JP2003530064A - 遺伝子治療用のコートタンパク質改変バキュロウイルス−ベクター - Google Patents
遺伝子治療用のコートタンパク質改変バキュロウイルス−ベクターInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は遺伝子治療用のコートタンパク質改変バキュロウイルスベクターに関する、適用範囲は医学、バイオテクノロジー及び遺伝子工学である。本発明の目的は、ウイルスの外被を改変することにより血液中で高い安定性を有し、かつ治療遺伝子がそのサイズとは無関係に哺乳類細胞中で高特異的及び有効に輸送及び樹立化することができるバキュロウイルスベクターの構築である。このベクターはヒトの遺伝子治療のために使用可能である。本発明によるベクターは昆虫ウイルス、特に代表的なバキュロウイルスからなるか又は核ポリヘドローシスウイルスからなり、このウイルスは次の成分：改変されたウイルスコートタンパク質、治療ＤＮＡ配列、遺伝子発現ように適したプロモータ及び場合により樹立化配列を含有する。
Description
【０００１】
本発明は、遺伝子治療用のコートタンパク質改変バキュロウイルスベクターに
関し、適用領域は医学、バイオテクノロジー及び遺伝子工学である。
関し、適用領域は医学、バイオテクノロジー及び遺伝子工学である。
【０００２】
過去数年において、遺伝子治療のための多数の方法及びベクターが開発されて
いる（Mulligan/1993/Science 260, 926参照）。この場合、多様なベクター、特
にレトロウイルス又はアデノウイルスから誘導されるベクターが使用される。両
方のウイルスベクタータイプは比較的広範囲に使用でき、この場合、レトロウイ
ルスベクターが分裂可能な細胞においてのみ有効であり、アデノウイルスは休止
細胞においても機能する。両方のベクタータイプは試験管内での肝細胞（Hepato
cyte）内への遺伝子輸送にとって適しているが、ヒトの場合の遺伝子治療のため
の生体内適応においてはほとんど問題とならない。一方でレトロウイルス性のベ
クターの適用にとって肝臓部分切除は細胞分裂（再生）の刺激のために必要であ
り、他方でアデノウイルス遺伝子輸送は著しくは安定あるとはいえない（ゲノム
内へ組み込まれない）。
いる（Mulligan/1993/Science 260, 926参照）。この場合、多様なベクター、特
にレトロウイルス又はアデノウイルスから誘導されるベクターが使用される。両
方のウイルスベクタータイプは比較的広範囲に使用でき、この場合、レトロウイ
ルスベクターが分裂可能な細胞においてのみ有効であり、アデノウイルスは休止
細胞においても機能する。両方のベクタータイプは試験管内での肝細胞（Hepato
cyte）内への遺伝子輸送にとって適しているが、ヒトの場合の遺伝子治療のため
の生体内適応においてはほとんど問題とならない。一方でレトロウイルス性のベ
クターの適用にとって肝臓部分切除は細胞分裂（再生）の刺激のために必要であ
り、他方でアデノウイルス遺伝子輸送は著しくは安定あるとはいえない（ゲノム
内へ組み込まれない）。
【０００３】
肝臓遺伝子輸送にとって潜在的な適用性を有するもう一つのベクターは、リポ
ソーム又はタンパク質ドメインを有する多成分−粒子をベースとし、これは肝臓
の特定のレセプター（例えばアシアログリコプロテイン−レセプター）に結合し
、かつこれが細胞内への内部移行によって取り込まれる（Vesland et al/1992/
Seminars in Liver Disease 12, 332参照）。このベクターの根本的な欠点は、
エンドソーム中で大部分のベクター及びそのＤＮＡの分解を引き起こすエンドサ
イトーシス経路での取り込みであるため、わずかな機能性ＤＮＡだけが細胞核へ
到達できるにすぎない。
ソーム又はタンパク質ドメインを有する多成分−粒子をベースとし、これは肝臓
の特定のレセプター（例えばアシアログリコプロテイン−レセプター）に結合し
、かつこれが細胞内への内部移行によって取り込まれる（Vesland et al/1992/
Seminars in Liver Disease 12, 332参照）。このベクターの根本的な欠点は、
エンドソーム中で大部分のベクター及びそのＤＮＡの分解を引き起こすエンドサ
イトーシス経路での取り込みであるため、わずかな機能性ＤＮＡだけが細胞核へ
到達できるにすぎない。
【０００４】
この問題の解決策は試験管内適用については見出されたが、生体内（患者）の
状態では適用できない。この解決策は、アデノウイルスでの標的細胞の同時感染
に基づいており、これはエンドソームの溶解及びベクター（ＤＮＡ）の放出を引
き起こす（Curiel, D.T., Agrawal, S., Wagner, E. and Cotten, M./1991, PNA
S 88, 8850-8854）。
状態では適用できない。この解決策は、アデノウイルスでの標的細胞の同時感染
に基づいており、これはエンドソームの溶解及びベクター（ＤＮＡ）の放出を引
き起こす（Curiel, D.T., Agrawal, S., Wagner, E. and Cotten, M./1991, PNA
S 88, 8850-8854）。
【０００５】
ドイツ国特許ＤＥ４４０７８５９明細書では、治療遺伝子を高特異的かつ効果
的に肝細胞内へ輸送することができるバキュロウイルス−ベクターが提案されて
いる。バキュロウイルスとは大きなＤＮＡ−ウイルスの種類に属し、この宿主ス
ペクトルはもちろんもっぱら節足動物に限定される。そのゲノム（８０ｋｂｐ〜
２００ｋｐｂ）はフレキシブルにヌクレオキャプシド内にパッケージングされ、
このヌクレオキャプシドは大量の外来ＤＮＡの挿入を可能にする。バキュロウイ
ルス遺伝子輸送のための決定的な条件は、哺乳動物細胞内で機能可能な発現カセ
ットの挿入である。それにより、肝臓の遺伝的疾患の治療のための重大な前提条
件が達成される。バキュロウイルス−ベクターによる肝細胞への遺伝子輸送の有
効性は、一般に血清成分により減少される（Sanding et al., 1996; Hum. Gen.
Ther. 7:1937-1945）。この遺伝子輸送の減少はおそらく、補体系によるバキュ
ロウイルス−ベクターの不活性化に起因し、生体内でのその遺伝子治療での使用
を著しく限定している。
的に肝細胞内へ輸送することができるバキュロウイルス−ベクターが提案されて
いる。バキュロウイルスとは大きなＤＮＡ−ウイルスの種類に属し、この宿主ス
ペクトルはもちろんもっぱら節足動物に限定される。そのゲノム（８０ｋｂｐ〜
２００ｋｐｂ）はフレキシブルにヌクレオキャプシド内にパッケージングされ、
このヌクレオキャプシドは大量の外来ＤＮＡの挿入を可能にする。バキュロウイ
ルス遺伝子輸送のための決定的な条件は、哺乳動物細胞内で機能可能な発現カセ
ットの挿入である。それにより、肝臓の遺伝的疾患の治療のための重大な前提条
件が達成される。バキュロウイルス−ベクターによる肝細胞への遺伝子輸送の有
効性は、一般に血清成分により減少される（Sanding et al., 1996; Hum. Gen.
Ther. 7:1937-1945）。この遺伝子輸送の減少はおそらく、補体系によるバキュ
ロウイルス−ベクターの不活性化に起因し、生体内でのその遺伝子治療での使用
を著しく限定している。
【０００６】
本発明の目的は、ウイルス外被の改変によって血清成分による不活化を回避し
、治療遺伝子を高特異的かつ有効に生体内肝細胞中へ輸送するバキュロウイルス
ベクターの構築である。
、治療遺伝子を高特異的かつ有効に生体内肝細胞中へ輸送するバキュロウイルス
ベクターの構築である。
【０００７】
本発明は請求項１及び１２により実現化され、従属形式請求項は有利な実施態
様である。
様である。
【０００８】
本発明の根底をなすコートタンパク質改変バキュロウイルスベクターを作成す
る技術は、突然変異及び選択又はバキュロウイルス外被の意図的な改変（レセプ
ターリガンドの挿入）により、非肝細胞の特異的「ターゲッティング」のための
宿主スペクトルの改変を可能にする広いスペクトルの新規の種類のベクターに帰
結する。本発明の範囲内で産生されるバキュロウイルス−ベクターの全体のスペ
クトルは、遺伝子治療のためのベクターに関する多様な要求についての解決策を
提示し、ヒトについての相応する適用について使用可能であるべきである。
る技術は、突然変異及び選択又はバキュロウイルス外被の意図的な改変（レセプ
ターリガンドの挿入）により、非肝細胞の特異的「ターゲッティング」のための
宿主スペクトルの改変を可能にする広いスペクトルの新規の種類のベクターに帰
結する。本発明の範囲内で産生されるバキュロウイルス−ベクターの全体のスペ
クトルは、遺伝子治療のためのベクターに関する多様な要求についての解決策を
提示し、ヒトについての相応する適用について使用可能であるべきである。
【０００９】
本発明によるベクターの治療ＤＮＡ配列として、治療すべき疾患において欠損
している、つまり欠けている又は突然変異により変更されている遺伝子のｃＤＮ
Ａが使用される。標的遺伝子内の突然変異を交差（ueberspannen）し、相同組み
替えすることができるゲノム配列の一部も使用することができる。
している、つまり欠けている又は突然変異により変更されている遺伝子のｃＤＮ
Ａが使用される。標的遺伝子内の突然変異を交差（ueberspannen）し、相同組み
替えすることができるゲノム配列の一部も使用することができる。
【００１０】
プロモータとしてまず第１に強力なウイルスプロモータ、有利にサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）のきわめて早期のプロモータが用いられる。
ウイルス（ＣＭＶ）のきわめて早期のプロモータが用いられる。
【００１１】
樹立化配列（Etablierungssequenz）は、ゲノム内へ組み込むことなく細胞中
でベクターを安定化させるという課題がある。この配列は特に長期間の発現が必
要な場合に使用される。本発明による有利な樹立化配列は、ウイルス性の核樹立
化配列、例えばエプスタイン−バーウイルス、又は哺乳類ゲノムからの自立複製
配列である。
でベクターを安定化させるという課題がある。この配列は特に長期間の発現が必
要な場合に使用される。本発明による有利な樹立化配列は、ウイルス性の核樹立
化配列、例えばエプスタイン−バーウイルス、又は哺乳類ゲノムからの自立複製
配列である。
【００１２】
新規ベクターの製造は、次の主要な工程で行われる：
Ｉ． 突然変異及び選択による方法（請求項２、実施例１）：
− ブロモデスオキシウリジンによるバキュロウイルスの突然変異誘発
− 突然変異したウイルスを血清と一緒にインキュベート
− 昆虫細胞でのプラーク−アッセイによる個々のウイルスクローンの単離
− 血清耐性及び感染スペクトルのスクリーニング
ＩＩ． 改変されたコートタンパク質の挿入による方法（請求項３〜６、実施例
２）： − 組換えベクター中でのバキュロウイルス性のプロモータの制御下でのＮ−末
端改変バキュロウイルス−コートタンパク質（ｇｐ６４）の配列のクローニング
ａ） − 治療ＤＮＡ配列をプロモータと一緒に含む構築物の組換えベクター内への組
み込み − 場合によるクローニング前又は後での樹立化配列の導入 − 昆虫ウイルスのＤＮＡと一緒に昆虫細胞内へ得られた構築物をトランスフェ
クション − 昆虫細胞培養の上澄みから昆虫細胞中にパッケージングされたベクターの獲
得 ｂ） − ウイルスパッケージング細胞中への構築物の適当な組み込み − 昆虫細胞内で治療発現カセットを備えた未改変ベクターの増殖によるコート
タンパク質改変−バキュロウイルスベクターの獲得 本発明により、今まで開発されたウイルスベクター（レトロウイルス、アデノ
ウイルス及び未改変バキュロウイルス）と比べて著しく利点を有する遺伝子輸送
用の新規種類のベクターが作成される。前記の利点には血液及び血清中での安定
性、肝臓特異性、細胞ターゲッティングの自由な変更、外来−ＤＮＡの組み込み
がほとんど制限なく可能、分裂可能でない細胞の感染、細胞毒性の欠損及び高い
力価の組換えウイルスの簡単な作成がある。
２）： − 組換えベクター中でのバキュロウイルス性のプロモータの制御下でのＮ−末
端改変バキュロウイルス−コートタンパク質（ｇｐ６４）の配列のクローニング
ａ） − 治療ＤＮＡ配列をプロモータと一緒に含む構築物の組換えベクター内への組
み込み − 場合によるクローニング前又は後での樹立化配列の導入 − 昆虫ウイルスのＤＮＡと一緒に昆虫細胞内へ得られた構築物をトランスフェ
クション − 昆虫細胞培養の上澄みから昆虫細胞中にパッケージングされたベクターの獲
得 ｂ） − ウイルスパッケージング細胞中への構築物の適当な組み込み − 昆虫細胞内で治療発現カセットを備えた未改変ベクターの増殖によるコート
タンパク質改変−バキュロウイルスベクターの獲得 本発明により、今まで開発されたウイルスベクター（レトロウイルス、アデノ
ウイルス及び未改変バキュロウイルス）と比べて著しく利点を有する遺伝子輸送
用の新規種類のベクターが作成される。前記の利点には血液及び血清中での安定
性、肝臓特異性、細胞ターゲッティングの自由な変更、外来−ＤＮＡの組み込み
がほとんど制限なく可能、分裂可能でない細胞の感染、細胞毒性の欠損及び高い
力価の組換えウイルスの簡単な作成がある。
【００１３】
コートタンパク質改変−バキュロウイルスベクターは改変に応じて、患者の該
当する器官内へ所望の遺伝子を導入しかつ機能箇所までの経路を最適に作り上げ
ることが可能である。ベクターの適用はこの場合局所的又は全身的に行うことが
できる。それによりヒトの遺伝的及び悪性の疾患の必要な治療のための本質的な
必要条件が達成される。
当する器官内へ所望の遺伝子を導入しかつ機能箇所までの経路を最適に作り上げ
ることが可能である。ベクターの適用はこの場合局所的又は全身的に行うことが
できる。それによりヒトの遺伝的及び悪性の疾患の必要な治療のための本質的な
必要条件が達成される。
【００１４】
本発明を次に実施例により詳説する。
【００１５】
実施例１：
Ｉ． 突然変異誘発及び選択による方法
バキュロウイルスによる遺伝子輸送は血清により減少する（先行技術）。
【００１６】
新規バキュロウイルスベクターは、昆虫細胞中でのブロモデスオキシウリジン
（５０μｇ／ｍｌ）によるバキュロウイルスの突然変異誘発（１０9ｐｆｕ）に
より製造した。ウイルス１０μｌを血清９０μｌと共に３０分間３７℃でインキ
ュベートした。個々のウイルスクローンを公知の方法での昆虫細胞でのプラーク
アッセイにより単離した。個々のウイルスプラークを肝臓細胞へのその感染能力
に関して新たな血清処理の後に試験した。この有効なウイルスの名称をBaculo-S
er(R)とした。変更された宿主スペクトルを有するウイルスも同様に単離された
。
（５０μｇ／ｍｌ）によるバキュロウイルスの突然変異誘発（１０9ｐｆｕ）に
より製造した。ウイルス１０μｌを血清９０μｌと共に３０分間３７℃でインキ
ュベートした。個々のウイルスクローンを公知の方法での昆虫細胞でのプラーク
アッセイにより単離した。個々のウイルスプラークを肝臓細胞へのその感染能力
に関して新たな血清処理の後に試験した。この有効なウイルスの名称をBaculo-S
er(R)とした。変更された宿主スペクトルを有するウイルスも同様に単離された
。
【００１７】
【外１】
【００１８】
実施例２：
Ｎ末端改変バキュロウイルス−コートタンパク質（ｇｐ６４）用の配列を組換
えベクター中でバキュロウイルスプロモータの制御下で公知の方法でクローニン
グした。この改変は、ＤＮＡレベルでのシグナル配列とバキュロウイルスｇｐ６
４の配列との間に補体−保護タンパク質の「崩壊促進因子（ＤＡＦ）」のアミノ
酸１〜３２０のためのＤＮＡ配列を挿入することにより達成される。この構築物
は治療ＤＮＡ配列をプロモータと一緒に含有する組換えベクター中でクローニン
グされるか又はウイルスパッケージングする細胞内へ安定に組み込まれる。ウイ
ルスを生産する場合、改変されたコートタンパク質はバキュロウイルス−ベクタ
ーの外被内へ挿入され、 − 補体−保護タンパク質又はグリコシルトランスフェラーゼの挿入による血清
耐性（請求項３及び５） − 特異的レセプターリガンドの挿入によるすでに証明された肝臓細胞特異性の
他の細胞タイプ特異的な感染 により媒介される。
えベクター中でバキュロウイルスプロモータの制御下で公知の方法でクローニン
グした。この改変は、ＤＮＡレベルでのシグナル配列とバキュロウイルスｇｐ６
４の配列との間に補体−保護タンパク質の「崩壊促進因子（ＤＡＦ）」のアミノ
酸１〜３２０のためのＤＮＡ配列を挿入することにより達成される。この構築物
は治療ＤＮＡ配列をプロモータと一緒に含有する組換えベクター中でクローニン
グされるか又はウイルスパッケージングする細胞内へ安定に組み込まれる。ウイ
ルスを生産する場合、改変されたコートタンパク質はバキュロウイルス−ベクタ
ーの外被内へ挿入され、 − 補体−保護タンパク質又はグリコシルトランスフェラーゼの挿入による血清
耐性（請求項３及び５） − 特異的レセプターリガンドの挿入によるすでに証明された肝臓細胞特異性の
他の細胞タイプ特異的な感染 により媒介される。
【００１９】
【外２】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１１年６月２１日（１９９９．６．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
Claims (13)
- 【請求項１】 次の成分： − 改変されたウイルスコートタンパク質、 − 治療ＤＮＡ配列、 − 哺乳類細胞中で発現するためのプロモータ、 − 及び場合により樹立化配列 を有するバキュロウイルスからなる遺伝子治療用ベクター。
- 【請求項２】 ウイルス−コートタンパク質の改変を血清耐性もしくは変更
された宿主スペクトルに関する突然変異及び選択により行う、請求項１記載のベ
クター。 - 【請求項３】 ウイルス−コートタンパク質の改変を、補体−保護タンパク
質、有利にＤＡＦ（崩壊促進因子, ＣＤ５５）、ＭＣＰ（膜補因子タンパク質,
ＣＤ４６）、ＣＤ５９（プロテクチン）又はこれらの組み合わせからなるタンパ
ク質の特異的挿入におり行う、請求項１記載のベクター。 - 【請求項４】 コートタンパク質の改変を、特異的レセプターリガンド、有
利にヘレグリン、スチールファクター、ＣＤ４又はトランスフェリンにより行う
、請求項１記載のベクター。 - 【請求項５】 ウイルス−コートタンパク質の改変をグリコシル化マスター
の変更により、有利にグリコシルトランスフェラーゼの媒介により行う、請求項
１記載のベクター。 - 【請求項６】 ウイルス−コートタンパク質の改変が、ウイルスゲノム内へ
相応して導入されたＤＮＡ配列により媒介されるか又は必要なＤＮＡ配列をウイ
ルスパッケージングするセルライン中へ安定に導入することにより達成される、
請求項１から５までのいずれか１項記載のベクター。 - 【請求項７】 治療ＤＮＡ配列として、治療すべき疾患において欠損してい
る１以上の遺伝子のｃＤＮＡを使用する、請求項１から６までのいずれか１項記
載のベクター。 - 【請求項８】 治療ＤＮＡ配列として、治療すべき疾患において欠損してい
る１以上の遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を使用する、請求項１から６までのいずれ
か１項記載のベクター。 - 【請求項９】 治療ＤＮＡ配列として、標的遺伝子中の突然変異を交差させ
、相同組換えにより遺伝子欠損の補修を行うゲノム配列の一部を使用する、請求
項１から６までのいずれか１項記載のベクター。 - 【請求項１０】 哺乳動物細胞中で発現するためのプロモータとして強いウ
イルス性のプロモータ又は細胞タイプ−特異的なプロモータを使用する、請求項
１から９までのいずれか１項記載のベクター。 - 【請求項１１】 樹立化配列として、ウイルス性の核樹立化配列、たとえば
エプスタイン−バーウイルスの樹立化配列又は自立増殖配列を使用する、請求項
１から１０までのいずれか１項記載のベクター。 - 【請求項１２】 バキュロウイルスのコートタンパク質を、 ａ） 血清耐性もしくは変更された宿主スペクトルに関する突然変異及び選択に
よるか又はｂ）バキュロウイルス−ゲノム内へ又はｃ）ベクター産生昆虫細胞内
へ改変のために必要なＤＮＡ配列を挿入することにより変更し、この治療ＤＮＡ
配列をプロモータ及び場合により樹立化配列と一緒にバキュロウイルスゲノム内
へ挿入し、ベクターを昆虫細胞培養の上澄みから獲得する、請求項１から１１ま
でのいずれか１項記載のベクターの製造方法。 - 【請求項１３】 ベクターを大量生産し、遺伝学的要因の疾患の治療のため
に患者に全身的又は局所的に投与することを特徴とする、請求項１から１２まで
のいずれか１項記載のベクターの使用方法。
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|---|---|---|---|
| DE1997135593 DE19735593C2 (de) | 1997-08-15 | 1997-08-15 | Hüllprotein-modifizierter Baculovirus-Vektor für die Gentherapie |
| DE19735593.5 | 1997-08-15 | ||
| PCT/DE1998/002255 WO1999009193A1 (de) | 1997-08-15 | 1998-08-05 | Hüllprotein-modifizierter baculovirus-vektor für die gentherapie |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP2000509856A Pending JP2003530064A (ja) | 1997-08-15 | 1998-08-05 | 遺伝子治療用のコートタンパク質改変バキュロウイルス−ベクター |
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| JP (1) | JP2003530064A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016059911A1 (ja) * | 2014-10-17 | 2016-04-21 | 国立大学法人金沢大学 | マラリアワクチン |
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|---|---|---|---|---|
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| WO2002096469A2 (en) * | 2001-05-29 | 2002-12-05 | Ark Therapeutics Ltd. | Gene delivery via a baculovirus vector |
| GB0119852D0 (en) | 2001-08-15 | 2001-10-10 | Univ York | Baculovirus |
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| KR101699142B1 (ko) | 2004-06-18 | 2017-01-23 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도 |
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