JPH11285394A - Ｄｎａ配列の遺伝子輸送用アデノウイルストランスファ―ベクタ― - Google Patents
Ｄｎａ配列の遺伝子輸送用アデノウイルストランスファ―ベクタ―Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アデノウイルス輸送システムを、治療に用い
る遺伝子を輸送するために体細胞遺伝子療法に使用でき
るように修飾または改変すること。 【解決手段】 ＤＮＡ配列の遺伝子輸送用アデノウイル
ストランスファーベクターにおいて、天然のアデノウイ
ルス蛋白質をもう全く発現しないアデノウイルスプラス
ミドから製造され、（ａ）野生型アデノウイルス（血清
型５）の左逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）およびパケー
ジングシグナルを有する第１のＤＮＡ配列、および
（ｂ）野生型アデノウイルス（血清型５）の右逆方向末
端反復配列（ＩＴＲ）を有する第２のＤＮＡ配列、およ
び（ｃ）アデノウイルスＤＮＡ配列の間に挿入された治
療用遺伝子中には存在しない制限エンドヌクレアーゼの
ための切断部位および／またはマーカー遺伝子からな
り、好ましくは（ｄ）ＩＴＲはトランスファーベクター
のアデノウイルス部分の切断を可能にするが、稀にしか
切断しない制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、認識配
列が８塩基対以上）、好ましくはＦseＩの切断部位によ
って囲まれているアデノウイルストランスファーベクタ
ー。
る遺伝子を輸送するために体細胞遺伝子療法に使用でき
るように修飾または改変すること。 【解決手段】 ＤＮＡ配列の遺伝子輸送用アデノウイル
ストランスファーベクターにおいて、天然のアデノウイ
ルス蛋白質をもう全く発現しないアデノウイルスプラス
ミドから製造され、（ａ）野生型アデノウイルス（血清
型５）の左逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）およびパケー
ジングシグナルを有する第１のＤＮＡ配列、および
（ｂ）野生型アデノウイルス（血清型５）の右逆方向末
端反復配列（ＩＴＲ）を有する第２のＤＮＡ配列、およ
び（ｃ）アデノウイルスＤＮＡ配列の間に挿入された治
療用遺伝子中には存在しない制限エンドヌクレアーゼの
ための切断部位および／またはマーカー遺伝子からな
り、好ましくは（ｄ）ＩＴＲはトランスファーベクター
のアデノウイルス部分の切断を可能にするが、稀にしか
切断しない制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、認識配
列が８塩基対以上）、好ましくはＦseＩの切断部位によ
って囲まれているアデノウイルストランスファーベクタ
ー。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子輸送に適当
なアデノウイルストランスファーベクターおよびトラン
スファーベクターからなり、典型的な血友病Ａの処置に
使用することができる組み合わせ生成物に関する。
なアデノウイルストランスファーベクターおよびトラン
スファーベクターからなり、典型的な血友病Ａの処置に
使用することができる組み合わせ生成物に関する。
【０００２】
【従来技術】多くの疾患が遺伝子の欠損によって起こる
ことは知られている。これらの症例では、生体内におい
て欠損または欠乏した遺伝子を置換することが可能な場
合にのみ永久的な治癒が期待できる。これは体細胞遺伝
子治療方法の集中的な研究が行われている理由である。
これらの方法では、正常な遺伝子の単回投与または長期
間隔での反復投与によって、患者の健康の回復がもたら
される。これらの努力の一例には体細胞遺伝子療法によ
る血友病Ａの治癒の達成の試みがある。
ことは知られている。これらの症例では、生体内におい
て欠損または欠乏した遺伝子を置換することが可能な場
合にのみ永久的な治癒が期待できる。これは体細胞遺伝
子治療方法の集中的な研究が行われている理由である。
これらの方法では、正常な遺伝子の単回投与または長期
間隔での反復投与によって、患者の健康の回復がもたら
される。これらの努力の一例には体細胞遺伝子療法によ
る血友病Ａの治癒の達成の試みがある。
【０００３】血友病Ａは、血液の凝固に要求される血液
凝固第VIII因子の欠損を生じる染色体の欠陥により起こ
る。遺伝子欠損はＸ染色体上に存在し、女性の遺伝物質
により伝達されるが、女性のキャリアー自体は血友病に
はならない。血友病Ａの有望な処置は血液凝固第VIII因
子の血漿濃縮物が利用できるようになって初めて可能に
なった。ヒトドナーよりプールされた血漿からの凝固因
子濃縮物は、現在導入されている不活性化方法および個
々の精製工程自体で感染物質は不活性化または除去され
るとしても、原理的にこれまで知られていないまたは確
実には同定できない感染物質も伝達される可能性があ
る。真核細胞内で産生される組換えヒト血液凝固因子の
使用はこのような危険を著しく低下させる。しかしなが
ら、野生型第VIII因子の発現は現在まで、比較的少量し
か可能でないという欠点がある。これは、一つには血液
凝固第VIII因子の分子が２３３２個ものアミノ酸を有す
る異常に大きなポリペプチドであって、したがって、こ
れまでに用いられてきた発現系におけるｍＲＮＡの濃度
が比較的低いという事実によって説明される。さらに初
期の翻訳生成物の小胞体からゴルジ装置への輸送が、低
分泌速度のために、細胞培養上清中における低収率を反
映してあまり効率的に行われない。
凝固第VIII因子の欠損を生じる染色体の欠陥により起こ
る。遺伝子欠損はＸ染色体上に存在し、女性の遺伝物質
により伝達されるが、女性のキャリアー自体は血友病に
はならない。血友病Ａの有望な処置は血液凝固第VIII因
子の血漿濃縮物が利用できるようになって初めて可能に
なった。ヒトドナーよりプールされた血漿からの凝固因
子濃縮物は、現在導入されている不活性化方法および個
々の精製工程自体で感染物質は不活性化または除去され
るとしても、原理的にこれまで知られていないまたは確
実には同定できない感染物質も伝達される可能性があ
る。真核細胞内で産生される組換えヒト血液凝固因子の
使用はこのような危険を著しく低下させる。しかしなが
ら、野生型第VIII因子の発現は現在まで、比較的少量し
か可能でないという欠点がある。これは、一つには血液
凝固第VIII因子の分子が２３３２個ものアミノ酸を有す
る異常に大きなポリペプチドであって、したがって、こ
れまでに用いられてきた発現系におけるｍＲＮＡの濃度
が比較的低いという事実によって説明される。さらに初
期の翻訳生成物の小胞体からゴルジ装置への輸送が、低
分泌速度のために、細胞培養上清中における低収率を反
映してあまり効率的に行われない。
【０００４】これが、血液凝固第VIII因子のｃＤＮＡの
部分を切断することを目標にした研究が既にあることの
理由である。国際特許出願ＷＯ８６／０６１０１、ＷＯ
８７／０７１４４およびＷＯ９１／０９１２２には、野
生型血液凝固第VIII因子蛋白質と同じ生物活性を有する
が、動物培養細胞内でかなり大量に発現する部分切断血
液凝固第VIII因子誘導体の組換えによる生産に関して既
に報告がある。
部分を切断することを目標にした研究が既にあることの
理由である。国際特許出願ＷＯ８６／０６１０１、ＷＯ
８７／０７１４４およびＷＯ９１／０９１２２には、野
生型血液凝固第VIII因子蛋白質と同じ生物活性を有する
が、動物培養細胞内でかなり大量に発現する部分切断血
液凝固第VIII因子誘導体の組換えによる生産に関して既
に報告がある。
【０００５】すなわち、たとえば J．J．Tooleらはアミ
ノ酸９８２〜１５６２またはアミノ酸７６０〜１６３９
を欠く血液凝固第VIII因子誘導体の生産および発現を報
告している（Proc．Natl．Acad．Sci. USA (1986) 83，
5939-5942）。D．L．Eatonらは、アミノ酸７９７〜１５
６２が欠失した血液凝固第VIII因子誘導体の生産および
発現に関して報告している（Biochemistry (1986) 25，
8343-8347）。R．J．Kaufmanはアミノ酸７４１〜１６４
６を欠く血液凝固第VIII因子誘導体の発現について記載
している（国際特許出願WO87／04187）。N．Sarverらは
アミノ酸７４７〜１５６０を欠く血液凝固第VIII因子誘
導体の生産および発現について報告している（DNA (198
7) 6，553-564）。M．Pasekらはアミノ酸７４５〜１５
６２またはアミノ酸７４１〜１６４８を欠く血液凝固第
VIII因子誘導体の生産および発現について報告している
（国際特許出願WO88／00831）。K.-D．Langnerはアミノ
酸８１６〜１５９８またはアミノ酸７４１〜１６８９を
欠く血液凝固第VIII因子誘導体の生産および発現につい
て報告している（Behring Inst．Mitt．(1988)No．82，
16-25，欧州特許出願 0 295 597）。P．Meulienらはア
ミノ酸８６８〜１５６２またはアミノ酸７７１〜１６６
６を欠く血液凝固第VIII因子誘導体の生産および発現に
ついて報告している（Protein Engineering (1988) 2
(4)，301-306，欧州特許出願 0 303 540）。これらの部
分切断血液凝固第VIII因子誘導体を哺乳動物細胞系にお
いて発現させると、第VIII因子の発現は通常、野生型血
液凝固第VIII因子の生産の場合に比べて約１０倍である
ことが見出されている。
ノ酸９８２〜１５６２またはアミノ酸７６０〜１６３９
を欠く血液凝固第VIII因子誘導体の生産および発現を報
告している（Proc．Natl．Acad．Sci. USA (1986) 83，
5939-5942）。D．L．Eatonらは、アミノ酸７９７〜１５
６２が欠失した血液凝固第VIII因子誘導体の生産および
発現に関して報告している（Biochemistry (1986) 25，
8343-8347）。R．J．Kaufmanはアミノ酸７４１〜１６４
６を欠く血液凝固第VIII因子誘導体の発現について記載
している（国際特許出願WO87／04187）。N．Sarverらは
アミノ酸７４７〜１５６０を欠く血液凝固第VIII因子誘
導体の生産および発現について報告している（DNA (198
7) 6，553-564）。M．Pasekらはアミノ酸７４５〜１５
６２またはアミノ酸７４１〜１６４８を欠く血液凝固第
VIII因子誘導体の生産および発現について報告している
（国際特許出願WO88／00831）。K.-D．Langnerはアミノ
酸８１６〜１５９８またはアミノ酸７４１〜１６８９を
欠く血液凝固第VIII因子誘導体の生産および発現につい
て報告している（Behring Inst．Mitt．(1988)No．82，
16-25，欧州特許出願 0 295 597）。P．Meulienらはア
ミノ酸８６８〜１５６２またはアミノ酸７７１〜１６６
６を欠く血液凝固第VIII因子誘導体の生産および発現に
ついて報告している（Protein Engineering (1988) 2
(4)，301-306，欧州特許出願 0 303 540）。これらの部
分切断血液凝固第VIII因子誘導体を哺乳動物細胞系にお
いて発現させると、第VIII因子の発現は通常、野生型血
液凝固第VIII因子の生産の場合に比べて約１０倍である
ことが見出されている。
【０００６】部分切断血液凝固第VIII因子誘導体の発現
に関してはアミノ酸Ａrg−７３９とＧlu−１６４９の間
の第VIII因子分子の高度にグリコシル化されたドメイン
Ｂはプレ凝血原および補因子活性には不必要であること
が繰り返し観察されてきた。この認識が高収率での発現
が可能で、血液凝固第VIII因子の完全な生物活性を示
し、しかも、血友病Ａの体細胞遺伝子療法を可能にする
適当なベクターに導入できる別の部分切断血液凝固第VI
II因子誘導体の研究を促進することになった。体細胞遺
伝子療法は最近では、レシピエントの体内で短い半減期
の間しか有効ではない外来性血液凝固第VIII因子の連続
的投与を不要にすることが可能な血友病Ａの唯一の処置
方法であると考えられている。これに反して、体細胞遺
伝子療法によれば、単回投与または比較的長い間隔（数
週または数年）での反復投与によって、血液凝固第VIII
因子の適当な産生を永久的に確保することが可能であ
る。
に関してはアミノ酸Ａrg−７３９とＧlu−１６４９の間
の第VIII因子分子の高度にグリコシル化されたドメイン
Ｂはプレ凝血原および補因子活性には不必要であること
が繰り返し観察されてきた。この認識が高収率での発現
が可能で、血液凝固第VIII因子の完全な生物活性を示
し、しかも、血友病Ａの体細胞遺伝子療法を可能にする
適当なベクターに導入できる別の部分切断血液凝固第VI
II因子誘導体の研究を促進することになった。体細胞遺
伝子療法は最近では、レシピエントの体内で短い半減期
の間しか有効ではない外来性血液凝固第VIII因子の連続
的投与を不要にすることが可能な血友病Ａの唯一の処置
方法であると考えられている。これに反して、体細胞遺
伝子療法によれば、単回投与または比較的長い間隔（数
週または数年）での反復投与によって、血液凝固第VIII
因子の適当な産生を永久的に確保することが可能であ
る。
【０００７】最近、様々な遺伝子輸送系が開発され、そ
れに伴って体細胞遺伝子療法に使用できる希望が増大し
てきた。
れに伴って体細胞遺伝子療法に使用できる希望が増大し
てきた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】最も有望なシステムの
一つはエキソビボのみでなく無傷の全生体内のインビボ
においても、現在使用されている他のシステムでは達成
できないきわめて高い遺伝子輸送効率を保証する、いわ
ゆる複製欠損アデノウイルスベクターから構成される。
このタイプのベクターシステムは既に、欧州特許出願
０ ８０８ ９０５に報告されている。しかしながら、野
生型血液凝固第VIII因子のｃＤＮＡもまた生物活性血液
凝固第VIII因子誘導体をコードする部分切断血液凝固第
VIII因子ｃＤＮＡのいずれも大きすぎて、この特異的な
ベクターシステムには導入できない。
一つはエキソビボのみでなく無傷の全生体内のインビボ
においても、現在使用されている他のシステムでは達成
できないきわめて高い遺伝子輸送効率を保証する、いわ
ゆる複製欠損アデノウイルスベクターから構成される。
このタイプのベクターシステムは既に、欧州特許出願
０ ８０８ ９０５に報告されている。しかしながら、野
生型血液凝固第VIII因子のｃＤＮＡもまた生物活性血液
凝固第VIII因子誘導体をコードする部分切断血液凝固第
VIII因子ｃＤＮＡのいずれも大きすぎて、この特異的な
ベクターシステムには導入できない。
【０００９】また、国際特許出願ＷＯ９６／３３２８０
には、最早複製できないアデノウイルスベクター中に３
６ｋＢまでの大きさの異種ＤＮＡを取り込むことが可能
なアデノウイルスヘルパーウイルス系が開示されてい
る。このシステムはアデノウイルスベクター構築体、１
種または２種以上のヘルパーウイルスおよびヘルパー細
胞系から構成される。ベクター構築体は複製可能で、ヘ
ルパー細胞系を欠陥パケージングシグナルを含有するヘ
ルパーウイルスとともに投与すれば、ビリオン粒子をヘ
ルパー細胞系内にパッケージさせることができる。
には、最早複製できないアデノウイルスベクター中に３
６ｋＢまでの大きさの異種ＤＮＡを取り込むことが可能
なアデノウイルスヘルパーウイルス系が開示されてい
る。このシステムはアデノウイルスベクター構築体、１
種または２種以上のヘルパーウイルスおよびヘルパー細
胞系から構成される。ベクター構築体は複製可能で、ヘ
ルパー細胞系を欠陥パケージングシグナルを含有するヘ
ルパーウイルスとともに投与すれば、ビリオン粒子をヘ
ルパー細胞系内にパッケージさせることができる。
【００１０】したがって、本発明の目的は、この種のア
デノウイルス輸送システムを、治療に用いる遺伝子を輸
送するために体細胞遺伝子療法に使用できるように修飾
または改変することであった。
デノウイルス輸送システムを、治療に用いる遺伝子を輸
送するために体細胞遺伝子療法に使用できるように修飾
または改変することであった。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＤＮＡ配列の
遺伝子輸送用アデノウイルストランスファーベクターに
おいて、天然のアデノウイルス蛋白質を最早全く発現し
ないアデノウイルスプラスミドから製造され、（ａ）野
生型アデノウイルス（血清型５）の左逆方向末端反復配
列（ＩＴＲ）およびパケージングシグナルを有する第１
のＤＮＡ配列、および（ｂ）野生型アデノウイルス（血
清型５）の右逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を有する第
２の配列、および（ｃ）アデノウイルスＤＮＡ配列の間
に挿入された治療用遺伝子中には存在しない制限エンド
ヌクレアーゼのための切断部位および／またはマーカー
遺伝子からなり、好ましくは（ｄ）ＩＴＲはトランスフ
ァーベクターのアデノウイルス部分の切断を可能にする
が、稀にしか切断しない制限エンドヌクレアーゼ（すな
わち、認識配列が８塩基対以上）、好ましくはＦseＩの
切断部位によって囲まれているアデノウイルストランス
ファーベクターに関する。
遺伝子輸送用アデノウイルストランスファーベクターに
おいて、天然のアデノウイルス蛋白質を最早全く発現し
ないアデノウイルスプラスミドから製造され、（ａ）野
生型アデノウイルス（血清型５）の左逆方向末端反復配
列（ＩＴＲ）およびパケージングシグナルを有する第１
のＤＮＡ配列、および（ｂ）野生型アデノウイルス（血
清型５）の右逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を有する第
２の配列、および（ｃ）アデノウイルスＤＮＡ配列の間
に挿入された治療用遺伝子中には存在しない制限エンド
ヌクレアーゼのための切断部位および／またはマーカー
遺伝子からなり、好ましくは（ｄ）ＩＴＲはトランスフ
ァーベクターのアデノウイルス部分の切断を可能にする
が、稀にしか切断しない制限エンドヌクレアーゼ（すな
わち、認識配列が８塩基対以上）、好ましくはＦseＩの
切断部位によって囲まれているアデノウイルストランス
ファーベクターに関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】すべてのアデノウイルス遺伝子の
欠失では３６ｋＢまでのパッケージング能力を生じる。
プラスミドにインテグレートされたこのようなＤＮＡフ
ラグメントを後者から切り出すことを所望の場合には、
きわめて稀にしか切断しない制限エンドヌクレアーゼの
隣接する切断部位が必要である。これらのエンドヌクレ
アーゼの認識配列は通常、４、６または８塩基長であ
る。統計的に見ると、６−ｂｐ長の認識配列を認識する
エンドヌクレアーゼは４０９６塩基対毎に１回切断する
ことになるが、認識配列が８−ｂｐ長の場合は６５５３
６回に１回しか切断が起こらない。このようなミニベク
ター構築体中への様々なＤＮＡフラグメントのクローニ
ングについての異なる可能性を最大数にするには、ミニ
ベクターＤＮＡが切断された場合でも挿入されたＤＮＡ
フラグメントは切断されないようなきわめて稀にしか切
断が起こらない酵素を用いるのが賢明である。
欠失では３６ｋＢまでのパッケージング能力を生じる。
プラスミドにインテグレートされたこのようなＤＮＡフ
ラグメントを後者から切り出すことを所望の場合には、
きわめて稀にしか切断しない制限エンドヌクレアーゼの
隣接する切断部位が必要である。これらのエンドヌクレ
アーゼの認識配列は通常、４、６または８塩基長であ
る。統計的に見ると、６−ｂｐ長の認識配列を認識する
エンドヌクレアーゼは４０９６塩基対毎に１回切断する
ことになるが、認識配列が８−ｂｐ長の場合は６５５３
６回に１回しか切断が起こらない。このようなミニベク
ター構築体中への様々なＤＮＡフラグメントのクローニ
ングについての異なる可能性を最大数にするには、ミニ
ベクターＤＮＡが切断された場合でも挿入されたＤＮＡ
フラグメントは切断されないようなきわめて稀にしか切
断が起こらない酵素を用いるのが賢明である。
【００１３】図１に記載されたプラスミドｐＡｄ５ｍｉ
ｎはこのタイプのアデノウイルストランスファーベクタ
ーの一例である。プラスミドｐＵＣ１９の配列がＦseＩ
切断部位、最初に左逆方向末端反復配列およびパッケー
ジングシグナル（ＩＴＲおよびパッケージングシグナル
＝Ａｄ５ＬＥ）を介して野生型アデノウイルス（血清型
５）の塩基対１から少なくとも３５８に結合される。つ
いで、ＰacＩ、ＡscＩおよびＣlaＩ切断部位が続き、塩
基対３５７０５〜３５９３５、少なくとも塩基対３５８
３３から３５９３５で構成される右逆方向末端反復配列
（ＩＴＲ＝Ａｄ５ＲＥ）のＤＮＡ配列に連結する配列が
記載されている。ついで他のＦseＩ切断部位が挿入され
る。このプラスミド構築体は酵素ＦseＩによりＡｄ５部
分をで切断することが可能である。得られた線状のＤＮ
Ａは線状アデノウイルス野生型と同じ末端を含み、各側
にシトシン塩基１個ずつ延長されている。
ｎはこのタイプのアデノウイルストランスファーベクタ
ーの一例である。プラスミドｐＵＣ１９の配列がＦseＩ
切断部位、最初に左逆方向末端反復配列およびパッケー
ジングシグナル（ＩＴＲおよびパッケージングシグナル
＝Ａｄ５ＬＥ）を介して野生型アデノウイルス（血清型
５）の塩基対１から少なくとも３５８に結合される。つ
いで、ＰacＩ、ＡscＩおよびＣlaＩ切断部位が続き、塩
基対３５７０５〜３５９３５、少なくとも塩基対３５８
３３から３５９３５で構成される右逆方向末端反復配列
（ＩＴＲ＝Ａｄ５ＲＥ）のＤＮＡ配列に連結する配列が
記載されている。ついで他のＦseＩ切断部位が挿入され
る。このプラスミド構築体は酵素ＦseＩによりＡｄ５部
分をで切断することが可能である。得られた線状のＤＮ
Ａは線状アデノウイルス野生型と同じ末端を含み、各側
にシトシン塩基１個ずつ延長されている。
【００１４】ＦseＩは８−ｂｐ長の認識配列を有し、た
とえば血液凝固第VIII因子ｃＤＮＡを切断しない。これ
は、血液凝固第VIII因子ｃＤＮＡおよびさらに他の任意
の遺伝子／ＤＮＡ配列を含むミニベクターＤＮＡを、２
つの制限切断部位の間に位置する配列を切断することな
く切断できることを意味する。
とえば血液凝固第VIII因子ｃＤＮＡを切断しない。これ
は、血液凝固第VIII因子ｃＤＮＡおよびさらに他の任意
の遺伝子／ＤＮＡ配列を含むミニベクターＤＮＡを、２
つの制限切断部位の間に位置する配列を切断することな
く切断できることを意味する。
【００１５】同じ理由からアデノウイルス末端間の通常
の多重クローニング部位（ＭＣＳ）の切断もまた同様に
不要となる。
の多重クローニング部位（ＭＣＳ）の切断もまた同様に
不要となる。
【００１６】通常のＭＣＳにおける問題は、ＭＣＳの多
くの切断部位が血液凝固第VIII因子中にも少なくとも１
個は存在することである。これは、ＭＣＳ中に血液凝固
第VIII因子のｃＤＮＡを挿入したのちには、第VIII因子
を同時に切断することなくＭＣＳ中に第２の配列を挿入
することはもうできないことを意味する。すなわち、ア
デノウイルス末端間の第２の配列の挿入は不可能であ
る。本発明のプラスミド構築体中に存在するＡscＩ切断
部位（８ｂｐ認識配列）は、血液凝固第VIII因子の配列
を切断せず、しかも他のすべての配列を切断することも
稀である。一端をＡscＩで切断し、他端をＭluＩ（Ｍlu
ＩはＡscＩと同じ突出末端を発生する）で切断したＤＮ
ＡフラグメントをこのＡscＩ切断部位に再び結合させる
と、ライゲーション後にミニベクター構築体中にＡscＩ
切断部位が生成する。この部位は、このようにして連続
的に、血液凝固第VIII因子ｃＤＮＡまたは他の挿入配列
を切断することなく使用することができる。
くの切断部位が血液凝固第VIII因子中にも少なくとも１
個は存在することである。これは、ＭＣＳ中に血液凝固
第VIII因子のｃＤＮＡを挿入したのちには、第VIII因子
を同時に切断することなくＭＣＳ中に第２の配列を挿入
することはもうできないことを意味する。すなわち、ア
デノウイルス末端間の第２の配列の挿入は不可能であ
る。本発明のプラスミド構築体中に存在するＡscＩ切断
部位（８ｂｐ認識配列）は、血液凝固第VIII因子の配列
を切断せず、しかも他のすべての配列を切断することも
稀である。一端をＡscＩで切断し、他端をＭluＩ（Ｍlu
ＩはＡscＩと同じ突出末端を発生する）で切断したＤＮ
ＡフラグメントをこのＡscＩ切断部位に再び結合させる
と、ライゲーション後にミニベクター構築体中にＡscＩ
切断部位が生成する。この部位は、このようにして連続
的に、血液凝固第VIII因子ｃＤＮＡまたは他の挿入配列
を切断することなく使用することができる。
【００１７】本発明によれば、したがって、ＭluＩ／Ａ
scＩフラグメントを合成するための特定のプラスミドが
構築された。これはＭＣＳを介して遺伝子またはｃＤＮ
Ａを挿入できる発現カセットを有する。完全な発現カセ
ットはＭluＩおよびＡscＩで切断し、ミニベクター構築
体中のＡscＩ部位に挿入することができる。
scＩフラグメントを合成するための特定のプラスミドが
構築された。これはＭＣＳを介して遺伝子またはｃＤＮ
Ａを挿入できる発現カセットを有する。完全な発現カセ
ットはＭluＩおよびＡscＩで切断し、ミニベクター構築
体中のＡscＩ部位に挿入することができる。
【００１８】ＰacＩも、インビボ試験で必要ないＧＦＰ
配列を、他のＤＮＡ配列を切断することなく、切断する
ことを可能にする稀にしか切断しない（８ｂｐ認識配
列）酵素である。
配列を、他のＤＮＡ配列を切断することなく、切断する
ことを可能にする稀にしか切断しない（８ｂｐ認識配
列）酵素である。
【００１９】すなわち要約すれば、本発明のベクターは
マーカー遺伝子たとえば緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）また
は治療用遺伝子たとえば血液凝固第VIII因子および第IX
因子、またはたとえば、Ｅ３領域の免疫調節アデノウイ
ルス遺伝子の導入が容易に可能になるように構築された
ということができる。制限エンドヌクレアーゼＰacＩ、
ＡscＩおよびＦseＩはそれぞれ８ｂｐ長の各切断部位を
有し、したがってきわめて稀にしか切断をしない。これ
は、ＰacＩおよびＡscＩ切断部位が制限エンドヌクレア
ーゼでは切断されないことから、それらの部位は広範囲
の遺伝子の挿入を可能にすることを意味する。ＣlaＩは
より高頻度に切断するが、アデノウイルスは１個所しか
切断しない点で特徴的である。ＰacＩはＧＦＰマーカー
遺伝子のクローニングにきわめて適しているという利点
があり、一方、ＡscＩおよびＣlaＩは同一の切断部位を
介して連続的に様々な遺伝子を反復して結合することを
可能にする。ＡscＩ切断部位は、ＤＮＡフラグメントを
この切断部位にクローニングすることを可能にし、ＤＮ
Ａフラグメントが５′位置にＭulＩ切断部位を３′位置
にＡscＩ切断部位有する場合にはＡscＩ切断部位がもう
一度再生される。ＣlaＩ切断部位へのクローニングも同
様に可能である。ＤＮＡ中におけるＦseＩの切断部位の
稀な存在は、完全なプラスミドからアデノウイルス部分
を挿入された遺伝子とともに切断することを可能にす
る。
マーカー遺伝子たとえば緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）また
は治療用遺伝子たとえば血液凝固第VIII因子および第IX
因子、またはたとえば、Ｅ３領域の免疫調節アデノウイ
ルス遺伝子の導入が容易に可能になるように構築された
ということができる。制限エンドヌクレアーゼＰacＩ、
ＡscＩおよびＦseＩはそれぞれ８ｂｐ長の各切断部位を
有し、したがってきわめて稀にしか切断をしない。これ
は、ＰacＩおよびＡscＩ切断部位が制限エンドヌクレア
ーゼでは切断されないことから、それらの部位は広範囲
の遺伝子の挿入を可能にすることを意味する。ＣlaＩは
より高頻度に切断するが、アデノウイルスは１個所しか
切断しない点で特徴的である。ＰacＩはＧＦＰマーカー
遺伝子のクローニングにきわめて適しているという利点
があり、一方、ＡscＩおよびＣlaＩは同一の切断部位を
介して連続的に様々な遺伝子を反復して結合することを
可能にする。ＡscＩ切断部位は、ＤＮＡフラグメントを
この切断部位にクローニングすることを可能にし、ＤＮ
Ａフラグメントが５′位置にＭulＩ切断部位を３′位置
にＡscＩ切断部位有する場合にはＡscＩ切断部位がもう
一度再生される。ＣlaＩ切断部位へのクローニングも同
様に可能である。ＤＮＡ中におけるＦseＩの切断部位の
稀な存在は、完全なプラスミドからアデノウイルス部分
を挿入された遺伝子とともに切断することを可能にす
る。
【００２０】この種類のアデノウイルストランスファー
ベクター中には、約３５ｋｂまでのＤＮＡを有する発現
カセットを２つのアデノウイルス末端の間に挿入するこ
とができる。これは、たとえば血液凝固第VIII因子の完
全なまたは先端切断ｃＤＮＡ配列、ならびに必要に応じ
てさらに免疫調節および／またはＤＮＡ安定化遺伝子を
ウイルス構築体中に導入することを可能にする。
ベクター中には、約３５ｋｂまでのＤＮＡを有する発現
カセットを２つのアデノウイルス末端の間に挿入するこ
とができる。これは、たとえば血液凝固第VIII因子の完
全なまたは先端切断ｃＤＮＡ配列、ならびに必要に応じ
てさらに免疫調節および／またはＤＮＡ安定化遺伝子を
ウイルス構築体中に導入することを可能にする。
【００２１】図２には、発現カセットが、サイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＧＦＰおよびウシ成
長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ−ＤＮＡから構成される本
発明のトランスファーベクターの一例を示す。このプラ
スミド構築体はｐＧＡｄ５ｍｉｎと命名され、ＰacＩ切
断部位の存在により、ＦＧＰ遺伝子を後で、他の遺伝子
をクローニングしたのちでも切断することができる。
ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＧＦＰおよびウシ成
長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ−ＤＮＡから構成される本
発明のトランスファーベクターの一例を示す。このプラ
スミド構築体はｐＧＡｄ５ｍｉｎと命名され、ＰacＩ切
断部位の存在により、ＦＧＰ遺伝子を後で、他の遺伝子
をクローニングしたのちでも切断することができる。
【００２２】組換えウイルスの生産には、（ＨＥＫ−２
９３）細胞系、ならびにこの種類のアデノウイルストラ
ンスファーベクター（ｐＧＡｄ５ｍｉｎ）およびヘルパ
−ウイルスまたはヘルパープラスミドによる同時のトラ
ンスフェクションが必要である。トランスファーベクタ
ーｐＧＡｄ５ｍｉｎおよびその誘導体では、アデノウイ
ルス蛋白質部分はこれらが以後挿入されることがない限
り発現されない。アデノウイルスの合成に必要な蛋白質
はしたがって、トランスに提供されなければならない。
このためには、好ましくは野生型のウイルスが使用され
る。培養細胞中でウイルスを産生させたのち、それらは
塩化セシウム勾配によって精製および分離されなければ
ならない。
９３）細胞系、ならびにこの種類のアデノウイルストラ
ンスファーベクター（ｐＧＡｄ５ｍｉｎ）およびヘルパ
−ウイルスまたはヘルパープラスミドによる同時のトラ
ンスフェクションが必要である。トランスファーベクタ
ーｐＧＡｄ５ｍｉｎおよびその誘導体では、アデノウイ
ルス蛋白質部分はこれらが以後挿入されることがない限
り発現されない。アデノウイルスの合成に必要な蛋白質
はしたがって、トランスに提供されなければならない。
このためには、好ましくは野生型のウイルスが使用され
る。培養細胞中でウイルスを産生させたのち、それらは
塩化セシウム勾配によって精製および分離されなければ
ならない。
【００２３】上述の空のトランスファーベクターはとく
にヒト血液凝固第VIII因子のアミノ酸１〜８５２および
１５２４〜２３３２を有するポリペプチドをコードする
ｃＤＮＡの導入に適している。
にヒト血液凝固第VIII因子のアミノ酸１〜８５２および
１５２４〜２３３２を有するポリペプチドをコードする
ｃＤＮＡの導入に適している。
【００２４】この血液凝固第VIII因子ペプチドの製造に
必要なｃＤＮＡ配列は完全な血液凝固第VIII因子のｃＤ
ＮＡ（ATCC 39812−pSP64−VIII）から、制限酵素Ｓal
Ｉを使用してpBluescript II KS(−)ファジミド（Strat
agene）中へのクローニングによって得られた。これに
よって生じたｐＫＳ−ＦVIIIは、制限酵素ＥcoＮＩ（Ne
w England Biolabs）で切断し、この方法によりアミノ
酸８５３〜１５２３をコードするＤＮＡ部分を欠失させ
た。ついで、非相補性ＤＮＡ末端を実施例１に記載のオ
リゴヌクレオチドリンカー配列に連結させた。リンカー
フラグメントの正しい導入は配列決定によって確認し
た。部分切断血液凝固第VIII因子についてこのようにし
て製造されたｃＤＮＡをついで、ＳalＩ制限部位を用い
て発現プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏ（Promega）に挿入し
た。発現は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨ
Ｏ）、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）およびヒト胚腎臓細胞系
（ＨＥＫ−２９３）中で実施した。
必要なｃＤＮＡ配列は完全な血液凝固第VIII因子のｃＤ
ＮＡ（ATCC 39812−pSP64−VIII）から、制限酵素Ｓal
Ｉを使用してpBluescript II KS(−)ファジミド（Strat
agene）中へのクローニングによって得られた。これに
よって生じたｐＫＳ−ＦVIIIは、制限酵素ＥcoＮＩ（Ne
w England Biolabs）で切断し、この方法によりアミノ
酸８５３〜１５２３をコードするＤＮＡ部分を欠失させ
た。ついで、非相補性ＤＮＡ末端を実施例１に記載のオ
リゴヌクレオチドリンカー配列に連結させた。リンカー
フラグメントの正しい導入は配列決定によって確認し
た。部分切断血液凝固第VIII因子についてこのようにし
て製造されたｃＤＮＡをついで、ＳalＩ制限部位を用い
て発現プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏ（Promega）に挿入し
た。発現は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨ
Ｏ）、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）およびヒト胚腎臓細胞系
（ＨＥＫ−２９３）中で実施した。
【００２５】比較のために、野生型血液凝固第VIII因子
遺伝子のｃＤＮＡも同一の発現系に挿入した。
遺伝子のｃＤＮＡも同一の発現系に挿入した。
【００２６】部分切断血液凝固第VIII因子ポリペプチド
は野生型血液凝固第VIII因子と等しい生物活性を有する
ことを証明することが可能であった。同時に、発現速度
は発現培地が異なると相違することが観察されたが、大
部分の場合、野生型抗血液凝固第VIII因子の発現率より
もかなり高い発現速度を示した。さらに、部分切断血液
凝固第VIII因子ポリペプチドでは安定性が増大し、発現
培地中での濃縮が可能なことを示すことができ、部分切
断血液凝固第VIII因子は蛋白分解による分解に対してか
なり感度が低いことが指示された。これは発現培地中に
おける蛋白分解による分解によってかなりの消失が観察
される野生型血液凝固第VIII因子とは著しい差である。
血液凝固第VIII因子分子のＢドメインの欠失は、現時点
までその生物学的機能を説明することはできていないも
のの、その収率が増大するのみでなく、部分切断血液凝
固第VIII因子誘導体のプロテアーゼに対する安定性が改
良されるように思われる。
は野生型血液凝固第VIII因子と等しい生物活性を有する
ことを証明することが可能であった。同時に、発現速度
は発現培地が異なると相違することが観察されたが、大
部分の場合、野生型抗血液凝固第VIII因子の発現率より
もかなり高い発現速度を示した。さらに、部分切断血液
凝固第VIII因子ポリペプチドでは安定性が増大し、発現
培地中での濃縮が可能なことを示すことができ、部分切
断血液凝固第VIII因子は蛋白分解による分解に対してか
なり感度が低いことが指示された。これは発現培地中に
おける蛋白分解による分解によってかなりの消失が観察
される野生型血液凝固第VIII因子とは著しい差である。
血液凝固第VIII因子分子のＢドメインの欠失は、現時点
までその生物学的機能を説明することはできていないも
のの、その収率が増大するのみでなく、部分切断血液凝
固第VIII因子誘導体のプロテアーゼに対する安定性が改
良されるように思われる。
【００２７】部分切断血液凝固第VIII因子ポリペプチド
の上述の性質は、体細胞遺伝子療法に採用できる本発明
のトランスファーベクターへのコードｃＤＮＡの挿入に
必要な前提条件である。さらにそれは、血液凝固第VIII
因子の生理学的な合成部位である肝臓への修飾血液凝固
第VIII因子ｃＤＮＡの導入に望ましい。J．Biol．Che
m．265，7318頁以下（1990）の記載によりヒト皮膚から
の線維芽細胞において機能できる血液凝固第VIII因子の
発現は既に開示されていて、遺伝子の輸送はレトロウイ
ルスベクター系によって実施されている。しかしなが
ら、このベクター系は血液凝固第VIII因子遺伝子の肝臓
への導入には不適当である。これに反し、上述のアデノ
ウイルスベクターは肝臓への遺伝子輸送に理想的であ
る。この方法により修飾されたアデノウイルスの使用、
およびレシピエント生体の同時の、一過性のアンチ−Ｃ
Ｄ４処置を伴う遺伝子輸送のためのこのベクターの使用
は、血液凝固第VIII因子の発現を長期間にわたり高レベ
ルに安定化するものと考えられる。アンチ−ＣＤ４処置
は、遺伝子輸送のためのアデノウイルスベクターの投与
と重複して、ＣＤ４抗原に対する適当なモノクローナル
抗体によって行うのが好ましい。この輸送系の必須の要
素は、肝臓への遺伝子輸送を改良するためアンチ−ＣＤ
４戦略とＥ３陽性ベクターとの組合せである。
の上述の性質は、体細胞遺伝子療法に採用できる本発明
のトランスファーベクターへのコードｃＤＮＡの挿入に
必要な前提条件である。さらにそれは、血液凝固第VIII
因子の生理学的な合成部位である肝臓への修飾血液凝固
第VIII因子ｃＤＮＡの導入に望ましい。J．Biol．Che
m．265，7318頁以下（1990）の記載によりヒト皮膚から
の線維芽細胞において機能できる血液凝固第VIII因子の
発現は既に開示されていて、遺伝子の輸送はレトロウイ
ルスベクター系によって実施されている。しかしなが
ら、このベクター系は血液凝固第VIII因子遺伝子の肝臓
への導入には不適当である。これに反し、上述のアデノ
ウイルスベクターは肝臓への遺伝子輸送に理想的であ
る。この方法により修飾されたアデノウイルスの使用、
およびレシピエント生体の同時の、一過性のアンチ−Ｃ
Ｄ４処置を伴う遺伝子輸送のためのこのベクターの使用
は、血液凝固第VIII因子の発現を長期間にわたり高レベ
ルに安定化するものと考えられる。アンチ−ＣＤ４処置
は、遺伝子輸送のためのアデノウイルスベクターの投与
と重複して、ＣＤ４抗原に対する適当なモノクローナル
抗体によって行うのが好ましい。この輸送系の必須の要
素は、肝臓への遺伝子輸送を改良するためアンチ−ＣＤ
４戦略とＥ３陽性ベクターとの組合せである。
【００２８】適当なモノクローナル抗体はＣＤ４受容体
からのシグナル伝達の遮断するかまたは標的生体からの
ＣＤ４陽性リンパ球の欠失させる抗体である。いずれの
場合も相当するヒト化モノクローナル抗体がとくに好ま
しい。アデノウイルスベクター系は本発明によるｃＤＮ
Ａの標的臓器としての肝臓への輸送を可能にし、また一
過性のアンチ−ＣＤ４処置と組合わせてかなり改良され
た免疫寛容の確保を可能にする。
からのシグナル伝達の遮断するかまたは標的生体からの
ＣＤ４陽性リンパ球の欠失させる抗体である。いずれの
場合も相当するヒト化モノクローナル抗体がとくに好ま
しい。アデノウイルスベクター系は本発明によるｃＤＮ
Ａの標的臓器としての肝臓への輸送を可能にし、また一
過性のアンチ−ＣＤ４処置と組合わせてかなり改良され
た免疫寛容の確保を可能にする。
【００２９】
【実施例】本発明を次に以下の実施例により詳細に説明
する。
する。
【００３０】実施例１ 血液凝固第VIII因子の部分切断ｃＤＮＡの製造 株ＡＴＣＣ ３９８１２−ｐＳＰ６４−VIIIから得られ
た血液凝固第VIII因子のｃＤＮＡを、ＳalＩ制限酵素を
用いpBluescript II KS(−)ファジミド（Stratagene）
中へクローニングした。これにより生成したプラスミド
ｐＫＳ−ＦVIIIをＥcoＮＩ（New England Biolabs）で
切断し、非相補性ＤＮＡ末端を１１個の塩基対からなる
オリゴヌクレオチドリンカーを挿入することにより互い
に連結させた。 これには以下のオリゴヌクレオチドを
使用した。 配列番号１：５′G TCA GGC CTC C ３′ 配列番号２：５′AG GAG GCC TGA ３′ リンカーの正しい挿入は自動蛍光配列決定分析（Applie
d Biosystems 373A）によって証明した。得られた部分
切断ｃＤＮＡ（５.２kb）はアミノ酸８５２がアミノ酸
１５２４に連結した部分切断血液凝固第VIII因子蛋白質
をコードしている。
た血液凝固第VIII因子のｃＤＮＡを、ＳalＩ制限酵素を
用いpBluescript II KS(−)ファジミド（Stratagene）
中へクローニングした。これにより生成したプラスミド
ｐＫＳ−ＦVIIIをＥcoＮＩ（New England Biolabs）で
切断し、非相補性ＤＮＡ末端を１１個の塩基対からなる
オリゴヌクレオチドリンカーを挿入することにより互い
に連結させた。 これには以下のオリゴヌクレオチドを
使用した。 配列番号１：５′G TCA GGC CTC C ３′ 配列番号２：５′AG GAG GCC TGA ３′ リンカーの正しい挿入は自動蛍光配列決定分析（Applie
d Biosystems 373A）によって証明した。得られた部分
切断ｃＤＮＡ（５.２kb）はアミノ酸８５２がアミノ酸
１５２４に連結した部分切断血液凝固第VIII因子蛋白質
をコードしている。
【００３１】実施例２ 発現システム 野生型および部分切断血液凝固第VIII因子のｃＤＮＡは
ＳalＩ制限部位を使用して発現プラスミドｐＣＩ−ｎｅ
ｏ（Promega）にクローン化した。発現には、ＣＨＯ、
ＣＯＳ、およびＨＥＫ−２９３細胞系を使用した。細胞
培地には、ＣＨＯ細胞の場合は１０％ウシ胎児血清（Bi
oWhitaker）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶
液（BioWhitaker）およびＨａｍｓ Ｆ１２（Gibco）、
またＨＥＫ−２９３およびＣＯＳ細胞系の場合はダルベ
ッコ改良イーグル培地（Gibco）を用いた。
ＳalＩ制限部位を使用して発現プラスミドｐＣＩ−ｎｅ
ｏ（Promega）にクローン化した。発現には、ＣＨＯ、
ＣＯＳ、およびＨＥＫ−２９３細胞系を使用した。細胞
培地には、ＣＨＯ細胞の場合は１０％ウシ胎児血清（Bi
oWhitaker）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶
液（BioWhitaker）およびＨａｍｓ Ｆ１２（Gibco）、
またＨＥＫ−２９３およびＣＯＳ細胞系の場合はダルベ
ッコ改良イーグル培地（Gibco）を用いた。
【００３２】トランスフェクションは６個のマイクロタ
イタープレート（Nunc）上、細胞密度約７０％で実施
し、１５μlのリポフェクタミン（Gibco）、１.５μgの
エンドトキシンフリーのプラスミドＤＮＡ（Qiagen プ
ラスミドキットによりエンドトキシンフリー最大まで精
製）および１mlの血清低下培地（OptiMEM、Gibco）を各
マイクロタイターのプレート中で混合した。３０分間イ
ンキュベート後、トランスフェクション混合物を細胞に
加え、ついで２４時間までインキュベートした。ついで
混合物を収集し、直ちに正常培地中で細胞をインキュベ
ートすることによってトランスフェクションを停止させ
た。
イタープレート（Nunc）上、細胞密度約７０％で実施
し、１５μlのリポフェクタミン（Gibco）、１.５μgの
エンドトキシンフリーのプラスミドＤＮＡ（Qiagen プ
ラスミドキットによりエンドトキシンフリー最大まで精
製）および１mlの血清低下培地（OptiMEM、Gibco）を各
マイクロタイターのプレート中で混合した。３０分間イ
ンキュベート後、トランスフェクション混合物を細胞に
加え、ついで２４時間までインキュベートした。ついで
混合物を収集し、直ちに正常培地中で細胞をインキュベ
ートすることによってトランスフェクションを停止させ
た。
【００３３】実施例３ 血液凝固第VIII因子抗原の測定 抗原の測定は高感度血液凝固第VIII因子ＥＬＩＳＡによ
って実施した。このサンドイッチＥＬＩＳＡではプレー
トをモノクローナル抗−ヒト血液凝固第VIII因子抗体
（ESH５、American Diagnostica）でコートした。結合
した血液凝固第VIII因子はポリクローナルヒツジ抗−ヒ
ト血液凝固第VIII因子抗体（Cedarlane）およびポリク
ローナル、ペルオキシダーゼカップリングロバ抗−ヒツ
ジＩｇＧ抗体（Jackson、ImmunoResearch Laboratorie
s）で検出した。正常個体からプールした血漿を標準と
して使用した。
って実施した。このサンドイッチＥＬＩＳＡではプレー
トをモノクローナル抗−ヒト血液凝固第VIII因子抗体
（ESH５、American Diagnostica）でコートした。結合
した血液凝固第VIII因子はポリクローナルヒツジ抗−ヒ
ト血液凝固第VIII因子抗体（Cedarlane）およびポリク
ローナル、ペルオキシダーゼカップリングロバ抗−ヒツ
ジＩｇＧ抗体（Jackson、ImmunoResearch Laboratorie
s）で検出した。正常個体からプールした血漿を標準と
して使用した。
【００３４】血液凝固第VIII因子活性は、天然の血液凝
固第VIII因子フリー血漿に基づく一段階アッセイおよび
免疫吸着による血液凝固第VIII因子フリー血漿（Immun
o）に基づく一段階アッセイの両者を用いて色素原アッ
セイ［DADE（登録商標）血液凝固第VIII因子色素原、Ba
xter］により測定した。
固第VIII因子フリー血漿に基づく一段階アッセイおよび
免疫吸着による血液凝固第VIII因子フリー血漿（Immun
o）に基づく一段階アッセイの両者を用いて色素原アッ
セイ［DADE（登録商標）血液凝固第VIII因子色素原、Ba
xter］により測定した。
【００３５】実施例４ 完全欠失アデノウイルストランスファーベクターの構築 野生型アデノウイルス（血清型５）のＩ鎖に基づき、
３′末端の２３１ｂｐを、以下の塩基配列のプライマ
ー、Ａｄ５−ＲＥ−ＡおよびＡｄ５−ＲＥ−Ｂを用いて
ＰＣＲにより増幅させた。 プライマーＡｄ５−ＲＥ−Ａ（配列番号３）の塩基配列： ５′TTG GCG CGC CAT CGA TGC CCA GAA ACG AAA GCC AAA AAA CCC ３′ プライマーＡｄ５−ＲＥ−Ｂ（配列番号４）の塩基配列： ５′CCC AAG CTT GGC CGG CCA TCA TCA ATA ATA TAC CTT ATT TTG G ３′ これにより、５′位置におけるＡscＩおよびＣlaＩ制限
エンドヌクレアーゼ切断部位、ならびに３′位置におけ
るＦseＩおよびＨind III切断部位のＰＣＲ産物への結
合を生じた。ＡscＩおよびＨind III切断部位を介する
ＰＣＲ産物のプラスミドｐＮＥＢ１９３（New England
Biolabs）へのクローニングが可能であった。得られた
プラスミドはｐＵＣＲＥと命名した。
３′末端の２３１ｂｐを、以下の塩基配列のプライマ
ー、Ａｄ５−ＲＥ−ＡおよびＡｄ５−ＲＥ−Ｂを用いて
ＰＣＲにより増幅させた。 プライマーＡｄ５−ＲＥ−Ａ（配列番号３）の塩基配列： ５′TTG GCG CGC CAT CGA TGC CCA GAA ACG AAA GCC AAA AAA CCC ３′ プライマーＡｄ５−ＲＥ−Ｂ（配列番号４）の塩基配列： ５′CCC AAG CTT GGC CGG CCA TCA TCA ATA ATA TAC CTT ATT TTG G ３′ これにより、５′位置におけるＡscＩおよびＣlaＩ制限
エンドヌクレアーゼ切断部位、ならびに３′位置におけ
るＦseＩおよびＨind III切断部位のＰＣＲ産物への結
合を生じた。ＡscＩおよびＨind III切断部位を介する
ＰＣＲ産物のプラスミドｐＮＥＢ１９３（New England
Biolabs）へのクローニングが可能であった。得られた
プラスミドはｐＵＣＲＥと命名した。
【００３６】アデノウイルス５′末端の４３６ｂｐを同
様にプライマー、Ａｄ５−ＬＥ−Ａ２およびＡｄ５−Ｌ
Ｅ−Ｂ２を用いて増幅させた。 プライマーＡｄ５−ＬＥ−Ａ２（配列番号５）の塩基配列： 5′GGG ACG TCG GCC GGC CAT CAT CAA TAA TAT ACC TTA TTT TGG 3′ プライマーＡｄ５−ＬＥ−Ｂ２（配列番号６）の塩基配列： 5′TTG ACG TCG GCG CGC CTT AAT TAA CGC CAA CTT TGA CCC GGA ACG C 3′ このＰＣＲ産物は、５′末端に結合した酵素ＡatＩおよ
びＦseＩ切断部位ならびに３′末端に結合したＰacＩお
よびＡscＩ切断部位によりＡatＩおよびＡscＩを介して
ｐＵＣＲＥへのクローニングが可能であった。
様にプライマー、Ａｄ５−ＬＥ−Ａ２およびＡｄ５−Ｌ
Ｅ−Ｂ２を用いて増幅させた。 プライマーＡｄ５−ＬＥ−Ａ２（配列番号５）の塩基配列： 5′GGG ACG TCG GCC GGC CAT CAT CAA TAA TAT ACC TTA TTT TGG 3′ プライマーＡｄ５−ＬＥ−Ｂ２（配列番号６）の塩基配列： 5′TTG ACG TCG GCG CGC CTT AAT TAA CGC CAA CTT TGA CCC GGA ACG C 3′ このＰＣＲ産物は、５′末端に結合した酵素ＡatＩおよ
びＦseＩ切断部位ならびに３′末端に結合したＰacＩお
よびＡscＩ切断部位によりＡatＩおよびＡscＩを介して
ｐＵＣＲＥへのクローニングが可能であった。
【００３７】これにより図１に示すプラスミドが生じ
た。このプラスミド構築体はＡｄ５部分を酵素ＦseＩで
切断することを可能にする。得られる線状ＤＮＡは線状
アデノウイルス野生型と同じ末端を含み、各側でシトシ
ン１個だけ延長されている。
た。このプラスミド構築体はＡｄ５部分を酵素ＦseＩで
切断することを可能にする。得られる線状ＤＮＡは線状
アデノウイルス野生型と同じ末端を含み、各側でシトシ
ン１個だけ延長されている。
【００３８】実施例５ プラスミドｐＡｄ５ｍｉｎへの発現カセットの導入 緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のＤＮＡを、ｐＥＧＦＰ−Ｎ
１（Clontech）から切断部位ＢamＨＩおよびＸbaＩを介
してｐＡＢＳ.４（Microbix）にクローニングした。プ
ロモーターおよびポリＡシグナルはｐＲc／ＣＭＶ（Inv
itrogen）からＡpoＩ／ＥcoＲＩおよびＫpaＩまたはＸb
aＩおよびＸhoＩ／ＳalＩ切断部位を介して上記構築体
にクローン化した。このプラスミドは、ｐＡＧＦＰ／Ｃ
Ｂと命名した。ＧＦＰは、発現カセットおよびカナマイ
シン抵抗性とともにこのプラスミドからＰacＩ切断部位
によって単離し、ｐＡｄ５ｍｉｎにクローン化すること
が可能であった。ついでこのプラスミドからＳawＩ切断
部位を介して抵抗性を欠失させることができた。このプ
ラスミド構築体はｐＧＡｄ５ｍｉｎと命名された。Ｐac
Ｉ切断部位の存在は稀なことから、ＧＦＰ遺伝子を後
で、他の遺伝子がクローニングされたのちでも、このプ
ラスミドから切断することは常に可能である。
１（Clontech）から切断部位ＢamＨＩおよびＸbaＩを介
してｐＡＢＳ.４（Microbix）にクローニングした。プ
ロモーターおよびポリＡシグナルはｐＲc／ＣＭＶ（Inv
itrogen）からＡpoＩ／ＥcoＲＩおよびＫpaＩまたはＸb
aＩおよびＸhoＩ／ＳalＩ切断部位を介して上記構築体
にクローン化した。このプラスミドは、ｐＡＧＦＰ／Ｃ
Ｂと命名した。ＧＦＰは、発現カセットおよびカナマイ
シン抵抗性とともにこのプラスミドからＰacＩ切断部位
によって単離し、ｐＡｄ５ｍｉｎにクローン化すること
が可能であった。ついでこのプラスミドからＳawＩ切断
部位を介して抵抗性を欠失させることができた。このプ
ラスミド構築体はｐＧＡｄ５ｍｉｎと命名された。Ｐac
Ｉ切断部位の存在は稀なことから、ＧＦＰ遺伝子を後
で、他の遺伝子がクローニングされたのちでも、このプ
ラスミドから切断することは常に可能である。
【００３９】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：11 配列の型：オリゴヌクレオチド 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：化学合成 配列の特徴：リンカー 配列： G TCA GGC CTC C 配列番号：２ 配列の長さ：11 配列の型：オリゴヌクレオチド 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：化学合成 配列の特徴：リンカー 配列： AG GAG GCC TGA 配列番号：３ 配列の長さ：42 配列の型：オリゴヌクレオチド 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：化学合成 配列の特徴：プライマー 配列： TTG GCG CGC CAT CGA TGC CCA GAA ACG AAA GCC AAA AAA CCC 配列番号：４ 配列の長さ：43 配列の型：オリゴヌクレオチド 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：化学合成 配列の特徴：プライマー 配列： CCC AAG CTT GGC CGG CCA TCA TCA ATA ATA TAC CTT ATT TTG G 配列番号：５ 配列の長さ：42 配列の型：オリゴヌクレオチド 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：化学合成 配列の特徴：プライマー 配列： GGG ACG TCG GCC GGC CAT CAT CAA TAA TAT ACC TTA TTT TGG 配列番号：６ 配列の長さ：46 配列の型：オリゴヌクレオチド 配列の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：化学合成 配列の特徴：プライマー 配列： TTG ACG TCG GCG CGC CTT AAT TAA CGC CAA CTT TGA CCC GGA ACG C
【図１】本発明のタイプのアデノウイルストランスファ
ーベクターの一例であるプラスミドｐＡｄ５ｍｉｎを示
す。
ーベクターの一例であるプラスミドｐＡｄ５ｍｉｎを示
す。
【図２】発現カセットが、サイトメガウイルス（ＣＭ
Ｖ）プロモーター、ＧＦＰおよびウシ成長ホルモン（Ｂ
ＧＨ）ポリＡ−ＤＮＡから構成される本発明のトランス
ファーベクターの一例を示す。
Ｖ）プロモーター、ＧＦＰおよびウシ成長ホルモン（Ｂ
ＧＨ）ポリＡ−ＤＮＡから構成される本発明のトランス
ファーベクターの一例を示す。
Claims (7)
- 【請求項１】 ＤＮＡ配列の遺伝子輸送用アデノウイル
ストランスファーベクターにおいて、天然のアデノウイ
ルス蛋白質を最早全く発現しないアデノウイルスプラス
ミドから製造され、 （ａ）野生型アデノウイルス（血清型５）の左逆方向末
端反復配列（ＩＴＲ）およびパケージングシグナルを有
する第１のＤＮＡ配列、および（ｂ）野生型アデノウイ
ルス（血清型５）の右逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を
有する第２のＤＮＡ配列、および（ｃ）アデノウイルス
ＤＮＡ配列の間に挿入された治療用遺伝子中には存在し
ない制限エンドヌクレアーゼのための切断部位および／
またはマーカー遺伝子からなり、好ましくは（ｄ）ＩＴ
Ｒはトランスファーベクターのアデノウイルス部分の切
断を可能にするが、稀にしか切断しない制限エンドヌク
レアーゼ（すなわち、認識配列が８塩基対以上）、好ま
しくはＦseＩの切断部位によって囲まれているアデノウ
イルストランスファーベクター。 - 【請求項２】 第１のＤＮＡ配列は野生型アデノウイル
ス（血清型５）の塩基対１から少なくとも３５８までか
ら、第２のＤＮＡは塩基対３５７０５〜３５９３５、少
なくとも塩基対３５８３３〜３５９３５からなる請求項
１記載のトランスファーベクター。 - 【請求項３】 それぞれの場合とも同種または異種ｃＤ
ＮＡ配列の同一制限部位への連続的な反復結合を可能に
する制限エンドヌクレアーゼＣlaＩおよび／またはＡsc
Ｉ切断部位からなる請求項１または２に記載のトランス
ファーベクター。 - 【請求項４】 ヒト血液凝固第VIII因子の完全なｃＤＮ
Ａ配列またはアミノ酸１〜８５２および１５２４〜２３
３２をコードする部分切断ｃＤＮＡ配列を含有する発現
カセット、ならびに必要に応じて免疫調節および／また
はＤＮＡ安定化遺伝子を含む他の発現カセットからなる
請求項１〜３のいずれかに記載のトランスファーベクタ
ー。 - 【請求項５】 さらにベクターからの削除に適当な切断
部位によって囲まれた１種または２種以上のマーカー遺
伝子からなる請求項１〜４のいずれかに記載のトランス
ファーベクター。 - 【請求項６】 アデノウイルスヘルパーウイルスまたは
ヘルパープラスミドおよびヘルパー細胞系を用いて構築
された請求項１〜５のいずれかに記載のトランスファー
ベクター。 - 【請求項７】 体細胞遺伝子療法に使用できる医薬を製
造するための請求項１〜６のいずれかに記載のトランス
ファーベクターの使用。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| DE19807265:1 | 1998-02-20 | ||
| DE19807265A DE19807265C2 (de) | 1998-02-20 | 1998-02-20 | Adenoviraler Transfervektor für den Gentransport einer DNA-Sequenz |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11285394A true JPH11285394A (ja) | 1999-10-19 |
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Family Applications (1)
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|---|---|
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| JP (1) | JPH11285394A (ja) |
| KR (1) | KR19990072793A (ja) |
| AU (1) | AU754272B2 (ja) |
| CA (1) | CA2261183A1 (ja) |
| DE (1) | DE19807265C2 (ja) |
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| EP1252897A4 (en) * | 2000-01-21 | 2003-07-30 | Hisamitsu Pharmaceutical Co | MEDICINES FOR GENE THERAPY |
| KR20030068337A (ko) * | 2002-02-15 | 2003-08-21 | 사회복지법인삼성생명공익재단(삼성서울병원) | 유전자치료용 진핵발현벡터 |
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| US5919676A (en) * | 1993-06-24 | 1999-07-06 | Advec, Inc. | Adenoviral vector system comprising Cre-loxP recombination |
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| WO1997032481A1 (en) * | 1996-03-07 | 1997-09-12 | The Regents Of The University Of California | Helper-free, totally defective adenovirus for gene therapy |
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-
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- 1999-02-18 AU AU17378/99A patent/AU754272B2/en not_active Ceased
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- 1999-02-19 CA CA002261183A patent/CA2261183A1/en not_active Abandoned
- 1999-02-20 KR KR1019990005666A patent/KR19990072793A/ko not_active Application Discontinuation
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