로부터 유도되는 배양의 세포 수에 대한 결과를 나타낸다. 비형질감염된 세포(모조); 안기오스타틴을 암호화하는 DNA 서열 및 세 개의 안기오스타틴 발현 클론(AST 25, AST 31 및 AST 37)없이 벡터(벡터 5)만으로 형질감염된 세포. 판넬(a)는 대조군(모조) 및 모든 안기오스타틴 클론(발현 및 비발현)으로부터의 배양액의 배양의 세포 수에 대한 결과를 나타낸다. 판넬(b)는 대조군(모조), 벡터(벡터 6) 및 쥐의 안기오스타틴을 발현하는 안기오스타틴 클론으로부터의 배양액의 배양의 세포 수에 대한 결과를 나타낸다. 판넬(c)는 대조군(모조) 및 쥐의 안기오스타틴을 발현하는 안기오스타틴 클론으로부터의 정제된 배양액의 배양의 세포 수에 대한 결과를 나타내며, 여기서 배양액은 라이신-세파로오즈 컬럼 생에서 정제되어, 라이신 결합 성분을 생성한다.

도 27은 전체 종양 부피에 대한 쥐 내의 이식 T241 섬유육종 세포의 영향을 시간의 함수로서 나타내며, 여기서 섬유육종 세포는 안기오스타틴 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 벡터로 형질감염되며, 벡터는 안기오스타틴 단백질을 발현할 수 있다. 비-형질감염된 은 쥐 내에 이식된 변경되지 않은 T241 섬유육종 세포를 의미한다. 벡터 6은 벡터만으로 형질감염된 T241 섬유육종 세포를 나타내며, 이는 쥐 내에 이식된 안기오스타틴 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유하지 않는다. 클론 25, 클론 31 및 클론 37은 쥐 내에 이식된 안기오스타틴 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 벡터로 형질감염된 T241 섬유육종 세포의 세 개의 안기오스타틴-생산 클론을 나타낸다.

도 28은 인간 플라스미노겐 및 그 크링글 단편의 구조에 대한 대략적 도식을 나타낸다. 인간 플라스미노겐은 Asn²⁸⁹에서 N-연결 글리코스화된 한 면을 가지는 791 아미노산을 함유하는 단일 체인 단백질이다. 인간 플라스미노겐의 비-단백효소 영역은, 원으로 나타내어지는 크링글이라 명명되는(K1, K2, K3, K4 및 K5) 다섯 개의 분리된 영역 내에 존재하는 N-말단 561 아미노산 및 이러한 구조를 분리시키는 단백질로 구성된다. 각각의 삼중 다이설파이드 결합된 크링글은 80 아미노산을 함유한다. 안기오스타틴은 이러한 크링글 영역 (K1-4)의 처음 4를 포함하며, 크링글 3 (K1-3) 및 크링글 4 (K4)은 엘라스타아제를 이용한 인간 플라스미노겐의 소화에 의하여 수득된다. 잔류 크링글 단편은 이. 콜라이 내에서 발현되는 재조합 단백질이다. SS=시그널 서열, PA=예비 활성화 단백질.

도 29는 환원 조건하에 플라스미노겐의 천연 크링글 단편 및 정제된 재조합의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. (A) 이.콜라이 박테리아 용해질로부터 정제된 개별적인 재조합 크링글 단편을 15% SDS 겔 상에 적재한 다음, Coomassie blue로 염색한다. 대략 5 ㎍의 단백질을 레인 당 각각 적재한다 (레인 2=크링글 (K1); 레인 3= 크링글 2 (K2); 레인 4=크링글 3 (K3); 레인 5=크링글 4 (K4); 레인 1=분자량 표시). (B) 정제된 큰 크링글 단편을 Coomassie blue로 염색한다. 크링글 1-4(레인 2) 및 크링글 1-3 (레인 3)을 엘라스타아제를 이용한 인간 플라스미노겐의 소화에 의하여 수득하고, 라이신-세파로오즈 크로마토그래피에 의하여 정제한다. 크링글 2-3 (레인 4)의 재조합 단편을 이.콜라이 내에 발현시키고, 시험관 내에서 재-폴딩한다. 분자량 표시는 왼쪽(레인 1)에 표시되어 있다.

도 30은 안기오스타틴의 재조합 개별 크링글 단편에 의한 내피 세포 증식의 억제를 보여준다. 1 ng/ml의 bFGF의 존재하에 72 시간 동안 크링글 단편을 소의 모세관 내피 세포 상에서 분석한다. (A) 두 개의 라이신-결합 크링글, rK1 및 rK4의 항-내피 세포 증식 효과. 고-친화성 라이신 결합 크링글, K1(-o-)은 투여량 의존성 방식으로 BCE 세포 증식을 억제한다. 중-친화성 라이신 결합 크링글, K4(-o-)은 고농도에서 단지 적은 억제 효과를 보인다. (B) 비-라이신 결합 K2 및 K3의 BCE 세포 증식의 억제. K2(-o-) 및 K3(-o-) 모두 투여량 의존성 방식으로 BCE 세포 증식을 억제한다. 자료는 세 번의 평균 +/-SEM을 나타낸다.

도 31은 안기오스타틴의 큰 크링글 단편의 항-내피 증식 활성을 보인다. 단백질 분해 단편, K1-4(안기오스타틴)(-o-) 및 K1-3(-o-)은 투여량 의존성 방식으로 BCE 세포 증식을 억제한다. 재조합 K2-3(-o-) 단편은 K1-3 및 K1-4보다 덜 유효한 억제를 보인다. 자료는 세 개의 측정에 대한 평균(+/-SEM)을 억제의 백분율로서 나타낸다.

도 32는 재조합 크링글 2 및 크링글 3의 부가적인 억제 활성을 보인다. (A) rK2-3의 비손상 단편(또한 도 31 참조)은 320 nM의 농도에서만 약한 억제 효과를 보인다. rK2 시스테인의 돌연변이 단편을 포지션 169에서 세린으로 대체하고, K3 (포지션 297에서 시스테인을 세린으로 대체)을 BCE 세포 상에서 함께 분석할 때, 동일한 농도에서, 부가적인 억제를 보인다. 각각의 값은 세 번의 평균 +/-SEM을 나타낸다. (B) K2 및 K3의 아미노산 서열 및 대략적인 구조. 체인간 크링글 다이설파이드 결합은 K2의 시스테인¹⁶⁹와 K3의 시스테인²⁹⁷사이에 존재하는 것으로 이미 보고되었다[참고문헌: Sohndel, S., Hu, C.-K., Marti,D.,Affolter, M.,Schaller, J.,Llinas, M., 및 Rickli, E.E. (1996) Biochem. in press].

도 33은 조합 크링글 단편에 의한 내피 증식의 억제를 보인다. 각각의 크링글 단편에 대하여 320 nM의 농도로 분석을 수행한다. 값은 세 번의 측정치에 대한 평균(+/-SEM)을 억제의 백분율로서 나타낸다. (A) 다양한 개별 크링글의 조합에 의한 단편의 억제 효과. (B) 조합된 크링글 단편의 조합 억제활성.

도 34는 환원 및 알킬화 후 내피 세포 상에서의 안기오스타틴의 억제 활성을 나타낸다. (A) 환원된 (레인 2) 및 비-환원된(레인 1) 형태의 인간 안기오스타틴의 SDS-PAGE 분석. 정제된 인간 안기오스타틴을 DTT로 환원시킨 다음, 과량의 요오도아세트아미드로 단백질을 알킬화한다. 처리된 샘플을 투석하고, BCE 세포 상에서 분석한다. (B) 320 nM의 농도에서 환원된 및 비-환원된 형태의 안기오스타틴에 의한 BCE 세포 증식의 억제. 자료는 세 번의 측정치에 대한 억제 평균+/-SEM을 나타낸다.

도 35는 인간 안기오스타틴의 추정 크링글 영역의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 네 개의 크링글 영역의 서열을 그들의 보유 시스테인에 의하여 정렬한다. 동일하고 보존된 아미노산을 음영으로 나타낸다. 크링글 4에서의 박스친 아미노산은, 유지되는 시스테인 잔기 22 및 80에 인접한 양전하를 가지는 라이신을 나타낸다.

도 36은 발현된 안기오스타틴의 라이신-결합 특성 및 반응성을 나타낸다.

도 36a는 Coomassie 염색된 겔을 나타낸다(40 ㎕ 적재).

도 36b는 유사한 겔의 면역 블랏(20 ㎕ 적재)을 나타낸다. 레인 1은 유도 배양의 진동 플라스크로부터의 육즙을 나타내며, 이는 약 50 kD의 안기오스타틴 단백질 및 기타 몇몇 개의 단백질을 나타낸다. 유도 배양으로부터의 육즙을 완충제로 1:1로 희석시키고, 라이신-세파로오즈 상으로 직접 적재한다. 레인 2는 라이신 컬럼을 통과하는 비-결합 단편을 나타낸다. 피. 파스토리스에 의하여 발현된 모든 안기오스타틴 단백질은 라이신 컬럼에 결합한다. 레인 3은 0.2 M 아미노 카프로인산을 이용한 특이적 용출을 나타내며, 이는 피.파스토리스-발현 안기오스타틴 단백질이 라이신 컬럼에 결합하며, 한 단계에서 라이신-세파로오즈에 걸쳐 균질성을 보이도록 정제될 수 있음을 보여준다. 또한, 피.파스토리스-발현 단백질은 크링글 1 내지 3에 대항하여 배양된 구조적 의존성 단일 클론성 항체(VAP)에 의하여 인식된다.

도 37은, 피.파스토리스-발현 안기오스타틴 단백질이 변성 비환원 SDS-PAGE Coomassie 염색 겔 상에 49 kDa 및 51.5 kDa에서 이동하는 한쌍으로 나타남을 보인다. 고-만노오즈 구조에 특이적인 N-글리카나아제를 이용하여 발현된 안기오스타틴 단백질로부터 단일 N-결합 복합 체인을 제거시키면, 49.5 kDa의 단일 밴드가 나타난다. 판넬 A 및 판넬 B는 각각 Coomassie 염색 겔 및 유사한 겔의 면역블랏을 나타낸다. 레인 1은 정제된 피.파스토리스-발현 안기오스타틴 단백질을 나타낸다. 레인 2는 분해 조건에서 N-글리카나아제 없이 배양된, 정제된 피.파스토리스-발현 안기오스타틴 단백질을 나타낸다. 레인 3은 N-글리카나아제로 분해된, 정제된 피.파스토리스-발현 안기오스타틴 단백질을 나타낸다.

도 38a는 4 ㎍의 정제된 피.파스토리스-발현 안기오스타틴 단백질을 Coomassie 겔 상에 한 쌍으로서 나타낸다.

도 38b는 정제된 재조합체가 BCE 증식을 억제함을 나타낸다. bFGF의 ( o )의 존재 하에 또는 ( o )의 부재 하에, 및 피.파스토리스-발현 안기오스타틴 단백질( o )과 함께 bFGF의 존재 하에, 72 시간 후에 얻어진 BCE 분석 세포 계산을 나타낸다.

도 38c는 억제가 투여량 의존성임을 나타낸다.

도 39는 피.파스토리스-발현 정제된 안기오스타틴이 원시 종양을 가지는 쥐에게 체계적으로 (피하) 주입됨을 보여준다.

도 39a 및 b는, 식염 또는 피.파스토리스-발현 안기오스타틴 또는 플라스미노겐-유도 안기오스타틴 단백질로 매일 처리된 쥐의 전이 수 및 폐 중량을 각각 나타낸다. 식염 처리 쥐의 폐 중량과 대조적으로 피.파스토리스-발현 안기오스타틴 단백질 또는 플라스미노겐-유도 안기오스타틴 단백질로 처리된 쥐의 폐는 비-혈관화되며, 전이가 효과적으로 억제된다.

도 40은 피.파스토리스-발현 안기오스타틴으로 처리된 쥐의 폐가 미세전이로 구멍이 뚫려지는 반면, 식염 대조군의 폐는 완전히 혈관화된 전이로 덮힘을 나타낸다.

도 41은, 니켈 친화력 컬럼 크로마토그래피 상에서, 다양한 정제 및 응집 단계의 재조합 쥐 안기오스타틴의 환원성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 사진(SDS-PAGE)을 나타낸다 (레인 1-3 체 세척, 레인 4 뇨에 불용성 분획, 레인 5 친화력 컬럼 시작 물질, 레인 6 유동 컬럼, 레인 7 용출제 안기오스타틴).

도 42는 소의 모세관 내피 세포에 대한 재조합 쥐 안기오스타틴 응집체 투여의 효과를 나타낸다.

도 43은 루이스 페 종양을 가지는 쥐 내 2 mg/kg/일 안기오스타틴 응집체 투여의 종양 용적에 대한 효과를 나타낸다.

도 44는 루이스 페 종양을 가지는 쥐 내 10 mg/kg/일 안기오스타틴 응집체 투여의 종양 용적에 대한 효과를 나타낸다.

본 발명은 맥관형성 관련 또는 개재 과정 및 질환의 치료 및 검출을 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 조성물은 혈청, 뇨 및 복수를 포함하는 체액으로부터 분리될 수 있거나, 화학적 또는 생물학적 방법(예를 들면, 세포 배양, 재조합 유전자 발현, 단백질 합성 및 활성 안기오스타틴 생성을 위한 시험관 내에서의 플라스미노겐 또는 플라스민의 효소적 촉매)에 의하여 합성될 수 있는 안기오스타틴이다. 재조합 기술은 중합효소 체인반응(PCR)을 이용하는 DNA 기원으로부터의 유전자 증식, 역전사효소/PCR을 이용하는 RNA 기원으로부터의 유전자 증식을 포함한다. 안기오스타틴은 비혈관화되거나 혈관화된 종양과 같은 조직 내로의 혈관의 성장을 억제한다.

본 발명은 또한, 안기오스타틴을 암호화하는 DNA 서열을 함유하며, 세포 내에 존재 시 안기오스타틴을 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물, 안기오스타틴 또는 단편 또는 동족체를 암호화하는 DNA 서열을 함유하고, 세포 내에 존재 시 안기오스타틴을 발현할 수 있는 벡터를 함유하는 세포를 포함하는 조성물 및 안기오스타틴을 암호화하는 DNA 서열을 함유하고, 세포 내에 존재 시 안기오스타틴을 발현할 수 있는 벡터를 함유하는 세포를 인간 또는 동물 내로 이식시키는 방법을 포함한다.

더욱이, 본 발명은 안기오스타틴, 안기오스타틴 단편, 안기오스타틴 항혈청, 약학적으로 허용되는 부형제와 결합된 안기오스타틴 수용체 동근 또는 안기오스타틴 수용체 길항근, 및 임의로, 생분해될 수 있는 중합체와 같은 약학 조성물을 형성하기 위한 유지-방출 화합물 또는 조성물을 포함한다. 특히, 본 발명은 플라스미노겐에 결합하지 않으며 안기오스타틴에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 포함한다.

보다 상세하게는, 본 발명은 대략 38 내지 45 kDa의 분자량을 가지며, 시험관 내에서 bFGF와 같은 내인성 성장 인자의 맥관 형성 활성을 극복할 수 있는 안기오스타틴으로 명명되는 단백질을 포함한다. 안기오스타틴은 환원성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 측정 시 대략 38 내지 45 kDa의 분자량을 가지며, 비손상 쥐 플라스미노겐 분자의 아미노산 번호 98에서 시작하는 쥐의 플라스미노겐 단편과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 가지는 단백질이다. 실질적으로 유사한이라는 용어는, 안기오스타틴 아미노산 서열에 관하여 사용될 때, 항-맥관 형성 활성을 가지고, 대략 38 내지 45 kDa의 분자량을 가지며, 또한, 쥐의 플라스미노겐 내 대략 아미노산 번호 98에서 시작하며 대략 38 내지 45 kDa으로 정량되는 쥐의 플라스미노겐 단백질 단편과 고도의 동족 관계 서열을 가지는 아미노산을 의미한다. 고도의 동족 관계는 적어도 약 60% 아미노산 동족체, 바람직하게는 적어도 약 70% 아미노산 동족체, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 아미노산 동족체를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 내피 억제 활성은 일반적으로 맥관형성을 억제, 예를 들면 섬유아세포 성장 인자의 존재하에 배양액 내에서 소의 모세관 내피 세포의 성장을 억제하는 분자의 능력을 의미한다.

완전한 쥐의 플라스미노겐 분자의 아미노산 서열은 도 1 및 서열번호 1에 나타낸다. 안기오스타틴에 대한 서열은 대략 아미노산 98에서 시작한다. 활성 인간 안기오스타틴은 비손상 인간 플라스미노겐 분자의 아미노산 97 또는 99에서 시작한다. 쥐의 안기오스타틴의 처음 339 아미노산의 아미노산 서열은 도 2에 나타내며(서열번호 2), 인간(서열번호 3), 붉은털 원숭이(서열번호 4), 돼지(서열번호 5) 및 소(서열번호 6) 플라스미노겐으로부터의 플라스미노겐 단백질 단편에 해당하는 서열과 비교된다. 50%를 초과하는 아미노산 내에서 상기 서열이 동일하다면, 안기오스타틴의 아미노산 서열은 종 간에 실질적으로 유사한 것으로 이해된다. 안기오스타틴 내의 아미노산 전체 수는 정확히 알려져 있지 않으나, 활성 분자의 분자량에 의하여 정의된다. 본 발명 안기오스타틴의 아미노산 서열은 플라스미노겐 분자가 유도된 종에 따라 변화할 수 있다. 따라서, 인간 플라스미노겐으로부터 유도된 본 발명의 안기오스타틴은 쥐로부터 유도된 안기오스타틴과 약간 상이한 서열을 가짐에도 불구하고, 이는 쥐의 종양 표본에 나타난 바와 같이 항-맥관 형성 활성을 가진다.

안기오스타틴은 시험관 내에서 내피 세포의 성장을 억제할 수 있는 것으로 나타난다. 안기오스타틴은 다른 세포형으로부터 유도되는 세포주의 성장을 억제하지 않는다. 특히, 안기오스타틴은 루이스 폐암 세포주, 밍크 폐 내피, 3T3 섬유아세포, 돼지 대동맥 평활근 세포, 돼지 망막 색소 내피, MDCK 세포(개의 신장 내피), W138 세포(인간 태아 폐 섬유아세포), EFN(쥐의 태아 섬유아세포 및 LM 세포(쥐의 연결 조직) 상에 아무런 영향을 미치지 않는다. 종양을 가지는 쥐 내의 내인성 안기오스타틴은 대략 10 mg 안기오스타틴/kg 체중의 체계적인 농도로 전이를 억제함에 효과적이다.

안기오스타틴은 플라스미노겐 분자의 크링글 영역으로 정의되는 [참고문헌: Robbin, K.C., The plasminogen-plasmin ewnzyme system Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Practice, 2nd Edition, ed. by Colman, R.W. et al. J.B. Lippincott Company, pp. 340-357, 1989]특이적 3 차원 구조를 가진다. 플라스미노겐 분자의 NH₂말단부 내에, 구조적으로 관련된 모티브이며, 실질적 서열 동족관계를 가지는 크링글 영역이 다섯 개 존재한다. 안기오스타틴의 3차 구조는 플라스미노겐 크링글 영역 1 내지 3 및 크링글 영역 4의 일부를 포함하는 것으로 믿어진다. 플라스미노겐 분자의 각각의 크링글 영역은 대략 80 개의 아미노산을 함유하며, 3 개의 다이설파이드 결합을 함유한다. 이러한 시스테인 모티브는 다른 생물학적 활성 단백질 내에 존재하는 것으로 알려져 있다. 이들 단백질은 프로토프롬빈, 간세포 성장 인자, 산란 인자 및 매크로파지 자극 단백질을 포함한다[참고문헌: Yoshimura, T et al., 인간 매크로파지 자극 단백질(MSP, MSTI)의 클로닝, 서열 분석 및 발현은 크링글 단백질 군의 일원으로서 MSP를 확인하며, MSP 유전자를 염색체 3 상에 위치시킨다 L. Biol. Chem., Vol. 268, No. 21, pp. 15461-15468, 1993]. 임의의 분리된 단백질, 또는 3차 크링글 유사 구조 또는 생체 내에서 항-맥관 형성 활성을 가지는 시스테인 모티브를 가지는 단백질은, 본 발명의 일부인 것으로 간주된다.

본 발명은 또한 암과 같은 질환의 진단 또는 예후를 위한 체액 및 조직 내의 안기오스타틴의 검출을 포함한다. 본 발명은 또한 세포 및 조직 내의 안기오스타틴 결합 영역 및 수용체를 포함한다. 본 발명은 또한, 안기오스타틴의 생성을 자극 및/또는 실질적으로 정제된 안기오스타틴 또는 안기오스타틴 동근 또는 길항근 및/또는 안기오스타틴 항혈청 또는 안기오스타틴 항혈청에 대항하는 항혈청을 환자에게 투여함으로써, 관절염 및 종양과 같은 맥관 형성 질환 및 과정을 예방 또는 치료하는 방법을 포함한다. 부가적인 치료 방법은 안기오스타틴, 안기오스타틴 단편, 안기오스타틴 동족체, 안기오스타틴 혈청 또는 세포독성 시약 관련 안기오스타틴 수용체 동근 및 길항근의 투여를 포함한다. 안기오스타틴은 동물 또는 인간 기원일 수 있는 것으로 이해된다. 안기오스타틴은 또한 화학 반응 또는 발현 시스템과 관련된 재조합 기술에 의하여 합성 제조될 수 있다. 안기오스타틴은 또한 분리된 플라스미노겐 또는 플라스미노겐을 효소적으로 분해함으로써, 항-맥관 형성 활성을 가지는 단백질을 생성함에 의하여 제조될 수 있다. 안기오스타틴은 또한 플라스미노겐을 안기오스타틴으로 분해하는 내인성 효소를 모방하는 화합물에 의하여 제조될 수 있다. 안기오스타틴 생성은 또한 플라스미노겐 분해 효소의 활성에 영향을 미칠 수 있는 화합물에 의하여 조정될 수 있다.

재생, 발달 및 상처 치료 및 조직 회복과 같은 맥관 형성-의존성 과정을 조정하기 위하여, 안기오스타틴에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 수동적 항체 치료법이 사용될 수 있다. 더욱이, 내인성 안기오스타틴 항혈청의 안기오스타틴 결합 능력을 방해하기 위하여, 안기오스타틴 항체의 Fab 영역 지향 항혈청이 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 환자 내의 안기오스타틴을 암호화하는 유전자가 조절되는 유전자 치료를 포함한다. 유전자 생산 단백질의 발현을 위하여 DNA를 세포로 전달 또는 운반하는 유전자 치료로 언급되는 다양한 방법이, 본원에 통합된 [참고문헌: Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotechn. 12(4):335-356 (1992)]에 개시된다. 유전자 치료는 생체 내 또는 생체 외에서의 사용을 위한 체세포 또는 생식 선 세포 내로의 DNA 서열의 통합을 포함한다. 유전자 치료는 유전자 대체, 정상 또는 비정상적 유전자 기능 증대 및 감염성 질환 및 기타 병리와 싸우는 기능을 한다.

의학적 문제를 유전자 요법을 이용하여 치료하기 위한 방법은, 결손 유전자를 선별한 후 기능성 유전자를 첨가하여, 결손 유전자의 기능을 대체하거나, 기능성 유전자를 증가시키는 것과 같은 치료법; 또는 상황을 처리하거나, 조직 또는 기관이 치료법의 영향을 쉽게 받도록 할 산물 단백질을 위한 유전자를 첨가하는 것과 같은 예방법을 포함한다. 예방법의 예로서, 안기오스타틴과 같은 유전자를 환자 내에 위치시킴으로써, 맥관 형성 발발을 예방할 수 있다; 또는 종양 세포를 방사선에 쉽게 영향받도록 하는 유전자를 삽입한 후, 종양의 방사선이 종양 세포의 파괴를 증가시킬 수 있다.

안기오스타틴 DNA 또는 안기오스타틴 조절 서열의 전달 방법이 본 발명에 구체화되어 있다. 특이적으로 안기오스타틴과 관련된 것으로 알려진 서열이외의 프로모터 서열 또는 안기오스타틴 단백질의 생산을 증가시킬 서열의 형질전환이 또한 유전자 치료법으로서 구체화되어 있다. 이러한 기술의 예는, 세포 내의 적혈구조혈 유전자 상에 회전하는 유전적 스위치를 삽입하기 위하여 상동 재조합을 이용하는 Transkaryotic Therapies, Inc., of Cambridge, Massachusetts에서 발견된다. Genetic Engineering News, April 15, 1994를 참조하라. 그러한 유전적 스위치는 정상적으로 안기오스타틴(또는 안기오스타틴 수용체)을 발현하지 않는 세포 내의 안기오스타틴 (또는 안기오스타틴 수용체)을 활성화하기 위하여 사용될 수 있다.

유전자 치료를 위한 유전자 전달 방법은 세 개의 부류로 구분된다-물리학적(전기영동, 직접적인 유전자 전달 및 입자 충격), 화학적(지질-기제 담체, 또는 기타 비-바이러스성 벡터) 및 생물학적(바이러스-유도 벡터 및 수용체 업테이크), 예를 들면, DNA로 코팅된 리포오좀을 포함하는 비-바이러스성 벡터가 사용될수 있다. 그러한 리포오좀/DNA 복합체는 환자에게 정맥 내로 직접 주사될 수 있다. 리포오좀/DNA 복합체는, DNA를 매크로파지 및 Knuffer 세포로 운반하는 간에 집중되는 것으로 이해된다. 상기 세포들은 수명이 길고, 따라서 운반된 DNA의 장기간 발현을 제공한다. 부가적으로, 치료 DNA의 표적 운반을 위하여, 유전자의 천연 DNA 또는 벡터가 요구되는 기관, 조직 또는 종양 내로 직접 주입될 수 있다.

일반적인 치료 방법학은 또한 운반 영역에 의하여 기술될 수 있다. 유전자를 운반하는 근본적인 방법은 생체 외 유전자 전달, 생체 내 유전자 전달 및 시험관 내에서의 유전자 전달을 포함한다. 생체 외의 유전자 전달의 경우, 세포가 환자로부터 채취되어 세포 배양액 내에서 배양된다. DNA는 세포 내로 형질 감염되고, 형질감염된 세포의 수가 증가된 후, 환자 내에 재이식된다. 생체 내의 유전자 전달의 경우, 형질변형된 세포는 조직 배양 세포와 같은 배양 내에서 배양되는 세포이며, 특정 환자로부터 채취된 특정 세포가 아니다. 이러한 실험실 세포가 형질감염되고, 환자 내로의 재이식 또는 기타 용도를 위하여 형질감염된 세포가 선택되고 증가된다.

생체 내에서의 유전자 전달은 DNA를 환자의 세포 내로 투입하는 것을 수반한다. 방법은, 환자 내의 유전자 전달을 위하여 비감염성 바이러스를 사용하는 바이러스-개재 유전자 전달을 이용하거나, 천연 DNA를 환자 내 영역 내로 주입하는 것을 포함하며, DNA는 유전자 산물 단백질이 발현되는 세포의 백분율로 채취된다. 부가적으로, 유전자 포와 같은 본원에 기술된 기타 방법이 시험관 내의 안기오스타틴 DNA 또는 안기오스타틴 조절 서열의 삽입을 위하여 사용될 수 있다.

유전자 치료의 화학적 방법은, DNA를 세포막을 통과하여 운반시키기 위하여, 반드시 리포오좀은 아닌 지질-기제 화합물을 수반할 수 있다. 음전하를 가지는 DNA에 결합하는 리포펙틴, 또는 사이토펙틴, 지질-기제 양이온은 세포막을 통과할 수 있는 복합체를 형성하고, 세포 내부로 DNA를 공급한다. 다른 화학적 방법은, 특이적 리간드의 세포 표면 수용체에의 결합, 봉입 및 세포막을 가로지르는 수송을 수반하는 수용체-기제 엔도시토시스를 사용한다. 리간드는 DNA에 결합하며, 복합체 전체가 세포 내로 수송된다. 리간드 유전자 복합체가혈액 스트림 내로 주입된 후, 수용체를 가지는 표적 세포가 리간드에 특이적으로 결합하여 리간드-DNA 복합체를 세포 내로 수송할 것이다.

많은 유전자 치료 방법학은 유전자를 세포 내로 삽입하기 위하여 바이러스 벡터를 사용한다. 예를 들면, 말초 종양-침투 임파구, 간세포, 표면세포, 근세포 또는 기타 체세포 내로 유전자를 투입하기 위한 생체 외 방법에 변형된 레트로바이러스 벡터가 사용된다. 이러한 변형된 세포는 환자 내로 투입되어 삽입된 DNA로부터 유전자 산물을 제공한다.

생체 내 방법을 이용하여 유전자를 세포 내로 삽입하는 데에 바이러스 벡터가 또한 사용되어 왔다. 외부 유전자의 조직-특이성 발현을 조절하기 위하여, 시스-작용 조절 요소 또는 조직-특이성으로 알려진 프로모터가 사용될 수 있다. 대안적으로, 이는 현장에서 DNA 또는 바이러스 벡터를 생체 내의 특정 해부학 상 영역으로 운반하는 것을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들면, 생체 내에서의 혈관으로의 유전자 전달은, 시험관 내에서 동맥 벽 상의 선택 영역 내의 형질도입된 표면세포를 이식함으로써 달성될 수 있다. 바이러스는 유전자 산물을 발현하는 주위 세포를 감염시킨다. 바이러스 벡터는, 카테테르에 의하여 생체 내 영역으로 직접 운반됨으로써, 특정 영역만이 바이러스에 의하여 감염되도록 하여, 장기간, 영역 특이성 유전자 발현을 제공할 수 있다. 레트로바이러스를 이용하는 생체 내에서의 유전자 전달 또한 포유 동물의 조직 및 간 조직 내에서 변형된 바이러스를 기관으로 유도하는 혈관 내로 주입함으로써 입증되어 왔다.

유전자 치료법에 사용되어 온 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 폴리오바이러스 또는 Sindbis 바이러스와 같은 기타 RNA 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-수반 바이러스, herpes 바이러스, SV 40, 백신 및 기타 DNA 바이러스를 포함한다. 증식-결손 쥐의 레트로바이러스 벡터가 가장 널리 이용되는 유전자 전달 벡터이다. 쥐의 백혈병 레트로바이러스는 핵 코어 단백질 및 중합효소 (pol)와 복합체를 형성하고, 단백질 코어 (gag)로 포장되고, 숙주 범위를 결정하는 당단백질 외막(env)으로 둘러싸인 일본쇄 RNA로 구성된다. 레트로바이러스의 유전적 구조는 5' 및 3' 장 말단 반복 (LTR)에 의하여 봉하여진 gag, pol 및 env 유전자를 포함한다. 레트로바이러스 벡터 시스템은, 바이러스 구조 단백질이 패키징 세포주 내에 in trans 공급된다면, 5' 및 3' LTR 및 패키징 시그널을 함유하는 최소 벡터가 벡터 패키징, 감염 및 표적 세포 내로의 통합을 허용하기에 충분함을 발견한다. 유전자 전달을 위한 레트로바이러스의 근본적인 이점은, 대부분의 세포형에서의 효율적인 감염 및 유전자 발현, 표적 세포 염색체 DNA 내로의 정확한 단일 복사 벡터 통합 및 레트로바이러스 게놈의 증식의 용이성을 포함한다.

아데노바이러스는, 코어 단백질과 복합체를 형성하고, 캡시드 단백질로 둘러싸여 있는 선형, 이본쇄 DNA로 구성된다. 분자 바이러스학의 발달은 이러한 유기체가 신규한 유전 서열을 생체 내에서 표적 세포 내로 형질도입할 수 있는 벡터를 창출하는 생물학의 발견으로 유도하여 왔다. 아데노바이러스-기제 벡터는 유전자 산물 단백질을 고 수준으로 발현할 것이다. 아데노바이러스 벡터는 저 역치의 바이러스로도 고효율의 감염성을 지닌다. 부가적으로, 바이러스는 무세포 비리온과 같이 완전 감염성이므로, 생산 세포주의 주입이 불필요하다. 아데노바이러스 벡터의 다른 잠재적 이점은 이형 유전자를 생체 내에서 장기간 발현시킬 수 있는 능력이다.

DNA 운반의 기계적 방법은 리포오좀 또는 막 융합을 위한 기타 소포와 같은 방추원성 지질 소포, 리포펙틴과 같은 양이온 지질을 통합하는 DNA의 지질 입자, 폴리라이신-개재 DNA 전달, 생식세포 또는 체세포 내로의 DNA의 미세 주입과 같은 DNA의 직접적인 주입, 유전자 포'에 사용되는 금 입자와 같은 함기적으로 운반된 DNA-코팅된 입자 및 인산칼슘 감염과 같은 무기화학적 접근을 포함한다. 다른 방법, 리간드-개재 유전자 치료는 DNA가 특이적 리간드와 함께 복합체를 형성하여 리간드-DNA 결합을 형성하고, DNA를 특정 세포 또는 조직으로 유도하는 것을 수반한다.

근육 세포 내로의 플라스미드 DNA 주입은 고율의 형질감염되고 마커 유전자의 발현을 유지시키는 세포를 산출함이 발견되었다. 플라스미드 DNA는 세포의 게놈 내로 통합되거나 통합되지 않을 수 있다. 형질감염된 DNA의 비-통합은, 말단 분화된 비-증식성 조직 내에서 연장된 기간 동안 돌연변이 삽입, 결실 또는 세포 또는 미토콘드리아 게놈 내의 변형없이, 유전자 산물 단백질의 발현 및 형질감염을 허용할 것이다. 반드시 영구적은 아닌 장기간의 특정 세포 내로의 치료 유전자 전달은 유전적 질환의 치료 또는 예방 용도를 제공할 것이다. DNA는 주기적으로 재주입되어, 수용체 세포의 게놈 내에 일어나는 돌연변이 없이 유전자 산물 수준을 유지시킬 수 있다. 외인성 DNA의 비-통합은, 하나의 세포 내에 다양한 유전자 산물을 발현시키는 모든 작제물과 함께 몇몇 개의 상이한 외인성 DNA 작제물의 존재를 허용할 수 있다.

입자-매개 유전자 전달 방법은 식물 조직을 형질전환하는데 처음 사용되었다. 입자 폭탄 장치, 즉 유전자 포를 이용하여, 유동력이 생성되어, DNA-코팅된 고밀도의 입자(금 또는 텅스텐과 같은)를 고속으로 가속화하여, 표적 기관, 조직 또는 세포의 침투를 허용한다. 입자 폭탄은 시험관 내의 시스템 또는 생체 외 또는 생체 내에서 DNA를 세포, 조직 또는 기관으로 투입시키는 기술에 사용될 수 있다.

유전자 전달을 위한 일렉트로포레이션은 전류를 사용하여, 세포 또는 조직이 일렉트로포레이션-개재 유전자 전달에 영향을 받기 쉽도록 한다. DNA 분자가 세포 내로 침투할 수 있는 방식으로 막 투과성을 증가시키기 위하여, 주어진 장(필드)력을 가지는 전기적 충격이 사용된다. 이러한 기술은 시험관 내 시스템 또는 생체 외 또는 생체 내에서 DNA를 세포, 조직 또는 기관으로 투입시키는 기술에 사용될 수 있다.

외부 DNA를 세포 내로 형질감염시키기 위하여, 생체 내에서의 담체-매개 유전자 전달이 사용될 수 있다. 담체-DNA 복합체는 편리하게 체액 또는 혈액 스트림 내로 투입된 후, 영역 특이적으로 체 내의 표적 기관 또는 조직으로 유도될 수 있다. 폴리라이신, 리포펙틴 또는 사이토펙틴과 같은 다가 양이온 및 리포오좀이 모두 사용될 수 있다. 세포 또는 기관-특이성 리포오좀이 개발될 수 있고, 따라서 리포오좀에 의하여 운반되는 외부 DNA는 표적 세포에 의하여 채취될 것이다. 수용체를 함유하는 세포 내로 DNA를 삽입하는 간편한 방법으로서, 특정 세포 상의 특정 수용체를 표적으로 하는 면역리포오좀의 주입이 사용될 수 있다. 사용되는 다른 담체 시스템은, 생체 내에서의 유전자 전달을 위하여 DNA를 간세포로 운반하기 위한 아시알로당단백질/폴리라이신 결합 시스템이다.

DNA가 수용체 세포로 운반된 후, 세포질 또는 핵질 내에 존재하기 위하여, 형질감염된 DNA는 다른 종류의 담체와 복합체를 형성할 수도 있다. DNA는 특이적으로 처리된 소포 복합체 내의 담체 핵 단백질과 커플링되어, 핵 내로 직접 운반될 수 있다.

안기오스타틴 유전자, 또는 안기오스타틴 유전자와 연결된 조절 영역에 결합하는 화합물, 또는 전사 또는 해독율을 변형시키기 위한 이에 상응하는 RNA 전사체를 투여함으로써, 안기오스타틴의 유전자 조절이 수행될 수 있다. 부가적으로, 안기오스타틴을 암호화하는 DNA 서열로 형질감염된 세포가 환자에게 투여되어, 생체 내의 안기오스타틴 기원을 제공할 수 있다. 예를 들면, 안기오스타틴을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 벡터로 세포가 형질감염될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 벡터는 특정 핵산 서열을 함유 또는 이와 결합할 수 있는 담체를 의미하며, 이는 특정 핵산 서열을 세포 내로 운반하는 기능을 한다. 벡터의 예는, 바이러스, 또는 리간드-DNA 배합체, 리포오좀, 지질-DNA 복합체와 같은 비바이러스 벡터와 같은 감염성 미생물 및 플라스미드를 포함한다. 안기오스타틴 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자는 발현 조절 서열과 연결되어, 안기오스타틴을 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 형성하는 것이 바람직하다. 형질감염된 세포는 환자의 정상적 조직, 환자의 질환 조직으로부터 유도된 세포이거나, 비-환자 세포일 수 있다.

예를 들면, 환자로부터 제거된 종양 세포는 본 발명의 안기오스타틴 단백질을 발현할 수 있는 벡터로 형질감염될 수 있으며, 환자 내로 재투입될 수 있다. 형질감염된 종양 세포는 환자 내에 종양 성장을 억제하는 안기오스타틴 수준을 생산한다. 환자는 인간 또는 동물일 수 있다. 세포는 또한, 일렉트로포레이션, 이온포레이션 또는 유전자 포와 같이 당업계에 공지된 물리적 또는 화학적 방법, 또는 비-벡터에 의하여 형질감염될 수 있다. 부가적으로, 안기오스타틴 DNA는 담체를 이용하지 않고 직접 환자 내로 주입될 수 있다. 특히, 안기오스타틴 DNA는 피부, 근육 또는 혈액 내로 주입될 수 있다.

안기오스타틴을 환자 내로 형질감염시키기 위한 유전자 치료법은, 세포의 게놈, 미니크로모좀 내로의 안기오스타틴 DNA 통합을 통한 것이거나, 세포질 또는 핵질 내의 별개의 복제 또는 비-복제 DNA 작제물로서 일 수 있다. 안기오스타틴 발현은 장기간 동안 계속되거나, 주기적으로 재주입되어, 세포, 조직 또는 기관 내에 요구되는 안기오스타틴 수준 또는 측정 혈액 수준을 유지시킬 수 있다.

안기오스타틴은 HPLC C4 컬럼 상에서 분리될 수 있다(표 3 참조). 안기오스타틴 단백질은 아세토니트릴 구배 내에서 30 내지 35%로 용출된다. 환원 조건 하에, 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 겔 상에서, 활성을 지니는 단백질 밴드는 대략 38 kDa에서 단일 피크로서 용출된다.

본 발명은, 성장하는 1차 종양이, 전이 내에서 맥관형성을 억제할 수 있으며, 따라서 전이 자체의 성장을 억제하는 안기오스타틴을 포함하는 특정 내피 세포 증식 억제 인자의 혈액 스트림 내로의 방출과 관련있음을 보여준다. 1차 종양과 관련된 안기오스타틴의 기원은 알려지지 않았다. 특정 프로테아제에 의한 플라스미노겐 분해에 의하여 화합물이 생성될 수 있으며, 안기오스타틴을 암호화하는 특정 유전자 발현에 의하여 안기오스타틴이 생성될 수 있다.

1차 종양의 맥관 형성 표현형은, 정상적인 세포에 의하여 형성되나 신형성으로의 형질전환 동안 하향-조정되는 것으로 믿어지는 과량의 내피 세포 억제 인자 내의 맥관 형성 단백질의 생성에 의존한다. 안기오스타틴의 생성은 개별적 종양 세포 내에서 그 모세포형에 의하여 생성에 비례하여 하향-조절될 수 있으나, 종양 전체에 의하여 형성되는 억제 인자의 전체 양은 순환되어, 미세전이 영역에서 내피 성장을 억제하기에 충분할 것이다. 안기오스타틴은 1차 종양에 의하여 방출된 맥관형성 단백질보다 상당히 장시간 순환에 유지된다. 따라서, 맥관형성 단백질은 국소적으로 작용하는 것으로 보이는 반면, 안기오스타틴은 전체에 작용하며, 비교적 장-반감기로 혈액 내에 순환한다. 안기오스타틴의 반감기는 대략 12 시간 내지 5 일이다.

하기의 가설에 부합하는 것이 바람직하지는 않으나, 종양이 맥관형성을 시작하면, 이는 맥관 외 방향으로부터 1차 종양 부근에서 표적 내피에 국소적으로 작용하며, 순환하지 않는(또는 단기의 반감기로 순환하는) 하나 이상의 맥관형성 단백질(예를 들면, aFGF, bFGF, VEGF, IL-8, GM-CSF 등)을 방출하는 것으로 믿어진다. 1차 종양이 계속하여 그 수를 증가시키기 위하여, 이들 맥관형성 단백질은 내피 세포 억제 인자(맥관형성 억제 인자)의 작용을 극복하기에 충분한 양으로 생산되어야 한다. 일단 그러한 1차 종양이 성장하면, 이는 계속하여 순환 내로 내피 세포 억제 이자를 방출한다. 가설에 의하면, 이들 억제 인자는 1차 종양으로부터 떨어진 거리에서 혈관 외 방향으로부터 표적 전이 모세관 내피에 작용하며, 계속하여 순환한다. 따라서, 전이가 맥관형성을 시작할 때, 그 부근의 모세관 내피는 안기오스타틴에 의하여 억제될 수 있다.

일단 1차 종양이, 안기오스타틴이 계속하여 순환 내로 방출되기에 충분한 크기에 도달하면, 2차 종양 이식(또는 미세 전이)이 그 자체의 맥관형성을 개시하거나 증가시키는 것은 어렵다. 2차 종양 이식(예를 들면, 피하 공간 내로, 각막 내로, 또는 정맥 내 폐로)이 1차 종양이 이식된 직후에 일어나면, 1차 종양은 2차 종양을 억제하지 못할 것이다(2차 종양 내의 맥관형성이 이미 진행 중일 것이므로). 두 종양이 동시에 이식되면(예를 들면, 반대 옆구리 내에), 억제 인자는 상호 동등한 억제 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 안기오스타틴은:

(i) 종양을 가지는 인간 또는 동물에게 항맥관형성 요법으로서 투여되고:

(ii) 인간 또는 동물 혈청, 뇨, 또는 조직 내에 예방적 마커로서 조절되고:

(iii) 유사 안기오스타틴 분자에 대한 암 환자의 뇨 및 혈청을 분석하기 위한 근본으로서 사용될 수 있다.

안기오스타틴이 환자의 뇨 또는 혈액과 같은 체액으로부터 분리될 수 있거나, 안기오스타틴이 당업자에게 공지된 합성 단백질 화학적 방법 또는 재조합 DNA 방법에 의하여 제조될 수 있음은 본 발명의 일부로 간주된다. 단백질 정제 방법은 당업계에 안기오스타틴 정제 방법의 특정 예로서 공지되어 있으며, 억제 활성의 분석이 하기의 실시예에 제공된다. 인간 내인성 안기오스타틴의 분리는 유사 기술을 이용하여 달성된다.

재조합 DNA를 이용하여 안기오스타틴을 제조하는 방법의 예는 (1) 상기및 이하 보다 상세히 기술하는 바와 같이 안기오스타틴을 식별 및 정제하고, (2) 정제된 억제 인자의 N-말단 아미노산 서열을 결정하고, (3) 안기오스타틴 서열을 위한 5' 및 3' DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하고, (4) 중합효소를 이용하여 안기오스타틴 유전자 서열을 증식하고, (5) 증식된 서열을 발현 벡터와 같이 적절한 벡터 내로 삽입하고, (6) 벡터를 함유하는 유전자를 미생물 또는 기타 억제 인자를 발현할 수 있는 발현 시스템으로 삽입하고, (7) 재조합에 의하여 생성된 억제 인자를 분리시키는 단계를 필요로 한다. 적절한 벡터는 바이러스, 박테리아 및 효모와 같은 진핵 세포 발현 벡터를 포함한다. 상기 기술은 Molecular Coning: A Laboratory Manual Second Edition by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 1989와 같은 실험 참고서에 보다 상세히 기술되어 있다. 인간 플라스미노겐의 DNA 서열이 공표되었으며[참고문헌: Browne, M. J., et al., Expression of recombinant human plasminogen and aglycoplasminogen in HeLa cells Fibrinolysis Vol. 5(4) 257-260, 1991], 본원에 참고 문헌으로 통합되어 있다.

안기오스타틴 유전자는 또한, (1) 조직으로부터 메신저 RNA를 분리시키고, (2) 역전사효소를 이용하여 상응하는 DNA 서열을 생성한 후, (3) 적절한 프라이머와 함께 중합효소 체인 반응(PCR)을 이용하여 활성 안기오스타틴 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열을 증식시킴으로써, 고수준의 안기오스타틴을 발현하는 조직 또는 세포(종양 세포와 같은)로부터 분리될 수 있다.

안기오스타틴 또는 그 생물학적 활성 단편을 제조하는 또 다른 방법은 단백질 합성에 의한 것이다. 일단 안기오스타틴의 생물학적 활성 단편이 하기에 보다 상세히 기술하는 분석 시스템을 이용하여 발견되면, 이는 예를 들면 자동 단백질 서열 분석법에 의하여 서열 분석될 수 있다. 대안적으로, 일단 안기오스타틴을 암호화하는 DNA 서열 또는 유전자가 예를 들어 상기 방법에 의하여 분리되면, DNA 서열 또한 당업계에 공지된 자동 서열 분석법 또는 수동적 방법에 의하여 결정될 수 있다. 핵산 서열은 교대로 아미노산 서열에 대한 정보를 제공한다. 따라서, 생물학적 활성 단편이 트립신 분해와 같은 특정 방법에 의하여 제조된다면, 또는 그 단편이 N-말단 서열 분석된다면, 잔류 아미노산 서열은 상응하는 DNA 서열로부터 결정될 수 있다.

일단 단백질의 아미노산 서열이 알려지면, 단편은 Solid Phase Protein Synthesis: A Parctical Approach E. Atherton and R.C.Sheppard, IRL Press, Oxford, England에 의하여 입증되는 바와 같이 당업계에 공지된 기술에 의하여 합성될 수 있다. 유사하게, 함께 연결되어 더 큰 단편을 형성할 다수의 단편이 합성될 수 있다. 이들 합성 단백질 단편은 또한, 시험관 내 또는 생체 내에서의 동근 및 길항근 활성을 시험하기 위하여, 특정 영역에서 아미노산 치환될 수 있다. 조직에의 결합에 대한 고친화력을 가지는 단백질 단편은 친화력 컬럼 상에서 안기오스타틴 수용체를 분리시키는데 사용될 수 있다. 안기오스타틴 수용체의 분리 및 정제는 안기오스타틴의 활성 기작을 명백히 하는 근본적인 단계이다. 안기오스타틴 수용체의 분리 및 안기오스타틴 동근 및 길항근의 식별은 안기오스타틴 수용체의 활성, 생물학적 활성으로의 최종 경로를 조절하기 위한 약품의 개발을 촉진시킬 것이다. 수용체의 분리는, 현장에서 용액 하이브리드화 기술을 이용하여 수용체의 합성 및 국재를 위한 뉴클레오티드 탐침의 작제를 가능케 한다. 더욱이, 안기오스타틴 수용체에 대한 유전자를 분리시켜, 발현 벡터 내로 통합하여, 환자 종양 세포와 같은 세포 내로 형질 감염시킴으로써, 세포형, 조직 또는 종양의 안기오스타틴 결합력을 증가시키고, 국소적 맥관형성을 억제할 수 있다.

안기오스타틴은 맥관형성-개재 또는 이를 수반하는 과정 또는 질환의 치료에 효율적이다. 본 발명은 유효량의 안기오스타틴 또는 그 생물학적 활성 단편 또는 항맥관형성 활성을 가지는 안기오스타틴 단편의 조합 또는 안기오스타틴 동근 및 길항근으로 맥관형성-개재 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 맥관형성-개재 질환은 충실성종양; 백혈병과 같은 혈종; 종양 전이; 예를 들면, 혈관종, 급성 신경종, 신경섬유종, 트라코마 및 화농성 육아종과 같은 양성 종양; 류마티스성 관절염; 건선; 예를 들면, 당뇨성 망막증, 조숙 망막증, 반점성 퇴화, 각막 이식 재주입, 혈관신생 녹내장, 후수정체 섬유증식증, 피부 조홍과 같은 눈의 맥관형성; Osler-Webber Syndrome; 심근 맥관형성; 플라그 혈관신생; 모세관확장증; 혈우성 관절; 섬유성혈관종; 및 상처 과립형성을 포함한다. 안기오스타틴은 과도한 또는 비정상적 내피 세포 자극 질환의 치료에 유용하다. 이러한 질환들은 장 점착, Crohn's 질환, 동맥경화증, 공피증 및 예를 들면 해족종과 같은 비대 상처를 포함한다. 안기오스타틴은 배아 착상에 요구되는 혈관신생을 예방함으로써 피임제로 사용될 수 있다. 안기오스타틴은 묘조병(Rochele minalia quintosa) 및 궤양(Helicobacter pylori)과 같은 병리적 결과로서 맥관형성을 가지는 질환의 치료에 유용하다.

안기오스타틴의 합성 단백질 단편은 광범위한 용도를 가진다. 안기오스타틴 수용체에 고-특이성 및 결합성으로 결합하는 단백질은 방사선 표지되며, 자동방사선사진법 및 막 결합 기술을 이용하여 결합 영역의 시각화 및 정량에 이용된다. 본원은 중요한 진단 및 조사 도구를 제공한다. 안기오스타틴 수용체의 결합 특성의 인식은 수용체 관련 형질도입 기작의 조사를 촉진한다.

부가적으로, 단기 반감기의 동위원소를 이용한 안기오스타틴 단백질의 포지는, 양전하 발산 단층촬영법 또는 기타 안기오스타틴 결합 영역을 가지는 종양을 국재시키는 방사선사진 기술을 이용하여 생체 내에서 수용체 결합 영역의 시각화를 가능케 한다.

이들 합성된 단백질 내의 아미노산의 체계적인 치환은 그 수용체에 결합하는 안기오스타틴을 증가 또는 감소시키는 안기오스타틴 수용체에 대한 고-친화력의 단백질 동근 및 길항근을 생성한다. 그러한 동근은 미세전이를 억제함으로써, 암의 확산을 제한하기 위하여 사용된다. 안기오스타틴에 대한 길항근은 불충분한 혈관화의 상황에 적용되어, 안기오스타틴의 억제 효과를 방해하고, 맥관형성을 촉진시킨다. 예를 들면, 이러한 처리는 당뇨병 환자의 상처 치료를 촉진시키는 치료적 효과를 가질 수 있다.

안기오스타틴 단백질은 배양된 종양 세포로부터 안기오스타틴 수용체의 분리를 위한 친화력 컬럼을 개발하기 위하여 사용된다. 안기오스타틴 수용체의 분리 및 정제 후, 아미노산 서열 분석을 한다. 상기 정보를 이용하여, 안기오스타틴 수용체를 암호화하는 유전자(들)이 식별 및 분리될 수 있다. 다음, 클로닝된 핵산 서열이 수용체를 발현할 수 있는 벡터 내로의 삽입을 위하여 개발된다. 상기 기술들은 당업자에게 공지되어 있다. 안기오스타틴 수용체를 암호화하는 핵산 서열의 종양 세포 내로의 형질감염 및 형질감염된 종양 세포에 의한 수용체의 발현은 이러한 세포의 내인성 또는 외인성 안기오스타틴에 대한 반응성을 증가시키고, 따라서 전이 성장율을 감소시킨다.

리신과 같은 세포 독성 시약은 안기오스타틴 및 고-친화력 안기오스타틴 단백질 단편에 연결됨으로써, 안기오스타틴에 결합하는 세포의 분해 도구를 제공한다. 이들 세포는 미세전이 및 1차 종양을 포함하는 많은 영역에서 발견된다. 세포 독성 시약에 연결된 단백질은 요구되는 영역으로의 운반을 최대화하는 방식으로 융합된다. 예를 들면, 리신-연결 고 친화력 안기오스타틴 단편은 배관을 통하여 관 내로 표적 영역에 공급하면서 또는 직접 표적으로 운반된다. 그러한 시약은 또한 융합 배관에 커플링된 삼투성 펌프를 통하여 조절된 방식으로 운반된다. 조직의 혈관화를 증가시키기 위하여, 안기오스타틴 길항근의 조합이 맥관형성의 조절 인자와 함께 적용될 수 있다. 이러한 치료 방법은 전이성 암을 분해시키는 효율적인 수단을 제공한다.

안기오스타틴은 질환 치료를 위한 다른 조성물 및 절차들과 배합되어 사용될 수 있다. 예를 들면, 종양이 안기오스타틴과 배합된 수술, 방사선 또는 화학요법을 이용하여 통상적으로 치료된 후, 미세전이의 휴지상태를 연장하고 잔류 1차 종양의 성장을 억제 및 안정화하기 위하여, 안기오스타틴이 연속적으로 환자에게 투여된다. 부가적으로, 안기오스타틴, 안기오스타틴 단편, 안기오스타틴 항혈청, 안기오스타틴 수용체 동근, 안기오스타틴 수용체 길항근 또는 이들의 조합이 약학적로 허용되는 부형제 및 임의로 생분해가능한 중합체와 같은 지속-방출 매트릭스와 배합되어 치료 조성물을 형성할 수 있다.

본원에서 사용되는 지속-방출 매트릭스는 효소적 또는 산/염기 가수분해 또는 용해에 의하여 분해될 수 있는 물질, 대개 중합체로 제조되는 매트릭스이다. 일단 체 내로 삽입되면, 효소 및 체액이 매트릭스에 작용한다. 지속-방출 매트릭스는 바람직하게는 리포오좀, 폴리락티드(폴리락토산), 폴리글리코라이드(글리코산의 중합체), 폴리락티드 코-글리코라이드(락토산 및 글리코산의 공중합체), 폴리안하이드라이드, 폴리(오르토)에스테르, 폴리프로틴, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 설페이트, 카르복실산, 지방산, 인지질, 폴리사카라이드, 핵산, 폴리아미노산, 페닐알라닌, 티로신, 이소루신과 같은 아미노산, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘과 같은 생-융화성 물질로부터 선택된다. 바람직한 생분해가능한 매트릭스는 폴리락티드, 폴리글리코라이드 또는 폴리락티드 코-글리코라이드(락토산 및 글리코산의 공중합체) 중 하나의 매트릭스이다.

본 발명의 맥관형성-조절 치료 조성물은 고체, 액체 또는 기교질일 수 있으며, 공지의 투여 경로에 의하여 투여될 수 있다. 고체 치료 조성물의 예는, 환제, 크림, 및 이식가능한 투여 단위를 포함한다. 환제는 경구적으로 투여될 수 있으며, 크림은 국소적으로 투여될 수 있다. 이식가능한 투여 단위는 국소적으로, 예를 들면 종양 영역에 투여되거나, 맥관형성-조절 치료 조성물의 체계적인 방출을 위하여, 예를 들면 피하로 이식될 수 있다. 액체 조성물의 예는, 피하, 정맥내, 동맥내 주사를 위하여 변형된 조성 및 국소적 및 각막내 투여를 위한 조성물을 포함한다. 기교질 조성물의 예는, 폐 투여를 위한 흡입 조성물을 포함한다.

본 발명의 안기오스타틴은 또한 억제 인자 및 그 수용체 특이성 항체를 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 항체는 다클론성 항체 또는 단일 클론성 항체일 수 있다. 안기오스타틴 또는 안기오스타틴 수용체에 특이적으로 결합하는 이들 항체는, 체액 또는 조직 내의 안기오스타틴 또는 안기오스타틴 수용체를 검출 또는 정량하기 위한 당업자에게 공지된 진단 방법 및 도구에 사용될 수 있다. 상기 시험 결과는 암 및 기타 맥관형성-개재 질환의 발발 또는 재발발을 진단 또는 예측하는데 사용될 수 있다.

안기오스타틴은 또한 안기오스타틴에 결합할 수 있는 항체의 검출 및 정량을 위한 진단 방법 및 도구에 사용될 수 있다. 이들 도구는 현장에서 1차 종양에 의하여 분비된 안기오스타틴의 존재 하에 미세전이의 분포를 나타내는 순환 안기오스타틴 항체의 검출을 허용한다. 그러한 순환 항-안기오스타틴 항체를 가지는 환자는 다수의 종양 및 암이 발달하기 쉬우며, 치료 또는 차도 기간 후에 암이 재발발하기 쉽다. 이들 항-안기오스타틴 항체의 Fab 단편은 항-안기오스타틴 항체를 중성화하는 항-안기오스타틴 Fab-단편 항혈청을 생성시키기 위한 항체로서 사용될 수 있다. 그러한 방법은 항-안기오스타틴 항체에 의한 순환 안기오스타틴의 제거를 감소시킴으로써, 순환 안기오스타틴 수준을 효율적으로 향상시킬 것이다.

본 발명의 다른 측면은 과량의 내인성 안기오스타틴의 작용을 방해하는 방법이다. 이는 시스템 내에 바람직하지 않은 안기오스타틴 특이성 항체로 인간 또는 동물을 수동적으로 면역화시킴으로써 행하여질 수 있다. 이러한 처리는 비정상적 배란, 월경 및 태반형성, 및 혈관화를 치료하는 데 있어 중요하다. 이는 전이 과정에 대한 안기오스타틴 제거의 효율을 조사하는 유용한 방법을 제공한다. 안기오스타틴 항체의 Fab 단편은 안기오스타틴 결합 영역을 함유한다. 이 단편은 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 안기오스타틴 항체로부터 분리된다. 안기오스타틴 항혈청의 Fab 단편은 항-Fab 단편 혈청을 생성하기 위한 항체로서 사용된다. 안기오스타틴의 Fab 단편에 대한 항혈청의 융합은 안기오스타틴이 안기오스타틴 항체에 결합하는 것을 방지한다. 안기오스타틴의 항-안기오스타틴 Fab 단편에의 결합을 방해하여 내인성 항-안기오스타틴을 중성화함으로써, 치료적 이점이 얻어진다. 이러한 치료의 순수 효과는 내인성 순환 안기오스타틴의 표적 세포에의 도달 능력을 촉진시킴으로써, 전이의 확산을 감소시키는 것이다.

본 발명은 내피 억제 활성을 가지는 임의의 안기오스타틴 유도체를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명은 전체 안기오스타틴 단백질, 안기오스타틴 단백질의 유도체 및 안기오스타틴 단백질의 생물학적 활성 단편을 포함한다. 이들은, 아미노산 치환되거나 당 또는 기타 아미노산 작용기에 부착된 분자를 가지는 안기오스타틴 활성을 지닌 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한 안기오스타틴 및 안기오스타틴 수용체을 암호화하는 유전자 및 이들 유전자에 의하여 발현되는 단백질을 또한 포함한다.

상기 안기오스타틴 활성을 가지는 단백질 및 단백질 단편은, 당업자에게 공지된 조성 방법을 이용하여 약학적으로 허용되는 조성으로 분리되고 실질적으로 정제된 단백질 및 단백질 단편으로서 제공될 수 있다. 이들 조성물은 정상적인 경로에 의하여 투여될 수 있다. 일반적으로, 조성물은, 경구적, 경피, 복막내, 두개 내, 대뇌실 내, 대뇌 내, 질 내, 자궁 내, 직장 또는 비경구적(예를 들면, 정맥 내, 척수 내, 피하 또는 근육 내) 경로에 의하여 투여될 수 있다. 부가적으로, 안기오스타틴은 화합물의 지속-방출을 허용하는 생분해가능한 중합체 내에 통합될 수 있으며, 이러한 중합체는 약품의 운반이 바람직한 곳, 예를 들면 종양 부위 근처에 이식되거나, 안기오스타틴이 체계적으로 서서히 방출되도록 이식된다. 전이 성장 내로 직접적으로 또는 종양으로 혈관 내 공급과 같이 요구되는 영역으로의 배관을 통한 고농도의 안기오스타틴의 운반을 조절하기 위하여, 삼투성 미니펌프가 또한 사용될 수 있다. 생분해가능한 중합체 및 그 용도가 예를 들면, 본원에 참고문헌으로 그 자체로 통합되어 있는 Brem et al., J. Neurosurg. 74;441-446(1991)에 상세히 기술되어 있다.

본 발명의 안기오스타틴의 투여는 처리되는 질환 상태 또는 상황, 및 인간 또는 동물의 체중 및 상황 및 화합물의 투여 경로와 같은 임상적 인자에 의존한다. 인간 또는 동물을 치료하기 위하여, 대략 0.5 mg/kg 내지 500 mg/kg의 안기오스타틴이 투여될 수 있다. 특정 인간 또는 동물 내 안기오스타틴의 반감기에 따라, 안기오스타틴이 매일 수 회 내지 주 당 1 회로 투여될 수 있다. 본 발명은 인간 및 동물용인 것으로 이해된다. 본 발명의 방법은 동시 또는 연장된 기간에 걸쳐, 다수의 투여 뿐아니라 1 회의 투여 또한 포함한다.

안기오스타틴 조성물은, 경구, 직장, 눈(초자체 내 또는 카메라 내), 코, 국소적(볼 및 설하 포함), 자궁 내, 질 또는 비경구적(피하, 복막 내, 근육 내, 정맥 내, 피부 내, 두개 내, 기관 내, 및 경막외) 투여에 적합한 것들을 포함한다. 안기오스타틴 조성물은 편리하게 단위 투여 형태로 존재할 수 있으며, 전형적인 약학적 기술에 의하여 제조될 수 있다. 그러한 기술은, 활성 성분과 약학적 담체 또는 부형제를 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 활성 성분을 액체 담체 또는 균일하게 배분된 고체 담체 또는 이들 모두와 불균일하고 근접하도록 결합시킨 후, 필요에 따라 산물을 성형시킴으로써 조성물이 제조된다.

비경구 투여에 적합한 조성물은, 항산화제, 완충제, 제균제, 및 수혈자의 혈액을 이용하여 조성물을 등장액으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 점증제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 조성물은 단위 투여 또는 다수 투여 용기, 예를 들면, 봉함된 앰풀 및 작은 병으로 존재할 수 있으며, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들 면 주사를 위한 물만을 필요로 하는 냉동-건조 조건으로 저장될 수 있다. 즉석의 주사 용액 및 현탁액이 멸균 분말, 환약 및 상기한 유형의 정제로부터 제조될 수 있다.

바람직한 단위 투여 조성물은, 투여 성분의 일간 투여 단위, 일간 분배 투여, 또는 이들의 적절한 단편을 함유하는 것들이다. 특히 상기한 구성 성분 이외에, 본 발명의 조성물은 문제시 되는 조성물의 유형에 관련된 당업계에서 통상적인 기타 시약을 포함할 수 있다. 임의로, 세포 독성 시약이 안기오스타틴 단백질 또는 그 생물학적 작용성 단백질 단편과 통합되거나 배합되어, 환자에게 이중의 치료를 제공할 수 있다.

본 발명의 맥관형성 억제 단백질은 표준 미세화학적 설비 내에서 합성될 수 있으며, HPLC 및 질량 분광측정법을 이용하여 순도를 조사할 수 있다. 단백질 합성, HPLC 정제 및 질량 분광측정 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 안기오스타틴 단백질 및 안기오스타틴 수용체 단백질 또한 재조합 이.콜라이 또는 효모 발현계 내에서 제조될 수 있으며, 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다.

하기를 포함하는 용도를 위하여 비손상 안기오스타틴 분자의 상이한 단백질 단편이 합성될 수 있다: 특이적 항혈청의 개발을 위한 항체, 안기오스타틴 결합 영역에서 활성을 가지는 동근 및 길항근, 안기오스타틴에 결합하는 세포의 표적 사멸을 위한 세포 독성 시약과 연결되거나 배합되어 사용되는 단백질. 상기 단백질을 포함하는 아미노산 서열은 분자의 외부 영역 상에서의 그들의 좌에 근거하여 선택되며, 항혈청에의 결합을 위하여 접근할 수 있다. 분자의 중간 영역 뿐아니라 안기오스타틴의 아미노 및 카복시 말단 또한 합성되는 단편 중에서 개별적으로 나타내어진다.

잠재적인 서열 동족관계를 측정하기 위하여, GenBank, Brookhaven, Protein, SWISS-PROT 및 PIR과 같은 단백질 서열 데이터베이스를 이용하여, 상기 단백질 서열이 공지 서열과 대조된다. 이러한 정보는 다른 분자와의 고도의 서열 동족관계를 보이는 서열의 제거를 촉진시킴으로써, 항혈청, 안기오스타틴에 대한 동근 및 길항근의 개발에 있어 고도의 특이성을 위한 잠재력을 증진시킨다.

안기오스타틴 및 안기오스타틴 유도 단백질은 일반적인 방법을 이용하여 다른 분자와 커플링될 수 있다. 안기오스타틴의 아미노 및 카복시 말단은 모두 티로신 및 라이신 잔기를 함유하며, 다양한 기술, 예를 들면 전형적인 기술을 이용하는 방사선표지법(티로신 잔기-클로르아민 T, 요오도겐, 락토퍼옥시다아제; 라이신 잔기-Bolton-Hunter 시약)을 이용하여 동위원소 및 비동위원소로 표지된다. 이들 커플링 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 대안적으로, 단백질 상의 반응성 아미노 및 히드록시기의 표지를 촉진시키기 위하여, 티로신 또는 라이신이 이러한 잔기를 가지지 않는 단편에 첨가된다. 커플링 기술은, 아미노, 설프히드랄, 카복시, 아미드, 페놀 및 이미다졸을 포함하는 아미노산에 유용한 작용기에 근거하여 선택된다. 상기 커플링을 실행하기 위하여 사용되는 다양한 시약은 무엇보다도 글루타알데하이드, 디아조화 벤지딘, 카보디이미드 및 p-벤조퀴논을 포함한다.

안기오스타틴 단백질은 동위원소, 효소, 담체 단백질, 세포 독성 시약, 형광성 분자, 화학발광체, 생발광체 및 기타 다양한 용도의 화합물과 커플링된다. 특정 반응에 적절한 상이한 기술을 이용하여 커플링 반응의 효율이 측정된다. 예를 들면,¹²⁵I로의 안기오스타틴 단백질의 방사선표지는 고도의 특이적 활성을 가지는 클로르아민 T 및 Na¹²⁵I를 이용하여 수행된다. 반응은 소디움 메타바이설파이트를 이용하여 종결되고, 혼합물이 폐기가능한 컬럼 상에서 탈염된다. 표지된 단백질은 컬럼으로부터 용출되고, 단편이 수집된다. 각각의 단편으로부터 분취량이 제거되고, 감마 카운터 내에서 방사능이 측정된다. 이러한 방식으로, 미반응 Na¹²⁵I가 표지된 안기오스타틴 단백질로부터 분리된다. 최고 특이적 방사능을 가지는 단백질 단편이 안기오스타틴 항혈청에의 결합력 분석과 같은 후속적 용도를 위하여 저장된다.

단백질 내합의 다른 용도는 다클론성 항혈청의 생산을 위한 것이다. 예를 들면, 라이신 잔기를 함유하는 안기오스타틴 단백질이 글루타르알데하이드를 이용하여 정제된 소의 혈청 알부민과 연결된다. 방사선표지된 단백질의 통합을 측정함으로써 반응의 효율이 측정된다. 미반응 글루타르알데하이드 및 단백질이 투석에 의하여 분리된다. 내합체는 후속적 용도를 위하여 저장된다.

안기오스타틴에 대한 항혈청, 안기오스타틴 동족체, 안기오스타틴의 단백질 단편 및 안기오스타틴 수용체가 생성될 수 있다. 단백질 합성 및 정제 후, 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 단일클론성 및 다클론성 항혈청이 배양된다. 예를 들면, 다클론성 항혈청은 토끼, 양, 염소 또는 기타 동물 내에서 배양될 수 있다. 소의 혈청 알부민과 같은 담체 분자에 내합된 안기오스타틴 단백질 또는 안기오스타틴 그 자체는 보조제 혼합물과 배합되고, 에멀션화되어, 등, 목, 옆구리 및 때로는 발바닥 상의 다수 영역에 피하 주사될 수 있다. 부스터 주사는, 주 당 2 내지 4 회와 같이 일정 간격으로 행하여진다. 주사 후 대략 7 내지 10 일 후, 예를 들면 확장 후 귀 정맥을 이용하는 정맥천자에 의하여 혈액 샘플을 수득한다. 혈액 샘플을 밤새도록 4℃에서 응괴시키고, 4℃에서 30 분간 대략 2400X로 여과시킨다. 이 혈청을 제거시키고, 분취량을 채취한 후, 즉석 용도를 위하여 4℃에서 또는 후의 분석을 위하여 -20 내지 -90℃에서 저장한다.

항체 역치의 측정을 위하여, 다클론성 항혈청의 생성으로부터의 모든 혈청 샘플 또는 단일클론성 항혈청의 생성으로부터의 배지 샘플을 분석한다. 몇몇 수단, 예를 들면 점 블랏 및 밀도 분석을 이용하여 역치를 확립한 후, 또한 단백질 A, 2급 항혈청, 무수 에탄올 또는 목탄-덱스트란을 이용하는 방사선표지된 단백질-항체 복합체의 침전으로, 감마 카운터 내에서 활성을 측정한다. 최고 역치의 항혈청을 또한 상업적으로 유용한 친화력 컬럼 상에서 정제한다. 안기오스타틴 단백질을 친화력 컬럼 내에서 겔에 커플링시킨다. 항혈청 샘플을 컬럼에 통과시키면, 잔류 항-안기오스타틴 항체는 컬럼에 결합된 채 남게 된다. 이들 항체를 연속적으로 용출시키고, 수집하여, 역치 및 특정성의 측정을 위하여 평가한다.

하기를 확립하기 위하여, 최고 역치의 안기오스타틴 항혈청을 시험한다; a) 최고 특이적 항원에의 결합 및 최저 비-특이적 결합을 위한 최적의 항혈청 희석, b) 표준 변위 곡선 내의 증가하는 안기오스타틴 단백질에의 결합력, c) 관련 단백질 및 플라스미노겐을 포함하는 단백질 및 관련 종의 안기오스타틴과의 잠재적 교차-반응성, d) 플라스마, 뇨, 조직 및 세포 배양액의 추출물 내의 안기오스타틴 단백질 검출 능력.

안기오스타틴 및 안기오스타틴 수용체의 측정을 위한 도구 또한 본 발명의 일부로 간주된다. 신속하고, 신뢰할 수 있으며, 민감성인 안기오스타틴의 국재 및 특정 측정을 위한 도구 사용의 용이성을 확립하기 위하여, 최고 역치 및 특이성을 가지며, 플라스마, 뇨, 조직 및 세포 배양액의 추출물 내의 안기오스타틴 단백질을 검출할 수 있는 항혈청을 조사한다. 이들 분석 도구는 하기의 기술을 포함한다; 경쟁적 및 비-경쟁적 분석, 방사선면역학적 분석, 생발광성 및 화학발광성 분석, 형광성 분석, 샌드위치 분석, 면역학적 방사성 분석, 점 블랏, ELISA를 포함하는 연결 효소 분석, 미아크로티터 플레이트, 뇨 또는 혈액의 신속한 조절을 위한 스트립 또는 딥스틱으로 코팅된 항체, 및 면역학적 세포화학. 각각의 도구에 대한 범위, 민감도, 정확성, 신뢰성, 특이성 및 분석의 반복성을 확립한다. 내분석 및 상호분석 변형이, 변위 또는 활성 표준 곡선 상의 20%, 50% 및 80%포인트에서 확립된다.

조사 및 임상에 통상 사용되는 분석 도구의 한 구체예는 방사선면역학적 분석(RIA) 도구이다. 안기오스타틴 RIA는 하기에 기술되어 있다. 안기오스타틴 또는 안기오스타틴 단백질의 성공적인 방사성요오드화 및 정제 후, 최고 역치를 가지는 항혈청을 적절한 완충계 내에 10,000 cpm과 같은 비교적 일정한 방사능을 함유하는 튜브에 상이한 희석액으로 가한다. 다른 튜브는 비-특이적 결합의 측정을 위하여, 완충제 또는 예비-면역 혈청을 함유한다. 4℃에서 24 시간 동안 배양시킨 후, 단백질 A를 가하고, 튜브를 회전시키고, 실온에서 90 분간 배양시킨 후, 4℃에서 대략 2000 내지 2500 X g으로 여과시켜, 표지된 항원에 결합된 항체의 복합체를 침전시킨다. 상청액을 흡기에 의하여 제거시키고, 펠리트 내의 방사능을 감마 카운터 내에서 계산한다. 비-특이적 결합을 공제한 후, 대략 10 내지 40 %의 표지된 단백질에 결합하는 항혈청 희석액의 특성이 규명된다.

다음, 공지된 양의 단백질을 방사선표지된 단백질 및 항혈청을 함유하는 튜브에 가함으로써, 항혈청의 개발을 위하여 사용되는 안기오스타틴 단백질의 희석 범위(대략 0.1 pg 내지 10 ng)를 측정한다. 부가적인 배양 기간, 예를 들면 24 내지 48 시간 후, 단백질 A를 가하고, 튜브를 원심분리시키고, 상청액을 제거시킨 후, 펠리트 내의 방사능을 계산한다. 비표지된 안기오스타틴 단백질에 의한 방사선표지된 안기오스타틴 단백질의 결합의 대체는 표준 곡선을 제공한다. 몇몇 농도의 기타 안기오스타틴 단백질 단편, 플라스미노겐, 상이한 종으로부터의 안기오스타틴 및 동족 단백질을 분석 튜브에 가하여, 안기오스타틴 항혈청의 특이성을 규명한다.

안기오스타틴을 추출하는데 성공적으로 사용되어온 추출 기술을 이용하여, 1차 및 2차 종양, 루이스 폐 종양, 안기오스타틴 생산 세포의 배양액, 태반, 궤양 및 기타 뇌, 간 및 장과 같은 조직을 포함하는 다양한 조직의 추출물을 제조한다. 조직 추출물의 동결건조 또는 Speed Vac 후, 분석 완충제를 가하고, 상이한 분취량을 RIA 튜브 내에 위치시킨다. 공지의 안기오스타틴 생산 세포의 추출물은 표준 곡선에 평행한 대체 곡선을 나타내는 반면, 안기오스타틴을 생산하지 않는 조직의 추출물은 안기오스타틴 항혈청으로부터 방사선표지된 안기오스타틴을 대체시키지 않는다. 더욱이, 루이스 폐 종양을 가지는 동물로부터의 뇨, 플라스마, 및 대뇌척수 액의 추출물을 증가량으로 분석 튜브에 가한다. 평행한 대체 곡선은 조직 및 체액 내의 안기오스타틴 측정을 위한 안기오스타틴 분석의 유용성을 나타낸다.

분취량을 역상 HPLC에 가함으로써, 안기오스타틴을 함유하는 조직 추출물을 부가적으로 규명한다. 용출액 분획을 수집하고, Speed Vac 내에서 건조시키고, RIA 완충제 내에서 재구축하여, 안기오스타틴 RIA 내에서 분석한다. 최대량의 안기오스타틴 면역학적반응성을 안기오스타틴 용출 부위에 해당하는 분획 내에 위치시킨다.

분석 도구는 지시, 항혈청, 안기오스타틴 또는 안기오스타틴 단백질 및 가능하게는 방사선 표지된 안기오스타틴 및/또는 결합된 안기오스타틴-안기오스타틴 항체 복합체의 침전을 위한 시약을 제공한다. 이 도구는 종양이 있거나 없는 인간 및 동물의 생물학적 유체 및 조직 추출물 내의 안기오스타틴의 측정에 유용하다.

조직 및 세포 내의 안기오스타틴의 국재를 위하여 다른 도구가 사용된다. 이러한 안기오스타틴 면역학적 조직화학 도구는 지시, 안기오스타틴 항혈청 및 가능하게는 플루오레신 이소티오시아네이트와 같은 형광성 분자 또는 기타 1차 항혈청을 시각화하기 위하여 사용되는 시약에 연결된 방해 혈청 및 2차 항혈청을 제공한다. 면역학적조직화학 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 안기오스타틴 면역학적 조직화학 도구는, 광 및 전자 현미경검사를 이용하여 조직 부위 및 배양 세포 내에 안기오스타틴의 국재를 허용한다. 이는 이는 조사용 및 임상적 목적으로 사용된다. 예를 들면, 안기오스타틴 생산 영역을 검사하기 위하여, 종양이 생검되거나 수집되고, 조직 부위가 마이크로톰으로 절단된다. 그러한 정보는 암의 검출 및 치료에서 진단 및 가능하게는 치료 목적으로 유용하다. 안기오스타틴 생합성 영역을 시각화하기 위한 다른 방법은, 안기오스타틴 메신저 RNA를 탐침하기 위하여, 현장에서의 하이브리드화에 사용하기 위한 핵산의 방사선 표지를 수반한다. 유사하게, 안기오스타틴 수용체를 국재시키고, 시각화하며, 면역학적 조직화학 기술을 이용하여 정량할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 상세히 기술되며, 이는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위에 제한을 가하는 것으로 해석되어서는 아니된다. 이와 대조적으로, 본원의 기술을 이해한 후, 당업자가 제안할 수 있는 다양한 구체예, 변형 및 이와 동등물이 본 발명의 사상 및/또는 청구항의 범위 내에서 가능함이 명백히 이해되어야 할 것이다.

실시예 1

전이의 생장이 1차 종양에 의해 억제되며 1차 종양의 제거 후에 가속화되는, 동물-종양 시스템의 선택

자신의 전이를 억제할 수 있는 다양한 쥐 종양을 스크리닝함에 의하여, 루이스 폐암이 가장 효과적으로 폐 전이를 억제하는 1차 종양으로 선택된다. 6주된 신제닉(syngenic) C57BI6/J 수컷 쥐에 종양 세포 1 x 10⁶를 주입한다(등 피하 위치). 3 내지 4일 후에 먼저 육안으로 볼 수 있는 종양이 출현한다. 종양이 대략 1500 mm³크기일 때, 쥐를 무작위로 2그룹으로 나눈다. 1차 종양은 첫째 그룹에서 완전히 절개되며, 둘째 그룹에서는 모의 수술 후에 온전하게 보존된다. 500 mm³내지 3000 mm³의 종양이 전이 생장을 억제하지만, 높은 생존율 및 어떠한 국부적 재발로 가지지 않게 안전하게 적출될 수 있는 가장 넓은 1차 종양은 1500 mm³이다.

21일 후에, 모든 쥐는 도살되며 부검된다. 온전한 1차 종양을 품는 쥐에서, 사+2 육안 전이가 있으며, 이는 종양이 제거된 쥐에서의 오십+5 전이와 비교된다(p0.0001). 이들 데이타는 전술한 바와 같이 종양 무게와 밀접히 연관된 폐 무게에 의해 인증된다. 종양이 제거된 쥐 내에서 폐의 습무게가 400% 증가되었으며, 이는 종양을 온전히 보유하고 있는 쥐와 비교된다(p0.0001).

이 실험 모델은 생산적인 데이타를 제공하며 기술된 실험은 반복생산적이다. 이 종양을 루이스 폐암-저 전이(LLC-Low)(Lewis lung carcinoma-low metastasis)라 표지한다. 또한, 이러한 종양은 B 및 T 림프구가 결손된 SCID 쥐에서와 거의 동일한 방식으로 전이를 억압한다.

실시예 2

1차 종양의 제거 유무에 상관없이, 고도의 전이력을 지닌 루이스 폐암 변이체의 정제

고도의 전이력을 지닌 루이스 폐암의 변이체는 한 그룹의 쥐에서 실시예 1의 LLC-Low 세포주로부터 자발적으로 생겨나며, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 정제되며 반복하여 이식된다. 이러한 종양 (LLC-Low)은 일차 전이의 존재 유무에 상관없이 30개 이상의 육안으로 볼 수 있는 폐 전이를 형성한다.

실시예 3

전이의 크기 및 전이 내에서의 종양 세포의 증식율. 전이를 억제하는 1차 종양의 효과 (LLC-Low).

모든 실험에 C57BI6/J 쥐를 사용한다. LLC-Low 세포를 쥐의 피하에 접종하고, 14일 후 절반의 쥐에서 1차 종양을 제거한다. 종양을 제거시키고 5, 10, 15일째 되는 날, 쥐를 도살한다. 폐 전이의 조직을 떼어낸다. 온전한 1차 종양을 품는 쥐는 신혈관화(neovascularization)되지 않은 폐 안에 미세전이(micrometastasis)를 가진다. 이들 전이는 직경이 12 내지 15인 세포층에 국한되며 종양 제거 후 15일이 경과하여도 상당한 크기 증가를 보이지 않는다. 반대로, 1차 종양이 제거된 동물은 수술 후 5일째만에 큰 혈관화된 전이를 드러낸다. 이들 전이는 계속하여 증가하여 종양 제거 후 15일째에는 체적이 4배나 된다(폐 무게 및 조직에 의해 반영됨). 1차 종양이 제거된 대략 50%의 동물은 실험이 끝나기 전에 폐 전이에 의해 사망한다. 온전한 종양을 품는 모든 동물은 실험이 끝날때까지 모두 생존한다.

전이 내에서의 종양 세포의 복제율은 쥐내로 이전에 주입된 BrdU에 의해 염색된 핵을 측정함으로써 결정된다. 온전한 1차 종양을 품는 동물의 작고 비혈관 전이에서 BrdU를 통합하는 종양의 높은 백분율은 1차 종양이 제거된 쥐의 커다란 혈관화된 전이내의 종양 세포의 BrdU 통합과 등가이다(도 3). 이러한 발견은 1차 종양의 존재가 전이내에서 종양 세포의 복제율에 직접 영향을 주지 않음을 제시한다.

도 3에서, 남겨진 패널은 1차 종양의 존재 또는 부재하에서 폐 안의 종양 세포의 BrdU 표지 인덱스를 나타낸다. 면역조직화학 염색 전에, 단면에 0.2M의 HCl을 10분간 스며들게하고, 37℃에서 0.2M Tris-HCl, 2 mM CaCl₂내 1 ㎍/ml 단백질분해효소 K (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany)로 15분간 분해시킨다. 표지 인덱스는 250동력에서 양성 핵의 백분율을 계산함으로써 측정된다. 도 3의 오른쪽 패널은 수술 후 5, 10 및 15일째 온전한 1차 종양 또는 1차 종양이 제거된 종양의 총 폐 무게의 분석을 도시한다. 동물은 BrdU(0.75 mg/쥐)의 복강내 주입 후 6시간 후에 도살된다.

실시예 4

온전한 1차 종양의 존재 하에서 폐 전이 내 맥관형성(angiogenesis)의 억제

폐 전이에서의 혈관화 정도를 측정하기 위해서, 본 윌레브랜드 인자(von Willebrand factor; 내피 특이적 마커, 캘리포니아 카펜테리아의 Dako Inc.로부터 구입가능함)에 대한 항체를 사용하여 조직을 염색한다. 온전한 종양을 품는 동물로부터의 전이는 폐정맥 주변에 얇은 커프(8 내지 12 종양 세포층)를 형성한다. 정맥 라인의 내피 세포를 제외하고는, 어떠한 세포도 본 윌레브랜드 인자에 대해 양성을 나타내지 않는다. 반대로, 1차 종양이 제거된 후 5일째의 동물의 폐 전이는 클 뿐만 아니라, 또한 본 윌레브랜드 인자에 대해 강하게 염색되는 내피 세포를 함유한 모세 싹(capillary sprout)으로 침윤된다.

폐 전이 내 내피 세포의 존재에 대한 면역조직화학 분석법에서, 접종 후 19일째의 온전한 일차 폐 종양을 품는 폐 전이는 폐 안에서 소정맥에 주변에 선재하는 종양 세포 커프를 가진다. 전이는 8 내지 12 세포층에 국한된다. 소정맥 주변에서 신혈관화의 증거는 없으며, 임의의 새로운 소정맥을 함유하지 않는다. 이는 비혈관 선-맥관형성 전이의 최대 크기의 전형적이다.

1차 종양이 적출된 이후 5일째 수집된 조직에 대한 면역조직화학 분석법에서, 전이는 폐 안에 선재하는 정맥을 에워싼다. 반대로, 1차 종양이 적출되지 않은 샘플에서 종양은 신혈관화되지 않는다. 따라서, 온전한 1차 종양은 전이내 새로운 모세 혈정맥의 형성을 억제하지만, 전이 내에서 종양 세포의 증식은 1차 종양에 의해 영향받지 않는다.

실시예 5

1차 종양은 쥐 각막 내 이식된 2차 종양의 맥관형성을 억제한다. 이러한 2차 종양의 생장은 억제된다.

루이스 폐 종양(LLC-Low) 0.25 내지 0.5 mm²를 0일째 날에 쥐 각막에 이식한다[참고문헌: Muthukkaruppan Vr., et al., Angiogenesis in the mouse cornea. Science 205:1416-1418, 1979]. 각막 이식 전 4 또는 7일째; 또는 각막 이식한 날; 또는 각막 이식 후 4 또는 7일째에 1 x 10⁶LLC-Low 세포를 등 내 피하에 접종함으로써, 1차 종양을 형성한다. 대조군 쥐는 피하 종양이 아닌 각막 이식만 받는다. 다른 대조군 쥐는 각막 이식을 받고 각막 이식 전 4일째에 LLC-High 종양 세포로 등에 접종받는다. 각막 종양의 생장 및 각막 주변의 가장자리로부터의 새로운 모세 정맥의 생장을 알아보기 위해, 각막을 슬릿-램프 입체현미경으로 매일 평가한다(접안 마이크로미터에 의해 측정됨).

일차 피하 종양을 지니지 않은 대조군 쥐에서, 각막의 대부분(6/8)은 각막 이식 후 6 내지 7일째부터 시작하여 10일째까지 계속하여서 신혈관화를 발전시킨다. 10일 후에, 혈관화된 각막 종양은 전체 눈의 체적의 대략 1/4에 도달한다. 일차 피하 LLC-Low 종양의 존재하에서, 각막 이식체는 1차 종양이 각막 이식 전 4일째 또는 그 이전에 행해졌다면 혈관화되지 않는다(표 1). 맥관형성의 부재하에서, 각막 종양은 각막 내에서 얇고 하얀 비혈관 디스크처럼 천천히 생장한다.

하지만, 1차 종양이 각막 이식 후 4일째까지 이식되지 않았다면, 각막은 혈관화하며, 3/3 각막 종양은 비-종양을 품는 대조군과 같이 유사한 생장율로 자란다. 일차 피하 LLC-High의 존재하에서, 각막의 대부분(2/3)은 각막 이식 후 7일째에 맥관형성을 개시하며 10일까지 계속하여 발전하며, 혈관화된 각막 종양은 다시 전체 눈의 체적의 대략 1/4에 도달한다.

일차 피하 종양에 의한 각막내 종양 맥관형성의 억제[*(LLC-High)를 제외하고는 모든 1차 종양이 LLC-Low이다].

눈 이식일	0 0 0 0 0 0 0
일차 종양 이식일	-7 -4 -4* 0 없음 +4 +7
10일째 새로운 각막 정맥을 지닌 쥐의 수	2/10 0/9 2/3 2/3 6/8 3/3 2/3

일차 LLC-Low 피하 종양이 눈 종양 이식 전 7일째(즉, -7)에 이식되었을때에 0/10 각막이 맥관형성을 보이는 것으로 기대된다. 그러나, 종양 중 둘(2/10)은 그들이 훨씬 크기 때문에 괴사하게 된다(3 cm³).

실시예 6

일차 온전한 종양은 기본 섬유아세포 생장 인자(bFGF)의 이차 피하 이식에 의해 유도된 맥관형성을 억제한다.

실시예 5 및 6에 기재된 실험이 1차 종양이 이차 전이에서의 맥관형성을 억제하는 것을 보여주긴 했지만, 이러한 연구는 1차 종양이 (i) 내피 증식을 직접적으로 억제하는지, 또는 (ii) 전이성 종양 세포의 맥관형성 활성을 하향-조절에 의해 간접적으로 억제하는지에 대해서는 밝혀주지 못했다. 이러한 두 가지 가능성을 구별하기 위하여, 피하 맥관형성의 포커스는 기본 섬유아세포 생장 인자(bFGF)를 함유한 매트리젤(matrigel)을 이식함에 의하여 유도된다[참고문헌: Passaniti A, et al., 재구성된 기저막, 헤파린 및 섬유아세포 생장 인자를 사용한 맥관형성 및 항-맥관형성제의 단순 정량법. Lab. Invest. 67:519, 1992].

헤파린 존재하에서 25 내지 50 ng/ml의 bFGF를 함유한 매트리젤(기저막 단백질의 추출물)을 정상 쥐 및 종양을 품는 쥐(LLC-Low)의 배 표면상에 피하적으로 주입한다. 4일 후에 쥐를 도살하고 혈정맥 형성을 정량화하기 위하여 젤 내의 헤모글로빈 농도를 측정한다. 매트리젤로 진입하는 새로운 정맥의 수가 헤모글로빈 농도와 상관관계가 있다는 것이 이전에 밝혀진 바 있다[참고문헌: Folkman J., Angiogenesis and its inhibitors inImportant Advances in Oncology 1985, VTDeVita, S. Hellman and S. Rosenberg, editors, J.B. Lippincott, Philadelphia 1985]. 또한, 조직 검사를 위해 일부 조직을 준비한다. 정상 쥐에서, 50 ng/ml bFGF를 함유한 매트리젤 펠리트는 완전한 붉은색이다. 그들은 새로운 모세 정맥에 의해 크게 침해받으며 2.4 g/dl 헤모글로빈을 함유한다. bFGF가 결손된 매트리젤은 반투명 회색이며 단지 0.4 g/dl 헤모글로빈(6배 차이)만을 함유한다. 반대로, 1차 종양을 품는 쥐로부터의 매트리젤은 단지 0.5 g/dl만을 함유한다(도 4).

본 실험에서의 맥관형성의 거의 완전한 억제는 루이스 폐 1차 종양의 존재가 bFGF-유도 맥관형성을 직접 억제할 수 있음을 제시한다.

실시예 7

종양을 품는 동물로부터 1차 종양이 제거된 동물로의 혈청 전달은 전이를 억압한다.

전술한 바와 같이 루이스 폐암을 쥐에 이식한다. 15일 후, 종양이 대략 1500 mm³일 때, 쥐를 무작위로 4개의 그룹으로 나눈다. 세 개의 그룹은 1차 종양의 완전한 외과 적출을 실시하고; 나머지 한 그룹은 그대로 둔다(모의 외과 절차 후에). 그리고 나서, 세 개의 적출 그룹 내 쥐에 식염수, 정상적인 비종양 쥐로부터 얻은 혈청 또는 1500 mm³루이스 폐암을 지닌 쥐로부터 얻은 혈청을 매일 복강내 주입한다. 온전한 종양을 품는 쥐 그룹에는 복강내 식염수를 주입한다. 모든 쥐를 21일 동안 처리한 후, 쥐를 안락사시켜 폐 전이를 계산한다.

	일차 종양이 제거됨	온전한 일차 종양
처치(복강내 주사)	식염수	정상쥐로부터의 혈청	종양을 지닌 쥐로부터의 혈청	식염수 주입
폐 전이 수	55±5	50±4	7±2	3±1

상기 결과는 폐 무게에 의해 인증된다. 두 그룹[(5550) 대 (73)]간의 차이에 대한 p=0.0001. 종양을 품는 동물의 뇨로부터의 안기오스타틴을 사용하여 유사한 결과가 얻어진다.

실시예 8

소 모세 내피 (BCE) 세포(bovine capillary endothelial cell) 분석

BCE 세포는 9 내지 14 계대접종에서만 사용된다. 0째날, BCE 세포를 겔라틴(37℃에서 PBS 내 1.5% 겔라틴, 24시간동안 10%의 CO₂및 그리고 나서 0.5 ml PBS로 세정)화된 24 웰 플레이트에 12,500 세포/웰의 농도로 플레이팅한다. 헤모사이토미터를 사용하여 세포 측정을 수행한다. 10%의 열 무력화된(56℃에서 20분동안) 송아지 혈청 및 1% 글루타민-펜-스트렙(GPS)를 지닌 500 ㎕ DMEM 내에 세포를 플레이팅한다.

BCE 세포를 하기와 같이 챌린징한다: 매질을 제거하고 250 ㎕의 DMEM/5% BCS/1%GPS로 대체한다. 그리고 나서, 시험되는 샘플을 웰에 가한다. (양은 시험되는 샘플에 따라 다양하다) 대략 10분동안 37℃/10% CO₂에 플레이트를 둔다. 2 ng/ml bFGF를 지닌 250 ㎕의 DMEM/5% BCS/1% GPS를 각 웰에 가한다. 최종 매질은 1 ng/ml bFGF를 지닌 DMEM/5% BCS/1%GPS/ 500 ㎕이다. 플레이트를 다시 72시간동안 37℃/10% CO₂배양기에서 배양한다.

4일째, 매질을 제거하여 세포를 측정한 후, 모든 웰(0.5 ml 트립신/EDTA)을 2 내지 3분 동안 트립신화한다. 이후, 현탁된 세포를 9.5 ml 헤마탈을 지닌 신틸레이션 병으로 이송한 후, 쿨터 카운터를 사용하여 측정한다. 활성 단위는 내피 세포가 72시간동안 bFGF 1 ng/ml내에 배양될 때 모세 내피 증식의 1/2 최대 억제를 할 수 있는 안기오스타틴을 함유한 혈청량이다.

실시예 9

저 전이 루이스 폐 종양 (LLC-Low)를 지닌 쥐로부터 수득한 혈청이 시험관내에서 모세 내피 세포 증식을 억제한다.

72시간 증식 분석에서, 소 모세 내피 세피를 기본 섬유아세포 생장 인자 (bFGF 1 ng/ml)로 자극시킨다. 이들 배양체에 가해진 종양을 품는 쥐의 혈청은 투여량-의존적 및 가역적 방식으로 내피 세포의 증식을 억제한다. 정상 혈청은 억제적이지 않다(도 5). 내피 세포 증식은 종양을 품는 nu/nu 쥐 및 SCID 쥐로부터 수득된 혈청에 의해 유사한 방식(대조군과 비교시)으로 억제된다. 1차 종양이 제거된 후에, 안기오스타틴 활성은 3 내지 5일 후에 혈청으로부터 사라진다.

종양을 품는 혈청은 또한, 대동맥 내피 세포 및 자발적인 쥐 혈관내피종으로부터 유도된 내피 세포를 억제하나[참고문헌: Obeso, et al., 실험실 투자에서의 방법, 혈관내피종-유도된 세포주; 내피 세포 생물학의 연구를 위한 모델로서의 이의 이용, Lab Invest., 63(2), pgs 259-269, 1990], 루이스 폐 종양 세포, 3T3 섬유아세포, 대동맥 평활근 세포, 밍크 폐 내피, 또는 W 138 인간 태아 폐 섬유아세포를 억제하지는 못한다.

실시예 10

전이를 억제하지 않는 루이스 폐 종양(LLC-High)을 지닌 쥐로부터 수득한 혈청은 시험관내에서 모세 내피 세포 증식을 억제하지 않는다.

LLC-High의 1차 종양을 품는 쥐로부터 수득한 혈청은 대조군과 상대적으로 bFGF-자극된 소 모세 내피 세포의 증식을 상당히 억제하지 못한다. 또한, 이 혈청이 정제 과정(헤파린-세파로스 크로마토그래피 및 젤 여과)의 처음 두 단계에 처해졌을때, 어떠한 분획에서도 안기오스타틴 활성은 발견되지 않는다.

실시예 11

루이스 폐암으로부터의 복수증(ascite) 또한, 안기오스타틴 혈청을 생성케한다.

LLC-Low 또는 LLC-High 종양 세포(10⁶)로 쥐의 복강 내에 주입하고 1주일 후, 10 내지 20 마리의 쥐 각각으로부터 1 내지 2 ml의 혈액 복수증을 수득한다. 장간막 종양 발아가 보인다. 이후, 쥐를 안락사시킨다. 심장을 뚫어서 혈청을 수득한다. 또한, 정상, 비-종양 쥐로부터도 대조군으로서 혈청을 수득한다. 세포를 제거하기 위해 혈청 및 복수증을 원심분리시키고 상층액을 bFGF (1 ng/ml)에 의해 자극된 소 모세 내피 세포 상에서 분석한다(실시예 9 참조). 두 유형의 종양으로부터 기원하는 복수증은 72시간 후에 대조군 이상으로 모세 내피 세포의 상당한 증식(예; 100% 증식)을 자극한다(도 6). 반대로, 저 전이 쥐로부터 수득한 혈청은 내피 세포 증식을 억제한다(대조군의 79% 억제). 고 전이 주로부터 수득한 혈청은 200%씩이나 자극한다.

이러한 데이타는 저 전이 주가 안기오스타틴 이상의 우월한 내피 생장 자극제를 함유함을 보여준다. 이러한 조건은 고형 1차 종양과 유사하다. 더욱이, 안기오스타틴 활성은 마치 자극 활성에 의해 저항받지 않는 것 처럼, 혈청 내에서도 출현한다. 이러한 방식은 고형 1차 종양(LLC-Low)과 유사하다. 고 전이 종양(LLC-High)으로부터 수득한 복수증도 또한, 우월한 내피 세포 자극제를 함유하나, 안기오스타틴은 혈청 내에서 확인될 수 없다.

실시예 12

컬럼 크로마토그래피에 의한 혈청으로부터의 안기오스타틴의 분획법 및 SDS-PAGE에 의한 생장-억제 분획 분석법.

안기오스타틴을 정제하기 위하여, 혈청을 종양을 품는 쥐로부터 수집한다. 전술한 시험관 내 억제 인자 활성 분석법에 따라 분석한 억제 활성을 헤파린 세파로스, 바이오겔 AO.5mm 아가로스, 및 C4-역전상 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)의 여러 사이클을 사용하여 순차적으로 크로마토그래피한다. 내피 억제 활성을 함유한 HPLC 분획의 SDS-PAGE는 38,000 달턴의 뚜렷이 감소된 M_r의 분명한 밴드를 드러내는데, 이는 대략 100만-배(표 3 참조) 정제되어 대략 2 x 10⁷의 특이 활성을 나타낸다. 정제의 상이한 단계에서, 수집된 분획을 기지의 내피 억제 인자의 존재에 대한 특이 항체로 시험한다. 혈소판 인자-4, 트롬보스폰딘, 또는 형질전환 생장인자 베타는 정제된 분획 내에서 발견되지 않는다.

	특이 활성 (단위^*/mg)	정제 배수
혈청헤파린 세파로스바이오-겔 AO.5mHPLC/C4	1.6914.9269.962 x 10⁷	18.841.41.2 x 10⁶

* 활성 단위는 내피 세포가 72시간동안 bFGF 1 ng/ml내에 배양될 때 모세 내피 증식의 1/2-최대 억제를 할 수 있는 안기오스타틴을 함유한 혈청량이다.

실시예 13

컬럼 크로마토그래피에 의한 뇨로부터의 안기오스타틴의 분획법 및 SDS-PAGE에 의한 생장-억제 분획의 분석법

혈청으로부터 내피 세포 억제 인자의 정제는, 각 쥐로부터 수득될 수 있는 혈청이 소량이고 혈청 내에 단백질이 다량이란 점에서 방해받는다.

종양을 품는 쥐로부터 수득된 뇨를 분석한 결과, 비-종양 쥐의 뇨 및 LLC-high 종양을 품는 쥐에 부재한 내피 세포 증식의 억제 인자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 내피 세포 억제 활성의 정제는 전술한 혈청 정제에 사용된 동일 전략에 의하여 수행된다(도 7).

도 7은 종양을 품는 동물로부터 수득한 부분 정제된 혈청 또는 뇨의 C4 역전 상 크로마토그래피를 도시한다. 모든 분획은 실시예 9에 기재된 72-시간 증식 분석법에서 bFGF를 지닌 소 모세 내피 세포 상에서 분석된다. 억제의 불연속 피크는 분획 23 내의 30 내지 35% 아세토니트릴에서 용출하는 양 경우에서 보여진다. 종양을 품는 동물로부터 수득한 혈청의 C4 역상 크로마토그래피의 3회 사이클로부터의 억제 분획의 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동은 약 38,000 달턴에서 단일 밴드를 나타낸다.

실시예 14

순환하는 안기오스타틴의 규명

실시예 9에 기재된 절차에 따라 내피 억제를 분석한다. 안기오스타틴을 신크로팩(Synchropak) HPLC C4 컬럼상에서 정제한다(참고; Synchrom, Inc. Lafayette, IN). 30 내지 35% 아세토니트릴 구배에서 억제 인자를 용출한다. 환원 조건(b-머캡토에탄올(5% v/v)하의 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(PAGE) 겔 상에서, 활성 단백질 밴드를 38 킬로달턴 지점에서 용출한다. 비-환원 조건 하에서, 활성 단백질을 28 킬로달턴 지점에서 용출한다. 활성은 초기 샘플이 뇨 또는 혈청으로부터 정제되었는지에 관계없이 유사한 지점에서 발견된다. 활성은 임의의 다른 밴드에서는 탐지되지 않는다.

밴드와 결부된 활성은 가열(100℃에서 10분동안) 또는 트립신 처리시에 잃어버린다. 활성을 지닌 밴드를 물/클로로포름 혼합물(1:1)으로 용출하였을때, 수성상에서만 활성이 발견된다.

실시예 15

인간 플라스미노겐으로부터 수득된 억제 단편의 정제

플라스미노겐 리신 결합좌 I는 시그마 화학 회사로부터 수득한다. 엘라스타아제로 분해한 후, 정제된 인간 플라스미노겐을 준비한다. 이러한 방식으로 수득된 리신 결합좌 I는 플라스민 A-체인(Kringle 1+2+3) 내 최소한의 첫째 세 개의 트리플-루프 구조(1 부터 3번)를 집합체로 함유한 단백질 군이다[참고문헌: Sotrrup-Jensen, L., et al. inProgress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3, 191, Davidson, J.F., et al. eds. Raven Press, New York 1978 and Wiman, B., et al., Biochemica et Biophysica Acta, 579, 142 (1979)]. 플라스미노겐 리신 결합좌 I (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo)를 물내 재현탁하고 HPLC-grade 물/0.1% TFA로 평형된 C4-역상 컬럼에 적용한다. 컬럼을 물/0.1% TFA 대 아세토니트릴/0.1% TFA 구배로 용출하고 난 뒤, 분획을 폴리프로필렌 튜브내로 수집한다. 각각의 표본을 스피드 백에서 증발시키고, 물로 재현탁하고, 증식 분석에서 BCE에 적용시킨다. 이러한 절차는 용출용 유사 구배를 사용하는 억제 분획을 위하여 2회 반복 실시된다. 억제 활성은 C4 컬럼의 최종 운전시 30 내지 35% 아세토니트릴에서 용출한다. 억제 분획의 SDS-PAGE는 40, 42.5 및 45 kd의 자명하게 감소된 분자량의 3개의 불연속 밴드를 드러낸다. 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE는 각각 분자량 30, 32.5 및 35 kd의 세 개의 밴드를 드러낸다.

실시예 16

SDS-PAGE로부터의 억제 활성의 추출

인간 플라스미노겐 기저 정제로부터의 정제된 억제 분획을 비-변성 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 용해시킨다. 동일 샘플과 함께 적재된 주변 레인에서 은 염색에 의해 보이는 밴드에 상응하는 겔 지역을 겔로부터 절개하여 폴리프로필렌 튜브내에서 12시간동안 4℃의 포스페이트 완충 식염수 1 ml내에서 항온시킨다. 상충액을 제거하고 6시간동안 식염수로 2회 투석하고(MWCO=6-8000) 6시간동안 증류수로 2회 투석한다. 투석액을 진공 원심분리에 의해 증발시킨다. 생성물을 식염수 내에서 재현탁시키고 72시간 분석법에서 1 ng/ml의 기본 섬유아세포 생장 인자에 의해 자극된 소 모세 내피 세포에 적용시킨다. 각각의 세 개의 밴드로부터 추출된 단백질은 모세 내피 세포를 방해한다.

실시예 17

플라스미노겐 단편 처리 연구

쥐에 루이스 폐암을 이식하여 종양이 1500-2000 mm³일 때 절개한다. 수술하는 날, 쥐를 각각 6마리씩 무작위로 6개의 그룹으로 나눈다. 쥐에 인간 플라스미노겐의 세 개의 정제된 억제 단편, 전체 인간 플라스미노겐, 종양을 품는 동물로부터의 뇨, 정상 쥐로부터의 뇨, 또는 식염수로 매일마다 복강내 주입한다. 모의 절차만을 가진, 종양을 품는 동물의 한 그룹은 식염수 주입으로 처리된다. 1차 종양 제거 후 즉시, 쥐에 적재 투여량으로서 억제 플라스미노겐 단편 24 ㎍ (1.2 mg/kg/일/쥐)을 복강 내 주입한다. 그리고나서, 실험 지속동안 억제 단편 12 ㎍ (0.6 mg/kg/일/쥐)을 매일 복강 내 주입한다. 대조군 쥐는 종양 제거 후, 전체 플라스미노겐 분자의 동일 투여량을 받는다. 뇨 처리를 위해, 정상 또는 종양을 품는 쥐의 뇨를 여과시키고, 광범위하게 투석시키고, 동결 건조시킨 뒤, 멸균수 내에서 재현탁하여 250배의 농축을 수득한다. 1차 종양의 제거 날에, 쥐에 하중 투여량으로서 종양을 품는 쥐 또는 정상 쥐로부터 투석된 뇨 농축액 0.8 ml를 두차례 복강 내 주입한다. 그리고 나서, 이들에게 실험 과정동안 투석 및 농축 뇨 0.4 ml를 매일 복강 내 주입한다. 처리는 모든 쥐가 도살 및 부검되는 지점까지 13일동안 계속된다.

실험 결과는 도 8 및 도 9에 도시된다. 도 8은 13일간 처리 후에 표면 폐 전이를 나타낸다. 표면 폐 전이는 부검시 쥐의 폐내에서 보이는 전이 수를 언급한다. 입체현미경이 전이를 측정하기 위해 사용된다. 도 8은 측정되는 표면 폐 전이수의 평균과 평균의 표준 오차를 나타낸다. 도시한 바와 같이, 1차 종양이 존재하는 쥐 그룹은 아무런 전이를 보이지 않는다. 1차 종양이 적출되고 식염수로 처리된 쥐는 광범위한 전이를 보인다. 인간 유도된 플라스미노겐 단편으로 처리된 쥐는 전이를 전혀 보이지 않는다. 전체 플라스미노겐으로 처리된 쥐는 광범위한 전이를 보이는데, 이는 전체 플라스미노겐 분자가 내피 억제 활성을 전혀 가지지 못함을 가리킨다. 종양을 품는 쥐로부터의 투석 및 농축 뇨로 처리된 쥐는 전혀 전이를 보이지 않는다. 정상 쥐로부터의 농축 뇨로 처리된 쥐는 광범위한 전이를 보인다. 폐 무게를 측정할 때, 유사한 결과가 수득된다(도 9).

실시예 18

쥐 및 인간 안기오스타틴의 아미노산 서열

쥐 뇨로부터 분리된 안기오스타틴의 아미노산 서열 및 인간 리신 결합좌 I 단편 제조로부터 분리된 안기오스타틴은 응용 바이오시스템 모델 477A 단백질 시퀀서 상에서 결정된다. 페닐티오히단토인 아미노산 분획은 온-라인 ABI 모델 120A HPLC와 함께 규명된다. 쥐 및 인간 안기오스타틴의 N-말단 서열과 트립신 분해로부터 결정된 아미노산 서열은 안기오스타틴의 서열이 쥐 플라스미노겐 아미노산 번호 98에서 개시하는 서열과 유사함을 가리킨다. 이리하여, 안기오스타틴의 아미노산 서열은 환원성 폴리아미드 겔 상에서 측정되는 바와 같이, 대략 38 kd 내지 45 kd 사이의 분자량을 지니며 온전한 쥐 플라스미노겐 분자의 아미노산 번호 98에서 개시하는 쥐 플라스미노겐 단편의 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 가진 단백질을 포함하는 분자이다. 쥐 안기오스타틴 (서열 번호: 2)의 아미노산 서열의 개시부는 도 1에 도시되어 있다. 아미노산 서열의 길이는 도 1에 도시된 바 보다 약간 길거나 짧을 수 있다.

인간 리신 결합좌 I (실시예 15 참조)의 활성 분획의 N 말단 아미노산 분석 및 트립신 분해는 분획의 서열이 인간 플라스미노겐의 대략 97 또는 99 지점에서 개시하며 인간 안기오스타틴이 쥐의 안기오스타틴과 상동임을 나타낸다. 인간 안기오스타틴의 아미노산 서열 개시부(아미노산 98에서 개시)는 도 2에 도시되어있다(서열 번호: 3). 인간 및 쥐 안기오스타틴의 아미노산 서열은 돼지, 소 및 붉은털 원숭이 플라스미노겐을 포함하여 기타 종의 플라스미노겐으로부터의 상응하는 내부 아미노산 서열과 도 2에서 비교되는데, 이들 종 내에서 안기오스타틴의 존재를 가리킨다.

실시예 19

이. 콜라이에서의 인간 안기오스타틴의 발현

pTrcHisA 벡터(Invitrogen)(도 10)가 이. 콜라이에서의 진핵 유전자의 증진된 해독 효율을 위한 trc 프로모터로부터의 고-수준의 조절된 전사를 얻고자 사용된다. 발현되는 안기오스타틴은 금속 친화 수지를 사용하여 한 단계 정제를 위한 N-말단 니켈-결합 폴리-히스티딘 꼬리에 융합된다. 이 융합 단백질내 엔테로키나아제 절단 인식 좌는 정제된 재조합 단백질로부터 N-말단 히스티딘 융합 단백질의 순차적 제거를 가능케한다. 재조합 인간 안기오스타틴 단백질은 리신에 결합된 채 발견되며, 크링글 영역 1, 2 및 3에 특이적인 단일 클론 항체와 가교-반응하며, 시험관내에서 bFGF-유도 내피 세포 증식을 억제한다.

삽입물을 작제하기 위하여, 인간 안기오스타틴을 암호화하는 유전자 단편을 인간 간 mRNA로부터 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 특이적 프라이머를 사용하여 역전사 및 증폭시켜 수득한다. 1131 염기쌍의 산물은 인간 플라스미노겐의 93 부터 470의 아미노산을 암호화한다. 증폭된 단편은 pTrcHisA의 XhoI/KpnI 좌 내로 클로닝되며, 이 작제물은 XL-1B(Stratagene으로부터 구입가능) 이. 콜라이 숙주 세포 내로 형질전환된다. 플라스미드 벡터 pTrcHisA만을 함유한 대조 클론은 마찬가지로 XL-1B 이. 콜라이 숙주 세포내로 형질전환된다. 이 클론을 벡터 대조 클론으로 언급하기로 한다. 양 클론은 하기에 기술되는 바와 같이 동일하게 정제된다.

발현하는 콜로니를 하기의 방식으로 선별한다. 안기오스타틴 암호화 유전자로 형질전환된 이. 콜라이의 콜로니 리프트는 IPTG 함침 니트로셀룰로오스 필터상에서 자라고 LB 한천 플레이트상에서 덧씌워진다. IPTG 유도 발현에 뒤따라서, 콜로니는 니트로셀룰로오스 필터상에서 용균된다. 니트로셀룰로오스 리프트는 블록킹되고, 세정되며 안기오스타틴의 특이적 구조를 인식하는 두 개의 개별 단일 클론 항체(mAbs Dcd and Vap; gift of S.G. McCance and F.J. Castellino, University of Notre Dame)를 사용하여 탐침된다. mAb에 의해 인식되는 강하게 발현되는 콜로니를 선별한다.

최대 발현을 위한 최적의 시간을 확인하기 위해서, 세포를 IPTG 유도 전 후의 다양한 시간에서 수집하여 반복적인 프리즈-쏘오 사이클(freeze-thaw cycle)에 노출시킨 뒤, SDS-PAGE, 면역블로팅 및 mAbs Dcd and Vap로의 탐침에 의해 분석한다.

이로부터, pTrcHisA/HAsH4 클론이 선택된다. IPTG와의 유도는 세포 펠리트가 수집되고 50 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, 5% 글리세롤 및 200 mg/ml 리소자임에서 재현탁되고 4℃에서 30분간 휘저은 후, 4시간 동안이다. 슬러리를 25분간 14,000 rpm에서 원심분리하고 펠리트를 50 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, 5% 글리세롤 및 0.1% DOC내에서 재현탁시킨다. 이러한 현탁액을 4℃에서 1시간동안 휘젓고 나서, 25분간 14,000 rpm에서 원심분리한다. 이 단계에서의 상층액 분획은 발현된 안기오스타틴을 함유한다. 이리하여 이. 콜라이 발현된 인간 안기오스타틴은 한 단계의 리신-세파로스(Pharmacia 또는 Sigma) 컬럼 상에서 정제된다. 컬럼으로부터의 안기오스타틴의 용출은 pH 7.5의 0.2 M 엡실론-아미노-n-카프로산에 의한다.

후속 실험은 pTrcHisA/HAsH4 클론의 규모가 커진 10 L 발효 배치에서 수행된다. 이러한 큰 규모의 유도로부터 수득된 세포는 펠리트화되고, pH 7.5의 50 mM Tris 내에서 재현탁되고, 10℃ 내-사이 통로에서 10,000 psi 3회 냉각에서 분쇄된다. 수득된 용균물을 4℃에서 30분간 10,000 rpm에서 원심분리하여 뚜렷이하고, 발현된 안기오스타틴을 리신-세파로스 상에서 분리시킨다(도 11).

정제된 이. 콜라이 발현 인간 안기오스타틴은 물로 철저히 투석시키고 동결건조시킨다. 발현된 인간 안기오스타틴을 배지(DMEM, 5% BCS, 1% 젠타마이신/페니실린/스트렙토마이신)에서 재현탁하여 3 ㎍/ml 농축물을 만들어 실시예 8에 기재된 바와 같이 시험관 내에서 소 모세 내피(BCE) 세포 분석에 사용한다. 유사하게, 벡터만을 함유한 대조 클론을 pTrcHisA/HAsH4 클론과 동일한 방식으로 처리한다. 이는 IPTG와 동일하게 유도되며, 박테리아 용균물은 리신에 결합하는데 사용되며, 0.2 M의 아미노 카프로산으로 용출되며, 철저히 투석되며 동결건조된다. 대조군 역시 3 ㎍/ml의 농도의 배지내에서 재현탁시킨다. 재조합 안기오스타틴 샘플 및 대조군은 상이한 유도 및 발효 배치로부터 수득되며, 또한 개별 정제 운전되며, EntreMed, Maryland에서 모두 암호화된다. 보스턴의 Children's Hospital에서 블라인드 방식으로 이들 암호화 샘플과 함께 BCE 분석을 수행한다.

재조합 인간 안기오스타틴의 BCE 분석 결과는 이. 콜라이에서 발현되는 인간 안기오스타틴이 bFGF(1 ng/ml에서 사용됨)에 기인하여 BCE 세포의 증식을 억제하는 것을 보여준다(도 12). 배지(약 3 ㎍/ml에서)내 원액 재조합 안기오스타틴은 1:5, 1:10 및 1:20 희석에서 사용된다. 억제 %는 하기와 같이 계산된다:

안기오스타틴과의 세포 수 - 0 째날의 세포 수

1-

bFGF 단독과의 세포 수 - 0 째날 세포 수

BCE 세포 증식의 억제 %는 유사 농도에서 플라스미노겐 유도된 안기오스타틴의 억제 %와 비슷하거나 높다. BCE 분석의 반복 운전으로부터 수득된 결과는 도 13에 도시되어 있으며, 원액 1:5 희석에서 재조합 안기오스타틴은 플라스미노겐 유도된 안기오스타틴으로 수득된 억제 %와 유사한 억제 %를 제공한다. 도 13은 인간 재조합 안기오스타틴 단백질이 배양에서 BCE 증식의 60% 이상, 75% 만큼 이상을 억제한다는 놀라운 결과를 제시한다.

실시예 20

안기오스타틴은 아팝토시스(apoptosis) 비율을 증가시킴에 의해 미세전이의 휴지상태를 유지한다.

C57 BL6/J 쥐에 루이스 폐암 세포(1 x 10⁶)를 복강내 접종한 다음에, 대략 1.5 cm³의 1차 종양이 만들어진다. 동물을 1차 종양의 외과 제거 또는 모의 수술하도록 한다. 수술 후 5, 10 및 15일째 쥐를 도살하고 조직학 검사를 위해 폐를 준비한다. 1차 종양이 적출된 동물은 모의 조작된 대조군과 비교시 미세전이의 광범위한 증식을 보인다(도 14). 이러한 변화는 폐 무게의 상당한 증가에 의해 수반된다.

브로모-데옥시우리딘(BrdU)의 흡수에 의해 측정되는 종양 세포 증식의 분석은 5, 9 및 13일째 온전한 1차 종양을 품는 동물 또는 1차 종양이 적출된 동물 사이에 아무런 차이가 없다는 것을 보여주는데, 이는 증가된 증식이 종양 무게에서의 증가를 설명할 수 없다는 것을 가리킨다(도 15). 따라서, 이들 동물에서 세포 사(killing)가 검사되었다. 아팝토시스, 즉, 유전자 발현에서의 변화에 의존하고 발생 동안과 소장과 같은 빠르게 증식하는 조직에서 세포 제거를 설명하는 세포 사 과정이 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(TdT) 기술로 면역조직학적으로 표지된 단편 DNA에 의해 검사된다. 아팝토시스 인덱스는 각 도살 시점에서 결정된다. 1차 종양의 제거는 검사된 모든 시간의 안락사 인덱스에서 통계학적으로 의미있는 증가(대략 3 내지 4배)를 야기한다.

1차 종양이 제거된 쥐를 외래성 맥관형성 억압자(suppressor)로 처리함에 의해 지지 증거가 수득된다. 이 물질, TNP-1470 (O-클로로아세틸카르바모일 퓨마길롤, 예전에는 AGM-1470으로 명명됨)은 보고된 항-맥관형성 활성을 지닌 퓨마질린의 동족체이다. TNP-1470 (30 mg/kg 이틀)의 피하내 주입에 의해 온전한 1차 종양을 품는 동물에 대해 전술한 것과 놀라울 정도로 유사한 결과가 얻어진다. 이들 동물들은 식염수-유도된 대조군보다 낮은 폐 무게, 비슷한 증식 인덱스 및 증가된 아팝토시스 인덱스를 보인다.

이들 데이타는 종양 세포 증식이 세포 괴사율과 동일하게 균형을 이룰 때 전이가 휴지 상태로 유지됨을 가리킨다. 1차 종양의 제거는 전이 생장에 있어서 급격한 증가를 초래하며, 아마도 이는 종양 세포내에 아팝토시스 증가에 의해 전이 생장을 조절하는 맥관형성 억제 인자(안기오스타틴)의 제거에 기인한다. 이러한 효과는 1차 종양의 제거 및 외래성 맥관형성 억제 인자의 투여에 뒤따라서 나타나는 것과 유사하다. 함께 고려하여, 이들 데이타는 1차 종양이 미세전이의 휴지 상태를 유지하는 안기오스타틴을 해방시켜줌을 제시한다.

실시예 21

생체내 안기오스타틴으로 1차 종양의 치료

상기 실시예 15에서 기술된 제한된 엘라스타아제 분해에 의해 인간 플라스미노겐으로부터 안기오스타틴을 정제한다. 안기오스타틴을 포스페이트-완충 식염수에서 재현탁하여 6주된 수컷 C57BI6/J 쥐에 투여한다. 루이스 폐암 또는 T241 파이브로사코마(섬유육종, fibrosarcoma)의 1 x 10⁶종양 세포를 동물 피하에 이식한다. 종양이 80 내지 160 mm³크기가 되었을 때, 4일 후에 안기오스타틴으로 처리하기 시작한다. 쥐는 복강내(ip) 또는 피하(sc) 경로를 통해 40 mg/kg 또는 80 mg/kg의 안기오스타틴을 한 차례 주입받는다. 처리 후 19일 후에 다양한 시간대에서 동물을 도살한다.

40 mg/kg ip로 매일 투여된 안기오스타틴은 T241 1차 종양의 생장에 있어서 고도로 상당한 억제를 만든다(도 17). 생장에 미치는 억제 효과는 이틀 내에 뚜렷하게 나타나며, 연구 시간에 걸쳐서 크기에 있어서 증가된다. 18일째, 안기오스타틴-처리된 쥐는 식염수 주입된 대조구 체적의 대략 38%를 차지한다. 이 차이는 통계학적으로 유효하다(p0,001, 학생 t-테스트).

안기오스타틴 처리(총 투여량 80 mg/kg/일, 매일 40 mg/kg ip 또는 sc로 두 번 투여) 역시, LLC-LM 1차 종양의 생장율을 상당히 감소시켰다(도 17). 억제 효과는 4일째 증명되며, 이후의 검사 시간에서 모두 크기가 증가하였다. 실험의 마지막날(19일째), 안기오스타틴-처리된 쥐는 식염수-주입된 대조군의 20%에 불과한 평균 종양 체적을 소지하며, 이는 상당히 다르다(p0.001, 학생 t-시험).

또 다른 일련의 실험에서, 안기오스타틴을 T241 파이브로사코마, 루이스 폐암 (LM) 또는 레티큘럼 세포 사코마 세포로 이식된 쥐에 투여한다. 각 유형의 종양 세포에서, 안기오스타틴을 받은 쥐는 실질적으로 감소된 종양 크기를 가진다. 도 19는 T241 파이브로사코마의 경우, 24일째에 안기오스타틴 처리된 쥐가 미처리된 쥐의 15%에 불과한 평균 종양 체적을 가짐을 가리킨다. 도 20은 루이스 폐암 (LM)의 경우, 24일째에 안기오스타틴 처리된 쥐가 미처리된 쥐의 13%에 불과한 평균 종양 체적을 가짐을 가리킨다. 도 21은 레티큘럼 사코마의 경우, 24일째에 안기오스타틴 처리된 쥐가 미처리된 쥐의 19%에 불과한 평균 종양 체적을 가짐을 가리킨다. 이 데이타는 각 시점에서 4마리 쥐의 평균을 나타낸다.

이러한 결과는 안기오스타틴이 생체내에서 세 종의 상이한 1차 종양의 생장에 있어서 유력한 억제 인자임을 가리킨다.

실시예 22

생체내에서 안기오스타틴으로 쥐 내에서 인간 세포-유도된 1차 종양의 처리

인간 전립선암 PC-3 및 인간 유방암 MDA-MB에서 인간 종양 세포주 상에서의 안기오스타틴의 효과를 연구하였다. 면역결핍 SCID 쥐에 인간 종양 세포를 이식하고, 실시예 21에 기술된 바와 같이 실질적으로 12 시간마다 50 mg/kg 안기오스타틴으로 쥐에 처리하였다. 결과는 본 발명의 안기오스타틴 단백질이 인간 종양 세포 생장의 잠재적 억제자임을 보여준다. 도 22는 인간 전립선암 PC-3의 경우, 24일째에 안기오스타틴 처리된 쥐는 미처리된 대조구 쥐와 비교시 평균 종양 체적의 2%만을 가짐을 보여준다. 도 23은 인간 유방암 MDA-MB의 경우, 24일째에 안기오스타틴 처리된 쥐는 미처리된 대조구 쥐와 비교시 평균 종양 체적의 8%만을 가짐을 보여준다.

실시예 23

유전자 치료-종양 체적 상에서의 안기오스타틴 유전자의 형질감염 효과

쥐 플라스미노겐 아미노산 1-460을 암호화하는, 쥐 플라스미노겐 cDNA (American Type Culture Collection(ATCC)로부터 수득함)로부터 유도된 안기오스타틴에 대한 1380 염기쌍의 DNA 서열을 PCR를 사용하여 증폭시켜 발현 벡터 내로 삽입한다. 발현 벡터를 T241 파이브로사코마 세포내로 형질감염시키며, 형질감염된 세포를 쥐 내로 이식한다. 대조군 쥐는 비-형질감염된 T241 세포 또는 벡터만으로 형질감염된 T241 세포(즉, 비-안기오스타틴 발현하는 형질감염 세포)만을 받는다. 세 개의 안기오스타틴-발현 형질감염된 세포 클론이 본 실험에 사용된다. 평균 종양 체적이 시간에 걸쳐서 측정된다. 결과는 안기오스타틴을 발현하는 세포 클론이 비-형질감염 및 비-발현 대조구 세포와 비교시 쥐에서의 평균 종양 체적에 있어서 놀랄만하고 상당한 감소를 보였다.

쥐 안기오스타틴 단백질을 암호화하는 쥐 DNA 서열은 쥐 플라스미노겐 cDNA로부터 유도된다. 쥐 안기오스타틴은 쥐 플라스미노겐 크링글 영역 1-4을 망라한다. 이 클론을 작제하는 도식도는 도 24에서 보여진다.

쥐 안기오스타틴 단백질 클론을 LIPOFECTIN^TM형질감염 시스템(메릴랜드 게이더스버그의 라이프 테크놀러지즈사로부터 구입가능)을 사용하여 T241 파이브로사코마 세포내로 형질감염시킨다. LIPOFECTIN^TM시제는 막여과수 내에 양이온 지질 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-n,n,n-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA) 및 디올레코일 포스포티딜에탄올아민(DOPE)의 1:1 (w/w) 리포좀 처방약이다.

세포의 일시적 형질감염 절차는 하기와 같다:

1. T241 세포를 60 cm²조직 배양 디쉬에서 혈청이 보충된 적절한 생장 배지 2 ml에서 자라게한다(seed=1-2 x 10⁵세포).

2. 37℃, CO₂배양기에서 세포가 40 내지 70% 융합할 때까지 세포를 배양시킨다. 대개 18 내지 24 시간이 소요되나, 세포 유형에 따라 소요 시간이 다양할 수 있다. T241 종양 세포 융합은 대개 70%이다.

3. 12 x 75 mm 멸균 튜브에 하기의 용액을 준비한다:

A 용액: 각각의 형질감염을 위하여, 혈청-자유 OPTI-MEM I 감소된 혈청 배지(OPTI-MEM I Reduced Serum Medium, 라이프 테크놀러지즈사로부터 구입가능)(조직 배양 등급 탈이온수 역시 사용된다) 100 ㎕ 내 DNA 5 ㎍ 희석액.

B 용액: 각각의 형질감염을 위하여, OPTI-MEM 배지 100 ㎕ 내 LIPOFECTIN 30 ㎍ 희석액.

4. 두 용액을 조심히 섞으면서 결합시킨 다음, 10 내지 15분간 실온에서 배양한다.

5. 혈청-자유 배지로 세포를 2회 세척한다.

6. 각각의 형질감염을 위하여, 혈청-자유 배지 0.8 ml를 LIPOFECTIN^TM시제-DNA 혼합물을 함유한 각각의 튜브에 가한다. 조심히 섞은 다음, 혼합물을 세포 위에 덧씌운다.

7. 37℃, CO₂배양기에서, 대략 12시간동안 세포를 배양한다.

8. 배지를 함유한 DNA를 혈청을 함유한 1 mg/ml 선택 배지로 대체하고 48 내지 72 시간동안 37℃, CO₂배양기에서 세포를 배양한다.

9. 48 내지 72 시간 후-형질감염에서 유전자 활성을 위해 세포 추출물을 분석한다.

형질감염된 세포를 안기오스타틴-특이 항체를 사용하여 안기오스타틴 단백질 발현에 대한 분석을 할 수 있다. 대안적으로, 약 10 내지 14일 후에, G418 내성 콜로니가 CMV-안기오스타틴 형질감염된 T241 세포 내에서 출현한다. 또한, 많은 클론이 비형질감염된 클론이 아닌 형질감염된 클론 벡터내에서만 보인다. G418 내성 클론은 면역형광법을 사용하여, 안기오스타틴의 발현을 위해 선택된다.

흥미롭게도, 안기오스타틴으로 형질감염된 T241 세포 및 루이스 폐 세포의 시험관내 세포 생장은 도 25 및 도 26에서 보여지는 바와 같이 억제되거나 달리 불리하게 영향받지 않는다.

도 27은 형질감염 실험 결과를 도시한다. 모든 세 개의 안기오스타틴-발현 T241 형질감염된 클론은 쥐에서 대조구 쥐에서의 종양 체적에 비하여 실질적으로 감소된 평균 종양 체적을 생성한다. 클론 37로 이식된 쥐의 평균 종양 체적은 대조구의 13%에 불과한 반면에, 클론 31 및 클론 25 종양 체적은 각각 대조구 종양 체적의 21% 및 34%에 불과하다. 이러한 결과는 안기오스타틴 암호화 DNA 서열이 세포내로 형질감염될 수 있고, 형질감염된 DNA 서열이 이식된 세포에 의해 안기오스타틴 단백질을 발현할 수 있으며 발현된 안기오스타틴이 생체내에서 종양 생장을 감소시키는 기능이 있음을 가리킨다.

실시예 24

안기오스타틴 발현 좌의 생체내 국재

안기오스타틴 단백질의 발현 좌를 생체내 국재시키기 위해서, 신규 종양 또는 수 회 계대접종 후의 세포 배양으로부터의 루이스 폐암 세포(쥐), T241 파이브로사코마(쥐), 및 Burkitt's 림포마 세포의 다양한 세포 유형으로부터의 총 RNA를 안기오스타틴 전사체의 존재를 확인하기 위해 분석한다. 샘플의 노던 분석은 쥐 플라스미노겐에 상응하는 대략 2.4 kb의 단일 시그널을 보이는 정상 쥐 간 RNA에서의 시그널을 제외하고는, 모든 샘플로부터 서열과 혼성화하는 임의의 시그널이 부재함을 보여준다. 인간 샘플의 노던 분석은 인간 플라스미노겐에 상응하는 대략 2.4 kb의 단일 시그널을 보이는 정상 인간 간 RNA의 시그널을 제외하고는, 모든 샘플로부터 인간 안기오스타틴 서열과 혼성화할 수 있는 임의의 시그널이 부재함을 보여준다.

역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 분석은 정상 쥐 간의 산물을 제외하고는, 쥐 안기오스타틴 서열로 탐침된 모든 샘플로부터 임의의 산물이 부재함을 보여준다. RT-PCR 분석은 정상 인간 간의 산물을 제외하고는, 인간 안기오스타틴 서열로 탐침된 모든 샘플로부터 임의의 산물이 부재함을 보여준다(쥐에서는 1050 bp 및 인간에서는 1134 bp의 크기가 기대됨).

이리하여, 쥐 안기오스타틴 전사체(쥐 플라스미노겐의 97 내지 450 아미노산과 동일할 것으로 추측됨)는 상기 모든 쥐 샘플에 의해 생성되지 않으며, 인간 안기오스타틴 전사체(인간 플라스미노겐의 93 내지 470 아미노산과 동일할 것으로 추측됨)는 상기 모든 인간 샘플에 의해 생성되지 않는다. 정상 쥐/인간 간에서 수득되는 양성의 시그널은 플라스미노겐과의 혼성화로부터 유도된다.

실시예 25

효모에서의 안기오스타틴의 발현

인간 플라스미노겐 93 내지 470 아미노산 암호화 유전자 단편은 pHIL-SI(Invitrogen)의 XhoI/EcoRI 좌 내로 클로닝되어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)효모내 PHO1 분비 시그널을 사용하여 단백질의 분비된 발현을 가능케한다. 유사하게, 인간 플라스미노겐 93 내지 470 아미노산 암호화 유전자 단편을 pPIC9(Invitrogen)의 SnaBI/EcoRI 좌 내로 클로닝되어, 피치아 파스토리스 효모 내에서 a-인자 분비 시그널을 사용하여 단백질의 분비된 발현을 가능케한다. 이 시스템에서 발현되는 인간 안기오스타틴 단백질은 단백질 프로세싱, 단백질 폴딩, 및 글리코실화를 포함하는 후해독 변형과 같이 이. 콜라이에서 발현되는 것 이상으로 많은 잇점을 가질 것이다.

피. 파스토리스에서의 유전자 발현은 문헌[참고: Sreekrishna, K. et al. (1988) High level expression of heterologous protein in methlyotropic yeastPichia pastoris. J. Basic Microbiol. 29(4): 265-278, and Clare, J.J. et al. (1991) Production of epidermal growth factor in yeast: High-level secretion using 피치아 파스토리스 strains containing multiple gene copies, Gene 105:205-212]에 기재되어 있으며, 이들 모두는 참고에 의해 본원에서 통합된다.

실시예 26

트랜스제닉 동물 및 식물에서의 안기오스타틴 단백질의 발현

소 또는 돼지 계열의 트랜스제닉 동물이 안기오스타틴 유전자 전사체를 발현시키기 위해서 창조된다. 상기 트랜스제닉 동물은 예를 들면, 이들 동물의 우유 내에 안기오스타틴 단백질을 발현한다. 부가적으로, 안기오스타틴 유전자 전사체를 발현하는 식용 트랜스제닉 식물도 작제된다.

외래성 DNA를 발현하는 트랜스제닉 동물을 작제하는 것은 문헌[참고: Smith H. Phytochrome transgenics: functional, ecological and biotechnical applications, Semin. Cell. Biol. 1994 5(5):315-325]에 기술되어 있으며, 이는 본원에서 참조에 의하여 통합된다.

실시예 27

내피 세포 증식을 억제하는 안기오스타틴 단편의 규명

하기의 실시예는 안기오스타틴 단편의 개별 및 조합 활성을 규명한다. 데이타는 기능적 차이가 개별 크링글 구조, 및 잠재적 항 내피 중에 존재하며, 따라서 항-맥관형성 활성은 안기오스타틴의 상기 단백질 단편으로부터 수득될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 안기오스타틴 단편은 내피 세포 증식을 방해하는 활성을 지닌 안기오스타틴의 단백질 유도체 또는 플라스미노겐을 의미한다. 안기오스타틴 단편은 맥관형성-개재 질환 또는 증후군을 치료하는데 유용하다. 예를 들면, 안기오스타틴 단편은 종양 생장을 억제하거나 억압하는데 사용될 수 있다. 상기 안기오스타틴 단편의 아미노산 서열은, 사용되는 정황에서 달리 지적되지 않는 한, 예를 들면, 쥐 플라스미노겐(서열 번호: 1), 쥐 안기오스타틴(서열 번호: 2); 인간 안기오스타틴(서열 번호: 3), 붉은털 원숭이 안기오스타틴(서열 번호: 4), 돼지 안기오스타틴(서열 번호: 5), 및 소 안기오스타틴(서열 번호: 6)의 일부로부터 선택될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 크링글 1은 사용되는 정황에서 달리 지적되지 않는 한, 쥐 크링글 1(서열 번호: 7), 인간 크링글 1(서열 번호: 8), 붉은털 원숭이 크링글 1(서열 번호: 9), 돼지 크링글 1(서열 번호: 10), 및 소 크링글 1(서열 번호: 11)에 의해 예시되나 여기에 제한되지는 않는 크링글 1과 상동인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 지니며 내피 세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지닌 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 쥐 크링글 1(서열 번호: 7)은 서열 번호: 1의 쥐 플라스미노겐의 103 내지 181번 아미노산과 상응하고 서열 번호: 2의 쥐 안기오스타틴의 6 내지 84번 아미노산과 상응한다. 인간 크링글 1(서열 번호: 8), 붉은털 원숭이 크링글 1(서열 번호: 9), 돼지 크링글 1(서열 번호: 10), 및 소 크링글 1(서열 번호: 11)은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 및 서열 번호: 6의 안기오스타틴의 6 내지 84번 아미노산에 각각 상응한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 크링글 2는 사용되는 정황에서 달리 지적되지 않는 한, 쥐 크링글 2(서열 번호: 12), 인간 크링글 2(서열 번호: 13), 붉은털 원숭이 크링글 2(서열 번호: 14), 돼지 크링글 2(서열 번호: 15), 및 소 크링글 2(서열 번호: 16)에 의해 예시되나 여기에 제한되지는 않는 크링글 2와 상동인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 지니며 내피 세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지닌 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 쥐 크링글 2(서열 번호: 12)는 서열 번호: 1의 쥐 플라스미노겐의 185 내지 262번 아미노산과 상응하고 서열 번호: 2의 쥐 안기오스타틴의 88 내지 165번 아미노산과 상응한다. 인간 크링글 2(서열 번호: 13), 붉은털 원숭이 크링글 2(서열 번호: 14), 돼지 크링글 2(서열 번호: 15), 및 소 크링글 2(서열 번호: 16)은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 및 서열 번호: 6의 안기오스타틴의 88 내지 165번 아미노산에 각각 상응한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 크링글 3은 사용되는 정황에서 달리 지적되지 않는 한, 쥐 크링글 3(서열 번호: 17), 인간 크링글 3(서열 번호: 18), 붉은털 원숭이 크링글 3(서열 번호: 19), 돼지 크링글 3(서열 번호: 20), 및 소 크링글 3(서열 번호: 21)에 의해 예시되나 여기에 제한되지는 않는 크링글 3과 상동인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 지니며 내피 세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지닌 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 쥐 크링글 3(서열 번호: 17)은 서열 번호: 1의 쥐 플라스미노겐의 275 내지 352번 아미노산과 상응하고 서열 번호: 2의 쥐 안기오스타틴의 178 내지 255번 아미노산과 상응한다. 인간 크링글 3(서열 번호: 18), 붉은털 원숭이 크링글 3(서열 번호: 19), 돼지 크링글 3(서열 번호: 20), 및 소 크링글 3(서열 번호: 21)은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 및 서열 번호: 6의 안기오스타틴의 178 내지 255번 아미노산에 각각 상응한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 크링글 4는 사용되는 정황에서 달리 지적되지 않는 한, 쥐 크링글 4(서열 번호: 22) 및 인간 크링글 4(서열 번호: 23)에 의해 예시되나 여기에 제한되지는 않는 크링글 4와 상동인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 지니며 내피 세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지닌 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 쥐 크링글 4(서열 번호: 22)은 서열 번호: 1의 쥐 플라스미노겐의 377 내지 454번 아미노산과 상응한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 크링글 2-3은 사용되는 정황에서 달리 지적되지 않는 한, 쥐 크링글 2-3(서열 번호: 24), 인간 크링글 2-3(서열 번호: 25), 붉은털 원숭이 크링글 2-3(서열 번호: 26), 돼지 크링글 2-3(서열 번호: 27), 및 소 크링글 2-3(서열 번호: 28)에 의해 예시되나 여기에 제한되지는 않는 크링글 2-3과 상동인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 지니며 내피 세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지닌 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 쥐 크링글 2-3(서열 번호: 24)은 서열 번호: 1의 쥐 플라스미노겐의 185 내지 352번 아미노산과 상응하고 서열 번호: 2의 쥐 안기오스타틴의 88 내지 255번 아미노산과 상응한다. 인간 크링글 2-3(서열 번호: 25), 붉은털 원숭이 크링글 2-3(서열 번호: 26), 돼지 크링글 2-3(서열 번호: 27), 및 소 크링글 2-3(서열 번호: 28)은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 및 서열 번호: 6의 안기오스타틴의 88 내지 255번 아미노산에 각각 상응한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 크링글 1-3은 사용되는 정황에서 달리 지적되지 않는 한, 쥐 크링글 1-3(서열 번호: 29), 인간 크링글 1-3(서열 번호: 30), 붉은털 원숭이 크링글 1-3(서열 번호: 31), 돼지 크링글 1-3(서열 번호: 32), 및 소 크링글 1-3(서열 번호: 33)에 의해 예시되나 여기에 제한되지는 않는 크링글 1-3과 상동인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 지니며 내피 세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지닌 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 쥐 크링글 1-3(서열 번호: 29)은 서열 번호: 1의 쥐 플라스미노겐의 103 내지 352번 아미노산과 상응하고 서열 번호: 2의 쥐 안기오스타틴의 6 내지 255번 아미노산과 상응한다. 인간 크링글 1-3(서열 번호: 30), 붉은털 원숭이 크링글 1-3(서열 번호: 31), 돼지 크링글 1-3(서열 번호: 32), 및 소 크링글 1-3(서열 번호: 33)은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 및 서열 번호: 6의 안기오스타틴의 6 내지 255번 아미노산에 각각 상응한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 크링글 1-2는 사용되는 정황에서 달리 지적되지 않는 한, 쥐 크링글 1-2(서열 번호: 34), 인간 크링글 1-2(서열 번호: 35), 붉은털 원숭이 크링글 1-2(서열 번호: 36), 돼지 크링글 1-2(서열 번호: 37), 및 소 크링글 1-2(서열 번호: 38)에 의해 예시되나 여기에 제한되지는 않는 크링글 1-2와 상동인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 지니며 내피 세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지닌 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 쥐 크링글 1-2(서열 번호: 34)는 서열 번호: 1의 쥐 플라스미노겐의 103 내지 262번 아미노산과 상응하고 서열 번호: 2의 쥐 안기오스타틴의 6 내지 165번 아미노산과 상응한다. 인간 크링글 1-2(서열 번호: 35), 붉은털 원숭이 크링글 1-2(서열 번호: 36), 돼지 크링글 1-2(서열 번호: 37), 및 소 크링글 1-2(서열 번호: 38)은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 및 서열 번호: 6의 안기오스타틴의 6 내지 165번 아미노산에 각각 상응한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 크링글 1-4는 사용되는 정황에서 달리 지적되지 않는 한, 쥐 크링글 1-4(서열 번호: 39) 및 인간 크링글 1-4(서열 번호: 40)에 의해 예시되나 여기에 제한되지는 않는 크링글 1-4와 상동인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 지니며 내피 세포 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 지닌 플라스미노겐의 단백질 유도체를 의미한다. 쥐 크링글 1-4(서열 번호: 39)은 서열 번호: 1의 쥐 플라스미노겐의 103 내지 454번 아미노산과 상응한다.

크링글 1, 크링글 2, 크링글 3, 크링글 4, 크링글 2-3, 크링글 1-3, 크링글 1-2 및 크링글 1-4 아미노산 서열은 각각 상기에서 규명된 특이적 크링글 서열과 상동이다. 바람직하게는, 아미노산 서열은 적어도 60%, 좀 더 바람직하게는 적어도 70%, 좀 더 바람직하게는 80%의 개시된 서열과의 동일성을 가진다. 이는 상기에서 열거된 단편들의 다양한 아미노산 치환, 추가, 결실 또는 기타 변형이 안기오스타틴 단편의 내피 세포 증식 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 증진 또는 변형할 수 없는 것으로 여겨진다. 기능적 동일성이란 용어는 결실, 추가 또는 다른 잔기의 치환을 포함하여 변형된 서열이 동일하거나 기능적으로 등가의 유전자 산물을 암호화하는 서열을 야기하여 본 발명에 따라서 사용될 수 있음을 의미한다. 유전자 산물 그 자체는 안기오스타틴 서열내에 결실, 추가 또는 아미노산 잔기의 치환을 함유할 수 있으며, 이는 잠재적 변화를 야기함으로써 기능적으로 등가의 안기오스타틴 단백질을 생산한다. 상기 아미노산 치환은 수반되는 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양극성에서의 유사성에 기초할 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산은 아스파르산 및 글루탐산을 포함하며; 양으로 하전된 아미노산은 리신, 히스티딘 및 아르기닌을 포함하며; 비전하의 극성 헤드 그룹을 지닌 아미노산은 유사한 소수성을 지니며 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신을 포함하며; 비극성 헤드 그룹을 지닌 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 프롤린, 메티오닌, 트립토판을 포함한다. 상기 변형은 청구범위의 범위 및 사상을 벗어나도록 의도되어서는 안 된다. 예를 들면, 인터-크링글 디설피드 브릿지의 형성에 의한 호모이원화를 피하기 위해서, 재조합 인간 크링글 2(서열 번호: 13)에서의 시스테인 잔기 C4 및 재조합 크링글 3(서열 번호: 18)에서의 C42는 세린으로 변이된다. 더욱이, 다양한 아미노산 치환, 첨가, 결실 또는 기타 변형은 상기 규명된 안기오스타틴 단편에서 행해질 수 있는 것으로 여겨지나, 단편의 내피 세포 증식 억제 활성에 상당한 변화를 초래하지 말아야 하며, 따라서 청구범위의 범위를 벗어나도록 의도되서는 안된다. 상당한 변화를 초래하지 말아야 한다는 뜻은 안기오스타틴 단편이 본원에 개시된 가장 근접한 상동 안기오스타틴 단편의 억제 활성과 비교시 내피 세포 증식 억제 활성이 적어도 60%, 좀 더 바람직하게는 적어도 70%, 좀 더 바람직하게는 적어도 80%를 가져야 함을 의미한다.

유전자 작제 및 발현

인간 플라스미노겐 (HPg)의 크링글 1(K1), 크링글 2(K2), 크링글 3(K3), 크링글 4(K4) 및 크링글 2-3(K2-3)을 암호화하는 cDNA 단편을 생성하기 위하여 PCR-기저 방법이 사용된다. 재조합 크링글 1(rK1), 크링글 2(rK2), 크링글 3(rK3), 크링글 4(rK4) 및 크링글 2-3(rK2-3)은 전술한 바와 같이 이. 콜라이에서 발현된다[참고문헌: Menhart, N., Shel, L.C., Kelly, R.F., and Castellino, F.J.(1991) Biochem. 30, 1948-1957; Marti, D., Schaller, J., Ochensberger, B., and Rickli, E.E. (1994) Eur. J. Biochem. 219, 455-462; Sohndel, S., Hu, C.-K., Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., and Rickli, E.E. (1996) Biochem.. in press; Rejante, M.R., Byeon, I.-J.L., and Llinas, M. (1991) Biochem. 30, 11081-11092]. 도 32B에서 도시된 바와 같이 인터-크링글 디설피드 브릿지의 형성에 의한 호모이원화를 피하기 위해서, rK2에서의 C169 및 rK3에서의 C297 시스테인 잔기를 각각 서열 번호: 13 및 18의 4 및 42번 위치에서 보이는 바와 같이 돌연변이시켰다[참고문헌: Sohndel, S., Hu, C.-K., Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., and Rickli, E.E. (1996) Biochem. in press]. rK3 및 rK2-3은 단백질 정제를 위해 사용되는 N-말단 헥사-히스티딘 택을 함유한다(비도시).

단백질 분해

K1-3, K-1-4 및 K4 단편을 전술한 바와 같이 돼지 엘라스타아제로 Lys-HPg(Abbott Labs)를 분해함으로써 마련한다[참고문헌: Powell, J.R., and Castellino, F.J. (1983) Biochem. 22, 923-927]. 간단히, 엘라스타아제 1.5 mg을 pH 8.0의 50 mM Tris-HCl 내 인간 플라스미노겐 200 mg과 함께 실온에서 밤새 진탕 배양한다. 반응을 최종 농도가 1 mM이 되도록 디이소프로필 플루오로포스페이트(DFP) (Sigma)를 첨가하여 종결한다. 혼합물을 실온에서 추가 30분간 진탕한 후, pH 8.0의 50 mM Tris-HCl로 밤새 투석한다.

단백질 정제

재조합 K1을 pSTII 플라스미드 벡터를 사용하여 DH5α 이. 콜라이 박테리아 세포 내에서 발현시킨다. 생성된 단백질을 리신-세파로스 4B (Pharmacia) 및 Mono Q (BioRad) 컬럼을 사용하여 크로마토그래피에 의해 균일하게 정제한다. rK2 및 rK3을 발현하는 이. 콜라이 박테리아 세포 (HB101 균주)를 앰피실린 100 mg/ml 및 카나마이신 25 mg/ml을 함유한 2 x YT 배지에서 OD₆₀₀값이 대략 0.8이 되도록 3℃에서 배양한다. IPTG(이소프로필-b-D-티오갈락토피라노사이드)를 최종 농도가 1 mM이 되도록 가한 후, 재조합 단백질의 생성을 유도하도록 세포를 37℃에서 추가 4.5시간 동안 배양한다. 세포를 원심분리에 의해 하비스트하고 펠리트를 -80℃에 보관한다. 동결된 세포 융균물을 추출 완충액에서 재현탁시킨다(0.1 M 나트륨 포스페이트내 6 M 구아니딘 히드로클로라이드, pH 8.0). 현탁액을 30분간 15,000 x g에서 원심분리하고 b-머캡토에탄올을 현탁액에 가해 최종 농도가 10 mM이 되도록 한다. 그리고 나서, 상층액을 추출 완충액으로 미리 평형된 Ni²⁺-NTA 아가로스 컬럼(1.5 cm x 5 cm) 상에 적재한다. 컬럼을 pH 8.0 및 pH 6.3의 추출 완충액으로 각각 연이어 세척한다. 재조합 K2 및 K3을 pH 5.0에서 추출 완충액으로 용출한다.

K1-3, K1-4 및 K4의 단백질 분해에 의해 절단된 단편을 pH 8.0의 50 mM Tris-HCl로 평형된 리신-세파로스 4B 컬럼 (2.5 cm x 15 cm)를 사용하여 180 nm에서의 흡수도가 0.005에 이를때까지 정제한다. 흡수된 크링글 단편을 pH 8.0의 200 mM ε-아미노카프로산을 함유한 트리스 완충액으로 용출시킨다. 용출된 샘플을 pH 5.0의 Tris-HCl로 밤새 투석하고, 동일 완충액으로 평형된 BioRad Mono-S 컬럼에 적용시킨다. K4, K1-3 및 K1-4 단편을 pH 5.0의 20 mM 포스페이트/1 M KCl의 0-20%, 20-50% 및 50-70% 단계 구배로 용출한다. 대부분의 K1-3 및 K1-4 단편은 SDS-PAGE에 의해 결정된 바와 같이 0.5 M KCl로 컬럼으로부터 용출한다. 모든 분획을 pH 8.0의 20 mM Tris-HCl로 밤새 투석한다. 투석 후에, K1-3 및 K1-4 단편을 pH 8.0의 20 mM Tris-HCl 완충액으로 미리 평형된 헤파린-세파로스 컬럼 (5 cm x 10 cm) (Sigma)을 사용하여 추가로 정제한다. K1-3 단편을 350 mM KCl로 용출하고 K1-4를 유동 통과 분획으로부터 회수한다. 정제된 크링글 단편을 SDS-젤 상에서 분석한 후, 은-염색, 항-인간 K4 및 K1-3 폴리클론 항체와의 웨스턴 면역블로팅 및 아미노-말단 서열 분석법을 행한다.

시험관내 재-폴딩

표준 프로토콜에 따라서, rK2, rK3 및 rK2-3의 재-폴딩을 수행한다[참고문헌: Cleary, S., Mulkerrin, M.G., and Kelley, R.R. (1989) Biochem. 28, 1884-1891]. 정제된 단백질을 pH 8.0으로 맞춘 후, 디티오트레이톨(DTT)를 가하여 최종 농도가 5 mM이 되도록 한다. 밤새 배양한 후에, 감소된 글루타티온 1.25 mM을 함유하는 pH 8.0의 Tris-HCl 50 mM의 4 체적으로 용액을 희석한다. 1 시간 배양 후에, 산화된 글루타티온을 가하여 최종 농도가 1.25 mM이 되도록 한 다음, 4℃에서 6 시간동안 배양한다. 원형 재현된 단백질을 처음 2일 동안 은 H₂O로 투석하고, 다음 2일 동안은 pH 8.0의 포스페이트-완충 식염수 50 mM로 투석한다. 이 후, 용액을 동일 포스페이트-완충된 식염수로 평형된 리신-바이오-겔 컬럼 (2 cm x 13 cm) 상에 적재한다. 컬럼을 포스페이트 완충된 식염수로 세척하고 단백질을 50 mM 6-AHA (6-아미노헥산산)을 함유한 포스페이트 완충액으로 용출한다. 역전-상 HPLC는 아쿠아포어 부틸 컬럼 (2.1 x 100 mm, widepore 30 nm, 7 mm, Applied Biosystem) 상에서 수행하고 아세토니트릴 구배를 가지고 Hewlett Packard liquid 크로마토그래피를 사용한다.

환원 및 알킬화

크링글 단편의 환원 및 알킬화를 표준 프로토콜에 따라 수행한다[참고문헌: Cao, Y., and Pettersson, R.F., (1990) Growth Factors 3, 1013]. 혈청이 결여된 DME 매질 300-500 ml 내에 정제된 단백질 대략 20 내지 80 mg을 15분간 0.5 M DTT 15 ml와 함께 실온에서 배양시킨다. 배양 후에, 0.5 M 요오드아세트아미드 30 ml를 반응에 가한다. 단백질 용액을 처음에는 DMEM 20 체적으로 4℃에서 밤새 투석한다. 더 나아가, 용액을 신선한 DMEM 20 체적으로 추가 4시간동안 4℃에서 투석한다. 투석 후에, 샘플을 SDS-젤 상에서 분석하고 내피 세포 증식에 관한 억제 활성을 알아보기 위해 분석한다.

내피 증식 분석

소 모세 내피 (BCE) 세포를 전술한 방식에 따라 분리하고[참고문헌: Folkman, J., Haudenschild, C.C., and Zetter, B.R. (1979) Proc. Natl, Acad. Sci USA. 76, 5217-5121] 열에 의해 불활성화된 송아지 혈청(BCS) 10%, 항생제, 및 3 ng/ml 재조합 인간 bFGF (Scios Nova, Mountainview, CA)로 보충된 DMEM 내에서 유지시킨다. 6-웰 플레이트 내에서 자라는 BCE 세포 단일층을 0.05% 트립신 용액 내에 분산시킨다. 10%의 BCS를 함유하는 DMEM으로 세포를 재-현탁시킨다. 0.5 ml 내 대략 12,500 세포를 겔라틴화된 24-웰 조직 배양 플레이트의 각각의 웰에 가하고 24 시간동안 37℃ (10% CO₂내)에서 배양한다. 매질을 5% BCS를 함유하는 신선한 DMEM 500 ml로 대체한 다음, 3배의 크링글 단편 각각 또는 조합 샘플을 각 웰에 가한다. 배양 30 분 후, bFGF를 가하여 최종 농도가 1 ng/ml가 되도록 한다. 배양 72 시간 후, 세포를 트립신으로 세척하고 Hematall (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) 내에서 재현탁시킨 후, 콜터 카운터로 측정한다.

인간 플라스미노겐의 크링글 단편의 정제 및 규명

인간 플라스미노겐의 개별 크링글 (K1, K2, K3 및 K4) 및 크링글 K2-3을 암호화하는 cDNA 단편을 PCR-기저 방법에 의해 증폭시킨다(도 28). PCR-증폭된 cDNA 단편을 박테리아 발현 벡터 내로 클로닝한다. 이. 콜라이로부터 발현되는 재조합 단백질을 시험관 내에서 재폴딩시키고 HPLC-커플링된 크로마토그래피를 사용하여 98% 이상 균일하도록 정제한다(도 29). 환원 조건 하에서, 재조합 K2, K3 및 K4는 각각의 크링글 단편의 예측 분자량에 상응하는 분자량 12-13 kDa으로 이동한다. K1-4 및 K1-3 단편은 인간 Lys-플라스미노겐 (Lys-HPg)을 전술한 엘라스타아제로 단백질 분해함에 의하여 수득한다[참고문헌: Powell, J.R., and Castellino, F.J. (1983) Biochem. 22, 923-927: Brockway, W.J., and Castellino, F.J. (1972) Arch. Biochem. Biophys]. 각각 43 kDa 및 35 kDa 분자량으로 예측되는 이러한 두 단편(도 29b, 1 및 2 레인)도 균일하게 정제한다. 정제된 단편의 N-말단 아미노산 서열 분석법에 의하여 K1-3 및 K1-4 각각에 대해 서열 번호: 30 및 서열 번호: 40에 의해 뒤따르는 -YLSE-서열을 규명한다. K4에 대한 N-말단 서열은 서열 번호: 23에 의해 뒤따르는 대략 20%의 -VQD-를 지닌 -VVQD-를 생성하며, 각각은 인간 안기오스타틴의 176번 발린 및 177번 발린으로 개시되는 기대 서열로부터 예측된다.

개별 크링글의 항-내피 세포 증식 활성

안기오스타틴의 개별 재조합 크링글을 bFGF에 의해 자극된 소 모세 내피 (BCE) 세포 생장에 관한 억제 활성용으로 분석한다. 도 30a에 도시된 바와 같이, rK1은 투여량-의존 방식으로 BCE 세포 증식을 억제한다. 50% 억제 (ED₅₀)에 도달하는데 필요한 rK1은 약 320 nM이다(표 4). 대조적으로, rK4는 내피 세포 증식에 관한 억제 활성을 거의 또는 전혀 보이지 않는다. 두 개의 비-리신 결합 크링글 단편인 재조합 K2 및 rK3도 내피 세포 증식의 투여량-의존 억제를 생성한다(도 30b). 하지만, rK2의 억제 능력은 rK1 및 rK3 (ED₅₀=460)보다 실질적으로 낮다(도 30 및 표 4). 이 크링글 단편을 높은 농도로 배양한 이후라 할지라도, 라운딩, 이탈 및 세포의 분절화와 같은 내피 세포의 아팝토시스에 수반되는 뚜렷한 형태 또는 어떠한 세포독성도 탐지될 수 없다. 이러한 데이타는 안기오스타틴의 항-내피 생장 활성이 K1, K2 및 K3 및 적게는 K4 단편에 의해 공유될 수 있음을 제시한다.

모세 내피 세포 증식에 대한 억제 활성

단편	ED₅₀(nM)
크링글 1	320
크링글 2	-
크링글 3	460
크링글 4	-
크링글 2-3	-
크링글 1-3	70
크링글 1-4 (안기오스타틴)	135

K1-3 및 K1-4 단편의 항-내피 세포 증식 활성

조합된 크링글 단편의 항-내피 세포 증식 효과를 측정하기 위하여, 인간 K1-4, K1-3 및 rK2-3의 정제된 단백질 분해 단편을 BCE 세포 상에서 분석한다. 이전의 발견[참고문헌: O'Reilly, M.S., Holmgren, L., Shing, Y., Chen, C., Rosenthal, R.A., Moses, J., Lane, W.S., Cao, Y., Sage, E.H., and Folkman, J. (1994) Cell 79, 315-328]에 일치하여, 도 31에서 도시한 바와 같이 BCE 세포 증식은 안기오스타틴-유사 단편 K1-4에 의해 상당히 억제된다(ED₅₀=135nM)(표 4). K1-3으로 항-내피 생장 활성의 증가가 얻어진다(ED₅₀=70nM)(표 4). 내피 세포 증식 억제는 투여량-의존 방식으로 나타난다. 이러한 결과는 안기오스타틴으로부터 K4를 제거하여도 항-내피 생장 활성을 보유함을 가리킨다.

rK2 및 rK3에 의한 추가 억제

rK2-3 단편은 rK2 단독에서와 유사한 약 억제 활성만을 보인다(도 31). 하지만, rK2 및 rK3 모두는 내피 세포 증식을 억제한다(도 30b). 이러한 발견은 K3의 억제 활성이 K2-3의 구조내에서 은폐됨을 암시한다. 이전의 구조 연구는 인터-크링글 디설피드 결합이 서열 번호: 3의 91번 시스테인 및 219번 시스테인에 상응하여 인간 플라스미노겐의 K2(169번 시스테인) 및 K3(297번 시스테인) 사이에 존재함을 보여준다[참고문헌: Sohndel, S., Hu, C.-K., Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., and Rickli, E.E. (1996) Biochem. in press](도 32b 참조). 조합한 rK2 및 rK3의 억제 효과가 시험된다. 흥미롭게도, 개별 rK2 및 rK3 단편이 BCE 세포에 함께 가해졌을때 추가 억제가 관측된다(도 32a 참조). 이러한 결과는 K2-3의 최대 억제 효과를 수득하기 위해서, K2 및 K3 사이에 인터디설피드 브릿지를 개방하는 것이 바람직하다는 것을 암시한다.

크링글 구조의 적절한 폴딩이 안기오스타틴의 항 내피 활성을 위해 필요하다.

항-내피 증식 활성에 위해 필요한 크링글 구조의 폴딩이 어떠한지 알아보기 위하여, 본래 안기오스타틴을 DTT로 환원시키고 소 모세 내피 세포 상에서 분석한다. 환원 후에, 안기오스타틴을 요오드아세트아미드로 추가 알킬화한 후, SDS 겔 전기영동에 의하여 분석한다. 도 34a에 도시된 바와 같이, DTT-처리된 단백질은 33 kDa의 분자량(레인 1)을 지닌 본래 안기오스타틴과 비교하여, 약 42 kDa의 분자량(레인 2)으로 높은 위치까지 이동하는데, 이는 안기오스타틴이 완전히 환원되었음을 암시한다(도 34b). 이러한 결과로부터, 인트라-크링글 디설피드 결합을 통한 안기오스타틴의 정확한 폴딩이 내피 세포 증식의 억제에 관한 잠재적 효과를 유지하는데 바람직함을 결론내릴 수 있다.

인간 플라스미노겐의 크링글 부위의 아미노산 서열 정렬은 도 35에서 도시한 바와 같이 동일한 구조 및 현저할만한 서열 상동성(56-82% 동일)을 보인다. 이러한 구조 중에서, 고-친화도 리신 결합 크링글, K1은 내피 세포 증식의 가장 잠재적인 억제 분절이다. 흥미롭게도, 중간-친화도 리신 결합 단편, K4는 억제 활성이 결여되어 있다. 이러한 데이타는 크링글 구조의 리신 결합좌는 억제 활성에 직접 관여되지 않을 수 있음을 암시한다. 이러한 크링글 구조의 아미노산 보전 및 기능적 분화는 진화 동안에 DNA 복제에 의해 야기된 돌연변이를 연구함에 있어서의 이상적인 시스템을 제공한다. 구조적으로 관련된 단백질의 한 그룹에 의해 보이는 맥관형성의 조절에 상대적인 유사한 분화 활성은 또한, -C-X-C- 케모카인 및 프로락틴-생장 호르몬 계열에서도 발견된다[참고문헌: Maione, T.E., Gray, G.S., Petro, A. J., Hunt, A.L., and Donner, S.I. (1990) Science 247, 77-79.; Koch, A.E., Polverini, P.J., Kunkel, S.L., Harlow, L.A., DiPietro, L.A., Elner, V.M., Elner, S.J., and Strieter, R.M. (1992) Scinece 258, 1798-1801.; Cao, Y., Chen, C., Weatherbee, J.A., Tsang, M., and Folkman, J. (1995) J. Exp. Med. 182, 2069-2077.; Strieter, R.M., Polverini, P.J., Arenberg, D.A., and Kunkel, S.L. (1995) Shock 4, 155-160.; Jackson, D., Volpert, O.V., Bouck, N., and Linzer, D.I.H. (1994) Science 266, 1581-1584].

추가의 서열 분석은 K4가 22번 및 78번 시스테인에 근접한 두 개의 양으로 하전된 리신 잔기를 함유함을 드러낸다(도 35).¹H 핵 자기 공명법(NMR)은 이들 4개의 리신이 57번 리신과 함께 K4 내에서 양으로 하전된 도메인의 코어를 형성[참고: Llinas M, 미발행 데이타]하는 반면에, 다른 크링글 구조는 이러한 양으로 하전된 도메인이 결여됨을 나타낸다. 이러한 리신-풍부 도메인이 인간 플라스미노겐의 크링글 4의 억제 활성의 손실에 기여하는지는 아직도 연구 과제로 남아 있다. K4는 기타 세포 유형의 증식을 자극하고 세포내 칼슘의 방출을 증가시키는 것으로 보고된 바 있다[참고 문헌: Donate, L.E., Gherardi, E., Srinivasan, N., Sowdhamini, R., Aporicio, S., and Blundell, T.L. (1994) Prot. Sci. 3, 2378-2394]. 안기오스타틴으로부터의 K4의 제거가 내피 세포에 억제 활성에 잠재적이라는 사실은 이러한 구조가 K1-3의 억제 효과의 일부를 방해할 수 있음을 암시한다.

안기오스타틴 및 이의 관련 크링글 단편이 어떻게 내피 세포 생장을 특이적으로 억제하는지에 대한 기작은 아직도 규명이 안 된 채 남아 있다. 억제가 증식하는 내피 세포 내에서 특이적으로 발현되는 리포터에 의해 개재되는지, 또는 안기오스타틴이 내피 세포에 의해 내재되고 후속적으로 세포 증식을 방해하는지는 아직도 분명하지 않다. 대안적으로, 안기오스타틴은 인테그린 a_vb₃와 같은 내피 세포 점착 리포터와 상호작용할 수 있어서, 인테그린-개재된 맥관형성을 블로킹할 수 있다[참고 문헌: Brooks, P.C., Montgomery, A.M., Rosenfeld, M., Reisfeld R.A., Hu, T. Klier, G., and Cheresh, D.A. (1994) Cell 79, 1157-1164]. 흥미롭게도, 생체내 각막 또는 융모요막 모델(bFGF 및 종양 괴사 인자에 의해 유도됨)은 a_vb₃인테그린 의존성임이 최근 보고되었다[참고문헌: Friedlander, M., Brooks, P.C., Shaffer, R.W., Kincaid, C.M., Varner, J.A., and Cheresh, D.A. (1995) 270, 1502]. 하지만, 형질전환 생장 인자, VEGF 또는 포볼 에스테르(phorbol ester)에 의해 자극된 안기오스타틴은 a_vb₅에 의존적이었다. 개별 인테그린에 대한 항체는 이들의 경로 중 하나를 특이적으로 블로킹하고, 두 개의 인테그린의 시클릭 단백질 길항제는 각 사이토카인에 의해 유도된 맥관형성을 블로킹하였다[참고문헌: Friedlander, M., Brooks, P.C., Shaffer, R.W., Kincaid, C.M., Varner, J.A., and Cheresh, D.A. (1995) 270, 1502]. bFGF- 및 VEGF-유도된 맥관형성이 안기오스타틴에 의해 억제되기 때문에, 이는 이들 인테그린-개재된 맥관형성에 대한 통상 경로를 블록킹할 수 있다.

증가된 숫자의 내재성 맥관형성 억제 인자가 지난 몇 세기 동안에 규명되었다[참고문헌: Folkman, J. (1995) N. Engl. J. Med. 333, 1757-1763]. 규명된 9개의 내피 세포 억압자 중에서, 여러 개의 억제 인자가 단백질 분해 단편이다. 예를 들면, 인간 프로락틴의 16 kDa N-말단 단편은 내피 세포 증식을 억제하고 생체내 맥관형성을 방해한다[참고문헌: Clapp, C., Martial, J.A., Guzman, R.C., Rentierdelrue, F., and Weiner, R.I. (1993) Endorinology 133, 1292-1299]. 최근 논문에서, 맥관형성의 16 kDa N-말단 단편은 미토겐-활성 단백질의 활성을 억제하는 것으로 보고되었다[참고문헌: D'Angelo, G., Struman, I., Martial, J., and Weiner, R. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 6374-6378]. 프로락틴의 온전한 모 분자, 유사 안기오스타틴은 내피 세포 증식을 억제하지도 못하고 맥관형성의 억제 인자도 아니다. 혈소판 인자 4 (PF-4)는 고농도에서 맥관형성을 억제한다[참고문헌: Maione, T.E., Gray, G.S., Petro, A.J., Hunt, A.L., and Donner, S.I. (1990) Science 247, 77-79; Cao, Y., Chen, C., Weatherbee, J.A., Tsang, M., and Folkman, J. (1995) J. Exp. Med. 182, 2069-2077]. 하지만, N-말단이 절단되어 단백질 분해된 PF-4 단편은 항-증식 활성에서 온전한 PF-4 분자 이상의 30 내지 50배의 증가를 보인다[참고문헌: Gupta, S.K., Hassel, T., and Singh, J.P. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 7799-7803]. 피브로넥틴, 쥐 표피 생장 인자 및 트롬보스폰딘의 더 작은 단백질 단편은 내피 세포 생장을 특이적으로 억제하는 것으로 또한 밝혀졌다[참고문헌: Homandberg, G.A., Wiliams, J.E., Grant, D., Schumacher, B., and Eisenstein, R. (1985) Am. J. Pathol. 120, 327-332; Nelson, J., Allen, W.E., Scott, W.N., Bailie, J.R., Walker, B., McFerran, N.V., and Wilson, D.J. (1995) Cancer Res. 55, 3772-3776; Tolsma, S.S., Volpert, O.V., Good, D.J., Frazer, W.A., Polverini, P.J., and Bouck, N. (1993) J. Cell Biol. 122, 497-511]. 큰 단백질의 단백질 분해 처리는 본래 분자의 구조를 변경시키거나 항-맥관형성 에피톱을 새로이 드러낼 수 있다. 이리하여, 단백질 분해 효소는 맥관형성의 조절에 있어서 중요한 역할을 수행할 수 있다. 현재까지, 생체내 이러한 단백질 분해 효소 활성의 조절에 관하여서는 알려진 바가 거의 없다.

또한, 데이타는 안기오스타틴의 크링글 구조의 디설피드 결합 개재된 폴딩이 내피 세포 생장에 대한 억제 활성을 유지함에 바람직하다는 것을 보여준다. 또한, 플라스미노겐 내에서의 이들에 대한 크링글 구조 동족체는 기타 다양한 단백질에서도 발견된다. 예를 들면, 전지질단백질에서는 플라스미노겐 크링글 4가 37번이나 반복되어 있다[참고문헌: McLean, J.W., Tomlinson, J.E., Kuang, W.-J., Eaton, D.L., Chen, E.Y., Fless, G.M., Scanu, A.M., and Lawn, R.M. (1987) Nature 330, 132-137]. 또한, 프로트롬빈의 아미노 말단부도 플라스미노겐의 것들과 유사한 두 개의 크링글을 함유한다[참고문헌: Walz, D.A., Hewett-Emmett, D., and Seegers, W.H. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 1969-1973]. 유로키나아제가 플라스미노겐과 광범위한 동일성을 공유하는 크링글 구조를 보유하는 것으로 밝혀졌다[참고문헌: Gunzler, W.A., J., S.G., Otting, F., Kim, S.-M. A., Frankus, E., and Flohe, L. (1982) Hoppe-Seyler's a. Physiol. Chem. 363, 1155-1165]. 게다가, 계면활성제 단백질 B 및 헤파토사이트 생장 인자 (HGF)도 또한, 크링글 구조를 공유한다[참고문헌: Johansson, J., Curstedt, T., and Jornvall., H. (1991) Biochem. 30, 6917-6921; Lukker, N.A., Presta, L.G., and Godowski, P.J. (1994) Prot. Engin. 7, 895-903].

실시예 28

안기오스타틴 단편에 의한 전이 및 내피 세포 증식의 억압

하기의 실시예는 추가적인 안기오스타틴 단편의 활성을 규명한다. 데이타는 잠재적 항-내피 및 종양 억압적 활성이 안기오스타틴의 상기 단백질 단편으로부터 수득될 수 있음을 암시한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 크링글 1-4BKLS는 내피 세포 억제 활성을 지니며, 크링글 1-4 BKLS와 상동인 서열을 포함하는 아미노산 서열을 지닌 플라스미노겐 유도체를 의미하며, 예컨대, 쥐 크링글 1-4BKLS (서열 번호: 41), 인간 크링글 1-4BKLS (서열 번호: 42)를 포함하나 이에 한정되지는 않으며, 다른 지적이 없는 한 이들이 본원에서 사용된다. 쥐 크링글 1-4BKLS (서열 번호: 41)은 서열 번호: 1의 쥐 플라스미노겐의 93번 부터 470번 아미노산에 상응한다. 이러한 예는 안기오스타틴 단편이 플라스미노겐 단편일 수 있으며 서열 번호: 3에서 제시된 안기오스타틴보다 더 큰 아미노산 서열을 망라함을 나타내며, 치료적 내피 세포 증식 억제 활성 또는 항-맥관형성 활성을 여전히 지님을 나타낸다.

크링글 1-4BLKS 아미노산 서열은 상기에서 규명된 특이적 크링글 1-4BLKS와 상동이다. 바람직하게는, 아미노산 서열은 개시된 서열과 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 80%의 상동성을 지닌다. 이는 상기에서 리스트된 단편에서의 다양한 아미노산 치환, 결실 및 기타 변형이 단편의 내피 세포 억제 활성을 증진시키거나 변형할 수 있는 것으로 여겨진다. 상기 변형은 본 청구범위의 범위 및 사상을 초과하지 않도록 의도된다. 더욱이, 다양한 잠재적 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실이 단편의 내피 세포 억제 활성을 상당히 변경하지 않도록 행해질 수 있으며, 역시 청구범위의 범위를 초과하지 않도록 의도되는 것으로 여겨진다.

피치아 파스토리스 내 에서의 안기오스타틴의 클로닝

안기오스타틴 암호화 서열은 Vent 중합효소 (New England Biolabs) 및 링커 Xho1 및 Eco R1을 각각 함유한 프라이머 #154 (5'-ATCGCTCGAGCGTTATTTGAAAAGAAAGTG-3') (서열 번호: 43) 및 #151 (5'-ATCGGAATTCAAGCAGGACAACAGGCGG-3') (서열 번호: 44)를 사용하고 템플레이트로서 pTrcHis/HAs 플라스미드를 사용하여 PCR에 의해서 증폭된다. 상기 플라스미드는 피. 파스토리스 본래 분비 시그널 PHO 1를 사용하여 pHIL-S1 발현 벡터의 Xho I/ECo R1 좌 내로 클로닝하기 위한 인간 플라스미노겐의 93번 부터 470번의 아미노산의 암호화 서열을 함유한다. 상기 동일한 서열은 알파-인자 분비 시그널을 지닌 발현 벡터 pPIC9의 Sna B1/ECo R1 좌 내로 클로닝하기 위하여, 링커 Sna B1 및 Eco R1을 각각 함유한 프라이머 #156 (5'-ATCGTACGTATTATTTGAAAAGAAAGTG-3') (서열 번호: 45) 및 #151를 사용하여 동일한 방식으로 증폭된다. 증폭 산물은 겔 상에서 정제되고, 링커는 적절한 효소에 의해 분해되고, 다시 유전자-클리닝 (Bio 101)을 사용하여 정제된다. 이들 유전자 단편은 적절한 벡터 내로 결찰된다. 결과 생성된 클론을 선별하고, 클론의 플라스미드 제조가 수득되며, 선형화에 의해 피. 파스토리스 숙주 균주 GS115 내로 형질전환될 때, His⁺Mut^s및 His⁺Mut⁺재조합 균주가 생성된다. 통합은 PCR에 의해 확인된다.

두 개의 His⁺및 His⁺Mut⁺재조합체는 메탄올로 유도되고, 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 젤 및 크링글 1 내지 3에 대한 쥐 모노클론 항체를 사용한 면역블로팅을 사용하여 고발현된 안기오스타틴을 위해 스크리닝된다[참고문헌: Castellino, Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN]. 이들로부터, GS115 형질전환된 피. 파스토리스 클론이 선별되며 표현형으로 pHIL-S1/HAs18은 His⁺Mut^s로 규명된다.

PHIL-S1/HAs18의 발현

pHIL-S1/HAs18로부터의 안기오스타틴의 발현은 His⁺Mut^s클론에 대해 전형적이다. 차단 쉐이크 플라스크 내에서의 유도에서, 1L의 OD₆₀₀세포를 1L 차단 플라스크내에서, 1% 효모 추출물, 2% 펩톤, pH 6.0의 100 mM 칼륨 포스페이트, 황산 암모늄 기저된 1.34% 효모 질소, 0.00004% 바이오틴 및 0.5% 메탄올을 함유하는 150 ml의 완충 메탄올 혼합물내에서 배양시킨다. 세포를 30℃, 250 rpm에서 일정하게 쉐이킹한다. 메탄올을 24 시간 간격으로 첨가하여 최종 메탄올 농도가 0.5%가 되도록 배치 내에 공급한다. 120 시간 후에, 세포를 10분간 5,000 rpm에서 회전시키고, 상층액을 사용할 때까지 -70℃에서 보관한다.

리신-세파로스 크로마토그래피에 의한 피. 파스토리스 발효 브로쓰로부터의 안기오스타틴의 정제

모든 절차를 4℃에서 수행한다. 안기오스타틴을 함유하는 조 발효 브로쓰 200 ml를 14,000 x g에서 원심분리에 의해 뚜렷이하고, Centriprep 30 (amicon) 30 kDa 분자량 컷오프 막에 의하여 본래 체적의 대략 1/4로 농축한다. pH 7.5의 50 mM 포스페이트 완충액의 1 체적을 농축된 샘플에 가하고, 센트리프렙에 의하여 본래 샘플 체적의 1/4이 되도록 다시 농축한다. 샘플을 다시 pH 7.5의 50 mM 나트륨 포스페이트 완충액으로 체적:체적 희석한다. 60 g의 리신-세파로스 4B (Pharmacia)를 pH 7.5의 500 ml 아이스-콜드 50 mM 포스페이트 완충액 내에서 재현탁시키고 48 x 100 mm 컬럼을 밀봉하기 위해서 사용한다(180 ml 밀봉된 체적). 컬럼을 유동 속도 1.5 ml/분에서 pH 7.5의 50 mM 나트륨 포스페이트 완충액의 7.5 컬럼 체적 (CV)에서 밤새 세척한다. 샘플을 유동 속도 1.5 ml/분에서 컬럼으로 펌핑하고 컬럼을 50 mM 나트륨 포스페이트의 1.5 CV로 세척한다. 이후, 컬럼을 유동 속도 3 ml/분의 유동 속도에서 pH 7.4의 1.5 CV 포스페이트-완충 식염수로 세척하고: 이후, 안기오스타틴을 유동 속도 3 ml/분에서 pH 7.4의 0.2 M ε-아미노-n-카프로산으로 용출시킨다. 상당한 흡수도를 함유하는 분획을 수집하고 탈이온수로 24 내지 48 시간 동안 투석시키고 동결건조시킨다. 100 mg 총 단백질 적재로부터의 전형적인 회수량은 10 mg 안기오스타틴이다. 컬럼을 pH 7.5의 50 mM 나트륨 포스페이트/1 M NaCl의 5 컬럼 체적을 사용하여 재생시킨다.

소 모세 내피 세포 증식 분석법

소 모세 내피 세포를 전술한 방식으로 수득한다. 세포를 75 cm²세포-배양 플라스크 내에서, 10% 열-불활성 송아지 혈청, 100 U/ml 페닐실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신 및 0.25 mg/ml 퓨지존 (BioWhittaker)으로 보충된 재조합 인간 bFGF (Scios Nova, Mountainview, CA) 3 mg/ml를 함유한 DMEM 내에서 유지한다. 분석은 전술한 방식으로 수행된다.

동물 연구

6주 내지 8주 지난 수컷 C57BI/6J 쥐 (Jackson Laboratories)을 쥐 루이스 폐암-저 전이 (LLC-LM) 세포주(1 x 10⁶세포/주입)로 피하 내 접종시킨다. 이식 후 대략 14일 후, 1차 종양이 1.5 cm³에 도달했을대, 동물을 메톡시플루란으로 마취시키고 1차 종양을 외과적으로 적출한다. 절개 부위를 단순 봉합으로 봉한다. 이 그룹 내 절반가량의 동물에 재조합 또는 플라스미노겐 유도된 안기오스타틴 적재 투여량(복강내 경로에 의하여 3 mg/kg)을 수술 후 즉시 복강내 투여한 다음, 14일 동안 매일마다 1.5 mg/kg을 주입한다. 대조군 쥐에는 수술 후 14일 동안 매일마다 PBS 동일 체적을 주입한다. 모든 쥐를 1차 종양 제거 후 14일째(종양 이식 후 28일째) 도살하고, 폐를 제거하여 무게를 달고, 표면 전이를 입체현미경으로 카운팅한다.

재조합 인간 안기오스타틴 단편의 규명

총 26개의 시스테인을 함유한 인간 플라스미노겐의 크링글 1 내지 4를 함유하는 인간 안기오스타틴을 암호화하는 유전자 단편을 메틸영양 효모주인 피치아 파스토리스 내에서 발현시킨다. 피. 파스토리스 발현되는 안기오스타틴은 리신 세파로스에 결합하고 ε-아미노 카프로산에 의해 특이적으로 용출될 수 있다. 이는 플라스미노겐의 크링글 1 내지 4의 물리적 성질[참고문헌: Sottrup-Jensen, L. et al.,Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3 (1978) Ravens Press, N.Y. p. 191]인, 완전한 기능적 엡실론 아미노 카프로산-결합 크링글이 피. 파스토리스에 의해 발현되고 분비될 수 있으며 재폴딩을 필요로 하지 않는 기술에 정제될 수 있음을 나타낸다(도 36a 및 b). 플라스미노겐의 엘라스타아제에 의해 정제된 안기오스타틴 뿐만 아니라, 피. 파스토리스로부터 발현된 안기오스타틴은 크링글 1 내지 3에 대한 단일 클론 항체에 구조적으로 의존하여 식별된다[참고문헌: Castellino, Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN](도 36b). 이러한 항체는 플라스미노겐 또는 안기오스타틴의 환원형을 식별하지 못한다.

피. 파스토리스 발현된 안기오스타틴은 변성된 비환원 SDS-PAGE 쿠마시 염색 젤 상에서 49 kDa 및 51.5 kDa에서 이동하는 더블릿으로 보인다. 피. 파스토리스 발현되는 단백질은 고-만노스 유형의 다수 N-연결 글리코실화 및 소수의 O-연결 글리코실화에 의하여, 후-해독 변형된다. 피. 파스토리스 발현 안기오스타틴 네에서의 글리코실화의 정도를 측정하기 위하여, 재조합 안기오스타틴을 51.5 kDa 밴드를 49 kDa에서의 밴드로의 이동을 야기하는, 고 만노스 구조에 특이적인 엔도글리코시다아제 H로 분해시킨다(도 37a 및 b). 시알산 잔기를 제거하기 위하여, 이전의 뉴라미니다아제 처리에 의한 O-글리카나아제 분해는 더블릿의 이동 유형에 변화를 주지 않는다(데이타는 비제시). 이러한 결과는 피. 파스토리스이 (1)아마도 하기 구조를 가지는 N-연결 복합체 체인 및 (2) 어떠한 글리코실화도 일어나지 않은 형태의 안기오스타틴을 발현함을 나타낸다.

(Man)_2-150--Man

Man--GlcNAc---GlcNAc-Asn-

(Man)_1-2-Man

시험관내 소 모세 내피 세포의 억제

재조합으로 발현되는 안기오스타틴이 맥관형성 활성에 대하여 잠재적인지를 측정하기 위하여, BCE를 bFGF의 존재 하에서 배양시켜 정제된 재조합 안기오스타틴의 첨가가 BCE의 증식을 억제하는지를 측정한다. 정제된 피. 파스토리스-발현 안기오스타틴은 투여량 의존적 방식(도 38c)으로 시험관내(도 38b) 소 내피 세포의 bFGF-유도된 증식을 억제한다. 1 ㎍/ml의 재조합 안기오스타틴에서, 억제는 80% 이었다. 50%의 억제는 인간 플라스미노겐의 엘라스타아제 절단으로부터 유도된 안기오스타틴으로 수득된 것과 등가이다.

생체내 전이 억압

안기오스타틴이 일차 규명된 트랜스이식 쥐 LLC (LM) 세포주가 사용된다. 신제닉 C57B1/6J 쥐 내 피하 이식될 때, 이들 종양은 급속히 생장하여 14일만에 1.5 cm³이상의 종양을 생성한다. 1차 종양 적출 후에, 폐 안의 미세전이는 급속히 생장하여 폐 표면을 완전히 덮는다. 이러한 전이는 1차 종양 적출 후 14일째에 고도로 맥관형성시킨다. 1차 종양이 남겨졌다면, 미세전이는 잠복할 것이며 거대하게 육안으로 보이지 않을 것이다. 재조합 안기오스타틴을 쥐에 시스템식으로 투여한 다음, 전이의 생장 억압을 시험하기 위해서 1차 종양 적출이 뒤따른다. 쥐 한 마리당 하루에 30 ㎍씩 시스템식으로 투여된 피. 파스토리스 발현 안기오스타틴은 표면 전이(도 39a) 및 총 폐 무게(도 39b)의 스코어링에 의해 정량된 바와 같이 전이의 생장을 억제한다. 1차 종양이 적출되고 매일마다 재조합 안기오스타틴 또는 플라스미노겐의 엘라스타아제 분해로부터 수득된 안기오스타틴 투여를 받는 쥐의 폐 무게는 정상 쥐의 무게(190 내지 200 mg)에 비교된다. 1차 종양이 적출되고 뒤이어 매일마다 재조합 안기오스타틴의 투여를 받은 쥐의 폐는 맥관형성이 되지 않은 미세전이의 최소 수와 함께 핑크색이다(도 40). 대조적으로, 1차 종양 적출 후, 식염수로 치료받은 쥐는 맥관형성된 전이로 뒤덮인 폐를 갖는다(도 41). 또한, 이러한 연구에서 사용되는 투여량 및 규정식이법에서의 피. 파스토리스 발현 안기오스타틴에 의해 야기되는 시스템식 및 국부적 독성의 부재가 중요하다. 모든 치료받은 쥐에서 염증 또는 출혈의 증거는 없다.

피. 파스토리스에 의해 발현되는 안기오스타틴 단백질은 본래 단백질의 두 개의 중요한 물리적 성질을 보유한다: (1) 인간 플라스미노겐의 크링글 1 내지 3에 대한 단일 클론 항체에 구조적으로 의존하여 인식되고(도 36b), (2) 리신에 결합한다(도 36a 및 b). 이러한 성질은 재조합 안기오스타틴 단백질이 본래의 분자를 흉내낸 구조와 함께 발현됨을 가리킨다. 피. 파스토리스 발현 안기오스타틴 단백질은 시험관내 bFGF에 의해 자극된 소 모세 내피 세포의 증식을 억제한다(도 38). 시스템식으로 투여될 때, 재조합 안기오스타틴은 억압된 상태에서 다른 치명적 전이 루이스 폐암을 유지한다(도 39a 및 b 및 도 40).

일차 데이타는 시험관내 배양에서의 4회 계대접종 후에, 쥐로부터 적출된 루이스 폐 종양 또는 LLC 세포에서 안기오스타틴에 대한 탐지가능한 전사체가 부재함을 보여준다. 간에 의해 생성된 플라스미노겐은 1.6±0.2 μM의 안정한 플라즈마 농도에서 순환하며 유지된다. LLC-LM 종양이 안기오스타틴을 생성하기 위하여, 결합되거나 순환하는 플라스미노겐을 절단하는 효소를 생성하는 것이 가능하다. 대안적으로, 종양 좌를 유인하는 염증 세포는 이러한 효소를 생산할 수 있다.

본래의 인간 플라스미노겐 뿐만 아니라, 피. 파스토리스는 글리코실화 및 비-글리코실화 유형으로 생산될 수 있다는 것이 흥미롭다. 인간 플라스미노겐의 경우에 있어서, 단일 유전자에 대한 단일 전사체는 두 가지 형태를 모두 생산할 수 있다. TPA에서도 발견되는, 인간 플라스미노겐의 분화된 후-해독 변형의 분자적 기작은 알려져 있지 않다.

안기오스타틴은 피. 파스토리스에 의해 고도로 발현된다. 상층액은 단백질 100 mg/L를 함유한다. 따라서, 임상적 치료를 위해 필요한 양은 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 제조 및 정제되어져야 한다. 이 발현 시스템의 개발 및 전이에 대항하여 정제된 재조합 안기오스타틴의 시험관내 및 생체내 활성의 표현은 종양 생장을 억제하고 암 환자 및 맥관형성-개재 질환으로 고생받는 다른 환자의 생명을 연장하기 위해서, 이들 단편의 성능의 부과를 위한 기초를 제공한다.

실시예 29

안기오스타틴 응집체의 생성 및 투여

본 실시예는 내피 세포 증식 및 종양 생장을 억제하기 위해서 안기오스타틴 응집체의 생산 및 투여를 나타낸다. 정상적으로, 이. 콜라이로부터 생성된 재조합 단백질은 생체내 활성을 얻기 위해서 용해 및 재-폴딩(원형 재현, 환원 및 알킬화)됨을 필요로 하는 것으로 추정된다. 공정에서, 상당량의 단백질이 종종 손실된다. 이 예에서, 집합 재조합 안기오스타틴은 정제 후에 생성되며, 맥관형성 및 종양 생장을 억제하기 위해서 추가의 원형 재현, 환원 또는 알킬화 없이 직접 사용된다. 따라서, 본 실시예는 안기오스타틴을 생산하고 사용하는 효율적인 수단을 제공한다. 이러한 안기오스타틴 응집체와 전달 방법은 또한, 안기오스타틴을 지지하는 방출 수단을 제공함으로써, 효율을 최적화할 수 있다. 본원에서 사용되는 안기오스타틴 응집체는 실질적으로 정제되나, 수동으로 재-폴딩하지 않는 안기오스타틴을 의미하며, 하기에서 더 상세히 기술된다.

안기오스타틴의 발현

빠르며, 생산적이며 또한 저렴한 잇점이 있는 이. 콜라이 발현 시스템이 쥐 안기오스타틴의 발현을 위해 사용된다. 플라스미노겐 크링글 1-4의 cDNA 서열(플라스미노겐 cDNA는 ATCC로부터 구입한다)을 플랭킹하는 두 개의 올리고 프라이머가 안기오스타틴 발현 시스템을 작제하는 PCR 기저 전략을 의해 고안된다[참고문헌: Menhart, N., Shel, L.C., Kelly, R.F., and Castellino, F.J. (1991) Biochem. 30, 1948-1957; Marti, D., Schaller, J., Ochensberger, B., and Rickli, E.E. (1994) Eur. J. Biochem. 219, 455-462; Sohndel, S., Hu, C.-K., Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., and Rickli, E.E. (1996) Biochem. in press; Rejante, M.R., Byeon, I.-J.L., and Llinas, M. (1991) Biochem. 30, 11081-11092]. PCR 산물을 T7 lac 프로모터 및 올리고히스티딘 서열을 함유한 pET22 벡터(Novegen)의 Nco I 및 Xho I 좌 내로 삽입시킨다. 이후, cDNA를 lacUV5 조절 하에 T7 RNA 중합효소의 염색체 복제물을 함유하는 이. 콜라이 (BL21 균주 (DE3))내로 형질 전환시킨다. 재조합 안기오스타틴의 발현은 IPTG의 첨가에 의해 유도된다. 발현된 안기오스타틴은 숙주 세포 내에서 봉입체로서 축적되고, 쿠마시 블루 염색에 의해 총 세포 단백질의 40% 이상을 구성하는 것으로 측정된다.

본 발명은 임의의 적절한 종으로부터 유도된 재조합 안기오스타틴, 또는 이의 단편이 당업자에게 널리 알려진 다양한 벡터 및 숙주 시스템 내에서 발현하는 것을 의도한다.

안기오스타틴의 정제 및 응집

봉입체를 함유하는 고주파 분해된 숙주 세포의 불용성 분획을 25분간, 9,000 rpm에서의 원심분리에 의하여 정제하며, 반복하여 세척한다. 결과 생성된 산물은 약 80%의 안기오스타틴을 함유하며, 이는 쿠마시 블루 염색법에 의하여 측정된다. 융합 단백질의 N-말단 올리고히스티딘 도메인은 변성 조건 하에서 Ni²⁺-NTA 아가로스 컬럼 (1.5 cm x 5 cm) 내에서 킬레이트 친화 크로마토그래피로, 6M 요소 내 봉입물을 용해시킴에 의하여 재조합 안기오스타틴의 통상적이고 경제적인 정제를 가능케한다. 도 47의 7 레인에서 도시된 바와 같이, 정제된 안기오스타틴은 약 45 kD 내지 65 kD, 더 바람직하게는 약 55 kD 지점까지의 이동율을 지니며, 쿠마시 블루 염색에 의하여 SDS-PAGE 상에서 단일 밴드를 보인다. 이러한 단일 단계 크로마토그래피는 단백질을 실질적인 균일하도록 정제할 수 있으나, 본 발명은 당업자에게 잘 알려진 다양한 기타 정제 기술이 본 생성물을 얻기 위해서 사용될 수 있는 것으로 여겨진다.

용출 완충액내에서의 단백질은 4℃에서 투석물의 3회 변화와 더불어 24시간동안 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 투석된다(15,000 MWCO). 투석 동안에, 백색 침전물이 보인다. 이 후, 투석 백으로부터 샘플을 제거하고 침전물을 원심분리에 의해 제거한다. 이후, voltex를 사용하여 PBS 내의 침전물을 재현탁시켜, 동물 모델에서 사용하기 위한 고순도의 현탁액을 형성시키고 -20℃에서 보관한다. 이러한 침전물은 안기오스타틴 응집체를 제공한다. 대안적으로, 20 mM tris-HCL pH 7.9/ 150 mM NaCl이 투석 완충액으로서 사용될 수 있다. 본 발명은 다소의 투석 및 다양한 기타 투석 완충액이 본 개시 범위에서, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있는 제한 범위내에서, 안기오스타틴 응집체의 상응량을 수득하는데 활용될 수 있는 것을 의도한다.

안기오스타틴 응집체의 시험관내 시험

소 모세 내피 (BCE)세포를 실시예 8에 약술된 바와 같이 분석에 사용한다. 세포를 본 실시예에 기술된 바대로 제조된 재조합 인간 안기오스타틴 응집체로 챌린징한다. 결과는 도 42에 도시하는데, 이는 안기오스타틴 응집체에 노출된 내피 세포의 상당한 억제를 드러낸다.

안기오스타틴 응집체의 생체내 시험

모든 동물 작업이 Children's Hospital의 동물 편의시설에서 안내에 따라서 수행된다.

A. 본 실시예에 기술된 방식에 따라 제조된 집합 재조합 쥐 안기오스타틴이 닭 CAM 분석법과 함께 시험된다[참고문헌: O'Reilly, M.S., Holmgren, L., Shing, Y., Chen, C., Rosenthal, R.A., Moses, M., Lane, W.S., Cao, Y., Sage, E.H., and Folkman, J., Cell (1994) 79:315-328]. 25 ㎍ 투여량에서, 모세 형성의 억제는 100%이었다(시험된 모든 다섯 개의 닭 CAM은 2-3+ 억제 지대를 제공한다). 100 ㎍ 투여량에서, 모세 형성의 억제는 96 시간 동안 지속된다. 기타 맥관형성 억제 인자 및 플라스미노겐 유도 안기오스타틴의 효과는 대략 48 시간 지속되는 것으로 알려져 있다. 이는 안기오스타틴 응집체가 실질적인 방출 잇점을 제공하는 것을 암시한다.

B. 루이스 폐암을 C57B16 쥐의 피하 가운데-등 내로 접종한다. 전술한 바대로 제조한 0.1 ml PBS 내 1 x 10⁶세포를 쥐에 이식하며 6 이하의 그룹으로 가둔다. 종양을 다이알캘리퍼로 측정하고 종양 체적을 폭 x 폭 x 길이 x 0.52를 사용하여 측정하며, 종양 체적 (T/C)을 조절하기 위하여 치료 비율을 지난 시간 동안 측정한다.

종양 체적이 100 내지 200 mm³가 된 이후(3 내지 5일 후에 발생됨)에, 쥐를 두 개의 실험군으로 무작위 분할한다. 첫째 실험에서, 24시간마다 종양으로부터 떨어진 지점에 PBS내 집합 재조합 쥐 안기오스타틴 현탁액을 쥐에 2-3 mg/kg씩 복강내 주입시킨다. 대조군은 상대적으로 식염수만 주입받는다. 둘째 분리 실험에서(n=6마리 쥐/그룹), 24시간마다 종양으로부터 떨어진 지점에 PBS내 집합 재조합 쥐 안기오스타틴 현탁액을 쥐에 10 mg/kg씩 복강내 주입시킨다. 대조구 쥐는 상대적으로 식염수만을 주입받는다.

집합 재조합 안기오스타틴 현탁액으로 처리된 쥐에서는 어떠한 독성이나 체중 손실도 관찰되지 않는다. 쥐에서, 안기오스타틴 응집체은 여러 시간에 걸쳐서 흡수하는 주입 후에, 복강내 질량으로 보인다. 이는 점차 용해되어 안기오스타틴 응집체가 지속 방출의 효율적 수단임을 암시한다. 두 개의 투여량에서, 처리된 쥐에서 루이스 폐암 1차 종양의 생장이 상당히 억제되었다. 도 43 및 44를 참조하라. 19일(식염수 대조군 동물을 죽기 시작하고 도살된 시점)동안 단일 주입으로서 10/mg/kg/일을 주입함으로써 수득된 T/C는 0.06으로서, 이는 본 발명 이전에서 결코 얻을 수 없었던 종양 체적 감소이다.

본 실시예의 시험관내 및 생체내 결과는 인간에서의 내피 세포 증식의 억제, 맥관형성, 및 종양 생장의 억제를 위해 기술된 산물 및 공정을 사용하기 위한 성공적인 합리적 기초를 제공한다. 이론에 얽매이지 않는 한, 본 발명 방법에 의해 생산된 집합 재조합 안기오스타틴은 상이한 구조를 지닐 수 있으며, 엘라스타아제로부터 생성된 안기오스타틴 또는 정상적으로 원형 재현된 기타 정제 단백질로부터, 상이한 물리적 성질을 지닐 수 있다. 정제된 재조합 안기오스타틴은 상대적으로 큰 체적의 완충액 또는 물로 단백질 용액을 투석함에 의하여 현탁액 응집체를 형성하기 위해서 침전된다. 이는 적절하지 않은 폴딩 단백질이 불용성이며 응집되기 때문에 일어나는 것으로 여겨진다. 이전에는, 변성 집합 단백질은 생체내에서 그렇게 효과적일 것으로 기대되지 않았을 것이다. 잠재적 항 종양 활성은 또한, 복강내 부위로부터의 집합 단백질의 느리지만 일정한 용해 및 방출에 기인하는 것으로 여겨진다. 본 발명은 추가로 본래적으로 발생하거나 또는 재조합 안기오스타틴, 및 안기오스타틴 단편이 본래 또는 재조합 안기오스타틴, 또는 안기오스타틴의 집합 단편을 수득하기 위하여 상기 기술된 방법에서 사용될 수 있으며, 이들이 원형 재현을 필요로 하지 않으면서, 내피 세포 증식 및 종양 생장의 성공적 억제를 위해 사용될 수 있도록 의도한다.

전술 내용은 본 발명의 바람직한 양태에만 관한 것으로서, 부속된 청구범위에 개시된 바와 같이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 한도 내에서 수많은 변형 또는 개질이 행해질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양한 참고문헌들이 본원에 인용되었으며, 이들은 본원에서 전체적으로 통합된다.

서열목록

(1) 종합 정보:

(i) 출원인: 포크만, M. 주다

오레일리, 마이클

이하이 카오

(ii) 발명의 명칭: 안기오스타틴 단편 및 그 이용 방법

(iii) 서열 수: 45

(iv) 서신 주소:

(A) 수신인: 존스 애스큐

(B) 거리명: 피치트리 스트리트 191, 37 플로아

(C) 도시명: 아틀란타

(D) 주명: 조지아

(E) 국명: 미국

(F) 우편번호: 30303-1769

(v) 컴퓨터 판독 형태:

(A) 매체형: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM 호환 기종

(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn 발매 #1.0, 버젼 #1.30

(vi) 현행 출원 자료:

(A) 출원번호: US

(B) 출원일:

(C) 분류:

(viii) 대리인 정보:

(A) 성명: 워렌, 윌리엄 엘

(B) 등록번호: 36,714

(C) 사건 번호: 05213-0216

(ix) 통신 수단:

(A) 전화번호; 404-818-3700

(B) 팩스번호: 404-818-3799

(2) 서열 번호 1에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 812 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 쥐

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: 플라스미노겐

(xi) 서열 기술: 서열 번호 1:

(2) 서열 번호 2에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 339 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 쥐

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: 안기오스타틴 단편

(xi) 서열 기술: 서열 번호 2:

(2) 서열 번호 3에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 339 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 호모 사피엔스

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: 안기오스타틴 단편

(xi) 서열 기술: 서열 번호 3:

(2) 서열 번호 4에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 339 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 붉은털 원숭이

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: 안기오스타틴 단편

(xi) 서열 기술: 서열 번호 4:

(2) 서열 번호 5에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 339 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 돼지

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: 안기오스타틴 단편

(xi) 서열 기술: 서열 번호 5:

(2) 서열 번호 6에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 339 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 소

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: 안기오스타틴 단편

(xi) 서열 기술: 서열 번호 6:

(2) 서열 번호 7에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 79 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 쥐

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1

(xi) 서열 기술: 서열 번호 7:

(2) 서열 번호 8에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 79 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 호모 사피엔스

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1

(xi) 서열 기술: 서열 번호 8:

(2) 서열 번호 9에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 79 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 붉은털 원숭이

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1

(xi) 서열 기술: 서열 번호 9:

(2) 서열 번호 10에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 79 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 돼지

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1

(xi) 서열 기술: 서열 번호 10:

(2) 서열 번호 11에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 79 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 소

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1

(xi) 서열 기술: 서열 번호 11:

(2) 서열 번호 12에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 78 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 쥐

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K2

(xi) 서열 기술: 서열 번호 12:

(2) 서열 번호 13에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 78 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 호모 사피엔스

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K2

(xi) 서열 기술: 서열 번호 13:

(2) 서열 번호 14에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 78 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 붉은털 원숭이

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K2

(xi) 서열 기술: 서열 번호 14:

(2) 서열 번호 15에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 78 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 돼지

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K2

(xi) 서열 기술: 서열 번호 15:

(2) 서열 번호 16에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 78 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 소

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K2

(xi) 서열 기술: 서열 번호 16:

(2) 서열 번호 17에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 78 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 쥐

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K3

(xi) 서열 기술: 서열 번호 17:

(2) 서열 번호 18에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 78 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 호모 사피엔스

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K3

(xi) 서열 기술: 서열 번호 18:

(2) 서열 번호 19에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 78 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 붉은털 원숭이

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K3

(xi) 서열 기술: 서열 번호 19:

(2) 서열 번호 20에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 78 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 돼지

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K3

(xi) 서열 기술: 서열 번호 20:

(2) 서열 번호 21에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 78 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 소

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K3

(xi) 서열 기술: 서열 번호 21:

(2) 서열 번호 22에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 78 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 쥐

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K4

(xi) 서열 기술: 서열 번호 22:

(2) 서열 번호 23에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 78 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 호모 사피엔스

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K4

(xi) 서열 기술: 서열 번호 23:

(2) 서열 번호 24에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 168 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 쥐

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K2-3

(xi) 서열 기술: 서열 번호 24:

(2) 서열 번호 25에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 168 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 호모 사피엔스

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K2-3

(xi) 서열 기술: 서열 번호 25:

(2) 서열 번호 26에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 168 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 붉은털 원숭이

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K2-3

(xi) 서열 기술: 서열 번호 26:

(2) 서열 번호 27에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 168 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 돼지

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K2-3

(xi) 서열 기술: 서열 번호 27:

(2) 서열 번호 28에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 168 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 돼지

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K2-3

(xi) 서열 기술: 서열 번호 28:

(2) 서열 번호 29에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 250 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 쥐

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1-3

(xi) 서열 기술: 서열 번호 29:

(2) 서열 번호 30에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 250 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 호모 사피엔스

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1-3

(xi) 서열 기술: 서열 번호 30:

(2) 서열 번호 31에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 250 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 붉은털 원숭이

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1-3

(xi) 서열 기술: 서열 번호 31:

(2) 서열 번호 32에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 250 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 돼지

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1-3

(xi) 서열 기술: 서열 번호 32:

(2) 서열 번호 33에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 250 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 소

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1-3

(xi) 서열 기술: 서열 번호 33:

(2) 서열 번호 34에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 160 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 쥐

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1-2

(xi) 서열 기술: 서열 번호 34:

(2) 서열 번호 35에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 160 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 호모 사피엔스

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1-2

(xi) 서열 기술: 서열 번호 35:

(2) 서열 번호 36에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 160 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 붉은털 원숭이

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1-2

(xi) 서열 기술: 서열 번호 36:

(2) 서열 번호 37에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 160 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 돼지

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1-2

(xi) 서열 기술: 서열 번호 37:

(2) 서열 번호 38에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 160 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 소

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1-2

(xi) 서열 기술: 서열 번호 38:

(2) 서열 번호 39에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 352 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 쥐

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1-4

(xi) 서열 기술: 서열 번호 39:

(2) 서열 번호 40에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 352 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 호모 사피엔스

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1-4

(xi) 서열 기술: 서열 번호 40:

(2) 서열 번호 41에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 378 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 쥐

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1-4BKLS

(xi) 서열 기술: 서열 번호 41:

(2) 서열 번호 42에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 378 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형:

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 호모 사피엔스

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: K1-4BKLS

(xi) 서열 기술: 서열 번호 42:

(2) 서열 번호 43에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 30 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: DNA (게놈)

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 호모 사피엔스

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: 프라이머 154

(xi) 서열 기술: 서열 번호 43:

(2) 서열 번호 44에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 28 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: DNA (게놈)

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 호모 사피엔스

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: 프라이머 151

(xi) 서열 기술: 서열 번호 44:

(2) 서열 번호 45에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 28 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 위상: 선형

(ii) 분자형: DNA (게놈)

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편형: N-말단

(vi) 근본적 기원:

(A) 유기체: 호모 사피엔스

(vii) 직접적 기원:

(B) 클론: 프라이머 156

(xi) 서열 기술: 서열 번호 45:

Claims

내피 세포에 증식 억제량의 안기오스타틴 단편을 투여하는 것을 포함하는 내피 세포 억제 방법.
제 1 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 약 500 nM 미만의 내피 세포 ED₅₀을 가지는 방법.
제 1 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 쥐의 플라스미노겐, 인간 플라스미노겐, 붉은털 원숭이 플라스미노겐, 돼지 플라스미노겐 또는 소의 플라스미노겐으로부터 유도되는 방법.
제 1 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42 또는 이들의 조합 또는 기능적 동족체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 크링글 1 단백질 방법.
제 5 항에 있어서, 크링글 1 단백질이 약 350 nM 미만의 내피 세포 ED₅₀을 가지는 방법.
제 5 항에 있어서, 크링글 1 단백질이 서열 번호 8 또는 이의 기능적 동족체의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 크링글 2 단백질인 방법.
제 8 항에 있어서, 크링글 2 단백질이 서열 번호 13 또는 이의 기능적 동족체의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 크링글 3 단백질인 방법.
제 10 항에 있어서, 크링글 3 단백질이 약 475 nM 미만의 내피 세포 ED₅₀을 가지는 방법.
제 10 항에 있어서, 크링글 3 단백질이 서열 번호 18 또는 이의 기능적 동족체의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 크링글 2-3 단백질인 방법.
제 13 항에 있어서, 크링글 2-3 단백질이 서열 번호 25 또는 이의 기능적 동족체의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 크링글 1-3 단백질인 방법.
제 15 항에 있어서, 크링글 1-3 단백질이 약 100 nM 미만의 내피 세포 ED₅₀을 가지는 방법.
제 15 항에 있어서, 크링글 1-3 단백질이 서열 번호 30 또는 이의 기능적 동족체의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 크링글 1-2 단백질인 방법.
제 18 항에 있어서, 크링글 1-2 단백질이 서열 번호 35 또는 이의 동족체의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 크링글 1-4 단백질인 방법.
제 20 항에 있어서, 크링글 1-4 단백질이 약 150 nM 미만의 내피 세포 ED₅₀을 가지는 방법.
제 20 항에 있어서, 크링글 1-4 단백질이 서열 번호 39 및 서열 번호 40 또는 이들의 기능적 동족체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 크링글 1-4BKLS 단백질인 방법.
제 23 항에 있어서, 크링글 1-4BKLS 단백질이 서열 번호 42 또는 이의 기능적 동족체의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 투여 단계가 두 개 이상의 안기오스타틴 단편의 배합 투여를 포함하는 방법.
제 25 항에 있어서, 안기오스타틴 단편의 배합이 크링글 1 단백질 및 크링글 2 단백질을 포함하는 방법.
제 26 항에 있어서, 크링글 1 단백질이 서열 번호 8 또는 이의 기능적 동족체의 아미노산 서열을 포함하고, 크링글 2 단백질이 서열 번호 13 또는 이의 기능적 동족체의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 25 항에 있어서, 안기오스타틴 단편의 배합이 크링글 1 단백질 및 크링글 2-3 단백질을 포함하는 방법.
제 28 항에 있어서, 크링글 1 단백질이 서열 번호 8 또는 이의 기능적 동족체의 아미노산 서열을 포함하고, 크링글 2-3 단백질이 서열 번호 25 또는 이들의 기능적 동족체의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 25 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 배합이 크링글 1 단백질, 크링글 2 단백질 및 크링글 3 단백질의 배합을 포함하는 방법.
제 30 항에 있어서, 크링글 1 단백질이 서열 번호 8 또는 이의 기능적 동족체의 아미노산 서열을 포함하고, 크링글 2 단백질이 서열 번호 13 또는 이의 기능적 동족체의 아미노산 서열을 포함하며, 크링글 3 단백질이 서열 번호 18 또는 이의 기능적 동족체의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 25 항에 있어서, 안기오스타틴 단편의 배합이 크링글 2 단백질 및 크링글 3 단백질을 포함하는 방법.
제 32 항에 있어서, 크링글 2 단백질이 서열 번호 13 또는 이의 기능적 동족체의 아미노산 서열을 포함하고, 크링글 3 단백질이 서열 번호 18 또는 이의 기능적 동족체의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
포유 동물에 치료 유효량의 안기오스타틴 단편을 투여하는 것을 포함하는 맥관 형성-개재 질환이 있는 포유 동물의 치료 방법.
제 34 항에 있어서, 포유 동물이 인간인 방법.
제 34 항에 있어서, 안기오스타틴-개재 질환이 암, 관절염, 반점성 변성 및 당뇨성 망막증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
제 34 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 크링글 1 단백질, 크링글 2 단백질, 크링글 3 단백질, 크링글 2-3 단백질, 크링글 1-3 단백질, 크링글 1-2 단백질, 크링글 1-4 단백질 및 크링글 1-4BKLS 단백질 또는 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
제 34 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41 및 서열 번호 42, 또는 이들의 조합 또는 기능적 동족체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 34 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 약 500 nM 미만의 내피 세포 ED₅₀을 가지는 방법.
맥관 형성을 억제하기 위한 치료용 약물의 제조를 위한 안기오스타틴의 용도.
제 40 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 약 500 nM 미만의 내피 세포 ED₅₀을 가지는 용도.
제 40 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 쥐의 플라스미노겐, 인간 플라스미노겐, 붉은털 원숭이 플라스미노겐, 돼지 플라스미노겐, 또는 소의 플라스미노겐으로부터 유도되는 용도.
제 40 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41 및 서열 번호 42, 또는 이들의 조합 또는 기능적 동족체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 용도.
실질적으로 분리된 안기오스타틴 단편 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 내피 세포 증식 억제용 치료 조성물.
제 44 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 쥐의 플라스미노센, 인간 플라스미노겐, 붉은털 원숭이 플라스미노겐, 돼지 플라스미노겐 또는 소의 플라스미노겐으로부터 유도되는 조성물.
제 44 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 크링글 1 단백질, 크링글 2 단백질, 크링글 3 단백질, 크링글 2-3 단백질, 크링글 1-3 단백질, 크링글 1-2 단백질, 크링글 1-4 단백질 및 크링글 1-4BKLS, 또는 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조성물.
제 44 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41 및 서열 번호 42, 또는 이들의 조합 또는 기능적 동족체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 일부를 포함하는 조성물.
내피 세포 증식 억제 활성을 가지는 안기오스타틴 단편을 암호화하는 분리된 DNA 서열을 포함하는 조성물.
제 48 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 크링글 1 단백질, 크링글 2 단백질, 크링글 3 단백질, 크링글 2-3 단백질, 크링글 1-3 단백질, 크링글 1-2 단백질, 크링글 1-4 단백질 및 크링글 1-4BKLS 또는 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조성물.
제 48 항에 있어서, DNA 서열이, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41 및 서열 번호 42, 또는 이들의 조합 또는 기능적 동족체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 암호화하는 조성물.
제 48 항에 있어서, 안기오스타틴 단편을 암호화하는 DNA 서열과 결합한, 세포 내에 존재 시 안기오스타틴 단편을 발현시킬 수 있는 벡터를 추가로 포함하는 조성물.
제 51 항에 있어서, 상기 벡터를 함유하는 세포를 추가로 포함하는 조성물.
세포 내에서, 안기오스타틴 단편을 암호화하는 DNA 서열을 함유하며, 세포 내에 존재 시 안기오스타틴 단편을 발현시킬 수 있는 벡터를 형질감염시키는 것열 포함하는, 내피 세포 증식 억제 활성을 가지는 안기오스타틴 단편을 발현시키는 방법.
제 53 항에 있어서, 안기오스타틴 단편이 크링글 1 단백질, 크링글 2 단백질, 크링글 3 단백질, 크링글 2-3 단백질, 크링글 1-3 단백질, 크링글 1-2 단백질, 크링글 1-4 단백질 및 크링글 1-4BKLS 또는 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
제 53 항에 있어서, DNA 서열이, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41 및 서열 번호 42, 또는 이들의 조합 또는 기능적 동족체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 안기오스타틴 단편을 암호화하는 방법.
안기오스타틴 응집체를 포함하는, 내피 세포 증식을 억제용 조성물.
제 56 항에 있어서, 안기오스타틴 응집체가 환원성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 측정 시 대략 45 내지 65 kDa의 분자량을 가지는 조성물.
제 56 항에 있어서, 안기오스타틴 응집체가, 인간 플라스미노겐, 쥐의 플라스미노겐, 소의 플라스미노겐, 붉은털 원숭이 플라스미노겐 또는 돼지 플라스미노겐으로부터 유도되는 대략 아미노산 번호 98에서 시작하는 플라스미노겐 단편으로부터 유도되는 조성물.
제 58 항에 있어서, 안기노스타틴 응집체가 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 및 서열 번호 6 또는 이들의 기능적 동족체로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
제 56 항에 있어서, 안기오스타틴 응집체가 재조합 안기오스타틴으로부터 유도되는 조성물.
제 56 항에 있어서, 안기오스타틴 응집체가 맥관 형성-개재 질환을 억제할 수 있는 조성물.
제 61 항에 있어서, 질환이 암, 관절염, 반점성 변성 및 당뇨성 망막증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조성물.
내피 세포에 증식 억제량의 안기오스타틴 응집체를 투여하는 것을 포함하는 내피 세포 증식 억제 방법.
제 63 항에 있어서, 안기오스타틴 응집체가 환원성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 측정시 대략 45 내지 65 kDa의 분자량을 가지는 방법.
제 63 항에 있어서, 아미노 응집 안기오스타틴이, 인간 플라스미노겐, 쥐의 플라스미노겐, 소의 플라스미노겐, 붉은털 원숭이 플라스미노겐, 또는 돼지의 플라스미노겐으로부터 유도되는 대략 아미노산 번호 98에서 시작하는 플라스미노겐으로부터 유도되는 방법.
제 63 항에 있어서, 안기오스타틴 응집체가 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6 또는 이들의 기능적 동족체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 63 항에 있어서, 안기오스타틴 응집체가 재조합 안기오스타틴으로부터 유도되는 방법.
제 63 항에 있어서, 안기오스타틴 응집체가 맥관 형성-개재 질환을 억제시킬 수 있는 방법.
제 68 항에 있어서, 맥관 형성-개재 질환이 암, 관절염, 반점성 변성 및 당뇨성 망막증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
맥관 형성-개재 질환이 있는 포유 동물에게 맥관 형성-개재 질환 치료 유효량의 안기오스타틴 응집체를 투여시키는 것을 포함하는 맥관 형성-개재 질환이 있는 포유 동물의 치료 방법.
맥관 형성 억제를 위한 치료용 약물의 제조를 위한 안기오스타틴 응집체의 용도.
제 71 항에 있어서, 안기오스타틴이 환원성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 측정 시 대략 45 내지 65 kDa의 분자량을 가지는 단백질인 용도.
제 71 항에 있어서, 안기오스타틴 응집체가, 인간 플라스미노겐, 쥐의 플라스미노겐, 소의 플라스미노겐, 붉은털 원숭이 플라스미노겐 또는 돼지의 플라스미노겐으로부터 유도되는 대략 아미노산 번호 98에서 시작하는 플라스미노겐 단편으로부터 유도되는 용도.
제 71 항에 있어서, 안기오스타틴 응집체가 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6 또는 이들의 기능적 동족체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 용도.
안기오스타틴을 정제하고, 정제된 안기오스타틴을 응집시키는 것으로 이루어지는, 내피 세포 증식의 억제용 안기오스타틴 응집체의 제조 방법.
제 75 항에 있어서, 안기오스타틴을 투석시킴으로써 응집 단계를 수행하는 방법.
제 76 항에 있어서, 대략 24 시간 동안 적어도 세 개의 투석물로 투석 단계를 수행하는 방법.
제 77 항에 있어서, 대략 4℃에서 투석 단계를 수행하는 방법.
제 75 항에 있어서, 안기오스타틴 응집체가 재조합 안기오스타틴으로부터 유도되는 방법.
제 79 항에 있어서, 재조합 안기오스타틴이 올리고히스티딘 부분을 포함하며, 니켈 친화력 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제 단계를 수행하는 방법.
제 75 항에 있어서, 안기오스타틴 응집체가 환원성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 측정시 대략 45 내지 65 kDa의 분자량을 가지는 방법.
제 75 항의 방법에 의하여 제조되는 산물.
안기오스타틴 응집체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
제 83 항에 있어서, 지속-방출 매트릭스를 추가로 포함하는 조성물.
제 83 항에 있어서, 안기오스타틴 응집체가 환원성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 측정시 대략 45 내지 55 kDa의 분자량을 가지는 조성물.