TW434260B - New variants of apolipoprotein A-I - Google Patents

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43426 經濟部中央操準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（1) 本發明係關於一種新穎阿朴脂蛋白A-Ι變異株。亦係關 於編碼此種新穎變異株之任一種核酸。此外，係關於此種 蛋白質或此等核酸用於治療用途。特別本發明係關於特別 於位置151含有突變阿朴脂蛋白A-Ι新穎變異株。 阿朴脂蛋白A-I(apoA-I)爲高密度脂蛋白（HDL)的主要成 分，係由膽固醇，磷脂質及三酸甘油酯組成的巨分子複合 體。apoA-I爲一種包括243個胺基酸脂蛋白酯，以含267個 殘基之前原蛋白質形式合成，分子量28,000道爾呑（daltons) 。apoA-I之前原形於人體係由肝臟及腸合成。然後此型蛋 白質割裂成原蛋白質分泌於血漿。然後於血管腔内原 apoA-I經由鈣相關蛋白酶作用轉成成熟蛋白質（243胺基酸） 。apoA-I於脂蛋白代謝作用上具有結構角色及活性角.色： apoA-I特別爲負貴酯化血漿膽固醇之卵磷脂：膽固醇轉醯 酶(LCAT)之輔因子。 iiDL·部份中膽固醇含量及apoA-I之血漿濃度爲人類發生 動脈粥瘤硬化的負面危險因予。流行病學研究驗證HDL膽 固醇及apoA-I濃度與心血管病盛行率成反比（E.G. Miller et al., Lancet, 1977: 965-968)。相反地，長壽顯然與HDL膽固 醇濃度高有關。近來，於表現人類a po脂蛋白A-Ι之轉移基 因小鼠模式驗證apoA-I的保護角色（Rubin et _al., Nature) 〇 類似地，兔體灌流HDL誘生病變退行（Badimon et al.，J. Clin. Invest. 85, 1234-41，1990)。曾經提出多種不同機轉來 解釋HDL的保護效果，特別HDL於膽固醇反相運輸扮演的 角色（Fruchart et al.，Circulation，87: 22-27, 1993)及 HDL之 -4- 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐> (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

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U B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（2) 抗氧化劑作用（Forte T.，Current Opinion in Lipidology，5: 354-364, 1994)。

ApoA-I編碼基因曾經選殖及決定序列（Sharpe et al.， Nucleic Acids Res. 12 (9) (1984) 3.917)。此·基因長 1863 bp ，包括4個有功能基因和3個無功能基因。也曾描述apoA-I 編碼 cDNA (Law et al.，PNAS 81 (1984) 66)。此種 cDNA 包 括840 bp(參見序列識別編號1)。除野生型apoA-I外，先前 技術曾經描述不同的天然變異株，此等變異株與野生型蛋 白質間之差異列舉於下表： 變異株： 突變 變異株： 突變 Milano Argl73Cys Norway Glul36Lys Marburg Lysl〇70 Prol65Arg Munster2B Alal58Glu Pro3His Giessen Prol43Arg ArglOLeu Munster3 A Asp 103Asn Gly26Arg Munster3B Pro4Arg Asp89Glu Munster3C Pro3Arg Lysl07Met Munster3D Asp213Gly Glul39Gly Munster4 Glul98Lys Glul47VaI Yame Asp 13Tyr Alal58GIu Asp213Gly Glul69Gln Argl77His 本發明鑑別一系列新穎阿朴脂蛋白A -1變異株。此系列 變異株，特別於位置151之精胺酸殘基被半胱胺酸殘基置 -5- 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（2! 〇 X 297公嫠） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

4 3 4260 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（3) 換°根據本發明之ap〇A-I變異株具有値得重视的治療性質 。具有特別重要的抗動脈粥瘤生成保護作用。如此，於血 中二酸甘油酯過高相關的HDL部份膽固醇濃度極低的情沉 下’存在有此種變異株可防止發生動脈粥瘤硬化，證實此 種突變aP〇A-I具有極爲強力的保護角色。此外，根據本發 明之apoA-I存在有半胱胺酸可經由雙硫.橋形成二聚物及其 它複合體。apoA-I呈自由形出現於血漿，自身結合成二元 體或與阿朴脂蛋白A-II，（乃另一種重要的HDL相關蛋白質 序列中已含半胱胺酸）結合。此外，位置1 5 j之精胺酸喪失 電荷造成此種變異株於等電對焦血漿蛋白質後，接著藉免 疫學方式檢測apoA-I可見此種突變株。 鑑於此種特別令人矚目的抗動脈粥瘤生成性質，根據本 發明足新穎蛋白質於心血管病之治療與預防上可提供實質 治療優點。 因此本發明之第一主旨係有關一系列於位置i 5丨包括一 個半胱胺酸之人類阿朴脂蛋白Ad變異株。參考品何朴A4 之胺基酸序列述於參考文獻（參見Law，引述如上）^此序 列包含前原區（殘基1至24)，述於序列識別编號1。因此根 據本發明之變異株之一個特點在於成熟阿朴A 位置丨5丨（對 應於序列識別編號位置175)存在有—個半胱胺酸置換參考 序列中存在的精胺酸。根據本發明之較佳變異株包括肽序 列序列識別編號2,又更佳肽序列位在序列識別編號丨之殘 基68與267間而殘基175由半胱胺酸置換。 根據本發明之變異株，特別可以阿朴Ad巴黎表示，換言 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4规格（210X297公釐） (請先閲绩背面之注意事項再填寫本頁). 浪-

Jy 434260 五、發明説明（4) 夂，相對於天然阿朴A-I之位 补Α·Ι。根據本發明之變里株，也；：；個半胱胺酸之阿 脂蛋白…它結構修改株二 置換殘基之其它突變= 包括藉半胱胺酸 株阿朴化黎及阿朴八：蘭二種特，株組合變異 變，改微π 4t , 蘭大老。也可存在有其它突 欠不3顯著知改阿朴A-Ι性質的殘基。此等變異株 活性特別可藉膽固醇流出試驗證實。 又、 :巧本發明之變異株可以多種方式獲得。可利用業界人 自參考阿朴以。較佳蛋白質：：：；成擁也可精突變得 貝馬里組株，換T之，經由於 、.田胞寄主表現對應核酸所得者（容後詳述）。 如前述，根據本發明之變異株可爲單體形成二元體形。 變異株序列中存在有至少一個半耽胺酸可藉雙硫鍵 、’.p生產一元體。二元體可苠阁觉_ _ — 虹』馬问質一兀體，換言之，包括二 分子根據本發明之變異株之二元體（例如二阿朴W巴黎）； 或雜二讀，換言之’包括—分子根據本發明之變異株及 另-分子具有自由半胱胺酸之二元體(例如阿朴W巴黎： 阿朴A-II)。 本發明之另-主曰係關於編碼如前定義之阿朴脂蛋白 變異株之核酸。本發明之核酸可爲去氡核糖核酸（dna)或 核糖核酸（RNA)。DNA中，可使用互補DNA(cDNA)，基因 組DNA(gDNA)，雜交體序列4合成或半合成序列。此外 ’核酸可以化學方式修改’例如増加對核酸酶的抗性，增 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210 X ：W公釐） I -I"· -I- - 11II y^y 1H (請先閲讀背面之注意事項再填寫本貰) 4r 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 434260 五、發明説明（5) 細胞鎖定目標及治療效果。此等核酸可爲 :類，動物’植物’細菌，病毒或合成來源。可藉業 學人“ “ π… ㈣精释檢基因存庫，或藉化 二成或D卜Μ含化學或酶學修改基㈣庫所得 牝合方法獲得。 較佳，核酸爲cDNA或gDNA。 更佳，本發明核酸包括序列識別編號2序列。又更佳， 包括序列識別編號1 〇序列。 本發明核酸較佳包括-個轉錄啓動基因區其於目標細胞 或有機體發揮功能，以及位在3,區其界定轉綠終結信號及 一個聚腺甞化位置。此組元體構成表現卡匣。至於啓動基 因區可爲天然負貴阿朴Α_ϊ基因表現之啓動基因區，或當 阿朴A-Ι變異株可於相關細胞或有機體内發揮功能時，得 自阿朴A-Ι變異株。啓動基因區也包括多種來源區（負責其 它蛋白質之表現）或甚至合成區。特別，包括眞核細胞基 因或病毒基因之啓動基因序列。例如，包括得自目標序列 基因组之啓動基因序列。眞核細.胞啓動基因中，可使用特 異性或以其它方式誘生性，或以其它方式強或弱刺激或壓 制基因轉錄的啓動基因或衍生序列。特別可使用泛在的啓 動基因（例如HPRT，PGK，vimentin，a -actin，及結合桿 菌式基因之啓動基因），治療基因之啓動基因（例如MDR， CFTR之啓動基因及因子VIII基因），組織特異性啓動基因（ 例如丙_酸激酶，villin，腸脂肪酸結合蛋白質及平滑肌沈 -actin基因之啓動基因）或另外負貴刺激的啓動基因（例如類 8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公澄） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

434260 A7 B7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（6) 固醇激素受體維生素A酸受體）。同理，可使用得自病毒基 因組之啓動基因序列例如腺病毒E1A及MLp基因之啓動基 因，CMV早期啓動基因及RSVLTR*動基因。此外，此等 啓動基因區可藉添加活化序列或調節序列，或可做組織特 異性或泛在性表現之序列修改。 此外’核酸亦含可指導合成產物進入目標細胞分泌路徑 的信號序列。信號序列可爲阿朴A 天然信號序列，但亦 可爲任何其它功能信號序列或人造信號序列。 本發明核酸可用於經由於重組株寄主細胞表現生產重組 株阿朴A-Ι變異株’或直接用做藥品用於基因或細胞療法 〇 欲生產本發明之重組變異株，核酸較佳併入病毒或質體 媒傳者’該媒傳者可爲可自行複製或整合的媒傳者。然後 此媒傳者用於轉移感染或感染特選細胞族群。如此獲得的 轉移感染或感染細胞隨後於可表現核酸之條件下培育，分 離本發明之重組阿朴A-Ι變異株。可用於藉重組手段生產 本發明變異株之細胞寄主爲眞核或原核寄主。較佳眞核寄 主有例如動物細胞酵母或眞菌。較佳酵母例如爲釀母菌屬 (Saccharomyces)，Kluyveromyces，Pichia，Schwanniomyces 或Hansenula種屬。較佳動物細胞有例如c〇S，CHO，CI27 及NIH-3T3細胞。較佳眞菌有例如麴菌屬（Aspergillus spp.) 或Trichoderma spp·。至於原核寄主，較佳使用下列細菌： 大腸桿菌，桿菌或鏈絲菌。然後如此分離的變異株可鐘於 其治療效果包裝。 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐）

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I 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 434260 A7 B7 五、發明説明（7 ) 根據特佳具體例，本發明核酸直接用做藥品供基因或細 胞啦療用。就此方面而言，可直接注射治療部位或與投藥 、田U培θ而使用。曾報告某核酸無需特殊媒傳者即可 進入細胞。雖s如此，但本發明中較佳使用投藥媒傳者， (1)可改良細胞參透效果，（ii)改良鎖定目標及…丨）改良胞外 及胞内安定性。 根據特殊具體例，本發明係關於包括如前定義之核酸之 媒傳者。 可使用各型媒傳者。媒傳者可爲病毒性或非病毒性。 較佳具體例中，本發明之媒傳者爲病毒媒傳者。 使用病毒媒傳者係基於病毒之天然轉移感染性質。如此 可使用腺病毒’疱疹病毒，反錄病毒，腺-相關病毒或另 外牛痘病毒。此等媒傳者由轉移感染觀點看來特別有效。 特別有關腺病毒，曾經特徵化其結構與性質略有不同的 多種血清型。此等血清型申，根據本發明較佳使用人類腺 病毒2型或5型（Ad 2或Ad 5)或動物來源之腺病毒（參見申請 案W094/26914)。根據本發明可使用之動物來源腺病毒中 ，以犬’牛’鼠（例如 Mavl，Beard et al” Virology 75 (1990) 81)，羊’豬’禽或另外猿（例如SAV)來源之腺病毒爲佳。 更佳’動物來源之病毒爲犬腺病毒，又更佳CAV2腺病毒[ 例如種株A26/61 (ATCC VR-800)]。較佳，人類或犬或混合 來源之腺病毒用於本發明。 較佳，本發明之缺陷腺病毒包括ITRs，ITR爲一種可使 感興趣的基因包囊的序列。又更佳，於本發明之腺病毒基 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) > 訂 4 42 ο Ο Α7 _Β7____ 五、發明説明（8) 因組中，至少El區爲無功能。病毒基因可藉任一種業界已 知技術》特別經由全刪除，取代，部份刪失或加成一或多 個鹼基於該基因而變成無功能。此等修改可於試管試驗（ 於分離的DNA)或於原處，例如利用基因工程技術，或另 外利用突變發生劑處理獲得。其它區域可修改，特別E3區 (WO95/02697)，E2 區（W094/28938)，E4區（W094/28152， W094/12649，WO95/02697)及 L5 區（WO95/02697)。根據特 佳具體例具有E1或E4區全部或部份刪失的重組株腺病毒用 於本發明。此型媒傳者可提供特隹安全性質。 本發明之缺陷重組株腺病毒可藉業界人士已知之任一種 技術製備（Levrero et al.，Gene 101 (1991) 195, EP 185,573; Graham，EMBO J. 3 (1984) 2917)。特別，可經由腺病，毒與 載有本發明之核酸或卡匣等之質體間進行同系重組製備。 同系重组係於腺病毒及質體共同轉移感染入適當細胞株後 進行。所用細胞株較佳⑴可適合藉該等原體轉形，及（ii) 含有可互補缺陷腺病毒基因組缺陷區序列，較佳呈整合一 體形俾避免重組風險。至於細胞株範例以人類胚胎腎株 293 (Graham et al·，J. Gen. Virol 36 (1977) 59)爲佳，該株 含有特別於基因組内整合有Ad 5腺病毒基因組之左手部份 (12°/。）。其它株述於申請案 W094/26914及WO95/02697。 隨後，已經增生的腺病毒根據分子生物學標準技術回收 及純化，如範例之舉例説明。 至於腺相關病毒（AAV)，爲相當小的DNA病毒，其穩定 且以位置特異性方式整合入其感染的細胞基因組。其可感 -11 - 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） -------..—-----「：^------訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本I·)

.I 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 542 A7 B7 五、發明説明（9) 染廣泛範園的細胞，而對生長形態或細胞分化無影響。此 外’顯然未涉及人類病變。AAV基因組曾經選殖決定序列 之特徵化。包括約4700鹼基，及於各端含有約145鹼基之 反錄重複子區（ITR)作爲病毒複製起點。其餘基因組分成 具有包囊功能的2大區；基因組左手部份含有病毒複製及 病毒基因表現相關rep基因；及基因組右手部份含有病毒 套膜蛋白之編碼cap基因。 使用衍生自AAV之媒傳者進行試管内及活體内細胞轉移 曾經描述於參考文獻（特別參見WO91/18088; WO93/09239; US 4,797,3 68, US 5,139,941，EP 488,528)。此等用途描述衍 生自AAV之不同構造，其中rep及/或cap基因被刪失或由感 興趣的基因置換，及其用於試管試驗（感染培養細胞）或活 體試驗（直接感染身體）轉移感興趣的基因。本發明之缺陷 重組株AAV可經由將含有本發明之核酸或卡g旁出2個 AAV反綠重複區（ITR)之質體及帶有AAV包囊基因（rep及 cap基因）質體同時轉移感染入感染有人類助手病毒(腺病毒） 的細胞株置備。然後生產的重組株AAV藉標準技術純化（ 特別參見WO95/06743)。 至於疱疹病毒及反錄病毒，重組株媒傳者構造大量描述 於參考文獻：特別參考 Breakflied et al.，New Biologist 3 (1991) 203; EP 453,242， EP 178,220， Bernstein et al., Genet, Eng. 7 (1985) 235及；McCormick，BioTechnology 3 (19S5) 689。特別，反錄病毒爲選擇性感染分裂中的細胞之 整合病毒。因此構成癌症用感興趣的媒傳者◊反錄病毒基 -12- 本紙張尺度適用中國國家操準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐）

I1JJ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局負工消費合作杜印製 43^260 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（1G) 因組主要包括二個LTRs，一個包囊序列及三個編碼區（gag ’ pol及env)。衍生自反錄病毒之重组媒傳者中，gag，ρ〇ι 及env基因通常整個或部份删失，並有感興趣的非同系核 酸序列置換。此等媒傳者可由不同型反錄病毒製備，特別 例如MoMuLV (M〇l〇ney鼠白血病病毒，亦名m〇MLV)， MSV (Moloney鼠肉瘤病毒），HaSV (Harvey肉瘤病毒）， SNV(脾臟壞死病毒），RSV (R〇us肉瘤病毒），或另外Friend 病毒。 欲構成含本發明之核酸或卡匣之重組株反錄病毒，構成 特別含LTRs，包囊序列或核酸或卡匣之質體，然後用來轉 移感染所謂的可供應質體缺乏的轉移反綠病毒功能之所謂 包囊細胞株。概略而言，包囊細胞株可表現gag，p〇l及env 基因。此等包囊細胞株述於先前技術，特別pA317株（us 4,861，719)，PsiCRIIMi (w〇9〇/〇28〇6)及 GP+envAm-im (W089/07150)。此外，重組株反綠病毒*LTRs含有修改俾 破壞轉綠活性，以及延長含部份gag基因之包囊序列 (Bender et al·，j. Vir〇1. 61 (1987) 1639)。然後生產的重組 株反錄病毒藉標準技術純化。 主欲進^本發明，最特佳使用缺陷重組株腺病毒或反錄病 母此等媒傳者特別具有編碼阿朴脂蛋白基因轉移的優異 性質。本發明之腺病毒媒傳者特佳供活體内直接投予純懸 浮^ ’或活體外轉型細胞，特別自體細胞（依其植入情形 而定）此外，本發明之腺病毒媒傳者具有顯著優點，例 如特別其感染效率極高，因此可由小量體積病毒懸浮液產 _____ -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（2丨〇><297公幻 ^^1 I-^ n (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 i. 434260 A7 ______B7^__ 五、發明説明（11) 生感染。 因此，本發明之較佳具體例係關於—種缺陷重組株腺病 毒’包括於其基因组内插有定義如前之編碼阿朴脂蛋白^ 變異株之DNA。 本發月之另一特佳具體例’可產生含有編碼阿朴η 異株序列之反綠病毒媒傳者細胞株用於活體内植入。可供 此種用途用之細胞株，特別包含PA317(US4,861719)， PsiCrip (W090/02嶋）及 GP+envAm_12 ⑽ 5 27M56)及修 改而可產生含有編碼本發明之阿朴變異株之核酸序列 的反綠病毒之細胞。 根據本發明之另一具體例，所用媒傳者爲化學媒傳者。 本發明媒傳者實際上可爲可促進核酸轉移入眞核細胞並於 其中表現的非病毒劑。化學或生物化學媒傳者代表天然病 毒，特別基於方便與安全的較佳替代之道，同時沒有有待 轉移感染DNA大小的理論限制。 △此等合成媒傳者具有兩大功能，縮合有待轉移感染的核 酸及促進其結合至細胞及其通過漿膜，及若屬適宜，通過 兩張核膜。欲模擬核酸之多陰離子性質，非病毒媒傳者皆 具有多陽離子電荷。 開發的合成媒傳者中，以聚離胺酸（LKLK)n，（LKKI^， 聚伸乙基亞胺及DEAE-葡萄聚糖型陽離子聚合物，或另外 陽離子脂質或脂肪感染劑爲最佳。其具有縮合DNA與促進 其餘細胞膜結合的性質。後述媒傳者中，以脂多胺 (lipofectamine ’ transfectam等）及不同陽離子或中性脂質 -14- -- -- _ 一·»»·一 本紙張尺度適用中國國家標準（CN+S ) A4规格（210X297公釐） ^1 *1 It (請先閲讀背面之注意事項I填寫本^>

A 麵 經濟部中央祿準局員工消費合作杜印製 4 3 4260..； Α7 Β7 經濟部中央標季局員工消費合作杜印製 五、發明説明（12) (DOTMA，DOGS，DOPE等）爲佳。更爲晚近，開發受體媒 介鎖定目標轉移感染構想，用來利用陽離子聚合物實施縮 合DNA原理，同時利用陽離子聚合物與存在於希望轉移感 染的鈿胞類型表面之膜受體配合基間之化學偶合反應指導 錯合體結合至膜。如此插述轉移素（transferin)或騰島素受 體或肝臟之asialo糖蛋白受體之鎖定目標。 本發明亦係關於經由插入編碼如前定義之阿朴脂蛋白A-I 變異株之核酸修改基因的任何細胞。此等細胞較佳爲可投 予活體内或植入活體内的哺乳類細胞。例如纖維母細胞， 肌母細胞，肝細胞，角質細胞，内皮細胞，上皮細胞或神 經膠質細胞。細胞較佳爲人體來源。特佳細胞爲自體，換 言之，取自病人，於活體外使用本發明之核酸修改而對其 賦予治療性質，然後重新投予該病.人。 本發明之細胞可得自一次培養。可藉業界人士已知之任 一種技術移出，然後於可增生條件下培養。特別有關纖維 母細胞，方便得自活體檢查例如Ham [Methods Cell. Biol. 21a (1980) 255]所述技術獲得。此等細胞可直接用於插入 本發明核酸（利用病毒或化學媒傳者）或例如藉冷凍儲存建 互自體銀行供稍後使用。本發明細胞亦可爲得自預先建立 的全部之二次培養（例如參見EP 228,458，EP 289,034，EP 400,047及EP 456,640)。 培養中之細胞特別可以本發明之重組病毒感染，俾使其 產生具有生物活性的阿朴A-Ι變異株。感染係根據業界人 士已知技術於試管試驗進行。特別’依據所用細胞類型及 -15- (请先閲請背西之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) Α4规格（210X297公釐） 4342 A7 B7 五、發明説明（u) 每個細胞所需病毒套數，業界人士可調整感染重複次數， 且若屬適宜，可進行該感染周期次數。當細胞預期供活體 内投藥用時，可於適當無菌條件下進行此等步驟。用於感 染細胞之重組株病毒劑量可由業界人士隨期望用途調整改 變β前述活體内投藥之條件可應用於試管試驗感染。對於 反綠病毒感染，也可共同培養希望感染的細胞與可產生本 發明之重組株反錄病毒的細胞。如此，可免除純化反錄病 毒的需求。 本發明之另一主指係關於一種植入物包括藉插入如前定 義之核酸進行基因修改哺乳類細胞及胞外基質。較佳本發 明植入物包括1〇5至101〇細胞。更佳包括1〇6至1〇8細胞。細 胞亦可爲基因組内含有插入前述核酸之重組株病毒產生性 細胞β 更佳，本發明之植入物中，胞外基質包括膠凝化合物， 若屬適宜’包括可使細胞定錨的撑體。 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁} 欲製備本發明之植入物，可使用各型膠凝劑。膠凝劑可 用於包含細胞於具有凝膠構造的.基質内，及若屬適宜，促 進細胞定錨於撑體。因此多種細胞黏著劑可用做勝凝劑， 例如特別膠原，明膠，糖胺聚糖，fibronectin，植物血液 凝集素（16(^!^)等。較佳膠原用於本發明。膠原可爲人， 牛’或鼠來源。更佳使用I型膠原。 如前述，本發明組成物較佳包括一種可定錨細胞之撑體 。定錨一詞表示任一型生物及/或化學及/或物理交互作用 可使細胞黏奢及/或結合至韓體。此外，細胞可，包覆使用 -16- 本紙張尺度適用中國國家擦準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 43 4260 A7 B7 五、發明説明（14) (請先閱讀背面之注意事項界填寫本貰) 的撑體或進入撑體内部或二者。較佳於本發明中，使用無 毒及/或相容固體撑體。特別使用聚四氟乙烯（pTFE)纖維 或生物來源撑體（例如珊蝴，骨或勝原）。 本發明之植入物可植入身體各個部位。特別可植入腹腔 ，皮下組織（例如恥骨上區，髂骨或腹股溝），器官，肌肉 ，腫瘤或中樞神經系統，或另外，黏膜下方。本發明之植 入物特佳爲可釋放阿朴A-Ι變異株有待控制的身體。首先 由感染繁殖及植入細胞數目決定。隨後，可藉撤出植入物 有限中止治療控制疾病缓解，或使用調整式表現系統，因 此可表現有待謗生或塵_制的治療基因控制缓解。 由於本發明之變異株之抗動脈粥瘤生成性質，如此核酸 於心血管病（例如動脈粥瘤硬化及血管再度縮窄）之治療及 預防上形成一種新藥。 本發明提供一種醫藥組成物包括前述阿朴脂蛋白A _ I變 異株及/或核酸及/或媒傳者及/或基因改質細胞連同醫藥 可接受性載劑或塗層。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 如此本發明提供一種治療或預防血中脂蛋白功能失調相 關病症的新穎手段，特別用於心血管病領域例如心肌梗塞 ’心绞痛，猝死，血管再度縮窄，心臟代償不能及中風。 更常見，此種方法提供基因上或代謝上之阿朴脂蛋白A_I 缺陷可矯正病例之治療性介入的可能手段。 本發明將利用下列實例詳細説明，其僅供舉例説明而決 非囿限本發明之範圍。 圖示 17- 本紙張尺度適用中國國家操準（CNS ) A4規格（210X2.97公釐） 434260 A7 B7 五、發明説明（15 ) 第1圖：質體pXL2116之限剪拼圖。 第2圖：載有病人的有功能基因4之M13噬菌體之構造。 第3圖：載有突變pXL2116之媒傳者之構造。 第4圖：濁度計量呈溫度函數之研究。 第5圖：凝膠過濾圖。 第6囷：於不同錯合體各部份之色胺酸螢光及磷脂質濃 度。 實例 實例1-阿朴A-Ι變異株之鑑別 變異株阿朴A -1巴黎係由於具有特殊脂質平衡之病人鑑 別及選擇。特別病人具有下述脂質平衡（樣品：血清） 總膽固醇 4_59毫莫耳/升 正常 4.54-6.97 三酸甘油酯 2.82毫莫耳/升 0.74-1.71 HDL膽固醇 0.25毫莫耳/升 0.88-1.60 LDL膽固醇 3.06毫莫耳/升 2.79-4.85 阿朴脂蛋白A-I 〇.50克/升 1.20-2.15 阿朴脂蛋白B 1.3 8克/升 0.55-1.30 表現型阿朴E: 3/3 出乎意外地，病人雖然HDL濃度極低及血中三酸甘油酯 高，但未出現動脈粥瘤硬化徵象。此乃申請人尋求保護的 起源。 由血聚分離含阿朴A-Ι巴黎之HDI, 空腹隔夜後，由含有阿朴A-Ι巴黎基因之病人出血。血液 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) i —Γτ—；---c,3衣丨— (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) —j 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 43 42 6 0 A7 一____B7 五、發明説明（16) 於4°C缓慢離心（2000克’ 30分鐘）製備血漿。經由於丨〇63_ 1.21克/毫升密度依序超離心製備高密度脂蛋白（Havel，j.

Clin，Invest· 34; 1345-54，195 5)。然後含 HDL部份對 10 mM 丁)^8-11(：1缓衝液，〇.〇1%疊氮化鈉，？117,4滲析。 阿朴A-Ι巴黎二元體之驗證 滲析妥的HDL副本於乙醚/乙醇（3:丨，v/v)混合物脱去脂 質’藉 Lowry方法（Lowry et al” J_ Biol. Chem·，193: 265-75, 1951)估計蛋白質濃度。HDL部份蛋白質於非還原條件下於 SDS存在下於聚丙烯醯胺凝膠上進行遷移。此種遷移可測 定病人HDL之不同蛋白質大小。除了存在有對應於正常大 小阿朴A-Ι及阿朴A-Π蛋白質外，分析顯示存在有對應阿朴 A-Ι一元體及阿朴A-Ι與阿朴A-Π複合體之較高分子量蛋白 質。複合體内存在有阿朴A-Ι及阿朴A-II，.可由特異性免疫 檢測技術證實。 玄變阿朴A-Ι電荷差|乏脸證 於血漿内直接檢測突變阿朴A-1係根據如下方案進行 (Merizel, H. J., and Utermann, G., Electroforesis, 7： 492-495 鯉濟、哪中央標準局員工消費合作社印製 1986) : 20微升血漿使用乙醇/醚混合物脱去脂質隔夜及再 度懸浮於裝載緩衝液。一份5微升於等電聚焦凝膠（pH 4_ 6.5 ’ Pharmalyte)上電泳，然後蛋白質轉移至尼龍膜上。對 應於阿朴A-Ι之帶經由使用抗原阿朴A_I抗體進行免疫反應 檢測。 突變阿朴A-Ι之檢測也可於HDL蛋白質上進行。經參析的 HDL·邵份於乙醚/乙醇（3 : j，v/v)混合物脱去脂質，藉L〇wry -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐) 434260 A7 __B7 _ 五、發明説明（17 ) 方法（Lowry et al_，J. Biol. Chem.，193: 265-75, 1951)估計蛋 白質濃度。約100微克蛋白質於等電聚焦凝膠（pH 4-6.5， Pharmalyte)上進行電泳，然後藉Coomassie藍色染色檢測蛋 白質。此種技術可驗證突變病人阿朴A-Ι之最大同等形朝 向陽極移動，其對應於-1價電荷相對於正常阿朴A-Ι電荷之 實例2 -基因與突變之鑑別 病人基因組 DNA係根據 Madisen等（Amer. J. Med. Genet， 27: 379-390, 1987)之技術分離至犬血〇然後阿朴A-Ι基因藉 PCR技術放大。欲達到此目的，對引進下列混合物！微克 純基因組DNA進行放大反應： -10微升 10x緩衝液（100 mM Tris-HCI pH 8.3; 500 mM KC1; 15 mM MgCl2; 0.1%.(w/v)明膠） -10微升 2 mM dNTP (dATP，dGTP，dCTP，dTTP) -20 pmol各引子 -2.5 U Taq聚合酶（Perkin-Elmer) -水適量加至100微升 放大用之引子如下： 經濟部中夬標隼局員工消費合作社印製

Sq5490: S'-AAGGCACCCCACTCAGCCAGGd'C序列識別編號3) Sq5491: 5'-TTCAACATCATCCCACAGGCCTCT-3’(序列識別編號4) Sq5492: 5'-CTGATAGGCTGGGGCGCTGG-3_(序列識別編號5)

Sq5493: 5,-匚000丁〇六(：丁000丁01'丁0八0(；-3，（序列識另|】編號6) 引子Sq5490及Sq5491可放大對應於阿朴A-Γ基因之有功能 基因2及3的508-bp片段，而引子Sq5492及Sq5493可放大對 -20- 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4规格"U10X297公釐） 434260 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（18) 應於此種基因之有功能基因4之664-bp片段。 然後決定放大產物序列（兩個508及664 PCR片段）。欲達 到此目的，使用第一方法包括使用PCR片段之決定序列套 件組（Amersham)直接決定序列。決定序列用之引子爲PCR 引子，但也可使用片段内部引子（參見引子S4，S6吸S8如 下）。 也可使用第二種決定序列技術，包括將PCR片段選殖入 M13 mp28媒傳者。M13雙股DNA以EcoRV割裂然後脱去磷 酸，？€11片段以尺1611〇评處理，磷酸化並接合至]^13媒傳者 。然後移出透明斑塊及單股DNA，放大，隨後於Catalyst (Applied Biosystem)上純化，使用螢光-20引子（PRISM染料 引子套件組及401386號方案，Applied Biosystem)決定.序列 ，或使用於片段定向後整合於片段之引予決定序列。然後 使用螢光二去氧核甞酸技術（染料去氧終結子套件組及 410388號方案，Applied Biosystera)。 S8 5，-TGG GAT CGA GTG AAG GAC CTG-3，(序列識別编號7) S4 5，-CGC CAG AAG CTG CAC CAG CTG-3’(序列識別編號8) S6 5，-GCG CTG GCG CAG CTC GTC GCT-3，(序列識別編號9) 然後得自若干純株的序列經編輯並與阿朴A-I序列比較。 成熟阿朴A-Ι之胺基酸序列148至154可列舉如下（對應於序 列識別編號1序列殘基172-178。 ATG CGC GAC CGC GCG CGC GCC Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala 151 -21 - SII. (請先閲讀背面之注項再填寫本頁) /装_ 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X2.97公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 434260 A7 B7 __ 五、發明説明（19 )

編碼aa 15 1密碼子第一鹼基之C->T突變[隨後編碼半胱胺 酸（參見如下序列識別编號2序列）]出現於決定序列之純株 部份。因此此種突變以異合子狀態存在於特選的病人。 ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC

Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala 151 決定编碼本發明之變異株阿朴A-I Paris之整個cDNA序列 。部份序列示於序列識別編號1 〇。 實例3 :質體表瑪媒傳者（pXL2116mute)之構成 阿朴A-I Paris於病人阿朴A-Ι基因之有功能基因4序列具 有一個點突變。構成表現媒傳者之策略包括於表現阿朴A_ I之媒傳者（媒傳者PXL2116，第1圖），置換對應於來自病 人基因的有功能基因4區。 3.1病人之有功能基因4選殖入M13之用途 有功能基因4係藉PCR生產自病人細胞之純化dna，並插 入噬菌體M13mp28之多聯結子之EcoRV部位（第2圖）。 突變策略係利用得自M13帶有突變的片段置換阿朴a_i片 段。因此必須選用適合兩種媒傳者之酶，因此對得自經蒸 煮PXL2116之媒傳者及對源自經蒸煮雙股Μπ之插子而言 產生相容内聚端。 3.2 限剪酶之選擇 •Bsu361於M13及PXL2116辨認突變上游的限剪位置。 -使用BamHI蒸煮，可辨認經由選殖技術於阿朴a] 3，端 之獨特限剪位置，也可辨認於M13之多聯結予限剪位置， • 22 _ 本^張尺度適用中國國家標华「CNS )八4規格（210X297公釐） ' —-丨^---^---ci東丨- (請先間讀背面之注意事項再填窝本頁) 訂 經濟部中央標率局員Η消費合作社印製 434260 A7 ____B7________ 五、發明説明（) 因此可： 1) 接合源自PXL2116之媒傳者及源自M13位置之插子 2) 此接合可以併入多聯結子片段進行，可經由酶蒸煮 證實源自Ml3之突變片段的插入。 須注意，存在有多聯結子之此種片段絕未改變阿朴A-Ι编 碼序列，原因爲其位在中止密碼子後方。 如此也可合成富組胺多肽，其核苷酸序列已經選殖於阿 朴A-I 5,端。 3.3媒傳者之構造（第3囷） -變成雙股的M13以Bsu36I/BamHI蒸煮，蒸煮產物施於凝 膠。如此產生的揷子以足量回收且大小確實爲1 kb。 -PXL2116以相同酶蒸煮單位未經純化。 欲避免蒸煮產物的再度接合，使用可辨認Bsu36I_BamHI 片段内兩個限剪位置的Xhol進行蒸煮。 首先嘗試脱去磷酸，但於培養皿上獲得結果極差.，24皿 皆未得陽性純株。 對15塵克插子於50塵克媒傳者評估插入用媒傳者及插 子之最佳數量。 DH5 π種株以如下三種接合產物轉形： -以Bsu3 6I及BamHI蒸煮媒傳者但未含接合酶（陰性接合對 照组） 口 -旄煮產物+接合酶 -蒸煮產物+插子+接合酶 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公澄） —^1· Bn— Hit ^^^1 .^1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 3 42 6 Ο Α7 Β7 五、發明説明（21 ) 勝任細胞也可使用pUC 19轉形俾試驗轉型效率。 於LB培養基培養m上以氣絲菌素（chloramphenicol)(選擇 BL21種株）及安比西林（ampicillin)(選擇整合該殖體的種株） 轉形細胞結果再現如下。 培養皿上所得結果 ΌΗ5α + 結果 _解釋 轉形 PUC19 200純株 轉形對照組 媒傳者 0純株 完全蒸煮，無再度環化質體 (+片段） 媒傳者 160純株 極大的背景：額外蒸煮策略大 (+片段） 爲失效 +接合酶 媒傳者 120純株 經常發現接合酶之”微縮效應” (+片段） 。細菌不一定以正確突變序列 +接合酶 轉形。 +插子 由培養皿4再度分離48純株。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 欲鑑別陽性純株（換言之插有M13突變片段者），經由對 48純株個別純化所得質體DNA以酶Mdel蒸煮。 若確實插入得自Ml3之插子，則於凝膠上可見二片段： 一者 4.5 kb，另一者 1 kb。 若進行另一次接合，可得數帶或單純一個線性化質體（ -24 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 434260 A7 _______B7_ 五、發明説明（22 ) 一般例）。 基於得自凝膠的結果，純株7，8，1 3，1 6及2 6顯然正 確。選定獲得明確結果的純株。 欲完全證實特選純株序列，進行六次酶催蒸煮。 藉此方式證實存在有多聯結子，因此存在有插予，但也 需證實接合作用。 顯然，接合爲預期者，原因爲質體大小正確，換言之等 於PXL2116大小。 除非有極罕見的突變，否則新選殖阿朴A-Ι序列應正確。 因此’純株8載有正確突變質體pXL2116。 實例4 :重組阿朴A-Ι變異株之表現 本例描述重組阿朴A -1變異株製法。此種方法係於細菌 進行。其它表現系統可用於此目的（例如酵母及動物細胞） 〇 4.1 原理 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 於細菌内表現質體係置於T7啓動基因及終結子控.制之下 。異·丙基硫半乳糖喊喃糖甞（i+ptg)(乳糖操縱子誘發劑） 可於此系統誘發T7 RNA聚合酶合成，隨後特異性結合至 T7啓動基因並引發重組株蛋白質基因的轉錄。rna聚合酶 藉T7終結子中止’然後防止轉綠通量超出感興趣的序列下 游。 芮芳皮辛（Rifampicin)是一種抑制大腸桿菌内生^^人聚合 酶活性的抗生素。因此可抑制細菌蛋白質合成，換言之， 兩種蛋白酶，因此可限制感興趣的蛋白質分子及污染細菌 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2Ϊ0Χ297公釐） 13^42 60 ^ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（23) 蛋白質，因而擴大感興趣蛋白質的表現。 4.2 計畫 用於表現的種株爲大腸桿菌BL21 DE3 pLys S。質體DNA 根據標準技術轉形引進大腸桿菌内。培養呈懸浮液形於_ 20°C於25%甘油存在下冷凍，並分成每一份5〇0微升儲存。 經由加入數滴冷凍懸浮液至1〇毫升M9_安比西林培養基 開始前培養，然後於37。0培育隔夜。1升錐形瓶以前培養 接種並置於37C振搖器上直到獲得於61〇 nm之OE)介於〇. 5 至1爲止。然後以1 mM終濃度加入ipTG (Bachem參考編號 Q-1280)。於37°C培育15分鐘後，以終濃度100微克/毫升加 入荷芳皮辛（Simga)。然後培養1小時後，離心（15分鐘， 8000 rpm)回收培養並於變性條件下於丨5〇/。丙烯醯胺凝膠上 利用免疫墨點法藉電泳證實表現。— 所得結果顯示突變蛋白質係依良好·表現水平表現，及使 用抗阿朴A-Ι多株抗體檢測。 實例5 重組阿朴A_〗變異株之純化 本例描述根據本發明純化重組阿朴變異株之方法。須 了解也可使用其它方法。 由於蛋白質係於大腸桿菌之胞質表現，故其萃取之第一 階段需要進行細胞溶解，接著移出核酸。 5.1細胞溶解 ' 培養離心後，細菌丸粒再度懸浮於溶解緩衝液内伴以溫 和攪拌且有蛋白酶抑制劑及万硫醇乙醇共存。 硫醇乙醇是一種可割裂藉於兩個半胱胺酸殘基間生成 -26- 本紙張尺度通用中國國豕椟準（CNS ) A4規格（2Ϊ0Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ic》------ir^---τ---ο!----^---^_________ -11- 43 42 6 0 A7 B7 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 五、發明説明（24 ) 的雙硫橋之還原劑。大腸桿菌胞質未生成雙硫橋’但一旦 蛋白質萃取後證實需要存在有還原劑。添加β硫醇乙醇至 溶解緩衝液可於細菌蛋白質之半胱胺酸殘基間生成橋而重 組株蛋白質則可避免。 經由於冰上超音波處理5分鐘共計3次獲得細胞溶解 (Vibracells超音波材料，脈衝型，輸出控制5);接著於 10,000 rpm離心（1小時，4°C 於 Beckman J2-21 M/E，JA10轉 子）可去除細胞殘骸。藉Bradford比色法對上清液進行蛋白 質檢定分析。 5.2 核酸之沉澱 核酸之沉澱係於溶解上清液進行，含10%鏈酶素硫酸鹽 溶液，含量比例爲10毫升相對於10克蛋白質，於4°c溫和 磁力授拌1小時。於1〇,〇〇〇 rpm離心去除核酸（1小時，4°C 於Beckman J2-21 M/E，JA10轉子），藉比色法檢定分析評 估上清液之蛋白質濃度。 二步驟結束時’獲得已知濃度之蛋白質溶液，其中全部 胞内奎白質包含感興趣的蛋白質皆存在。後者藉層析技術 純化。 ->藉凝膠過濾層析 - >親和層析 5.3藉凝膠過濾層析 此步驟目的係去除EDTA，EDTA爲干擾親和層析所需條 件的分子。供此目的之用，選用撐體Tris_acryl GF 〇5 (Sepracor)。凝膠可分離分予量（MM)介於3〇〇至25〇〇道爾呑 -27- 本紙張尺度剌巾晒家榇準（CNS )八4祕（210X297公楚） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

43 42 6 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（25 ) 之分子，排除分子量大於2500道爾呑之分子，包括蛋白質 。此外，此種凝膠具有對壓力之抗性良好的優點，因此可 以高流速發揮效果而未改變解析度。細胞溶解產物之層析 係於pH 8磷酸鹽緩衝液進行。排除體積内之蛋白質濃度經 測定，且若屬適宜，經由於pH 8磷酸鹽緩衝液内稀釋，調 整至4毫克/毫升。 此步驟可以對2x 10升PBS滲析替代。然後蛋白質溶液暴 露於25 inM Hecameg。此種清潔劑經由降低蛋白質_蛋白質 交互作用而有利於次一純化步驟。 5.4 親和層析 原理 存在有6個重組株蛋白質相關連續組胺酸殘基使其對鎳 離子（Ni2+)具有特高親和力（15)。此等鎳離子利用腈基三乙 酸（NTA)結合至瓊脂基質。介於組胺酸之咪唑與鎳離子間 產生金屬螯合鍵；此鍵比離子鍵更強但比共價鍵更弱。 計畫

NiNTA-瓊脂糖凝膠（Qiagen)之結合能力爲2毫克蛋白質/ 每毫升凝膠。此凝膠於pH 8緩衝液内藉添加25 Hecameg平衡。污染的細菌性蛋白質未保有於pH8或於 6去除，而感興趣的蛋白質於pH 5回收。此等步驟係於 mM Hecameg存在下進行。 於PH5溶離之溶離分（2毫升）使用下列各者處理： 60微升1M氫氧化鈉（中和）

10 微升 0.2M PMSF ____ - 28 - 本紙張尺度國國家標準^77^格（210χ297公釐） 11~^---;---II (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂_ 434260 ： 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（26 )

40微升 0.1MEDTA 溶離分依據溶離蛋白質之濃度及純度匯集。此等特性藉 電泳分析（15% SDS-PAGE)。 於ί>Η 5溶離經由作用於鎳Ni2+-NTA键可脱離與鎳結合的 蛋白質。因此，需要由重組株蛋白質解離此種陽離子。此 步驟係經由於50 mM組胺酸存在下於4°C以磁力溫和攪拌 培育1小時完成。 5.5 渗析 如此可去除組胺酸及鎳。樣品於4Ό滲析（Spectra/Por膜 ，MWCO 12-14,000道爾呑）5小時，然後對兩倍10升2 mM EDTA-PBS緩衝液滲析隔夜。最終進行蛋白質檢定分析。 此種方法可以純化形式獲得阿朴A-I Paris蛋白質大體不 含污染蛋白質。 實例6 :重組株阿朴A-I Paris之重組株之正常阿朴A-Ι之 物理化學性質 6.1濁度測量 6.1.1濁度計量呈溫度之函數 於阿朴A-Ι存在下測量DMPC囊於325 um之吸光率可測量 是否生成小型鐵餅型蛋白脂質複合體。19至28°C之溫度變 化分析顯示於蛋白脂質之轉變溫度（23°C )附近吸光率降低 ，證實複合體生成。第4圖（於有或無GdnHDL存在下以免 生成二元體）顯示此等複合體之生成與重组株正常阿朴A-I 及重組株阿朴A-Ι巴黎，以及天然阿朴A-Ι之比較。此三種 蛋白質之表現相當類似，但以阿朴A-Ι巴黎爲例，發現存 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210 X297公釐〉 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本貫)

34260 A7 B7 五、發明説明（27) 在有形成二元體之傾向。 6.1.2濁度計量呈時間之函數

阿朴A-Ι分子培育後，DMPC囊之濁度下降係於有或無 GdnHDL存在下於特定溫度呈時間之函數追蹤。時間常數 (l/tl/2，相當於初濁度降低50%)評估爲1/τ之函數（溫度以 凱式溫標表示）。天然阿朴A-Ι之結合速率快速，重组株阿 朴A-Ι分子較慢，特別阿朴A-Ι巴黎。此外，添加GdnHDL 可增加蛋白質-脂質結合。於重組株阿朴Α_ι分子，特別阿 朴A-Ι巴黎之例極爲顯著。 6.2 色胺酸螢光發射光譜 不同阿朴A-Ι分子之色胺酸之螢光發射光譜係於3〇〇至4〇〇 nm(於295 nm激光）間之波長測量。阿补分子及阿朴A-I/ 膽固醇/POPC複合體之發光最大値示於下表1。不同阿朴八_ I分子及複合體之色胺酸之螢光發光最大値相同，指示三 種蛋白質之色胺酸皆處於相同環境。 ^ϋ> ^^^1 In In an ^^^1 r .--^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1T_ 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 表1 產物 發光最大値 A-Ι巴黎 — ____335 POPC/C/A-I 巴黎 —— ^ ^ 332 重組株Α-Ι 334 POPC/C/A-I rec ------------- ____332 A-Ι血漿 33 6 POPC/C/A-I 血漿 ___333 ό. "30 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 342 6 0 A7 B7 五、發明説明（28) 6.3 阿朴A-I/脂質複合體之分離與特徵化 含阿朴A-Ι及POPC之複合體係藉螯合技術製備《複合體 經由於Superose 6PG柱上進行凝膠過滤層析而與自由阿朴 A-Ι分離，分析其組成。凝膠過濾圖示於第5圖。對使用天 然阿朴A-Ι製成的複合體獲得單一均質峰，而使用重組株 阿朴A-Ι分子製成的複合體觀察到非均質峰。自由阿朴A-I 分子係於溶離分20至24溶離。各溶離分中對不同複合體之 磷脂質濃度及色胺酸螢光示於第6圖。 實例7-表現突變阿朴A-Ι之腺病毒媒傳者之構成 於成熟阿朴A-Ι之151位置含有Arg->Cys突變之編碼本發 明變異株之cDNA係藉PCR獲得。 使用引子

Alml: ATC GAT ACC GCC ATG AAA GCT GCG GTG CTG (序列識別編號II)，

Alm2: ATG GGC GCG CGC GCA GTC GCG CAT CTC CTC (序列識別編號12)，

Alm3: GAG GAG ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC CAT (序列識別編號13)， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) A Alra4: GTC GAC GGC GCC TCA CTG GGT GTT GAG CTT (序列識別編號14)。 引子Alml及Alm4分別於cDNA 5’端及3'端引進Clal及Sail 位置，而互補的引子Alm2及Alm3引進突變。欲引子對 Alml-Alm2及Alm3-Alm4之PCR反應，首先於未突變阿朴A· I之cDNA進行。然後得自此等PCR之片段於引子Alml及 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1342 6 0 A7 B7 五、發明説明（29) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Alra4存在下再度引進第三pCR，產生822_bp片段，然後選 殖入pCRII (Invitrogen)供證實其序列。然後含有突變cDna 之Clal-Sall片段經相同限剪位置引進穿梭媒傳者pXL_Rsv_ LPL替代LPL cDNA (FR94/06759)，該穿梭媒傳者含有處於 RSV LTR啓動基因控制下的LpL cDNA且含有牛生長激素 聚腺茫化位置。任何其它穿梭媒傳者顯然皆可使用。然後 所得媒傳者經腺性化及共同轉移感染293獲得重组株腺病 毒。如此所得腺病毒可於溶菌斑上放大，純化（特別使用 氯化铯）然後冷凍儲存，例如儲存於甘油。供治療用，可 與任一種醫藥可接受性媒劑組合。此等媒劑特別爲無菌等 張鹽水溶液（含有例如鱗酸一鈉或二鈉，鈉，却，與或鎂 氯化物，或此等鹽之混合物）’或無水，特別凍乾組成物 ，若屬適宜，添加無菌水或生理鹽水可調成注射液。用於 治療血中脂蛋白功能不良相關病症時，本發明之缺陷重組 株腺病毒可依多重模式投藥，特別靜脈注射。較佳注入門 靜脈。注射用病毒劑量可依據不同參數調整，特別依據使 用的投藥模式，治療的病情或另外期望治療時間而定。一 般而言，本發明之重組株病毒經調配並以i 〇4至丨〇 w pW毫 升劑量形式投藥。對AAVs腺病毒也可使用ι〇6至1〇1〇 毫 升劑量。Pfu("溶菌斑生成單位"）一詞相當於病毒顆粒懸= 液的感染力，且係經由感染適當細胞培養物，並通常於48 小時後測量感染細胞之溶菌斑數目測定。病毒溶液之pfu 力價測量技術於參考文獻中有詳細記載。 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（3〇 ) 序列表 (1) 一般資訊： ⑴申請人： (A) 名稱：RHONE-POULENC RORER S.A.

(B) 街名：20，avenue Raymond ARON

(C) 城市：ANTONY (E) 國名：法國 (F) 郵遞區號：92165 ⑴申請人：

(A) 名稱：UNIVERSITY PIERRE AND MARIE CURIE (B) 街名： (C) 城市： (E) 國名：法國 (F) 郵遞區號： (i) 申請人：

(A) 名稱：INSTITUTE PASTEUR DE LITTLE (B) 街名： (C) 城市： (E) 國名：法國 (F) 郵遞區號：

(ii) 發明名稱：New variants of apolipoprotein A-I (iii) 序列數目：1 4 (iv) 電腦可讀程式： (A)媒體類型：磁帶 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2[0'X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

4 3^42 6 0 A7 _B7_. ' 第85106086號專利申請案 中文説明書修正頁(87年5月） 五、發明説明（別

(B) 電腦：IBM PC相容 (C) 操作系統：PC-DOS/MS-DOS (D) 軟體：Patentln Release #1‘0, Version #1.30 (EPO) (2)序列識別編號：1 . (i)序列特點： :842鹼基對 :核苷酸 :雙 線性 ：cDNA (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (A) 長度： (B) 類別： (C) 股性： XD)形狀：

Cii)分子類別 (iii) 假設：無 (iv) 反訊息：無 (vi)原始來源： (A)有機體：.Homo sapiens (IX)特徵： (A) 名稱/關鍵字：匚03 (B) 所在位置：L.842 (C) 其它資訊：產物人類apoA-IcDNA” 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (xi)序列説明：序列識別编號1 : ATG Ρ-Λ.Α GCT GCG GTG CTG ACC TTG GCC GTG XTC TTC .CTG ACG GGG AGC 4 8

Met Lys Ala Ala Vsl Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 CAG GCT CGG CAT TTC TGG CAG CAA GAT GAA CCC CCC CAG AGC CCC TGG 96

Gin Pila. Arg His Phe Trp Gin Gin Asp Glu Pro Pro Gin Ser Pro Trp 20 ' 25 30 34 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210Χ297公釐） 4§4260“ 第85106086號專利_請案 中文説明書修正頁职年^月） 五、發明説明（ 經濟部中央標準局.員工消费合作社印裝 A7

GAT CGA GTG GAC CTG GCC ACT GTG TAC GTG* GAT GTG CTC ΑΛΑ GAC 144

Asp Arg Val Lvs Asp Leu Ala Thr Val Tyr;VaI Asp Val Leu'Lys Asp 35 · 40 45

AGC GGC AGA GAC TAT GTG TCC CAG TIT GAA GGC TCC GCC TTG GGA AAA 192

Ssr Gly Arg Asp Tvr Val Ser Gin Phe GIu Glv Ser Ala Leu Glv Lvs 30 ' 55 ^ 60 … CAG CTA AAC CTA KAG CTC CTT GAC AAC TGG GAC AGC GTG ACC TCC ACC 240

Gin Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 70 75 80

TTC AGC AAG CTG CGC GAA CAG CTC GGC COT GTG ACC CAG GAG TTC TGG 288

Phe Ser Lys Leu Arg G上u Gin Leu Gly Pro Val Thr Gin Giu Phe Trp 85 90 95 ^ GAT AAC CTG GA^. AAG GAG ACA GAG GGC CTG AGG CAG GAG ATG AGC .^G 336

Asp Asn Leu Clu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gin Glu Met Ser Lys 100 * 105 110

GAT CTG gXg GAG GTG AAG GCC AAG GTG CAG CCC TAC CTG GAC GAC TTC 384

Asp Leu Glu Glu Vai Lys Ala Lys Val Gin Pro Tyr Leu Asd Asd Phe 115 120 125 · * i CAG AAG AAG TGG CAG GAG GAG ATG GAG CTC TAC CGC CAG >AG GTG GAG 432

Gin Lys Lys Tro Gin Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gin Lvs Vai Glu 130 , 135 140 "

CCG CTG CGC GCA GAG CTC CAA GAG GGC GCG CGC CAG AAG CTG CAC GAG 4 80

Pro Leu Arg P±a Glu Leu Gin Glu Gly Ala Arg Gin L.ys Leu His Glu 145 150 155 - ISO CTG CAA GAG AAG CTG AGC CCA CTG GGC GAG GAG ATG CGC GAC CGC GCG 523 -

Leu Gin Glu Lvs Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg .^la | _ 165 170 175 CGC GCC CAT GTG GAC GCG CTG CGC ACG CAT CTG GCC CCC TAC AGC GAC 576

Arg Ala His Val Asd Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tvr Ser Asp ISO ' 185 190 GAG CTG CGC CAG CGC TTG GCC GCG CGC CTT GAG GCT CTC AAG GAG PAC 624

Glu Leu Arg Gin Arg Leu Ma Ala Arg Leu Glu Ma Leu Lys Glu Asn 195 200 205 GGC GGC GCC AGA CTG GCC &.G TAC CAC GCC PJkG GCC ACC GAG CAT CTG 672

Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr Kis Ala Lys Ala Thr Glu His Leu -34a - 本紙張尺度適用中國國家標芈（CNS ) A4規格（210X297公釐）

4^426 0 ΐ ' 第85106086號專利申請案 中文説明書修正頁(87年5月） 五、發明説明（ 210 補充 215 220

AGC ACG CTC AGC GAG AAG GCC AAG CCC GCG CTC GAG GAC CTC CGC CAA 720

Ser Thr Leu Ser GIu Lvs Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gin 225 230 — 235 240 ί ,. r

GGC CTG CTG CCC GTG CTG GAG AGC TTC GTC AGC TTC CTG AGC GCT 768

Glv Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser ?he Lys Val Ssr ?he Leu Ser Ala ’ 245 250 255

CTC GAG GAG TAC ACT AAG AAG CTC AAC ACC CAG TGA GGCGCCCGCC 814

Leu Glu Glu Tvr Thr Lys Lvs Leu Asn Thr Gin * 260 * 255

GCCGCCCCCC TTCCCGGTGC TCAGAATA S4'2 (2)序列識別編號：2 (諳先閱讀背面之注意事項再秦象本頁) 經濟部中央標準局.貝工消费合作社印製 -34b - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297'公釐） 3 6 〇 Α7 Β7五、發明説明（32 ) (2)序列識別编號·· 2 ⑴序列特點： (A) 長度：21鹼基對 (B) 類別：核苷酸 (C) 股性：雙 (D) 形狀：線性 (ii)分子類別：cDNA Ciii)假設：無 (iv)反訊息：無 (vi)原始來源： (A)有機體：Homo sapiens (ix)特徵： (A) 名稱/關键字：CDS (B) 所在位置：1..21 (C) 其它資訊：產物="變異株apoA-IcDNA1' (xi)序列説明：序列識別編號2 : ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC 21 Met 1 Arg Asp Cys Ala 5 Arg Ala 經濟部宁央標準局負工消費合作社印# (2)序列識別編號：3 (i)序列特點： (A) 長度：21鹼基對 (B) 類別：核甞酸 (C) 股性：單 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

4»426〇 A7 B7 五、發明説明（33 ) (D)形狀：線性 (ii)分予類別：cDNA (ix)特徵： (D)其它資訊：產物=Sq5490 (xi)序列説明：序列識別編號3 : AAGGCACCCC ACTCAGCCAG G 21 (2)序列識別編號：4 (i) 序列特點： (A) 長度：24鹼基對 (B) 類別：核甞酸 (C) 股性：單 (D) 形狀：線性 (ii) 分子類別：cDNA (ix)特徵： (D)其它資訊：產物=Sq5491 (xi)序列説明：序列識別編號4 : TTCAACATCA TCCCACAGGC CTCT 24 (2)序列識別編號：5 (i) 序列特點： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (A) 長度：20鹼基對 (B) 類別：核苷酸 (C) 股性：單 (D) 形狀：線性

(ii) 分予類別：cDNA ¥ -36 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α·4規格（210 X 297公釐） 4瞢42603 A7 B7 五、發明説明（34 ) (ix)特徵： (D)其它資訊：產物=Sq5492 (xi)序列説明：序列識別編號5 : CTGATAGGCT GGGGCGCTGG 20 (2)序列識別編號：6 (i) 序列特點： (A) 長度：20鹼基對 (B) 類別：核苷酸 (C) 股性：單 (D) 形狀：線性 (ii) 分子類別：cDNA (ix)特徵： (D)其它資訊：產物=Sq5493 (xi)序列説明：序列識別編號6 : CGCCTCACTG GGTGTTGAGC 20 (2)序列識別編號：7 ⑴序列特點： (A) 長度：21鹼基對 (B) 類別：核甞酸 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) (C) 股性：單 (D) 形狀：線性 (ii)分子類別：cDNA (ix)特徵： (D)其它資訊：產物=S8 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（35 ) (xi)序列説明：序列識別編號7 : TGGGATCGAG TGAAGGACCT G 21 (2)序列識別編號：8 (i) 序列特點： (A) 長度：21鹼基對 (B) 類別：核钻酸 (C) 股性：單 (D) 形狀：線性 (ii) 分子類別：cDNA (ix)特徵： (D)其它資訊：產物=S4 (xi)序列説明：序列識別編號8 : CGCCAGAAGC TGCACCAGCT G 21 (2)序列識別編號：9 (〇序列特點： (A) 長度：21鹼基對 (B) 類別：核苷酸 (C) 股性：單 (D) 形狀：線性 (ii)分予類別：cDNA (ix)特徵： (D)其它資訊：產物=S6 (xi)序列説明：序列識別編號9 : GCGCTGGCGC AGCTCGTCGC T 21 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -5 Λ

^42 6〇ji '' 第85l〇6〇86號專利申請案 中文説明書修正頁(87年5月;) 經濟部中央輮準局.貝工消費合作社印衆 五、發明説明（36 ) (2)序列識別編號^ (i)序列特點 (A) 長度 (B) 類別： (C.)股性： .(D)形狀： .(ii)分子類別 (vi)原始來源

603鹼基對 核苷酸 雙. 線性 cDNA + (A)有機體：Homo sapiens (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵字：CDS (B) 所在位置：丨.，603 (xi)序列説明：序列識別編號1〇 CTA 48. Leu 1 CTG 96 Leu GAA 144 Glu GAG 192 Glu TGG 240 Tro 65 GCA 288 Ala 請 閲 Φ 之 注 意 頁 訂 m AAG CTC CTT GAC Lys Leu Leu Asd 5 CGC GAA CAG CTC Arg Glu Glp. Leu 20 GAG ACA GAG GGC CTG AGG Thr Glu

Lys Glu 3S AAC TGG GAC AGC GTG ACC TCC ACC TTC Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thx: Phe ' 10 GGC C*C? GTG ACC CAG GAG TTC TGG GAT Gly Pro Val Thr Gin Glu Phe Trp Asd " 25 30 CAG GAG AT G AGC AAG GJVT Gin Glu Met Ser Lys Aso 45 ' TTC CAG Ph£ Gin

Gly Leu Arg ^ 40 GTG AAG GCC AAG GTG CAG CCC TAC CTG GAC GAC Ala Lys

Vai Lys 50 CAG* GAG G丄n Glu

Val Gin Pro 55

Tvr Leu Asp Asp - ‘ 60 AGC AAG Ser Lvs 15 " AAC CTG Asn Leu CTG GAG Leu Glu AAG AAG Lvs Lvs GAG ATG GAG CTC TAC CGC CAG AAG GTG GAG CCG CTG CGC Glu Met

Glu Leu Tyr 70 GAG CTC CAA GAG Glu Leu.Gin Glu 85

Arg Gin Lys Val 75

Glu Pro Leu Arg 80 GGC GCG CGC CAG AAG CTG CAC GAG CTG C^A GAG Gly Ala Arg

Gin Lvs Leu His 90

Glu Leu Gin Glu 95 -39 - 本紙張尺度適用_中國國家標率（.CNS ) A4規格（2〖0X297公釐） Ι3#2.6〇ίΊ Α7 Β7 ’. 第851〇6〇86號專利申請案 中文説明書修正頁(87年5月） 五、發明説明（） 87. 5. 〇 4年月曰 修正補充 AAG CiG AGC CCA CTG GGC GAG GAG ATG336 Eys Leu Ser Pro Leu Glv Glu Glu Met100 ^ . ,105 GTG GAC G^G CTG CGC ACG CAT CTG GCC384 \/a丄 Asp Ala Lsu .Arg Thr His Leu Ala 1:5 120 CAG CGC TTG GCC GCG CGC CTT GAG GCT 4 3-2 Gin Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala 130 135 AGA CTG GCC GAG TAC CAC GCC AAG GCC 480 Arg Leu Ala Glu Tvr His Ala Lvs Ala 14S 150 " AGC &AG AAG GCC AAG CCC GCG CTC GAG528 Ser Glu Lys Aia Lys Pro Ala Leu Glu'165 CCC GTG CTG GAG AGC TTC AAG GTC AGC576 Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser180 185 TAG ACT AAG AAG CTC AAC ACC CAG TGA603 Tyr Thr Lys hys Leu Asn Thr Gin *195 200 CGC GAC TGC Arg Asp Cys CCC TAG AGC Pro Tyr Ser CTC AAG GAG Leu Lys Glu.140 ACC GAG CAT Thr Glu Kis155 GAC CTC CGC Aso Leu Arg170 TTC CTG AGC Phe Leu Ser

GCG CGC GCC CAT Ala Arg Aia HisX10 . GAC GAG CTG CGCI Asp Glu Leu Arg125 AAC GGC GGC GCC Asn Giv Gly Ala； i CTG AGC ACG CTC Leu Sei： Thr Leu160 CAA GGC CTG CTG Gin Glv Leu Leu175 GCT CTC GAG GAG Ala. Leu Glu GluISO {請先閲讀背面之注意事項再填寫本買) 訂 -- 經濟部中央榡準局WC工消費合作社印裝 (2)序列識別編號：j i (0序列特點： (A) 長度：3〇鹼基對 (B) 類別：核苷酸 (C) 股性.·單 (D) 形狀：線性 -39a - 本紙張Λ度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) i 3 42 6 0 ； 第85106086號專利申請案 中文説明書修正頁(87年5月） 五、發明説明（ (ii)分子類別：c'DN'A (IX)特徵： (D)其它資訊：產物=alml (xi)序列説明：序列識別編號1 1 : ATCGATACCG CCA.TGAAAGC TGCGGTGCTG 30 (請先閱讀背面之注意事項再填??1本頁) 訂 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 -39b- 本紙張尺度適用中國國家標準（C»S ) A4規格（210X297公釐） 134260 A7 B7 五、發明説明（37) (2)序列識別编號：12 ⑴序列特點： . (A) 長度：30鹼基對 (B) 類別：核甞酸 (C) 股性：單 (D) 形狀：線性 (ii)分子類別：cDNA (ix)特徵： (D)其它資訊：產物=alm2 (xi)序列説明：序列識別編號12 : ATGGGCGCGC GCGCAGTCGC GCATCTCCTC 30 (2)序列識別編號：13 ⑴序列特點： (A) 長度：30鹼基對 (B) 類別：核甞酸 (C) 股性：單 (D) 形狀：線性 (ii)分子類別：cDNA (ix)特徵： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (D)其它資訊：產物=alm3 (xi)序列説明：序列識別編號13 : GAGGAGATGC GCGACTGCGC GCGCGCCCAT 30 (2)序列識別編號：14 (i)序列特點： -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 41 43426 0 A7 B7 五、發明説明（38 ) (A) 長度：30鹼基對 (B) 類別：核茫酸 (C) 股性：單 (D) 形狀：線性 (ii)分子類別：cDNA (ix)特徵： (D)其它資訊：產物=alm4 (xi)序列説明：序列識別編號14 : GTCGACGGCG CCTCACTGGG TGTTGAGCTT 30 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁)

Claims (1)

1. 434260 第851〇6〇86號專利申請案 JI 中文申請專利範圍修正本(89年12月） CS JJn 申請專利範園 89. ί2. 22 絛正‘ “曰補充 公

   1. 一種人類阿朴脂蛋白（apolipoprotein)A-I變體：其具 Λ 如下所示序列： 經濟部中央標準局貝工消费合作社印装 (請先閲讀背面之注$¾再填莴本頁) A.TG AAA GCT GCG GTG CTG ACC TTG CCC GTG CTC TTC CTG ACG GGG .^GC 48 Mec： Lvs Ala Val Leu Thr I^u A_U Va丄 Leu ku Th: Gly Se£ 1 - 5 LQ 3.3 CAC Gin GCT CGQ Al A 入：g CAT TTC Hi, 5 ?hs 20 i.T CGA GTG K\Q GAC Lys Λ33 A.sp Arg Val ^ 35 ACC GGC AGA s*r TGG CAG trp GLr, CTC- GCC Aia CAA GAT GITl Λ3 3 25 1 产·^ 产 *** l" ·'、、· < - u 7r.r v^i, =；0 Gi-i CCC CCC CAG AGC GL^ ?ro ?ro Glr. 3ar 3C CCC TGO ?rs Tr? 96 CAG Gl.n 55 ps a GAT A3? GAT As? CAG Gi,.i Glv Arg 50 CTA .1AC Leu Asa GAC tAT Aso Tyr CTA AAG U3U Lvs C-TO TCC CAG TTT GI,- ?hs AGC AAG CTG CGC 5er Lvs uau Arg 35 Va.1 5ar 55 CTC CT7 Leu Leu 70 GAA CAG GIu Gla TAC GTG tyr Vil OOC GIu GIv GAT GTG CTC .W, C-AC Asa Vei Lau Lys >.so • 4 5 _ TCC GCC TTG GGA ,^Λ 53：: Ala Lau Giy Lvs 50 * * 144 L92 GAC AAC ;\sp Asn CTC CCC Lsu *31 v TGG GAC AGC GTG A.CC TCC ACC Ser Vai thr Trp Asp 75 3er Thr 30 CCT GTG ACC CAG GAO TTC TGG Thr Gla Glu Pro Val 90 ?ha Tro 95 ' AAC CTG Asa Leu λΑΟ GAG ACA Gla The Glu Lys LOO ^ GAG GGC CTG AGG Gla Qlv Lau Arg LQ5 CAG GAO ,\TG XQC AAG Glr, Gl*u Msc 3e: Lvs U〇 * 240 288 336 CTG GAG GAG GTG I^u Glu G丄u V3丄 U5 AAG AAG I*GG CAG Tro Gir* Lvs Lys L30 CCG CTG CGC?ro 1,¾u Arq L45 GCA GAG Ala Giu ΛΛ〇 GCC ΰν3 Ala AAG GTG CAG CCC TAC CTG GAC Gin ?r〇 Lvs Val I2Q Tvr I-sm Aso L25 · GAG GAG ATG C-AG MiC GiM Glu Glu 135 CTC OA ueu Gi*i 150 GAG GGC Giu GIv CTC TAG CGC CAG K\Q Lau Tyr Arc Gin Lv-s L4Q " GAC TTC Asp ?ha GTG GAG V<ai Ciu 384 432 GCG CGC CAG .^ACi CTG CAC GAG 2^3, Ar? Gla t*ys Leu Ki.3 Giu 155 ISO 4:80

   本紙張尺度逋用t國國家梯準（CNS >八4规*格（210父297公# ) 申請專利範圍 8888 ABCD CTG CAA GAG AAG CTG AGC CQA CTG GGC GAG GAG ATO CGC GAC CGC GCG t Oeu Gin Gla Lvs Lau Sec ?co Csu Giv Glu Glu Hec Arq Aso Arc a ^ I〇5 170 175 ^ CGC GCC CAT GTG GAC GCG CTG CGC ACG CAT CTG CCC CCC TAC AGC GAC Arg ； 528 576 His V三丄 A^p Ala i-au A 130 ' Thr His Lau AJ.a Pro Tyr Sar Asp 135 L90 ' GAG CTG CGC CAG CGC TTG GCC GCG CGC CTT GAG GCT CTC GAG AAC GIu Leti Arg Gia Arg I*au Ala Ala Arg Leu GIu Ala Lsu Lvs Giu Asn L53 2QQ 20 3 .: GGC GGC GCC AGA CTG GCC GAG TAC CAC GCC AAG GCC ACC GAG CVT CTG GLy* Giy Aid Arg Leu Ala Giu Tyr Hi>s Ala Lys Ala The Giu Kia Laa 2IQ Zl5 " 2Z0 AGC ACG CTC AGC GAG GCC AAG CCC GCG CTC GAG GAC CiC CGC C,-^A 624 672 720 —Jr Ίί n-m - - HI ί~·-~~ί [ -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本育) Ssr Thr Lat-i Ser C-L'j, Lvs A 225 230 L：/3 Pro Ala Lau CIll Asp Lau Arg GLn . 235 240 GGC CTG CTG CCC GTG CTG GAG AGC TTC GTC AGC TTC CTG AGC GCT GIv Lau Isa ?tq Val Lau GLui Ser ?hs Lys 5^r ?he Lau Ala ^ 245 250 235 CTC GAG GAG TAC ACT ^AG *^AG CTC K\C ACC CAG TGA GOCGCCCGCC Lau Giu GLu Tvr Thr uvs Lvs Lau Asp. Thr GLr. ’ 250 265 768 814 訂 842 經濟部t央揉隼局貞工消費合作社印裝 GCCGCCCCCC TTCCCGGTGC TCAGAATA 其中位置175之精胺酸為半胱胺酸所取代，或 GAT G.i\ CCC CCC CAG AGC CCC TGG 24 Αΐρ Giu Pro ?ro Gir； 5sr ?:〇 T-p 1 5 ' C-AT GTG iAG CAC CTG CCC i.CT C-TC ~AC C~Q G.-.T GTG CTC iiA C-AC 72 A·3? ~~7 W- Lys Ai? Ls*j Ala thr Vai Tvr Val Aap '/a.I Lau lys Asp l〇 15 2〇 AGC GCC AGA GAC T.V： GTG TCC CAG T?T G3A GGC TCC GC：C TTG C-GA ΑΛΑ 120 5-r GJ./ Arg Asp Tvr val S^c GLn ?ha Giu Gly 5ar Aia Lau Glv Lys 25 * 30 35 40 -2- 本紙張尺度適用令國國家揉準（〇呢）人4規格（210父297公釐） 13 42 iQ AS B8 C8 D8 經濟部中央棣牟局男工消費合作杜印¾. 々、申請專利範圍 CAG CTA AAC CTA ΑΛΟ CTC CTT GAC .^AC TGG GACNAGC GTG ACC TCC ACC 168 Glr. Leu A^a Lau Lvs Lsu Leu Asp Aan Trp Asp 5ar Vai, Thr S3r Ήι二 45 50 55 TTC AGC AAG CTG CGC GA.^ CAG CTC GGC CCT GTG ACC CAG GAG TTC TGG 216 ?he Lys Lau Arg Glu Gin Le·-： Glv ?ro Val Thr Gin GIu ?hi Trp 60 65 70 GAT AAC CTG GAA :AAG GAG ACA GAG GGC CTG AGG CAG GAG .1.TG AGC ;AG 264 Asp Asn. Lau GIu Lys GIu Thr GIu Oly Leu Arg Gin GIu Mac 3ar Lvs 75 80 85 GAT CTG GAG GAG GTG >AG GCC .^AG GTG CAG CCC TAC CTG GAG GAC TTC 312 As? Lau GIu Giu '/aI Lys Ala Lva Gin ?ro tyr Leu As? As? 90 95 100 C.\C AAG AAG TGG CAC GAG GAG ATG GAG CTC TAC CGC CVG >AG GTG GAG 360 Gin Lys Lys Tr? Gin GIu GIu Ma~ GIu Lau Tvr Arg Gin. Lys V*1 GIu 105 110 115 120 CCG CTG CGC GCA GAG CTC CAA GAG GGC GCG CGC CAG AAG CTG CAC GAG 408 ?C〇 Lau Arg Ala Glu Lay Gin GIu Gly Ala Arg Gin Lys Lau K丄s .Gin 125 130 135 、 CTG CXA. GAG ^AG CTG AGC CCA CTG GGC GAG GAG ATG CGC GAC CGC GCG 456 Leu Gin GIu Lys Leu Sac ?~a Lsu Giy G丄u Glu Kec Arg Aap Axg Ala 140 145 150 CGC GCC CAT GTG GAC GCG CTG CGC ACG CAT CTG GCC CCC TAC AGC GAC 504 A_rg Ala His v*l Asp Ala Lau Ατς The His Leu Ala ?ro Tyr Ser λ3〇 155 160 165 .GAG CTG CGC CAG CGC TTG GCC GCG CGC CTT GAG GCT CTC A.5.G GAC- ^AC 552 GIu Lau Arq GI.i Arg Lau Aia Ala Arg Lau GIu AJ.a Laa L/s Giu Asn 170 175 180 GGC GGC GCC AGA CTG GCC GAG tAC CAC GCC AAG GCC ACC GAG CAT GTG 600 Glv til.7 Ala Arg L«u Ala G丄u 了yr Kis Ala Lys Aia Thr Glu His uau 165 190 195 200 dOLf -3- 本紙法尺度逋用t國國家揉準（CNSM4規格（2〖〇X297公釐）

   13426 0 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 AGC ACG CTC AGC GAG AAG GCC CCC GCG CTC GAG GAC CTC CGC CAA g43 - · > 3er Thr L^u 5er Giu Lys Ms Lys ?ro A丄丑 Gi1 二 Λ3〇 Leu Αζς C-In 205 210 715 C-GC CTG C了G CCC GTG CTC： C+AG AGC mAG CTC AGC ΐτί： CTG AGC GCT 696 Giy Ls'j Lau Pro Val Leu Giu 5e - ?ha L/3 Vai 5ec ?^.e 乙eu 3ar 入i_i 220 " 225 23。 CTC GAG GAG TAG ACT AAG AAG CTC ACC CAG TGA GCCGCCCGCC 742 L^u Giu Glu Tyr Thr Lys Lys Lsu Asn T'r.r Gin — 235 240 ! GCCGCCCCCC TTCCCGGTGC TCAGAATA / 770 其中位置151之精胺酸為半胱胺酸所取代《 2. 根據申請專利範圍第1項之變體，其特徵為其為重 級蛋白質。 3. 根據申請專利範圍第1項之變體，其係呈二元體形》 4. 根據申請專利範園第3項之變體，其特徵為其為同 質二元體/ 5. —種編碼如申請專利範園第1項之阿朴脂蛋白A-Ι變 體之核酸，其具如下所示序列： 經濟部中央揉车局負工消费合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ATG AAA GCT GCG GTG CTG ACC TTG GCC GTG CtC TTC CTG i«：G GGG AGC 48 Mac Lvs -\la Aj.a Val Leu Thi Leu Ala Val Lau ?h.a Ceu Thr Gly. Sac 1 ·5 L0 15 CAG GCT CGG CAT ttC TGG CAG C.V. GAT QK\ CCC CCC CAG ACC CCC TGG 96 'GI- ,Ua Arg His ?he Trs Gla C-Ir. Asc C*Lu ?ro ?ro Glr, ?ra Trp 20 25 30 _______ _ -4- 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS > A4規格（2丨0X29?公釐) 434260 AS 38 C8 DS 六、申讀專利範圍 GAT CGA C-TG AAG GAC CTC- GCC ACT C-TG tAC C-TG GAT 0~Z CTG GAC 144 A33 Arg Vai Lys Asp Lau Ala Thr V-i tv- Val Asa Vil Lau Lvs isa 35 45 AGC GCC AGA GAC ΤΛΤ GTG TCC CAG TTT G.^ GGC TCC GCC "TG GGA i.iA 192 5*r Gly Arg As? tvr vai s-c Gi.i Jhe Glu Giy 5sr Ala isa Glv Lvs 5〇 55 50 ' CAG CTA ,^AC CTA AAG CTC GTt Lau Lvs GXp. Lau Asa 55 TTC AGC CTG CGC ?ha Sar Lvs Leu Arg 35 tau ueu TO G^A GAG Giu Gin GAC AAC tGG GAC A5〇 As?. Trp Asp CTC GGC CCT GTG I*au Giv ?ro Va丄 90 AGC GTG ACC TCC .\CC Sac Vai Thr Ser Thr 30 ACC CAG GAG TTC TGG Thr Gin Glu 240 288 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) GAT AAC C了G GAA AAG Aso Asa Lau Glu Lvs LOO ' GAT CTG GAG Aso Leu Glut GAG GTG Glu Vai. GAG GAG GCC Gin Thr Glu GLv 105 GCC X\G GTG Lvs AJ.a CAG AAG AAG TGG CAG GAG GAG Lys Trp Gin Lvs 130 Gin, Glu Glu L35 Lvs VaL 120 ATG GAG GXu CTG AGG CAG GAG ATG Leu Wig' G丄n Giu Met LiO CAG CCC TAG CTG GAC GIr. ?ro Tyr Lau Aso 125 . CTC TAG CGC CAG >AG Leu Tyr Α^ς Gin Lvs L40 ' ?hs Tr^ 95 AGC AAG 5ar L/s GAC TTC Asp ?he GTG G.iXJ Val Glu 336 384 432 經济部_央橾隼局貝工消費合作社印裝 CCG CTG CGC GCA. GAG CTC OA ?ro Leu Arg Ala Glu Lau Gla L45 150 CTG C^A GAG AAG CTG AGC CCA ί Leu Gin Giu Lvs CGC GCC CAT GTG Arg Ala His Val 130 Lau Sar ?co 155 GAC GCG CTG A53 Ala Leu GAG GGC GCG CGC Giu Glv Ala Arg ' L55 CTG GGC GAG GAG Ls'j Giv Giu Glu 170 CAG CTG CAC GAG Gin L./s Lau His Glu 150 ATG CGC GAC CGC GCG Mac Arg Asp CGC ACG CAT CTG GCC CCC TAC His L^u Axg Thrias rUa Pro Tyr 190 Arg Ala 175 AGC GAC Ser Aso 〇〇 480 528 576 r\ 5 本紙張尺度逋用中國國家揀準（CNS > M規格（210X297公釐） 3426 0 v A8 B3 C8 D8 經濟部t央標率局貞工消費合作社"製 六、申請專利範圍 GAG CTG CGC CAG CGC TTG GCC GCG CGC CTT GAG ,GCT CTC GAO ^AC GLm Leu Arg Gin Arg Lau Ali Arg Leu Glu Lau Lys Giu A.sn 195 2QQ 20 5 .. GGC GGC GCC AGA CTC GCC GAG TAC CAC GCC AAC GCC ACC GAG CAT CTG GLy G丄y Ala Arg Lau .Ala GIu tyr His Ala Lys Ala thr Glu His Lau 2L0 2：5 220 *-*.wv» r*.v— -j Cd 1 ^ ,-*» ,ν*? w^—^ ^ ^ L ^ 匕 Lm·*··-· 5ar Tn: Laa 5er GIu Lys AJ.a Lys ?ro A丄a Lati Gi,u Asp Lau Arg Gin 225 230 ^ 235 ^ 240 624 672 720 GGC CTG CTG CCC GTG CTG GAG AGC TTC .AAG GTC ACC TTC CTG AGC GCT 768 ·./ γ,λμ 7^λ»_ι 2 ro ν^,Ι Lsll Glu 53: ?h^ L vs V"三丄 3 ^.c ? Γ. ί »ll Glu 5sr ?he lvs Vi 250 iu Ser Ala 255 (请先E靖背面之注意事項再填寫衣頁) CTC GAG GAG TAC ACT .=>AG .AAG CTC ACC CAG GGCGCCCGCC 814 Lsu Gi-j GIu Tvr Thr Lvs Lvs Lau Asn Thr Gin 250 " " 255 GCCGCCCCCC TTCCCGGTGC TCAGAATA 842 〇D 其中位置523至525之CGC為TGC所取代，或 GAT G.iA CCC CCC C.^C AGC CCC TGC A^p-GLu Pro ?ra C-ir. 5-ar ?ra Tr? i 5 * 24 GAT CGA GTG .-AC GAC CTG CCC Λ GTC 0ΛΤ GTG CTC -^AC 72 A-sp A-g Val Lvs A^p 乙Ala Thr V三1 了yr Vai A-s? V = I Leu Lys Asp 10 15 20 AGC GGC AGA GAC TAT GTG TCC CAG TTT GAA GCC TCC GCC TTG GGA .^Λ 120 5sr Giv ,~.xq A53 Ty- Val Saf Gin ?hs Giu Glv 5sr Ala Z,su Giy Lys 25 . 30 35 4〇 -6 - 本紙張Λ度適用中國國家揉準（CMS )八4規<格（210X297公釐) 4342.60;， SS008 ABCD 六、申請專利範園 CAG CT^ AAG CTC CTT GAC TQ<： GA<； AGC GTS ACC TCC '^CC GLn Leu Aaa Lau iys Lau A« AS^ Tr? As? 5ar Val Thr Sar Th- 45 50 55 --C \GC CT<^ c^c GA.^ CAG CTC GGC CCT GTG ACC CAG GAG TTC TGG ?he Ser Lvs Ar? G-^ ?r3 Vai Th- Gin Giu ?h' T;? 16θ 216 60 65 7Ό G.vr 说 CTG 私说 GAG ACA GAG G°c CTG AGG GAGArG AGC .iAG As?、3n Lsu Gl···1 Giu τη: Giu G1'/ L3U A:g Glr· ciu M*s Ssr L'/S 75 8〇 · 85 CTG ^ ^XC GTG -^G GCC .iAG GTO CAG CCC TAC CTG SAC GAC TTC ：s? riu Glu Vai Lvs Aia Vdi Gin ?：〇 T'/： Lau Ai? A3? ?hS '' 90 一 « : 1〇° CAG AAG AAG TGG CAG GAG GAG .\TG GAG CTC TAC CGC CAG AAG G1：G GAG Gin Givi Glu Me·- Glu Leu Ty- Arg Gin Lva <2I-U uo 115 120 264 312 360 (請先閲靖背面之注f項再魂寫本瓦) Gin Lvs Lys Tr? 105 經濟部4-央揉率扃員工消費合作社印«. CCG CTG CGC GC^ GAG CTC CAA 0.¾ GGC GCG CGC CV3 CTC CAC GAG ?rb Lau A.rg .\Ia Gi-U i-*u Gia Giu Gl^ Arg Gin Lys L~~ HiS GiU 125 130 135 1 CTG CA.A. GAG AAG CTG .^GC CCA CTG GGC GAG GAG .hiG CG^- CGv. G"-J Lau Gin Giu Lys i-au Ser ?r〇 Lsu Giv Glu Glu Mac Arg As? Arg 140 145 . . ISO . CGC GCC CAT GTG GAC GCG CTG CGC ACG CAT ClG C<_<_ TAw AG·- Azq .^-La His VS1 .^? .Ua λζ^ 7hr r.is Leu Ada ?=〇 Tyr Ssr -^?· 155 160 1每 5 .GAG CTG CGC CAG CGC TTG GCC GCG CSC CTT GAG GCT CTC AAG G.a.G Giu Lsu Ajg Gir· Arg Lati Ala A_U Ail Giu Ala hu Lys Giu Asn 170 175 · 180 G5C GGC GCC .AJGA CTG GCC GAG TAC CAC GCC A.A.G GCC ACC GAG CAT Ci.G. Giv Glv iJLi Ara Lay Ala Giu Tvr His Aid Lys Ma Thr Glu His ^ * _ 195 200 4Q8 456 504 552 60〇 165 190 本纸張尺度適用中國國家揉準.（CNS ) A4说格（210X297公釐）

   <34260 A8 B8 CS Ό8 六、申請專利範圍 ,GC C"C AGO .^AG GCC CCs# Ci'w GAw CvC G^jC λ 648 Ser thr Lau 5er Giu Lys ?-±i Lvs ?ro Λ-La Lsu GL·-：入3p Ar^ Gi.-i 205 ' 210 715 C^C CTG CTG CCC GTG C?G GAG AGC TTC .-AG GtC AGC . TTC CTC AGC GCT 696 ·* j C-Ly l€u Le'j. Pro Vi I Giu 3s: ?r.s Lys Val Sa: Ss:: A_La J 220 " 225 230 etc GAG GAG tAC ACT .-AG .iAG CTC .^AC ACC CAG TC-A GwCGCCCC-CC 742 Lau Gin GIu Tyr Thr Ly5 Lys Leu Asri Thr Girt ^ 235 240 GCCGCCCCCC TTCCCGGTGC TCAG.iAT.i. 77ΰ 。丨丨 其中位置451至453之CGC為TGC所取代。 6. 根據.申請專利範圍第5項之核酸，其特徵為其為 cDNA。 7. 根據申請專利範圍第5項之核酸，其特徵為其為基 因组DNA。 8. 根據申請專利範圍第5項之核酸，其特徵為其為 RNA。 經濟部4-央標準局貝工消费合作社印装 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 9. 一種用於治療或預防心血管病變之醫藥組成物，包 括根據申請專利範圍第1項之阿朴脂蛋白A-Ι變體於 醫藥可接受性載劑或塗層。 -8- 本纸張尺度適用中國國家搮準（0阳）六4见格（210父297公釐)