KR20210075087A - 죽상동맥경화증 및 관련 질환을 예방 및 치료하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
죽상동맥경화증 및 관련 질환을 예방 및 치료하기 위한 방법 및 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에서 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산, 또는 이 핵산을 포함하는 벡터를 상기 개체에게 투여하는 단계, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 발현하는 세포, 또는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상기 핵산을 포함하는 조직 또는 장기를 상기 개체에 이식하는 단계, 및/또는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상기 핵산을 포함하는 혈청 또는 간질액을 상기 개체에 주입하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.
Description
본 발명의 내용은 생물의약 분야에 속하고, 죽상동맥경화증 및 관련 질환을 예방 및 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
죽상동맥경화증은 지질 선조 또는 죽상동맥경화성 플라크를 형성하는, 동맥 혈관 벽 내의 지질 축적으로 인한 동맥 혈관의 기능장애를 지칭한다. 결과적으로 플라크 형성으로 인한 동맥 혈관운동 기능 감소, 내강 협착 및 심지어 혈전은 동맥에 의해 공급되는 조직 및 장기의 혈액 공급에 영향을 미침으로써, 조직 및 장기의 국소 또는 전체 허혈을 초래한다.
오랫동안 죽상동맥경화증 및 죽상동맥경화증 관련 질환을 더 효과적으로 예방할 수 있고/있거나 치료할 수 있는 약물 및/또는 치료 방법에 대한 요구가 있었다.
따라서, 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환의 신규 치료 방법이 필요하다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시키고 관련 장점도 제공한다. 본 발명의 방법, 조성물 및/또는 적용은 질환 모델 동물에서 산화 저밀도 지단백질의 수준을 유의미하게 감소시킬 수 있고, 죽상동맥경화성 플라크 형성을 유의미하게 감소시킬 수 있고 죽상동맥경화증의 진행을 유의미하게 억제할 수 있다.
한 양태에서, 본원은 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에서 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산, 또는 이 핵산을 포함하는 벡터를 상기 개체에게 투여하는 단계, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 발현하는 세포, 또는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상기 핵산을 포함하는 조직 또는 장기를 상기 개체에 이식하는 단계, 및/또는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상기 핵산을 포함하는 혈청 또는 간질액을 상기 개체에 주입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 가진다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산(들)의 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 비천연 아미노산은 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 셀레노시스테인, D-아미노산 또는 합성 비천연 아미노산, 및 이들의 유도체를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14에 표시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편, 및 서열번호 18에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편을 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편 및 막횡단 수송 기능을 달성하는 데 기여하는 단편을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 1개 내지 20개의 아미노산의 화학적 변형을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 화학적 변형은 아미노 또는 글리코실화 변형, 지방산 변형, 아실화 변형, Fc 단편 융합, 알부민 융합, 페길화(pegylation) 변형, 덱스트란 변형, 헤파린 변형, 폴리비닐피롤리돈 변형, 폴리아미노산 변형, 폴리시알산 변형, 키토산 및 이의 유도체 변형, 렉틴 변형, 알긴산나트륨 변형, 카르보머 변형, 폴리비닐피롤리돈 변형, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 변형, 하이드록시프로필 셀룰로스 변형, 아세틸화 변형, 포르밀화 변형, 인산화 변형, 메틸화 변형 및/또는 설폰화 변형을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 벡터는 진핵생물 발현 플라스미드 벡터, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 바큘로바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 가성광견병 바이러스를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 세포는 인간의 줄기 세포, 전구 세포 또는 성체 세포 중 어느 한 세포이다. 일부 특정 실시양태에서, 줄기 세포는 유도 다능(pluripotent) 줄기 세포, 전환분화(transdifferentiation)에 의해 얻은 세포, 또는 일차 배양으로부터 유래된 줄기 세포, 모세포로부터 분화된 다능 또는 단능(unipotent) 줄기 세포이다. 일부 특정 실시양태에서, 조직은 뇌, 간, 신장, 비장 또는 췌도의 전체 장기 또는 부분 조직 덩어리, 또는 혈액, 지방, 근육, 골수 또는 피부이다. 일부 특정 실시양태에서, 상기 방법은 지질저하제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 상기 방법은 혈압강하제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 상기 방법은 항응고제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 개체는 경피적 관상동맥 중재술, 관상동맥 우회로 이식술 또는 경동맥 내막절제술로 구성된 군으로부터 선택되는 외과 수술을 받는다. 일부 특정 실시양태에서, 상기 방법은 동맥 혈관 벽 내의 지질 축적을 감소시킨다. 일부 특정 실시양태에서, 지질은 혈중 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 트리글리세라이드, 킬로미크론(CM), 저밀도 지단백질(LDL), 초저밀도 지단백질(VLDL), 중밀도 지단백질(IDL), 지단백질 (a)(Lp(a)), 산화 저밀도 지단백질(oxLDL) 및 이들 각각의 대사 중간체 중 하나 이상을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환은 혈관 내경 협착, 혈관 외경 확장, 혈관수축 및 혈관확장 능력의 감소, 혈관 탄력의 감소, 혈관 취약성의 증가, 맥관결석 변성 또는 석회증, 또는 혈전에 의해 유도된 혈관의 혈액 공급 능력의 감소를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환은 고혈압, 협심증, 심근 경색, 심근 혈액 공급 부족, 부정맥, 뇌 혈액 공급 부족, 허혈성 뇌졸중, 뇌 위축증, 신기능부전, 신동맥 협착증, 마비성 장폐색 또는 말단 허혈성 괴사를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 혈관 내피에 의한 지질 흡수의 감소를 필요로 하는 개체에서 혈관 내피에 의한 지질 흡수를 감소시키는 방법으로서, 치료 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 가진다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산(들)의 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 비천연 아미노산은 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 셀레노시스테인, D-아미노산 또는 합성 비천연 아미노산, 및 이들의 유도체를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14에 표시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편 및 서열번호 18에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 대식세포에서의 지질 축적의 감소를 필요로 하는 개체에서 대식세포에서의 지질 축적을 감소시키는 방법으로서, 치료 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 가진다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산(들)의 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 비천연 아미노산은 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 셀레노시스테인, D-아미노산 또는 합성 비천연 아미노산, 및 이들의 유도체를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14에 표시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편 및 서열번호 18에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 간 세포에서의 지질 축적의 증가를 필요로 하는 개체에서 간 세포에서의 지질 축적을 증가시키는 방법으로서, 치료 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 가진다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산(들)의 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 비천연 아미노산은 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 셀레노시스테인, D-아미노산 또는 합성 비천연 아미노산, 및 이들의 유도체를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14에 표시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편 및 서열번호 18에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 개체의 혈관에서 순환 산화 LDL의 양을 감소시키는 방법으로서, 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 유리 산화 LDL과 복합체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 복합체를 형성하지 않은 유리 산화 LDL의 양 및 총 산화 LDL의 양을 감소시킨다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 가진다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산(들)의 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 비천연 아미노산은 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 셀레노시스테인, D-아미노산 또는 합성 비천연 아미노산, 및 이들의 유도체를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14에 표시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편 및 서열번호 18에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 개체의 혈관 내의 플라크 형성을 감소시키는 방법으로서, 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 유리 산화 LDL과 복합체를 형성할 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 혈관은 동맥이다. 일부 특정 실시양태에서, 혈관은 대동맥이다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 가진다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산(들)의 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 비천연 아미노산은 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 셀레노시스테인, D-아미노산 또는 합성 비천연 아미노산, 및 이들의 유도체를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14에 표시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편 및 서열번호 18에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 혈관 내의 순환 유리 산화 LDL을 단백질-지질 복합체의 형태로 격리시키는 방법으로서, 상기 산화 LDL을 단백질에 노출시켜 혈관에서 단백질-지질 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 상기 단백질은 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 가진다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산(들)의 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 비천연 아미노산은 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 셀레노시스테인, D-아미노산 또는 합성 비천연 아미노산, 및 이들의 유도체를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14에 표시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편 및 서열번호 18에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체와 지질의 복합체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원은 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환을 치료하기 위한 치료제를 스크리닝하는 방법으로서, 상기 치료제를 sDSS1 단백질, sDSS1 단백질의 유전자, sDSS1 유전자의 조절 요소 및 sDSS1 유전자의 전사 생성물과 접촉시키는 단계, 및 sDSS1 단백질의 발현에 대한 상기 치료제의 효과를 평가하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
예를 들면, 본원은 하기 기술적 해법을 제공한다: 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 심혈관 및 뇌혈관 질환 및 말초 혈관 질환의 예방 및 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 단백질의 적용으로서, 상기 적용이 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 심혈관 및 뇌혈관 질환 및 말초 혈관 질환의 예방 및 치료용 약물의 제조를 위해 sDSS1 단백질을 사용하는 것임을 특징으로 하는 적용.
일부 특정 실시양태에서, 죽상동맥경화증은 동맥 혈관의 기능장애를 유발하는, 동맥 혈관 벽 내의 지질 축적에 의해 야기된 지질 선조 또는 죽상동맥경화성 플라크의 출현을 지칭한다.
일부 특정 실시양태에서, 지질은 혈중 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 트리글리세라이드, 킬로미크론(CM), 저밀도 지단백질(LDL), 초저밀도 지단백질(VLDL), 중밀도 지단백질(IDL), 지단백질 (a)(Lp(a)), 고밀도 지단백질(HDL), 산화 저밀도 지단백질(oxLDL) 및 이들 각각의 대사 중간체 중 하나 이상을 지칭한다.
일부 특정 실시양태에서, 동맥 혈관의 기능장애는 혈관 내경 협착, 혈관 외경 확장, 혈관수축 및 혈관확장 능력의 감소, 혈관 탄력의 감소, 혈관 취약성의 증가, 맥관결석 변성 또는 석회증, 및 혈전에 의해 유도된 혈관의 혈액 공급 능력의 감소를 의미한다.
일부 특정 실시양태에서, 죽상동맥경화증 관련 심혈관 질환은 고혈압, 협심증, 심근 경색, 심근 혈액 공급 부족, 부정맥 및 돌연사를 지칭한다.
일부 특정 실시양태에서, 죽상동맥경화증 관련 뇌혈관 질환은 뇌 혈액 공급 부족, 허혈성 뇌졸중 및 뇌 위축증을 지칭한다.
일부 특정 실시양태에서, 죽상동맥경화증 관련 말초 혈관 질환은 신기능부전, 신동맥 협착증, 마비성 장폐색 또는 말단 허혈성 괴사를 지칭한다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질은 호모 사피엔스(Homo sapiens), 판 트로글로다이테스(Pan troglodytes), 판 파니스쿠스(Pan paniscus), 고릴라(Gorilla), 오랑우탄(Orangutan), 노마스쿠스 류코제니스(Nomascus leucogenys), 리노피테쿠스 록셀라나(Rhinopithecus roxellana), 마카카 뮬라타(Macaca mulatta), 리노피테쿠스 비에티(Rhinopithecus bieti), 파피오 아누비스(Papio anubis), 콜로부스 안골렌시스(Colobus angolensis), 세르코세부스 아티스(Cercocebus atys), 만드릴루스 류코패우스(Mandrillus leucophaeus) 및 마카카 레오니나(Macaca leonina) 중 어느 하나의 sDSS1 단백질 서열에 의해 형성된 기본 단백질을 포함하고, 이때 호모 사피엔스 sDSS1의 아미노산 서열은 서열번호 1로서 기재되고, 판 트로글로다이테스 sDSS1의 아미노산 서열은 서열번호 2로서 기재되고, 판 파니스쿠스 sDSS1의 아미노산 서열은 서열번호 3으로서 기재되고, 고릴라 sDSS1의 아미노산 서열은 서열번호 4로서 기재되고, 오랑우탄 sDSS1의 아미노산 서열은 서열번호 5로서 기재되고, 노마스쿠스 류코제니스 sDSS1의 아미노산 서열은 서열번호 6으로서 기재되고, 리노피테쿠스 록셀라나 sDSS1의 아미노산 서열은 서열번호 7로서 기재되고, 마카카 뮬라타 sDSS1의 아미노산 서열은 서열번호 8로서 기재되고, 리노피테쿠스 비에티 sDSS1의 아미노산 서열은 서열번호 9로서 기재되고, 파피오 아누비스 sDSS1의 아미노산 서열은 서열번호 10으로서 기재되고, 콜로부스 안골렌시스 sDSS1의 아미노산 서열은 서열번호 11로서 기재되고, 세르코세부스 아티스 sDSS1의 아미노산 서열은 서열번호 12로서 기재되고, 만드릴루스 류코패우스 sDSS1의 아미노산 서열은 서열번호 13으로서 기재되고, 마카카 레오니나 sDSS1의 아미노산 서열은 서열번호 14로서 기재된다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질은 상기 언급된 실시양태들에 기재된 sDSS1 단백질에 대한 70% 초과의 유사성을 갖는 임의의 제1 단백질이다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질은 상기 언급된 실시양태들에 기재된 sDSS1 단백질의 C-말단에 있는 31개의 아미노산들과 동일하거나 유사한, 융합을 위해 사용된 다른 폴리펩타이드 단편의 구조적 특성 또는 아미노산 서열 특성을 가진, N-말단 또는 C-말단에서 상기 폴리펩타이드 단편에 융합된, 상기 언급된 실시양태들에 기재된 sDSS1 단백질의 N-말단에 있는 58개의 아미노산들에 기반한 임의의 제2 단백질이다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질은 막횡단 수송 기능을 가능하게 하는 융합된 단백질을 가진, N-말단 또는 C-말단에서 다른 아미노산 단편에 융합된, 상기 언급된 실시양태들에 기재된 sDSS1 단백질의 N-말단에 있는 58개의 아미노산들에 기반한 임의의 제3 단백질이다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질은 기본 단백질, 제1 단백질, 제2 단백질 또는 제3 단백질을 임의의 길이의 단백질 그 자체, 담체 단백질, 항체 또는 다른 아미노산 단편에 라이게이션시킴으로써 형성된 융합 단백질이다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질은 기본 단백질, 제1 단백질, 제2 단백질, 제3 단백질 또는 융합 단백질에 기반한 변형에 의해 생성된 폴리펩타이드/단백질 변형제이다.
일부 특정 실시양태에서, 폴리펩타이드/단백질 변형제는 특이적으로 또는 비특이적으로 1개 내지 20개의 부위에서 아미노산 측쇄 상의 아미노 기, 아미노산 측쇄 상의 카르보닐 기, 질소 말단 아미노 기, 탄소 말단 카르보닐 기, 시스테인, 티로신, 세린 및 트립토판이 화학적으로 변형된다.
일부 특정 실시양태에서, 폴리펩타이드/단백질 변형제의 변형 방법은 글리코실화 변형, 지방산 변형, 아실화 변형, Fc 단편 융합, 알부민 융합, 페길화 변형, 덱스트란 변형, 헤파린 변형, 폴리비닐피롤리돈 변형, 폴리아미노산 변형, 폴리시알산 변형, 키토산 및 이의 유도체 변형, 렉틴 변형, 알긴산나트륨 변형, 카르보머 변형, 폴리비닐피롤리돈 변형, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 변형, 하이드록시프로필 셀룰로스 변형, 아세틸화 변형, 포르밀화 변형, 인산화 변형, 메틸화 변형, 설폰화 변형, 및 다른 약학적으로 이용 가능한 폴리펩타이드/단백질 변형 방법 중 하나 이상을 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질은 기본 단백질, 제1 단백질, 제2 단백질, 제3 단백질 또는 융합 단백질의 아미노산 서열에 기반하여 20종의 기본 아미노산들 이외의 아미노산을 사용하여 1개 내지 31개의 임의 아미노산 부위에서 치환시킨 비천연 아미노산 치환 단백질이다.
일부 특정 실시양태에서, 비천연 아미노산 치환 단백질의 아미노산 치환은 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 셀레노시스테인, D-아미노산, 합성 비천연 아미노산 및 이들의 유도체를 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질은 기본 단백질, 제1 단백질, 제2 단백질, 제3 단백질, 융합 단백질, 폴리펩타이드/단백질 변형제 또는 비천연 아미노산 치환 단백질 및 약학적으로 적용 가능한 약물 담체에 의해 형성된 부분 또는 전체 복합체이다.
일부 특정 실시양태에서, 상기 복합체의 약물 담체는 장 코팅 제제, 캡슐, 미소구/미세캡슐, 리포좀, 미세유화액, 복합 유화액, 나노입자, 자기 입자, 젤라틴 및 겔 중 하나 이상을 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질은 개체 자신의 sDSS1 단백질을 표적화하고, 개체 자신의 sDSS1 단백질의 수준은 외래 약물에 의해 영향을 받는다.
일부 특정 실시양태에서, 약물은 약물의 표적으로서 sDSS1 단백질, sDSS1 단백질의 유전자, sDSS1 유전자의 조절 요소 및 sDSS1 유전자의 전사 생성물을 사용한다.
일부 특정 실시양태에서, 약물은 혈액, 뇌척수액 또는 림프액에서 프로테아제(protease)/펩티다제(peptidase) 활성에 영향을 미침으로써 혈액, 뇌척수액 또는 림프액에서 sDSS1 단백질의 양을 조절한다.
일부 특정 실시양태에서, 약물은 화학 소분자 약물, 항체, 폴리펩타이드/단백질 약물, 핵산 약물 또는 나노약물에 의해 형성된 제1 약물이다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질은 기본 단백질, 제1 단백질, 제2 단백질, 제3 단백질, 융합 단백질, 폴리펩타이드/단백질 변형제, 복합체 및 제1 약물 중 어느 하나의 2개 이상의 성분들의 조합에 의해 형성된 제2 약물이다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질은 기본 단백질, 제1 단백질, 제2 단백질, 제3 단백질, 융합 단백질, 폴리펩타이드/단백질 변형제, 복합체 및 제1 약물 중 어느 하나의 1개, 2개 또는 더 많은 성분과 약학적으로 이용 가능한 부형제에 의해 형성된 제3 약물이다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질은 기본 단백질, 제1 단백질, 제2 단백질, 제3 단백질 또는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 생체 내로 도입하고 발현 시스템을 통해 발현시킴으로써 수득된 제4 약물이다.
일부 특정 실시양태에서, 발현 시스템은 진핵생물 발현 플라스미드 벡터, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 바큘로바이러스, 헤르페스 바이러스, 가성광견병 바이러스, ZFN 유전자 편집 기술, TALEN 유전자 편집 기술, CRISPR/Cas 유전자 편집 기술 및 다른 의학적으로 이용 가능한 유전자 편집 기술 또는 바이러스 벡터이다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질은 세포를 개체에 이식함으로써 수득된 기본 단백질, 제1 단백질, 제2 단백질, 제3 단백질 또는 융합 단백질에 의해 형성된 제5 단백질이다.
일부 특정 실시양태에서, 세포는 인간의 줄기 세포, 전구 세포 또는 성체 세포 중 어느 하나이다.
일부 특정 실시양태에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 유도 다능 줄기 세포, 전환분화에 의해 얻은 세포, 또는 일차 배양으로부터 유래된 줄기 세포, 모세포로부터 분화된 다능 또는 단능 줄기 세포이다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질은 혈청, 뇌척수액, 림프액 또는 간질액의 주입에 의해 개체 내로 도입된 제6 단백질이다.
일부 특정 실시양태에서, sDSS1 단백질은 조직 또는 장기를 개체에 이식함으로써 수득된 기본 단백질, 제1 단백질, 제2 단백질, 제3 단백질 또는 융합 단백질에 의해 형성된 제7 단백질이다.
일부 특정 실시양태에서, 조직은 뇌, 간, 신장, 비장 또는 췌도의 전체 장기 또는 부분 조직 덩어리, 또는 혈액, 지방, 근육, 골수 또는 피부이다.
일부 특정 실시양태에서, 예방 약물은 기본 단백질, 제1 단백질 내지 제7 단백질 중 어느 한 단백질, 융합 단백질, 폴리펩타이드/단백질 변형제, 비천연 아미노산 치환 단백질, 복합체, 약물 조합물, 발현 시스템, 세포, 조직, 장기, 체액 또는 간질액을 포함하는 단백질 약물, 폴리펩타이드 약물, 핵산 약물, 화학 소분자 약물, 세포 제품, 시판되는 이식 조직, 주사액, 냉동건조된 분말, 건강관리 제품 및 식품 첨가제 중 하나 이상이다.
일부 특정 실시양태에서, 치료 약물은 기본 단백질, 제1 단백질 내지 제7 단백질 중 어느 한 단백질, 융합 단백질, 폴리펩타이드/단백질 변형제, 비천연 아미노산 치환 단백질, 복합체, 제1 약물, 제2 약물, 제3 약물, 발현 시스템, 세포, 조직, 장기, 체액 또는 간질액을 포함하는 단백질 약물, 폴리펩타이드 약물, 핵산 약물, 화학 소분자 약물, 세포 제품, 시판되는 이식 조직, 주사액, 냉동건조된 분말, 건강관리 제품 및 식품 첨가제 중 하나 이상이다.
본 발명의 특징 및/또는 유리한 효과는 하기 특징 및/또는 효과를 포함한다:
1．본 발명에 의해 제공된 sDSS1 단백질은 시험관 내에서 oxLDL 및 LDL에 결합하는 능력을 갖는다는 점;
2．본 발명에 의해 제공된 sDSS1 단백질은 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에 의한 oxLDL의 흡수를 억제할 수 있다는 점;
3．본 발명에 의해 제공된 sDSS1 단백질은 단핵구 THP-1로부터 분화된 대식세포에 의한 oxLDL의 식세포작용을 억제할 수 있다는 점;
4．본 발명에 의해 제공된 sDSS1 단백질은 간 세포 HepG2에 의한 oxLDL의 흡수를 증가시킬 수 있다는 점;
5．본 발명에 의해 제공된 sDSS1 단백질은 모델 동물에서 oxLDL/LDL 비의 수준을 감소시킬 수 있다는 점;
6．본 발명에 의해 제공된 sDSS1 단백질은 모델 동물에서 죽상동맥경화성 플라크의 면적을 감소시킬 수 있고 죽상동맥경화증의 진행을 억제할 수 있다는 점;
7．본 발명에 의해 제공된 sDSS1 단백질은 인간 및 기타 영장류에 의해 보유된 단백질이고, 생체 내에서 상대적으로 작은 분자량, 낮은 면역원성 및 천연 단백질 분해 기작을 가진다는 점. 따라서, 이의 임상 적용은 분명한 면역 반응 또는 다른 부작용을 야기하지 않을 것이므로, 안전하고 신뢰할 수 있다.
요약하면, 본 발명은 죽상동맥경화증 및 죽상동맥경화증 관련 심혈관 및 뇌혈관 질환 및 말초 혈관 질환의 예방 및 치료를 위한 sDSS1 단백질 약물을 제공한다. 분자, 세포 및 동물 수준에서의 실험에 의해 입증된 바와 같이, sDSS1 단백질은 LDL 또는 oxLDL 단백질에 결합하여 복합체를 형성할 수 있고, 배양 배지에의 sDSS1 단백질의 첨가는 혈관 내피 세포 및 단핵 대식세포에 의한 oxLDL의 흡수를 감소시키고, 간 세포에 의한 oxLDL의 흡수를 증가시킨다. 동물 실험에서, sDSS1 단백질은 죽상동맥경화증 모델 마우스에서 산화 저밀도 지단백질의 수준을 효과적으로 감소시킬 수 있고, 죽상동맥경화성 플라크의 면적을 효과적으로 감소시킬 수 있고, 죽상동맥경화증의 진행을 효과적으로 억제할 수 있다. sDSS1 단백질은 보다 더 낮은 단백질 면역원성 및 상당한 약학 효과를 갖고, 죽상동맥경화증 및 죽상동맥경화증 관련 심혈관 및 뇌혈관 질환 및 말초 혈관 질환의 예방 및 치료에 있어서 임상적으로 사용될 잠재력을 가진다.
본 발명을 분명하고 완전하게 만들기 위한 것이나 본 발명의 보호범위를 제한하기 위한 것이 아닌 첨부된 도면을 참조함으로써 이하에서 본 발명을 상세히 더 기술할 것이다.
도 1. 분자 실험은 sDSS1 단백질이 oxLDL 및 LDL과 상호작용할 수 있음을 보여주었다.
도 1a. 아세트산나트륨/아세트산 완충액(pH 4.5)에서, oxLDL 또는 LDL을 12시간 동안 sDSS1 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 생성물을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색하였다. 결과는 LDL 단백질(L1), oxLDL 단백질(L2) 밴드 단독의 분자량이 약 70 KD이고, sDSS1 밴드(L3, L6) 단독의 분자량이 약 15 KD임을 보여준다. LDL 또는 oxLDL과 sDSS1 단백질의 공-인큐베이션은 상호작용을 야기하였다. (L4 및 L7은 LDL 및 sDSS1 단백질에 상응하고, L5 및 L8은 oxLDL 및 sDSS1 단백질에 상응한다).
SDS-PAGE 겔 상에서, sDSS1 단백질과 반응시킨 후, 반응 시스템에서 oxLDL 단백질 또는 LDL 단백질(분자량 약 70 KD) 밴드는 유의미하게 더 옅어지고; 반응 시스템 내의 sDSS1 단백질의 농도가 증가함에 따라, 더 많은 복합체가 LDL 또는 oxLDL에 의해 형성되었고 밴드는 더 짙어진다.
도 1b. 인산염 완충액(pH 7.2)에서, oxLDL 또는 LDL을 12시간 동안 sDSS1 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 생성물을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. 결과는 LDL 단백질(L1), oxLDL 단백질(L2) 밴드 단독의 분자량은 약 70 KD이고 sDSS1 밴드(L3, L6) 단독의 분자량은 약 15 KD임을 보여준다. LDL 또는 oxLDL과 sDSS1 단백질의 공-인큐베이션은 상호작용을 야기하였다. (L4 및 L7은 LDL 및 sDSS1 단백질에 상응하고, L5 및 L8은 oxLDL 및 sDSS1 단백질에 상응한다).
SDS-PAGE 겔 상에서, sDSS1 단백질과 반응시킨 후, 반응 시스템에서 oxLDL 단백질 또는 LDL 단백질(분자량 약 70 KD) 밴드는 유의미하게 변하지 않았고; 반응 시스템 내의 sDSS1 단백질의 농도가 증가함에 따라, 더 많은 복합체가 LDL 또는 oxLDL에 의해 형성되었고 밴드는 더 짙어진다.
도 1c 및 도 1d. 인산염 완충액(pH 7.2)에서, oxLDL을 각각 sDSS1-M1 또는 sDSS1-M2와 함께 인큐베이션하였다. 생성물을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. 결과는 oxLDL이 sDSS1-M1과 함께 인큐베이션되었을 때, sDSS1-M1 단백질이 반응 시스템에서 oxLDL 단백질과 상호작용하여, SDS-PAGE 겔 상에서 고분자량 영역(>75 KD) 및 37 KD 내지 75 KD 영역에서 분명한 확산 밴드(L3, L5, L7)를 형성하지만, 반응 시스템에서 sDSS1-M1 단백질 밴드가 명확히 더 옅어짐(L2 대 L3, L4 대 L5, L6 대 L7)을 보여준다(도 1c). oxLDL이 sDSS1-M2와 함께 인큐베이션되었을 때, sDSS1-M2 단백질은 이량체(L2, L4, L6)로서 나타났고, oxLDL 단백질과 상호작용하여, 고분자량 영역(>75 KD) 및 37 KD 내지 75 KD 영역에서 분명한 확산 밴드(L3, L5, L7)를 형성하였다. 이들 두 반응 시스템들에서, 반응 시스템 내의 sDSS1-M1 또는 sDSS1-M2 단백질의 농도가 증가함에 따라, 반응 시스템에서 더 많은 복합체가 형성되었고, 밴드는 더 짙어진다.
도 2. sDSS1 단백질은 내피 세포에 의한 oxLDL의 흡수를 억제할 수 있다.
도 2a. 10 ㎍/㎖ Dil-oxLDL을 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 배양 배지에 첨가하였거나, Dil-oxLDL을 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖의 농도로 sDSS1 단백질과 함께 첨가하였다. 5시간 후, Dil-oxLDL은 HUVEC 세포에 의해 흡수되었다. 상기 세포에서 적색 형광을 보이는 상이한 수의 식세포성 소포가 형광 현미경 하에서 관찰될 수 있었다. sDSS1 단백질을 첨가한 후, HUVEC 세포에서의 형광은 약해졌고, 효과는 농도 의존적이었다.
도 2b. HUVEC 세포에 의한 Dil-oxLD의 흡수 후, 유세포분석으로 상기 세포에서 형광 신호를 검출하였고, 배양 배지에 첨가된 sDSS1 단백질의 양이 증가함에 따라, 상기 세포의 형광 신호가 점진적으로 약해짐을 발견하였다.
도 2c. 유세포분석 시험 결과는 sDSS1 단백질이 대조군 세포에 비해 HUVEC 세포에 의한 oxLDL의 흡수를 유의미하게 억제할 수 있었음을 통계적으로 보여주었다(10 ㎍/㎖ Dil-oxLDL). 배양 배지에의 2 ㎍/㎖ sDSS1 단백질의 첨가는 oxLDL의 흡수를 절반 감소시킬 수 있었고, 효과는 분명히 용량 의존적이었다.
도 3. sDSS1 단백질은 대식세포에 의한 oxLDL의 식세포작용을 억제할 수 있다.
도 3a. THP-1 세포를 4일 동안 100 nM PMA로 유도한 후, 이 세포는 성숙 대식세포로 분화한다. 10 ㎍/㎖ Dil-oxLDL을 배양 배지에 첨가하였거나, Dil-oxLDL을 2 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖의 농도로 sDSS1 단백질과 함께 첨가하였다. 5시간 후, 대조군 세포에서 Dil-oxLDL은 대식세포에 의해 포식되었음이 관찰되었고, 상기 세포에서 분명한 적색 형광 식세포성 소포가 관찰될 수 있었다. sDSS1 단백질을 첨가한 후, 상기 세포에서 기본적으로 분명한 형광 신호는 관찰되지 않았다.
도 3b. 유세포분석으로 대식세포의 형광 신호를 검출하였다. 결과는 형광 신호를 갖는 세포가 대조군 내의 세포에서 검출될 수 있었지만(10 ㎍/㎖ Dil-oxLDL), 형광 신호를 갖는 세포는 기본적으로 sDSS1 단백질이 첨가된 2개의 실험군 내의 세포에서는 나타나지 않았음을 보여주었다.
도 4. sDSS1 단백질은 인간 간 세포에 의한 oxLDL 단백질의 흡수 능력을 증가시킬 수 있다.
도 4a. Dil-oxLDL을 Hep G2 세포에 첨가한 지 9시간 후, 형광 현미경으로 세포의 형광을 검출하였다. 결과는 분명한 형광이 대조군 및 실험군 내의 세포에서 관찰될 수 있었음을 보여준다. 형광은 상이한 수의 식세포성 소포에서 나타났는데, 이것은 Hep G2 세포가 Dil-oxLDL을 흡수하였음을 시사한다.
도 4b. 유세포분석으로 세포 형광 값을 검출하였다. 분명한 Dil 형광 신호가 대조군 내의 Hep G2 세포에서 검출될 수 있었음을 확인할 수 있었다. 배양 배지에의 5 ㎍/㎖ sDSS1의 첨가는 세포내 형광 수준에 유의미한 영향을 미치지 않은 반면, 50 ㎍/㎖ sDSS1 단백질은 세포에서 Dil 신호의 강도를 유의미하게 증가시킬 수 있었다.
도 4c. 유세포분석에 의한 통계적 검출 결과는 대조군에 비해 50 ㎍/㎖ sDSS1 단백질을 배양 배지에 첨가한 후, Hep G2 세포에 의한 oxLDL의 흡수 능력이 약 27% 증가되었고, 이것은 대조군에 비해 유의미하게 개선된 수준이었음(**p<0.01)을 보여주었다.
도 5. sDSS1 단백질은 인간 간 세포에 의한 LDL 단백질의 흡수 능력에 유의미한 영향을 미치지 않는다.
도 5a. Dil-LDL을 Hep G2 세포에 첨가한 지 10시간 후, 형광 현미경으로 세포 형광을 검출하였다. 결과는 명확한 형광이 대조군 및 실험군 내의 세포에서 관찰될 수 있었음을 보여주었다. 형광은 상이한 수의 식세포성 소포에서 나타났는데, 이것은 Hep G2 세포가 Dil-LDL을 흡수하였음을 시사한다. 형광 세포의 수를 측정하였고, 유의미한 차이는 없었다.
도 5b. 유세포분석으로 세포 형광 값을 검출하였다. 분명한 Dil 형광 신호가 대조군 내의 Hep G2 세포에서 검출될 수 있었음을 알 수 있었다. 배양 배지에의 5 ㎍/㎖ sDSS1 또는 50 ㎍/㎖ sDSS1 단백질의 첨가는 세포에서 Dil 형광 신호의 강도의 유의미한 변화를 야기할 수 없었다.
도 6. sDSS1 단백질은 마우스에서 혈장 oxLDL 수준 및 혈장 oxLDL/LDL 비를 감소시키고 LDL 수준의 유의미한 차이는 없다.
ApoE-/- 마우스를 2개의 군, 즉 대조군 및 sDSS1 단백질 투여군으로 나누었다. 200 ㎕의 생리염수를 복강내 주사로 하루에 1회 대조군에게 제공하였고, sDSS1 단백질을 복강내 주사로 10 mg/kg 체중(10 mpk) 또는 30 mg/kg 체중(30 mpk)에 따라 하루에 1회 투여군에게 투여하였고, 양성 대조군 약물로서 아토르바스타틴(atorvastatin)(ATV)을 연속 7일 동안 복강내 주사로 40 mg/kg 체중(40 mpk)에 따라 매일 투여하였다. 투여 말기에, 마우스에서 oxLDL 및 LDL의 혈장 수준을 검출하였다.
도 6a. 혈장 oxLDL 수준을 검출하였고, sDSS1 단백질의 투여 후, sDSS1 단백질의 저용량 주사가 마우스에서 혈장 oxLDL 수준에 유의미한 영향을 미치지 않은 반면, 고용량 투여가 40 mpk ATV와 동일한 효능을 보이면서 마우스에서 oxLDL 수준을 유의미하게 감소시켰음을 발견하였다.
도 6b. 혈장 LDL 수준을 검출하였고, 대조군 내의 마우스에 비해, 10 mpk 또는 30 mpk의 sDSS1 단백질의 주사가 마우스에서 혈장 LDL 수준의 유의미한 변화를 야기하지 않았음을 확인하였다.
도 6c. 혈장 oxLDL/LDL 비를 분석하였고, 결과는 ATV와 유사한 효능을 보여주면서, 고용량 sDSS1 단백질 군의 마우스의 혈장 oxLDL/LDL 비가 대조군의 마우스의 혈장 oxLDL/LDL 비보다 유의미하게 더 낮았음을 보여주었다(* p 값 <0.05).
도 7. sDSS1 단백질은 ApoE-/- 마우스에서 죽상동맥경화성 플라크의 형성을 억제한다. 연속 13주 동안 3 mpk의 sDSS1 또는 40 mpk의 ATV를 16주령 ApoE-/- 마우스에게 연속적으로 주사하였다. 주사 말기에, 오일 레드 O 염색을 위해 대동맥을 절개하였고, 플라크의 면적을 계산하였다.
도 7a. ApoE-/- 마우스의 대동맥 앞면(정면)의 염색은 죽상동맥경화성 플라크를 보여주었다. 죽상동맥경화성 플라크는 오일 레드 O에 의해 염색되었고 적색을 띤 주황색으로 나타났고, 플라크를 갖지 않은 영역은 색상을 띠지 않았고 투명하였다. 결과는 양성 약물 군 내의 마우스의 죽상동맥경화성 플라크의 면적이 모델 군에 비해 유의미하게 감소되었고, sDSS1 단백질 군 내의 마우스의 죽상동맥경화성 플라크의 면적도 모델 군에 비해 유의미하게 감소되었고, 일부 영역들에서의 효과가 양성 약물의 효과보다 훨씬 더 우수하였음을 보여준다.
도 7b. 오일 레드 O 염색 면적 및 총 대동맥 면적을 측정하였고, 플라크 면적 비를 계산하였다. 양성 약물 군 및 sDSS1 단백질 군의 플라크 면적 비는 모델 군의 플라크 면적 비보다 유의미하게 더 작았고(**p<0.01), 양성 약물 군과 sDSS1 단백질 군 사이에 플라크 면적 비의 유의미한 차이는 없었다.
도 1. 분자 실험은 sDSS1 단백질이 oxLDL 및 LDL과 상호작용할 수 있음을 보여주었다.
도 1a. 아세트산나트륨/아세트산 완충액(pH 4.5)에서, oxLDL 또는 LDL을 12시간 동안 sDSS1 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 생성물을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색하였다. 결과는 LDL 단백질(L1), oxLDL 단백질(L2) 밴드 단독의 분자량이 약 70 KD이고, sDSS1 밴드(L3, L6) 단독의 분자량이 약 15 KD임을 보여준다. LDL 또는 oxLDL과 sDSS1 단백질의 공-인큐베이션은 상호작용을 야기하였다. (L4 및 L7은 LDL 및 sDSS1 단백질에 상응하고, L5 및 L8은 oxLDL 및 sDSS1 단백질에 상응한다).
SDS-PAGE 겔 상에서, sDSS1 단백질과 반응시킨 후, 반응 시스템에서 oxLDL 단백질 또는 LDL 단백질(분자량 약 70 KD) 밴드는 유의미하게 더 옅어지고; 반응 시스템 내의 sDSS1 단백질의 농도가 증가함에 따라, 더 많은 복합체가 LDL 또는 oxLDL에 의해 형성되었고 밴드는 더 짙어진다.
도 1b. 인산염 완충액(pH 7.2)에서, oxLDL 또는 LDL을 12시간 동안 sDSS1 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 생성물을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. 결과는 LDL 단백질(L1), oxLDL 단백질(L2) 밴드 단독의 분자량은 약 70 KD이고 sDSS1 밴드(L3, L6) 단독의 분자량은 약 15 KD임을 보여준다. LDL 또는 oxLDL과 sDSS1 단백질의 공-인큐베이션은 상호작용을 야기하였다. (L4 및 L7은 LDL 및 sDSS1 단백질에 상응하고, L5 및 L8은 oxLDL 및 sDSS1 단백질에 상응한다).
SDS-PAGE 겔 상에서, sDSS1 단백질과 반응시킨 후, 반응 시스템에서 oxLDL 단백질 또는 LDL 단백질(분자량 약 70 KD) 밴드는 유의미하게 변하지 않았고; 반응 시스템 내의 sDSS1 단백질의 농도가 증가함에 따라, 더 많은 복합체가 LDL 또는 oxLDL에 의해 형성되었고 밴드는 더 짙어진다.
도 1c 및 도 1d. 인산염 완충액(pH 7.2)에서, oxLDL을 각각 sDSS1-M1 또는 sDSS1-M2와 함께 인큐베이션하였다. 생성물을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. 결과는 oxLDL이 sDSS1-M1과 함께 인큐베이션되었을 때, sDSS1-M1 단백질이 반응 시스템에서 oxLDL 단백질과 상호작용하여, SDS-PAGE 겔 상에서 고분자량 영역(>75 KD) 및 37 KD 내지 75 KD 영역에서 분명한 확산 밴드(L3, L5, L7)를 형성하지만, 반응 시스템에서 sDSS1-M1 단백질 밴드가 명확히 더 옅어짐(L2 대 L3, L4 대 L5, L6 대 L7)을 보여준다(도 1c). oxLDL이 sDSS1-M2와 함께 인큐베이션되었을 때, sDSS1-M2 단백질은 이량체(L2, L4, L6)로서 나타났고, oxLDL 단백질과 상호작용하여, 고분자량 영역(>75 KD) 및 37 KD 내지 75 KD 영역에서 분명한 확산 밴드(L3, L5, L7)를 형성하였다. 이들 두 반응 시스템들에서, 반응 시스템 내의 sDSS1-M1 또는 sDSS1-M2 단백질의 농도가 증가함에 따라, 반응 시스템에서 더 많은 복합체가 형성되었고, 밴드는 더 짙어진다.
도 2. sDSS1 단백질은 내피 세포에 의한 oxLDL의 흡수를 억제할 수 있다.
도 2a. 10 ㎍/㎖ Dil-oxLDL을 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 배양 배지에 첨가하였거나, Dil-oxLDL을 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖의 농도로 sDSS1 단백질과 함께 첨가하였다. 5시간 후, Dil-oxLDL은 HUVEC 세포에 의해 흡수되었다. 상기 세포에서 적색 형광을 보이는 상이한 수의 식세포성 소포가 형광 현미경 하에서 관찰될 수 있었다. sDSS1 단백질을 첨가한 후, HUVEC 세포에서의 형광은 약해졌고, 효과는 농도 의존적이었다.
도 2b. HUVEC 세포에 의한 Dil-oxLD의 흡수 후, 유세포분석으로 상기 세포에서 형광 신호를 검출하였고, 배양 배지에 첨가된 sDSS1 단백질의 양이 증가함에 따라, 상기 세포의 형광 신호가 점진적으로 약해짐을 발견하였다.
도 2c. 유세포분석 시험 결과는 sDSS1 단백질이 대조군 세포에 비해 HUVEC 세포에 의한 oxLDL의 흡수를 유의미하게 억제할 수 있었음을 통계적으로 보여주었다(10 ㎍/㎖ Dil-oxLDL). 배양 배지에의 2 ㎍/㎖ sDSS1 단백질의 첨가는 oxLDL의 흡수를 절반 감소시킬 수 있었고, 효과는 분명히 용량 의존적이었다.
도 3. sDSS1 단백질은 대식세포에 의한 oxLDL의 식세포작용을 억제할 수 있다.
도 3a. THP-1 세포를 4일 동안 100 nM PMA로 유도한 후, 이 세포는 성숙 대식세포로 분화한다. 10 ㎍/㎖ Dil-oxLDL을 배양 배지에 첨가하였거나, Dil-oxLDL을 2 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖의 농도로 sDSS1 단백질과 함께 첨가하였다. 5시간 후, 대조군 세포에서 Dil-oxLDL은 대식세포에 의해 포식되었음이 관찰되었고, 상기 세포에서 분명한 적색 형광 식세포성 소포가 관찰될 수 있었다. sDSS1 단백질을 첨가한 후, 상기 세포에서 기본적으로 분명한 형광 신호는 관찰되지 않았다.
도 3b. 유세포분석으로 대식세포의 형광 신호를 검출하였다. 결과는 형광 신호를 갖는 세포가 대조군 내의 세포에서 검출될 수 있었지만(10 ㎍/㎖ Dil-oxLDL), 형광 신호를 갖는 세포는 기본적으로 sDSS1 단백질이 첨가된 2개의 실험군 내의 세포에서는 나타나지 않았음을 보여주었다.
도 4. sDSS1 단백질은 인간 간 세포에 의한 oxLDL 단백질의 흡수 능력을 증가시킬 수 있다.
도 4a. Dil-oxLDL을 Hep G2 세포에 첨가한 지 9시간 후, 형광 현미경으로 세포의 형광을 검출하였다. 결과는 분명한 형광이 대조군 및 실험군 내의 세포에서 관찰될 수 있었음을 보여준다. 형광은 상이한 수의 식세포성 소포에서 나타났는데, 이것은 Hep G2 세포가 Dil-oxLDL을 흡수하였음을 시사한다.
도 4b. 유세포분석으로 세포 형광 값을 검출하였다. 분명한 Dil 형광 신호가 대조군 내의 Hep G2 세포에서 검출될 수 있었음을 확인할 수 있었다. 배양 배지에의 5 ㎍/㎖ sDSS1의 첨가는 세포내 형광 수준에 유의미한 영향을 미치지 않은 반면, 50 ㎍/㎖ sDSS1 단백질은 세포에서 Dil 신호의 강도를 유의미하게 증가시킬 수 있었다.
도 4c. 유세포분석에 의한 통계적 검출 결과는 대조군에 비해 50 ㎍/㎖ sDSS1 단백질을 배양 배지에 첨가한 후, Hep G2 세포에 의한 oxLDL의 흡수 능력이 약 27% 증가되었고, 이것은 대조군에 비해 유의미하게 개선된 수준이었음(**p<0.01)을 보여주었다.
도 5. sDSS1 단백질은 인간 간 세포에 의한 LDL 단백질의 흡수 능력에 유의미한 영향을 미치지 않는다.
도 5a. Dil-LDL을 Hep G2 세포에 첨가한 지 10시간 후, 형광 현미경으로 세포 형광을 검출하였다. 결과는 명확한 형광이 대조군 및 실험군 내의 세포에서 관찰될 수 있었음을 보여주었다. 형광은 상이한 수의 식세포성 소포에서 나타났는데, 이것은 Hep G2 세포가 Dil-LDL을 흡수하였음을 시사한다. 형광 세포의 수를 측정하였고, 유의미한 차이는 없었다.
도 5b. 유세포분석으로 세포 형광 값을 검출하였다. 분명한 Dil 형광 신호가 대조군 내의 Hep G2 세포에서 검출될 수 있었음을 알 수 있었다. 배양 배지에의 5 ㎍/㎖ sDSS1 또는 50 ㎍/㎖ sDSS1 단백질의 첨가는 세포에서 Dil 형광 신호의 강도의 유의미한 변화를 야기할 수 없었다.
도 6. sDSS1 단백질은 마우스에서 혈장 oxLDL 수준 및 혈장 oxLDL/LDL 비를 감소시키고 LDL 수준의 유의미한 차이는 없다.
ApoE-/- 마우스를 2개의 군, 즉 대조군 및 sDSS1 단백질 투여군으로 나누었다. 200 ㎕의 생리염수를 복강내 주사로 하루에 1회 대조군에게 제공하였고, sDSS1 단백질을 복강내 주사로 10 mg/kg 체중(10 mpk) 또는 30 mg/kg 체중(30 mpk)에 따라 하루에 1회 투여군에게 투여하였고, 양성 대조군 약물로서 아토르바스타틴(atorvastatin)(ATV)을 연속 7일 동안 복강내 주사로 40 mg/kg 체중(40 mpk)에 따라 매일 투여하였다. 투여 말기에, 마우스에서 oxLDL 및 LDL의 혈장 수준을 검출하였다.
도 6a. 혈장 oxLDL 수준을 검출하였고, sDSS1 단백질의 투여 후, sDSS1 단백질의 저용량 주사가 마우스에서 혈장 oxLDL 수준에 유의미한 영향을 미치지 않은 반면, 고용량 투여가 40 mpk ATV와 동일한 효능을 보이면서 마우스에서 oxLDL 수준을 유의미하게 감소시켰음을 발견하였다.
도 6b. 혈장 LDL 수준을 검출하였고, 대조군 내의 마우스에 비해, 10 mpk 또는 30 mpk의 sDSS1 단백질의 주사가 마우스에서 혈장 LDL 수준의 유의미한 변화를 야기하지 않았음을 확인하였다.
도 6c. 혈장 oxLDL/LDL 비를 분석하였고, 결과는 ATV와 유사한 효능을 보여주면서, 고용량 sDSS1 단백질 군의 마우스의 혈장 oxLDL/LDL 비가 대조군의 마우스의 혈장 oxLDL/LDL 비보다 유의미하게 더 낮았음을 보여주었다(* p 값 <0.05).
도 7. sDSS1 단백질은 ApoE-/- 마우스에서 죽상동맥경화성 플라크의 형성을 억제한다. 연속 13주 동안 3 mpk의 sDSS1 또는 40 mpk의 ATV를 16주령 ApoE-/- 마우스에게 연속적으로 주사하였다. 주사 말기에, 오일 레드 O 염색을 위해 대동맥을 절개하였고, 플라크의 면적을 계산하였다.
도 7a. ApoE-/- 마우스의 대동맥 앞면(정면)의 염색은 죽상동맥경화성 플라크를 보여주었다. 죽상동맥경화성 플라크는 오일 레드 O에 의해 염색되었고 적색을 띤 주황색으로 나타났고, 플라크를 갖지 않은 영역은 색상을 띠지 않았고 투명하였다. 결과는 양성 약물 군 내의 마우스의 죽상동맥경화성 플라크의 면적이 모델 군에 비해 유의미하게 감소되었고, sDSS1 단백질 군 내의 마우스의 죽상동맥경화성 플라크의 면적도 모델 군에 비해 유의미하게 감소되었고, 일부 영역들에서의 효과가 양성 약물의 효과보다 훨씬 더 우수하였음을 보여준다.
도 7b. 오일 레드 O 염색 면적 및 총 대동맥 면적을 측정하였고, 플라크 면적 비를 계산하였다. 양성 약물 군 및 sDSS1 단백질 군의 플라크 면적 비는 모델 군의 플라크 면적 비보다 유의미하게 더 작았고(**p<0.01), 양성 약물 군과 sDSS1 단백질 군 사이에 플라크 면적 비의 유의미한 차이는 없었다.
본 발명의 실시양태들을 기술하기 전, 이 실시양태들이 예로써만 제공되고, 본원에 기재된 본 발명의 실시양태들의 다양한 대안들이 본 발명을 실시하는 데 이용될 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명을 벗어나지 않으면서 다수의 변경, 변형 및 치환이 당분야에서 숙련된 자에게 인식될 것이다.
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 갖는 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 이하에 기재된다. 불일치가 있는 경우, 본 발명의 (정의를 포함하는) 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시하기 위한 것일 뿐이고 제한하기 위한 것이 아니다. 본 발명을 벗어나지 않으면서 다수의 변경, 변형 및 치환이 당분야에서 숙련된 자에게 인식될 것이다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 단수형 용어는 복수형 지시대상을 포함한다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 교환 가능하게 사용된다. 상기 중합체는 선형 또는 분지된 중합체일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 단절될 수 있다. 상기 용어는 예를 들면, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작(예컨대, 표지부착 성분과의 커플링)에 의해 변형된 아미노산 중합체도 포괄한다.
용어 "아미노산"은 D 또는 L 광학 이성질체들을 포함하나 이들로 제한되지 않는 천연 아미노산 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산뿐만 아니라, 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱(peptidomimetic)도 지칭한다. 표준 1-문자 또는 3-문자 코드를 사용하여 아미노산을 표기한다.
용어 "천연 아미노산"은 글리신(G), 프롤린(P), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 메티오닌(M), 시스테인(C), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W), 히스티딘(H), 라이신(K), 아르기닌(R), 글루타민(Q), 아스파라긴(N), 글루탐산(E), 아스파르트산(D), 세린(S) 및 쓰레오닌(T)의 L 광학 이성질체 형태를 의미한다. 용어 "비천연 아미노산"은 상기 언급된 천연 아미노산이 아닌 임의의 아미노산을 포함한다.
"단편"은 단백질에 사용될 때 치료 및/또는 생물학적 활성의 적어도 일부를 보유할 수 있거나 보유하지 않을 수 있는, 천연 생물학적 활성 단백질의 절두된(truncated) 형태이다. "변이체"는 단백질에 사용될 때 천연 생물학적 활성 단백질의 치료 및/또는 생물학적 활성의 적어도 일부를 보유하는, 천연 생물학적 활성 단백질에 대한 서열 상동성을 갖는 단백질이다. 예를 들면, 변이체 단백질은 기준 생물학적 활성 단백질에 비해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 공유할 수 있다. 본원에서 사용될 때, 용어 "생물학적 활성 단백질 부분"은 예를 들면, 부위 지정 돌연변이유발, 코딩 유전자의 합성, 삽입 등에 의해 의도적으로 변형되었거나 돌연변이에 의해 우발적으로 변형된 단백질을 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", "핵산", "뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 교환 가능하게 사용된다. 이들은 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드인 임의의 길이의 뉴클레오타이드 또는 이의 유사체의 중합된 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지되어 있거나 공지되어 있지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 비제한적 예는 다음과 같다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 연관 분석에 의해 확인된 좌위, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보좀 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조의 변형은 중합체 어샘블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 단절될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, 표지부착 성분과 커플링시킴으로써, 중합 후 더 변형될 수 있다.
본원에서 확인된 폴리펩타이드 서열에 대해, "서열 동일성의 퍼센트(%)"는 서열들을 정렬하고 필요하다면 최대 퍼센트의 서열 동일성을 수득하기 위해 갭을 도입하고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 부분으로서 간주하지 않은 후 질의 서열에서 제2 기준 폴리펩타이드 서열 또는 이의 부분의 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성의 퍼센트를 측정하는 것을 목적으로 하는 정렬은 당분야의 기술 내의 다양한 방식들, 예컨대, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN, NEEDLE 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 이용함으로써 달성될 수 있다. 당분야에서 숙련된 자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 수득하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하는 데 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 동일성의 퍼센트는 전체 정의된 폴리뉴클레오타이드 서열의 길이에 걸쳐 측정될 수 있거나, 더 짧은 길이, 예를 들면, 더 큰 정의된 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 수득된 단편의 길이에 걸쳐 측정될 수 있고, 상기 단편은 예를 들면, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 70개 또는 적어도 150개의 연속 잔기들의 단편이다. 이 길이들은 예시하기 위한 것일 뿐이고, 본원의 표, 도면 또는 서열목록에 제시된 서열들에 의해 뒷받침되는 임의의 단편 길이를 사용하여, 동일성의 퍼센트가 측정될 수 있는 길이를 기술할 수 있음을 이해해야 한다.
"벡터"는 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내로 전달하고/하거나 숙주 세포들 사이에 전달하는, 바람직하게는 적합한 숙주에서 스스로 복제하는 핵산 분자이다. 상기 용어는 주로 DNA 또는 RNA를 세포 내로 삽입하는 역할을 하는 벡터, 주로 DNA 또는 RNA 복제의 역할을 하는 복제 벡터, 및 DNA 또는 RNA 전사 및/또는 번역의 역할을 하는 발현 벡터를 포함한다. 상기 용어는 상기 언급된 효과들 중 하나 초과의 효과를 제공하는 벡터도 포함한다. "발현 벡터"는 적합한 숙주 세포 내로 도입될 때 전사될 수 있고 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오타이드이다. "발현 시스템"은 일반적으로 원하는 발현 생성물을 생성하는 데 사용될 수 있는 발현 벡터를 함유하는 적합한 숙주 세포를 의미한다.
용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 하기 정의된 (질환의 치료를 포함하나 이것으로 제한되지 않는) 의도된 적용을 달성하기에 충분한, 본원에 기재된 화합물의 양을 지칭한다. 치료 유효량은 (시험관내 또는 생체내) 의도된 적용 또는 치료되는 대상체 및 질환 상태, 예를 들면, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있고, 이것은 당분야에서 통상의 기술을 갖는 자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 용어는 표적 세포에서 특정 반응, 예를 들면, 표적 유전자 유도 및/또는 아폽토시스를 유도할 용량에도 적용된다. 구체적인 용량은 선택된 구체적인 화합물, 따를 투약 용법, 다른 화합물과 함께 투여되는지 여부, 투여 시기, 투여되는 조직, 및 이를 운반하는 물리적 전달 시스템에 따라 달라질 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는" 또는 "완화시키는" 또는 "개선하는"은 본원에서 교환 가능하게 사용된다. 이 용어들은 치료 이익 및/또는 예방 이익을 포함하나 이들로 제한되지 않는 유리한 또는 원하는 결과를 수득하기 위해 이용되는 방법들을 지칭한다. 소위 치료 이익은 치료되는 기저 질환의 박멸 또는 개선을 의미한다. 또한, 치료 이익은 다음과 같이 수득되기도 한다: 대상체가 기저 질환에 의해 여전히 고통받을 수 있지만, 대상체에서 개선이 관찰될 정도로 기저 질환과 관련된 생리학적 증상들 중 하나 이상의 생리학적 증상이 박멸되거나 개선된다. 예방 이익의 경우, 질환이 진단되지 않았을 수 있지만, 조성물은 특정 질환을 발생시킬 위험을 갖는 대상체 또는 상기 질환의 하나 이상의 생리학적 증상을 호소하는 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료 효과"는 전술된 치료 이익 및/또는 예방 이익을 포괄한다. 예방 효과는 질환 또는 질병의 발생을 지연시키거나 제거하는 것, 질환 또는 질병의 증상의 발병을 지연시키거나 제거하는 것, 질환 또는 질병의 진행을 늦추거나, 정지시키거나 역전시키는 것, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
"의약" 또는 "치료제"는 생물학적, 약학적 또는 화학적 화합물 또는 다른 모이어티를 지칭한다. 비제한적 예는 단순한 또는 복잡한 유기 또는 무기 분자, 펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오타이드, 항체, 항체 유도체, 항체 단편, 비타민 유도체, 탄수화물, 독소 또는 화학요법 화합물을 포함한다. 다양한 코어 구조물들, 예를 들면, 소분자 및 올리고머(예컨대, 올리고펩타이드 및 올리고뉴클레오타이드) 및 합성 유기 화합물에 기반하여 다양한 화합물들을 합성할 수 있다. 추가로, 다양한 천연 공급원들, 예컨대, 식물 또는 동물 추출물 등은 스크리닝을 위한 화합물을 제공할 수 있다.
용어 "생체내"는 대상체 내부에서 일어나는 사건을 지칭한다.
용어 "시험관내"는 대상체 외부에서 일어나는 사건을 지칭한다. 예를 들면, 시험관내 시험은 대상체 시험 이외의 임의의 시험 실시를 커버한다. 시험관내 시험은 살아있거나 사멸된 세포가 사용되는 세포 기반 시험을 커버한다. 시험관내 시험은 온전한 세포가 사용되지 않는 무세포 시험도 커버한다.
Shfm1(열수/열족 기형 1형) 유전자는 인간 집게발(crab claw) 질환에 있어서 핵심 유전자들 중 하나이고 진화 과정에서 잘 보존된다. 이에 의해 코딩된 DSS1 단백질은 게놈의 안정화, 상동성 유전자의 재조합, DNA 손상의 복구 및 세포 증식과 같은 과정에 관여한다[22 내지 26]. 본 발명자들의 연구 결과는 태그로서의 DSS1 단백질이 에너지 소모 효소 반응을 통해 산화된 단백질에 추가되어, 세포가 산화된 단백질을 제거하는 것을 도울 수 있음을 보여준다[27]. 이 결과는 생물학적 활성에 있어서 DSS1 단백질의 중요한 역할을 보여준다.
인간 sDSS1 단백질의 서열은 서열번호 1에 표시된 바와 같다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 가진다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산(들)의 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산(들)의 치환을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산(들)의 치환을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산(들)의 치환을 포함하고, 이때 치환은 시스테인이 페닐알라닌으로 치환됨을 의미한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 비천연 아미노산은 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 셀레노시스테인, D-아미노산 또는 합성 비천연 아미노산, 및 이들의 유도체를 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14에 표시된 아미노산 서열에 대한 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편, 및 서열번호 18에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편을 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체와 다른 기능성 폴리펩타이드의 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 기능성 폴리펩타이드는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체의 막횡단 수송을 용이하게 할 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 기능성 폴리펩타이드는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체의 안정성을 용이하게 할 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 기능성 폴리펩타이드는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체와 표적 분자가 조합되어 복합체를 형성하는 것을 용이하게 할 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 기능성 폴리펩타이드는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체와 oxLDL의 조합을 용이하게 할 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 기능성 폴리펩타이드는 혈관 내피 세포 또는 대식세포에 의한 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체 oxLDL의 흡수를 억제할 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 기능성 폴리펩타이드는 간 조직 또는 간 세포에 의한 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체 oxLDL의 흡수를 용이하게 할 수 있다.
일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 1개 내지 20개의 아미노산의 화학적 변형을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 화학적 변형은 아미노 또는 글리코실화 변형, 지방산 변형, 아실화 변형, Fc 단편 융합, 알부민 융합, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 변형, 덱스트란 변형, 헤파린 변형, 폴리비닐피롤리돈 변형, 폴리아미노산 변형, 폴리시알산 변형, 키토산 및 이의 유도체 변형, 렉틴 변형, 알긴산나트륨 변형, 카르보머 변형, 폴리비닐피롤리돈 변형, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 변형, 하이드록시프로필 셀룰로스 변형, 아세틸화 변형, 포르밀화 변형, 인산화 변형, 메틸화 변형 및/또는 설폰화 변형을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 N-말단에서 PEG 변형을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜의 예는 모노메톡시 PEG 말레이미드, 모노메톡시 PEG 요오도아세트아미드 또는 모노메톡시 PEG 프로피온알데하이드를 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 추가로, 폴리에틸렌 글리콜은 약 1 Kd 내지 200 Kd, 약 5 Kd 내지 200 Kd, 약 5 Kd 내지 150 Kd, 약 8 Kd 내지 150 Kd, 약 8 Kd 내지 100 Kd, 약 10 Kd 내지 100 Kd, 약 10 Kd 내지 50 Kd, 약 12 Kd 내지 50 Kd, 또는 약 12 Kd 내지 40 Kd의 분자량을 가질 수 있다.
일부 특정 실시양태에서, 변형된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비변형된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체에 비해 더 긴 반감기를 가진다. 일부 특정 실시양태에서, 변형된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비변형된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체에 비해 더 높은 안정성을 가진다. 일부 특정 실시양태에서, 변형된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비변형된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체에 비해 본원에 기재된 바와 같이 더 강한 생물학적 활성을 가진다.
본원은 본원에 개시된 단백질 또는 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포도 제공한다. 숙주 세포는 단일 세포, 세포 배양물 또는 세포주를 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 본원에 기재된 벡터를 포함하는 이종 서열로 형질감염될 수 있다. 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포, 예컨대, 세균 세포, 진균 세포, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등일 수 있다. 세균 숙주 세포의 예는 에스케리키아(Escherichia), 세라티아(Serratia), 바실러스(Bacillus), 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 마이크로박테리움(Microbacterium), 슈도모나스(Pseudomonas) 등에 속하는 미생물을 포함한다. 예를 들면, 세균 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) XL1-Blue, XL2-Blue, DH1, MC1000, KY3276, W1485, JM109, HB101, No. 49, i W3110, NY49, G1698, BL21 또는 TB1을 포함할 수 있으나 이들로 제한되지 않는다. 다른 세균 숙주 세포는 세라티아 피카리아(Serratia ficaria), 세라티아 폰티콜라(Serratia fonticola), 세라티아 리쿠에파시엔스(Serratia liquefaciens), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum) ATCC 14068, 브레비박테리움 사카로라이티쿰(Brevibacterium saccharolyticum) ATCC 14066, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869, 코리네박테리움 아세토악시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC 13870, 마이크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum) ATCC 15354, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 종 D-0110 등을 포함할 수 있으나 이들로 제한되지 않는다.
효모 숙주 세포는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 트리코스포론(Trichosporon), 사카로마이세스(Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 슈와니오마이세스(Schwanniomyces), 피키아(Pichia), 칸디다(Candida) 등에 속하는 미생물, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 슈와니오마이세스 알루비우스(Schwanniomyces alluvius), 칸디다 유틸리스(Candida utilis) 등과 같은 미생물을 포함할 수 있다.
진핵생물 세포의 예는 동물 세포, 예컨대, 포유류 세포를 포함한다. 예를 들면, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 원숭이 세포, 예컨대, COS 세포, HepG2 세포, A549 세포, 및 ATCC 또는 다른 수집 기관으로부터 입수될 수 있는 임의의 세포를 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 숙주 세포는 배양물, 및 배양물을 생장시키는 데 이용될 수 있는 임의의 장치(발효기를 포함함)에서 생장될 수 있다. 숙주 세포는 단일 층으로서 생장될 수 있거나 표면에 부착된 상태로 생장될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 현탁액 중에서 생장될 수 있다. 세포는 무혈청 배지에서 생장될 수 있다. 상기 배지는 8 mM L-글루타민과 같은 글루타민으로 보충된 Opti-CHO(인비트로겐(Invitrogen), 카탈로그 #12681)와 같은, 그러나 이로 제한되지 않는, 시판되는 배지일 수 있다.
본 개시의 숙주 세포는 본원에 기재된 폴리펩타이드 또는 단백질의 발현을 달성하기 위해 이종 서열을 함유할 수 있다. 이종 서열은 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내로 전달하고/하거나 숙주 세포들 사이에 전달하는, 바람직하게는 자가 복제 핵산 분자인 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 주로 DNA 또는 RNA를 세포 내로 삽입하는 역할을 하는 벡터, 주로 DNA 또는 RNA 복제의 역할을 하는 복제 벡터, 및 DNA 또는 RNA 전사 및/또는 번역의 역할을 하는 발현 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 상기 언급된 효과들 중 하나 초과의 효과를 제공하는 벡터도 포함한다. 발현 벡터는 적합한 숙주 세포 내로 도입될 때 전사될 수 있고 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오타이드이다.
본원에 기재된 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 이종 서열은 단일 벡터 또는 다수의 벡터들에 의해 발현될 수 있다. 핵산 서열은 하나 이상의 벡터에 배치된 단일 오페론 또는 별개의 오페론에 임의의 순서로 배열될 수 있다. 필요할 때, 2개 이상의 발현 벡터들이 이용될 수 있고, 이들 각각은 단일 오페론 내에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종 서열을 함유한다. "연결된"은 화학적 커플링 또는 재조합 수단을 포함하는 임의의 수단에 의한 2개 이상의 화학적 요소들 또는 구성요소들의 연결을 지칭한다. "작동 가능하게 연결된"은 이러한 기재된 구성요소들이 그들의 의도된 방식으로 작용하게 하는 관계로 존재하는 병치를 의미한다. 예를 들면, 프로모터 서열이 코딩 서열의 전사를 촉진하는 경우, 프로모터 서열은 코딩 서열에 연결된 또는 작동 가능하게 연결된 상태이다. 본원에 기재된 벡터는 에피좀으로서 복제될 수 있거나, 숙주 세포 게놈의 일부로서 복제될 수 있다.
본 개시의 이종 서열은 단일 조절 요소의 제어 하에 있을 수 있다. 일부 경우, 이종 핵산 서열은 단일 프로모터에 의해 조절된다. 다른 경우, 이종 핵산 서열은 단일 오페론 내에 배치된다. 다른 경우, 이종 핵산 서열은 단일 리딩 프레임으로 배치된다.
본원에 기재된 핵산의 제조는 다양한 통상의 재조합 기법들 및 합성 절차들에 의해 수행될 수 있다. 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기법은 당분야에서 잘 공지되어 있고, 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, (1989) (Maniatis) and T. J. Silhavy, M. L. Bennan, and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) and Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)]에 기재되어 있다. 요약하면, 본원에 기재된 핵산은 게놈 DNA 단편, cDNA 및 RNA로서 제조될 수 있고, 이들 모두가 세포로부터 직접 추출될 수 있거나 PCR 및 rtPCR을 포함하나 이들로 제한되지 않는 다양한 증폭 방법들에 의해 재조합 제조될 수 있다.
핵산의 직접적인 화학적 합성은 통상적으로 3'-차단된 뉴클레오타이드 단량체 및 5'-차단된 뉴클레오타이드 단량체를 성장하는 뉴클레오타이드 중합체 쇄의 말단 5'-하이드록실 기에 순차적으로 추가하는 단계를 포함하고, 이때 각각의 추가는 성장하는 쇄의 말단 5'-하이드록실 기가 추가되는 단량체의 3'-위치를 친핵성 공격함으로써 달성되고, 추가된 단량체는 통상적으로 인 유도체, 예컨대, 포스포트리에스테르, 포스포라미다이트 등이다. 이 방법은 당분야에서 통상의 기술을 갖는 자에게 공지되어 있고 관련 서적 및 문헌(예를 들면, 문헌[Matteuci et al., Tet. Lett. 521:719 (1980)]; 캐루더스 등(Caruthers et al.)에게 권리부여된 미국 특허 제4,500,707호; 및 서던 등(Southern et al.)에게 권리부여된 미국 특허 제5,436,327호 및 제5,700,637호)에 기재되어 있다.
조절 요소는 예를 들면, 당단백질을 코딩하는 하나 이상의 이종 서열의 발현을 증가시키기 위해 조작될 수도 있는 프로모터 및 오퍼레이터 유전자를 포함한다. 프로모터는 RNA 중합효소에 의한 핵산 서열의 전사를 시작하고 제어하는 뉴클레오타이드 서열이다. 오퍼레이터 유전자는 원하는 핵산 서열의 전사를 제어하도록 작용하는, 프로모터에 인접한 뉴클레오타이드 서열이다. 오퍼레이터 유전자는 특정 리프레서 단백질이 결합될 수 있는 단백질 결합 도메인을 함유한다. 적합한 리프레서 단백질의 부재 하에서, 전사는 프로모터에 의해 시작된다. 적합한 리프레서 단백질의 존재 하에서, 리프레서 단백질은 오퍼레이터 유전자에 결합함으로써, 프로모터로부터의 전사를 억제한다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 발현 벡터에서 사용된 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 다른 실시양태에서, 발현 벡터에서 사용된 프로모터는 항시성 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산 서열은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 반면, 하나 이상의 다른 핵산 서열은 항시성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 진핵생물 숙주 세포에 적합한 프로모터의 비제한적 예는 CMV 즉시 초기 프로모터, HSV 타이미딘 키나제 프로모터, 초기 또는 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스로부터의 LTR 및 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터를 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
일반적으로, 발현 벡터 내의 유전자는 임의의 코딩된 mRNA 유전자 생성물의 번역(즉, 합성)을 안내하기 위해 리보좀 결합 부위도 코딩할 것이다. 발현 벡터에 사용될 수 있는 다른 조절 요소는 전사 인핸서 요소 및 전사 터미네이터를 포함한다. 예를 들면, 문헌[Bitter et al., Methods in Enzymology, 153:516-544 (1987)]을 참조한다.
발현 벡터는 특정 유형의 숙주 세포에 적용될 수 있으나, 다른 숙주 세포에는 적용 불가능할 수 있다. 그러나, 당분야에서 통상의 기술을 갖는 자는 관용적인 실험을 통해 특정 발현 벡터가 소정의 숙주 세포에 적용될 수 있는지를 용이하게 확인할 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터를 숙주 유기체 내로 도입한 후, 그의 생존율 및 벡터에 함유된 임의의 유전자의 발현을 모니터링할 수 있다.
발현 벡터는 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포를 선택하거나 확인하는 데 유용한 하나 이상의 표현형적 형질을 부여하도록 발현되는 하나 이상의 선택 마커 유전자도 포함할 수 있다. 진핵생물 세포에 적합한 선택 마커의 비제한적 예는 디하이드로폴레이트 환원효소 및 네오마이신 내성을 포함한다.
본원에 기재된 벡터는 다양한 확립된 기법들에 의해 숙주 세포 내로 안정하게 또는 일시적으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 방법들 중 하나는 염화칼슘 처리를 수반하고, 이때 발현 벡터는 칼슘 침전에 의해 도입된다. 유사한 절차를 따라 다른 염, 예컨대, 인산칼슘도 사용할 수 있다. 전기천공(즉, 핵산에 대한 세포의 투과성을 증가시키기 위한 전류의 적용)도 이용할 수 있다. 다른 형질전환 방법은 미세주사, DEAE 덱스트란 매개 형질전환 및 아세트산리튬의 존재 하에서의 열 충격을 포함한다. 지질 복합체, 리포좀 및 덴드리머도 숙주 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다.
이종 서열을 숙주 세포 내로 도입한 후, 다양한 방법들을 수행하여, 본원에 기재된 벡터가 도입되어 있는 숙주 세포를 확인할 수 있다. 예시적 선택 방법은 단일 세포를 하위배양하여 단일 콜로니를 형성한 후, 원하는 단백질 생성물의 발현을 검출하는 단계를 포함한다. 이종 서열을 함유하는 숙주 세포를 선택하는 또 다른 방법은 발현 벡터에 함유된 선택 마커 유전자의 발현에 의해 부여된 표현형적 형질에 기반한다. 통상의 기술을 갖는 자는 이 방법들 또는 당분야에서 이용될 수 있는 다른 방법들을 이용하여 유전적으로 변형된 숙주 세포를 확인할 수 있다.
예를 들면, 숙주 세포 내로의 본 개시의 다양한 이종 서열들의 도입은 PCR, 서던 블롯팅 또는 노던 블롯팅과 같은 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 수득된 숙주 세포로부터 핵산을 제조할 수 있고, 관심 있는 서열에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR로 관심 있는 특정 서열을 증폭시킬 수 있다. 증폭된 생성물을 아가로스 겔 전기영동, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 모세관 전기영동으로 처리한 후, 브롬화에티듐, SYBR 그린 용액 등으로 염색하거나 UV 검출을 수행하여 DNA를 검출한다. 대안적으로, 관심 있는 서열에 특이적인 핵산 프로브를 하이브리드화 반응에 사용할 수 있다. 역전사 커플링된 PCR 또는 노던 블롯 하이브리드화를 통해 상응하는 mRNA를 검출함으로써, 또는 코딩된 유전자 생성물에 반응하는 항체를 사용한 면역어세이로 특정 유전자 서열의 발현을 확인할 수 있다. 예시적 면역어세이는 ELISA, 방사면역어세이 및 샌드위치 면역어세이를 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
또한, 숙주 세포 내로의 본 개시의 다양한 이종 서열들의 도입은 이종 서열에 의해 코딩된 효소의 효소 활성에 의해 확인될 수 있다. 상기 효소는 당분야에서 공지된 다양한 방법들에 의해 확인될 수 있다. 일반적으로, 효소 활성은 연구중인 효소 반응의 생성물의 형성 또는 기질의 전환에 의해 확인될 수 있다. 이 반응은 시험관 또는 생체 내에서 일어날 수 있다.
한 양태에서, 본원은 죽상동맥경화증 및/또는 죽상동맥경화증 관련 질환을 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산, 또는 이 핵산을 포함하는 벡터를 개체에게 투여하는 단계, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 발현하는 세포, 또는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상기 핵산을 포함하는 조직 또는 장기를 개체에 이식하는 단계, 및/또는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상기 핵산을 포함하는 혈청, 뇌척수액, 림프액 또는 간질액을 개체에 주입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원은 혈관에 의한 지질 흡수의 감소를 필요로 하는 개체에서 혈관에 의한 지질 흡수를 감소시키는 방법으로서, 치료 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산, 또는 이 핵산을 포함하는 벡터를 상기 개체에게 투여하는 단계, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 발현하는 세포, 또는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상기 핵산을 포함하는 조직 또는 장기를 상기 개체에 이식하는 단계, 및/또는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상기 핵산을 포함하는 혈청, 뇌척수액, 림프액 또는 간질액을 상기 개체에 주입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원은 대식세포에서의 지질 축적의 감소를 필요로 하는 개체에서 대식세포에서의 지질 축적을 감소시키는 방법으로서, 치료 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산, 또는 이 핵산을 포함하는 벡터를 상기 개체에게 투여하는 단계, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 발현하는 세포, 또는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상기 핵산을 포함하는 조직 또는 장기를 상기 개체에 이식하는 단계, 및/또는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상기 핵산을 포함하는 혈청, 뇌척수액, 림프액 또는 간질액을 상기 개체에 주입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원은 간 세포에서의 지질 축적의 증가를 필요로 하는 개체에서 간 세포에서의 지질 축적을 증가시키는 방법으로서, 치료 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산, 또는 이 핵산을 포함하는 벡터를 상기 개체에게 투여하는 단계, sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 발현하는 세포, 또는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상기 핵산을 포함하는 조직 또는 장기를 상기 개체에 이식하는 단계, 및/또는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상기 핵산을 포함하는 혈청, 뇌척수액, 림프액 또는 간질액을 상기 개체에 주입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원은 sDSS1 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체와 지질의 복합체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원은 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환을 치료하기 위한 치료제를 스크리닝하는 방법으로서, 상기 치료제를 sDSS1 단백질, sDSS1 단백질 유전자, sDSS1 유전자의 조절 요소 및 sDSS1 유전자의 전사 생성물과 접촉시키는 단계, 및 sDSS1 단백질의 발현에 대한 상기 치료제의 효과를 평가하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
1955년 이후 역학 데이터, 임상전 연구 및 임상시험 데이터는 상승된 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-c)을 특징으로 하는 이상지질혈증이 죽상동맥경화성 심혈관 질환(ASCVD)의 중요한 위험 요인이고 심혈관 질환의 이환율 및 사망률과 양의 관계를 가짐을 보여준다. LDL 및 산화 저밀도 지단백질(oxLDL)은 ASCVD를 갖는 환자에서 유의미하게 증가되고 심혈관 사건과 관련되어 있다[1]. LDL 및 oxLDL 수준의 저하는 ASCVD의 발병률 및 사망 위험을 유의미하게 감소시킬 수 있다[2 내지 7]. 다른 유형의 이상지질혈증, 예컨대, 증가된 TG 또는 감소된 고밀도 지단백질(HDL)도 ASCVD의 증가된 발생 위험과 관련되어 있다[8, 9].
LDL은 생체 내에서 반응성 산소 종(ROS)의 작용 하에서 동맥 벽의 내피 층에서 oxLDL을 형성한다. oxLDL은 혈관 내피 세포의 비정상적인 활성화, 대식세포의 식세포작용 및 포말 세포의 형성에 참여함으로써 죽상동맥경화증의 발생 및 발달을 촉진할 수 있다[10 내지 12]. 혈관 내피 세포가 비정상적으로 활성화될 때, 혈관 내피 세포의 표면에 의해 발현된 인테그린 및 부착 분자 및 상기 세포에 의해 분비된 케모카인은 분명히 증가된다. 이 기능적 변화들은 순환계 내의 단핵구가 혈관의 내막에 부착하고 이동하고 대식세포로 더 분화할 가능성을 높인다. 대식세포는 그의 표면 상의 스캐빈저(scavenger) 수용체를 통해 oxLDL을 흡수한다. 지질이 대식세포에 축적됨에 따라, 대식세포는 점차적으로 포말 세포로 변하고 아폽토시스 또는 괴사를 겪는다. 대식세포 및 포말 세포는 더 많은 케모카인을 추가로 방출하여 더 많은 단핵 대식세포 및 평활근 세포를 동원하여 내막으로 이동시킴으로써, 결과적으로 죽상동맥경화성 플라크가 형성된다[13]. 죽상동맥경화증의 진행은 세포에 의한 oxLDL의 흡수를 감소시켜, 혈관 내피 세포의 비정상적인 활성화 및 대식세포에 의한 oxLDL의 흡수를 억제함으로써 예방될 수 있거나 지연될 수 있다[14 내지 16].
따라서, 한 양태에서, 본원에 기재된 조성물, 방법 및/또는 폴리펩타이드를 사용하여, 혈관 내피 세포 또는 대식세포에 의한 지질 흡수의 감소를 필요로 하는 개체에서 이러한 지질 흡수를 감소시킬 수 있다. 추가로, 또 다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 조성물 및/또는 폴리펩타이드와 접촉시킨 후, 혈액 지질 또는 콜레스테롤의 흡수가 감소된 변형된 세포를 제공한다. 일부 특정 실시양태에서, 세포는 혈관 내피 세포이다. 일부 특정 실시양태에서, 세포는 대식세포이다. 일부 특정 실시양태에서, 변형된 세포에 의한 혈액 지질 또는 콜레스테롤의 흡수는 본원에 기재된 조성물 및/또는 폴리펩타이드와 접촉시킨 후 적어도 5% 감소된다. 일부 특정 실시양태에서, 변형된 세포에 의한 혈액 지질 또는 콜레스테롤의 흡수는 본원에 기재된 조성물 및/또는 폴리펩타이드와 접촉시킨 후 적어도 10% 감소된다. 일부 특정 실시양태에서, 변형된 세포에 의한 혈액 지질 또는 콜레스테롤의 흡수는 본원에 기재된 조성물 및/또는 폴리펩타이드와 접촉시킨 후 적어도 20% 감소된다. 일부 특정 실시양태에서, 변형된 세포에 의한 혈액 지질 또는 콜레스테롤의 흡수는 본원에 기재된 조성물 및/또는 폴리펩타이드와 접촉시킨 후 적어도 30% 감소된다. 일부 특정 실시양태에서, 변형된 세포에 의한 혈액 지질 또는 콜레스테롤의 흡수는 본원에 기재된 조성물 및/또는 폴리펩타이드와 접촉시킨 후 적어도 40% 감소된다. 일부 특정 실시양태에서, 변형된 세포에 의한 혈액 지질 또는 콜레스테롤의 흡수는 본원에 기재된 조성물 및/또는 폴리펩타이드와 접촉시킨 후 적어도 50% 감소된다. 일부 특정 실시양태에서, 변형된 세포에 의한 혈액 지질 또는 콜레스테롤의 흡수는 본원에 기재된 조성물 및/또는 폴리펩타이드와 접촉시킨 후 적어도 100% 감소된다.
oxLDL은 동맥 혈관 벽 내에서의 LDL의 산화 변형으로부터 유도되고, 이의 생성은 체내 산화 압력 수준과 양의 상관관계를 가진다. oxLDL/LDL 비는 환자의 지질 산화 수준을 반영하는 평가 지표로서 사용될 수 있다[17 내지 19]. oxLDL 및 LDL은 각각 스캐빈저 수용체 클래스 B I형(SR-BI) 및 저밀도 지단백질 수용체(LDLR)를 통해 간 세포로 들어간 후, 대사에 의해 제거될 수 있다[20, 21]. 따라서, 체내 지질 산화 수준의 감소 및 간 세포로부터의 oxLDL 제거의 증가는 고지혈증에 의해 야기된 심혈관 및 뇌혈관 질환을 예방하고 치료하는 방식으로서 이용될 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및/또는 폴리펩타이드는 체내 지질 산화 수준을 감소시킬 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 본원은 체내 지질 산화 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 조성물 및/또는 폴리펩타이드는 개체에서 oxLDL/LDL 비를 감소시킬 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 개체 내의 oxLDL/LDL 비는 치료 전에 비해 본원에 기재된 조성물 및/또는 폴리펩타이드의 투여 후 적어도 10% 감소된다. 일부 특정 실시양태에서, 개체 내의 oxLDL/LDL 비는 본원에 기재된 조성물 및/또는 폴리펩타이드의 투여 후 적어도 20% 감소된다. 일부 특정 실시양태에서, 개체 내의 oxLDL/LDL 비는 본원에 기재된 조성물 및/또는 폴리펩타이드의 투여 후 적어도 30% 감소된다. 일부 특정 실시양태에서, 개체 내의 oxLDL/LDL 비는 본원에 기재된 조성물 및/또는 폴리펩타이드의 투여 후 적어도 40% 감소된다. 일부 특정 실시양태에서, 개체 내의 oxLDL/LDL 비는 본원에 기재된 조성물 및/또는 폴리펩타이드의 투여 후 적어도 50% 감소된다. 일부 특정 실시양태에서, 개체 내의 oxLDL/LDL 비는 본원에 기재된 조성물 및/또는 폴리펩타이드의 투여 후 적어도 100% 감소된다.
한 발명에서, 본원은 개체의 혈관 내에서 순환 산화 LDL의 양을 감소시키는 방법으로서, 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 유리 산화 LDL과 복합체를 형성할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유리"는 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체에 의해 형성된 복합체에 대한 상대적 용어이다. 예를 들면, 일례로서 oxLDL을 상정할 때, 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체와 조합되어 복합체를 형성하지 않은 oxLDL은 본원에서 "유리" oxLDL로서 지칭된다. 대조적으로, 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체와 조합되어 복합체를 형성한 oxLDL은 비-유리 복합체화된 또는 조합된 oxLDL, 또는 단백질-oxLDL 복합체로서 지칭된다.
이론에 의해 제한되지 않지만, 본원에 기재된 폴리펩타이드는 혈액에서 유리 지질 분자와 복합체를 형성함으로써, 혈관 조직에서 지질 분자의 축적을 차단할 수 있으므로, 혈관 내에서의 플라크 형성의 위험 및 죽상동맥경화증 및 관련 질환의 발생 위험을 감소시킬 수 있다고 생각된다. 따라서, 한 양태에서, 본원은 혈관 내의 순환 유리 산화 LDL을 단백질-지질 복합체의 형태로 격리시키는 방법으로서, 상기 산화 LDL을 단백질에 노출시켜 혈관에서 단백질-지질 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 상기 단백질은 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 한 양태에서, 본원은 혈액에서 단백질과 지질에 의해 형성된 복합체도 제공하고, 이때 상기 단백질은 본원에 기재된 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물, 방법 및/또는 폴리펩타이드를 사용하여 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환을 예방할 수 있고/있거나 치료할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 죽상동맥경화증은 지질 줄무늬 또는 죽상 플라크를 형성하는, 동맥 혈관 벽 내의 지질 축적으로 인한 동맥 혈관 기능장애이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 죽상동맥경화증은 동맥에 의해 공급되는 조직 및 장기의 혈액 공급에 영향을 미쳐, 조직 및 장기의 부분적 또는 전체적 허혈을 초래하는, 혈관 내에서의 플라크 형성으로 인한 감소된 동맥 혈관운동 기능, 루멘 협착 및 심지어 혈전을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 죽상동맥경화증 관련 질환은 죽상동맥경화증 관련 심혈관 질환 또는 죽상동맥경화증 관련 말초 혈관 질환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 죽상동맥경화증 관련 질환은 혈관의 내경의 협착, 혈관의 외경의 확장, 혈관 수축 및 팽창의 감소, 혈관의 감소된 탄성, 혈관의 증가된 취약성, 혈관의 벽 내에서의 석회화 또는 석회증, 또는 혈전증에 의해 야기된 혈관의 감소된 혈액 공급, 고혈압, 협심증, 심근 경색, 심근 허혈, 부정맥, 뇌 허혈, 허혈성 졸중, 뇌 위축증, 신기능부전, 신동맥 협착증, 마비성 장폐색 및/또는 사지 허혈 괴사를 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
용어 "지질" 또는 "콜레스테롤"은 혈액 또는 혈관 내의 순환 지질 또는 콜레스테롤의 관점에서 교환 가능하게 사용된다. 콜레스테롤은 유리 또는 에스테르화된 콜레스테롤, 예컨대, 지단백질 입자 또는 킬로미크론, 초저밀도 지단백질(VLDL), 저밀도 지단백질(LDL) 및 고밀도 지단백질(HDL) 중 하나 이상의 형태로 혈액에 존재한다. 따라서, 본 발명에 관한 것인 한, 지질 또는 콜레스테롤은 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 트리글리세라이드, 킬로미크론(CM), 저밀도 지단백질(LDL), 초저밀도 지단백질(VLDL), 중밀도 지단백질(IDL), 지단백질 (a)(Lp(a)) 및 산화 저밀도 지단백질(oxLDL), 및 이들 각각의 대사 중간체들 중 하나 이상을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 지질 또는 콜레스테롤은 지단백질을 지칭한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 지질 또는 콜레스테롤은 저밀도 지단백질(LDL)을 지칭한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에서 사용된 지질 또는 콜레스테롤은 산화 저밀도 지단백질(oxLDL)을 지칭한다.
혈중 총 콜레스테롤의 농도는 소화관으로부터의 콜레스테롤의 흡수, 탄수화물, 단백질, 지방 및 에탄올과 같은 식이 성분으로부터의 콜레스테롤의 합성, 및 조직을 통한 혈액으로부터의 콜레스테롤의 제거에 의해 영향을 받고, 그 후 콜레스테롤은 담즙산, 스테로이드 호르몬 및 담즙 콜레스테롤로 전환된다. 간은 혈액으로부터 콜레스테롤을 제거하는 데 있어서 중요한 장기이다. 죽상동맥경화증의 예방 및/또는 치료 방법은 혈중 순환 콜레스테롤의 양을 감소시키는 단계를 포함한다. 간 세포에 의한 콜레스테롤의 제거는 혈중 순환 콜레스테롤 함량을 감소시킴으로써, 죽상동맥경화증의 위험을 감소시킬 수 있다. 따라서, 죽상동맥경화증의 효과적인 예방 및/또는 치료 방법은 간 세포에 의한 지질의 흡수 또는 제거를 개선하는 단계를 포함한다. 따라서, 한 양태에서, 본원에 기재된 조성물, 방법 및/또는 폴리펩타이드는 간 세포에서의 지질 축적의 증가를 필요로 하는 개체에서 이러한 지질 축적을 증가시키는 방법에 사용될 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물, 방법 및/또는 폴리펩타이드는 간 세포에 의한 혈액 지질의 흡수를 효과적으로 개선함으로써, 혈중 순환 지질의 양을 감소시킨다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물, 방법 및/또는 폴리펩타이드는 간 세포에 의한 혈중 순환 oxLDL의 흡수를 효과적으로 개선함으로써, 혈중 순환 oxLDL의 양을 감소시킨다.
혈중 순환 콜레스테롤의 농도는 유전적 요인 및 환경적 요인에 의해 영향을 받을 수 있다. 유전적 요인은 콜레스테롤 생합성 속도 제한 효소의 농도, 간에서의 저밀도 지단백질 수용체의 농도, 콜레스테롤 담즙산을 전환시키는 속도 제한 효소의 농도, 지단백질 합성 및 분비의 속도, 및 인간의 성별을 포함한다. 인체에서 혈중 콜레스테롤 농도의 정상 상태에 영향을 미치는 환경적 요인은 식이 구조, 흡연 빈도, 신체 운동 및 다양한 약물들의 사용을 포함한다. 식이 변수는 지방의 양 및 유형(포화 지방산 및 불포화 지방산), 콜레스테롤의 양, 섬유, 비타민, 예컨대, 비타민 C 및 D의 양 및 유형, 및 무기질, 예컨대, 칼슘의 양을 포함한다.
본원에 기재된 방법은 스타틴, 피브레이트, 콜레스테롤 흡수 억제제, 프로부콜, 콜산 킬레이팅제, 니코틴산 및 전구단백질 전환효소 서브틸리신(subtilisin) 9 억제제 등을 비롯한 지질 저하 약물을 개체에게 투여하는 단계도 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 저-콜레스테롤 규정식을 개체에게 투여하는 단계도 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 고-섬유 규정식을 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 개체의 주간 운동량을 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 개체의 주간 운동량을 적어도 10% 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 개체의 주간 운동량을 적어도 20% 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 개체의 주간 운동량을 적어도 30% 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 개체의 주간 운동량을 적어도 40% 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 개체의 주간 운동량을 적어도 50% 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 개체의 주간 운동량을 적어도 100% 증가시키는 단계를 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 치료 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 코딩하는 유효량의 핵산 또는 이 핵산을 포함하는 벡터를 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 발현하는 세포, 또는 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상기 핵산을 포함하는 조직 또는 장기를 개체에 이식하는 단계를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상기 핵산을 포함하는 혈청, 뇌척수액, 림프액 또는 간질액을 개체에 주입하는 단계를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 단계들 중 하나 이상의 단계를 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, 개체는 포유류이다. 일부 특정 실시양태에서, 개체는 인간이다. 일부 특정 실시양태에서, 개체는 마우스, 래트, 고양이, 개, 토끼, 양, 말, 소, 염소, 게르빌루스쥐, 햄스터, 기니 피그, 원숭이 또는 임의의 다른 포유류일 수 있다.
일부 특정 실시양태에서, 개체는 수술을 받는다. 일부 특정 실시양태에서, 개체는 경피적 관상동맥 중재술, 관상동맥 우회로 이식술 및/또는 경동맥 내막절제술을 포함하는 수술을 받는다.
본원에 기재된 조성물은 본원에 기재된 활성 성분(sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체; sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산; 상기 핵산을 포함하는 벡터; sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 상기 핵산을 포함하는, 혈청, 뇌척수액, 림프액 및/또는 간질액을 포함하는 세포, 조직 및/또는 장기 등을 포함함), 및 불활성 고체 희석제 및 충전제, 희석제, 멸균 수용액 및 다양한 유기 용매들, 침투 향상제, 가용화제 및 보조제를 포함하나 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체를 포함한다. 비제한적 예시적 약학 조성물 및 이의 제조가 이하에 기재되어 있다.
본원에 기재된 조성물은 예를 들면, 정제, 캡슐, 환제, 산제, 지속 방출 제제, 용액 또는 현탁액으로서 경구 투여, 멸균 용액, 현탁액 또는 유화액으로서 비경구 주사, 연고 또는 크림으로서 국소 투여, 또는 좌약제로서 직장 투여에 적합한 형태로 존재할 수 있다. 약학 조성물은 정확한 용량의 단회 투여에 적합한 유닛 제형일 수 있다.
예시적 비경구 제형은 멸균 수용액, 예컨대, 프로필렌 글리콜 수용액 또는 덱스트로스 용액 중의 본원에 기재된 활성 성분의 용액 또는 현탁액을 포함한다. 필요한 경우, 이러한 제형은 히스티딘 및/또는 인산염과 같은 염에 의해 적절히 완충될 수 있다.
일부 경우, 본원은 본원에 기재된 활성 성분 및 주사에 적합한 약학 부형제를 함유하는 주사용 약학 조성물을 제공한다. 상기 조성물의 성분 및 용량은 본원에 기재된 바와 같다.
주사 투여를 위해 본 발명의 신규 조성물 내로 혼입될 수 있는 제형은 참깨유, 옥수수유, 면실유 또는 땅콩유뿐만 아니라, 엘릭시르, 만니톨, 덱스트로스 또는 멸균 수용액 및 유사한 약학 담체도 포함하는 수성 또는 유성 현탁액 또는 유화액을 포함한다.
식염수 중의 수용액도 주사를 위해 관용적으로 사용된다. 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등(및 이들의 적합한 혼합물), 사이클로덱스트린 유도체 및 식물성 오일도 사용될 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 분산액의 경우 원하는 입자 크기를 유지하기 위한 코팅제, 예컨대, 레시틴의 사용, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 다양한 항균제들 및 항진균제들, 예컨대, p-하이드록시벤조에이트, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등을 사용하여 미생물의 작용을 예방할 수 있다.
멸균 주사 용액은 하기 단계들에 의해 제조될 수 있다: 원하는 양으로 본 발명의 본원에 기재된 활성 성분을, 요구된 경우 상기 나열된 다양한 다른 성분들을 갖는 적절한 용매 내로 혼입시키는 단계, 및 이어서 여과하고 멸균하는 단계. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분들을, 기본 분산 매질 및 상기 나열된 성분들 중 다른 원하는 성분을 함유하는 멸균 담체 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 원하는 제조 방법들 중 일부는 활성 성분과 임의의 추가 원하는 성분으로 이루어진 분말을 이들의 미리 멸균 여과된 용액으로부터 생성하는 진공 건조 기법 및 냉동 건조 기법이다.
일부 경우, 본원은 본원에 기재된 활성 성분 및 경구 투여에 적합한 약학 부형제를 함유하는, 경구 투여용 약학 조성물을 제공한다.
일부 경우, 본원은 (i) 본원에 기재된 유효량의 활성 성분; 임의적으로 (ii) 유효량의 제2 작용제; 및 (iii) 경구 투여에 적합한 약학 부형제를 포함하는, 경구 투여용 고체 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 (iv) 유효량의 제3 작용제를 추가로 포함한다.
일부 경우, 약학 조성물은 경구 투여에 적합한 액체 약학 조성물일 수 있다. 경구 투여에 적합한 본원에 기재된 조성물은 캡슐, 카세제 또는 정제와 같은 분리된 제형으로 제공될 수 있거나, 수성 또는 비수성 액체, 수중유 유화액 또는 유중수 액체 유화액 중의 분말 또는 과립, 용액 또는 현탁액으로서, 소정의 양의 활성 성분을 각각 함유하는 액체 또는 에어로졸 스프레이로 제공될 수 있다. 약학 방법이 활성 성분을, 하나 이상의 필수 성분을 구성하는 담체와 조합하는 단계를 포함하는 한, 임의의 약학 방법으로 이러한 제형을 제조할 수 있다. 일반적으로, 조성물은 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 이들 둘 다와 균일하고 조밀하게 혼합한 후, 필요한 경우 생성물을 원하는 제시 형태로 성형함으로써 제조된다.
물이 일부 폴리펩타이드의 분해를 촉진할 수 있기 때문에, 본 발명은 활성 성분을 함유하는 무수 약학 조성물 및 제형도 포함한다. 예를 들면, 약학 분야에서, 물(예를 들면, 5%)은 제제의 저장 수명 또는 시간에 따른 안정성과 같은 특성을 측정하기 위해 장기간 저장을 시뮬레이션하는 수단으로서 첨가될 수 있다. 본 발명의 무수 약학 조성물 및 제형은 무수 또는 저-수분 성분 및 저-수분 또는 저-습도 조건을 이용함으로써 제조될 수 있다. 락토스를 함유하는, 본원에 기재된 조성물 및 제형은 제조, 포장 및/또는 저장 동안 물 및/또는 습한 공기와의 실질적인 접촉이 예상되는 경우 무수 상태로 만들어질 수 있다. 무수 약학 조성물은 그의 무수성이 유지될 수 있도록 제조되고 저장될 수 있다. 따라서, 무수 조성물은 적합한 처방 키트에 함유될 수 있도록 물에의 노출을 방지하는 것으로 공지된 물질을 사용함으로써 포장될 수 있다. 적합한 포장재의 예는 기밀 밀봉된 포일, 플라스틱 등, 유닛 용량 용기, 블리스터 포장재 및 스트립 포장재를 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
본원에 기재된 활성 성분은 통상의 약학 조제 기법에 따라 약학 담체와 조밀하게 혼합될 수 있다. 담체는 투여를 위해 요구된 제제의 형태에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 경구 제형으로 조성물을 제조함에 있어서, 경구 액체 제제(예컨대, 현탁액, 용액 및 엘릭시르) 또는 에어로졸의 경우 통상의 약학 매질들 중 임의의 약학 매질, 예컨대, 물, 글리콜, 오일, 알코올, 풍미제, 보존제, 착색제 등을 담체로서 사용할 수 있거나; 경구 고체 제제의 경우 전분, 당, 미세결정성 셀룰로스, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제 및 붕해제와 같은 담체를 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 락토스는 사용되지 않는다. 예를 들면, 고체 경구 제제에서, 적합한 담체는 산제, 캡슐 및 정제를 포함한다. 필요한 경우, 정제는 표준 수성 또는 비수성 기법에 의해 코팅될 수 있다.
약학 조성물 및 제형에 적합한 접착제는 옥수수 전분, 감자 전분 및 다른 전분, 젤라틴, 천연 검 및 합성 검, 예컨대, 아카시아, 알긴산나트륨, 알긴산, 다른 알긴산염, 분말화된 트라가칸쓰, 구아 검, 셀룰로스 및 이의 유도체(예를 들면, 에틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 칼슘 카르복시메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스), 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로스, 전호화 전분, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 미세결정성 셀룰로스 및 이들의 혼합물을 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
본원에 개시된 약학 조성물 및 제형에 사용하기에 적합한 충전제의 예는 탈크, 탄산칼슘(예를 들면, 과립 또는 분말), 미세결정성 셀룰로스, 분말화된 셀룰로스, 글루코스 결합제, 고령토, 만니톨, 규산, 소르비톨, 전분, 전호화 전분 및 이들의 혼합물을 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
붕해제는 수성 환경에 노출될 때 붕해되는 정제를 제공하기 위해 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 과도한 붕해제는 병에서 즉시 붕해되는 정제를 생성할 수 있다. 너무 적은 붕해제는 붕해가 일어나기에 충분하지 않을 수 있으므로, 제형으로부터의 활성 성분의 방출 속도 및 정도를 변화시킬 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 화합물의 제형은 활성 성분의 방출을 유해하게 변화시키지 않도록 너무 적지 않고 너무 많지도 않은 충분한 양의 붕해제를 사용함으로써 형성될 수 있다. 사용된 붕해제의 양은 제제의 유형 및 투여 방식에 따라 달라질 수 있고, 당분야에서 통상의 기술을 갖는 자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 약 0.5 중량% 내지 약 15 중량%의 붕해제, 또는 약 1 중량% 내지 약 5 중량%의 붕해제가 약학 조성물에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 제형을 형성하는 데 사용될 수 있는 붕해제는 한천, 알긴산, 탄산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 크로스카멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 폴라크릴린(polacrilin) 칼륨, 나트륨 전분 글리콜레이트, 감자 또는 타피오카 전분, 다른 전분, 전호화 전분, 다른 전분, 점토, 다른 알긴, 다른 셀룰로스, 검 또는 이들의 혼합물을 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
본원에 기재된 조성물 및 제형을 형성하는 데 사용될 수 있는 윤활제는 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 광유, 경질 광유, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜, 다른 글리콜, 스테아르산, 라우릴황산나트륨, 탈크, 수소첨가된 식물성 오일(예를 들면, 땅콩유, 면실유, 해바라기유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유), 스테아르산아연, 에틸 올레에이트, 에틸 라우레이트, 한천 또는 이들의 혼합물을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 다른 윤활제는 예를 들면, 실로이드 실리카 겔, 합성 실리카의 응고된 에어로졸, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 윤활제는 임의적으로 약학 조성물의 약 1 중량% 미만의 양으로 첨가될 수 있다.
수성 현탁액 및/또는 엘릭시르가 경구 투여를 위해 요구될 때, 이의 활성 성분은 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 이들의 다양한 조합들과 같은 희석제와 함께 다양한 감미제 또는 풍미제, 착색 물질 또는 염료, 및 (필요한 경우) 유화제 및/또는 현탁제와 조합될 수 있다.
정제는 코팅되지 않을 수 있거나, 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시키기 위해 공지된 기법에 의해 코팅됨으로써, 더 긴 시간 동안 지속된 작용을 제공할 수 있다. 예를 들면, 시간 지연 물질, 예컨대, 모노스테아르산글리세롤 또는 디스테아르산글리세롤이 사용될 수 있다. 경구 투여용 제제는 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예컨대, 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 고령토와 혼합되어 있는 경질 젤라틴 캡슐, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질, 예컨대, 땅콩유, 액체 파라핀 또는 올리브유와 혼합되어 있는 연질 젤라틴 캡슐로서 제공될 수도 있다.
본원에 기재된 조성물 및 제형을 형성하는 데 사용될 수 있는 계면활성제는 친수성 계면활성제, 친유성 계면활성제 및 이들의 혼합물을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 즉, 친수성 계면활성제의 혼합물, 친유성 계면활성제의 혼합물, 또는 적어도 하나의 친수성 계면활성제와 적어도 하나의 친유성 계면활성제의 혼합물이 사용될 수 있다.
낮은 HLB 값을 갖는 계면활성제는 더 높은 친유성 또는 소수성을 나타내고 오일에서 높은 가용성을 갖고, 높은 HLB 값을 갖는 계면활성제는 더 높은 친수성을 나타내고 수용액에서 더 높은 가용성을 가진다. 친수성 계면활성제는 전형적으로 약 10 초과의 HLB 값을 갖는 화합물로서 간주되고, HLB 스케일은 일반적으로 음이온성, 양이온성 또는 양쪽성 화합물에 적용될 수 없다. 유사하게, 친유성(즉, 소수성) 계면활성제는 약 10 이하의 HLB 값을 갖는 화합물이다. 그러나, 계면활성제의 HLB 값은 산업용 유화액, 약학 유화액 및 미용 유화액의 제제화를 뒷받침하기 위해 통상적으로 사용되는 대략적인 지침일 뿐이다.
친수성 계면활성제는 이온성 또는 비이온성 계면활성제일 수 있다. 적합한 이온성 계면활성제는 알킬 암모늄 염; 푸시드산 염; 아미노산, 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드의 지방산 유도체; 아미노산, 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드의 글리세라이드 유도체; 레시틴 및 수소첨가된 레시틴; 용혈성 레시틴 및 수소첨가된 용혈성 레시틴; 인지질 및 이의 유도체; 리소포스파타이드 및 이의 유도체; 카르니틴 지방산 에스테르 염; 알킬 설페이트의 염; 지방산 염; 도큐산나트륨; 아실 락테이트; 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 모노아세틸화된 주석산염 및 디아세틸화된 주석산염; 석시닐화된 모노글리세라이드 및 디글리세라이드; 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 구연산염; 및 이들의 혼합물을 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
상기 군에서, 이온성 계면활성제는 예를 들면, 레시틴, 리소포스파티딜콜린, 인지질, 리소포스파타이드 및 이의 유도체; 카르니틴 지방산 에스테르 염; 알킬 설페이트의 염; 지방산 염; 도큐산나트륨; 아실 락테이트; 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 모노아세틸화된 주석산염 및 디아세틸화된 주석산염; 석시닐화된 모노글리세라이드 및 디글리세라이드; 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 구연산염; 및 이들의 혼합물을 포함한다.
이온성 계면활성제는 레시틴, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 포스파티딜세린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜 에탄올아민, 리소포스파티딜글리세롤, 리소포스파티드산, 리소포스파티딜세린, PEG-포스파티딜에탄올아민, PVP-포스파티딜에탄올아민, 지방산의 락토일 에스테르, 스테아로일-2-락테이트, 스테아로일 락테이트, 석시닐화된 모노글리세라이드, 모노/디글리세라이드의 모노/디아세틸화된 주석산염, 모노/디글리세라이드의 구연산염, 콜릴사르코신, 헥사노에이트, 옥타노에이트, 데카노에이트, 라우레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 올레에이트, 리시놀레에이트, 리놀레에이트, 리놀렌에이트, 스테아레이트, 라우릴 설페이트, 테라세틸 설페이트, 도큐세이트, 라우로일 카르니틴, 팔미토일 카르니틴, 미리스토일 카르니틴 및 이온화된 형태의 염, 및 이들의 혼합물일 수 있다.
친수성 비이온성 계면활성제는 알킬 글루코사이드; 알킬 말토사이드; 알킬 티오글루코사이드; 라우릴 폴리에틸렌 글리콜 글리세라이드; 폴리옥시알킬렌 알킬 에테르, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 알킬 에테르; 폴리옥시알킬렌 알킬 페놀, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 알킬 페놀; 폴리옥시알킬렌 알킬 페놀 지방산 에스테르, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 지방산 모노에스테르 및 폴리에틸렌 글리콜 지방산 디에스테르; 폴리에틸렌 글리콜 글리세린 지방산 에스테르; 폴리글리세롤 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 탈수된 소르비톨 지방산 에스테르, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 탈수된 소르비톨 지방산 에스테르; 폴리올과, 글리세라이드, 식물성 오일, 수소첨가된 식물성 오일, 지방산 및 스테롤로 구성된 군의 적어도 하나의 구성원의 친수성 에스테르 교환 생성물; 폴리옥시에틸렌 스테롤, 및 이의 유도체 및 유사체; 폴리옥시에틸렌 비타민 및 이의 유도체; 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체; 및 이들의 혼합물; 폴리에틸렌 글리콜 탈수된 소르비톨 지방산 에스테르; 및 폴리올과, 트리글리세라이드, 식물성 오일 및 수소첨가된 식물성 오일로 구성된 군의 적어도 하나의 구성원의 친수성 에스테르 교환 생성물을 포함할 수 있으나 이들로 제한되지 않는다. 폴리올은 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비톨, 프로필렌 글리콜, 펜타에리쓰리톨 또는 사카라이드일 수 있다.
다른 친수성 비이온성 계면활성제는 PEG-10 라우레이트, PEG-12 라우레이트, PEG-20 라우레이트, PEG-32 라우레이트, PEG-32 딜라우레이트, PEG-12 올레에이트, PEG-15 올레에이트, PEG-20 올레에이트, PEG-20 디올레에이트, PEG-32 올레에이트, PEG-200 올레에이트, PEG-400 올레에이트, PEG-15 스테아레이트, PEG-32 디스테아레이트, PEG-40 스테아레이트, PEG-100 스테아레이트, PEG-20 딜라우레이트, PEG-25 글리세릴 트리올레에이트, PEG-32 디올레에이트, PEG-20 글리세릴 라우레이트, PEG-30 글리세릴 라우레이트, PEG-20 글리세릴 스테아레이트, PEG-20 글리세릴 올레에이트, PEG-30 글리세릴 올레에이트, PEG-30 글리세릴 라우레이트, PEG-40 글리세릴 라우레이트, PEG-40 팜핵유, PEG-50 수소첨가된 피마자유, PEG-40 피마자유, PEG-35 피마자유, PEG-60 피마자유, PEG-40 수소첨가된 피마자유, PEG-60 수소첨가된 피마자유, PEG-60 옥수수유, PEG-6 글리세릴 데카노에이트/옥타노에이트, PEG-8 글리세릴 데카노에이트/옥타노에이트, 폴리글리세릴-10 라우레이트, PEG-30 콜레스테롤, PEG-25 파이토스테롤, PEG-30 대두 스테롤, PEG-20 트리올레이트, PEG-40 탈수된 소르비탄 올레에이트, PEG-80 탈수된 소르비탄 라우레이트, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, POE-9 도데실 에테르, POE-23 도데실 에테르, POE-10 올레일 에테르, POE-20 올레일 에테르, POE-20 스테아릴 에테르, 토코페롤 PEG-100 석시네이트, PEG-24 콜레스테롤, 폴리글리세릴-10 올레에이트, Tween 40, Tween 60, 수크로스 모노스테아레이트, 수크로스 모노라우레이트, 수크로스 모노팔미테이트, PEG10-100 노닐페놀 시리즈, PEG15-100 옥틸페놀 시리즈 및 폴록사머를 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
적합한 친유성 계면활성제는 예를 들면, 지방 알코올; 글리세린 지방산 에스테르; 아세틸화된 글리세린 지방산 에스테르; 저급 알코올 지방산 에스테르; 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르; 소르비탄 지방산 에스테르; 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 지방산 에스테르; 스테롤 및 스테롤 유도체; 폴리옥시에틸렌화된 스테롤 및 스테롤 유도체; 폴리에틸렌글리콜 알킬 에테르; 당 에스테르; 당 에테르; 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 젖산 유도체; 폴리올과, 글리세라이드, 식물성 오일, 수소첨가된 식물성 오일, 지방산 및 스테롤로 구성된 군의 적어도 하나의 구성원의 소수성 에스테르 교환 생성물; 지용성 비타민/비타민 유도체; 및 이들의 혼합물을 포함한다. 이 군에서, 바람직한 친유성 계면활성제는 글리세린 지방산 에스테르, 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르 및 이들의 혼합물, 또는 폴리올과, 식물성 오일, 수소첨가된 식물성 오일 및 트리글리세라이드로 구성된 군의 적어도 하나의 구성원의 소수성 트랜스에스테르화 생성물을 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물은 본 개시의 화합물의 우수한 용액 및/또는 용해를 보장하고 본 개시의 화합물의 침전을 최소화하기 위해 가용화제를 포함할 수 있다. 이것은 비경구 조성물(예를 들면, 주사용 조성물)에 특히 중요할 수 있다. 가용화제는 친수성 약물 및/또는 다른 성분, 예컨대, 계면활성제의 가용성을 증가시키거나, 조성물을 안정한 또는 균질한 용액 또는 분산액으로서 유지하기 위해 첨가될 수도 있다.
적합한 가용화제의 예는 하기 물질들을 포함하나 이들로 제한되지 않는다: 알코올 및 폴리올, 예컨대 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 벤질 알코올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부탄디올 및 이의 이성질체, 글리세롤, 펜타에리쓰리톨, 소르비톨, 만니톨, 트랜스큐톨, 디메틸 이소소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐 알코올, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 및 다른 셀룰로스 유도체, 사이클로덱스트린 및 사이클로덱스트린 유도체; 약 200 내지 약 6000의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜의 에테르, 예컨대, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올 PEG 에테르(글리코푸롤) 또는 메톡실 PEG 에테르; 아미드 및 다른 질소 함유 화합물, 예컨대, 2-피롤리돈, 2-피페리돈, ε-카프로락탐, N-알킬 피롤리돈, N-하이드록시알킬 피롤리돈, N-알킬 피페리돈, N-알킬 카프로락탐, 디메틸 아세트아미드 및 폴리비닐피롤리돈; 에스테르, 예컨대, 에틸 프로피오네이트, 트리부틸 시트레이트, 트리에틸 아세틸시트레이트, 트리부틸 아세틸시트레이트, 트리에틸 시트레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 옥타노에이트, 에틸 부티레이트, 트리아세틴, 프로필렌 글리콜 모노아세테이트, 프로필렌 글리콜 디아세테이트, ε-카프로 락톤 및 이의 이성질체, δ-발레로락톤 및 이의 이성질체, β-부티로락톤 및 이의 이성질체; 및 당분야에서 공지된 다른 가용화제, 예컨대, 디메틸아세트아미드, 디메틸 이소소르비톨, N-메틸 피롤리돈, 모노옥카타노인, 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 및 물.
가용화제의 혼합물도 사용될 수 있다. 예는 트리아세틴, 트리에틸 시트레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 옥타노에이트, 디메틸아세트아미드, N-메틸 피롤리돈, N-하이드록시에틸 피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 사이클로덱스트린, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 200-100, 글리코푸롤, 트랜스큐톨, 프로필렌 글리콜 및 디메틸 이소소르비톨을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 특히 바람직한 가용화제는 소르비톨, 글리세롤, 트리아세틴, 에탄올, PEG-400, 글리코푸롤 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.
함유될 수 있는 가용화제의 양은 특별히 제한되지 않는다. 가용화제의 소정의 양은 당분야에서 숙련된 자에 의해 용이하게 확인될 수 있는 생물학적으로 허용 가능한 양으로서 제한될 수 있다. 일부 경우, 예를 들면, 약물의 농도를 최대화하기 위해 생물학적으로 허용 가능한 양을 훨씬 초과하는 양의 가용화제를 포함시키는 것이 유리할 수 있고, 여분의 가용화제는 조성물을 대상체에게 제공하기 전에 증류 또는 증발과 같은 통상의 기술을 이용함으로써 제거된다. 따라서, 존재하는 경우, 가용화제는 약물과 다른 부형제의 조합된 중량을 기준으로 10%, 25%, 50%, 100% 또는 최대 약 200%(중량 기준)일 수 있다. 필요한 경우, 극소량, 예를 들면, 5%, 2%, 1% 또는 훨씬 더 적은 양의 가용화제를 사용할 수도 있다. 일반적으로, 가용화제는 약 1% 내지 약 100%, 보다 전형적으로 약 5% 내지 약 25%(중량 기준)의 양으로 존재할 수 있다.
조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 첨가제 및 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 첨가제 및 부형제는 점착방지제, 소포제, 완충액, 중합체, 항산화제, 보존제, 킬레이팅제, 점도조절제, 장력조절제, 풍미제, 착색제, 풍미제, 자외선차단제, 현탁제, 접착제, 충전제, 가소제, 윤활제 및 이들의 혼합물을 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
추가로, 편리한 처리 및 안정성의 향상을 위해 또는 다른 이유로, 산 또는 염기를 조성물 내로 혼합할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염기의 예는 아미노산, 아미노산 에스테르, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 중탄산나트륨, 수산화알루미늄, 탄산칼슘, 수산화마그네슘, 규산알루미늄마그네슘, 합성 규산알루미늄, 합성 하이드로칼사이트, 수산화알루미늄마그네슘, 디이소프로필에틸아민, 에탄올아민, 에틸렌디아민, 트리에탄올아민, 트리에틸아민, 트리이소프로판올아민, 트리메틸아민, 트리스(하이드록시메틸) 아미노 메탄(TRIS) 등을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 산, 예컨대, 아세트산, 아크릴산, 아디프산, 알긴산, 알칸 설폰산, 아미노산, 아스코르브산, 벤조산, 붕산, 부티르산, 탄산, 구연산, 지방산, 포름산, 푸마르산, 글루콘산, 하이드로퀴논 설폰산, 이소아스코르브산, 젖산, 말레산, 옥살산, p-브로모벤젠설폰산, 프로피온산, p-톨루엔설폰산, 살리실산, 스테아르산, 석신산, 탄닌산, 주석산, 머캡토아세트산, 톨루엔설폰산, 요산 등의 염인 염기도 적합하다. 인산나트륨, 인산수소이나트륨 및 인산이수소나트륨과 같은 다염기성 산의 염도 사용될 수 있다. 염기가 염인 경우, 양이온은 임의의 적합한 약학적으로 허용 가능한 양이온, 예를 들면, 암모늄, 알칼리 금속, 알칼리 토금속 등일 수 있다. 예는 나트륨, 칼륨, 리튬, 마그네슘, 칼슘 및 암모늄을 포함할 수 있으나 이들로 제한되지 않는다.
적합한 산은 약학적으로 허용 가능한 유기산 또는 무기산이다. 적합한 무기산의 예는 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 질산, 붕산, 인산 등을 포함한다. 적합한 유기산의 예는 아세트산, 아크릴산, 아디프산, 알긴산, 알칸 설폰산, 아미노산, 아스코르브산, 벤조산, 붕산, 부티르산, 탄산, 구연산, 지방산, 포름산, 푸마르산, 글루콘산, 하이드로퀴논 설폰산, 이소아스코르브산, 젖산, 말레산, 메탄설폰산, 옥살산, p-브로모벤젠설폰산, 프로피온산, p-톨루엔설폰산, 살리실산, 스테아르산, 석신산, 탄닌산, 주석산, 머캡토아세트산, 톨루엔설폰산, 요산 등을 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, 본 개시의 조성물 및/또는 단백질은 또 다른 활성 물질과 함께 투여될 수 있다. 용어 "함께 투여"는 모든 투여되는 프로그램들이 특정 시간 간격으로 최소(de minimus) 양으로 개별 신체 또는 개별 신체의 작용 부위 내에 존재하도록 하나 이상의 용량 및 하나 이상의 시간 간격으로 투여하는 것을 의미한다. 예를 들면, 시간 간격은 임의의 적합한 시간 간격, 예컨대, 분, 시, 일 또는 주의 적절한 시간 간격일 수 있다. 예를 들면, 투여되는 프로그램은, 예를 들면, 단일 조성물의 부분으로서 함께 투여될 수 있거나, 추가로 투여될 수 있다. 투여되는 프로그램은 기본적으로 동일한 시간에 투여될 수 있고, 예를 들면, 서로 사이의 시간 간격은 약 5분, 약 3분 또는 약 1분 이하이거나, 서로의 시간 간격의 짧은 시간 이내에 있고, 예를 들면, 서로의 시간 간격은 약 1시간, 30분 또는 10분 이하이거나, 약 5분을 초과하고 최대 약 1시간이다. 이러한 투여되는 프로그램은 기본적으로 동일한 시간에 투여되는 것으로서 간주될 수 있다. 당분야에서 숙련된 자는 투여되는 프로그램이 최소 수준 및/또는 유효 농도보다 더 큰 수준으로 개별 신체 내에 존재하도록, 투여되는 프로그램이 개별 신체에 투여되기 위해 요구되는 적합한 용량 및 시간 간격을 결정할 수 있다. 투여되는 프로그램이 개체의 신체에 동시에 투여될 때, 임의의 이러한 투여되는 프로그램은 단독으로 투여될 때 사용될 수 있는 유효량보다 더 적은 유효량으로 존재할 수 있다. 본원에도 기재된 용어 "유효량"은 이 보다 낮은 유효량 및 일반적인 유효량을 포함하고, 사실상 특별한 상태, 효과 및/또는 반응을 야기할 수 있는 임의의 유효량이다. 따라서, 프로그램을 동시에 투여하기 위한 임의의 이러한 용량은 단독으로 투여될 때 사용될 수 있는 용량보다 더 적을 수 있다. 이러한 임의의 투여되는 프로그램의 하나 이상의 효과는 중첩된 효과 또는 상승작용적 효과일 수 있다. 이러한 임의의 투여되는 프로그램은 1회 초과의 빈도로 투여될 수 있다.
일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및/또는 단백질은 또 다른 활성 물질과 함께 투여된다. 일부 특정 실시양태에서, 활성 물질은 지질저하제이다. 일부 특정 실시양태에서, 활성 물질은 혈압강하 약물이다. 일부 특정 실시양태에서, 활성 물질은 응고제이다.
활성화제에 대한 용어 "유효량"은 특별한 생물학적 상태, 효과 및/또는 반응을 야기하기에 충분한 활성화제의 양을 지칭한다. 예를 들면, 특별한 작용제의 유효 절대량은 요구된 생물학적 종점, 작용제 자체, 대상체 또는 다른 객체 부분 및/또는 유사한 요인과 같은 다양한 요인들에 따라 이 방식으로 달라진다. 활성화제의 유효량은 단회 용량 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다. 유효량의 활성화제에 의해 생성되는 생물학적 상태, 효과 및/또는 반응의 예는 예를 들면, 죽상동맥경화증 및 이의 관련 질환의 위험 및/또는 중증도의 감소, 간 조직 또는 간 세포에 의한 지단백질과 같은 지질의 흡수의 개선, 혈관 내피 세포 또는 대식세포와 같은 혈관에 의한 지단백질과 같은 지질의 흡수의 감소, 순환 유리 지질의 함량 감소, 순환 유리 저밀도 지단백질, 예컨대, oxLDL의 비율 감소 등을 포함한다. 성분은 적어도 유효량, 또는 특별한 목표 또는 목적, 예컨대, 본원에 기재된 임의의 목표 또는 목적과 관련된 적어도 유효량을 갖는 것으로서 본원에 기재될 수 있다.
실시예
하기 내용은 실시예와 함께 본 개시의 바람직한 실시양태를 예시하고 입증할 것이고, 본 개시의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 본 개시의 모든 범위는 청구범위의 정의에 기반한다.
달리 특정되어 있지 않은 한, 하기 실시예에서 사용된 실험 방법들은 모두 통상의 실험 방법들이다.
하기 실시예에서 사용된 sDSS1 단백질은 회사 자체에 의해 제조되고 품질 관리된다. 검출 시, 상기 단백질의 순도는 95% 초과의 수준이고, 내독소(내독소의 함량은 3 EU/mg 단백질 미만임) 및 다른 불순물 잔사는 표준을 충족시킨다. sDSS1 단백질은 분명한 동물 독성 반응을 야기하지 않으면서 동물 실험을 위해 사용될 수 있다.
sDSS1 단백질을 제외한, 하기 실시예에서 사용된 재료 및 시약은 모두 시판된다.
실시예 1: sDSS1 단백질과 oxLDL 또는 LDL의 상호작용
1.1 실험 재료 및 방법
실험 재료: sDSS1 단백질, sDSS1 돌연변이체 단백질 1(sDSS1-M1, 서열번호 15), sDSS1 돌연변이체 단백질 2(sDSS1-M2, 서열번호 16), 산화 저밀도 지단백질(oxLDL)(솔라바이오(Solarbio), 제품 번호: H7980); 저밀도 지단백질(LDL)(솔라바이오, 제품 번호: H7960).
실험 방법: 2 ㎍의 oxLDL 또는 LDL을 각각 20 mM 아세트산나트륨/아세트산 완충액(pH 4.5) 또는 20 mM 인산염 완충액(pH 7.2)의 존재 하에서 1.5 ㎖ EP 튜브 내에서 6 ㎍의 sDSS1 단백질 또는 10 ㎍의 sDSS1 단백질과 혼합하고 12시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 로딩 완충액을 인큐베이션된 생성물에 첨가하고 균일하게 혼합하였고, 수득된 혼합물을 10분 동안 100℃에서 변성시켜 로딩 샘플을 제조하였다. 생성된 샘플을, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 통해 전기영동 분리하였다. 분리 후, SDS-PAGE 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 단백질 줄무늬를 표시하였다. sDSS1-M1 또는 sDSS1-M2 단백질을 oxLDL과 각각 혼합하고 인큐베이션하고 동일한 방식으로 처리하였다. SDS-PAGE 전기영동 분리를 위해 15 ㎕의 샘플을 사용하였다.
1.2 실험 결과
아세트산염 완충액 시스템(pH 4.5)에서, LDL 단백질 및 oxLDL 단백질이 약 70 kD(L1, L2)에 위치하고, sDSS1 단백질이 약 15 kD(L3, L6)에 위치함을 염색된 SDS-PAGE 겔로부터 발견하였다. LDL 또는 oxLDL을 sDSS1과 혼합하고 인큐베이션한 후, LDL 또는 oxLDL은 sDSS1 단백질과 상호작용하였다(L4 및 L7은 sDSS1 단백질을 갖는 LDL에 상응하였고, L5 및 L8은 sDSS1 단백질을 갖는 oxLDL에 상응하였다). SDS-PAGE 겔 상에서, 반응 시스템 내의 oxLDL 단백질 또는 LDL 단백질의 줄무늬는 sDSS1 단백질과 반응시킨 후 더 옅어지고; 반응 시스템 내의 sDSS1 단백질의 농도가 증가함에 따라, LDL 또는 oxLDL과 sDSS1 단백질에 의해 형성된 더 많은 복합체가 있었고, 분산된 줄무늬는 더 짙었다(L4 대 L7; L5 대 L8)(도 1a).
인산염 완충액 시스템(pH 7.2)에서, LDL 단백질 및 oxLDL 단백질은 약 70 kD(L1, L2)에 위치하고 sDSS1 단백질은 약 15 kD(L3, L6)에 위치함을 염색된 SDS-PAGE 겔로부터 확인하였다. LDL 또는 oxLDL을 sDSS1과 혼합하고 인큐베이션한 후, LDL 또는 oxLDL은 sDSS1 단백질과 상호작용하였다(L4 및 L7은 sDSS1 단백질을 갖는 LDL에 상응하였고, L5 및 L8은 sDSS1 단백질을 갖는 oxLDL에 상응하였다). SDS-PAGE 겔 상에서, 반응 시스템 내의 oxLDL 단백질 또는 LDL 단백질의 줄무늬는 sDSS1 단백질과 반응시킨 후 유의미하게 더 옅어지고; 반응 시스템 내의 sDSS1 단백질의 농도가 증가함에 따라, LDL 또는 oxLDL과 sDSS1 단백질에 의해 형성된 더 많은 복합체가 있었고, 분산된 줄무늬는 더 짙었다(L4 대 L7; L5 대 L8)(도 1b).
이 결과들은 sDSS1 단백질이 oxLDL 또는 LDL과 상호작용하여 SDS-PAGE에 의해 분리될 수 없는 복합체를 형성할 수 있음을 보여준다.
한편, sDSS1 단백질의 돌연변이체, 즉 sDSS1-M1 단백질 또는 sDSS-M2 단백질이 oxLDL과 함께 인큐베이션되었을 때, 돌연변이체 단백질과 oxLDL에 의해 형성된 복합체는 고분자량 영역에서 분산된 줄무늬를 나타내었고, 분산된 줄무늬는 돌연변이체 단백질의 함량이 증가함에 따라 더 짙어지고, 돌연변이체 단백질의 줄무늬는 유의미하게 더 옅어진다는 것도 알 수 있었다(도 1c, 도 1d). 이 결과들은 sDSS1-M1 및 sDSS1-M2 단백질이 oxLDL과도 상호작용하여, SDS-PAGE에 의해 분리될 수 없는 복합체를 형성할 수 있음을 보여준다.
실시예 2: sDSS1 단백질은 혈관 내피 세포에 의한 oxLDL의 흡수를 감소시킨다.
2.1 실험 재료 및 방법
실험 재료: sDSS1 단백질, DiL-oxLDL(써모 피셔 테크놀로지(Thermo Fisher technology), 제품 번호: L34358), 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)(프로모셀(PromoCell), 제품 번호: C-12200).
실험 방법: 웰당 300000개의 세포를 사용하여 HUVEC 세포를 6웰 플레이트에 접종하였다. 24시간의 부착 후, 1.5 ㎖의 10 ㎍/㎖ DiL-oxLDL을 첨가하였거나, 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 또는 20 ㎍/㎖의 sDSS1 단백질과 함께 1.5 ㎖의 10 ㎍/㎖ DiL-oxLDL을 첨가하였다. 인큐베이터에서 5시간 동안 인큐베이션한 후, 세포에서 형광 신호를 형광 현미경으로 관찰하였다. 유세포분석을 통해 형광 강도를 검출하기 위해 세포를 트립신으로 분해하여 단일 세포를 형성하였다.
2.2 실험 결과
DiL-oxLDL을 HUVEC 세포 배양 용액에 첨가하고 5시간 동안 인큐베이션하였을 때, 형광 현미경 하에서 분명한 형광이 HUVEC 세포에서 관찰되었고, 식세포성 소포는 형광 매트릭스에서 발생하였다. 더욱이, sDSS1s 단백질을 첨가한 후, 세포에서 형광 강도의 감소 및 세포에서 형광을 갖는 식세포성 소포의 수의 감소가 관찰되었다. 이 현상은 용량 의존적이다. 고농도 군에서, 세포 내의 형광은 약하였다(도 6a). 세포의 형광 강도를 유세포분석으로 검출함으로써, 2 ㎍/㎖ 또는 10 ㎍/㎖의 sDSS1 단백질이 첨가되었을 때, HUVEC 세포 내에서의 형광이 유의미하게 약해졌음을 보여주었다(도 6b). 통계적 결과도 sDSS1 단백질이 HUVEC 세포에서 형광 값을 유의미하게 감소시켰고, 이 효과가 용량 의존적이었음을 보여줌으로써, sDSS1 단백질이 세포에서 oxLDL의 흡수를 감소시킴을 암시하였다. 2 ㎍/㎖의 sDSS1 단백질을 배양 용액에 첨가한 후, 세포에 의한 oxLDL의 흡수는 절반 감소되었다. 이 결과들은 sDSS1 단백질이 HUVEC 세포에 의한 oxLDL 단백질의 흡수를 감소시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 3: sDSS1 단백질은 대식세포에 의한 oxLDL의 식세포작용을 억제한다.
3.1 실험 재료 및 방법
실험 재료: sDSS1 단백질, DiL-oxLDL, 포르볼(phorbol) 에스테르(PMA, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 제품 번호: P1585), 인간 단핵구 THP-1(Cell Bank of Typical Culture Preservation Committee of Chinese Academy of Sciences, 카탈로그 번호: SCSP-567).
실험 방법: 웰당 250000개의 세포를 사용하여 THP-1 세포를 6웰 플레이트에 접종하였고, 배양 용액은 100 ng/㎖ PMA를 함유하였다. 48시간 동안 PMA로 활성화시킨 후, 세포를 4일 동안 새로운 배양 배지에서 배양하여 세포 부착을 용이하게 하였다. 오래된 배양 배지를 따라버렸다. 1.5 ㎖의 10 ㎍/㎖ DiL-oxLDL을 첨가하였거나, 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 또는 20 ㎍/㎖의 sDSS1 단백질과 함께 1.5 ㎖의 10 ㎍/㎖ DiL-oxLDL을 첨가하였다. 인큐베이터에서 5시간 동안 인큐베이션한 후, 세포에서 형광 신호를 형광 현미경으로 관찰하였다. 유세포분석을 통해 형광 강도를 검출하기 위해 세포를 트립신으로 분해하여 단일 세포를 형성하였다.
3.2 실험 결과
DiL-oxLDL을 5시간 동안 대식세포에 첨가한 후, 세포에서 형광을 검출하였다. 대조군의 결과는 다양한 식세포성 소포들로 나타나는 대식세포에서 분명한 형광이 관찰될 수 있음을 보여줌으로써, 대식세포에 의한 oxLDL의 흡수를 시사한다. 그러나, sDSS1 단백질을 배양 용액에 첨가한 후, 분명한 형광이 세포에서 관찰되지 않았거나, 형광이 매우 약하였다(도 3a). 세포에서 형광 값을 유세포분석으로 검출하였다. 확인할 수 있는 바와 같이, 형광을 갖는 세포는 대조군에서 검출되었고, 2 ㎍/㎖ 또는 10 ㎍/㎖의 sDSS1 단백질이 첨가된 후 형광을 갖는 세포는 검출되지 않았다(도 3b). 이 결과들은 sDSS1 단백질이 대식세포에 의한 oxLDL 단백질의 흡수를 억제할 수 있음을 암시한다.
실시예 4: sDSS1 단백질은 간 세포에 의한 oxLDL의 식세포작용을 촉진하나, LDL의 식세포작용에는 영향을 미치지 않는다.
4.1 실험 재료 및 방법
재료: sDSS1 단백질, DiL-oxLDL, DiL-LDL(써모피셔(ThermoFisher), L3482), 인간 간 세포종 세포 Hep G2(Cell Bank of Typical Culture Preservation Committee of Chinese Academy of Sciences, 카탈로그 번호: SCSP-510).
실험 방법: ① Hep G2 세포에 의한 oxLDL의 식세포작용을 검출할 때, 웰당 250000개의 세포를 사용하여 Hep G2 세포를 6웰 플레이트에 접종하였다. 12시간 후, 모든 세포들이 부착되었다. 오래된 배양 배지를 따라버렸다. 1.5 ㎖의 10 ㎍/㎖ DiL-oxLDL을 첨가하였거나, 5 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 sDSS1 단백질과 함께 1.5 ㎖의 10 ㎍/㎖ DiL-oxLDL을 첨가하였다. 인큐베이터에서 9시간 동안 인큐베이션한 후, 세포에서 형광 신호를 형광 현미경으로 관찰하였다. 유세포분석을 통해 형광 강도를 검출하기 위해 세포를 트립신으로 분해하여 단일 세포를 형성하였다. ② Hep G2 세포에 의한 LDL의 식세포작용을 검출할 때, 웰당 250000개의 세포를 사용하여 Hep G2 세포를 6웰 플레이트에 접종하였다. 12시간 후, 모든 세포들이 부착되었다. 오래된 배양 배지를 따라버렸다. 1.5 ㎖의 10 ㎍/㎖ DiL-LDL을 첨가하였거나, 5 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 sDSS1 단백질과 함께 1.5 ㎖의 10 ㎍/㎖ DiL-LDL을 첨가하였다. 인큐베이터에서 10시간 동안 인큐베이션한 후, 세포에서 형광 신호를 형광 현미경으로 관찰하였다. 유세포분석을 통해 형광 강도를 검출하기 위해 세포를 트립신으로 분해하여 단일 세포를 형성하였다.
4.2 실험 결과
DiL-oxLDL을 9시간 동안 Hep G2 세포에 첨가한 후, 세포에서 형광을 형광 현미경으로 검출하였다. 결과는 명확한 형광이 다양한 식세포성 소포들로 나타나는, 대조군 및 실험군 둘 다의 세포들에서 관찰됨을 보여줌으로써, Hep G2 세포에 의한 oxLDL의 흡수를 시사한다(도 4a). 세포에서 형광 값을 유세포분석으로 검출하였다. 알 수 있는 바와 같이, Dil 형광 신호는 대조군의 HepG2 세포에서 검출될 수 있고, 배양 용액에의 5 ㎍/㎖ sDSS1의 첨가는 세포 내에서의 형광 수준에 유의미한 영향을 미치지 않는 반면, 50 ㎍/㎖의 sDSS1 단백질은 세포에서 DiL 신호 강도를 유의미하게 증가시킬 수 있다(도 4b). 유세포분석으로부터의 검출 결과를 요약하면, oxLDL을 흡수하는 Hep G2 세포의 능력은 50 ㎍/㎖ sDSS1 단백질을 배양 용액에 첨가한 후 대조군에 비해 27% 증가되었다(도 4c). 이 결과들은 sDSS1 단백질이 oxLDL 단백질을 흡수하는 인간 간 세포의 능력을 향상시킬 수 있음을 암시한다.
Dil-LDL을 10시간 동안 HepG2 세포 배양물에 첨가하였을 때, 형광 염료는 세포에서 나타났고 소포로 분산되었음을 관찰하였다. DiL-LDL만을 첨가한 군과 비교할 때, 5 ㎍/㎖ 또는 50 ㎍/㎖ sDSS1 단백질을 첨가한 후 DiL-LDL을 흡수하는 Hep G2 세포의 양은 유의미하게 변화되지 않았다(도 5a). 유세포분석을 통한 세포 분석 결과는 상이한 농도의 sDSS1 단백질을 첨가한 후, 세포 내의 형광 강도가 기본적으로 일관됨을 보여줌으로써(도 5b), sDSS1 단백질이 인간 간 세포에 의한 LDL의 흡수에 유의미한 영향을 미치지 않음을 암시한다.
이 결과들은 sDSS1 단백질이 인간 간 세포에 의한 oxLDL의 흡수를 증가시킬 수 있으나, 간 세포에 의한 LDL의 흡수에 유의미한 영향을 미치지 않음을 암시한다.
실시예 5: sDSS1 단백질의 투여는 ApoE-/- 마우스의 혈장에서 oxLDL 수준 및 oxLDL/LDL 비를 감소시킨다.
5.1 실험 재료 및 방법
실험 동물: 난징 대학의 난징 생체의학 연구소로부터 8주령 내지 10주령의 수컷 ApoE-/- 마우스를 구입하였다. 동물들을 실험 전에 1주 동안 동물 방에서 수용하였다.
실험 재료: sDSS1 단백질, oxLDL ELISA 키트(우한 엘라브사이언스 바이오테크놀로지 컴퍼니 리미티드(Wuhan Elabscience Biotechnology Co., Ltd.), 제품 번호: E-EL-M0066c), LDL ELISA 키트(우한 엘라브사이언스 바이오테크놀로지 컴퍼니 리미티드, 제품 번호: E-EL-M1363c)
실험 방법: ApoE-/- 마우스를 2개의 군, 즉 대조군과 sDSS1 단백질 군으로 무작위로 나누었다. 7일 동안, 200 ㎕의 생리염수를 대조군에 하루에 1회 복강내 주사하였고, 10 mg/kg의 sDSS1 단백질을 sDSS1 단백질 군에 하루에 1회 복강내 주사하였다. 7일의 투여 후, 마우스의 혈액을 채취하였고 항응고제로서 EDTA-Na을 사용하여 혈장을 분리하였다. oxLDL ELISA 키트를 사용하여 혈장 oxLDL 수준을 측정하였고, LDL ELISA 키트로 혈장 LDL 수준을 측정하였다.
100 ㎕의 oxLDL 표준물 또는 샘플을 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였고; 웰 내의 액체를 따라버렸고, 100 ㎕의 바이오티닐화된 oxLDL 항체 작업 액체를 첨가하고 60분 동안 37℃에서 인큐베이션하였고; 3회 세척하였고; 100 ㎕의 효소 결합 작업 용액을 첨가하고 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였고; 5회 세척하였고; 90 ㎕의 기질 용액을 첨가하고 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하였고; 50 ㎕의 종결 용액을 첨가하였고, 450 nm 파장에서 OD 값을 즉시 측정하였고; 표준 생성물로 표준 곡선을 확립하였고, 각각의 샘플의 oxLDL 수준을 표준 곡선에 따라 계산하였다.
100 ㎕의 LDL 표준물 또는 샘플을 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였고; 웰 내의 액체를 따라버렸고, 100 ㎕의 바이오티닐화된 LDL 항체 작업 액체를 첨가하고 60분 동안 37℃에서 인큐베이션하였고; 3회 세척하였고; 100 ㎕의 효소 결합 작업 액체를 첨가하고 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였고; 5회 세척하였고; 90 ㎕의 기질 용액을 첨가하고 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하였고; 50 ㎕의 종결 용액을 첨가하였고, 450 nm 파장에서 OD 값을 즉시 측정하였고; 표준 생성물로 표준 곡선을 확립하였고, 각각의 샘플의 LDL 수준을 표준 곡선에 따라 계산하였다.
oxLDL/LDL 비 = oxLDL 농도(ng/㎖) ÷ LDL 농도(ng/㎖)
5.2 실험 결과
7일 동안 10 mg/kg의 sDSS1 단백질을 ApoE -/- 마우스에게 복강내 주사한 후, 혈장 LDL 및 oxLDL 수준을 각각 측정하였다. 결과는 sDSS1 단백질을 투여받은 마우스에서 혈장 LDL 수준이 정상 수준으로 유지되고 대조군 마우스의 혈장 LDL 수준과 유의미한 차이를 갖지 않음을 보여준다(도 6a). 그러나, sDSS1 단백질의 주사는 마우스에서 혈장 oxLDL 함량을 유의미하게 감소시킬 수 있고, 억제 효과는 양성 대조군인 ATV의 억제 효과와 유사하다(도 6b). 추가 분석을 통해, sDSS1 단백질이 주사된 마우스의 혈장 oxLDL/LDL 비 또한 대조군 마우스의 혈장 oxLDL/LDL 비보다 유의미하게 더 낮은데, 이것은 양성 대조군인 ATV의 효과와 기본적으로 일치한다(도 6c). 결론적으로, sDSS1 단백질은 마우스의 혈장 oxLDL 수준을 감소시킬 수 있으나, 혈장 LDL 수준에 영향을 미치지 않음으로써, 최종적으로 혈장 oxLDL/LDL 비의 감소를 초래할 수 있다.
실시예 6: sDSS1 단백질은 ApoE-/- 마우스에서 죽상동맥경화성 플라크의 형성을 억제한다.
6.1 실험 재료 및 방법
실험 동물: 난징 대학의 난징 생체의학 연구소로부터 8주령의 수컷 ApoE-/- 마우스를 구입하였다. 실험 동물들을 실험 전에 1주 동안 동물 방에서 수용하였다.
재료: sDSS1 단백질, 아토르바스타틴(ATV).
실험 방법: 9주령부터 시작하는 0.25% 콜레스테롤 함유 고지방 정규식을 ApoE-/- 마우스에게 공급하였다. 고지방 정규식 공급 10주째부터, 마우스들을 총 콜레스테롤 수준에 따라 3개의 군들로 무작위로 나누었고, 이때 각각의 군에는 10마리의 마우스가 있었다. 200 ㎕의 생리염수를 모델 군에 하루에 1회 복강내 주사하였고, 40 mg/kg의 ATV를 양성 약물 군에 하루에 1회 경구 제공하였고, 3 mg/kg의 sDSS1 단백질을 sDSS1 군에 하루에 1회 복강내 주사하였다. 고지방 정규식 공급 22주째, 즉 투여 13주째에서, 동물들을 안락사시키고 해부하였고, 전체 대동맥을 분리하였다. 분리된 대동맥을 정면 오일 레드 O로 염색하여 죽상동맥경화성 플라크의 형성을 평가하였다.
6.2 실험 결과:
정면 염색의 결과는 모델 군에서 오일 레드 O에 의해 적색으로 염색되는 명확한 죽상동맥경화성 플라크가 마우스의 전체 대동맥에서 발생된 반면, 플라크를 갖지 않은 부분은 염색되지 않았고 투명하였음을 보여준다. 양성 약물 군에서, 마우스에서의 죽상동맥경화성 플라크의 면적은 모델 군 마우스에서의 죽상동맥경화성 플라크의 면적에 비해 유의미하게 감소되고, sDSS1 단백질 군의 마우스에서의 죽상동맥경화성 플라크의 면적은 모델 군 마우스에서의 죽상동맥경화성 플라크의 면적에 비해 유의미하게 감소된다(도 7a). 이미지 프로 플러스(Image Pro Plus)를 이용함으로써 오일 레드 O로 염색된 면적 및 총 대동맥 면적을 측정하였고 비를 계산하였다. ANOVA 분석은 양성 약물 군 및 sDSS1 단백질 군의 플라크 면적 비가 모델 군의 플라크 면적 비보다 유의미하게 더 작으나(**P < 0.01), 양성 약물 군과 sDSS1 단백질 군 사이에 플라크 면적 비의 유의미한 차이가 없음을 보여준다. 이 결과들은 sDSS1 단백질이 ApoE-/- 마우스에서 죽상동맥경화성 플라크의 형성을 유의미하게 억제할 수 있고 죽상동맥경화증의 진행을 늦출 수 있음을 암시한다.
참고문헌:
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<400> 1
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<211> 89
<212> PRT
<213> Pan troglodytes
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<212> PRT
<213> Pan paniscus
<400> 3
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<211> 89
<212> PRT
<213> Gorilla sp.
<400> 4
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<213> Pongo sp.
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<212> PRT
<213> Nomascus leucogenys
<400> 6
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<212> PRT
<213> Rhinopithecus roxellana
<400> 7
Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp
1 5 10 15
Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu
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<212> PRT
<213> Macaca mulatta
<400> 8
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Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu
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<210> 9
<211> 89
<212> PRT
<213> Rhinopithecus bieti
<400> 9
Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp
1 5 10 15
Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val
35 40 45
Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile
50 55 60
Lys Val Tyr Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Ile Leu His Gln Lys Gly
65 70 75 80
Arg Met Cys Ile Ala Phe Leu Cys Cys
85
<210> 10
<211> 89
<212> PRT
<213> Papio anubis
<400> 10
Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp
1 5 10 15
Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val
35 40 45
Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Lys
50 55 60
Lys Val Tyr Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Ile Leu His Gln Lys Gly
65 70 75 80
Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys
85
<210> 11
<211> 89
<212> PRT
<213> Colobus angolensis
<400> 11
Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp
1 5 10 15
Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val
35 40 45
Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile
50 55 60
Lys Val Tyr Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Ile Leu His Gln Lys Gly
65 70 75 80
Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys
85
<210> 12
<211> 89
<212> PRT
<213> Cercocebus atys
<400> 12
Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp
1 5 10 15
Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val
35 40 45
Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile
50 55 60
Lys Val Tyr Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Ile Leu His Gln Lys Gly
65 70 75 80
Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys
85
<210> 13
<211> 89
<212> PRT
<213> Mandrillus leucophaeus
<400> 13
Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp
1 5 10 15
Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val
35 40 45
Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile
50 55 60
Lys Val Tyr Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Ile Leu His Gln Lys Gly
65 70 75 80
Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys
85
<210> 14
<211> 89
<212> PRT
<213> Macaca nemestrina
<400> 14
Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp
1 5 10 15
Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val
35 40 45
Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile
50 55 60
Lys Val Tyr Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Ile Leu His Gln Lys Gly
65 70 75 80
Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys
85
<210> 15
<211> 89
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 15
Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp
1 5 10 15
Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val
35 40 45
Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile
50 55 60
Leu Val Ala Glu Thr Pro Tyr Gly Ala Tyr Val Leu His Gln Lys Gly
65 70 75 80
Arg Met Ala Ser Ala Phe Leu Ala Ala
85
<210> 16
<211> 89
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 16
Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp
1 5 10 15
Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val
35 40 45
Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile
50 55 60
Leu Val Val Glu Thr Pro Tyr Gly Val Tyr Val Leu His Gln Lys Gly
65 70 75 80
Arg Met Val Ser Ala Phe Leu Val Val
85
<210> 17
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 17
Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp
1 5 10 15
Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val
35 40 45
Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala
50 55
<210> 18
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 18
Thr Val Leu Leu Met Ile Leu Val Cys Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr
1 5 10 15
Val Leu His Gln Lys Gly Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys
20 25 30
Claims (69)
- 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에서 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산, 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 상기 개체에게 투여하는 단계, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 발현하는 세포, 또는 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체 또는 상기 핵산을 포함하는 조직 또는 장기를 상기 개체에 이식하는 단계, 및/또는 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체 또는 상기 핵산을 포함하는 혈청 또는 간질액을 상기 개체에 주입하는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산(들)의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 셀레노시스테인, D-아미노산 또는 합성 비천연 아미노산, 및 이들의 유도체를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편 및 서열번호 18에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편 및 막횡단 수송 기능을 달성하는 데 기여하는 단편을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 1개 내지 20개의 아미노산의 화학적 변형을 포함하는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 화학적 변형은 아미노 또는 글리코실화 변형, 지방산 변형, 아실화 변형, Fc 단편 융합, 알부민 융합, 페길화 변형, 덱스트란 변형, 헤파린 변형, 폴리비닐피롤리돈 변형, 폴리아미노산 변형, 폴리시알산 변형, 키토산 및 이의 유도체 변형, 렉틴 변형, 알긴산나트륨 변형, 카르보머 변형, 폴리비닐피롤리돈 변형, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 변형, 하이드록시프로필 셀룰로스 변형, 아세틸화 변형, 포르밀화 변형, 인산화 변형, 메틸화 변형 및/또는 설폰화 변형을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 벡터는 진핵생물 발현 플라스미드 벡터, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 바큘로바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 가성광견병 바이러스를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포는 인간의 줄기 세포, 전구 세포 또는 성체 세포 중 어느 한 세포인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 줄기 세포는 유도 다능 줄기 세포, 전환분화에 의해 얻은 세포, 또는 일차 배양으로부터 유래된 줄기 세포, 모세포로부터 분화된 다능 또는 단능 줄기 세포인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 조직은 뇌, 간, 신장, 비장 또는 췌도의 전체 장기 또는 부분 조직 덩어리, 또는 혈액, 지방, 근육, 골수 또는 피부인 방법.
- 제1항에 있어서, 지질저하제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 혈압강하제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 항응고제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 개체는 경피적 관상동맥 중재술, 관상동맥 우회로 이식술 또는 경동맥 내막절제술로 구성된 군으로부터 선택되는 외과 수술을 받고 있는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 동맥 혈관 벽 내의 지질 축적을 감소시키는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 지질은 혈중 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 트리글리세라이드, 킬로미크론(CM), 저밀도 지단백질(LDL), 초저밀도 지단백질(VLDL), 중밀도 지단백질(IDL), 지단백질 (a)(Lp(a)), 산화 저밀도 지단백질(oxLDL) 및 이들 각각의 대사 중간체 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환은 혈관 내경 협착, 혈관 외경 확장, 혈관수축 및 혈관확장 능력의 감소, 혈관 탄력의 감소, 혈관 취약성의 증가, 맥관결석 변성 또는 석회증, 및 혈전에 의해 유도된 혈관의 혈액 공급 능력의 감소를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환은 고혈압, 협심증, 심근 경색, 심근 혈액 공급 부족, 부정맥, 뇌 혈액 공급 부족, 허혈성 뇌졸중, 뇌 위축증, 신기능부전, 신동맥 협착증, 마비성 장폐색 또는 말단 허혈성 괴사를 포함하는 것인 방법.
- 혈관 내피에 의한 지질 흡수의 감소를 필요로 하는 개체에서 혈관 내피에 의한 지질 흡수를 감소시키는 방법으로서, 치료 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산(들)의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 셀레노시스테인, D-아미노산 또는 합성 비천연 아미노산, 및 이들의 유도체를 포함하는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편 및 서열번호 18에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편을 포함하는 것인 방법.
- 대식세포에서의 지질 축적의 감소를 필요로 하는 개체에서 대식세포에서의 지질 축적을 감소시키는 방법으로서, 치료 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산(들)의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 셀레노시스테인, D-아미노산 또는 합성 비천연 아미노산, 및 이들의 유도체를 포함하는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편 및 서열번호 18에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편을 포함하는 것인 방법.
- 간 세포에서의 지질 축적의 증가를 필요로 하는 개체에서 간 세포에서의 지질 축적을 증가시키는 방법으로서, 치료 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산(들)의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 것인 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 셀레노시스테인, D-아미노산 또는 합성 비천연 아미노산, 및 이들의 유도체를 포함하는 것인 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편 및 서열번호 18에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편을 포함하는 것인 방법.
- 개체의 혈관에서 순환 산화 LDL의 양을 감소시키는 방법으로서, 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체가 유리 산화 LDL과 복합체를 형성할 수 있는 것인 방법.
- 제44항에 있어서, 복합체를 형성하지 않은 유리 산화 LDL의 양 및 총 산화 LDL의 양을 감소시키는 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산(들)의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 것인 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 셀레노시스테인, D-아미노산 또는 합성 비천연 아미노산, 및 이들의 유도체를 포함하는 것인 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편 및 서열번호 18에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편을 포함하는 것인 방법.
- 개체의 혈관 내의 플라크 형성을 감소시키는 방법으로서, 유효량의 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체가 유리 산화 LDL과 복합체를 형성할 수 있는 것인 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 혈관은 동맥인 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 혈관은 대동맥인 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산(들)의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 것인 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 셀레노시스테인, D-아미노산 또는 합성 비천연 아미노산, 및 이들의 유도체를 포함하는 것인 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편 및 서열번호 18에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편을 포함하는 것인 방법.
- 혈관 내의 순환 유리 산화 LDL을 단백질-지질 복합체의 형태로 격리시키는 방법으로서, 상기 산화 LDL을 단백질에 노출시켜 혈관에서 단백질-지질 복합체를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 단백질이 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체인 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산(들)의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 것인 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 비천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.
- 제64항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 셀레노시스테인, D-아미노산 또는 합성 비천연 아미노산, 및 이들의 유도체를 포함하는 것인 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 서열번호 17에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편 및 서열번호 18에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단편을 포함하는 것인 방법.
- sDSS1 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체와 지질의 복합체.
- 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증 관련 질환을 치료하기 위한 치료제를 스크리닝하는 방법으로서, 상기 치료제를 sDSS1 단백질, sDSS1 단백질의 유전자, sDSS1 유전자의 조절 요소 및 sDSS1 유전자의 전사 생성물과 접촉시키는 단계, 및 sDSS1 단백질의 발현에 대한 상기 치료제의 효과를 평가하는 단계를 포함하는 방법.
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