JP2003514565A

JP2003514565A - 非分裂細胞を不死化する能力をもつベクター及び前記ベクターで不死化された細胞

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Publication number: JP2003514565A
Application number: JP2001539890A
Authority: JP
Inventors: オチオドロ，テレサ; サルモン，パトリック; トローノ，ディディエ
Original assignee: Universite de Geneve
Current assignee: Universite de Geneve
Priority date: 1999-11-25
Filing date: 2000-11-24
Publication date: 2003-04-22
Also published as: EP1103615A1; US20090142841A1; AU2667901A; WO2001038548A3; EP1244798A2; WO2001038548A2; CA2389667A1

Abstract

(57)【要約】非分裂細胞又は緩分裂細胞のゲノム内に導入遺伝子を安定した形で組込む能力をもち、少なくとも１つの不死化分子を含むか又は発現するベクター、及び前記ベクターで不死化された細胞。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】当該技術分野においては、非分裂細胞又は緩分裂細胞が体内における卓越した
生命細胞型であり、肝、筋肉及び脳を含む遺伝子移入の最も望ましい標的を占め
ていることから、不死化により非分裂細胞又は緩分裂細胞を膨張させる方法に対
するニーズが長年にわたり感じられてきている。

【０００２】当該技術分野において実施された不死化研究の大部分は、オンコレトロウイル
スを使用してきた。しかしながら、オンコレトロウイルスといったような単純レ
トロウイルスは、おそらくは、これらのレトロウイルスの組込み前複合体のサイ
ズが嵩高である核孔を通してのその受動的拡散が妨げられるために、標的細胞の
ゲノム内に遺伝子を移入するのに有糸分裂前期において核膜の解離を必要とする
ことから、非分裂細胞又は緩分裂細胞を不死化することができない。

【０００３】かくして、これらのベクターのプロウイルス組込みのためには細胞分裂が必要
である。

【０００４】数多くの初代細胞の安定した遺伝子操作についての主要な１つの目的点は、細
胞が培養中に容易に分裂できないという点にある。このため特に、オンコレトロ
ウイルスベクターを含む従来の遺伝子送達系に対するその感受性は著しく減少す
る。レンチウイルスベクターは、in vitro及びin vivo両方での非分裂細胞内へ
の導入遺伝子のこの効率の良い送達、組込み及び長期発現を支配する能力をもつ
ことから、レンチウイルスから誘導されたベクターはこの考え方を変化させた。

【０００５】本発明は、非分裂細胞又は緩分裂細胞を不死化する能力をもつベクターを初め
て提供するものである。

【０００６】既知の送達系とは対照的に、本発明のベクターは、非分裂細胞又は緩分裂細胞
のゲノム内で少なくとも１つの不死化分子を安定した形で組込む能力をもつ。

【０００７】本発明のベクターは、以下の特長： − 非分裂細胞又は緩分裂細胞のゲノム内の導入遺伝子を安定した形で組込む
能力をもち、少なくとも１つの不死化分子を含むか又は発現する； − １つの細胞の核内に導入遺伝子を輸送し、前記細胞のゲノム内に前記導入
遺伝子を安定した形で組込む能力をもち、少なくとも１つの不死化分子を含む； − 非分裂細胞又は緩分裂細胞を不死化する能力をもつ； − 前記ベクターによって遺伝的に修飾された細胞の目的の表現型を不可逆的
に修飾しない； − 前記細胞の目的の表現型を不可逆的に修飾することなく細胞を不死化する
能力をもつの可能な組合せのうちの少なくとも１つ又は任意の１つを有している。

【０００８】本発明に従うと；「ベクター」という語は、場合によって少なくとも１つのタンパク質又はペプ
チドと集合させられた少なくとも１つの核酸分子を内含し、該ベクターは、導入
遺伝子を含有又は含み、該導入遺伝子を標的細胞内に導入する能力を有する。

【０００９】本書で使用される「導入遺伝子」という語は、細胞内で通常発現されない分子
を含む。

【００１０】「細胞」という語は、真核細胞を意味する。「細胞」という語には、ヒト又は
動物由来の細胞が内含される。

【００１１】「分子」という語は、核酸分子、ペプチド又はタンパク質を内含する。

【００１２】「核酸分子」という語には、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれ
らの組合せが含まれる。

【００１３】「核酸分子」という語には、転写調節分子に動作可能な形で連結されたＤＮＡ
、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの組合せが内含される。

【００１４】「転写調節分子」という語には、プロモーター、エンハンサー、又はウイルス
転写調節分子が含まれる。好ましくは、転写調節分子は、モロニーマウス白血病
ウイルスプロモーター／エンハンサー要素、ヒトサイトメガロウイルスエンハン
サー又はワクシニアＰ７．５プロモーターである。モロニーマウス白血病ウイル
スプロモーター−エンハンサー要素といったような一部のケースでは、これらの
プロモーター／エンハンサー要素は、ＬＴＲ配列内又はそれに隣接して存在する
。もう１つの好ましい転写調節分子は、ウイルスＬＴＲプロモーター／エンハン
サーシグナルである。転写調節分子は、所望の遺伝子配列に対し相同又は非相同
でありうる。特定の細胞個体群における遺伝子配列の発現をターゲティングする
ために、細胞又は組織特異的転写調節分子を利用することができる。本発明の実
施において使用するのに適した哺乳動物及びウイルスプロモーターは、周知のも
のであり、当該技術分野において容易に入手可能である。

【００１５】「核」という語には、真核細胞内の染色体を含む物質が内含され、この物質は
核外被により制限されている。

【００１６】本書で使用されている「非分裂細胞」という語は、以下の定義を有することが
できる： − 細胞周期のさまざまな段階で遮断される細胞。非分裂細胞が遮断される細
胞周期のさまざまな段階とは、Ｇ０，Ｇ１，Ｓ，Ｇ２，前期、前中期、及び中期
段階である； − 非増殖細胞； − 成長停止細胞； − 分裂終了細胞； − 非有糸分裂細胞； − 休止細胞； − 終期分化細胞； − 核被包が破れていない細胞 − 初代細胞； − 非腫瘍細胞； − 未処理細胞。

【００１７】非分裂細胞の例としては、初代細胞、内分泌細胞、内皮細胞、肝臓洞様内皮細
胞、β細胞、肝細胞、造血細胞、幹細胞、始原細胞、神経細胞、神経幹細胞、リ
ンパ球、樹状細胞、上皮細胞、顆粒細胞及びマクロファージがある。

【００１８】本書で使用される「緩分裂細胞」という語は、以下の定義を有する可能性があ
る： − in vitro（インビトロ）で緩慢に分裂しており、分裂誘発処理なく分裂を
停止する細胞； − その最後の分裂又はその最後の平板固定から２０，２４，２８，３２，３
６，４０，４４，４８，５２，５６，６０，６４，６８，７２，７６，８０，８
４，８８，９２又は９６時間以上後で分裂する細胞； − オンコレトロウイルスによる感染、形質導入及び／又は不死化を受けるこ
とのできない細胞； − その目的の表現型の修飾なくオンコレトロウイルスによる感染、形質導入
及び／又は不死化を受けることのできない細胞。

【００１９】緩分裂細胞の例としては、一部の初代細胞、一部の特異的筋芽細胞、一部の特
異的ケラチノサイト及び一部の特異的線維芽細胞がある。

【００２０】本書で使用される「初代細胞」という語は、以下の定義を有し得る： − 動物から直接得られ、展開のための処置を受けたことのない細胞； − （平板固定される、すなわち皿又はフラスコといった組織培養基板に付着
される前に）脊椎動物の組織供給源から分離された細胞懸濁液中に存在する細胞
； − 組織から誘導された外植体内に存在する細胞； − 初めて平板固定された２つの前述の細胞型の両方； − 上述の平板固定された細胞から誘導された細胞懸濁液。

【００２１】「遺伝的修飾された」という表現は、感染、トランスフェクション、組込み及
び／又は形質導入を受けていることを意味する。

【００２２】「不死化分子」というのは、単独で又は少なくとも１つのさらなる不死化分子
と組合わせた形で少なくとも１つの細胞型を不死化する能力をもつ分子である。
本発明に従った「不死化分子」の意味が付与されるには、少なくとも１つのその
他の不死化分子と組合せた状態でのみ細胞を不死化できる分子が、前記組合せの
不死化効果にとって不可欠なものでなくてはならない。「不可欠な」というのは
、不死化分子がその組合せに対し抑制されている場合にその組合せの不死化効果
が消失することを意味しうる。

【００２３】好ましくは、本発明の「不死化分子」は、in vivo（インビボ）での催腫瘍性
の不在を提示する。

【００２４】「不在化分子」は、細胞の非分裂又は緩分裂状態の原因となる遺伝子の発現の
負の調節を行なう分子でありうる。「負の調節を行なう」という語は、前記遺伝
子の発現の抑制を意味し得る。細胞の非分裂又は緩分裂状態の原因となる遺伝子
は、腫瘍抑制遺伝子でありうる。１つの細胞の非分裂又は緩分裂状態が、遺伝子
の発現と結びつけられる場合、不死化分子は、翻訳レベルでのその遺伝子の発現
と干渉する分子であり得る。このアプローチでは、例えば、特異的ｍＲＮＡをア
ンチセンス核酸又は３重らせん作用物質でマスキングすること又はリボザイムで
それを分割することにより、このｍＲＮＡの転写又は翻訳を遮断するため、アン
チセンス核酸、リボザイム又は３重らせん作用物質が利用される。アンチセンス
核酸は、特異的ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に対し相補的であるＤＮＡ又は
ＲＮＡ分子である（Weintranb, Scientific American, ２６２：４０，１９９０
）。細胞の中で、アンチセンス核酸は、対応するｍＲＮＡにハイブリッド形成し
て、２本鎖分子を形成する。アンチセンス核酸は、該細胞が２本鎖のｍＲＮＡを
翻訳しないことから、ｍＲＮＡの翻訳を干渉する。約１５個のヌクレオチドのア
ンチセンスオリゴマーは容易に合成され、標的細胞内に導入されたときこれより
大きな分子に比べ目的をひき起こす確率が低いことから好まれる。遺伝子のin v
itro翻訳を阻害するためにアンチセンス方法を使用することは、当該技術分野に
おいて周知のことである（Marcus Sakura, Anal. Biochem., 172: 289, 1988）
。３重らせん方法は、転写を避けるためオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴ
マーは２重らせんＤＮＡのまわりに巻き付き、３本鎖らせんを形成する。３重ら
せん化合物を、選択された遺伝子上のユニークな部位を認識するように設計する
ことができる（Maher., et al., Antisense Res.及びDev., 1(13); 227, 1991;
Helene, C., 抗ガン剤の設計、6(6); 569, 1991）。リボザイムは、ＤＮＡ制限
エンドヌクレアーゼと類似の形でその他の１本鎖ＲＮＡを特異的に分割する能力
を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修
飾によって、ＲＮＡ分子内の特異的ヌクレオチド配列を認識しそれを分割する分
子を工学処理することが可能である。このアプローチがもつ主要な利点は、配列
特異的であるために、特定の配列をもつｍＲＮＡのみが不活性化されるという点
にある。

【００２５】「不死化」という語は、不死化された細胞を得るための方法を意味しうる。

【００２６】「不死化された細胞」という語は、以下の定義を有し得る： − 遺伝子的に工学処理された細胞内の不死化分子（単複）の発現のため細胞
に対し改変された成長特性を付与する少なくとも１つの「不死化分子」の導入に
起因して、培養中で無限に成長する能力をもつ細胞； − 無限の生命をもつ細胞； − 無限の増殖をもつ細胞； − 無限の寿命をもつ細胞； − 培養条件が維持された場合に分裂を停止しない細胞； − 少なくとも２５，３０，３５，４０，４５，５０又は６０継代中又は少な
くとも１００，１２０，１４０，１６０，１８０又は２００個体群倍加中、又は
少なくとも３，４，５，６，７又は８カ月の間、培養中又はin vitroで維持され
得る細胞； − その細胞の通常の継代、個体群倍加又は寿命の数の２，３，４，５又は１
０倍である少なくとも一定数の継代、個体群倍加又は寿命の数の間、培養中又は
in vitroで維持され得る細胞。細胞の通常の継代、個体群倍加又は寿命数という
のは、細胞の継代、個体群倍加又は寿命数を増大する能力をもつ何らかの作用物
質なしでこの細胞が培養された場合のその継代、個体群倍加又は寿命数を意味し
得る。

【００２７】特定の細胞の「目的の表現型」という語には、前記特異的細胞のユーザーが関
心をもつ表現型が内含される。１つの細胞の「目的の表現型」は、細胞のタイプ
及びこの細胞のその後の用途に応じて変動し得る。筋芽細胞の目的の表現型は、
好ましくはその分化能力、より特定的には、多核筋管に対するその正常な融合能
力である。ケラチノサイトの目的の表現型は好ましくは、in vitroで正常な表皮
等価物を形成するその能力である。内皮細胞の目的の表現型は、好ましくは、Ｌ
ＤＬレセプター及びフォンウィルブランド因子、食作用及び開窓の存在である。

【００２８】より一般的には、細胞の「目的の表現型」は、そのもとの分化状態、すなわち
この細胞が不死化された時点で非分裂又は緩増殖細胞であった場合のこの細胞の
分化状態であり、そうでなければ、不死化された時点で、非分裂又は緩増殖細胞
であったこの細胞の祖先の目的の表現型である。細胞が末端分化を受けている場
合、この細胞の目的の表現型は好ましくはその分化状態であり得る。細胞が完全
に分化されていない場合（幹細胞、始原細胞、初代β細胞）、この細胞の目的の
表現型は好ましくは、その分化能力であり得る。

【００２９】目的の表現型は、その細胞について天然に発生する表現型であってよく、また
あるいは、細胞の遺伝的修飾の結果としてもたらされる表現型であり得る。かか
る修飾は、不死化の前又は後で発生し得る。

【００３０】本発明のベクターは、好ましくは欠損性である。

【００３１】本発明に従うと、「欠損性ベクター」というのは、標的細胞に侵入する能力を
もつもののこの標的細胞を離れる能力をもついずれのウイルス粒子も産生するこ
とのできないベクター、又はその標的細胞を腫瘍細胞に形質転換しないベクター
であり得る。「腫瘍細胞」という語には、動物の体内に導入された時点で腫瘍を
ひき起こす細胞が内含される。

【００３２】ベクターがレトロウイルスである場合、「欠損性レトロウイルス」という語は
以下の定義を有し得る： − このレトロウイルスでの標的細胞のトランスフェクション又は感染の後標
的細胞内に包膜され得ないレトロウイルス； − 感染性ビリオン内へのレトロウイルスＲＮＡの包膜又はパッケージング
に必要とされるウイルス構造タンパク質のすべてを内含しないレトロウイルス； − 包膜に必要とされるウイルス構造因子の少なくとも１つを内含しないレト
ロウイルス； − ゲノムＲＮＡの包膜を妨げるシス欠損をもつレトロウイルス。

【００３３】好ましい実施形態においては、本発明のベクターは、不死化分子として少なく
とも１つの増殖分子、少なくとも１つの抗老化分子、少なくとも１つの抗アポト
ーシス分子及び／又は細胞の分化経路を修飾する能力をもつ少なくとも１つの分
子を含む。

【００３４】「増殖分子」という表現は、以下の定義を有し得る： − 単独で又はもう１つの分子と組合わさった形で細胞の増殖又は分裂を誘発
する能力をもつ分子。本発明に従った「増殖分子」の意味が付与されるには、少
なくとも１つのその他の分子と組合わさった形でのみ細胞の増殖又は分裂を誘発
できる分子が、前記組合せの増殖又は分裂効果にとって不可欠なものでなくては
ならない。「不可欠な」というのは、増殖分子がその組合せに対し抑制されてい
る場合にその組合せの増殖又は分裂効果が消失することを意味しうる。 − 細胞の有糸分裂への侵入及び／又は有糸分裂侵入後の有糸分裂の各段階を
誘発できる分子。

【００３５】本発明に従うと、「増殖分子」という語は、「成長プロモーター」又は「細胞
周期誘発物質」と同義に用いられる。

【００３６】好ましい増殖分子は、発ガン遺伝子、ｍｙｃ様分子（機能的にｍｙｃと等価の
分子）、ｓｒｃ様の分子（機能的にｓｒｃと等価の分子）、結合性腫瘍抑制遺伝
子Ｒｂ及びｐ５３によって作用するＳＶ４０大型Ｔ抗原、アデノウイルスＥ１Ａ
，ヒト乳頭腫ウイルスＥ６又はＥ７，ｖ−ｍｙｃ，Ｂｍｉ−１，Ｓｒｃ及びｒａ
ｓである。

【００３７】特に好ましい増殖分子はＢｍｉ−１である。

【００３８】「抗老化分子」という語には、テロメアーの摩滅を防ぐか又は低減させる分子
が含まれる。

【００３９】好ましい抗老化作用物質は、細胞分裂の数が増大するにつれて発生するテロメ
アーの漸進的な短縮を防ぐテロメラーゼである。

【００４０】好ましい抗アポトーシス分子は、Ｂｃｌ−２様（機能的にＢｃｌ−２と等価の
分子）及びＦＬＩＰ様の分子（機能的にＦＬＩＰと等価の分子）である。

【００４１】好ましい抗アポトーシス分子はＢｃｌ−２及びＦＬＩＰである。

【００４２】好ましくは、本発明のベクターは、Ｂｃｌ−２ファミリの抗アポトーシス分子
のうちの少なくとも１つ及び／又は、ＦＬＩＰファミリの抗アポトーシス分子の
少なくとも１つを含む。

【００４３】好ましくは、本発明のベタクーは、Ｂｃｌ−２及び／又はＦＬＩＰを含む。

【００４４】「細胞の分化経路を修飾する能力をもつ分子」という語は、１つの細胞の分化
プログラム又は分化経路を遅延、停止、修飾又は加速する能力をもつ分子を内含
する。

【００４５】細胞の分化経路を修飾する能力をもつ好ましい分子は、Notchレセプターであ
る。

【００４６】好ましくは、本発明のベクターは、１つの不死化分子を含む。

【００４７】好ましくは、本発明のベクターは、１つの増殖分子を含む。

【００４８】好ましくは、本発明のベクターは、少なくとも１つの増殖分子及び少なくとも
１つの抗老化分子を含む。

【００４９】好ましくは、本発明のベクターは、Ｂｍｉ−１及びテロメラーゼを含む。

【００５０】好ましくは、本発明のベクターは少なくとも１つの増殖分子及び少なくとも１
つの抗アポトーシス分子を含む。

【００５１】好ましくは、本発明のベクターは、少なくとも１つの増殖分子、少なくとも１
つの抗老化分子及び少なくとも１つの抗アポトーシス分子を含む。

【００５２】好ましくは、本発明のベクターは、Ｂｍｉ−１、テロメラーゼ、及びＢｃｌ−
２を含む。

【００５３】好ましくは、本発明のベクターは、ＳＶ４０大型Ｔ抗原、Ｂｍｉ−１、テロメ
ラーゼ及びＢｃｌ−２を含む。

【００５４】特に好ましい実施形態に従うと、各々異なる不死化分子を含む不死化用分子が
、ベクターカクテルの形で使用される。カクテル中の異なる不死化分子の組合せ
効果は、その細胞を不死化させるということにある。例えば、カクテルは、増殖
分子といったような第１の不死化分子を含有する第１の不死化分子及び抗老化分
子といったような第２の不死化分子を含有する第２のベクターを含む。

【００５５】この実施形態に従うと、各ベクターは通常、１つの不死化分子を含むが、時と
して、特に２つといった複数の分子を使用することができる。例えば２，３又は
４といったように２つ以上のベクターの組合せを使用することもできる。特に好
ましいカクテル（すなわち異なるベクター上の不死化分子の組合せ）は、増殖分
子／抗老化分子；増殖分子／抗アポトーシス分子といったものである。本発明
の方法は、形質導入効率が高く同じ細胞内への多数のベクターの導入を可能にす
ることから、かかるカクテルの使用に特に適合させられている。

【００５６】好ましい実施形態においては、本発明のベクターは、前記ベクターの標的細胞
型に特異的である転写調節因子を含む。

【００５７】好ましい実施形態では、本発明のベクターは、このベクターを組込んだ細胞の
脱不死化系を含む。

【００５８】「脱不死化」という語には、不死化された細胞の不死化された表現型を抑制す
る方法が内含される。

【００５９】好ましい脱不死化は、標的細胞内に不死化分子が組込まれた後の本発明のベク
ター内に含まれたこの不死化分子の欠失を可能にする系である。

【００６０】特に好ましい脱不死化系は、ｌｏｘＰ／ｃｒｅ組換え／欠失系である。

【００６１】好ましい実施形態においては、本発明のベクターは、標的細胞内に不死化分子
が組込まれた後の前記ベクター内に含まれたこの不死化分子の欠失を可能にする
系を含む。

【００６２】好ましい１実施形態においては、本発明のベクターは、少なくとも１つのlox
Ｐ部位を含む。

【００６３】特に好ましい実施形態においては、本発明のベクターは、レトロウイルスであ
る。

【００６４】好ましくは、本発明のレトロウイルスはレンチウイルスである。

【００６５】「レトロウイルス」には、ウイルスゲノムがＲＮＡであるＲＮＡウイルスが内
含される。宿主細胞がレトロウイルスに感染させられた時点で、ゲノムＲＮＡは
、感染した細胞の染色体ＤＮＡ内に非常に効率良く組込まれるＤＮＡ中間体の中
に逆転写される。この組込まれたＤＮＡ中間体は、プロウイルスと呼ばれる。

【００６６】特に好ましい実施形態においては、本発明のベクターは、ＧＡＧの少なくとも
１つのタンパク質の少なくとも１つの機能を支持する少なくとも１つの成分、Ｐ
ＯＬの少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの機能を支持する少なくと
も１つの成分、前記ベクターの付着及び標的細胞内への侵入を可能にする成分、
前記ベクターの核タンパク質複合体を前記ベクターの標的細胞の核内に輸送する
ことのできる少なくとも１つの要素及び逆転写及び組込みに必要なシス作用性要
素といった成分を含む。

【００６７】上述の成分は、ベクターのレトロウイルスゲノム及び／又はプロウイルスＤＮ
Ａ内に含まれ得る。

【００６８】上述の成分は、レトロウイルスゲノムと集合させられたタンパク質内に含まれ
得る。

【００６９】ＧＡＧの少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの機能を支持する成分
は、すべて又は部分的に、基質、カプシド及び／又はヌクレオカプシドから誘導
され得る。

【００７０】ＰＯＬの少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの機能を支持する成分
は、インテグラーゼ及び／又はＲＮＡ誘導されたＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵
素）からすべて又は部分的に誘導され得る。

【００７１】本発明のベクターの付着及び標的細胞内への侵入を可能にする成分は、好まし
くはウイルスＥＮＶである。

【００７２】ウイルスＥＮＶは好ましくは、広宿主性（amphotropic）又は狭宿主性（ecotr
opic）である。

【００７３】ウイルスＥＮＶは好ましくは、モロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）及び水疱性
口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ＥＮＶからなる群より選択される。

【００７４】前述の「前記ベクターの核タンパク質複合体をこのベクターの標的細胞の核内
に輸送できる要素」には、前記ベクターの核タンパク質複合体と会合させられ、
前記ベクターの標的細胞の核移入機構により認識される要素が内含される。

【００７５】本発明の実施において使用するように考慮されているようなベクターの核タン
パク質複合体と（直接的に又は間接的に）結合し標的細胞の核移入機構により認
識される要素には、例えば基質タンパク質（ＭＡ）、イングラーゼ（ＩＮ）など
といったような標的細胞の核移入機構により直接認識されるウイルスタンパク質
、ならびに例えば逆転写酵素（ＲＴ）、ヌクレオカプシド、プロテアーゼなどと
いったような（標的細胞の核移入機構により認識される作用物質及び核タンパク
質複合体と会合させることによって）非分裂細胞の核移入機構によって間接的に
認識されるウイルスタンパク質が内含される。

【００７６】好ましくは、「前記ベクターの標的細胞の核の中に前記ベクターの核タンパク
質複合体を輸送できる要素」は、逆転写酵素、基質タンパク質、ヌクレオカプシ
ド、プロテアーゼ、インテグラーゼ及びｖｐｒからなる群より選択される。

【００７７】好ましい「前記ベクターの標的細胞の核の中に前記ベクターの核タンパク質複
合体を輸送できる要素」は、レンチウイルスインテグラーゼ特にＨＩＶインテグ
ラーゼである。

【００７８】好ましくは、「前記ベクターの標的細胞の核の中に前記ベクターの核タンパク
質複合体を輸送できる要素」は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。

【００７９】当業者であれば、本書で使用するのに適したＮＬＳを容易に同定することがで
きる。例えば、TIBS16;478-481(1991)中でDingwall 及び Laskey により、また
Science271;1 513〜1518(1996)中でGoerlich及びMattajにより記述されている数
多くのＮＬＳ配列を参照のこと。例えば、適切なＮＬＳをＨＩＶ−１インテグラ
ーゼから誘導することができる。核親和性を示し、かくして本書で有用であるも
う１つのタンパク質は、Ｖprである。さらに、当該技術分野では、１７のアミノ
酸の隣接配列を含むものとして特徴づけされ、ここで最初の２つのアミノ酸が塩
基性アミノ酸でありその後に任意の１０個のアミノ酸のスペーサ領域、そしてそ
の後に、次の５つのアミノ酸のうちの少なくとも３つが塩基性である塩基性クラ
スタが続いている、コンセンサスＮＬＳも同定されてきた。さらに、当該技術分
野では、例えばアミノ酸配列ＫＲＫＱ（配列番号１：ＬｙｓＡｒｇＬｙｓ
Ｇｌｎ），アミノ酸配列，ＫＥＬＱＫＱ（配列番号２：ＬｙｓＧｌｕＬｅｕ
ＧｌｎＬｙｓＧｌｎ），アミノ酸配列，ＫＲＫＧＧＩＧ（配列番号３：Ｌ
ｙｓＡｒｇＬｙｓＧｌｙＧｌｙＩｌｅＧｌｙ），アミノ酸配列ＰＲ
ＫＫＲＫＶ（配列番号４：ＰｒｏＬｙｓＬｙｓＬｙｓＡｒｇＬｙｓ
Ｖａｌ），アミノ酸配列ＡＡＦＥＤＬＲＶＬＳ（配列番号５：ＡｌａＡｌａ
ＰｈｅＧｌｕＡｓｐＬｅｕＡｒｇＶａｌＬｅｕＳｅｒ），酵母Ｇ
ＡＬ４ターゲティングシグナルなどの数多くの特異的核局在化シグナルが同定さ
れてきた。

【００８０】好ましくは、核局在化シグナルがＨＩＶ−１インテグラーゼから誘導される。

【００８１】好ましくは、「前記ベクターの標的細胞の核の中に前記ベクターの核タンパク
質複合体を輸送できる要素」は、標的細胞の核移入機構によって認識されるよう
その自然の構造との関係において修飾又は突然変異を受けている。

【００８２】好ましくは、「前記ベクターの標的細胞の核の中に前記ベクターの核タンパク
質複合体を輸送できる要素」は、核親和性成分をそれに添加することによって修
飾される。

【００８３】好ましくは、「前記ベクターの標的細胞の核の中に前記ベクターの核タンパク
質複合体を輸送できる要素」は、核局在化シグナルをそれに添加することによっ
て修飾される。

【００８４】好ましくは、「前記ベクターの標的細胞の核の中に前記ベクターの核タンパク
質複合体を輸送できる要素」は、すべて又は部分的にレンチウイルスから誘導さ
れている。

【００８５】好ましい１実施形態においては、本発明のベクターは少なくとも１つの核親和
性成分を含む。

【００８６】核親和性成分は、レンチウイルスの基質、ｕｐｒ又はインテグラーゼ成分の１
部でありうる。

【００８７】核親和性成分は、レンチウイルスの修飾された又は突然変異を受けた基質、ｕ
ｐｒ又はインテグラーゼ成分であり得る。

【００８８】「レンチウイルス」という語には、ＨＩＶ，ＳＩＶ，ＦＩＶ，ＢＩＶ，ＥＩＡ
Ｖ，ＶＩＳＮＡ又はＣＡＥＶが内含される。

【００８９】もう１つの好ましい実施形態では、本発明のベクターはそのゲノム内に、２つ
の長い末端反復（ＬＴＲ）分子、特にレンチウイルスからのＬＴＲである２つの
さらなる成分を含む。

【００９０】２つの長い末端反復（ＬＴＲ）分子は好ましくは、それぞれ５′及び３′ＬＴ
Ｒである。

【００９１】本発明の好ましいベクターにおいては、ゲノムの逆転写に必要な分子（ｔＲＮ
Ａプライマー結合部位）そして場合によっては同様に粒子内へのウイルスＲＮＡ
の効率の良い包膜に必要な分子（Ψ部位）も、５′ＬＴＲに隣接している。

【００９２】２つの長い末端反復（ＬＴＲ）分子は好ましくは、本発明のベクターのゲノム
にフランキングする。

【００９３】ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写及びポリアデニル化を促進するのに役立つ。

【００９４】ＬＴＲは、ウイルス複製に必要なその他のすべてのシス作用性分子を含有する
ことができる。

【００９５】本発明のベタクーのＬＴＲは、組換え部位を含むことができる。

【００９６】本発明のベクターのＬＴＲ内に含まれ得る好ましい組換え部位は、loxＰ部位
である。

【００９７】好ましくは、本発明のベクターは、ｖｉｆ，ｖｐｒ，ｔａｔ，ｒｅｖ，ｖｐｕ
，ｎｅｆ，及びｖｐｘからなる群の中で選択される少なくとも１つの付加的な成
分を含む。

【００９８】上述の本発明のベクターの成分は、前記ベクターの導入又は少なくとも１つの
不死化分子の導入のためにターゲティングされた細胞型に基づいて選択される。

【００９９】上述の本発明のベクターの成分は、好ましくは、ＭｏＭｕＬＶ，ＨａＭｕＳＶ
，ＭｕＭＴＶ，ＧａＬＶ，ＲＳＶ，ＨＩＶ，ＳＩＶ，ＦＩＶ，ＢＩＶ，ＥＩＡＶ
，ＶＩＳＮＡ又はＣＡＥＶから得られる。

【０１００】以上で挙げた好ましい成分は、レンチウイルスそして特にＨＩＶから得られる
。

【０１０１】もう１つの態様においては、本発明は、上述の本発明のベクターを産生する方
法を提供する。

【０１０２】上述の本発明のベクターを産生する方法は、ＧＡＧの少なくとも１つのタンパ
ク質の機能を有する少なくとも１つの分子をコードする核酸、ＰＯＬの少なくと
も１つのタンパク質の機能を有する少なくとも１つの分子をコードする核酸、前
記ベクターの付着及び標的細胞内への侵入を可能にする成分をコードする核酸、
前記ベクターの核タンパク質複合体を前記ベクターの標的細胞の核内に輸送する
ことのできる要素又は前記ベクターの核タンパク質と結合し標的細胞の核移入機
構により認識される要素をコードする核酸、及び、逆転写及び組込みのために必
要なシス作用性核酸によりフランキングされたパッケージングシグナルをコード
する核酸及び調節分子に動作可能な形で連結された少なくとも１つの不死化分子
の導入のためのクローニング部位を含む単数又は複数のベクターを適切なパッケ
ージング宿主細胞内に導入する工程を含む。

【０１０３】上述の本発明のベクターの産生方法は、ＧＡＧの少なくとも１つのタンパク質
の機能をもつ少なくとも１つの分子をコードする核酸、ＰＯＬの少なくとも１つ
のタンパク質の機能をもつ少なくとも１つの分子をコードする核酸（ここで前記
第１又は第２の核酸によりコードされる少なくとも１つのタンパク質は標的細胞
の核の中に前記ベクターの核タンパク質複合体を輸送できるように又は標的細胞
の核移入機構により認識されるように修飾されている）、前記ベクターの付着及
びその標的細胞内への侵入を可能にする成分をコードする核酸及び逆転写及び組
込みのために必要なシス作用性核酸によってフランキングされたパッケージング
シグナルをコードする核酸、及び調節分子に対し動作可能な形で連結された少な
くとも１つの不死化核酸分子の導入のためのクローニング部位を含む単数又は複
数のベクターを適切なパッケージング転写調節内に導入する工程を含む。

【０１０４】本発明の方法はさらに、ｖｐｒ，ｖｉｆ，ｎｅｆ，ｖｐｘ，ｔａｔ，ｒｅｖ，
及びｖｐｕからなる群より選択された少なくとも１つの分子をコードする少なく
とも１つの核酸分子を導入する工程を含むことができる。

【０１０５】本発明の方法はさらに、前記トランスフェクションを受けた宿主細胞によって
産生されたベクターを回収する工程を含むことができる。

【０１０６】好ましい実施形態においては、本発明の方法は、レンチウイルス様のウイルス
そしてより特定的にはヒト免疫不全症ウイルス様のウイルスを産生する。

【０１０７】本発明のベクターの産生のための現在好まれている方法には、上述のような本
発明の最終ベクターを産生するため最低３〜４個の産生ベクターの組合せを使用
することが関与している。

【０１０８】第１の産生ベクターは、ＧＡＧの少なくとも１つのタンパク質の機能を有する
少なくとも１つの成分及びＰＯＬの少なくとも１つのタンパク質の機能をもち少
なくとも１つの成分をコードする核酸を提供している。

【０１０９】ＧＡＧの少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの機能を支持する成分
は、すべて又は部分的に基質、カプシド及び／又はヌクレオカプシドから誘導さ
れ得る。

【０１１０】ＰＯＬの少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの機能を支持する成分
は、すべて又は部分的にインテグラーゼ及び／又はＲＮＡ誘導されたＤＮＡポリ
メラーゼ（逆転写酵素）から誘導される。

【０１１１】かかる成分は、さまざまなウイルス供給源、例えばモロニーマウス白血病ウイ
ルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ），マウス
哺乳動物腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）
，ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ），ＳＩＶ，ＦＩＶ，ＢＩＶ，ＥＩＡＶ，Ｖ
ＩＳＮＡ，ＣＡＥＶ，ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などから入手可能である。

【０１１２】本発明の実施において利用される第２の産生ベクターは、前記第２のベクター
を用いて産生された本発明の最終的ベクターの付着及び標的細胞内への侵入を可
能にする成分をコードする核酸を提供する。

【０１１３】最終的ベクターの付着及び標的細胞内への侵入を可能にする成分は好ましくは
、ウイルス外被（ｅｎｖ）である。

【０１１４】ウイルス外被は、レトロウイルスを含むあらゆるウイルスから誘導され得る。
ｅｎｖは、ヒト及びその他の種の細胞の形質導入を可能にする両栄養性外皮タン
パク質であってもよいし、あるいはまたマウス及びラット細胞のみを形質導入す
ることのできる狭宿主性外皮タンパク質であってもよい。

【０１１５】レトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の例としては、モロニーマウス白血病ウイ
ルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ），マウス
哺乳動物腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）
，ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ），ＳＩＶ，ＦＩＶ，ＢＩＶ，ＥＩＡＶ，Ｖ
ＩＳＮＡ，ＣＡＥＶ，ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などが内含される。水疱性
口内炎ウイルス（ＶＳＶ）といったようなその他のｅｎｖ遺伝子（タンパク質Ｇ
）も同様に使用可能である。

【０１１６】本発明の最終ベクターの付着及び標的細胞内への侵入を可能にする成分は、有
利には、特定の標的細胞型のレセプターに対するターゲティングのため特定のリ
ガンド又は抗体と会合し得る。

【０１１７】かくして、第２の産生ベクターは、第２の産生ベクター内に（調節領域を含む
）少なくとも１つの目的の配列を添加することによって、標的特異的なものにす
ることができる。

【０１１８】目的の配列は、標的細胞の特異的レセプターのリガンドについてコードするこ
とができる。

【０１１９】最終的ベクターは、糖脂質又はタンパク質により標的特異的なものにされ得る
。好ましくは、最終ベクターは、抗体によって標的特異的なものにされる。

【０１２０】当業者であれば、特異的標的に対する本発明のベクターの送達を達成するため
の特異的方法を知っていることと思われ、必要以上の実験なくそれを容易に確認
することができる。

【０１２１】本発明の最終的ベクターの付着及び標的細胞内への侵入を可能にする成分をコ
ードする核酸は、例えばプロモーター又はエンハンサーといった調節配列と動作
的に結合される。

【０１２２】好ましくは、調節配列はウイルスプロモーターである。調節配列は、例えばモ
ロニーマウス白血病ウイルスプロモーター−エンハンサー要素、ヒトサイトメガ
ロウイルスエンハンサー（例中で使用されているようなもの）又はワクシニアＰ
７．５プロモーターといったものを含む、任意の真核性プロモーターであり得る
。モロニーマウス白血病ウイルスプロモーター−エンハンサー要素といったよう
な一部のケースでは、これらのプロモーター−エンハンサー要素は、ＬＴＲ配列
の中又はそれに隣接して存在する。

【０１２３】本発明の実施において使用するべく考慮されている第３の産生ベクターは、ウ
イルスの寿命に必要なシス作用性ウイルス配列を提供する。かかる配列は、Ψ
パッケージング配列、逆転写シグナル、組込みシグナル、ウイルスプロモーター
、エンハンサー、及びポリアデニル化配列からなる群の中に含まれた配列及びシ
グナルのうちの少なくとも１つを内含できる。

【０１２４】かかる配列又はシグナルは、例えばＭｏＭｕＬＶ，ＨａＭｕＳＶ，ＭｕＭＴＶ
，ＧａＬＶ，ＨＩＶ，ＳＩＶ，ＦＩＶ，ＢＩＶ，ＥＩＡＶ，ＶＩＳＮＡ，ＣＡＥ
Ｖ，ＲＳＶなどといったさまざまなウイルス供給源から入手可能である。

【０１２５】第３の産生ベクターは同様に、少なくとも１つの非相同核酸配列の導入のため
の少なくとも１つのクローニング部位を含有する。

【０１２６】本発明の状況下では、少なくとも１つの非相同核酸配列は、上述のような少な
くとも１つの不死化分子そして場合によっては少なくとも１つの選択作用物質で
ある。

【０１２７】好ましい選択作用物質はＨＳＶ−ＴＫである。

【０１２８】ベクターの存在について検定し、かくして、感染及び組込みを確認するために
、選択可能なマーカー遺伝子を利用することができる。このマーカー遺伝子の存
在は、挿入されたＤＮＡを発現するような宿主細胞のみの成長を確実にする。標
準的選択遺伝子は、抗生物質及びその他の毒性物質例えばヒスチジノール、プロ
マイシン、ネオマイシン、メトトレキセートなどに対する耐性を付与するタンパ
ク質をコードする。当該技術分野において一般に使用されるその他のマーカー系
には、便利なことに視覚的に監視できるＳ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、及
びルシフェラーゼリポータ又はマーカー系が含まれる。

【０１２９】第３の産生ベクターは、好ましくは、バイ−又はポリ−シストロン性である。

【０１３０】第３の産生ベクターは、ＩＲＥＳ配列を含む。

【０１３１】任意には、本発明の実施において使用するために考慮されている第４の産生ベ
クターは、前記ベクターの標的細胞の核内に本発明の最終的ベクターの核タンパ
ク質複合体を輸送できる、又は前記最終ベクターの核タンパク質複合体と結合す
る要素を提供する。

【０１３２】前記ベクターの標的細胞の核内に本発明の最終的ベクターの核タンパク質複合
体を輸送できる好ましい要素は、ＨＩＶ−１インテグラーゼ、特にＨＩＶ−１プ
ロモーターの制御下で発現されたＨＩＶ−１インテグラーゼである。

【０１３３】以上で記述した本発明の方法では、上述のとおりの組換え型ビリオンのパッケ
ージングに必要とされる機能のすべてを提供する少なくとも３つのベクター、そ
してそれに加えて可能であれば、核タンパク質複合体と結合しかくして非分裂細
胞又は緩分裂細胞の不死化を可能にする能力をもつ要素を提供する第４のベクタ
ーを使用することが考慮されている。

【０１３４】上述の本発明の方法では同様に、ｖｐｒ，ｖｉｆ，ｎｅｆ，ｖｐｘ，ｔａｔ，
ｒｅｖ，及びｖｐｕといったようなウイルス遺伝子を内含するベクターのトラン
スフェクションも考慮されている。これらの遺伝子の一部又はすべては、例えば
パッケージング構成体ベクター上に内含され得、またあるいは、産生ベクター上
にあってもよい。利用可能な産生ベクターの数には、それらが単一の組換え型ベ
クターを産生すべくパッケージング細胞系に同時トランスフェクションされるか
ぎりにおいて、全く制限がない。例えば、ｇａｇ及びｐｏｌ全又は部分誘導体と
同じ構成体上に、ｅｎｖ核酸配列を置くことができる。

【０１３５】本書で使用するように考慮されている産生ベクターは、パッケージング細胞系
内のトランスフェクション又は感染を介して導入される。パッケージング細胞系
は、ベクターゲノムを含有するウイルス粒子を産生する。トランスフェクション
又は感染の方法は、当業者には周知のものである。パッケージング細胞系に対す
る少なくとも３つのベクターの同時トランスフェクションの後、組換え型ベクタ
ーは、培地から回収され、当業者によって使用される標準的方法によって力価測
定される。

【０１３６】上述の本発明のベクターの産生方法は、適切なパッケージング細胞系を同時ト
ランスフェクションするのに使用される３つ以上の産生ベクターを利用する。こ
れらの産生ベクターは、核酸の感染及び標的細胞への移送のための組換え型ウイ
ルスの産生のために必要とされる遺伝子のすべてを集合的に含有することから、
ヘルパーウイルスの使用の必要性は全くない。

【０１３７】しかしながら、上述の第１、第２及び／又は第４の産生ベクターは、置換され
たベクターに対応する欠如したウイルス可能基を提供するヘルパー細胞系を用い
ることによって、置換可能である。

【０１３８】当業者であれば容易に認識するように、本発明に従ってさまざまな異なるパッ
ケージング細胞系を調製することができる。かくして例えば、上述のベクターの
うちのいくつかを含有する安定したパッケージング細胞系が調製され、そのため
、本発明のベクターを産生する能力をもつビリオンを産生するためには、非相同
核酸配列を含有するベクターを導入する必要しかなくなる。

【０１３９】好ましい実施形態においては、本発明の１つのベクターは、以前に記述された
ように（Naldini et al., 1996）２９３Ｔ上皮細胞系内に３つのプラスミドを過
渡的に同時トランスフェクションすることによって達成されるＨＩＶベースのベ
クターである。

【０１４０】第１のプラスミドは、その高い安定性及び広い向性のため、シュードタイプの
ＨＩＶ粒子に対し、好ましくはＶＳＶ−Ｇ外皮である外皮を提供する。

【０１４１】第２のプラスミド（パッケージングプラスミド）は、ウイルスの構造及び調節
タンパク質についてコードする。第２のプラスミドは好ましくは、ＨＩＶＧag
及びＰol前駆体及び調節タンパク質Ｔat及びＲevについてのみコードするＲ８
．９１プラスミドである。実際には、Ｖpr，Ｖpu，Ｖif及びＮeｆといったよう
なその他のＨＩＶタンパク質が、非分裂細胞の効率の良い感染にとっては必要不
可欠である（Zufferey et al., 1997）。これは、産生細胞において考えられる
組換え事象に関する付加的な安全性機能を提供する。

【０１４２】第３のプラスミド（ベクタープラスミド）は、ウイルス粒子内の包膜のために
設計されている。以前に記述されたｐＨＲプラスミド（Naldini et al., 1996）
の誘導体である最近のバージョンが好ましくは使用される。最も好ましいバージ
ョンは、逆転写の後自己不活性化を導く３′ＬＴＲのＵ３領域内の欠失を有し（
Zufferey et al., 1998），かつ／又は産生細胞及び標的細胞の両方の中でより
大きいＲＮＡレベルを可能にする（Zufferey et al., 1999）ウッドチャック肝
炎ウイルスの転写後調節要素（ＷＨＶ−ＰＲＥ）を含有する（Donello et al.,
1998）最も最近のバージョンである。

【０１４３】もう１つの態様では、本発明は、上述の本発明のベクターを産生するための方
法のいずれか１つにより入手可能であるベクターを提供する。

【０１４４】もう１つの態様では、本発明は、細胞の不死化のための方法において、前記細
胞内に上述の本発明のベクターのうちの少なくとも１つを導入し、前記細胞内で
前記ベクターによりコードされた不死化分子を発現する段階を含む方法を提供す
る。

【０１４５】上述のような本発明の不死化方法は、好ましくは、in vitro又はex vivoで実
施される。

【０１４６】あるいは、該方法は、in vivoで実施されてもよい。

【０１４７】好ましい実施形態においては、上述の不死化方法で使用される本発明のベクタ
ーは、すべて又は部分的にレトロウイルス、特にレンチウイルスから誘導されて
いる。

【０１４８】本発明のベクターは、in vitroで非分裂細胞又は緩分裂細胞を膨張させるのに
優れたベクターである。

【０１４９】本発明の方法によって不死化されうる細胞の好ましい例は、内皮細胞、筋芽細
胞、ケラチノサイト、β細胞、肝細胞、造血細胞、幹細胞、始原細胞、神経細胞
、神経幹細胞、リンパ球、樹状細胞、上皮細胞、顆粒細胞及びマクロファージで
ある。

【０１５０】特に好ましい細胞は、単一ヒット不死化すなわち単一の発ガン遺伝子の発現を
による不死化に対し抗療性の細胞である。

【０１５１】もう１つの態様においては、本発明は、上述の本発明のベクターを産生する能
力をもつ安定した産生細胞系を提供する。

【０１５２】重要な１つの態様においては、本発明は、上述の本発明の不死化の方法のいず
れか１つに従った方法によって得ることのできる不死化された細胞を提供する。

【０１５３】本発明は、不死化されていることを特徴とする、もともと非分裂性又は緩分裂
性の細胞を提供する。

【０１５４】「不死化された細胞」という語は、以下の定義を有し得る： − 遺伝的に操作された細胞内の不死化分子（単複）の発現のため細胞に対し
改変された成長特性を付与する少なくとも１つの「不死化分子」の導入に起因し
て、培養中で無限に成長する能力をもつ細胞； − 無限の生命をもつ細胞； − 無限の増殖をもつ細胞； − 無限の寿命をもつ細胞； − 培養条件が維持された場合に分裂を停止しない細胞； − 少なくとも２５，３０，３５，４０，４５，５０又は６０継代中又は少な
くとも１００，１２０，１４０，１６０，１８０又は２００個体群倍加中、又は
少なくとも３，４，５，６，７又は８カ月の間、培養中又はin vitroで維持され
得る細胞； − その細胞の通常の継代、個体群倍加又は寿命の数の２，３，４，５又は１
０倍である少なくとも一定数の継代、個体群倍加又は寿命の数の間、培養中又は
in vitroで維持され得る細胞。細胞の通常の継代、個体群倍加又は寿命数は、細
胞の継代、個体群倍加又は寿命数を増大する能力をもつ何らかの作用物質なしで
この細胞が培養された場合のその継代、個体群倍加又は寿命数であり得る。

【０１５５】「もともと非分裂又は緩分裂性の細胞」には、不死化された時点で非分裂性又
は緩分裂性であった細胞又はその子孫を内含する。

【０１５６】本発明は、不死化されその目的の表現型を不可逆的に喪失しない細胞を提供す
る。

【０１５７】特定の細胞の「目的の表現型」という語には、前記特異的細胞のユーザーが関
心をもつ表現型が内含される。１つの細胞の「目的の表現型」は、細胞のタイプ
及びこの細胞のその後の用途に応じて変動し得る。筋芽細胞の目的の表現型は、
好ましくはその分化能力、より特定的には、多核筋管に対するその正常な融合能
力である。ケラチノサイトの目的の表現型は好ましくは、in vitroで正常な表皮
等価物を形成するその能力である。内皮細胞の目的の表現型は、好ましくは、Ｌ
ＤＬレセプター及びフォンウィルブランド因子、食作用及び開窓の存在である。

【０１５８】より一般的には、細胞の「目的の表現型」は、そのもとの分化状態、すなわち
この細胞が不死化された時点で非分裂細胞であった場合のこの細胞の分化状態で
あり、そうでなければ、不死化された時点で、非分裂細胞であったこの細胞の祖
先の目的の表現型である。細胞が末端分化を受けている場合、この細胞の目的の
表現型は好ましくはその分化状態であり得る。細胞が完全に分化されていない場
合（幹細胞、始原細胞、初代β細胞）、この細胞の目的の表現型は好ましくは、
その分化能力であり得る。

【０１５９】本発明は、不死化されそのもとの目的の表現型を不可逆的に喪失しない細胞を
提供する。

【０１６０】細胞の「もとの目的の表現型」は、この細胞が初代細胞である場合のこの細胞
の目的の表現型又はこの細胞の初代祖先の目的の表現型でありうる。

【０１６１】目的の表現型は、その細胞について天然に発生する表現型であってよく、また
あるいは、細胞の遺伝的修飾の結果としてもたらされる表現型であり得る。かか
る修飾は、不死化の前又は後で発生し得る。

【０１６２】本発明は、もともと非分裂又は緩分裂性であり、本発明のベクターに対応する
プロウイルスをそのゲノム内に組込まれた状態で含んで成る細胞を提供する。

【０１６３】本発明は、そのもともとの目的の表現型を不可逆的に失っておらず、本発明の
ベクターに対応するプロウイルスをそのゲノム内に組込まれた状態で含んで成る
細胞を提供する。

【０１６４】本発明は、本発明のベクターに対応するプロウイルスをそのゲノム内に組込ま
れた状態で含んで成る不死化された細胞を提供する。

【０１６５】好ましくは、本発明の細胞は、そのゲノム内に少なくとも１つのＬＴＲ部位を
含む。

【０１６６】好ましい実施形態において、本発明の細胞は、そのゲノム内に２つのＬＴＲ部
位を含む。

【０１６７】好ましくは、２つのＬＴＲ部位は、転写調節核酸分子に動作可能な形で連結さ
れた少なくとも１つの不死化核酸分子によって分離されている。

【０１６８】上述のＬＴＲ部位は、レトロウイルス由来、好ましくはレンチウイルス由来、
そしてより好ましくはＨＩＶ由来のものでありうる。

【０１６９】上述のＬＴＲ部位は、組換え部位好ましくはloxＰ部位を含みうる。

【０１７０】好ましくは、本発明の細胞は、そのゲノム内に組込まれた状態で少なくとも１
つの選択可能なマーカー及び／又は少なくとも１つの不死化分子を含む。好まし
い選択可能なマーカーはＨＳＶ−ＴＫである。

【０１７１】好ましい実施形態においては、選択可能なマーカー及び少なくとも１つの不死
化分子は、本発明の細胞のゲノム内に存在する。

【０１７２】好ましくは、選択可能なマーカー及び少なくとも１つの不死化分子は、バイ−
又はポリ−シストロン配列又はカセットを形成するように動作可能に連結されて
いる。

【０１７３】好ましくは、本発明の細胞は、図１又は５の中に描かれている少なくとも１つ
の配列のすべて又は一部分を含む。

【０１７４】好ましくは、本発明の細胞は可逆的にか又は条件付きで不死化される。

【０１７５】好ましくは、本発明の細胞は、脱不死化の後そのもとの目的の表現型を回復す
る。

【０１７６】かくして、本発明の特に好ましい細胞は、脱不死化の後、緩分裂細胞であるこ
と、そのもとの表現型をもつことそしてレンチウイルスＬＴＲを含むことという
特徴を組合わせる。

【０１７７】同様にして、脱不死化の前の本発明の好ましい細胞は、以下の特徴を組合わせ
ることによって特徴づけされる： − それらは不死化されている； − それらは、不死化の前にそのもとの表現型を保っている； − そしてそれは、そのゲノム内に組込まれた状態でレンチウイルスＬＴＲの間
に不死化分子（単複）を含有する。

【０１７８】本発明の細胞は有利にも、特異的作用によって脱不死化され得る。

【０１７９】特異的作用というのは、外来性不死化分子を除去することであり得る。

【０１８０】外来性不死化分子の除去は、好ましくは本発明の細胞をｃｒｅリコンビナーゼ
と接触させることによって実施される。

【０１８１】本発明の細胞の目的の表現型は、内皮細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、β細
胞、肝細胞、造血細胞、幹細胞、始原細胞、神経細胞、神経幹細胞、リンパ球、
樹状細胞、上皮細胞及びマクロファージからなる群より選択された細胞型の表現
型であり得る。

【０１８２】本発明の細胞は、内皮細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、β細胞、肝細胞、造
血細胞、幹細胞、始原細胞、神経細胞、神経幹細胞、リンパ球、樹状細胞、上皮
細胞及びマクロファージであり得る。

【０１８３】本発明のベクターにより不死化された細胞系は、膨張され、クローニングされ
、その不死化され、そして「脱不死化された」（すなわち不死化分子の除去／サ
イレンシング後の）状態の両方で広範に特徴づけされ、基本生理学からプロテオ
ミクスに至るまでの分析のため、特異的タンパク質の産生のためそして選択され
たケースでは移植のために使用され得る。

【０１８４】本発明の細胞は、好ましくは腫瘍細胞ではない。「腫瘍細胞」という語は、動
物の中に導入された時点で腫瘍をひき起こす細胞を内含する。好ましくも、本発
明のベクターにより不死化された細胞の注入は、ヌードマウスの体内での腫瘍の
発生を導かなかった。本発明の不死化された細胞は、好ましくは、腫瘍形成性を
欠如している。

【０１８５】本発明の細胞は、有利には、in vitroで目的のタンパク質を生成するのに使用
され得る。タンパク質は、例えば組換え型タンパク質といった不死化された細胞
との関係において異種性であってもよいし、あるいはまた、細胞に対し内因性で
あるタンパク質であってもよい。この後者のケースでは、タンパク質は通常、細
胞内で活発に発現される遺伝子の産物であり得る。あるいは、それは、細胞内で
通常は転写的にサイレント状態にあり、その調節配列の修飾といったような適切
な措置により活性化された遺伝子の産物でありうる。

【０１８６】好ましい実施形態においては、本発明の細胞は被包されている。

【０１８７】治療の観点から見ると、初代細胞の可逆的不死化は、細胞移植の分野にとって
刺激的な展望を開く。

【０１８８】２つの潜在的な臨床的応用分野に言及することができる。すなわち一方では、
条件付きで不死化された細胞は、その上清から容易に精製され得る治療因子を産
生するのに役立つことができる。モノクローナル抗体を分泌する形質細胞又はホ
ルモンを産生する内分泌細胞がその好例である。他方では、一部の細胞は、その
播種を妨げる半透過性コンテナ内に封じ込められた場合でさえ、治ゆ効果を及ぼ
すことができる。被包されたベータ細胞の移植を介した糖尿病の治療を目的とし
た現行の研究が、この一般的概念を例示している。

【０１８９】本発明の好ましい細胞は、膵臓β細胞である。

【０１９０】本発明は、本発明の膵臓β細胞を含むバイオ人工膵を提供する。

【０１９１】本発明のその他の好ましい細胞は、ケラチノサイトである。

【０１９２】本発明は、本発明のケラチノサイトを含む等価の上皮細胞又は皮ふを提供する
。

【０１９３】本発明のケラチノサイトは、火傷又は潰瘍を処置するのに使用することができ
る。

【０１９４】本発明の好ましい細胞は、肝類洞内皮細胞である。

【０１９５】本発明の肝類洞内皮細胞は有利には、薬学的研究のために使用することができ
る。

【０１９６】本発明の好ましい細胞は、筋芽細胞である。

【０１９７】本発明は、本発明の筋芽細胞の融合から形成された筋管を提供する。

【０１９８】本発明の筋管は有利には、筋肉を再構成するために使用可能である。

【０１９９】本発明の好ましい細胞は、樹状細胞である。

【０２００】本発明の樹状細胞は有利には、抗腫瘍又は抗感染性物質を設計するために使用
することができる。

【０２０１】本発明の好ましい細胞は、Ｂリンパ球又は形質細胞である。

【０２０２】本発明のＢリンパ球又は形質細胞は有利には、モノクローナル抗体を産生する
ために使用可能である。

【０２０３】本発明の好ましい細胞は肝細胞である。

【０２０４】かかる細胞培養の潜在的利用分野は数多く存在する。特に、本発明の不死化さ
れた肝細胞は、長期間培養され得、かくしてゲノムならびにプロテオミック研究
が可能となる。初代肝細胞には増殖能力が欠けていたため、これらの研究は、こ
れまでのところ不可能ではないものの困難であった。

【０２０５】もう１つの潜在的利用分野は、ウイルス学において見い出すことができる。肝
細胞は、Ｂ型及びＣ型肝炎といったようないくつかのウイルスの標的である。標
的細胞内でのウイルスの複製サイクルを理解することが、療法への必要な第一歩
である。これまでのところ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のin vitro複製を可能
にする系は全く存在しなかった。かかる系の不在は、これらのウイルスに対する
治療及びワクチンの探究を著しく妨げてきた。天然の肝細胞の特性を共有し、ま
ず第１に感染を防止するために可能な方法を見い出し次に治療をテストする目的
でウイルス感染及び複製についての実験を可能にするような系に対するニーズが
存在している。本発明の不死化された肝細胞は、肝向性ウイルスの成長を支援す
る潜在的な候補である。

【０２０６】一般的な状況下では、増殖する肝細胞は、肝細胞サイクル、代謝経路、その他
の細胞との相互作用、細胞内及び細胞間伝達を研究するための貴重なツールであ
る。これらの本質的な点を理解することは、次に、これらの特徴を修飾する方法
の発見へと導いてくれる。

【０２０７】ゲノムの観点では、かくして発現された遺伝子及び肝細胞内でそれらの発現を
駆動するプロモーターを研究することが可能である。

【０２０８】プロテオミックの観点では、これにより、ペプチド及びタンパク質の産生及び
パターンの分析が可能となる。

【０２０９】細胞内伝達の観点では、かくして、ホルモン又は成長因子治療といったような
さまざまな生理学的条件によって引き起こされる肝細胞の変化を研究することが
可能である。分泌された可溶性因子、リン酸化されたタンパク質及び異なる刺激
の後の肝細胞のその他の変化を見極めることが有利である。

【０２１０】この肝細胞機能を理解することで、必要な場合にこの機能を修飾することが可
能となる。肝細胞に向けられたすべての医薬品について、本発明の不死化された
細胞は、ほぼ自然の状況下でのそれらの治療及び毒学的効果をテストするための
系を提供する。かくして、薬学的及び毒物学的研究は、本発明の肝細胞について
実施され得る。

【０２１１】本発明のベクターによって不死化された肝細胞のもう１つの潜在的利用分野は
、移植という状況の中にある。肝細胞機能不全、代謝疾患又はその他の急性又は
慢性疾患を患う患者については、本発明の肝細胞を移植することができる。これ
らは自然の肝細胞の特性を有することから、その生理学的機能を果たし、自然欠
損した機能に置き換わることができるだろう。これらの移植された肝細胞は、遊
離細胞として放出されてもよいし又は被包されてもよい。この第２の可能性は、
移植された細胞が体全体に拡散するのを防ぎ、このことは、本発明のベクターが
自己不活性化をもつという事実に加えてさらに安全性を増大させる。

【０２１２】実施例例１：切除可能なＨＩＶ由来のベクターの設計ＬｏｘＰ／Ｃｒｅリコンビナーゼ系を用いたＨＩＶベースのベクター（Hoess
and Abremski, 1984; Sauer and Henderson, 1988）を使用する。このＨＩＶベ
クターは、３′ＬＴＲ（ＨＩＶ／ＬＯＸベクター）のＳＩＮ（Self INactivatin
g)バージョンの中にＬｏｘＰ配列を含有している。このベクターの概略的バック
ボーンは図１に描かれている。

【０２１３】これには、産生細胞内の適切な発現のために必要な要素が含まれている（Nald
ini et al., 1996）。バクテリオファージＰ１のＬｏｘＰ部位を含有する５８ヌ
クレオチド配列が、Ｕ３とＲ配列の間の接合部近くで、いわゆる自己不活性化ヒ
ト免疫不全症ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１）由来のベクターの中に挿入された。Ｕ
３配列は、ベクターの逆転写及び組込みの後に自己不活性化ＬＴＲを生成するた
めに断端にされた。

【０２１４】内部カセットは、リポータ遺伝子として増強された緑色蛍光タンパク質（Ｅｇ
ｆｐ，Clontech Laboratories)をコードする遺伝子を内含する２つのシストロン
で構成されている。この遺伝子は、例４の実験において目的の遺伝子（不死化遺
伝子（単複））で置換される。第２のシストロンは、条件的毒素として使用され
る、単純ヘルペスウイルス１型のチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶＩ−ＴＫ）（
Colbere-Garapin et al., 1979）である。１つの実施形態においては、バイシス
トロンカセットは、ヒトサイトメガロウイルスの超初期プロモーターの転写制御
下にある（Foecking and Hofstetter, 1986）。ＥＦ１プロモーターといったよ
うなその他のプロモーター（ヒト伸長因子ＥＦ−１−アルファ遺伝子）を用いて
、ＣＭＶプロモーターが充分でない細胞の中での高い発現レベルを得ることがで
きる。ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子の翻訳は、エンセファロミオカルジチス（ＩＲＥＳ
）の内部リボソーム侵入部位によって駆動される（Sugimoto et al., 1994）。
以下で記述する実験では、ＷＨＶ−ＰＲＥのないＨＩＶ／ＬＯＸベクターの１バ
ージョンが使用されたという点に留意されたい。

【０２１５】前述した３プラスミドトランスフェクション技術（Naldini et al., 1996）に
より、ウイルス粒子を産生する。これらのウイルス粒子が有するゲノムＲＮＡが
、図１の中に描かれている。逆転写の間、３′ＬＴＲのＵ３領域は複製され、か
くしてＬoxＰ部位は、組込まれたプロウイルスのゲノムを最後にフランキングし
て終結することになる。かくして、標的細胞内への組込みの後、プロウイルスＤ
ＮＡは、バイシストロンカセット全体ならびにウイルス配列をフランキングする
ＬoxＰ配列の２つのコピーを含有する。このとき、標的細胞内のＣre細菌リコン
ビナーゼ発現プラスミドのトランスフェクションの時点で、２つのＬoxＰ部位の
間に存在するＤＮＡ配列は切除され、宿主細胞ゲノム内にＬoxＰ不活性化された
ＬＴＲキメラの１つのコピーのみが残る。この孤立したＬＴＲ残留物には、すべ
ての転写活性が欠如している。

【０２１６】例２：ヒト細胞系内のＨＩＶ／ＬＯＸの形質導入及び切除ＨｅＬａ細胞は、ＨＩＶ／ＬＯＸ−ｇｆｐ（又は対照ＨＩＶ−ｇｆｐ）ウイル
ス粒子での感染を受け、ｇｆｐの高い相同な発現について個々のクローンが選択
された。このとき、選択されたクローンを、トランスフェクションについての対
照としてＨｅＬａ細胞（すなわちマウスＣＤ８α）の表面上に存在しない膜マー
カーについてコードするプラスミドと合わせて核局所化シグナルでタグ付けされ
たＣre細菌リコンビナーゼの発現プラスミドで一過的に同時トランスフェクショ
ンした。Ｃｒｅプラスミド／ＣＤ８プラスミドの比率は、ＣＤ８陽性細胞内のＣ
ｒｅの信頼性の高い発現を確保するため、７／１であった。トランスフェクショ
ンを受けた細胞を、トランスフェクションから３日後にｇｆｐ及びｍＣＤ８の両
方の発現について分析した。ＣＤ８−陽性（トランスフェクションされた）ＨＩ
Ｖ／ＬＯＸ−ｇｆｐ細胞内のＧｆｐ−陽性の百分率は１５％まで減少し、一方Ｃ
Ｄ８陰性（トランスフェクションされていない）細胞は８６％Ｇｆｐ−陽性にと
どまった。対照ＨＩＶ−ｇｆｐベクターに感染した細胞中のＣｒｅ及びｍＣＤ８
の同じトランスフェクションによってＧｆｐ陽性細胞の百分率が改変されること
はなく（図２）また、ＨＩＶ／ＬＯＸ−ｇｆｐに感染した細胞内でのｍＣＤ８単
独のトランスフェクションによっても改変されなかった。（データ示さず）。ま
たＨｅＬａ及び２９３Ｔ細胞の独立したクローンならびにＨｅＬａ及び２９３Ｔ
細胞のバルク培養においても、類似の結果が得られるということも指摘できる。
これらの結果は、ＬｏｘＰ／Ｃｒｅ系が、我々のＨＩＶベクターの状況下で機能
的であり、切除後のリポーター発現の急速な喪失を誘発するということを表して
いる。

【０２１７】アデノウイルスベクターを用いてＣｒｅが送達された場合にも、類似の結果が
得られた（図３）。ＨＩＶ／ＬＯＸ−ｇｆｐ（クローンＨ４，５）を含有するＨ
ｅＬａ細胞の安定したクローンを、Ｃｒｅタンパク質についてコードするアデノ
ウイルスベクターのさまざまな濃度の粒子と共にインキュベートした。図３に示
されているように、Ａｄ−Ｃｒｅベクターでの処置後Ｇｆｐ＋にとどまった細胞
の画分は、感染多重度に反比例していた（ＭＯＩ：１ＭＯＩは標的細胞あたりの
１形質転換単位を表わす）。１００というＭＯＩで、細胞の９５％がＨＩＶ／Ｌ
ＯＸ−Ｇｆｐ構成体を切除した。

【０２１８】例３：ガンシクロビルを用いた残留ｇｆｐ陽性細胞の除去治療目的で応用可能となるためには、可逆的不死化には、膨張期後、増殖細胞
を完全に除去することが必要となる。（高力価のＣｒｅ−アデノウイルスの使用
（Anton and Graham)といったように）トランスフェクションに比べてより効率
の良い系内でＣｒｅ形質導入がさらにテストされることになるとしても、Ｃｒｅ
によるベクター切除を逃れた残留細胞を除去することが必要となる可能性はきわ
めて高い。かくして我々は、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳ
ＶＩ−ＴＫ）に基づいて、条件的除去系をテストした。ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を
コードする遺伝子を発現する細胞は、アシクロビル（ＡＣＶ）又はガンシクロビ
ル（ＧＣＶ）のようなヌクレオチド類似体に対する感受性をもつ。これらの分子
は、ＤＮＡ内への取込み時点で有毒であるヌクレオチドへとＨＳＶＩ−ＴＫによ
り特異的に変換される（Elion, 1983）。この系はかくして、ＨＳＶＩ−ＴＫを
発現すると同時に分裂しつつある細胞について特異的にターゲティングする。こ
の系の効力を制御するため、我々は、ＨｅＬａ細胞をＨＩＶ／ＬＯＸ−ｇｆｐ−
ＩＲＥＳ−ＴＫベクターで感染させ、次にベクター切除の逐次的２工程を行なっ
た（図４）。最初に、ベクターを切除するためＣｒｅプラスミド細胞をトランス
フェクションした。４日後、切除されたベクターがトランスフェクションされた
細胞をクリアできるようにするため、培地にガンシクロビルを添加した。図４に
示されているように、標準濃度のガンシクロビルでの１０日間の処置は、Ｇｆｐ
陽性細胞の３６％から１．２％までの減少（３０分の１の低減）を達成している
。２９３Ｔ細胞内でアシクロビルを用いても、類似の結果が得られた。これらの
結果は、ＨＳＶ１−ＴＫ系を用いた残留増殖細胞の除去が効率の良いものである
ことを表わしている。

【０２１９】例４：本発明のレトロウイルスを用いて得られた不死化されたヒト細胞（ＨＩ
Ｖ／ＬＯＸ系）さまざまな不死化カクテルで初代ヒト組織を形質導入することにより、いくつ
かの不死化された細胞系がすでに得られている。これらには、以下の４つの例が
内含される：

【０２２０】肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）肝類洞内皮細胞は通常in vitroで増殖しない。

【０２２１】これらの細胞は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原及びテロメラーゼについてコードするＨ
ＩＶ／ＬＯＸベクターでヒト肝臓生検からの細胞を形質導入することにより、初
めて不死化された。これらの細胞を、最初にＳＶ４０大型Ｔ抗原についてコード
するＨＩＶ／ＬＯＸベクターで感染させ、その後、テロメラーゼについてコード
するＨＩＶ−ｌｏｘベクターで感染させた。それぞれＳＶ４０大型Ｔ抗原及びテ
ロメラーゼのトランスフェクションのために使用された構成は、図５に示されて
いる。

【０２２２】これらの細胞は、現在、９カ月以上（６０継代以上）の間培養状態に維持され
てきている。

【０２２３】さらに、これらの細胞は、その目的の表現型を保っている。すなわち、これら
はＬＳＥＣに典型的な３つの特長すなわちｉ）ＬＤＬレセプター及びフォンウ
ィルブランド因子の発現、ii）食作用を行なう能力及び iii）開窓を示す。

【０２２４】腫瘍形成性検定を実施した。免疫不全症のヌードマウスをエンフルランで麻酔
し、１０⁶個のＨｅＬａ細胞又はＬＳＥＣを皮下注射した。１１週間、マウスを
毎週検査した。１cm以上の大きさの腫瘍を有した時点（ＨｅＬａ細胞対照、４週
間後）又は観察期間の終了時点（ＬＳＥＣクローン、１１週）のいずれかの時点
でマウスを安楽死させた。この検定は、本発明のベクターにより不死化されたそ
の他の細胞の腫瘍形成性の不在を示すのに使用することができる。

【０２２５】ＬＳＥＣの２つの独立したクローンからの１０⁶個の細胞の皮下注射は、１１
週間後にヌードマウスの体内で腫瘍の発生を導かなかった。

【０２２６】これらの細胞はかくして不死化され、特異的成長因子の不在下で連絡して分裂
し、それでも一次類洞内皮細胞の表現型及び形態学的特徴を数多く保持する。同
様に、これらの細胞は、ヌードマウスで腫瘍を誘発せず、このことはすなわちそ
れらを不死化するのに用いられる遺伝子が腫瘍形成性形質転換を導かないことを
表わしている。

【０２２７】これらの細胞は、Ｃreを発現するアデノウイルスベクターでの処置後分裂を停
止し、そうでなければガンシクロビルでの処置に対して感受性である。これは、
広範囲にわたる代謝及び薬学的研究のための強力なツールを構成する不死化され
た肝類洞内皮細胞の第１例である。これはさらに、その目的の表現型を保つ不死
化された細胞の第１例でもある。

【０２２８】ＨＬ−ＳＥＣ．Ｅ４及びＨＬ−ＳＥＣ．Ｇ９と名付けられたこれらの細胞の２
つのクローンが、１９９９年１１月２５日にＩ−２３５７及びＩ−２３５８とい
う受入れ番号でＣＮＣＭ（国立微生物培養収集機関；パスツール研究所、28 rue
du Dr Roux, F-75724 Paris cedex15, France）に寄託された。

【０２２９】筋芽細胞 ex vivo遺伝子療法プロトコール内での筋芽細胞／筋管の使用は、筋肉生検か
ら分離され得る初代筋原性細胞の数が不充分であることによって制限される。

【０２３０】初代クローナル培養をヒト筋肉生検から入手し、ＳＶ４０大型Ｔ抗原、Ｂmi−
１，Ｂcl−２及びテロメラーゼといった遺伝子のさまざまな組合せを含有するＨ
ＩＶ／ＬＯＸベクターで感染させた。感染していない初代細胞クローンが、通常
観察されるとおり、２−３カ月又は９継代にわたり培養した後老化状態となった
一方で、６カ月以上の培養又は４５の継代の後増殖し続ける４つの細胞系が得ら
れた。これら４つの不死化された系を得るために使用された組合せは以下のとお
りである：ＳＶ４０大型Ｔ抗原＋テロメラーゼ、Ｂmi−１＋テロメラーゼ及び
ＳＶ４０大型Ｔ抗原＋テロメラーゼ＋Ｂcl−２＋Ｂmi−１。筋芽細胞を形質導入
するために使用される構成は、図５に描かれている。これら４つの系のうち１つ
のクローン（Ｂmi−１及びテロメラーゼ形質導入されたもの）は、不死化遺伝子
の先行する切除なしでも、「増殖」から「分化」組織培地へと移行したとき多核
筋管へと分化する能力をもつ。これらの細胞は、筋肉の障害の細胞ベースの療法
のために、そして治療用タンパク質（すなわちエリスロポエチン、鎮痛物質など
）を産生し体内に放出するのに被包された細胞が用いられるような状況において
、価値あるものである。

【０２３１】ＨＭＢ６．１３及びＨＭＢ９．４と名付けられたこれらの細胞の２つのクロー
ンは、１９９９年１１月２５日にＩ−２３５５及びＩ−２３５６の受入れ番号で
ＣＮＣＭに寄託された。

【０２３２】ケラチノサイト毛髪小胞の外部毛根鞘を前もって形成された線維芽細胞フィーダ層上に移植片
培養することによって、ヒト初代ケラチノサイトの個体群を入手した。その後、
これらの初代細胞について最大３〜５継代で、コラーゲンコーティングされた皿
の上に二次培養を行なった。ＳＶ４０大型Ｔ抗原／Ｂmi−１／Ｂcl−２／テロメ
ラーゼ遺伝子を含有するＨＩＶベクターでの形質導入の後、これまで我々は、
連続増殖で少なくとも２５継代についてこれらの細胞を培養することができた。
ケラチノサイトの形質導入のために用いられた構成は、図５に示されている。

【０２３３】プロウイルス配列の切除前後のこれらの形質導入された細胞の分化状態は、現
在研究中である。最下の１つの目標は、慢性創傷及び熱傷の治療のための生体人
口皮ふの開発を長期的目標として、表皮層を再構成するこれらの細胞の能力をテ
ストすることにある。

【０２３４】肝細胞ほとんど化学療法を受けたことのない若い患者（３７才）から採取した肝生検
からのコラゲナーゼ灌流により、ヒト肝細胞を分離した。肝細胞をパーコールグ
ラジエント上で精製し、その後高い細胞密度でPrimaria培養皿上に播種し、成長
因子の不在下で二次培養した。ｐＬｏｘ，ＣＭＶＡｇＴ／Ｂｃｌ２／ＴＥＲＴ
／Ｂmil 又はｐLox. ＣＭＶＡｇＴ／ＴＥＲＴ及びｐＬox. Elalpha. ＴＩＮ２
．１３の組合せを用いて、可逆的に不死化するレンチウイルスベクターで初代肝
細胞を感染させた後、細胞個体群及びクローンを得た。

【０２３５】その形態学的特徴及びアルブミン及びアシアログリコプロテインレセプターの
サイトケラチン８．１８及び１９の発現に基づいて、これらの個体群及びクロー
ンは肝細胞であることが発見された。以来これらのヒト不死化肝細胞は、標準培
養皿上で、Ｌ−アルギニン、チミジン、ペニシリン／グルタミン及び１０％の補
体除去されたウシ胎児血清で補足されたＤＭＥＭ／ＨＡＭＦ１２培地の中で、
培養されてきた。

【０２３６】それぞれＨＨＩ−１０．３及びＨＨＩ−ＰＯＰ１０と名付けられたこれらの細
胞の１つのクローン及び１つの個体群が、２０００年１１月２４日にＩ−２５８
０及びＩ２５８１という受入れ番号でＣＮＣＭに寄託された。

【０２３７】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＩＶ／ＬＯＸベクターのライフサイクルの概略図。ＨＩＶベースのベクターの基本的要素すなわちＬＴＲｓ，ＳＤ，ＳＡ，Ψ，Ｇ
ａ，ＲＲＥについてはすでに記述されてきた（Naldini et al., 1996）。Ａ．ＨＩＶ／ＬＯＸベクターのライフサイクルＢ．対照のＨＩＶベースのベクターの概略図。バイシストロンカセットは、ヒトホスホグリセレートキナーゼ遺伝子プロモー
ター（ＰＧＫ）により駆動されるＥｇＦｐ遺伝子から成るモノシストロンカセッ
トによって置換されている。両方のＬＴＲ共に無傷である。

【図２】ＨｅＬａ細胞内のＣreリコンビナーゼの一過的トランスフェクションの後のＨ
ＩＶ／Ｌｏｘ−ｇｆｐＨＩＶベクター又はＨＩＶ／ＬＯＸベクター（２×１０⁶）で形質導入された
細胞を、核局在化シグナル−Ｃｒｅを発現するプラスミド３５μgとマウスＣＤ
８を発現するプラスミド５μgで一過的に同時トランスフェクションした。トラ
ンスフェクションから３日後に、細胞をＰＥ接合された抗ｍＣＤ８抗体で染色し
、ＦＡＣＳで分析した。ＣＤ８陽性（トランスフェクションされた）及びＣＤ８
陰性（トランスフェクションされていない）細胞（ＣＤ８／Ｇｆｐドットプロッ
ト、左側図版）についてゲートするため２色で細胞を分析した。ゲートされたＣ
Ｄ８＋又はＣＤ８−細胞の緑色（Ｇｆｐ）蛍光を次にヒストグラムとして表示、
Ｇｆｐ−陽性細胞の百分率を測定した。

【図３】Ｃｒｅリコンビナーゼを含有するアデノウイルスベクターでの形質導入後のＨ
ＩＶ／ＬＯＸ−ｇｆｐの切除ＨＩＶ／ＬＯＸｇｆｐ構成体（Ｈ４，５）を含有するＨｅＬａ細胞の安定した
クローンを、Ｃｒｅリコンビナーゼを含有するさまざまな用量のアデノウイルス
ベクターでインキュベートした。７日後、細胞をＦＡＣＳにより分析し、Ｇｆｐ
蛍光をヒストグラムとして表示し、Ｇｆｐ陽性細胞の百分率を測定した。未処置
のＨ４，５及び親ＨｅＬａを、それぞれＧｆｐ蛍光のための陽性及び陰性の対照
として並行して分析した。

【図４】残留するマーカー陽性ＨｅＬａ細胞は、ガンシクロビルでの処置後に効率良く
除去される。ＨｅＬａ細胞（左上図版）を、ＨＩＶ／ＬＯＸ−ｇｆｐベクターで形質導入し
た。６日後、ＨＩＶ／ＬＯＸ−ｇｆｐ細胞のバルク培養をＦＡＣＳにより分析し
（右上図版）、Ｃｒｅ−発現プラスミド（２×１０⁶個の細胞について４０μg）
でトランスフェクションした。４日後、細胞をＦＡＣＳ（左下図版）により分析
し、１０日間１μMのガンシクロビルでの処置に付した。処置後、細胞をＦＡＣ
Ｓにより残留ｇｆｐ蛍光について分析した。

【図５】ヒト初代細胞の可逆的不死化のために使用されたＨＩＶ／ＬＯＸベクターの概
略的表現。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 21/00 Ａ６１Ｐ 31/00 31/00 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 7/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 7/02 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 21/08 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者サルモン，パトリックフランス国、エフ−74100 ヴェトラ−モントゥー、アンパース・ドゥ・ラ・ラペ 35 (72)発明者トローノ，ディディエスイス国、ツェーハー−1245 コロンジュ −ベルリーヴ、シュマン・ドゥ・スー−シェール４Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA41 CA04 DA02 DA03 DA05 DA11 EA02 FA20 HA08 HA11 4B064 AF27 AG27 CA02 CA05 CA10 CA12 CA19 CA20 CC24 DA01 4B065 AA01X AA57X AA90X AA90Y AA95Y AB01 AB02 CA23 CA25 CA44 4C084 AA13 NA14 ZA752 ZA892 ZA942 ZB212 ZB262 ZB312 4C087 AA02 BC83 NA14 ZA75 ZA89 ZA94 ZB21 ZB26 ZB31

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】非分裂細胞又は緩分裂細胞のゲノム内の導入遺伝子を安定し
て組込む能力をもつベクターにおいて、ベクターが、少なくとも１つの不死化分
子を含むか又は発現する、ベクター。
【請求項２】細胞の核内に導入遺伝子を輸送する能力をもち、前記細胞の
ゲノム内に前記導入遺伝子を安定して組込む能力をもつベクターにおいて、ベク
ターが、少なくとも１つの不死化分子を含む、ベクター。
【請求項３】非分裂細胞又は緩分裂細胞を不死化する能力をもつことを特
徴とする、請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】前記ベクターによって遺伝的に修飾された細胞の目的の表現
型を不可逆的に修飾しないことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記
載のベクター。
【請求項５】前記細胞の目的の表現型を修飾することなく細胞を不死化す
る能力をもつベクター。
【請求項６】それが欠損であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれ
か１項に記載のベクター。
【請求項７】不死化分子が： − 増殖分子、 − 抗老化分子、 − 抗アポトーシス分子、 − 細胞の分化経路を修飾する能力をもつ分子、及び − これらの分子のいずれか１つをコードする遺伝子、からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記
載のベクター。
【請求項８】増殖分子が、発ガン遺伝子、ＳＶ４０大型Ｔ抗原、アデノウ
イルスＥ１Ａ、ヒト乳頭腫ウイルスＥ６又はＥ７、ｖ−ｍｙｃ、Ｂｍｉ−１、Ｓ
ｒｃ、ｒａｓ、又はこれらの分子のいずれか１つをコードする遺伝子からなる群
より選択されることを特徴とする、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】抗老化分子がテロメラーゼであることを特徴とする、請求項
７に記載のベクター。
【請求項１０】抗アポトーシス分子が、Ｂcl−２及びＦＬＩＰからなる群
より選択されることを特徴とする、請求項７に記載のベクター。
【請求項１１】細胞の分化経路を修飾する能力をもつ分子が、Notchレセ
プターであることを特徴とする、請求項７に記載のベクター。
【請求項１２】１つの不死化分子を含むことを特徴とする、請求項１〜１
１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１３】不死化分子が、増殖分子であることを特徴とする、請求項
１２に記載のベクター。
【請求項１４】少なくとも１つの増殖分子及び少なくとも１つの抗老化分
子を含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１５】Ｂmi−１及びテロメラーゼを含むことを特徴とする、請求
項１４に記載のベクター。
【請求項１６】少なくとも１つの増殖分子及び少なくとも１つの抗アポト
ーシス分子を含むことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のベ
クター。
【請求項１７】少なくとも１つの増殖分子、少なくとも１つの抗老化分子
及び少なくとも１つの抗アポトーシス分子を含むことを特徴とする、請求項１〜
１６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１８】Ｂｍｉ−１、テロメラーゼ及びＢｃｌ−２を含むことを特
徴とする、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】Ｔａｇ、Ｂｍｉ−１、テロメラーゼ及びＢｃｌ−２を含む
ことを特徴とする、請求項１７に記載のベクター。
【請求項２０】非分裂細胞又は緩分裂細胞が、非ヒト動物細胞又はヒト細
胞であることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２１】非分裂細胞が、内皮細胞、内分泌細胞、β細胞、肝細胞、
造血細胞、幹細胞、始原細胞、神経細胞、神経幹細胞、リンパ球、樹状細胞、上
皮細胞及びマクロファージからなる群より選択されることを特徴とする、請求項
１〜２０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２２】緩分裂細胞が、筋芽細胞又はケラチノサイトからなる群よ
り選択されることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のベクタ
ー。
【請求項２３】前記ベクターの標的細胞型に特異的な転写調節因子を含む
ことを特徴とする、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２４】前記ベクターを組込んだ細胞の脱不死化系をさらに含むこ
とを特徴とする、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２５】該ベクターの中に含有された不死化分子の欠失を可能にす
る系を含むことを特徴とする、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のベクター
。
【請求項２６】ｌｏｘＰ部位を含むことを特徴とする、請求項２５に記
載のベクター。
【請求項２７】レトロウイルスであることを特徴とする、請求項１〜２６
のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２８】前記レトロウイルスが、レンチウイルスであることを特徴
とする、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】下記成分：ＧＡＧの少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの機能を有する少なくと
も１つの成分、ＰＯＬの少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの機能を
有する少なくとも１つの成分、前記ベクターの付着及び標的細胞内への侵入を可
能にする成分、前記ベクターの核タンパク質複合体を前記ベクターの標的細胞の
核内に輸送することのできる要素及び逆転写及び組込みに必要なシス作用性要素
を含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３０】前記要素が、核タンパク質複合体と結合し、前記ベクター
の標的細胞の核移入機構によって認識される、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】前記要素が、逆転写酵素、基質タンパク質、ヌクレオカプ
シド、プロテアーゼ、インテグラーゼ及びｖｐｒからなる群より選択されている
、請求項２９〜３０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３２】前記要素が、レンチウイルスインテグラーゼである、請求
項２９〜３１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３３】前記要素が、ＨＩＶインテグラーゼである、請求項３２に
記載のベクター。
【請求項３４】前記要素が、核局在化シグナルを含む、請求項２９〜３３
のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３５】前記核局在化シグナルが、ＨＩＶ−１インテグラーゼから
誘導されている、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】前記要素が、標的細胞の核移入機構によって認識されるよ
うにその自然の構造について修飾を受ける、請求項２９〜３５のいずれか１項に
記載のベクター。
【請求項３７】前記要素が、標的細胞の核移入機構により認識されるよう
に突然変異を受ける、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】前記要素が、核親和性成分を添加することによって修飾さ
れる、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３９】核親和性成分を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記
載のベクター。
【請求項４０】前記核親和性成分が、ｖｐｒ、基質タンパク質又はインテ
グラーゼである、請求項３８〜３９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４１】前記要素が、核局在化シグナルを添加することによって修
飾される、請求項２９〜４０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４２】前記ベクターの付着及び標的細胞内への侵入を可能にする
成分がウイルスＥＮＶである、請求項２９〜４１のいずれか１項に記載のベクタ
ー。
【請求項４３】ＥＮＶが、広宿主性又は狭宿主性である、請求項２９〜４
２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４４】ＥＮＶが、モロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）ＥＮＶ及び
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ＥＮＶからなる群より選択される、請求項２９
〜４３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４５】ＶＰＲ，ＶＩＦ，ＮＥＦ，ＶＰＸ，ＴＡＴ，ＲＥＶ及びＶ
ＰＵからなる群より選択された少なくとも１つのウイルスタンパク質を含む、請
求項１〜４４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４６】分子が、核酸分子である、請求項１〜４５のいずれか１項
に記載のベクター。
【請求項４７】核酸分子が、転写調節分子に動作可能に連結されている、
請求項４６に記載のベクター。
【請求項４８】転写調節分子が、プロモーター、エンハンサー又はウイル
ス転写調節分子である、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】前記ベクターの成分が、少なくとも１つの不死化分子の導
入のためにターゲティングされた細胞の型に基づいて選択される、請求項１〜４
８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５０】前記ベクターの成分の各々又はすべてが、ＭｏＭｕＬＶ，
ＨａＭｕＳＶ，ＭｕＭＴＶ，ＧａＬＶ，ＲＳＶ，ＨＩＶ，ＳＩＶ，ＦＩＶ，ＢＩ
Ｖ，ＥＩＡＶ，ＶＩＳＮＡ又はＣＡＥＶから得られる、請求項１〜４９のいずれ
か１項に記載のベクター。
【請求項５１】請求項１〜５０のいずれか１項に記載のベクターを産生す
る方法であって、該方法が、下記：ＧＡＧの少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの機能を有する少なくと
も１つの成分をコードする核酸、ＰＯＬの少なくとも１つのタンパク質の少なく
とも１つの機能を有する少なくとも１つの成分をコードする核酸、前記ベクター
の付着及び標的細胞内への侵入を可能にする成分をコードする核酸、前記ベクタ
ーの核タンパク質複合体を前記ベクターの標的細胞の核内に輸送することのでき
る要素又は前記ベクターの核タンパク質と結合し標的細胞の核移入機構により認
識される要素をコードする核酸及び逆転写及び組込みのために必要なシス作用性
核酸によりフランキングされたパッケージングシグナルをコードする核酸、及び
調節分子に動作可能に連結された少なくとも１つの不死化分子の導入のためのク
ローニング部位を含む単数又は複数のベクターを適切なパッケージング宿主細胞
内に導入することを含む方法。
【請求項５２】さらに、前記トランスフェクションされた宿主細胞により
産生された組換え型ウイルスを回収することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】請求項１〜５０のいずれか１項に記載のベクターを産生す
る方法であって、該方法は、下記：ＧＡＧの少なくとも１つのタンパク質の機能をもつ少なくとも１つの分子をコー
ドする核酸、ＰＯＬの少なくとも１つのタンパク質の機能をもつ少なくとも１つ
の分子をコードする核酸（ここで前記第１又は第２の核酸によりコードされる少
なくとも１つのタンパク質が、標的細胞の核の中に前記ベクターの核タンパク質
複合体を輸送できるようにか又は標的細胞の核移入機構により認識されるように
修飾されている）、前記ベクターの付着及びその標的細胞内への侵入を可能にす
る成分をコードする核酸及び逆転写及び組込みのために必要なシス作用性核酸に
よってフランキングされたパッケージングシグナルをコードする核酸、及び調節
分子に対し動作可能に連結された少なくとも１つの不死化核酸分子の導入のため
のクローニング部位を含む単数又は複数のベクターを適切なパッケージング宿主
細胞内に導入することを含む方法。
【請求項５４】さらに、前記修飾された転写調節によって産生された組換
え型ウイルスを回収することを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】ベクターが、レンチウイルスから完全にか又は部分的に誘
導される、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】レンチウイルスが、ヒト免疫不全症ウイルスである、請求
項５５に記載の方法。
【請求項５７】導入することが、さらに、ｖｐｒ，ｖｉｆ，ｎｅｆ，ｖｐ
ｘ，ｔａｔ，ｒｅｖ，及びｖｐｕからなる群より選択された核酸分子を、少なく
とも１つのベクターが提供することを含む、請求項５１〜５６のいずれか１項に
記載の方法。
【請求項５８】請求項５１〜５７のいずれか１項に記載の方法により得る
ことのできる組換え型ベクター。
【請求項５９】非分裂細胞又は緩分裂細胞の不死化方法であって、非分裂
細胞又は緩分裂細胞の中に請求項１〜５０のいずれか１項に記載の少なくとも１
つのベクターを導入すること、及び前記非分裂細胞又は緩分裂細胞内で前記ベク
ターによりコードされた不死化分子を発現することを含む方法。
【請求項６０】前記細胞が、内皮細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、β細
胞、肝細胞、造血細胞、幹細胞、始原細胞、神経細胞、神経幹細胞、リンパ球、
樹状細胞、上皮細胞、顆粒細胞及びマクロファージからなる群より選択される、
請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】不死化が、インビトロ又はインビボで実施される、請求項
５９〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】ベクターが、レトロウイルス例えばレンチウイルスから全
体的又は部分的に誘導される、請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】複数のベクターが前記細胞内に導入され、前記ベクターの
各々か単数又は複数の不死化分子を含む、請求項５９〜６２のいずれか１項に記
載の方法。
【請求項６４】請求項１〜５０のいずれか１項に記載のベクターを産生す
る安定したパッケージング細胞系。
【請求項６５】請求項５９〜６３のいずれか１項に記載の方法によって得
ることができる不死化された細胞。
【請求項６６】不死化されていることを特徴とする、もともとは非分裂又
は緩分裂性である細胞。
【請求項６７】不死化されていて、そのもともとの目的の表現型を不可逆
的に失なわないことを特徴とする細胞。
【請求項６８】それらが可逆的又は条件的に不死化されることを特徴とす
る、請求項６６又は６７に記載の細胞。
【請求項６９】脱不死化後に、そのもともとの目的の表現型を回復するこ
とを特徴とする、請求項６７又は６８に記載の細胞。
【請求項７０】特異的作用によって脱不死化され得ることを特徴とする、
請求項６８又は６９に記載の細胞。
【請求項７１】特異的作用が、該細胞をｃｒｅリコンビナーゼと接触状態
におくこと又は外来性不死化分子を除去することである、請求項７０に記載の細
胞。
【請求項７２】もともと非分裂又は緩分裂性であり、請求項１〜５０のい
ずれか１項に記載のベクターに対応するプロウイルスをそのゲノム内に組込まれ
た状態で含む細胞。
【請求項７３】そのもともとの目的の表現型を不可逆的に失っておらず、
請求項１〜５０のいずれか１項に記載のベクターに対応するプロウイルスをその
ゲノム内に組込まれた状態で含む細胞。
【請求項７４】請求項１〜５０のいずれか１項に記載のベクターに対応す
るプロウイルスをそのゲノム内に組込まれた状態で含む、不死化された細胞。
【請求項７５】可逆的又は条件的に不死化される、請求項７４に記載の細
胞。
【請求項７６】そのゲノム内に少なくとも１つのＬＴＲ部位を含む、請求
項６５〜７５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７７】１つのＬＴＲ部位は、場合により、レンチウイルス由来例
えばＨＩＶ由来のようなレトロウイルス由来のものであり、組換え部位及び／又
はｌｏｘＰ部位を含む、請求項７６に記載の細胞。
【請求項７８】そのゲノム内に２つのＬＴＲ部位を含む、請求項７３〜７
５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７９】２つのＬＴＲ部位が、転写調節核酸分子に動作可能に連結
された少なくとも１つの不死化核酸分子によって分離されている、請求項７８に
記載の細胞。
【請求項８０】前記目的の表現型が、内皮細胞、筋芽細胞、ケラチノサイ
ト、β細胞、肝細胞、造血細胞、幹細胞、始原細胞、神経細胞、神経幹細胞、リ
ンパ球、樹状細胞、上皮細胞及びマクロファージからなる群より選択された細胞
型の表現型であることを特徴とする、請求項６７、６９及び７３のいずれか１項
に記載の細胞。
【請求項８１】内皮細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、β細胞、肝細胞、
造血細胞、幹細胞、始原細胞、神経細胞、神経幹細胞、リンパ球、樹状細胞、上
皮細胞及びマクロファージからなる群の中で選択されていることを特徴とする、
請求項６４〜８０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８２】被包されている、請求項６４〜８０のいずれか１項に記載
の細胞。
【請求項８３】膵臓β細胞であることを特徴とする、請求項６４〜８０の
いずれか１項に記載の細胞。
【請求項８４】ケラチノサイトであることを特徴とする、請求項６４〜８
０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８５】肝臓の類洞内皮細胞であることを特徴とする、請求項６４
〜８０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８６】筋芽細胞であることを特徴とする、請求項６４〜８０のい
ずれか１項に記載の細胞。
【請求項８７】樹状細胞であることを特徴とする、請求項６４〜８０のい
ずれか１項に記載の細胞。
【請求項８８】肝細胞であることを特徴とする、請求項６４〜８０のいず
れか１項に記載の細胞。
【請求項８９】インビトロで非分裂細胞又は緩分裂細胞を展開させるため
の請求項１〜５０のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項９０】請求項８３に記載の細胞を含むバイオ人工膵。
【請求項９１】請求項８４に記載の細胞を含む皮ふ。
【請求項９２】インビトロで目的のタンパク質を産生するための、請求項
６４〜８０のいずれか１項に記載の細胞の使用。
【請求項９３】薬学的研究のための、請求項８５に記載の細胞の使用。
【請求項９４】請求項８６に記載の細胞の融合から形成された筋管。
【請求項９５】抗腫瘍又は抗感染症物質を設計するための、請求項８７に
記載の樹状細胞の使用。
【請求項９６】熱傷又は潰瘍を処置するための、請求項８４に記載の細胞
の使用。
【請求項９７】筋肉を再構成するための、請求項８６又は９４に記載の細
胞の使用。
【請求項９８】Ｂリンパ球又は形質細胞であることを特徴とする、請求項
６４〜８０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９９】モノクローナル抗体を産生するための、請求項９８に記載
の細胞の使用。
【請求項１００】腫瘍性でないことを特徴とする、請求項６４〜８０のい
ずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０１】請求項６６〜１００のいずれか１項に記載の不死化され
た細胞が、その細胞中での前記目的のタンパク質の発現を可能にする条件下で、
インビトロ又はエキソビボで培養され、そして場合により前記タンパク質を回収
することを特徴とする、目的のタンパク質の産生のための方法。
【請求項１０２】目的のタンパク質が、前記細胞に対し内因性である、請
求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】前記目的のタンパク質が、前記細胞の遺伝的修飾の結果
として産生される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】前記遺伝的修飾が、前記細胞内への前記目的のタンパク
質をコードする遺伝子の挿入、又は前記タンパク質の発現を可能にする調節又は
コーディング配列の挿入を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】非分裂細胞又は緩分裂細胞を不死化する能力をもち、請
求項１〜５０のいずれか１項に記載の複数のベクターを含む、ベクターカクテル
。
【請求項１０６】 − 少なくとも１つの不死化分子を含む第１の不死化用
ベクター、及び − 第１のベクター内に含有されているものとは異なる少なくとも１つの不死
化分子を含む第２の不死化用ベクター、を含む、請求項１０５に記載のカクテル。
【請求項１０７】不死化用ベクターのうちの少なくとも１つが、不死化分
子として増殖分子を含有する、請求項１０６に記載のカクテル。
【請求項１０８】不死化用ベクターのうちの少なくとも１つが、不死化分
子として抗老化分子を含有する、請求項１０７に記載のカクテル。
【請求項１０９】ベクターの少なくとも１つがレンチウイルスベクターで
ある、請求項１０５〜１０８のいずれか１項に記載のカクテル。