ES2319238T3

ES2319238T3 - Composiciones para modular la longitud de los talomeros.

Info

Publication number: ES2319238T3
Application number: ES97928088T
Authority: ES
Inventors: Benoit Chabot
Original assignee: Gemin X Pharmaceuticals Canada Inc
Current assignee: Gemin X Pharmaceuticals Canada Inc
Priority date: 1996-07-01
Filing date: 1997-06-30
Publication date: 2009-05-05
Anticipated expiration: 2017-06-30
Also published as: EP0909317B1; US20020114797A1; US6294332B1; ATE417926T1; CA2259389A1; DE69739167D1; WO1998000537A1; AU3251597A; EP0909317A1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LA LONGITUD DE TELOMEROS Y AL PAPEL DEL RNPHN A1, UP1 O SUS DERIVADOS. MAS PARTICULARMENTE, LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE AL RNPHN A1, UP1 O SUS DERIVADOS PARA MANTENER O MODIFICAR LA LONGITUD DE TELOMEROS EN LAS CELULAS. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE IGUALMENTE A PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA AUMENTAR O DISMINUIR LA CAPACIDAD PROLIFERATIVA DE LAS CELULAS Y PARA RETARDAR O PRECIPITAR LA APARICION DE LA SENECTUD. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS AL RNPHN A1, UP1 O SUS DERIVADOS COMO REACTIVOS FARMACEUTICOS, TERAPEUTICOS Y DIAGNOSTICOS.

Description

Composiciones para modular la longitud de los telómeros.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la longitud de los telómeros y a su efecto sobre la proliferación y senescencia de las células. Más particularmente, la presente invención se refiere a hnRNP A1, UP1 o derivados de los mismos, para mantener o alterar la longitud de los telómeros en las células. Asimismo, la presente invención se refiere a composiciones para incrementar o reducir la capacidad proliferativa de las células y para retrasar o precipitar el inicio de la senescencia. La invención se refiere además a reactivos farmacéuticos, terapéuticos y diagnósticos relacionados con la longitud de los telómeros y/o a las modulaciones de la misma.

Antecedentes de la invención

Los telómeros son la estructura de ADN en los extremos de los cromosomas de los eucariotas, incluyendo el ser humano y comprenden longitudes variables de repeticiones de doble cadena que terminan con repeticiones ricas en G de una sola cadena originalmente identificados en levaduras y protozoos (Makarov et al., Cell 88:657-666, 1997).

Entre los artículos de revisión referentes a los telómeros se incluyen Greider, Ann. Rev. Biochem. 65:337, 1996, y Zakian, Science 270:1601, 1995. Entre los artículos relevantes sobre diversos aspectos de los telómeros se incluyen Cooke y Smith, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:213, 1986; Morin, Cell 59:521, 1989, 1989; Blackburn et al., Genome 31:553, 1989; Szostak, Nature (London) 337:303, 1989; Gall, Nature (London) 344:108, 1990; Henderson et al., Biochemistry 29:732, 1990; Gottschling et al., Cell 63:751, 1990; Harrington et al., Nature (London) 353:451, 1991; Muller et al., Cell 67:815, 1991; Yu et al., Cell 67: 823, 1991; Gray et al., Cell 67:807, 1991; de Lange, 1995, "Telomere Dynamics and Genome Instability in Human Cancer", E. Blackburn y C.W. Greider (editores), en: Telomeres, Cold Spring Harbor Laboratory Press, páginas 265 a 293, 1995; Rhyu, J. Natl. Cancer Inst. 87:884, 1995; Greider y Harley, "Telomeres and Telomerase in Cell Senescence and Immortalization", en: Cellular Aging and Cell Death, Wiley-Liss, Inc., páginas 123 a 138, 1996. Entre otros artículos de alguna relevancia se incluyen Lundblad et al., Cell 57:633, 1989, y Yu et al., Nature (London) 344:126, 1990.

El mantenimiento de la integridad de los telómeros resulta esencial para la supervivencia celular (Muller, The Collecting Net 13:181-195, 1938; Sandell et al., Cell 75:729-739, 1993). El potencial proliferativo de las células se ha correlacionado con alteraciones de la longitud de estas secuencias repetidas en tándem (Zakian, Ann. Rev. Genet. 23:579-604, 1989; Counter et al., EMBO J. 11:1921-1929, 1992).

La capacidad replicativa finita de las células humanas normales, por ejemplo los fibroblastos, está caracterizada porque presenta un cese de la proliferación a pesar de la presencia de factores de crecimiento séricos. Este cese de la replicación tras un máximo de 50 a 100 duplicaciones de la población in vitro se denomina senescencia celular (ver Goldstein, Science 249:1129, 1990; Hayflick y Moorehead, Exp. Cell Res. 25:585, 1961; Hayflick, ibid., 37:614, 1985; Ohno, Mech. Aging Dev. 11:179, 1979; Ham y McKeehan, "Media and Growth Requirements", W.B. Jacoby e I.M. Pastan (editores), 1979, en: Methods of Enzymology, Academic Press, NY, 58:44-93. La duración de la vida replicativa de las células es inversamente proporcional a la edad in vivo del donante (Martin et al., Lab. Invest. 23:86, 1979; Goldstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 64:155, 1969; Schneider y Mitsui, ibid. 73:3584, 1976) y por lo tanto se sugiere que refleja el envejecimiento in vivo a nivel celular.

La inmortalización celular (vida no limitada) puede considerarse un escape anormal de la senescencia celular (Shay et al., Exp. Cell Res. 196:33, 1991). Las células somáticas humanas normales aparentemente son mortales, es decir, presentan un potencial de replicación finito. En contraste, la línea germinal y las células tumorales malignas son inmortales (presentan un potencial proliferativo indefinido). Los cultivos de células humanas in vitro aparentemente requieren la ayuda de oncoproteínas transformantes para inmortalizarse e, incluso en este caso, la frecuencia de inmortalización es de entre 10^{-6} y 10^{-7} (Shay et al., Exp. Cell Res. 184:109, 1989). Se han avanzado una diversidad de hipótesis a lo largo de los años para explicar las causas de la senescencia celular. Una de dichas hipótesis propone que la pérdida de ADN telomérico con la edad, finalmente desencadena la salida del ciclo celular y la senescencia celular (Zakian, Ann. Rev. Genet. 23:579-604, 1989; Harley et al., Nature (London) 345:458-460, 1990; Hastie et al., Nature (London) 346:866-868, 1990; Allsopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10114-10118, 1992; Counter et al., EMBO J. 11:1921-1929, 1992).

Los fibroblastos primarios humanos en cultivo entran en crisis tras un número preciso de divisiones celulares asociado con el acortamiento gradual de los telómeros, punto en el que todas las células mueren (de Lange, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2882-2885, 1994). Los fibroblastos primarios de ratón presentan telómeros más largos y/o más estables y muestran un comportamiento similar al cultivarlos in vitro (Prowse y Greider, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4818-4822, 1994). Sin embargo, tras la crisis, las células primarias de ratón en cultivo se inmortalizan espontáneamente con una frecuencia de 10^{-6}, posiblemente debido a que telómeros más largos facilitan el crecimiento de células mutantes (de Lange, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2882-2885, 1994).

Debe indicarse, tal como se ha indicado anteriormente, que se han avanzado otras hipótesis para explicar la senescencia y que todavía no existe un consenso o una hipótesis universalmente aceptada para la misma. Anteriormente, la relación causal entre los telómeros y el cáncer/el envejecimiento/la senescencia se ha construido por completo basándose en estudios correlativos.

Los datos recientes han demostrado que los telómeros desempeñan un papel directo en la senescencia y transformación celulares. En efecto, Wright et al., EMBO J. 15:1734-1741, 1996, utilizando células negativas para la telomerasa que presentan una vida limitada en cultivo de tejidos, han demostrado que la introducción de oligonucleótidos portadores de repeticiones teloméricas causa el alargamiento de los telómeros e incrementa la capacidad proliferativa de estas células. Además, los autores afirman que "los estudios anteriores han demostrado una notable correlación entre la longitud de los telómeros y la senescencia celular. Los presentes resultados proporcionan la primera evidencia experimental de una verdad relación causal entre la longitud de los telómeros y una capacidad proliferativa limitada". Feng et al., Science 269:1236-1241, 1995, demostraron que la línea celular humana (HeLa) transfectada con un ARN antisentido de telomerasa, pierden ADN telomérico y empiezan a morir tras 23 a 26 duplicaciones celulares. Los autores afirman que "los resultados apoyan la hipótesis de que la pérdida de los telómeros conduce a la crisis y muerte celulares tras acortarse los telómeros hasta una longitud crítica".

La relación postulada entre senescencia/proliferación de las células y la longitud de los telómeros ha conducido a procedimientos terapéuticos y diagnósticos relacionados con la longitud de los telómeros o a la telomerasa, el enzima ribonucleoproteína implicado en la síntesis del ADN telomérico. La publicación PCT nº 93/23572 describe agentes oligonucleótidos que reducen la pérdida de secuencias teloméricas durante el cultivo de células in vitro, o que incrementan la longitud telomérica de las células inmortales in vitro. El mismo tipo de enfoque también se enseña en la publicación PCT nº 94/13383 y en la patente US nº 5.484.508, que hacen referencia a procedimientos y composiciones para la determinación de la longitud de los telómeros y la actividad de telomerasa, así como a procedimientos para inhibir la actividad de telomerasa en el tratamiento de las enfermedades proliferativas. También se enseñan procedimientos para incrementar o reducir la longitud de los telómeros a través de una acción sobre la telomerasa. Los agentes que se demuestra que reducen la pérdida telomérica de longitud de los telómeros durante la proliferación son oligonucleótidos que estimulan la síntesis de ADN en los extremos teloméricos, así como de telomerasa.

La publicación PCT nº 95/13383 da a conocer un procedimiento y composiciones para incrementar la longitud telomérica en las células normales, de manera que se incrementa la capacidad proliferativa de las células y se retrasa el inicio de la senescencia celular. La publicación PCT nº 96/10035 enseña que la longitud de los telómeros actúa como biomarcador de la renovación celular. Además, se da a conocer que la medición de la longitud de los telómeros puede utilizarse para diagnosticar e identificar el estadio del cáncer y de otras enfermedades, así como la senescencia celular.

Las partículas de ribonucleoproteína nuclear heterogénea (hnRNP) son proteínas abundantes en las células de mamífero, de entre las que los miembros A a U han sido los mejor caracterizados debido a sus propiedades de unión a ARN (Dreyfuss et al., Ann. Rev. Biochem. 62:289, 1993). Existen más de 20 de dichas proteínas hnRNP en las células humanas. La proteína hnRNP mejor caracterizada hasta el momento es la proteína RNP A1, que se ha demostrado que se encuentra implicada en el procesamiento alternativo del ARN (Mayeda et al., Cell 68:367-375, 1992; Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6924-6928). En efecto, la proteína hnRNP A1 presenta una elevada afinidad para el ARN in vitro (Bird y Dreyfuss, EMBO J. 13:1197-1204, 1994). UP1 es un producto proteolítico derivado de hnRNP A1 (Riva et al., EMBO J. 5:2267-2273, 1986). UP1 no presenta actividad en el procesamiento alternativo in vitro (Mayeda et al., EMBO J. 13:5483-5495, 1994). Los experimentos in vitro han demostrado que hnRNP A1 se une a oligonucleótidos que contienen secuencias de sitio de empalme 3' de vertebrado (Buvoli et al., Nucl. Acids Res. 18:6595, 1990). La versión ADN de las secuencias de sitio de empalme 3' comparten algunas similitudes con las repeticiones teloméricas de vertebrado (Ishikawa et al., Molec. Cell Biol. 13:4301-4310, 1993). Los datos in vitro referentes a hnRNP A1 (UP1) pueden resumirse de la manera siguiente: (1) A1 se une a oligonucleótidos de ADN que porta las secuencias de sitio de empalme 3' que contienen TTAGGT (Buvoli et al., Nucl. Acids Res. 18:6595, 1990); (2) UP1 es parte de los complejos ensamblados en oligonucleótidos portadores de repeticiones teloméricas (TTAGGG)_{n} (Ishikawa et al., Molec. Cell. Biol. 13:4301-4310, 1993), indicando que A1 y/o UP1 "podrían posiblemente" unirse a telómeros cromosómicos. Sin embargo, este resultado in vitro todavía no se ha correlacionado con datos in vivo y no puede demostrar la interacción directa de A1 y/o UP1 con las repeticiones teloméricas en el complejo formado. Además, los oligonucleótidos utilizados en el experimento portadores de repeticiones teloméricas también son similares al oligo de sitio de empalme 3' utilizado por Buvoli et al., Nucl. Acids Res. 18:6595, 1990. Esto podría significar que A1 (UP1) se une a las secuencias de sitio de empalme 3' y que la secuencia telomérica coincidentalmente es similar a un sitio de empalme 3' (versión ADN), y (3) Bird y Dreyfuss, EMBO J. 13:1197-1204, 1994, muestran que A1 se une a ARN y que la secuencia óptima reconocida por A1 es similar a un sitio de empalme 3' y a un sitio de empalme 5'. Aunque la secuencia de reconocimiento óptima también es similar a una repetición telomérica, la hipótesis de que A1 podría unirse a telómeros aparentemente ha sido desechada. Los modelos en los que A1 se une a su secuencia preferida en el contexto de una molécula de ARN, modulando, cortando, transportando y posiblemente traduciendo aparentemente han sido favorecidas (Bird y Dreyfuss, EMBO J. 13:1197-1204, 1994).

Las proteínas que se unen a repeticiones teloméricas pueden subdividirse en dos categorías: las que se unen a repeticiones de doble cadena, y las que se unen a repeticiones de una sola cadena ver Lin, BioEssays 15:555, 1993. Se han caracterizado varias proteínas que se unen a repeticiones de doble cadena. Entre ellas se incluyen RAP1 y TBF\alpha de levadura, PPT en Physarum y TRF en mamíferos.

Aunque TBF\alpha y PPT no se unen a oligonucleótidos que contienen secuencias teloméricas in vitro, no se ha demostrado que estas proteínas se unan a telómeros in vivo. RAP1, pero no TBF\alpha, influye sobre la longitud de los telómeros en las levaduras (Conrad et al., Cell 63:739, 1990). En los mamíferos, cabe indicarse que se ha demostrado que TRF une los telómeros in vivo (Chong et al., 1995, Science 270:1663). Además la sobreexposición de TRF estimula una reducción de la longitud de los telómeros, mientras que la expresión de una forma mutada de TRF causa el alargamiento de los telómeros (van Steensel et al., Nature (London) 385:740, 1997, y de Lange, patente WO97/08314).

Entre las proteínas que se unen a repeticiones teloméricas de una sola cadena in vitro se incluyen las proteínas \alpha y \beta de Oxytrichia y Stylonychia, \alpha de Euplotes, MF3 de pollo y XTEF de Xenopus. No se ha demostrado que las proteínas de vertebrado MF3 y XTEF se unan a telómeros in vivo ni se ha sugerido que la expresión de las mismas influya sobre el tamaño de los telómeros. Las proteínas NSR1, GBP2, cdc13/EST4 y EST1 de levadura se ha demostrado que se unen a ADN telomérico de levadura de una sola cadena (Lin y Zakian, Nucl. Acids Res. 22:4906, 1994; Nugent et al., Science 274:249, 1996; Virta-Pearlman et al., Genes Dev. 10:3094, 1996). Aunque NSR1 y GBP2 no afectan a la longitud de los telómeros in vivo, las cepas mutantes manipuladas para que no expresen cdc13p o para expresar formas mutadas de EST1 experimentan el desgaste de los telómeros a pesar de presentar cantidades típicas del tipo salvaje de actividad de telomerasa (Nugent et al., Science 274:249, 1996; Virta-Pearlman et al., Genes Dev. 10:3094, 1996). Se ha informado de que un número limitado de proteínas de mamífero, incluyendo las proteínas hn-RNP, se asocian a oligonucleótidos que portan repeticiones teloméricas (Ishikawa et al., Molec. Cell. Biol. 13:4301-4310, 1993; McKay y Cooke, Nucl. Acids Res. 20:6461-6464, 1992; de Lange, Seminars in Cell & Dev. Biol. 7:23-29, 1996; Sarig et al., J. Biol. Chem. 272:4474-4482, 1997). Todavía no se ha informado de que estas proteínas se unan a repeticiones teloméricas de una sola cadena y afecten a la longitud telomérica in vivo. En cualquier caso, la observación de que una proteína se une a secuencias teloméricas in vitro no puede considerarse predictiva de un papel en el tamaño de los telómeros in vivo.

De esta manera, sigue existiendo una necesidad de reactivos que no sean oligonucleótidos y telomerasa, que puedan influir sobre la longitud de los telómeros en las células, y de procedimientos para incrementar o reducir la capacidad proliferativa de las células y de retrasar o precipitar el inicio de la senescencia. La presente invención intenta satisfacer estas y otras necesidades, tal como se describe a continuación.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a terapias o diagnósticos asociados al control de la longitud de los telómeros. Entre las estrategias terapéuticas de la presente invención se incluyen reducir la velocidad de la cantidad absoluta de pérdida de longitud de los telómeros durante la proliferación celular, permitiendo de esta manera posponer la senescencia celular y reducir el nivel de fusión cromosómica y de otras aberraciones cromosómicas. Además, puede utilizarse la actividad de hnRNP A1/UP1 o derivados de la misma, para controlar enfermedades asociadas a la inmortalización celular, tales como la neoplasia.

Asimismo, la invención se refiere a la determinación del estado celular mediante el análisis de la longitud y nivel de los telómeros de hnRNP A1/UP1 y derivados de la misma. Se llevan a cabo ensayos que proporcionen información útil sobre la edad relativa y la capacidad proliferativa remanente de una amplia diversidad de tipos celulares en numerosos tejidos. Se utiliza la actividad ligante y/o el nivel de A1, y más preferentemente de UP1, como marcador para el diagnóstico e identificación de estadio de la neoplasia.

Debido a que se cree que una proteasa de tipo tripsina se encuentra implicada en la conversión entre hnRNP A1 a UP1 (Pandolfo et al., Nucl. Acids Res. 13:6577-6590, 1985), la presente invención también se refiere a esta proteasa de tipo tripsina como diana para influir sobre la longitud de los telómeros. Además, esta proteasa (magnitud absoluta o actividad) también puede utilizarse como marcador de la capacidad celular de proliferación de las células y para diagnosticar e identificar el estadio de la neoplasia.

El solicitante ha determinado que las células que no contienen cantidades detectables de hnRNP A1 presentan una longitud de repetición telomérica drásticamente acortada en comparación con las células que contienen niveles normales de hnRNP A1. El solicitante también ha determinado que restaurar la expresión de hnRNP A1 en células deficientes en hnRNP A1 estimula un incremento gradual de la longitud de los telómeros. Además, el solicitante también ha determinado que UP1, un producto proteolítico de hnRNP A1 que ha perdido su actividad en el procesamiento alternativo (Mayeda et al., EMBO J. 13:5483, 1994), también estimula un incremento gradual de la longitud de los telómeros al expresarse en células deficientes en hnRNP A1. De esta manera, el solicitante es el primero que proporciona datos que muestran que hnRNP A1 y el derivado del mismo, UP1, influyen sobre la longitud de los telómeros, descartando de esta manera un papel indirecto mediante procesamiento alternativo, sino más bien dando lugar a un factor implicado en la biogénesis y el mantenimiento de la longitud de los telómeros. Previamente a los experimentos del solicitante de los que se informa en la presente invención, no existía consenso en la técnica que permitiese predecir que dichos experimentos proporcionarían los datos observados por el solicitante o que dichas manipulaciones presentarían utilidad terapéutica.

La longitud de los telómeros se correlaciona con la duración de vida de una célula; mediante el incremento de la longitud de los telómeros, se incrementa la capacidad de una célula de replicarse; mediante la reducción de la longitud de los telómeros, se reduce la capacidad de una célula de replicarse. Los fragmentos de hnRNP A1 y de UP1, o las versiones mutadas de los mismos, se utilizan para prevenir y revertir la senescencia celular en el tratamiento de enfermedades tales como las enfermedades relacionadas con la edad (a título de ejemplo, no limitativos, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, el ictus, la osteoporosis y la aterosclerosis). El procedimiento puede utilizarse para generar células con elevada capacidad proliferativa para trasplante (a título de ejemplo, no limitativo, la terapia celular). Además, a título de ejemplos no limitativos de los mismos se incluyen el tratamiento del SIDA, la anemia, la leucemia y el linfoma. El procedimiento también puede utilizarse para evitar la senescencia celular de células en cultivo de diferente origen, incluyendo, aunque sin limitación, las células madre embrionarias no humanas y las células madre fetales y además resulta útil en técnicas de cultivo de tejidos y como procedimiento de prevención de enfermedades. Por lo tanto, los fragmentos de UP1 o las versiones mutadas se utilizan en el tratamiento de tumores para reducir el tamaño de los telómeros. Este procedimiento puede utilizarse para controlar las enfermedades asociadas con la inmortalidad celular, tales como la neoplasia (el cáncer) y las enfermedades proliferativas causadas por la infección con organismos patogénicos. Las versiones mutadas compiten con hnRNP A1 endógeno y fragmentos implicados en el mantenimiento de telómeros estables y resultan en la reducción de la longitud de los telómeros, causando inestabilidad genética y la muerte celular. Mediante el incremento de la actividad proliferativa de las células totipotentes o pluripotentes, excepto las células madre embrionarias humanas, pueden generarse y amplificarse células de cualquier tipo particular. La actividad proliferativa incrementada también puede resultar aplicable a hibridomas producidos a partir de células de mamífero, preferentemente células de ratón y humanas. El procedimiento resulta aplicable a todos los tipos de neoplasia (cáncer), al contrario que los enfoques basados en la telomerasa, que pueden resultar aplicables a determinados tipos de tumores que no presentan niveles detectables de actividad de telomerasa.

De esta manera, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para modular el tamaño de los telómeros, que comprende la utilización de una cantidad efectiva de hnRNP A1, UP1, fragmentos de derivados de hnRNP A1 o fragmentos y derivados de UP1 o de las proteasas implicadas en la conversión de hnRNP A1 en UP1.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona un procedimiento para el tratamiento de una afección asociada con una tasa de incremento de la proliferación de una célula, por ejemplo, la pérdida de las repeticiones teloméricas asociada a la proliferación celular. El procedimiento implica administrar a la célula una cantidad terapéuticamente efectiva de hnRNP A1, UP1, fragmentos de derivados de hnRNP A1 o fragmentos y derivados de UP1 o de la proteasa implicada en la conversión de hnRNP A1 en UP1 para reducir la pérdida de longitud de los telómeros dentro de la célula durante la proliferación. Dichos agentes resultan especialmente aplicables a afecciones relacionadas con la proliferación celular incrementada.

La expresión "tasa incrementada de proliferación" aplicada a una célula se refiere a que la célula presenta una tasa más elevada de divisiones celulares comparada con células normales de ese tipo celular, o comparada con células normales dentro de otros individuos de ese tipo celular. Entre los ejemplos de dichas células, aunque sin limitarse a ellas, se incluyen las células CD4+ de individuos infectados por VIH, fibroblastos del tejido conectivo asociados a enfermedades articulares degenerativas, degeneración muscular relacionada con la edad, astrocitos asociados con la enfermedad de Alzheimer y células endoteliales asociadas con la aterosclerosis. En cada caso, se observa que un tipo particular de célula o de grupo de células se replica a un nivel incrementado comparado con las células circundantes en aquellos tejidos, o comparado con individuos normales. por ejemplo individuos no infectados con el virus VIH. De esta manera, la invención proporciona administrar en aquellas células un agente que reduce la pérdida de longitud de los telómeros en aquellas células durante su proliferación. Resulta necesario que el agente mismo no enlentezca el proceso de proliferación, sino que permita que el proceso de proliferación continúe durante más divisiones celulares que las que se observarían en ausencia del agente. El agente también puede resultar útil para enlentecer la pérdida de las repeticiones teloméricas que se produce durante el envejecimiento normal, y para reducir la pérdida de repeticiones teloméricas expandiendo simultáneamente el número de células ex vivo para las terapias basadas en células. El agente podría de esta manera simplemente estabilizar la longitud de los telómeros.

Debe indicarse que los fragmentos y derivados de hnRNP A1 o UP1, útiles en la modulación de la longitud de los telómeros, podrán ser fácilmente identificados por los expertos ordinarios en la materia utilizando procedimientos de cribado rutinarios. Por ejemplo, se selecciona una célula particular que presenta una longitud de telómero conocida y se permite que prolifere y se mide la longitud de los telómeros durante la proliferación. Puede identificarse el análisis de la longitud de los telómeros en células que expresan diferentes derivados o fragmentos utilizando procedimientos descritos posteriormente u otros procedimientos conocidos por el experto ordinario en la materia. Los ejemplos no limitativos de dichos derivados y fragmentos comprenden hnRNP A1 in vitro mutagenizado en la parte que se encuentra ausente en UP1, y mutaciones tales como deleciones, inserciones, fusiones y similares de hnRNP A1 y UP1. El mismo principio resulta aplicable a la proteasa de tipo tripsina que convierte hnRNP A1 en UP1. En este caso, pueden someterse a ensayo derivados del mismo in vitro (células en cultivo) o in vivo mediante su papel indirecto en la determinación de la longitud de los telómeros.

En la presente memoria, hnRNP A1 y UP1 pretenden hacer referencia al ácido nucleico y/o a la proteína. Un experto ordinario en la materia reconocerá si se pretende hacer referencia al fragmento de proteína o de ácido nucleico.

En aspectos relacionados, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que incluye cantidades terapéuticamente eficaces de hnRNP A1, UP1, fragmentos de derivados de hnRNP A1 o fragmentos y derivados de UP1 o la proteasa implicada en la conversión entre hnRNP A1 y UP1 y tampones farmacéuticamente aceptables tal como se describe a continuación. Estas composiciones farmacéuticas pueden incluir uno o más de estos inhibidores o agentes y pueden coadministrarse con otros fármacos. Por ejemplo, AZT se utiliza comúnmente para el tratamiento del VIH y puede coadministrarse con un agente de la presente invención.

En otro aspecto relacionado, la invención proporciona composiciones para extender la capacidad de replicarse de una célula. Se proporciona durante la replicación celular una cantidad extensora de la replicación de un agente activo en la reducción de la pérdida de la longitud de los telómeros dentro de la célula. Tal como resultará evidente para los expertos ordinarios en la materia, este agente es similar al que resulta útil para el tratamiento de una afección asociada a una tasa incrementada de proliferación de una célula. Sin embargo, las composiciones resultan útiles para el tratamiento de individuos que no sufren de ninguna afección particular, pero en los que uno o más tipos celulares son limitativos en ese paciente, y la vida del cual puede extenderse mediante la extensión de la capacidad de dichas células de continuar la replicación. Es decir, se añade el agente para retrasar el inicio de la senescencia celular, caracterizada por la incapacidad de la célula de replicarse más en un individuo. Un ejemplo de este grupo de células incluye linfocitos presentes en pacientes con síndrome de Down (aunque el tratamiento de estas células también puede resultar útil en individuos que no se ha identificado que sufran de ninguna afección o enfermedad particular, sino simplemente para reconocer que una o más células o agrupaciones de células resultan limitativos durante la vida del individuo).

Resulta notable que la administración de dichos inhibidores o agentes no se espera que resulte perjudicial para ningún individuo particular. Sin embargo, en el caso de que se utilice la terapia génica para introducir los agentes de la invención en alguna población celular particular, debe procurarse garantizar que la actividad de dicho agente se regula cuidadosamente, por ejemplo mediante la utilización de un promotor que pueda regularse mediante la nutrición del paciente. De esta manera, por ejemplo, el promotor únicamente puede activarse en el caso de que el paciente ingiera un nutriente particular, y en caso contrario es inactivo. De esta manera, si la población celular se convierte en maligna, el individuo puede inactivar fácilmente la replicación de la célula y provocar que se convierta en senescente simplemente no ingiriendo más dicho nutriente.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para el diagnóstico de una afección en un paciente asociada con un nivel elevado de la actividad de proteasa de tipo tripsina responsable de convertir hnRNP A1 en UP1 dentro de una célula. El procedimiento implica determinar la presencia o la cantidad de dicha proteasa, o medir la actividad de la misma dentro de las células en dicho paciente. Pueden utilizarse procedimientos comunes para esta determinación.

Todavía en otro aspecto, la invención proporciona composiciones para incrementar la frecuencia de inmortalización de las células primarias normales que comprenden la introducción en las mismas de un segmento de ácido nucleico codificante de hnRNP A1, UP1 o fragmentos o derivados de los mismos. Un expresión incrementada de hnRNP A1, UP1 o fragmentos o derivados de los mismos debería evitar el acortamiento de los telómeros y la crisis celular.

Un segundo aspecto de la presente invención proporciona composiciones para el tratamiento de una afección asociada a un nivel elevado de actividad de telomerasa y/o con telómeros más largos y/o más estables dentro de una célula. Las composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que reduce o desestabiliza la longitud de los telómeros para la administración en una célula. Dichos agentes comprenden hnRNP A1, UP1, fragmentos o versiones mutadas de A1 o UP1, así como fragmentos o versiones mutadas de la proteína de tipo tripsina implicada en la conversión de A1 en UP1. El nivel de actividad de telomerasa puede medirse de acuerdo con la presente invención o mediante cualquier otro procedimiento existente o procedimiento equivalente. Entre los ejemplos de dichas afecciones se incluyen afecciones neoplásicas (cancerosas), o afecciones asociadas con la presencia de células que no se encuentran normalmente presentes en ese individuo, tal como parásitos protozoarios o patógenos oportunistas. La administración de dicho agente puede conseguirse mediante cualquier medio deseado bien conocido por los expertos ordinarios en la materia.

Entre los ejemplos no limitativos de dichos agentes también se incluyen la cadena antisentido de hnRNP A1 o los derivados de la misma. Además, entre estos agentes se incluyen ribozimas con diana en la degradación del ARNm de A1. Entre otros tipos de agentes comprendidos en la presente invención se incluyen ligandos que son específicos de hnRNP A1 o de UP1. Entre los ejemplos no limitativos de dichos ligandos se incluyen anticuerpos dirigidos contra hn-RNP A1, UP1 o derivados o fragmentos de los mismos.

La expresión "nivel elevado" referida a dicha expresión se refiere a que el nivel absoluto de actividad de telomerasa en una célula particular se encuentra elevada en comparación con las células normales en otros individuos que no sufren de la misma afección. Se aplica el mismo principio a un nivel elevado o a una actividad elevada de la proteasa de tipo tripsina indicada anteriormente, o a la actividad de A1 o de UP1 sobre la longitud de los telómeros.

Además, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" de un inhibidor es una expresión bien conocida. La cantidad realmente aplicada dependerá del individuo o animal en el que debe aplicarse el tratamiento, y preferentemente será una cantidad optimizada que permita conseguir un efecto inhibitorio sin efectos secundarios significativos (en el grado de que éstos puedan evitarse mediante la utilización del inhibidor). Es decir, si puede conseguirse la inhibición efectiva sin efectos secundarios con el inhibidor a una concentración determinada, esta concentración debe utilizarse y no una concentración más alta a la que pueden manifestarse efectos secundarios. Sin embargo, si los efectos secundarios son inevitables, debe utilizarse la cantidad mínima de inhibidor que resulta necesaria para conseguir la inhibición deseada.

Debe apreciarse que, al reconocerse que la proteasa que convierte hnRNP A1 en UP1 es una diana para afectar el tamaño de los telómeros, deberían cribarse los inhibidores de la actividad de proteasa en ensayos de la presente invención o sustitutos de los mismos, bien conocidos para el experto en la materia, para realizar el seguimiento y determinar cómo dichos inhibidores de la actividad de proteasa podría reducir la longitud de los telómeros en las células. Alternativamente, podrían identificarse los inductores o estimuladores de la actividad de proteasa.

El término "inhibidor" simplemente se refiere a cualquier reactivo, fármaco o compuesto químico capaz de inhibir la actividad de proteasa in vivo o in vitro. Dichos inhibidores pueden identificarse fácilmente utilizando protocolos de cribado estándares en los que una proteasa se pone en contacto con un inhibidor potencial y se mide el nivel de UP1 frente al de hnRNP A1 y finalmente la longitud de los telómeros, en presencia o en ausencia del inhibidor, o en presencia de diversas cantidades del mismo. De esta manera, no sólo pueden identificarse inhibidores o estimuladores útiles, sino que puede determinarse in vitro el nivel óptimo de dicho inhibidor o estimulador.

El aspecto terapéutico de la invención se refiere a la observación ahora evidente de que la capacidad de una célula de seguir siendo inmortal comprende la capacidad de dicha célula de mantener o de incrementar la longitud de los telómeros de los cromosomas dentro de dicha célula. Dicha longitud de los telómeros puede mantenerse con la presencia de actividad suficiente de la proteasa de tipo tripsina o de hnRNP A1, UP1 o derivados de los mismo. De esta manera, los enfoques terapéuticos para reducir el potencial de una célula de seguir siendo inmortal se centran en la inhibición de la actividad de proteasa o en la presencia de un inhibidor de UP1 o en el papel de hnRNP A1 de mantener la estabilidad de los telómeros en aquellas células en las que resulta deseable causar la muerte celular. Entre los ejemplos de dichas células, no limitativos, se incluyen células cancerosas, que son ejemplificativos de células somáticos que muestran una longitud o estabilidad incrementada de los telómeros y que se han convertido en inmortales. La presente invención permite entonces que dichas células se conviertan en inmortales nuevamente mediante una reducción del tamaño o la estabilidad de los telómeros. Como tal, la inhibición puede conseguirse de una multitud de maneras tal como, por ejemplo, proporcionando inhibidores de proteasa, mutantes negativos dominantes de hnRNP A1, de UP1 o de la proteasa, derivados de dichos mutantes negativos dominantes, o moléculas antisentido de hnRNP A1, de UP1 o de la proteasa que convierte el primero en el segundo.

Los inhibidores pueden utilizarse para el tratamiento de cánceres de cualquier tipo. Entre los ejemplos no limitativos de los mismos se incluyen tumores sólidos y leucemias, carcinoma, trastornos histiocíticos, leucemia, histiocitosis maligna, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin pequeño inmunoproliferativo, plasmacitoma, reticuloendoteliosis, melanoma y similar, osteosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, neoplasmas y para cualquier tratamiento o todas las demás afecciones en las que las células se han inmortalizado.

La expresión "moléculas antisentido" se refiere a fragmentos de ácido nucleico que son complementarios a su diana y que finalmente conducen a una inhibición de la producción de la proteína codificada por su diana. Estos antisentido puede ser segmentos cortos de ácido nucleico o segmentos largos. También pueden comprender modificaciones que incrementan su estabilidad. El diseño de moléculas antisentido apropiadas y derivados de las mismas es bien conocido por el experto ordinario en la materia. Estas moléculas antisentido contra hnRNP A1 pueden someterse a ensayo para sus efectos sobre la longitud de los telómeros de acuerdo con la presente invención u otros procedimientos
adecuados.

En otros casos, resulta importante ralentizar la pérdida de las secuencias de telómero, en particular de células asociadas a determinadas enfermedades (aunque dicho tratamiento no se encuentra limitado a ello, puede utilizarse en tratamientos del envejecimiento normal y tratamientos ex vivo). Por ejemplo, algunas enfermedades se manifiestan por una tasa rápida anormal de proliferación de uno o más grupos particulares de células. Un ejemplo de este tipo de enfermedad es el SIDA, en el que la muerte es causada por la senescencia temprana de las células CD4+. Resulta importante indicar que dichas células envejecen, no debido a la pérdida anormal de secuencias de telómeros (aunque éste puede ser un factor) sino debido a que la tasa replicativa de las células CD4+ resulta incrementada de manera que se produce la reducción de los telómeros a una tasa superior a la normal para ese grupo de células (Lundblad y Wright, Cell 87:369, 1996). De esta manera, la presente invención proporciona medios para estabilizar la longitud de los telómeros. Por lo tanto, el solicitante proporciona agentes terapéuticos que pueden utilizarse en el tratamiento de dichas enfermedades y, además, los procedimientos diagnósticos con los que pueden detectarse enfermedades similares de manera que puedan diseñarse e implementarse protocolos terapéuticos apropiados.

Específicamente, la pérdida de telómeros dentro de cualquier población celular particular puede reducirse mediante la provisión de hnRNP A1, UP1 o derivados de los mismos, la proteasa o estimuladores de A1, UP1 y similares. Estas moléculas pueden proporcionarse dentro de una célula con el fin de reducir la pérdida de telómeros o para inmortalizar dicha célula. Los expertos ordinarios en la materia reconocerán que pueden utilizarse otras actividades enzimáticas para incrementar el alargamiento de los telómeros dentro de dichas células, por ejemplo proporcionando determinadas secuencias víricas dentro de una célula, y entre los ejemplos no limitativos de las mismas se incluyen EBV y SV40. Además, pueden cribarse fácilmente moléculas equivalentes de este tipo, u otras moléculas, para determinar las que reducirán la pérdida de telómeros o estabilizarán la longitud de los mismos. Dicho cribado puede producirse in vitro, y los agentes terapéuticos descubiertos mediante dicho cribado pueden utilizarse en el procedimiento anterior in vivo. Debe interpretarse que en algunas situaciones, los ensayos in vitro tales como los desplazamientos en gel, pueden resultar suficientes para evaluar la actividad estabilizadora de la longitud de los telómeros de un agente. En otros casos, puede resultar necesaria la determinación de la longitud per se de los telómeros (no la unión de un agente a los mismos) en células en cultivo, por ejemplo. El experto en la materia será capaz de determinar qué ensayo (que no se limita a los dos indicados anteriormente) resulta suficiente para determinar el efecto del agente sometido a ensayo sobre la longitud de los telómeros.

Con respecto a los procedimientos diagnósticos, los ejemplos de dichos procedimientos resultan evidentes a partir de lo expuesto anteriormente con respecto a la terapia. Debido a que existe una correlación directa entre la duración de vida de una célula individual y la longitud de sus telómeros, estos procedimientos diagnósticos pueden resultar de gran importancia para predecir y evaluar la duración de vida potencial de cualquier tipo celular individual y para realizar un seguimiento de la pérdida de los telómeros de manera que pueda realizarse una estimación revisada de dicha duración de vida con el tiempo.

En determinadas enfermedades, por ejemplo la enfermedad del SIDA mencionada anteriormente, evidentemente resultaría importante realizar el seguimiento de la longitud de los telómeros en las células CD4+. Además, el reconocimiento de que el número de CD4+ es limitativo en dichos individuos permite diseñar un protocolo terapéutico en el que las células CD4+ pueden eliminarse de un individuo en una edad temprana, durante la detección inicial del SIDA, almacenarse en un banco y después reintroducirse en el individuo en una edad posterior, cuando el individuo ya no dispone del número requerido de células CD4+. De esta manera, puede extenderse la vida de un individuo mediante un protocolo que implica la administración ininterrumpida de las células limitantes de ese individuo en puntos apropiados del tiempo. Estos puntos apropiados pueden determinarse mediante el seguimiento de la senescencia de las células CD4+ o mediante la determinación de la longitud de los telómeros dentro de dichas células CD4+ (indicativos del momento en el que las células resultarán senescentes). De esta manera, en lugar de esperar hasta que la célula se convierta en senescente (y de esta manera provocar que el individuo se encuentre bajo riesgo de muerte), puede realizarse el seguimiento de la longitud de los telómeros hasta que la longitud se reduzca hasta un nivel inferior al que se haya determinado que es pre-senescente, y de esta manera puede optimizarse la temporización de la administración de nuevas células CD4+. Además, las células reintroducidas en el paciente podrían diseñarse para que presenten una duración de vida más larga, proporcionando agentes que estabilicen o alarguen el tamaño de los telómeros.

De esta manera, los procedimientos diagnósticos de la presente invención incluyen procedimientos en los que la longitud de los telómeros en diferentes poblaciones celulares se mide para determinar si alguna población celular particular es limitante en la duración de vida de un individuo, y después determinar un protocolo terapéutico para garantizar que dichas células ya no sean limitantes para ese individuo. Además, dichas poblaciones celulares pueden ser dianas específicas mediante la administración de fármaco específico para garantizar que se reduce y/o se estabiliza la pérdida de longitud de los telómeros, tal como se ha expuesto anteriormente.

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la lectura de la descripción no limitativa siguiente de las formas de realización preferidas de la misma proporcionadas únicamente a título de ejemplo haciendo referencia a los dibujos adjuntos y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos adjuntos:

la figura 1 muestra que la expresión de hnRNP A1 afecta a la longitud de los telómeros. (A) Análisis de transferencia western de la expresión de hnRNP A1 en células CB3 y de los derivados restaurados establemente para la expresión de A1. Se separaron las proteínas totales (5 \mug) de diversas células eritroleucémicas de ratón mediante SDS-PAGE. Tras la transferencia sobre nitrocelulosa, el anticuerpo monoclonal 9H10 (Bird et al., EMBO J. 13:1197, 1994, cortesía de G. Dreyfuss) se utilizó para detectar las proteínas hnRNP A1 mediante ECL (AmershamLife Sciences). Las células DP27-17 (carril 1) y CB7 (carril 5) son líneas celulares eritroleucémicas de ratón (Shibuya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3721, 1983; Ben-David et al., Genes Dev. 5:908, 1991) que expresan niveles normales de proteínas hnRNP A1. Las células CB3 (carril 2) son deficientes en expresión de hnRNP A1 (Ben-David et al., Mol. Cell. Biol. 12:4449, 1992; Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6924, 1994). Las células CB3-A1 (carril 3) son células CB3 que han sido establemente restauradas para la expresión de hnRNP A1, mediante la infección con un retrovirus recombinante. Los vectores retrovíricos se construyen mediante la inserción del ADNc de A1 de ratón (Ben-David et al., Mol. Cell. Biol. 12:4449, 1992) en el sitio EcoRI de pMSLV, un vector retrovírico que contiene el gen de resistencia a la neomicina controlado por el promotor pgk (Hawley et al., J. Exp. Med. 176:1149, 1992). Se transfectaron vectores retrovíricos recombinantes en células GP+A-86 (Hawley et al., J. Exp. Med. 176:1149, 1992). Tras la selección en presencia de G418, se recolectaron los stocks víricos y se determinaron los títulos de los mismos. A continuación, las células CB3 se infectaron con cada stock vírico y se seleccionaron los reservorios de células infectadas se seleccionaron en medio que contenía G418 (800 \mug/ml durante la primera semana y 400 \mug/ml posteriormente). Las células se sembraron dos veces semanalmente a una proporción de división de 1:20. Se produjeron células CB3-A1\alpha (carril 4) mediante infección de células CB3 con un retrovirus que porta el ADNc de A1 en orientación inversa. La posición del marcador de peso molecular se indica a la izquierda; las líneas celulares respectivas a partir de las que se prepararon los extractos de proteína se indican en la parte superior de cada carril; las posiciones de la proteína A1 y la isoforma procesada de la misma A1b se muestran a la derecha. (B, C) Se extrajo ADN genómico de células eritroleucémicas de ratón, se digirieron con HinfI y RsaI. Para cada carril, se cargaron 5 \mug de ADN digerido en el gel. El ADN estándar de peso molecular era una mezcla de ADN en escalera marcado en el extremo con ^{32}P (GIBCO) y ADN de lambda no marcado digerido con HindIII. Para confirmar la identidad de las señales teloméricas detectadas en las células CB7 y CB3, se digirió ADN genómico con la exonucleasa Bal31 previamente al tratamiento con endonucleasas de restricción. Este tratamiento eliminó las señales teloméricas permitiendo simultáneamente la detección de los fragmentos de restricción que contenían repeticiones de secuencias internas en el genoma del ratón (datos no representados). El ADN cortado se separó en un gel de agarosa al 0,5% y se hibridó con la sonda telomérica de mamífero ^{32}P-(CCCTAA)_{3}. En el panel C, el ADN de células CB3 no infectadas o de células CB3 infectadas con los virus A1 o A1\alpha se analizó tras 46 pases celulares. Se indican la posición y tamaño (en kb) de los marcadores de peso molecular (M) (carriles 1 en los paneles B y C).

La figura 2 muestra que UP1 estimula el alargamiento de los telómeros en las células CB3. (A) Se realizó el seguimiento de la expresión de ARN de UP1 y de A1 en células CB3, CB3-UP1 y de células CB3-A1\alpha previamente producidas mediante RT-PCR, tras la digestión de las muestras de ARN con ADNasa I. La posición de los cebadores oligonucleótidos se ilustra a la derecha. Los productos amplificados se separaron en un gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de etidio (izquierda). Se indican la posición y el tamaño de los productos amplificados, así como la posición de los marcadores de peso molecular (M). El conjunto de cebadores A1-893/A1-M permite la detección de ARN transcrito únicamente a partir del constructo A1 debido a que el constructo UP1 no contiene secuencias complementarias al cebador A1-893. Sin embargo, los ARNs generados a partir de los constructos A1 y UP1 contienen secuencias complementarias al cebador A1-647, permitiendo que el conjunto de cebadores A1-647/A1-M detecte ambos transcritos. (B) Se extrajo el ADN genómico de células CB7 y CB3 infectadas con los virus A1\alpha y UP1 en diferentes pases (número en paréntesis). El ADN se digirió y se hibridó con la sonda telomérica tal como se describe en la fig. 1.

La figura 3 muestra que UP1 se une específicamente a repeticiones teloméricas de vertebrado monocatenarias. Se llevó a cabo un ensayo de desplazamiento en gel (Virta-Pearlman et al., Genes Dev. 10:3094, 1996) con proteína GST-UP1 recombinante purificada a una concentración de 432 nM con 500 pM de d(T_{2}AG_{3})_{3} marcado en el extremo (carriles 1 a 8) u oligómero d(C_{3}TA_{2})_{3} (carril 9). Se añadieron competidores no marcadores en un exceso molar de 1 y 1.000 respecto al oligómero d(T_{2}AG_{3})_{3} telomérico de vertebrado marcado. Entre los oligómeros competidores se incluyen el oligómero telomérico de vertebrado (carriles 2 a 4) y el oligómero telomérico de levadura GGGTGTGGGTGTGTGTGGTGGG (carriles 5 a 7).

La figura 4 muestra la actividad de telomerasa en células de ratón deficientes en A1, y que contienen A1 y UP1. Los lisados celulares analizados se derivaron de células CB3 infectadas con vector vacío (carriles 2 y 4), células CB3-A1 (carriles 3 y 5), células CB3-A1\alpha (carriles 6 a 9), células CB3-UP1 (carriles 10 a 13) y células CB7 (carriles 1 y 14 a 17). Se utilizó el ensayo TRAP para realizar el seguimiento de la actividad de telomerasa (ver Kim et al., Science 266:2011, 1994; Broccoli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9082, 1995), llevado a cabo en células CB3 no infectadas e infectadas por virus que habían sido subcultivadas más de 40 veces. Los lisados celulares se prepararon utilizando el protocolo de lisis con detergente CHAPS. Se utilizó un equivalente de 10^{4} células en los carriles 1 a 5 y en los carriles 6, 10 y 14. Se llevaron a cabo diluciones en serie de los extractos tal como se indica en la parte superior de los carriles. Los productos de PCR se resolvieron en un gel no desnaturalizante de acrilamida al 15%. Se llevó a cabo una reacción de control en ausencia de extracto celular (C, carril 18). Se muestran las posiciones del cebador marcado (LP) y de la escalera de 6 pb de productos de PCR (AP).

La figura 5 muestra que los oligonucleótidos de ADN marcados con ^{32}P se mezclaron con perlas de glutatión sefarosa 4B que contenía o que carecía de la proteína de fusión GST-UP1. Tras 5 lavados de 1 ml en tampón que contenía NaCl 165 mM, se midió la recuperación de los oligos marcados. Se recuperó el oligonucleótido (TTAGGG)_{3} con el máximo rendimiento. Un experimento de control con perlas solas rindió menos de 10% de oligonucleótido (TTAGGG)_{3} unido. Se recuperó un oligonucleótido de ADN marcado que contenía la secuencia complementaria (CCCTAA)_{3} a un nivel de fondo. Un oligonucleótido no relacionado de longitud similar no se unió significativamente a GST-UP1. UP1 se asoció directamente a repeticiones teloméricas que portaban la secuencia TTAGGG. Los ensayos de desplazamiento en gel llevados a cabo con oligonucleótidos mutados indican que UP1 se une específicamente al oligonucleótido (TTAGGG)_{3}.

Descripción detallada de la invención

Se aislaron las líneas celulares CB3 y CB7 a partir de colonias de bazo independientes de un ratón BALB/c infectado durante el nacimiento con el virus de la leucemia de Friend-Murine (Shibuya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80:3721, 1983). Tanto las células CB3 como CB7 presentan sucesos de inserción retrovírica sostenidos cadena abajo de uno de los dos alelos codificantes de hnRNP A1 (Ben-David et al., Molec. Cell. Biol. 12:4449, 1992). El segundo alelo de hnRNP A1 se ha perdido en las células CB3 (Ben-David et al., Molec. Cell. Biol. 12:4449, 1992). En consecuencia, las células CB7 contienen niveles normales de proteína hnRNP A1, mientras que las células CB3 producen 200 a 500 veces menos transcritos de hnRNP A1 y niveles no detectables de proteína hnRNP A1 (Ben-David et al., Molec. Cell. Biol. 12:4449, 1992; Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6924, 1994) (fig. 1A). Se investigó el efecto de la deficiencia de hnRNP A1 sobre la longitud de los telómeros mediante análisis de transferencia southern (Harley et al., Nature (London) 345:458, 1990; Counter et al., EMBO J. 11:1921, 1992). Se aisló ADN genómico de células CB3 y CB7, se digirió con HinfI y RsaI, que no cortan dentro de las repeticiones teloméricas, y se separó en un gel de agarosa al 0,5%. El gel seco se hibridó directamente a una sonda telomérica marcada con ^{32}P d(CCCTAA)_{3}. Debido a que el número de repeticiones teloméricas varía en cromosomas diferentes y entre células, las señales de los fragmentos de restricción terminales (TRFs) aparecen desdibujados. Las células CB7 muestran una longitud media de los TRF de -20 kb (fig. 1B, carril 2). Por el contrario, los TRF en las células CB3 presentaban una longitud significativamente menor a 15 kb (fig. 1B, carril 3).

Con el fin de demostrar que hnRNP A1 desempeña un papel en el alargamiento de los telómeros, se restauró establemente la expresión de hnRNP A1 en las células CB3. La restauración de la expresión de hnRNP A1 se consiguió mediante la manipulación de vectores retrovíricos que portaban el ADNc de hnRNP A1 murino bajo el control del promotor retrovírico (ver la leyenda de la fig. 1). A modo de control, se construyó un vector retrovírico que contenía el ADNc de A1 en orientación inversa (A1\alpha). Todos los vectores retrovíricos portaban una copia del gen de la neomicina bajo el control del promotor fosfoglucoquinasa. Tras la transfección de los ADN retrovíricos recombinantes en una línea celular de empaquetamiento, se recolectaron las partículas víricas y se utilizaron para infectar células CB3. Se realizó el seguimiento de la expresión de hnRNP A1 tras el subcultivo extensivo de las células en medio que contenía G418. Los resultados del análisis de transferencia western indican que la expresión de hnRNP A1 se había restaurado a niveles normales en las células CB3-A1 (fig. 1A, carril 3). No se detectó proteína A1 en las células CB3 resistentes a G418 infectadas con el virus A1\alpha (CB3-A1 \alpha; fig. 1A, carril 4). Se aisló el ADN genómico y se analizó para cambios en la longitud de los telómeros. La infección de las células CB3 con el virus A1 condujo a un drástico incremento del tamaño de los TRF, que presentó una media de 20 kb tras 46 pases celulares (fig. 1C, carril 3). En contraste, tras la infección con el virus A1\alpha, las células cultivadas el mismo número de pases contenía TRFs que seguían presentando un tamaño comparable al del cultivo de células CB3 falsamente infectadas (fig. 1C, comparar el carril 4 con el carril 2). SE confirmó este resultado mediante un conjunto independiente de infecciones llevado a cabo en células CB3: se asoció la expresión de A1 con un incremento gradual de la longitud de los TRF que alcanzaron aproximadamente 20 kb y que permanecieron estables posteriormente a pesar del subcultivo continuo durante más de un año (datos no representados). Tal como puede observarse comparando la fig. 1B, carril 3 con la fig. 1C, carril 2, se observó alguna variación en la longitud de los telómeros en el cultivo de células CB3 durante su propagación durante periodos prolongados, tal como se observa en otras líneas de células inmortales (Strahl et al., Mol. Cell. Biol. 16:53, 1996). Sin embargo, las longitudes medias de los TRF en las células CB3 en todo momento siguieron siendo considerablemente más cortas que la longitud de los TRF en las células CB3-A1 derivadas del mismo cultivo de células CB3. La infección de las células CB7 con el virus A1 no condujo a la sobreexpresión de hnRNP A1, y no se observó ningún cambio en la longitud de los telómeros tras el subcultivo continuo de las células durante más de un año en medio que contenía G418 (datos no representados). Una diversidad de ensayos que ha incluido el crecimiento en medio con una concentración reducida de suero y la inyección en ratones indica que los cambios en la expresión de hnRNP A1 no afectaron de manera detectable las propiedades transformadas de las células CB3 (datos no representados).

Dado que hnRNP A1 modula el procesamiento alternativo del ARN (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:6924, 1994; Mayeda et al., Cell 68:365, 1992; Cáceres et al., Science 265:1706, 1994), es posible que hnRNP A1 influya sobre la selección del sitio de empalme en un pre-ARNm alternativamente procesado el producto del cual afecte a la longitud de los telómeros. Para analizar si el efecto de A1 sobre los telómeros dependía de su actividad como factor de procesamiento alternativo, los presentes inventores sometieron a ensayo el efecto de la expresión de UP1 en las células CB3. UP1 es un fragmento proteolítico de hnRNP A1 identificado inicialmente como proteína de unión a ADN monocatenario (Riva et al., EMBO J. 5:2267, 1986; Herrick et al., J. Biol. Chem. 251:2124-2133, 1976; Cobianchi et al., J. Biol. Chem. 263:1063, 1988; Casas-Finet et al., J. Mol. Biol. 229:873, 1993). UP1 carece por completo de actividad en el procesamiento alternativo (Mayeda et al., EMBO J. 13:5483, 1994). Se produjo un retrovirus recombinante UP1 y se utilizó para infectar células CB3. Brevemente, se produjo el fragmento de ADNc de UP1 mediante amplificación por PCR de un clon de ADNc de A1 utilizando los oligonucleótidos A1-M [5'-AATTCTTTTGCTCGACGCTGCCGAG-3'; la secuencia subrayada se localiza en al final del extremo 5' del ADNc del A1 murino (Ben-David et al., Mol. Cell. Biol. 12:4449, 1992) y A1-647 [5'-AATTCTGTCAGCGACCTCTCTGACTGGATGA-3'; la secuencia subrayada es complementaria a la región codificante del dominio carboxi-terminal de UP1]. La amplificación por PCR conduce a la inclusión de un codón de parada inmediatamente después del codón que especifica el último aminoácido en UP1. Se subclonó el fragmento de UP1 de 661 nt, se secuenció y se insertó en forma de fragmento EcoRI en el sitio EcoRI de pMSCV. Se produjeron stocks víricos y se utilizaron para infectar células CB3 tal como se ha descrito anteriormente. Debido a que el epítopo reconocido por el anticuerpo anti-A1 se encuentra ausente de la proteína UP1, se utilizó un ensayo de PCR-RT para realizar el seguimiento de la expresión de UP1 (fig. 2A). Se aisló el ADN genómico a intervalos regulares tras la infección y se analizó para cambios en la longitud de los TRF. Mediante la comparación con una infección paralela del mismo cultivo de células CB3 con el virus A1\alpha (fig. 2B, carriles 2 a 5), la infección con el virus UP1 condujo a un incremento gradual del tamaño de los TRF, migrando la mayoría de los fragmentos en el intervalo de 8 a 12 kb tras 57 pases celulares (fig. 2B, carriles 6 a 9). Los pases adicionales mostraron que las longitudes de los telómeros siguieron incrementándose. En efecto, tras 86 pases, se demostró que las longitudes de los telómeros en las células CB3-UP1 comigraban con los de las células CB7 (datos no representados). En ningún caso se observó un incremento del tamaño e intensidad de hibridación de los TRF tal como el observado al expresarse hnRNP A1 (fig. 1C, carril 3) o UP1 (fig. 2B, carril 9), en células CB3 falsamente infectadas o en células CB3 infectadas por el virus A1\alpha. De esta manera, el incremento del tamaño de los TRF es específico de la expresión de A1 y de UP1 en las células CB3 y no se debe a la variación clonal.

A pesar del hecho de que los oligómeros monocatenarios que portan repeticiones teloméricas se unen a A1 (Abdul-Manan et al., Biochemistry 35:3545, 1996; ibid., Nucleic Acids Res. 24:4063, 1996) y se ensamblan formando complejos que contienen UP1 en extractos de HeLa (Ishikawa et al., Mol. Cell. Biol. 13:4301, 1993), todavía no se conoce si UP1 puede interaccionar directamente con dichas repeticiones. Utilizando un ensayo de desplazamiento de movilidad en gel, se ha demostrado que UP1 recombinante purificado se une al oligonucleótido telomérico monocatenario de vertebrado d(TTAGGG)_{3} (fig. 3, carriles 1 y 8). No pudo detectarse UP1 ligante del oligonucleótido complementario d(CCCTAA)_{3} (fig. 3, carril 9). Un exceso de oligómero que contenía repeticiones teloméricas de levadura fue considerablemente menos eficiente que d(TTAGGG)_{3} frío en la competición con la unión de UP1 (fig. 3, carriles 2 a 8). Estos resultados sugieren que UP1 se une preferentemente a repeticiones teloméricas de vertebrado que portan repeticiones TTAGGG.

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Las longitudes reducidas de los segmentos de repetición telomérica en las células CB3 podrían ser una consecuencia de la actividad de telomerasa severamente reducida o ausente en estas células (Rogan et al., Mol. Cell. Biol. 15:4745; Bryan et al., EMBO J. 14:4240, 1995). Para investigar si los cambios de los niveles de hnRNP A1/UP1 se asociaban a diferencias de actividad de la telomerasa, los presentes inventores llevaron a cabo un protocolo de amplificación de las repeticiones teloméricas (TRAP) (Kim et al., Science 266:2011, 1994; Broccoli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9082, 1995) utilizando extractos preparados a partir de las células deficientes en A1, que expresan A1, A1\alpha y UP1. Debido al modo de alargamiento de repeticiones mediado por telomerasa, el ensayo TRAP típicamente produce una mezcla de productos con una periodicidad de 6 pares de bases (Kim et al., Science 266:2011, 1994; Broccoli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9082, 1995). No se observó ninguna diferencia de actividad o de capacidad de procesamiento de la telomerasa entre las células CB7, CB3 y CB3 infectadas por virus (fig. 4).

Los cambios graduales en los segmentos de repetición telomérica tras la restauración de la expresión de hnRNP A1 o de UP1 en las células CB3 recuerdan a un retraso fenotípico similar asociado con los cambios en los segmentos teloméricos de levadura causados por la sobreexpresión de Rap1p (Conrad et al., Cell 63:739, 1990) por mutaciones en los genes EST1 y EST4/CDC13 (Nugent et al., Science 272:249, 1996; Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13760, 1996; Lundblad et al., Cell 57:633, 1989) o por determinados alelos mutantes de RAP1 (Lustig et al., Science 250:549, 1990; Kyrion et al., Mol. Cell. Biol. 12:5159, 1992). HnRNP A1 no comparte una similitud significativa con ésta y otras proteínas de levadura que se unen a repeticiones teloméricas monocatenarias o que afectan a la longitud de los telómeros (Nugent et al., Science 272:249; Virta-Peariman et al., Genes Dev. 10:3094, 1996; Greenwell et al., Cell 82:823, 1995; Morrow et al., Cell 82:831, 1995; Runge et al., Mol. Cell. Biol. 16:3094, 1996), ni con proteínas de Tetrahymena (Collins et al., Cell 81:677, 1995) ni de Oxytricha (Hicke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1481, 1990; Gray et al., Cell 67:807, 1991) que son componentes de la telomerasa o se asocian con los telómeros in vivo. HnRNP A1 también es bastante diferente de la proteína TRF humana que se asocia con las repeticiones teloméricas bicatenarias (Zhong et al., Mol. Cell. Biol. 12:4834, 1992; Hanish et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8861, 1994; Chong et al., Science 270:1663, 1995). Mientras que los miembros de la familia de proteínas hnRNP que no son hnRNP A1 pueden asociarse a repeticiones teloméricas in vitro (Ishikawa et al., Molec. Cell. Biol. 13:4301, 1993; McKay et al., Nucleic Acids Res. 20:6461, 1992), su presencia en células CB3 aparentemente no es suficiente para evitar el acortamiento de los telómeros. Notablemente, la deficiencia de hnRNP A1 no se asoció a una actividad de telomerasa ausente o severamente reducida, ni la restauración de la expresión de hnRNP A1 o de UP1 afectó a la actividad de telomerasa in vitro. Este resultado sugiere que hnRNP A1/UP1 no es en sí mismo una parte obligatoria del complejo de telomerasa activo ni resulta necesario, por lo menos in vitro, para la presentación de sustrato a la telomerasa. Los resultados de los presente inventores plantean la posibilidad de que el procesamiento proteolítico de A1 en UP1 pueda ser parte de la ruta normal que modula la función de A1 en la biogénesis de los telómeros. La unión de A1 o de UP1 a ADN monocatenario que incluye repeticiones TAGGGT de vertebrado sugiere posibles mecanismos por los que A1/UP1 podría estimular el alargamiento de los telómeros. HnRNP A1/UP1 podría proteger las colas monocatenarias expuestas frente a la degradación nucleolítica. Debido a que UP1 estimula a la ADN polimerasa \alpha (Riva et al., EMBO J. 5:2267, 1986), la unión de UP1 a ADN telomérico monocatenario también podría facilitar la síntesis de cadena de C tras el alargamiento de la telomerasa.

La estabilización de los telómeros resulta esencial para la inmortalización celular. Aunque la activación de la telomerasa se ha asociado a la inmortalización y al cáncer (Counter et al., EMBO J. 11:1921, 1992; Kim et al., Science 266:2011, 1994; Counter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2900, 1994), se han descrito células inmortalizadas y de cáncer que carecen de actividad de telomerasa detectable (Rogan et al., Mol. Cell. Biol. 15:4745, 1995; Bryan et al., EMBO J. 14:4240, 1995; Kim et al., Science 266:2011, 1994). Resulta interesante que la expresión de hnRNP A1 se incrementa con la transición del estado quiescente al estado proliferativo (Le Stourgeon et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 42:885, 1977; Planck et al., Nucleic Acids Res. 24:11663, 1988; Biamonti et al., J. Mol. Biol. 230:77, 1993). Además, mientras que hnRNP A1 se expresa a niveles elevados en células germinales, líneas de células inmortalizadas y tumores, la expresión de hnRNP A1 se reduce en las células somáticas diferenciadas y en células senescentes que experimentan la reducción de los telómeros (Kamma et al., Exp. Cell. Res. 221:187, 1995; Hubbard et al., Exp. Cell Res. 218:241, 1995; Zhang et al., Science 276:1268, 1997). Debido a que la variación de los niveles de hnRNP A1 afecta a la estructura de los telómeros in vivo, es posible que hnRNP A1/UP1 desempeñe un papel en la modulación de la estructura de los telómeros durante el desarrollo, el envejecimiento y la neoplasia.

La presente invención se describe con mayor detalle en los ejemplos no limitativos siguientes.

Ejemplo 1 Procedimiento para incrementar la frecuencia de inmortalización de las células primarias normales

El procedimiento contemplado para incrementar la frecuencia de inmortalización de las células primarias normales implica, en una forma de realización, introducir moléculas de ADN recombinantes que portan el gen hnRNP A1 o versiones modificadas del mismo en células primarias. La sobreexpresión de A1 o las versiones modificadas deberían evitar el acortamiento de los telómeros y la crisis celular. Preferentemente, se utiliza UP1 o una versión modificada del mismo.

Los medios para introducir material recombinante en las células eucarióticas se encuentran bien descritos y pueden llevarse a cabo mediante infección vírica, lipofección, electroporación, transfección, etc. A continuación se describe la técnica de infección vírica utilizada para restaurar la expresión de hnRNP A1 en las células CB3.

1. Producción de virus A1 recombinante

Ya han sido generados los virus A1, A1b y UP1. Los ADNc de A1, de A1b y de UP1 se han insertado en el vector de expresión retrovírico MSCV (Hawley et al., Leukemia Research 15:659-673, 1991) mediante procedimientos de clonación estándares. El vector retrovírico que se ha utilizado también contenía un gen de neomicina que proporciona resistencia al fármaco G418. Pueden construirse vectores retrovíricos para que contengan otros genes de marcador seleccionable que proporcionan resistencia a otros fármacos, por ejemplo higromicina y puromicina.

a): se mezcló 0,1 \mug de cada inserción de ADNc de A1 (fragmento EcoRI) con 0,1 \mug de MSCV linearizado en el sitio EcoRI. Se llevó a cabo ligación con ADN ligasa de T4 y la mezcla se transformó en bacterias. Las colonias se cribaron para la presencia de inserciones en MSCV y se determinó la orientación de la inserción mediante digestión con endonucleasas de restricción. Estos son procedimientos de clonación estándares y bien descritos.

b): se transfectaron moléculas de ADN recombinante en una línea celular ecotrópica de empaquetamiento libre de ayudante (GP+E-86; Markowitz et al., J. Virol. 62:1120, 1988) que proporciona virus capaces de infectar células de ratón. En la actualidad se encuentran disponibles diferentes líneas de células de empaquetamiento. Algunas líneas de células de empaquetamiento permiten la producción de virus anfotrópicos, es decir virus que pueden infectar una diversidad de especies (incluyendo el ser humano).

Tras la transfección, las células de empaquetamiento transfectadas se cultivaron en presencia de G418 hasta la aparición de colonias resistentes a G418. Estas colonias pueden agruparse o cultivarse individualmente y cribarse para la producción vírica máxima.

Las partículas víricas se recolectan mediante el cambio del medio de cultivo al alcanzar las células una confluencia de entre 70% y 80%. Se aplican 4 ml de medio de cultivo sin G418 a las células en una placa de Petri de 100 mm y se dejan durante 4 a 16 horas. Las placas de Petri se dejan sobre hielo y el sobrenadante se transfiere a tubos. Las células se centrifugan a 1.800 rpm durante 3 minutos. A continuación, el sobrenadante se transfiere a un tubo limpio en hielo. El sobrenadante puede almacenarse a -80ºC en alícuotas pequeñas (0,5 ml).

2. Células

La infección vírica con el fin de incrementar la viabilidad puede conseguirse, en principio, en cualquier tipo de célula primaria, incluyendo, aunque sin limitación, células madre embrionarias, células madre hematopoyéticas y células madre de origen neural.

3. Infección

La infección de las células de ratón (o de cualquier otra especie de mamífero, incluyendo el ser humano) se consigue mediante:

a): la eliminación del sobrenadante de cultivo de las células cultivas en placas de Petri (aproximadamente 10^{6} células/placa de Petri de 100 mm),

b): la mezcla de 0,5 ml de sobrenadante vírico + 0,5 ml de polibreno frío (100 \mug/ml de PBS) en un tubo frío,

c): la aplicación de la solución vírica en células,

d): la incubación a 37ºC durante 40 minutos, agitando cada 10 a 15 minutos,

e): la aspiración del sobrenadante vírico y el enjuague de las células con medio sin G418,

f): tras 24 horas, el cambio del medio de cultivo con medio que contiene G418. Las colonias resistentes aparecen 10 a 14 días después.

Ya ha sido demostrado que los virus A1 recombinantes pueden infectar una diversidad de células de ratón, incluyendo las células eritroleucémicas (CB3, DP28, DP27, CB7), las células de neuroblastoma (N2a) y las células fibroblásticas inmortalizadas (NIH3T3). A partir de este punto, se recolectan células a intervalos regulares para el análisis de los telómeros (ver la sección i) y la expresión de proteínas A1 o derivados (ver la sección ii). Debe indicarse que las células infectadas no pueden producir partículas víricas debido a que carecen de la capacidad de producir los componentes víricos requeridos para la producción vírica; únicamente las líneas de células de empaquetamiento poseen esa capacidad.

Ejemplo 2 Análisis del ADN telomérico 1) Extracción del ADN

a): Se resuspendieron células (<10^{7} células) en 0,4 ml de tampón ADN-A en un tubo de eppendorf de 1,5 ml (tampón A=Tris 10 mM, pH 7,5 a 8,0), EDTA 10 mM, NaCl 10 mM). Se añadió un volumen igual de tampón ADN-B (ADN-A más SDS al 2%) que contenía proteinasa K (100 \mug/ml) a la mezcla de las células. La mezcla se incubó durante 3 horas a 37ºC, agitando ocasionalmente. Se añadió un volumen igual de fenol saturado con agua y se mezcló en un agitador giratorio durante 10 a 20 minutos. Tras microcentrifugar durante 3 a 5 minutos, se eliminó la fase acuosa utilizando una pipeta de 1 ml en la que se había cortado el extremo de la punta de plástica para evitar romper el ADN. Se repitió la extracción utilizando fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). Se eliminó la fase acuosa tras la centrifugación y se llevó a cabo una extracción adicional utilizando cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). La fase acuosa se transfirió a un tubo transparente y se elevó la concentración de NaCl a 0,2 M, bajo agitación suave. Se añadieron lentamente dos volúmenes de etanol absoluto, el tubo se mezcló suavemente hasta iniciarse la precipitación del ADN. El ADN precipitado se transfirió a la punta de una micropipeta de vidrio sellada. El ADN transferido se enjuagó en etanol al 70% y etanol absoluto sucesivamente y se dejó secar. Se rompió la punta de vidrio en un tubo de eppendorf que contenía agua (aproximadamente 100 \mul para 10^{6} células). El tubo se dejó en un agitador durante la noche para permitir que se disolviese el ADN y se obtuvo una lectura espectrofotométrica de la densidad óptica a 260 nm de una alícuota de 10 a 20 \mul en 1 ml de agua (1 D.O.=50 \mug/ml).

2) Ensayo en gel

Se digirieron 5 \mug de ADN con enzimas de restricción apropiados para el análisis de los telómeros (por ejemplo HinfI y RsaI). En un volumen total de 20 \mul, los tubos se incubaron durante un periodo de entre 3 horas y toda la noche a 37ºC; tras la incubación, se añadieron 2 \mul de pigmento de glicerol. Estas muestras se cargaron en un gel de agarosa al 0,5% preparado en 0,5X TBE (10X TBE=216 g de base Tris, 18,6 g de Na_{2}EDTA, 110 g de ácido bórico, H_{2}O hasta 2 litros) que se dejó solidificar durante por lo menos 1 hora. Se vertió 0,5X TBE sobre el gel de manera que cubriese la mitad del grosor del gel. El gel se sometió a 50 voltios durante 1 hora. Tras entrar el pigmento en el gel, el gel se cubrió con 0,5X TBE y el voltaje se incrementó hasta máximo 30 durante 17,5 horas. Transcurrido este periodo, el gel se dejó sobre 2 trozos de papel Whatman y se cubrió con envoltorio Saran Wrap. El gel se secó a 60ºC durante 30 minutos. El gel seco se dispuso en una solución desnaturalizante (M NaCl a 1,515 M, NaOH a 0,5 N) con agitación suave durante 15 minutos. La solución desnaturalizante se eliminó y el gel se embebió en una solución neutralizante (M NaCl a 1,515 M, Tris-HCl a 0,5 M con pH 8) con agitación suave durante 10 minutos. El gel se eliminó y se dispuso en una bolsa de plástico y se añadieron 5 ml de la solución hibridante, y se añadieron 20 ml adicionales de la solución hibridante que contiene la sonda telomérica. La bolsa se selló y se dejó incubar a 37ºC durante 16 horas. La solución hibridante se eliminó y el gel se sumergió en 0,24X SSC (20X SSC= 350,6 g de NaCl, 176,4 g de citrato sódico, volumen se ajusta a 2 l con H_{2}O, se ajusta el pH a 7,0) con agitación durante 7 minutos. Se sustituyó con 0,24X SSC fresco, con agitación durante 7 minutos. La etapa e lavado se repitió. El gel se eliminó y se dispuso en papel Whatmann y se cubrió con envoltorio Saran Wrap. El gel se expuso a película de rayos X durante 1 a 3 días.

Solución hibridante (100 ml) = 25 ml de 20X SSC, 10 ml de solución de Deinhart, 3 \mul de ATP 100 \muM, 33 \mul de ADN de esperma de salmón desnaturalizado (10 mg/ml), 1 ml de pirofosfato 5 mM/Na_{2}HPO_{4} 10 mM.

3) Preparación de sonda telomérica

Se preparó lo siguiente: 5 \mul que contenían 5 pmoles de (C_{3}TA_{2})_{3}, oligonucleótido, 8 \mul de tampón de quinasa de T4, 5 \mul de \gamma-^{32}P-ATP (Amersham), 1 \mul de quinasa de T4 y 61 \mul de H_{2}O, y se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Se utilizaron 20 \mul para cada experimento de hibridación en gel de telómero.

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Ejemplo 3 Análisis de la expresión de hnRNP A1 1) Lisis celular

Se centrifugaron 5 x 10^{6} células y se enjuagaron dos veces en PBS-A (10 g de NaCl, 0,25 g de KCl, 1,4 g de Na_{2}HPO_{4}, 0,25 g de KH_{2}PO_{4}, H_{2}O hasta 4 litros). El pellet celular se transfirió a un tubo de 1,5 ml y se resuspendió en 500 \mul de PBS-A al que se añadieron 500 \mul de pigmento Laemmli 2X. La mezcla anterior se hirvió durante 5 minutos y se almacenó a -80ºC hasta la utilización.

2) Separación en gel de proteínas

La muestra anterior se sometió a ebullición durante 3 minutos y se cargaron 20 \mul de mezcla de proteínas en un gel de poliacrilamida al 12,5%/SDS (PAGE). La mezcla se sometió a electroforesis a 30 mA hasta encontrarse el pigmento a 1 cm del borde inferior. El gel se equilibró en tampón de transferencia (base Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol al 25%) durante 30 minutos.

3) Detección western

El gel se transfirió a una membrana de nitrocelulosa utilizando un aparato de transferencia western. El papel de nitrocelulosa se empapó durante 1 hora en SDS al 0,1% y leche seca al 0,5%. El anticuerpo anti-hnRNP A1 (9B10; proporcionada por G. Dreyfuss) se añadió a solución de leche/SDS (1:1.000) y se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente y después se lavó en TBST (base Tris 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,1%) dos veces durante 15 minutos cada vez. El anticuerpo de ratón ligado a peroxidasa (Amersham) se añadió durante 1 hora (10 \mul de anticuerpo para 10 ml de solución) y la nitrocelulosa se lavó dos veces en TBST durante 15 minutos cada vez. Se utilizó el kit de detección de anticuerpo ECL (Amersham).

Ejemplo 4 Seguimiento de la crisis celular

Las células no infectadas (o células infectadas con vector retrovírico sin A1) empezarán a morir tras un periodo de tiempo que puede variar dependiendo del tipo de células que se utilice. La inspección visual de los recipientes de cultivo de tejidos o la tinción con azul de tripán, que tiñe únicamente células muertas, resulta suficiente para detectar la crisis producida en el cultivo celular. La senescencia celular también puede seguirse mediante tinción para la actividad de \beta-galactosidasa a pH 6,0. Este marcador puede detectarse en células senescentes pero se encuentra ausente en células proliferantes jóvenes, en células inmortalizadas y en células jóvenes en las que se provoca la falta de división mediante privación de suero (Dimri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9363, 1995). Se realiza el seguimiento de la supervivencia más allá del estado de crisis en células infectadas por A1 tal como anteriormente. En el caso de las células de ratón, un incremento de la frecuencia de la supervivencia celular y la división celular continua indican que la crisis ha sido bloqueada. En células humanas, cualquier supervivencia y división celular más allá del estadio de crisis indica que la crisis ha sido superada.

Ejemplo 5 Aplicaciones terapéuticas

Las aplicaciones terapéuticas del presente procedimiento son de amplio alcance y pueden utilizarse para extender la vida de las células primarias que serán utilizadas para fines de trasplante (terapia celular) en casos de SIDA y otras enfermedades hematopoyéticas o inmunológicas (linfoma, leucemia, etc.). El crecimiento prolongado de las células primarias incrementará el periodo de tiempo durante el que las células pueden manipularse para corregir otros defectos (por ejemplo eliminar el ADN vírico del VIH, corregir mutaciones responsables de hemofilia, talasemia, leucemia, etc.).

Dicho procedimiento también resulta aplicable a enfermedades relacionadas con la edad que implican degeneración neural, tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson u otras enfermedades degenerativas, tales como la osteoporosis, la aterosclerosis, etc. En estos casos puede obtenerse tejido neuronal (u otros tejidos) del individuo afectado, introducirse moléculas o derivados de A1 recombinante en las células, y reintroducirse las células en el individuo. La expresión de A1 (o derivados) podría extender la vida de estas células y evitar o reducir la progresión de la enfermedad.

La expresión constitutiva de A1 (o derivados) en diversos tejidos podría contemplarse que proporcione un efecto protector frente al envejecimiento. De esta manera, este procedimiento podría utilizarse como terapia preventiva y aplicarse en individuos con un riesgo elevado de desarrollo de trastorno relacionado con la edad.

El crecimiento extendido más allá de la etapa de crisis también resulta una herramienta útil para mejorar nuestra comprensión básica de los mecanismos biológicos implicados en la crisis celular, en la división celular y en una diversidad de otras cuestiones básicas que hasta el momento únicamente se han investigado mediante la utilización de un cultivo de células inmortalizadas o transformadas.

Ejemplo 6 Tratamiento del cáncer

La introducción en células HeLa (células derivadas de un carcinoma cervical humano), un vector que programa la expresión de una molécula antisentido complementaria a la parte de ARN de la telomerasa reduce la actividad de telomerasa, reduce el tamaño de los telómeros y lleva las células HeLa a crisis (muerte celular) (Feng et al., Science 269:1236, 1995). Lo expuesto anteriormente demuestra el potencial de la inhibición de telomerasa como enfoque terapéutico para tratar el cáncer humano. Debido a que A1 resulta esencial para mantener los telómeros estables, el bloqueo de la acción de A1 debería estimular el acortamiento de los telómeros (tal como se observa en células CB3 que carecen de A1 y presentan telómeros cortos). Las células CB3 son células de eritroleucemia en crecimiento, de esta manera en este caso las alteraciones teloméricas no se asocian a la muerte celular. Esto probablemente se debe a la presencia de otras mutaciones en estas células que puedan superar la ausencia de A1. Sin limitarse a ningún modelo en particular, la pérdida de los telómeros probablemente es el inicio de una cascada de sucesos que conduce a la muerte celular, y cualquier alteración en la expresión de proteínas o factores en cualquiera de las etapas que conduce a la muerte celular podría evitar la muerte celular. Las células CB3 han experimentado varios sucesos de inserción retrovírica y no expresan p53, un gen esencial para la apóptosis (muerte celular).

Las diferentes células neoplásicas pueden responder de manera diferente a alteraciones en la expresión de A1. Preferentemente se utilizan UP1 o derivados del mismo.

Los anticuerpos de la presente invención, específicos de hnRNP A1/UP1, también pueden utilizarse para estimular el acortamiento de los telómeros.

Ejemplo 7 Alteración de la expresión de A1

a): La expresión de las moléculas antisentido de A1 puede reducir el nivel de proteína de A1 en las células, probablemente conduciendo a telómeros más cortos y finalmente a la muerte celular.

b): La expresión de proteínas de A1 o UP1 mutados puede llevar al mismo resultado indicado anteriormente. Las mutaciones en las regiones RRM1 o RRM2 de la proteína A1 modifican las propiedades de unión de A1 a los ácidos nucleicos (Mayeda et al., EMBO J. 13:5483, 1994). La introducción en las células neoplásicas de un vector que permita la sobreexpresión de un A1 o UP1 mutado puede conducir a una reducción de las moléculas A1/UP1 normales (a través de la inhibición por retroalimentación del gen de A1 endógeno mediante regulación traduccional, por ejemplo). La reducción de las proteínas de U1/UP1 normales entonces podría resultar en la producción anormal de telómeros que reducirán su tamaño hasta la entrada en crisis y muerte de las células de cáncer. Pueden introducirse mutaciones en otros sitios con el fin de interferir con las interacciones putativas con otros factores, compitiendo de esta manera con la acción normal de A1/UP1. Esto también conducirá al acortamiento de los telómeros y a la muerte celular. Otra manera de producir mutantes negativos dominantes de UP1 es insertar dominios no relacionados adicionales (por ejemplo GST, lacZ) en el extremo NH_{2}- o COOH- de UP1. Estos dominios voluminosos podrían no interferir con la unión de UP1 a los telómeros, pero interferir con la interacción de UP1 con otros componentes nucleares y evitar la presentación de los telómeros a la telomerasa o evitar el secuestro de los telómeros en estructuras nucleares especializadas, estimulando de esta manera el desgaste rápido de los telómeros.

Basándose en los resultados anteriores, se potencia la generación de ratones transgénicos que expresan UP1. La elección de UP1 resulta preferida debido a que esta forma no interfiere con el procesamiento alternativo, por lo menos in vitro (Mayeda et al., EMBO J. 13:5493-95, 1994). Además, debido a que hnRNP A1 se encuentra implicado en por lo menos dos procesos moleculares diferentes, los efectos de la alteración de la expresión de A1 en animales completos son impredecibles. Los cambios de la expresión de A1 pueden ser letales o causar múltiples defectos debidos a una o varias de las funciones biológicas de A1. Los animales transgénicos se generan mediante la programación de la expresión de UP1 mediante promotores diferentes, incluyendo el promotor MMTV que permite dirigir la expresión específica de tejido en las glándulas mamarias. Se utiliza un promotor constitutivo (\beta-actina) para controlar la expresión de UP1 en todos los tejidos. Un incremento de la expresión específica de tejido o general de UP1 debería estimular la formación de telómeros anormalmente largos y estables. El alargamiento de los telómeros puede asociarse a una mayor protección frente al cáncer, al mantener bajo controlar la inestabilidad genómica. Alternativamente, podría ofrecer una ventaja selectiva de crecimiento a células que expresan oncogenes o antioncogenes mutados. Se realiza un seguimiento de la consecuencia de las alteraciones de la estructura de los telómeros sobre el desarrollo embrionario (viabilidad e incidencia de anormalidades importantes), la inestabilidad genómica (anormalidades cromosómicas importantes determinadas mediante análisis del cariotipo y la tasa de mutación espontánea en un gen informador), la incidencia de tumores y la susceptibilidad a agentes mutagénicos o tumorigénicos (por ejemplo la radiación), la tasa de crecimiento y la frecuencia de inmortalización espontánea de los fibroblastos primarios. El efecto de la expresión de UP1 sobre el desarrollo tumoral se verifica adicionalmente llevando a cabo cruces entre los animales transgénicos MMT/UP1 y los transgénicos singénicos MMTV/neu (Jackson Labs., Maine), una cepa que manifiesta una elevada incidencia de tumores mamarios.

Para incrementar la relevancia del presente estudio para el ser humano, se propone cruzar transgénicos de UP1 (cepas de M. musculus) con la cepa Mus spretus de tipo salvaje. Las células de M. spretus presentan telómeros más pequeños que M. musculus y muestran una frecuencia más baja de inmortalización espontánea. Tras varios retrocruzamientos de transgénicos de UP1 con Mus spretus, se obtiene un transgén de UP1 expresado en un fondo de telómeros de Mus spretus. Se llevan a cabo experimentos tales como los descritos anteriormente, para monitorizar los efectos de los cambios mediados por UP1 de la estructura de los telómeros sobre la senescencia celular y la incidencia del cáncer.

Ejemplo 8 UP1 se une directamente a repeticiones teloméricas monocatenarias in vitro

Para investigar si UP1 puede unirse directamente y con especificidad a repeticiones teloméricas se llevó a cabo el experimento siguiente:

se mezclaron oligonucleótidos de ADN marcados con ^{32}P con perlas de glutatión sefarosa 4B que contenían o que carecían de la proteína de fusión GST-UP1. Tras 5 lavados de 1 ml en tampón que contenía NaCl 165 mM, se midió la recuperación de los oligos marcados. Se recuperó el oligonucleótido (TTAGGG)_{3} con el rendimiento más alto. Un experimento control con perlas simples produjo menos de 10% de oligonucleótido (TTAGGG)_{3} unido. Se recuperó a nivel de fondo un oligonucleótido de ADN marcado que contenía la secuencia complementaria (CCCTAA)_{3}. Un oligonucleótido no relacionado de longitud similar no se unió significativamente a GST-UP1. De esta manera, UP1 puede asociarse directamente con repeticiones teloméricas que portan la secuencia TTAGGG. Además, los ensayos de desplazamiento en gel llevados a cabo con oligonucleótidos mutados indican que UP1 se une específicamente al oligonucleótido (TTAGGG)_{3}. Este resultado es completamente consistente con la demostración de que la actividad de UP1 se encuentra mediada por la unión directa a repeticiones teloméricas monocatenarias. Todavía no se ha demostrado que UP1 se asocie a repeticiones teloméricas in vivo.

Claims

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1. Procedimiento para modular la longitud de los telómeros, que comprende la etapa que consiste en administrar a una célula in vitro una cantidad de una molécula suficiente para modular la longitud de los telómeros, en el que dicha molécula es:

a)

una secuencia de ácidos nucleicos codificante de hnRNP A1,

b)

una secuencia de ácidos nucleicos codificante de UP1,

c)

un polipéptido hnRNP A1 purificado,

d)

un polipéptido UP1 purificado,

e)

una molécula de ácido nucleico codificante de hnRNP A1 mutante que se mutageniza in vitro en la parte que se encuentra ausente en el ácido nucleico codificante de UP1, en el sentido de ser una deleción, inserción o fusión de la molécula de ácido nucleico de a), en el que dicho ácido nucleico codificante de hnRNP A1 mutante codifica un polipéptido que conserva la actividad que consiste en modular la longitud de los telómeros de la molécula del que se deriva,

f)

un polipéptido hnRNP A1 mutante que se mutageniza in vitro en la parte que se encuentra ausente en UP1, en el sentido de ser una deleción, inserción o fusión de la molécula de c), en el que dicho polipéptido hnRNP A1 mutante conserva la actividad que consiste en modular la longitud de los telómeros de la molécula del que se deriva; o

g)

un agente seleccionado de entre el grupo que comprende:

(i)

un anticuerpo que presenta una afinidad de unión específica para un polipéptido o parte portadora de epítopo de hnRNP A1 o UP1, o (ii) una cadena antisentido complementaria a un ácido nucleico codificante de hnRNP A1 o UP1, o (iii) un ribozima que corta hnRNP A1.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la modulación comprende incrementar o estabilizar la longitud de los telómeros.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la modulación comprende reducir o desestabilizar la longitud de los telómeros.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho agente se selecciona de entre el grupo que comprende un anticuerpo que presenta una afinidad de unión específica para un polipéptido o parte portadora de epítopo de hnRNP A1 o de UP1.
5. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho agente se selecciona de entre el grupo que comprende una cadena antisentido complementaria a un ácido nucleico que codifica hnRNP A1 o un ribozima que corta hnRNP A1.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho ribozima es un ribozima de tipo Tetrahymena.
7. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho ribozima es un ribozima de tipo cabeza de martillo.
8. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
9. Procedimiento para extender la capacidad de una célula de replicarse, que comprende la etapa que consiste en introducir en dicha célula in vitro una cantidad, suficiente para extender la replicación de dicha célula, de por lo menos una de las moléculas siguientes:

a)

una secuencia de ácido nucleico codificante de hnRNP A1,

b)

una secuencia de ácido nucleico codificante de UP1,

c)

un polipéptido hnRNP A1 purificado,

d)

un polipéptido UP1 purificado,

e)

una molécula de ácido nucleico codificante de hnRNP A1 mutante que se mutageniza in vitro en la parte que se encuentra ausente en el ácido nucleico codificante de UP1, en el sentido de ser una deleción, inserción o fusión de la molécula de ácido nucleico de a), en el que dicho ácido nucleico codificante de hnRNP A1 mutante codifica un polipéptido que conserva la actividad de modular la longitud de los telómeros de la molécula de la que se deriva; o
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```
f)

un polipéptido hnRNP A1 mutante que se mutageniza in vitro en la parte que se encuentra ausente en UP1, en el sentido de ser una deleción, inserción o fusión de la molécula de c), en el que dicho polipéptido hnRNP A1 mutante conserva la actividad de modular la longitud de los telómeros de la molécula de la que se deriva.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicha célula es una célula primaria, y en el que dicha introducción en la misma de una secuencia de ácido nucleico codificante de hnRNP A1 o UP1, inmortaliza dicha célula primaria.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha secuencia de ácido nucleico se encuentra presente en un plásmido recombinante.
12. Procedimiento según la reivindicación 10 u 11, en el que dicho plásmido recombinante es un vector de expresión.
13. Procedimiento según la reivindicación 9, 10, 11 ó 12, en el que dicha célula es una célula comprometida procedente de un paciente afectado por la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson.
14. Composición farmacéutica para modular la longitud de los telómeros, comprendiendo dicha composición farmacéutica:

por lo menos una molécula seleccionada de entre el grupo constituido por:

(i)

una secuencia de ácido nucleico codificante de hnRNP A1,

(ii)

una secuencia de ácido nucleico codificante de UP1,

(iii)

un polipéptido hnRNP A1 purificado,

(iv)

un polipéptido UP1 purificado,

(v)

un ácido nucleico codificante de UP1 mutante que comprende una deleción, inserción o fusión de una molécula de ácido nucleico codificante de UP1, en la que dicho ácido nucleico codificante de UP1 mutante codifica un polipéptido que conserva la actividad que consiste en modular la longitud de los telómeros de la molécula de la que se deriva; y

(vi)

un polipéptido hnRNP A1 o UP1 mutante que comprende una deleción, inserción, o fusión de un polipéptido hnRNP A1 o UP1, en la que dicho polipéptido hnRNP A1 o UP1 mutante conserva la actividad de modular la longitud de los telómeros de la molécula de la que se deriva.

un agente seleccionado de entre el grupo que comprende:

(i)

un anticuerpo que presenta una afinidad de unión específica para un polipéptido o parte portadora de epítopo de hnRNP A1 o de UP1, o

(ii)

una cadena antisentido complementaria a un ácido nucleico codificante de hnRNP A1 o UP1, o

(iii)

un ribozima que corta hnRNP A1, y

un portador adecuado.
15. Composición farmacéutica según la reivindicación 14, en la que dicha composición comprende una cantidad efectiva de polipéptido hnRNP A o de polipéptido UP1, y en la que dicha composición incrementa o estabiliza dicha longitud de los telómeros.
16. Composición farmacéutica para desestabilizar o reducir la longitud de los telómeros, comprendiendo dicha composición farmacéutica:

un agente específico para hnRNP A1 o UP1 seleccionado de entre el grupo que comprende:

(i)

un anticuerpo que presenta una afinidad de unión específica para un polipéptido o parte portadora de epítopo de hnRNP A1 o UP1,

(ii)

una cadena antisentido complementaria a un ácido nucleico codificante de hnRNP A1 o de UP1, o

(iii)

un ribozima que corta hnRNP A1, que interfiere con la actividad de hnRNP A1 o de UP1 en el incremento de la longitud de los telómeros, y

un portador adecuado.
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```
17. Procedimiento según la reivindicación 1, 2, o cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que dicha molécula es una molécula de ácido nucleico de hnRNP A1 que se mutageniza in vitro en la parte que se encuentra ausente en UP1, o una deleción, inserción o fusión de la molécula de ácido nucleico de a).
18. Procedimiento según la reivindicación 1, 2, o cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que dicha molécula es un polipéptido hnRNP A1 que se mutageniza in vitro en la parte que se encuentra ausente en UP1, o una deleción, inserción o fusión de la molécula de c).
19. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho agente de la parte g) interfiere además con la actividad de hnRNP A1 en la modulación de la longitud de los telómeros.
20. Procedimiento para la determinación del estatus celular de una célula que comprende la etapa que consiste en analizar:

a)

la longitud de los telómeros de dicha célula; y

b)

el nivel de hnRNP A1 o de UP1,

permitiendo una correlación entre dicha longitud de los telómeros y dicho nivel de hnRNP A1 o de UP1 determinar el estatus celular de la célula.
21. Utilización de una medición de por lo menos uno de entre:

a)

el nivel celular de hnRNP A1 o de UP1; y

b)

la afinidad de unión de hnRNP A1 o de UP1 para los telómeros como marcador para el diagnóstico y/o la determinación de estadio de neoplasia en una célula.