KR20180075698A - 개선된 유전자 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 개선된 유전자 치료 벡터, 세포 기반 조성물, 및 유전자 치료 방법에서 이를 이용하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 조혈 세포를 확장하기 위한 개선된 유전자 치료 조성물, 및 지중해빈혈 및 빈혈 등의 조혈 시스템의 질환, 장애 및 상태를 치료하는 관련 방법을 제공한다.

Description

개선된 유전자 치료 방법{IMPROVED GENE THERAPY METHODS}
서열 목록에 관한 설명
본 출원과 관련된 서열 목록은 복사 용지 대신에 텍스트 형태로 제공되고, 이에 의해 명세서에 참고로 인용된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 파일의 명칭은 BLBD_005_00WO_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 95KB이고, 2011년 9월 23일에 작성되었고, EFS-웹을 통해 전자적으로 제출된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 세포의 확장 및 유전자 치료를 이용한 질환의 치료에 이용된 조성물에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 조혈 세포를 확장시키는 개선된 유전자 치료 조성물, 및 조혈 시스템의 질환, 장애 및 상태를 치료하는 관련 방법에 관한 것이다.
유전자 치료 분야의 최근 발전은 β 지중해빈혈 및 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia) 등의 이상헤모글로빈증이 발병된 환자가 새로운 치료 방법으로부터 혜택을 받을 것이라는 기대를 높였다. β-글로빈 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 변형된 조혈 세포(HC)의 이식은 헤모글로빈 장애의 몇몇 마우스 모델의 장기간 수정을 가져왔지만[참조: Imren et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(22):14380-14385; Malik et al., Ann NY Acad Sci. 2005;1054:238-249; May et al., Nature. 2000;406(6791):82-86; Pawliuk et al., Science. 2001;294(5550): 2368-2371], 대조적으로, 유일한 β 지중해빈혈 환자에서 수혈 독립성을 유도했다[참조: Cavazzana-Calvo et al., Nature. 2010;467(7313):318-322]. 유전적으로 변형된 자가 세포를 주입하는 주요 이점은 GVHD 및 면역억제 이식전 조정의 위험을 피할 수 있을 뿐만 아니라 적합한 공여자의 부족을 해결할 수 있지만, 현재의 치료는 적어도 3가지 실질적인 주의사항: 독성 골수절제를 위한 요건[참조: Dunbar et al,. Hum Gene Ther. 1998;9(17):2629-2640]; 현재의 유전자 전달 방법이 조혈 줄기 세포(HSC)의 분획보다 많이 형질도입시킬 없다는 점[참조: Santoni de Sio and Naldini, Methods Mol Biol. 2009;506:59-70] 및 이용가능한 다양한 생체내 선택 전략이 차선의 효과 및 안전성을 겪게 된다[참조: Beard et al., J Clin Invest. 2010;120(7):2345-2354; Cornetta et al., Cancer Gene Ther. 2006;13(9):886-895; Milsom et al., Cancer Res. 2008;68(15): 6171-6180]는 점에 직면한다.
예를 들면, β 지중해빈혈 수용자 마우스는 안정한 생착 및 표현형 개선을 달성하기 위해 적어도 200rad 조사 및 매우 고용량의 골수 세포(> 20×106)를 필요로 했다[참조: Bradley et al., Biol Blood Marrow Transplant. 2002;8(8):453-461]. 그러나, 사이토킨-확장된 골수 세포는 비-골수절제된 마우스 수용자[참조: Ramshaw et al., Blood. 1995;86(3):924-929] 뿐만 아니라 조사된 마우스 수용자[참조: Peters et al., Blood. 1996;87(1):30-37]에서 불량한 장기간 재증식 능력을 갖고, 이는 이식전 조정 섭생의 부재하에 마우스 및 환자에서 레트로바이러스 형질도입된 세포의 낮은 수준의 생착을 유도한다[참조: Dunbar et al., 1998; Kittler et al., Blood. 1997;90(2):865-872].
따라서, 조혈 장애의 치료 또는 예방을 위한 유전자 치료의 개선된 방법이 당해 기술분야에서 필요하다. 본 발명은 당해 기술을 괴롭히는 이들 및 기타 문제에 대한 해결책을 제공한다.
본 발명은 세포를 확장하고 유전자 치료를 이용한 장애를 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 본 발명은 조혈 세포를 확장하기 위한 개선된 유전자 치료 조성물, 및 조혈 시스템의 질환, 장애 및 상태를 치료하기 위한 관련 방법을 제공한다.
다양한 실시양태에서, 본 발명은, 부분적으로, 좌측(5') 레트로바이러스 LTR; 목적 유전자에 작동적으로 연결된 조혈 세포 발현 조절 서열; 절단된(truncated) 에리트로포이에틴 수용체(tEpoR)에 작동적으로 연결된 편재(ubiquitous) 발현 조절 서열; 및 우측(3') 레트로바이러스 LTR을 포함하는 벡터를 의도한다.
특정 실시양태에서, 상기 조혈 세포 발현 조절 서열은 조혈 줄기 세포 프로모터 또는 조혈 전구 세포 프로모터이다.
특정 실시양태에서, 상기 조혈 세포 발현 조절 서열은 적혈구 세포 특이적 프로모터 및 임의로 적혈구 세포 특이적 인핸서를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 상기 조혈 세포 발현 조절 서열은 인간 β-글로빈 프로모터; 인간 β-글로빈 LCR; 및 인간 α-글로빈 HS40 인핸서 및 안키린-1(ankyrin-1) 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 실시양태에서, 상기 편재 발현 조절 서열은 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 유전자 프로모터(CMV), 신장 인자 1 알파 프로모터(EF1-α), 포스포글리세레이트 키나제-1 프로모터(PGK), 유비퀴틴-C 프로모터(UBQ-C), 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 프로모터(CAG), 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제 프로모터(MC1), 베타 액틴 프로모터(β-ACT) 및 유인원 바이러스 40 프로모터(SV40)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 가지 특정 실시양태에서, 상기 목적 유전자는 인간 β-글로빈, 인간 δ-글로빈 및 인간 γ-글로빈으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 상기 인간 β-글로빈 유전자는 코돈 87에서 트레오닌이 글루타민으로 돌연변이 된 것을 인코딩하는 인간 βA-글로빈 유전자((βA -T87Q)), 또는 인간 βA-글로빈 유전자이다.
어느 특정한 실시양태에서, tEpoR은 C-말단 절단을 포함한다.
추가의 특정 양태에서, 상기 C-말단 절단은 내인성 에리트로포이에틴 수용체(EpoR)와 비교하여 tEpoR의 대사회전(turnover)을 감소시킨다.
추가의 특정 실시양태에서, 상기 C-말단 절단은 내인성 에리트로포이에틴 수용체(EpoR)와 비교하여 tEpoR의 반감기를 증가시킨다.
다양한 실시양태에서, 본 발명은, 부분적으로, 좌측(5') 레트로바이러스 LTR; 목적 유전자에 작동적으로 연결된 제1 적혈구 세포 특이적 발현 조절 서열; tEpoR에 작동적으로 연결된 제2 적혈구 세포 특이적 발현 조절 서열 및 우측(3') 레트로바이러스 LTR을 포함하는 벡터를 의도한다.
한 가지 실시양태에서, 상기 제1 적혈구 세포 특이적 발현 조절 서열은 인간 β-글로빈 프로모터; 인간 β-글로빈 LCR; 및 인간 α-글로빈 HS40 인핸서 및 안키린-1 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 상기 제2 적혈구 세포 특이적 발현 조절 서열은 인간 β-글로빈 프로모터; 인간 β-글로빈 LCR; 및 인간 α-글로빈 HS40 인핸서 및 안키린-1 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 상기 목적 유전자는 인간 β-글로빈, 인간 δ-글로빈 및 인간 γ-글로빈으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
어느 특정 실시양태에서, 상기 인간 β-글로빈 유전자는 야생형 인간 β-글로빈 유전자, 인트론 서열의 하나 이상의 결실을 포함하는 결실된 인간 β-글로빈 유전자, 및 적어도 하나의 항겸상(antisickling) 아미노산 잔기를 인코딩하는 돌연변이된 인간 β-글로빈 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 실시양태에서, 상기 인간 β-글로빈 유전자는 코돈 87에서 트레오닌이 글루타민으로 돌연변이 된 것을 인코딩하는 인간 βA-글로빈 유전자((βA - T87Q)) 또는 인간 βA-글로빈 유전자이다.
추가의 특정 실시양태에서, 상기 tEpoR은 C-말단 절단을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 상기 tEpoR은 약 10 내지 약 100개 아미노산의 C-말단 절단을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 상기 tEpoR은 50 내지 60개 아미노산의 C-말단 절단을 포함한다.
한 가지 특정 실시양태에서, 상기 tEpoR은 80 내지 90개 아미노산의 C-말단 절단을 포함한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 상기 tEpoR은 85 내지 95개 아미노산의 C-말단 절단을 포함한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 상기 tEpoR은 약 55, 약 83 또는 약 91개 아미노산의 C-말단 절단을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 본 발명은, 부분적으로, 좌측(5') 레트로바이러스 LTR; 목적 유전자에 작동적으로 연결된 β-글로빈 프로모터 및 β-글로빈 유전자좌 조절 영역(LCR); 절단된 에리트로포이에틴 수용체(tEpoR)에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열 및 우측(3') 레트로바이러스 LTR을 포함하는 벡터를 의도한다.
한 가지 양태에서, 본원에서 의도된 임의의 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
특정한 실시양태에서, 본원에서 의도된 임의의 벡터는 렌티바이러스로부터의 5' LTR 또는 3' LTR, 즉 렌티바이러스 LTR이다.
어느 특정 실시양태에서, 본원에서 의도된 임의의 벡터는 렌티바이러스로부터의 5' LTR 및 3' LTR, 즉 렌티바이러스 LTR들이다.
어느 추가의 실시양태에서, 상기 렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1), 인간 면역결핍 바이러스 유형 2(HIV-2), 비스나(visna) 바이러스, 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 소 면역결핍 바이러스(BIV) 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
어느 추가의 실시양태에서, 상기 렌티바이러스는 HIV-1이다.
특정한 추가의 실시양태에서, 상기 5' LTR의 프로모터는 이종성 프로모터로 치환되어 있다.
특정한 추가 실시양태에서, 상기 이종성 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 루스(Rous) 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 티미딘 키나제 프로모터 또는 유인원 바이러스 40(SV40) 프로모터이다.
특정한 어느 실시양태에서, 본원에서 의도된 임의의 벡터는 하나 이상의 변형을 포함하는 3' LTR을 포함한다.
한 가지 특정 실시양태에서, 본원에서 의도된 임의의 벡터는 하나 이상의 결실을 포함하는 3' LTR을 포함한다.
한 가지 특정 실시양태에서, 본원에서 의도된 임의의 벡터는 자가-불활성화(SIN) LTR인 3' LTR을 포함한다.
한 가지 실시양태에서, 상기 β-글로빈 프로모터는 인간 β-글로빈 프로모터이다.
또 다른 실시양태에서, 상기 β-글로빈 LCR은 인간 β-글로빈 LCR로부터 하나 이상의 DNAase I 과민 부위 2, 3 및 4를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 목적 유전자는 글로빈 유전자이다.
추가의 실시양태에서, 상기 글로빈 유전자는 인간 β-글로빈, 인간 δ-글로빈 및 인간 γ-글로빈으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
어느 실시양태에서, 상기 인간 β-글로빈 유전자는 야생형 인간 β-글로빈 유전자, 인트론 서열의 하나 이상의 결실을 포함하는 결실된 인간 β-글로빈 유전자, 및 적어도 하나의 항겸상 아미노산 잔기를 인코딩하는 돌연변이된 인간 β-글로빈 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 상기 인간 β-글로빈 유전자는 코돈 87에서 트레오닌이 글루타민으로 돌연변이 된 것을 인코딩하는 인간 βA-글로빈 유전자((βA - T87Q)) 또는 인간 βA-글로빈 유전자이다.
한 가지 특정 실시양태에서, 본원에서 의도된 임의의 벡터는 인간 β-글로빈 3' 인핸서 요소를 추가로 포함한다.
추가의 실시양태에서, 상기 발현 조절 서열은 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 유전자 프로모터(CMV), 신장 인자 1 알파 프로모터(EF1-α), 포스포글리세레이트 키나제-1 프로모터(PGK), 유비퀴틴-C 프로모터(UBQ-C), 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 프로모터(CAG), 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제 프로모터(MC1), 베타 액틴 프로모터(β-ACT ) 및 유인원 바이러스 40 프로모터(SV40)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 상기 발현 조절 서열은, 인간 β-글로빈 프로모터, 인간 β-글로빈 LCR; 및 인간 α-글로빈 HS40 인핸서 및 안키린-1 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적혈구 특이적 발현 조절 서열이다.
어느 특정 실시양태에서, 상기 적혈구 특이적 발현 조절 서열은 인간 α-글로빈 HS40 인핸서 및 안키린-1 프로모터를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 의도된 임의의 벡터는 하나 이상의 Psi 팩키징 서열(Ψ+), 중앙 폴리퓨린관/DNA 피판(flap)(cPPT/FLAP), 레트로바이러스 엑스포트(export) 요소, 전사후 조절 요소, 절연 요소, 폴리아데닐화 서열, 선택가능한 마커 및 세포 자살 유전자를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본원에서 의도된 임의의 벡터는 Psi 팩키징 서열(Ψ+), 중앙 폴리퓨린관/DNA 피판(cPPT/FLAP), 레트로바이러스 엑스포트 요소, 절연 요소 및 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본원에서 의도된 임의의 벡터는 rev 반응 요소(RRE)인 레트로바이러스 엑스포트 요소를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본원에서 의도된 임의의 벡터는 HIV-1로부터 cPPT/FLAP를 포함한다.
한 가지 실시양태에서, 본원에서 의도된 임의의 벡터는 최적화된 코작(Kozak) 서열을 포함하는 목적 유전자를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 상기 tEpoR은 최적화된 코작 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 의도된 임의의 벡터는 최적 코작 서열, (GCC)RCCATGG을 포함하고, 여기서 R은 퓨린(A 또는 G)이다.
추가의 실시양태에서, 상기 3' LTR은 적어도 하나의 절연 요소를 포함한다.
어느 추가의 실시양태에서, 상기 3' LTR은 2개의 절연 요소를 포함한다.
특정한 추가 실시양태에서, 절연체는 서열번호 37 또는 38에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 절연체는 서열번호 37의 뉴클레오티드 8-49에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 상기 폴리아데닐화 서열은 AATAAA, ATTAAA, AGTAAA, 소 성장 호르몬 폴리A 서열(BGHpA) 및 토끼 β-글로빈 폴리A 서열(rβgpA)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 가지 실시양태에서, 상기 tEpoR은 C-말단 절단을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 tEpoR은 약 10 내지 약 100개 아미노산의 C-말단 절단을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 tEpoR은 50 내지 60개 아미노산의 C-말단 절단을 포함한다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 tEpoR은 80 내지 90개 아미노산의 C-말단 절단을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 tEpoR은 85 내지 95개 아미노산의 C-말단 절단을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 상기 tEpoR은 약 55개, 약 83개 또는 약 91개 아미노산의 C-말단 절단을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 본 발명은, 부분적으로, 좌측(5') 레트로바이러스 LTR; Psi 팩키징 서열(Ψ+); 중앙 폴리퓨린관/DNA 피판(cPPT/FLAP); 레트로바이러스 엑스포트 요소; 목적 유전자에 작동적으로 연결된 β-글로빈 프로모터 및 β-글로빈 유전자좌 조절 영역(LCR); 절단된 에리트로포이에틴 수용체(tEpoR)에 작동적으로 연결된 적혈구 세포 특이적 발현 조절 서열; 및 하나 이상의 절연 요소 또는 폴리아데닐화 서열을 포함하는 우측(3') 레트로바이러스 LTR을 포함하는 벡터를 의도한다.
다양한 특정 실시양태에서, 본 발명은, 부분적으로, 좌측(5') HIV-1 LTR; Psi 팩키징 서열(Ψ+); HIV-1 중앙 폴리퓨린관/DNA 피판(cPPT/FLAP); rev 반응 요소(RRE); 목적 유전자에 작동적으로 연결된 β-글로빈 프로모터 및 β-글로빈 유전자좌 조절 영역(LCR); 절단된 에리트로포이에틴 수용체(tEpoR)에 작동적으로 연결된 적혈구 세포 특이적 발현 조절 서열; 및 하나 이상의 절연 요소 및 토끼 β-글로빈 폴리A 서열(rβgpA)을 포함하는 우측(3') 레트로바이러스 LTR을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 의도한다.
다양한 기타 실시양태에서, 본 발명은, 부분적으로, 본원에서 의도된 임의의 벡터를 포함하는 조성물을 의도한다.
한 가지 실시양태에서, 조성물은 세포를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 상기 세포는 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 성인 전구 세포 및 분화된 성체 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정한 실시양태에서, 상기 세포는 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포이다.
추가의 실시양태에서, 상기 줄기 세포 또는 전구 세포의 공급원은 골수, 제대혈, 태반 혈액 또는 말초 혈액이다.
특정한 실시양태에서, 상기 세포는 벡터로 형질도입된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 벡터는 에피솜 벡터이거나, 세포의 게놈에 통합되지 않는다.
특정 실시양태에서, 상기 벡터는 세포의 게놈에 통합된다.
한 가지 특정 실시양태에서, 상기 통합은 게놈 내의 위치에 표적화된다.
다양한 실시양태에서, 본 발명은, 부분적으로, 본원에서 의도된 임의의 벡터로 형질도입된 세포를 포함하는 세포 모집단을 투여하는 것을 포함하는, 형질도입된 세포를 대상체에게 제공하는 방법을 의도한다.
특정 실시양태에서, 상기 형질도입된 세포는 조혈 줄기 세포를 포함한다.
어느 특정 실시양태에서, 상기 형질도입된 세포는 조혈 전구 세포를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 세포의 모집단은 본원에서 의도된 임의의 벡터로 형질도입된 5% 세포를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 세포의 모집단은 본원에서 의도된 임의의 벡터로 형질도입된 10% 세포를 포함한다.
관련된 특정 실시양태에서, 세포의 모집단은 본원에서 의도된 임의의 벡터로 형질도입된 25% 세포를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 형질도입된 세포를 대상체에게 제공하는 방법은 에리트로포이에틴을 상기 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
한 가지 실시양태에서, 세포의 모집단 및 에리트로포이에틴은 비경구적으로 투여된다.
특정한 실시양태에서, 상기 비경구 투여는 정맥내 투여이다.
추가의 실시양태에서, 세포의 모집단은, 에리트로포이에틴을 대상체에게 투여하기 전에, 대상체에게 투여된다.
한 가지 실시양태에서, 상기 대상체는 이상헤모글로빈증(hemoglobinopathy)을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 상기 이상헤모글로빈증은 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상 세포 질환(SCD), 겸상 세포 빈혈, 유전성 빈혈, 지중해빈혈, β-지중해빈혈, 종중성 지중해빈혈, 중간성 지중해빈혈, α-지중해빈혈 및 헤모글로빈 H 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다양한 기타 실시양태에서, 본 발명은, 부분적으로, 본원에서 의도된 임의의 벡터로 형질도입된 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 세포 모집단을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법으로서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포, 또는 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 자손 세포가, 에리트로포이에틴의 투여 전의 대상체에서 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포 또는 자손 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴의 투여 후의 대상체에서 증가되는, 방법을 의도한다.
특정한 실시양태에서, 상기 세포 모집단은 골수, 제대혈, 태반 혈액 또는 말초 혈액으로부터 단리된다.
추가의 실시양태에서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 5%는 형질도입되어 있다.
특정 실시양태에서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 10%는 형질도입되어 있다.
추가의 실시양태에서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 25%는 형질도입되어 있다.
특정 실시양태에서, 대상체에서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법은 에리트로포이에틴을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
한 가지 실시양태에서, 상기 세포 모집단 및 에리트로포이에틴은 혈관내 투여된다.
추가의 실시양태에서, 상기 투여는 정맥내이다.
또 다른 실시양태에서, 상기 이상헤모글로빈증은 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상 세포 질환(SCD), 겸상 세포 빈혈, 유전성 빈혈, 지중해빈혈, β-지중해빈혈, 종중성 지중해빈혈, 중간성 지중해빈혈, α-지중해빈혈 및 헤모글로빈 H 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 상기 이상헤모글로빈증은 β-지중해빈혈이다.
어느 특정한 실시양태에서, 상기 대상체는 골수 절제 화학치료 또는 방사선조사를 받았거나 받고 있다.
추가의 특정 실시양태에서, 대상체에서 증가된 자손 세포는 적혈구 세포를 포함한다.
추가의 특정 실시양태에서, 상기 적혈구 세포는 적혈구 전구 세포이다.
한 가지 실시양태에서, 상기 적혈구 세포가 적혈구이다.
한 가지 실시양태에서, 상기 적혈구 세포는, 에리트로포이에틴 투여 전의 대상체에서 적혈구 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 후에 적어도 10배 증가된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 적혈구 세포는, 에리트로포이에틴 투여 전의 대상체에서 적혈구 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 후에 적어도 25배 증가된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 적혈구 세포는, 에리트로포이에틴 투여 전의 대상체에서 적혈구 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 후에 적어도 50배 증가된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 적혈구 세포는, 에리트로포이에틴 투여 전의 대상체에서 적혈구 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 후에 적어도 100배 증가된다.
특정한 실시양태에서, 상기 적혈구 세포는 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 비-적혈구 세포와 비교하여 적어도 25배 증가된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 상기 적혈구 세포는 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 비-적혈구 세포와 비교하여 적어도 50배 증가된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 상기 적혈구 세포는 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 비-적혈구 세포와 비교하여 적어도 100배 증가된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 상기 적혈구 세포는 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 비-적혈구 세포와 비교하여 적어도 150배 증가된다.
다양한 기타 실시양태에서, 본 발명은, 부분적으로, 본원에서 의도된 임의의 벡터로 형질도입된 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 세포 모집단을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 적혈구 세포 수를 확장시키는 방법으로서, 상기 조혈 줄기 세포의 적혈구 자손 세포 수가 대상체에서 확장되는, 방법을 의도한다.
다양한 특정 실시양태에서, 본 발명은, 부분적으로, 본원에서 의도된 임의의 벡터로 형질도입된 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 세포 모집단을 투여하고 에리트로포이에틴을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 백혈구 세포와 비교하여 적혈구 세포의 비율을 증가시키는 방법으로서, 상기 조혈 줄기 세포의 적혈구 자손 세포의 비율이 대상체에서 조혈 줄기 세포의 백혈구 자손 세포와 비교하여 증가되는, 방법을 의도한다.
특정한 실시양태에서, 대상체에서 적혈구 세포 수를 선택적으로 확장시키는 방법은 에리트로포이에틴을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 대상체에서 백혈구 세포와 비교하여 적혈구 세포의 비율을 증가시키는 방법은 에리트로포이에틴을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
특정한 양태에서, 상기 세포 모집단은 골수, 제대혈, 태반 혈액 또는 말초 혈액으로부터 단리된다.
한 가지 실시양태에서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 5%는 형질도입되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 10%는 형질도입되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 25%는 형질도입어 있다.
특정 실시양태에서, 상기 세포 모집단 및 에리트로포이에틴은 혈관내 투여된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 상기 투여는 정맥내이다.
추가의 실시양태에서, 상기 대상체는 이상헤모글로빈증을 갖는다.
추가의 특정 실시양태에서, 상기 이상헤모글로빈증은 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상 세포 질환(SCD), 겸상 적혈구 빈혈, 유전성 빈혈, 지중해빈혈, β-지중해빈혈, 종중성 지중해빈혈, 중간성 지중해빈혈, α-지중해빈혈 및 헤모글로빈 H 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 실시양태에서, 상기 이상헤모글로빈증은 β-지중해빈혈이다.
추가의 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 골수 절제 화학치료 또는 방사선조사를 받았거나 받고 있다.
한 가지 실시양태에서, 상기 적혈구 자손 세포는, 에리트로포이에틴 투여 전의 대상체에서 적혈구 자손 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 후에 적어도 10배 증가된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 적혈구 자손 세포는, 에리트로포이에틴 투여 전의 대상체에서 적혈구 자손 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 후에 적어도 25배 증가된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 적혈구 자손 세포는, 에리트로포이에틴 투여 전의 대상체에서 적혈구 자손 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 후에 적어도 50배 증가된다.
여전히 또 다른 실시양태에서, 상기 적혈구 자손 세포는, 에리트로포이에틴 투여 전의 대상체에서 적혈구 자손 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 후에 적어도 100배 증가된다.
특정 실시양태에서, 상기 적혈구 자손 세포는 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 비-적혈구 세포와 비교하여 25배 증가된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 상기 적혈구 자손 세포는 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 비-적혈구 세포와 비교하여 50배 증가된다.
여전히 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 적혈구 자손 세포는 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 비-적혈구 세포와 비교하여 100배 증가된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 상기 적혈구 자손 세포는 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 비-적혈구 세포와 비교하여 150배 증가된다.
다양한 실시양태에서, 상기 적혈구 자손 세포는 적혈구를 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 RBC는 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 WBC와 비교하여 적어도 25배 증가된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 상기 RBC는 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 WBC와 비교하여 적어도 50배 증가된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 상기 RBC는 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 WBC와 비교하여 적어도 100배 증가된다.
또 다른 특정 실시양태에서, 상기 RBC는 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 WBC와 비교하여 적어도 150배 증가된다.
도 1은 본원에 기재된 특정 실험에 이용된 몇몇 바이러스 벡터 작제물 및 마우스 에리트로포이에틴 수용체(EpoR)를 나타낸다. (A) MSCV(쥐 줄기 세포 바이러스) LTR(긴 말단 반복부위) 프로모터의 조절하에 내부 리보솜 도입 부위(IRES)-유도된 증강된 녹색 형광 단백질(eGFP) 리포터 유전자를 함유하는 마우스 감마레트로바이러스 벡터(γRV). EpoR cDNA는 IRES 전에 클로닝되었다. (B) 인간 β-글로빈 프로모터 및 유전자좌 조절 영역(LCR)의 조절하에 변형된 β-글로빈(βAT87Q) 사슬을 인코딩하는 렌티글로빈(LG) 벡터. LG 벡터는 또한 우측 긴 말단 반복부위(LTR)의 U3 영역에서의 결실, 토끼 β-글로빈 폴리A 시그날, 및 고감수성 부위 4(HS4) 닭 β-글로빈 유전자좌의 2개 250bp 염색질 절연체를 함유한다. LG/HA-Y1은 인간 α-글로빈 HS40 인핸서 및 안키린-1 프로모터의 조절하에 절단 EpoR-Y1 cDNA를 함유한다. LG/HA-eGFP는 EpoRY1의 위치에 eGFP를 함유한다. HPV570는 EF1α 프로모터의 조절하에 eGFP를 함유한다. (C) 쥐 야생형(EpoRY1-8) 및 절단된 EpoR(EpoRY1-7 내지 EpoRY1). 소수성 리더 서열을 구성하는 최초 24개 아미노산은 존재하지 않고 넘버링에 고려하지 않는다. 티로신(Y) 343, 401, 429, 431, 443, 460, 464 및 479가 제시되어 있다. EpoRY1 및 EpoRY1-2에서, 정지 코돈은 Y401 및 Y429을 대체한다. (D) 인간 야생형(hEpoRY1-8) 및 절단된 EpoR(hEpoRY1-7 내지 EpoRY1). 소수성 리더 서열을 구성하는 최초 24개 아미노산은 존재하지 않고 넘버링에 고려하지 않는다. 티로신(Y) 344, 402, 430, 432, 444, 461, 465 및 480이 제시되어 있다.
도 2는 이식후 20주에서 tEpoR 의해 변형된 말초 혈액 세포의 비율 증가를 나타낸다. (A) 평균 백분율, 표준 오차 및 eGFP-양성 적혈구(RBC) 및 백혈구(WBC)의 개별 값. 조혈 세포(HC)는 γRV(1), γRV/EpoRY1(2), γRV/EpoRY1-2(3) 또는 γRV/EpoRY1-8(4) 레트로바이러스 벡터에 의해 형질도입되었다. (B) 동일한 마우스에서 측정된 평균 혈장 Epo 수준 및 표준 오차. * P <.05는 그룹 1 및 4와 비교했다.
도 3은 LG 벡터 내에서 HA 프로모터에 의해 제공된 eGFP의 엄격한 적혈구 특이적 발현을 나타낸다. (상부) LG/HA-eGFP 또는 (하부) HPV570(EFLα-eGFP) 형질도입된 세포가 이식된 정상 마우스의 BM(B 림프[B], 골수[M] 및 적혈구[E]), 흉선(T 림프[T]) 및 말초혈(B, M, T 및 RBC)에서 eGFP-양성 세포의 평균 퍼센트 및 개별 값. 백혈구의 경우, 공여자 세포는 CD45.2 항원 발현에 의해 동정되었다.
도 4는 tEpoR이 적혈구 세포 증폭을 매개하는 것을 나타낸다. (A-B) LG(■) 및 LG/HA-EpoRY1(□) 마우스의 말초 혈액에서 변형된 RBC의 비율과 형질도입된 WBC의 비율 사이의 관계. 변형된 백혈구에 대한 tEpoR의 최소 효과를 가정하면, 변형된 적혈구 세포(FE 인자)의 1-, 10-, 50- 및 200배 우선적 확장에 상응하는 4개 이론적 곡선은 식 3(A) 및 2(B)로부터 유도된다. 보다 큰 곡률(A)과 직선(B)의 좌측 이동은 변형되지 않은 세포와 비교하여 변형된 적혈구 세포에 대한 큰 이점에 상응한다. (C-D) 박스의 하부 및 상부 경계는 25번째 및 75번째 백분위수를 나타낸다. 박스 위 아래 수염(오차 막대)는 90 번째와 10 번째 백분위수를 나타낸다. 박스 안의 선은 평균을 표시한다. (C) LG(■) 및 LG/HA-EpoRY1(□) 마우스에서 중간치 및 개별 적혈구 증폭률 FE. (D) LG(■) 및 LG/HA-EpoRY1(□) 마우스에서 이식 전에 유전자 변형된 백혈구(WBC) 분획 및 생체외 변형된 HC 분획 사이의 중간치 및 개별 비율.
도 5는 빈혈 및 적혈구생성장애의 수정이, 벡터 중의 tEpoR의 존재와 독립적으로, 변형된 RBC의 수준에 부분적으로 의존한다는 것을 나타낸다. 마우스는 LG/HA-EpoRY1(□) 또는 LG(■) 형질도입된 골수 세포를 이식하였다. (A) 전체 및 인간 헤모글로빈 농도(Hb), 적혈구 계수(RBC), 망상적혈구 비율(Retic) 및 비장 중량과, 이식된 β 지중해빈혈 마우스의 변형된 RBC와의 상관 관계. 회귀 직선 및 95% 신뢰 구간(점선)은 40% 초과의 RBC 비율을 갖는 LG 마우스로부터 수득했다. 수평 및 수직 사선 박스의 하부 및 상부 경계는 β 지중해빈혈 및 정상 C57BL/6J 마우스 값의 평균±SD 나타낸다. 헤모글로빈의 경우, 하부 및 상부 회귀 직선은 각각 치료(인간) 및 전체 헤모글로빈에 상응한다. (B) 비장 중량과, 비장에서 적혈구 세포의 백분율과의 관계. 회귀 직선과 95% 신뢰 구간은 모든 마우스의 데이터로 플롯팅되었다. 모의-형질도입된 세포를 제공한 3마리 마우스(●)가 포함되었다.
도 6은, tEpoR가 치료 글로빈 유전자와 동시 발현될 때, 빈혈이 변형된 WBC의 보다 낮은 수준에서 수정되는 것을 나타낸다. 마우스는 LG/HA-EpoRY1(□) 또는 LG(■) 형질도입된 골수 세포를 이식했다. (A) 변형된 RBC(RBC), 헤마토크릿 값(Hc), 전체 헤모글로빈 농도(Hb) 및 망상적혈구 비율(Retic)와, 이식된 β 지중해빈혈 마우스의 변형된 WBC(WBC)와의 상관 관계. 사선은 20% 상하의 WBC를 갖는 데이터를 분리한다. (B) 평균 ± SD 및 개별 변형된 RBC 비율, 헤마토크릿 값, 전체 헤모글로빈 농도, 및 20% 상하의 WBC를 갖는 마우스의 망상적혈구 비율. 그래프 하부의 숫자는 변형된 WBC의 평균 백분율을 나타낸다.
도 7은 BM 항상성이 이식후 10개월에서 유지되는 것을 나타낸다. (A) LG(흑색 막대) 및 LG/HA-Y1(개방 막대) 마우스의 말초 혈액(PB) 및 골수(BM)에서 CD45.2-양성 백혈구중 골수(M), B-림프구(B) 및 T-림프구(T)의 비율. (B) 인간 수정된 RBC(RBC)를 갖는 혈장 Epo의 대수. 회귀 직선 및 95% 신뢰 구간(점선)은 40%초과의 RBC 비율을 갖는 LG 마우스로부터 수득했다. 수평 및 수직 사선 박스의 상부 및 하부 경계는 각각 β 지중해빈혈 및 정상 C57BL/6J 마우스 값의 평균 SD를 나타낸다. (C) LG(■) 및 LG/HA-Y1(□) 마우스에서 평균 SD 및 개별 백혈구 및 혈소판 수.
도 8은 적혈구 세포 확장 후에 프로토-암유전자와 LG/HA-EpoRY1 벡터 통합 부위(IS)의 결합의 결여를 나타낸다. 모두 4마리 마우스의 통합 부위는 이 분석을 위해 풀링(pooling)했다. Ter119+(A) 및 CD45+(B) BM 세포로부터 단리된 통합 부위는 가장 가까운 RefSeq 유전자에 따라 표지된다. 상대적 클론 크기는, 시험관내 MuA 트랜스포사제에 의해 촉매된 독립적 통합 이벤트로 단리되는 회수에 의해 정량했다. 프로토-암유전자는, allOnco 데이터베이스에서 주석을 붙인 바와 같이, 별표로 표시되어 있다. 가장 가까운 유전자가 암유전자인 IS의 빈도는 적혈구와 비적혈구 세포(P=.5523) 사이에 통계학적 차이가 없다. (C) 프로토-암유전자에 대한 통합 부위 근접. 프로토-암유전자로부터 통합 부위 > 50kb 및 < 50kb의 비율이 제시되어 있다. 프로토-암유전자로부터 < 50kb에서 발견된 통합 부위의 수에서 유의차는 본 연구에서 동정된 통합 부위와, 이식 전후에 LG 벡터로 형질도입된 HC에서 특성화된 IS 사이에서 발견되지 않았다(2-테일 피셔 정확 검정으로 P > .05).
도 9는 tEpoR이 이식후 20주에서 eGFP+ 적혈구, 림프구 및 골수 세포의 높은 비율을 유도하는 것을 나타낸다. 적혈구(RBC), 백혈구(WBC), 림프구 세포(Lympho) 및 골수 세포(GM: 과립구/단핵구) 구획에서 eGFP 양성 세포의 평균 및 중앙 백분율(각각 청색 및 적색 직선), 표준 오차(청색 오차 막대), 25번째 및 75번째 백분위수(박스이 하부 및 상부 경계) 및 개별 백분율(회색 원). 조혈 세포는 γRV, γRV/EpoRY1(Y1), γRV/EpoRY1-2(Y1-2) 또는 γRV/EpoRY1-8(Y1-8) 레트로바이러스 벡터에 의해 형질도입되었다.
도 10은 최고 수준의 eGFP를 발현하는 골수 세포가 tEpoR에 의해 변형된 세포를 이식한 마우스에서 선택되는 것을 나타낸다. 이식전의 조혈 세포(시험관내) 및 림프구 세포(lympho) 및 골수 세포(GM) 구획에서 평균 형광 강도(막대그래프), 표준 편차(청색 오차 막대) 및 개개 MFI(회색 원)의 평균. 조혈 세포는 γRV, γRV/EpoRY1(Y1), γRV/EpoRY1-2(Y1-2) 또는 γRV/EpoRY1-8(Y1-8) 레트로바이러스 벡터에 의해 형질도입되었다.
도 11은 4마리 LG/HA-EpoRY1 마우스의 CD45+ 및 Ter119+ 골수 세포로부터 단리된 통합 부위의 분포를 나타낸다. 통합 부위는 가장 가까운 RefSeq 유전자에 따라 표지되어 있다. 회수된 부위의 비율은, 시험관내에서 MuA 트랜스포사제에 의해 촉매된 독립적 통합 이벤트로 단리된 회수에 의해 정량화했다. 단리된 통합 부위의 2% 미만에 기연하는 회수된 부위는 저빈도 그룹과 조합되었다. 클론 존재량을 반영하는 독립적 Mu 전위 이벤트의 수는 각 마우스의 각각의 세포형 하부에 표시되어 있다.
서열 식별자의 간단한 설명
서열번호 1은 인간 알파 글로빈 cDNA의 폴리뉴클레오티드 서열을 기재한다.
서열번호 2는 인간 알파 글로빈 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 3은 마우스 알파 글로빈 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 4는 랫트 알파 글로빈 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 5는 인간 베타 글로빈 cDNA의 폴리뉴클레오티드 서열을 기재한다.
서열번호 6은 인간 베타 글로빈 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 7은 돌연변이 인간 베타 글로빈 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 8은 마우스 베타 글로빈 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 9는 랫트 베타 글로빈 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 10은 인간 감마 글로빈 cDNA의 폴리뉴클레오티드 서열을 기재한다.
서열번호 11은 인간 감마 글로빈 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 12는 마우스 감마 글로빈 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 13은 랫트 감마 글로빈 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 14는 인간 델타글로빈 cDNA의 폴리뉴클레오티드 서열을 기재한다.
서열번호 15는 인간 델타 글로빈 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 16은 인간 에리트로포이에틴 수용체 cDNA의 폴리뉴클레오티드 서열을 기재한다.
서열번호 17은 마우스 에리트로포이에틴 수용체 cDNA의 폴리뉴클레오티드 서열을 기재한다.
서열번호 18은 랫트 에리트로포이에틴 수용체 cDNA의 폴리뉴클레오티드 서열을 기재한다.
서열번호 19는 인간 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 20은 절단된 인간 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 21은 절단된 인간 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 22은 24개 아미노산 N-말단 시그날 펩티드를 결여하는 인간 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 23은 24개 아미노산 N-말단 시그날 펩티드를 결여하는 절단된 인간 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 24는 24개 아미노산 N-말단 시그날 펩티드를 결여하는 절단된 인간 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 25는 마우스 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 26은 절단된 마우스 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 27은 절단된 마우스 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 28은 24개 아미노산 N-말단 시그날 펩티드를 결여하는 마우스 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 29는 24개 아미노산 N-말단 시그날 펩티드를 결여하는 절단된 마우스 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 30은 24개 아미노산 N-말단 시그날 펩티드를 결여하는 절단된 마우스 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 31은 랫트 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 32는 절단된 랫트 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 33은 절단된 랫트 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 34는 24개 아미노산 N-말단 시그날 펩티드를 결여하는 랫트 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 35는 24개 아미노산 N-말단 시그날 펩티드를 결여하는 절단된 랫트 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 36은 24개 아미노산 N-말단 시그날 펩티드를 결여하는 절단된 랫트 에리트로포이에틴 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 37은 절연 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 기재한다.
서열번호 38은 절연 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 기재한다.
A. 개요
본 발명은 일반적으로 개선된 유전자 치료용 벡터, 및 유전적 질환을 치료, 예방 또는 개선하기 위해 이를 이용하는 방법에 관한 것이다. 유전자 치료에 대한 하나의 중요한 문제는, 수정된 세포가 비형질도입된 세포에 비해 고유 선택적 이점을 갖지 않는 이식을 받은 대상체에서 수정된 세포 모집단을 유지 및/또는 확장하는 것이다. 예를 들면, 유전된 조혈 장애, 예를 들면, 겸상 세포 질환 및 β-지중해빈혈에 있어서의 제한은, 이로써 제한되지 않지만, 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 비효율적 형질도입, 독성 골수억제 또는 골수절제 치료에 대한 요구, 및 형질도입된 세포의 생체내 선택을 위한 최적 방법의 결여를 포함한다.
본 발명은, 부분적으로, 본 발명의 유전자 치료 벡터가 유전자 치료의 효율 및 특이성을 추가로 증가시키기 위해 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 치료 세포의 수를 선택적으로 또는 구체적으로 확장 또는 증가시키는데 이용될 수 있다는 예상치 않은 발견에 기초한다. 어떠한 특정 이론에 구속되는 것을 원하지 않지만, 본 발명은, 본 발명의 벡터를 포함하는 치료 세포가 실질적으로 확장될 수 있기 때문에, 보다 적은 세포가 유전자 치료를 받는 대상체의 치료, 예방 또는 개선 종점을 제공하는데 요구되는 것을 부분적으로 의도한다. 더욱이, 본 발명의 벡터를 포함하는 세포의 전부 또는 적어도 일부는 다른 세포와 비교하여 증식 이점을 갖기 때문에, 골수억제 또는 골수절제 치료는 치료, 예방 또는 개선 종점을 달성하기 위해 반드시 필요한 것은 아니다.
따라서, 본 발명은, 세포의 일부에만 벡터에 의해 효과적으로 표적화되지만 치료, 예방 또는 개선 효과를 제공하는데 불충분한 수준에서 표적화됨으로써, 유전자 질환의 치료에서 유전자 치료의 효능을 개선하는 충족되지 않은 임상적 필요를 해결한다. 본 발명은 특히 목적하는 결과를 촉진하기 위해 벡터, 유전자 조작된 세포, 및 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 유전자 조작된 세포 또는 세포 모집단의 선택적 확장에 관한 것이다.
본 발명의 실시는, 달리 구체적으로 지시하지 않는 한, 본 분야의 기술 내의 분자생분자 및 재조합 DNA 기술의 통상의 방법을 이용할 것이며, 이들의 대부분은 설명을 위해 하기에 기재된다. 이러한 기술은 문헌[참조: Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, ed., 1984)]에 충분히 설명되어 있다.
본원에서 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 이들의 전체가 참고로 도입된다.
B. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 이용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어들은 이하에 정의된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "레트로바이러스"는 이의 게놈 RNA를 선형 이중 사슬 DNA 카피로 역전사시키고, 이어서 이의 게놈 DNA를 숙주 게놈 내에 공유적으로 통합시키는 RNA 바이러스를 나타낸다. 레트로바이러스는 유전자 송달을 위한 통상적 도구이다[참조: Miller, 2000, Nature. 357: 455-460]. 일단 바이러스가 숙주 게놈 내에 통합되면, 이는 "프로바이러스(provirus)"라 지칭된다. 프로바이러스는 RNA 폴리머라제 II에 대한 주형으로 작용하며, 새로운 바이러스 입자를 생산하는데 필요한 구조 단백질 및 효소를 인코딩하는 RNA 분자의 발현을 지시한다.
예시적인 레트로바이러스에는, 이로써 제한되지 않지만, 몰로니 쥐(Moloney murine) 백혈병 바이러스(M-MuLV), 몰로니 쥐 육종 바이러스(MoMSV), 하베이(Harvey) 쥐 육종 바이러스(HaMuSV), 쥐 유방 종양 바이러스(MuMTV), 지본 유인원(gibbon ape) 백혈병 바이러스(GaLV), 고양이 백혈병 바이러스(FLV), 스푸마바이러스(spumavirus), 프렌드(Friend) 쥐 백혈병 바이러스, 쥐 줄기 세포 바이러스(MSCV) 및 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV) 및 렌티바이러스 벡터가 포함된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "렌티바이러스"는 복합(complex) 레트로바이러스의 그룹(또는 속)이다. 예시적인 레트로바이러스에는, 이로써 제한되지 않지만, HIV(인간 면역결핍 바이러스; HIV 유형 1, 및 HIV 유형 2 포함); 비스나-메디(visna-maedi) 바이러스(VMV); 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV); 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역결핍 바이러스(BIV); 및 유인원(simian) 면역결핍 바이러스(SIV)가 포함된다. 한 가지 실시양태에서, HIV 기반 벡터 골격(즉, HIV 시스-작용 서열 요소)이 바람직하다.
레트로바이러스 벡터, 및 더욱 특히 렌티바이러스 벡터는 본 발명의 실시에서 이용될 수 있다. 따라서, 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "레트로바이러스" 또는 "레트로바이러스 벡터"는 각각 "렌티바이러스" 및 "렌티바이러스 벡터"를 포함하는 것을 의미한다.
용어 "벡터"는 본원에서 또 다른 핵산 분자를 전이시키거나 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하기 위해서 이용된다. 전이된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 결합되는데, 예를 들면, 벡터 핵산 분자 내에 삽입된다. 벡터는 세포에서의 자율적 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 숙주 세포 DNA 내로의 통합을 허용하는데 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터에는, 예를 들면, 플라스미드(예를 들면, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포손, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 및 바이러스 벡터가 포함된다. 유용한 바이러스 벡터에는, 예를 들면, 복제 결함 레트로바이러스 및 렌티바이러스가 포함된다.
당해 기술분야의 기술자에게 명백한 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터"는, 전형적으로 핵산 분자의 전이 또는 세포의 게놈 내로의 통합을 용이하게 하는 바이러스-유래된 핵산 요소를 포함하는 핵산 분자(예를 들면, 전이 플라스미드), 또는 핵산 전이를 매개하는 바이러스 입자를 지칭하기 위해서 광범하게 이용된다. 바이러스 입자는 전형적으로 핵산(들) 이외에도 다양한 바이러스 성분, 및 종종 또한 숙주 세포 성분들을 포함할 것이다.
용어 바이러스 벡터는 핵산을 세포 내로 전이시킬 수 있는 바이러스 또는 바이러스 입자, 또는 전이된 핵산 그 자체를 지칭할 수 있다. 바이러스 벡터 및 전이 플라스미드는 주로 바이러스로부터 유래된 구조적 및/또는 기능적 유전자 요소를 함유한다. 용어 "레트로바이러스 벡터"는 주로 레트로바이러스로부터 유래된 구조적 및 기능적 유전자 요소 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 용어 "렌티바이러스 벡터"는 주로 렌티바이러스로부터 유래된 LTR을 포함한 구조적 및 기능적 유전자 요소 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 용어 "하이브리드"는 레트로바이러스, 예를 들면, 렌티바이러스 서열 및 비-렌티바이러스 바이러스 서열 둘 다를 함유하는 벡터, LTR 또는 기타 핵산을 지칭한다. 한 가지 실시양태에서, 하이브리드 벡터는 역전사, 복제, 통합 및/또는 팩키징을 위한 레트로바이러스, 예를 들면, 렌티바이러스 서열을 포함하는 벡터 또는 전이 플라스미드를 지칭한다.
특정한 실시양태에서, 용어 "렌티바이러스 벡터", "렌티바이러스 발현 벡터"는 렌티바이러스 전이 플라스미드 및/또는 감염성 렌티바이러스 입자를 지칭하기 위해서 이용될 수 있다. 본원에서 클로닝 부위, 프로모터, 조절 요소, 이종 핵산 등과 같은 요소들을 언급하는 경우에, 이들 요소의 서열은 본 발명의 렌티바이러스 입자에서 RNA 형태로 존재하고 본 발명의 DNA 플라스미드에서 DNA 형태로 존재하는 것으로 이해되어야 한다.
프로바이러스의 각각의 말단에는 "긴 말단 반복부위(long terminal repeat)" 또는 "LTR"로 불리우는 구조가 존재한다. 용어 "긴 말단 복제부위(LTR)"는 이들의 천연 서열 환경에서 직접적인 반복부위이고 U3, R 및 U5 영역을 함유하는 레트로바이러스 DNA의 말단에 위치하는 염기쌍의 도메인을 나타낸다. LTR는 일반적으로 레트로바이러스 유전자의 발현(예를 들면, 촉진, 개시 및 유전자 전사물의 폴리아데닐화) 및 바이러스 복제에 기본적인 기능을 제공한다. LTR은 전사 조절 요소, 폴리아데닐화 시그날 및 바이러스 게놈의 복제 및 통합에 필요한 서열을 포함하는 다수의 조절 시그날을 함유한다. 바이러스 LTR은 U3, R 및 U5로 불리우는 3개 영역으로 구분된다. U3 영역은 인핸서 및 프로모터 요소를 함유한다. U5 영역은 프라이머 결합 부위와 R 영역 사이의 서열이고, 폴리아데닐화 서열을 함유한다. R(반복부위) 영역은 U3 및 U5 영역의 측면에 있다. U3, R 및 U5 영역으로 구성된 LTR은 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단 둘 다에서 나타난다. 5' LTR에 인접한 것은 게놈의 역전사(tRNA 프라이머 결합 부위)를 위해서, 및 바이러스 RNA의 입자 내로의 효율적인 팩키징(Psi 부위)을 위해서 필요한 서열이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "팩키징 시그날" 또는 "팩키징 서열"은 바이러스 RNA를 바이러스 캡시드 또는 입자 내로 삽입하는데 요구되는 레트로바이러스 게놈 내에 위치한 서열을 지칭한다[참조: Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101-2109]. 몇 가지의 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 캡시드화(encapsidation)에 필요한 최소 팩키징 시그날(또한 psi[Ψ] 서열로도 지칭됨)을 이용한다. 따라서, 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "팩키징 서열", "팩키징 시그날", "프사이(psi)" 및 기호 "Ψ"는 바이러스 입자 형성 중에 레트로바이러스 RNA 사슬의 캡시드화에 필요한 비-코딩 서열과 관련하여 이용된다.
다양한 실시양태에서, 벡터는 변형된 5' LTR 및/또는 3' LTR을 포함한다. 3' LTR의 변형은 종종, 바이러스를 복제-결함성으로 되도록 함으로써 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 시스템의 안전성을 개선시키기 위해서 이루어진다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "복제-결함"은 감염성 비리온이 생산되지 않도록 완전하고 효과적인 복제를 할 수 없는 바이러스를 지칭한다(예를 들면, 복제-결함성 렌티바이러스 자손). 용어 "복제-적격(replication-competent)"은 바이러스의 바이러스 복제가 감염성 비리온(예를 들면, 복제-적격성 렌티바이러스 자손)을 생산할 수 있도록 복제할 수 있는 야생형 바이러스 또는 돌연변이 바이러스를 지칭한다.
"자가-불활성화"(SIN) 벡터는, U3 영역으로 알려진 우측(3') LTR 인핸서-프로모터 영역이 바이러스 복제의 일차 라운드를 초과하는 바이러스 전사를 방지하도록 변형(예를 들면, 결실 또는 치환에 의해)되어 있는 복제-결함 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 지칭한다. 이것은 우측(3') LTR U3 영역이 바이러스 복제 중에 좌측(5') LTR U3 영역에 대한 주형으로 이용되고, 이에 따라 바이러스 복제물은 U3 인핸서-프로모터의 부재하에 만들어질 수 없기 때문이다. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 3' LTR은 U5 영역이, 예를 들면, 이상적인 폴리(A) 서열로 대체되도록 변형된다. 3' LTR, 5' LTR, 또는 3' 및 5' LTR 둘 다에 대한 변형과 같은 LTR에 대한 변형도 본 발명에 포함되는 것에 유의해야 한다.
추가의 안전성 증진은 5' LTR의 U3 영역을 이종 프로모터로 대체하여 바이러스 입자의 생산 중에 바이러스 게놈의 전사를 유도시킴으로써 제공된다. 이용될 수 있는 이종 프로모터의 예로는, 예를 들면, 바이러스성 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들면, 초기 또는 후기), 사이토메갈로바이러스(CMV)(예를 들면, 즉시 초기), 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MoMLV), 라우스 육종 바이러스(RSV) 및 단순 포진 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터가 포함된다. 전형적인 프로모터는 Tat-독립적 방식으로 높은 수준의 전사를 유도할 수 있다. 이러한 대체는 복제-적격 바이러스를 생성시키는 재조합의 가능성을 감소시키는데, 이는 바이러스 생산 시스템 내에 적격 U3 서열이 없기 때문이다. 특정한 실시양태에서, 이종 프로모터는 바이러스 게놈이 전사되는 방식으로 조절하는데 있어서 추가의 이점을 갖는다. 예를 들면, 이종 프로모터는, 유도 인자가 존재하는 경우에만 바이러스 게놈의 전부 또는 일부의 전사가 발생하도록 유도될 수 있다. 유도 인자에는, 이로써 제한되지 않지만, 하나 이상의 화학적 화학물, 또는 숙주 세포가 배양되는 온도 또는 pH와 같은 생리학적 조건이 포함된다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 TAR 요소를 포함한다. 용어 "TAR"은 렌티바이러스(예를 들면, HIV) LTR의 R 영역 내에 위치한 "트랜스-활성화 반응" 유전자 요소를 지칭한다. 이 요소는 렌티바이러스 트랜스-활성화(tat) 유전자 요소와 상호작용하여 바이러스 복제를 증강시킨다. 그러나, 이 요소는 5' LTR의 U3 영역이 이종 프로모터에 의해 대체되는 실시양태에서 필요하지 않다.
"R 영역"은 캡핑(capping) 그룹의 개시점(즉, 전사의 개시)에서 시작하여 폴리A 관의 개시점 직전에서 종결하는 레트로바이러스 LTR 내의 영역을 지칭한다. R 영역은 또한, U3 및 U5 영역의 측면에 있는 것으로 정의된다. R 영역은 역전사 중에 게놈의 한 말단으로부터 다른 말단으로 신생 DNA의 전이를 허용하는데 중요한 역할을 한다.
본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "FLAP 요소"는 이의 서열이 레트로바이러스, 예를 들면, HIV-1 또는 HIV-2의 중앙 폴리퓨린관 및 중앙 종결 서열(cPPT 및 CTS)을 포함하는 핵산을 지칭한다. 적합한 FLAP 요소는 미국 특허 제6,682,907호, 및 문헌[참조: Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173]에 기재되어 있다. HIV-1 역전사 중에, 중앙 폴리퓨린관(cPPT)에서의 플러스-사슬 DNA의 중앙 개시 및 중앙 종결 서열(CTS)에서의 중앙 종결은 3-사슬 DNA 구조: HIV-1 중앙 DNA 피판의 형성을 유도한다. 어떠한 이론에 구속되는 것을 원하지 않지만, DNA 피판은 렌티바이러스 게놈 핵 임포트(nuclear import)의 시스-활성 결정인자로 작용할 수 있고/있거나 바이러스의 역가를 증가시킬 수 있다. 특정한 실시양태에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 골격은 벡터 내의 목적 이종 유전자의 상류 또는 하류에 하나 이상의 FLAP 요소를 포함한다. 예를 들면, 특정한 실시양태에서, 전이 플라스미드는 FLAP 요소를 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 HIV-1로부터 단리된 FLAP 요소를 포함한다.
한 가지 실시양태에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 전이 벡터는 하나 이상의 엑스포트 요소를 포함한다. 용어 "엑스포트 요소"는 핵으로부터 세포의 세포질로 RNA 전사물의 수송을 조절하는 시스-작용성 전사-후 조절 요소를 지칭한다. RNA 엑스포트 요소의 예로는, 이로써 제한되지 않지만, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) rev 반응 요소(RRE)[참조: Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053; and Cullen et al., 1991. Cell 58: 423], 및 간염 B 바이러스 전사-후 조절 요소(HPRE)가 포함된다. 일반적으로, RNA 엑스포트 요소는 유전자의 3' UTR 내에 배치되며, 하나 또는 다수의 카피로 삽입될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 바이러스 벡터 내의 이종 서열의 발현은 벡터 내에 전사-후 조절 요소, 효율적인 폴리아데닐화 부위 및 임의로 전사 종결 시그날을 도입시킴으로써 증가된다. 다양한 전사-후 조절 요소, 예를 들면, 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73:2886); 간염 B 바이러스에 존재하는 전사-후 조절 요소(HPRE)[참조: Huang et al., Mol . Cell. Biol., 5:3864] 및 기타[참조: Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766]는 단백질에서 이종 핵산의 발현을 증가시킬 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 WPRE 또는 HPRE와 같은 전사-후 조절 요소를 결여하거나 포함하지 않는데, 이는 일부 경우에 이들 요소가 세포 형질전환의 위험을 증가시키고/시키거나 mRNA 전사물의 양 또는 mRNA의 안정성을 실질적으로 또는 상당히 증가시키지 않기 때문이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 추가된 안전성 척도로서 WPRE 또는 HPRE를 결여하거나 포함하지 않는다.
이종 핵산 전사물의 효율적인 종결 및 폴리아데닐화를 지시하는 요소는 이종 유전자 발현을 증가시킨다. 전사 종결 시그날은 일반적으로 폴리아데닐화 시그날의 하류에서 발견된다. 특정한 실시양태에서, 벡터는 발현되는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 폴리아데닐화 서열 3'을 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "폴리A 부위" 또는 "폴리A 서열"은 RNA 폴리머라제 II에 의한 신생 RNA 전사의 종결 및 폴리아데닐화 둘 다를 지시하는 DNA 서열을 나타낸다. 폴리아데닐화 서열은 코딩 서열의 3' 말단에 대한 폴리A 테일의 부가에 의해 mRNA 안정성을 촉진시키고, 따라서 증가된 번역 효율에 기여할 수 있다. 재조합 전사물의 효율적인 폴리아데닐화가 바람직한데, 이는 폴리A 테일을 결여하는 전사물이 불안정하고 신속하게 분해되기 때문이다. 본 발명의 벡터에서 이용될 수 있는 폴리A 시그날의 예시적인 예로는 이상적 폴리A 서열(예를 들면, AATAAA, ATTAAA AGTAAA), 소 성장 호르몬 폴리A 서열(BGHpA), 토끼 β-글로빈 폴리A 서열(rβgpA), 또는 당해 기술분야에서 공지된 또 다른 적합한 이종 또는 내인성 폴리A 서열이 포함된다.
특정한 실시양태에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터는 절연체(insulator) 요소를 추가로 포함한다. 절연체 요소는, 게놈 DNA에 존재하는 시스-작용성 요소에 의해 매개될 수 있고 전이된 서열의 탈조절된 발현을 유도할 수 있는 통합 부작용으로부터 렌티바이러스-발현된 서열, 예를 들면, 치료학적 폴리펩티드를 보호하는데 기여할 수 있다(즉, 위치 효과(position effect); 참조: Burgess-Beusse et al., 2002, Proc . Natl . Acad . Sci ., USA, 99:16433; 및 Zhan et al., 2001, Hum. Genet., 109:471). 일부 실시양태에서, 전이 벡터는 3' LTR 내에 하나 이상의 절연체 요소를 포함하고, 숙주 게놈 내로 프로바이러스의 통합시에 당해 프로바이러스는 3' LTR을 복제하는 측면에서 5' LTR 또는 3' LTR 둘 다에 하나 이상의 절연체를 포함한다. 본 발명에서 이용하기에 적합한 절연체에는, 이로써 제한되지 않지만, 닭 β-글로빈 절연체[참조: Chung et al., 1993. Cell 74:505; Chung et al., 1997. PNAS 94:575; and Bell et al., 1999. Cell 98:387; 본원에서 참고로 도입됨)가 포함된다. 절연체 요소의 예로는, 이로써 제한되지 않지만, 닭 HS4와 같은 β-글로빈 유전자좌(locus)로부터의 절연체가 포함된다.
본 발명의 특정한 구체적 실시양태에 따르면, 바이러스 벡터 골격 서열의 대부분 또는 전부는 렌티바이러스, 예를 들면, HIV-1로부터 유래된다. 그러나, 렌티바이러스 서열의 다수의 상이한 공급원이 이용될 수 있고, 특정한 렌티바이러스 서열 중에서 다수의 치환 및 변경이 본원에 기재된 기능을 수행하는 전이 벡터의 능력을 손상시키지 않고서 수용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 다양한 렌티바이러스 벡터는 당해 기술분야에서 공지되어 있다[참조: Naldini et al.,(1996a, 1996b, 및 1998); Zufferey et al.,(1997); Dull et al., 1998, 미국 특허 제6,013,516호; 및 5,994,136호; 이들 중 다수는 본 발명의 바이러스 벡터 또는 전이 플라스미드를 생산하기 위해 채용될 수 있다].
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 메신저 RNA(mRNA), RNA, 게놈 RNA(gRNA), 플러스 사슬 RNA(RNA(+)), 마이너스 사슬 RNA(RNA(-)), 게놈 DNA(gDNA), 상보적 DNA(cDNA) 또는 DNA를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 및 이중 사슬 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 전형적으로 변이체가 기준 서열의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 경우에, 본원에 기재된 임의의 기준 서열(참조: 서열 목록)에 대해서 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 변이체를 포함한다. 다양한 예시적 실시양태에서, 본 발명은, 부분적으로, 바이러스 벡터 및 전이 플라스미드 폴리뉴클레오티드 서열 및 이들을 포함하는 조성물을 의도한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 치료학적 폴리펩티드 및/또는 목적 기타 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드 변이체" 및 "변이체" 등은 기준 폴리뉴클레오티드 서열 또는, 이하에 정의된 엄격한 조건하에서 기준 서열과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드와 실질적 서열 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이들 용어는 하나 이상의 뉴클레오티드가 부가 또는 결실되거나, 기준 폴리뉴클레오티드와 비교하여 상이한 뉴클레오티드로 대체된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이와 관련하여, 돌연변이, 부가, 결실 및 치환을 포함하는 특정의 변경이 기준 폴리뉴클레오티드에 대해 이루어지고, 이에 의해 변경된 폴리뉴클레오티드가 기준 폴리뉴클레오티드의 생물학적 기능 또는 활성을 보유할 수 있음은 당해 기술분야에서 잘 이해된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 이의 천연 상태에서 통상적으로 동반하는 성분들을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는 물질, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 세포를 의미한다. 특정한 실시양태에서, 용어 "수득된" 또는 "유래된"은 단리된과 동의어로 이용된다. 예를 들면, 본원에서 이용된 바와 같은 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 천연-발생 상태에서 이의 측면에 있는 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 통상 단편에 인접하는 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭한다.
폴리뉴클레오티드의 배향을 기재하는 용어에는 다음이 포함된다: 5'(통상적으로, 유리 포스페이트 그룹을 갖는 폴리뉴클레오티드의 말단) 및 3'(통상적으로 유리 하이드록실(OH) 그룹을 갖는 폴리뉴클레오티드의 말단). 폴리뉴클레오티드 서열은 5'에서 3' 배향 또는 3'에서 5' 배향으로 주석을 달 수 있다.
용어 "상보적" 및 "상보성"은 염기-쌍 규칙에 의해 관련된 폴리뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드의 서열)을 지칭한다. 예를 들면, DNA 서열 5' AGTCATG 3'의 상보적 사슬은 3' TCAGTAC 5'이다. 후자의 서열은 종종 좌측에 5' 말단 및 우측에 3' 말단을 갖는 역보체, 5' CATGACT 3'로 기재된다. 이의 역보체에 해당하는 서열은 회문식 서열(palindromic sequence)인 것으로 언급된다. 상보성은, 핵산 염기의 단지 일부가 염기 쌍 규칙에 따라 정합되는 "부분적"일 수 있다. 또는, 핵산들 사이에는 "완전한" 또는 "전체" 상보성이 존재할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "핵산 카세트"는 RNA, 및 이어서 폴리펩티드를 발현할 수 있는 벡터 내의 유전자 서열을 지칭한다. 핵산 카세트는 목적 유전자(들), 예를 들면, 목적 폴리뉴클레오티드(들)를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 카세트는 하나 이상의 발현 조절 서열 및 목적 유전자(들), 예를 들면, 목적 폴리뉴클레오티드(들)을 함유한다. 벡터는 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 핵산 카세트를 포함할 수 있다. 핵산 카세트는, 당해 카세트 내의 핵산이 RNA로 전사되고, 필요한 경우에 단백질 또는 폴리펩티드로 번역되고, 형질전환된 세포에서 활성에 필요한 적절한 번역-후 변형을 겪고, 적절한 세포내 구획에 대한 표적화 또는 세포외 구획 내로의 분비에 의해 생물학적 활성에 적절한 구획으로 전좌될 수 있도록 벡터 내에 위치적으로 및 순차로 배향된다. 바람직하게는, 카세트는 벡터 내로의 준비된 삽입에 적당한 이의 3' 및 5' 말단을 가지며, 예를 들면, 이는 각각의 말단에 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 핵산 카세트는 조혈 장애와 같은 유전자 장애를 치료, 예방 또는 개선시키기 위해 이용된 치료 유전자의 서열을 함유한다. 카세트는 제거하고, 단일 유닛으로서 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내에 삽입할 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 목적 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "목적 폴리뉴클레오티드"는 발현시키고자 하는 발현 벡터 내에 삽입된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 폴리펩티드(즉, 목적 폴리펩티드)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 벡터 및/또는 플라스미드는 하나 이상의 목적 폴리뉴클레오티드, 또는 발현이 요구되는 폴리펩티드, 예를 들면, 절단된 에리트로포이에틴 수용체를 인코딩하는 기타 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정의 실시양태에서, 목적 폴리뉴클레오티드는, "치료학적 폴리펩티드"로 지칭될 수 있는, 질환 또는 장애의 치료, 예방 또는 개선에서 치료학적 효과를 제공하는 폴리펩티드, 예를 들면, 글로빈 유전자를 인코딩한다[참조: 서열번호 2-4, 6-9, 11-13 및 15].
용어 "글로빈"은 헴 잔기와 공유 또는 비공유 결합할 수 있고 따라서 산소를 수송 또는 저장할 수 있는 모든 단백질 또는 단백질 아단위를 의미하기 위해 본원에서 이용된다. 척추동물 및 무척추동물 헤모글로빈, 척추동물 및 무척추동물 미오글로빈 또는 이들의 돌연변이체의 아단위는 용어 글로빈에 포함된다. 글로빈의 예에는 α-글로빈 또는 이의 변이체, β-글로빈 또는 이의 변이체, γ-글로빈 또는 이의 변이체, 및 δ-글로빈이 포함된다.
한 가지 실시양태에서, 목적 폴리뉴클레오티드는 이상헤모글로빈증의 치료를 위해 치료학적 기능을 제공하는 폴리펩티드, 예를 들면, α-글로빈, β-글로빈 또는 β-글로빈A - T87Q를 인코딩하는 유전자이다. 목적 폴리뉴클레오티드 및 이로부터 인코딩된 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 이의 기능적 변이체 및 단편을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 기능적 변이체는 상응하는 야생형 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 대해서 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는다. 특정의 실시양태에서, 기능적 변이체 또는 단편은 상응하는 야생형 폴리펩티드의 생물학적 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%를 갖는다. 본 발명에서 이용하기에 적합한 대표적인 폴리뉴클레오티드 서열에는, 이로써 제한되지 않지만, α-글로빈, β-글로빈, β-글로빈A - T87Q, 및 다양한 절단된 에리트로포이에틴 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 서열번호 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 35 및 36이 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 코딩 서열 자체의 길이와는 무관하게, 이들의 전체 길이가 상당히 달라질 수 있도록 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 또는 당해 기술분야에서 공지된 바와 같이, 프로모터 및/또는 인핸서, 비번역된 영역(UTR), 코작 서열, 폴리아데닐화 시그날, 추가의 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 내부 리보솜 도입 부위(IRES), 재조합효소(recombinase) 인식 부위(예를 들면, LoxP, FRT 및 Att 부위), 종결 코돈, 전사 종결 시그날, 및 자가-절단 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 에피토프 태그와 같은 다른 DNA 서열과 조합될 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 폴리뉴클레오티드 단편이 이용될 수 있고, 전체 길이는 바람직하게는 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서 제조 및 이용 용이성에 의해 제한되는 것으로 생각된다.
용어 "발현 조절 서열"은, 하나 이상의 프로모터, 인핸서, 또는 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드의 전사 또는 발현을 지시, 증가, 조절 또는 제어할 수 있는 기타 전사 조절 요소 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 특정 세포, 세포 유형 또는 세포 계통, 예를 들면, 표적 세포에 특이적인 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함하고, 즉 특정 세포, 세포 유형 또는 세포 계통에 특이적인 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현은 표적 세포에서 발현되고 기타 비-표적 세포에서 발현되지 않는다. 세포 특이적인 벡터 내의 하나 이상의 발현 조절 서열 중의 각각의 서열은 요구된 치료에 따라 동일하거나 상이한 세포 유형에서 발현할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 벡터는 조혈 세포, 예를 들면, 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포에 특이적인 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 벡터는 적혈구 세포에 특이적인 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제가 결합하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)의 인식 부위를 지칭한다. 용어 "인핸서"는, 증강된 전사를 제공할 수 있는 서열을 함유하고 일부의 경우에 또 다른 조절 서열에 대해 이들의 배향과는 독립적으로 작용할 수 있는 DNA의 세그먼트를 지칭한다. 인핸서는 프로모터 및/또는 기타 인핸서 요소와 협동적으로 또는 부가적으로 작용할 수 있다. 용어 "프로모터/인핸서"는 프로모터 및 인핸서 기능 둘 다를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 세그먼트를 지칭한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 외인성, 내인성 또는 이종 조절 서열을 포함한다. "내인성" 조절 서열은 게놈 내에서 소정 유전자와 자연적으로 연결된 것이다. "외인성" 조절 서열은 당해 유전자의 전사가 연결된 인터류킨/프로모터에 의해 지시되도록 유전자 조작(즉, 분자 생물학 기술)의 방법에 의해 유전자에 병렬로 배치된 것이다. "이종" 조절 서열은 유전적으로 조작된 세포와 상이한 종으로부터 유래하는 외인성 서열이다.
용어 "작동적으로 연결된"은 기재된 성분이 이들을 이들의 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계로 존재하는 병렬관계를 지칭한다. 한 가지 실시양태에서, 상기 용어는 핵산 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터 및/또는 인핸서 또는 기타 발현 조절 서열)과 제2 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 목적 폴리뉴클레오티드 사이의 기능적 연결을 지칭하고, 여기서 발현 조절 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "구성적 발현 조절 서열"은 작동적으로 연결된 서열의 전사를 계속해서 또는 연속적으로 가능하게 하는 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서를 지칭한다. 구성적 발현 조절 서열은 광범한 종류의 세포 및 조직 유형에서 발현을 가능하게 하는 "편재성(ubiquitous)" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서, 또는 제한된 종류의 세포 및 조직 유형에서 각각 발현을 가능하게 하는 "세포 특이적", "세포 유형 특이적", "세포 계통 특이적" 또는 "조직 특이적" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서일 수 있다. 예시적인 편재성 발현 조절 서열에는, 이로써 제한되지 않지만, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터, 바이러스성 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들면, 초기 또는 후기), 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 단순 포진 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터, 백시니아 바이러스로부터의 H5, P7.5, 및 P11 프로모터, 신장 인자(elongation factor) 1-알파(EF1a) 프로모터, 초기 성장 반응 1(EGR1), 페리틴 H(FerH), 페리틴 L(FerL), 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH), 진핵성 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1), 열 쇼크 70kDa 단백질 5(HSPA5), 열 쇼크 단백질 90kDa 베타, 구성원 1(HSP90B1), 열 쇼크 단백질 70kDa(HSP70), β-키네신(β-KIN), 인간 ROSA 26 유전자좌[참조: Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477-1482(2007)], 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터 및 β-액틴 프로모터가 포함된다.
특정한 실시양태에서는, 세포, 세포 유형, 세포 계통 또는 조직 특이적 발현 조절 서열을 이용하여 바람직한 폴리뉴클레오티드 서열의 세포 유형 특이적, 계통 특이적 또는 조직 특이적 발현을 달성하는 (예를 들면, 단지 세포 유형, 세포 계통 또는 조직의 서브세트에서, 또는 발육의 특정 단계 중에 폴리펩티드를 인코딩하는 특정 핵산을 발현시키는) 것이 바람직할 수 있다. 세포, 세포 유형, 세포 계통 또는 조직 특이적 발현 조절 서열의 예시적 예로는, 이로써 제한되지 않지만, B29 프로모터(B 세포 발현), 런트(runt) 전사 인자(CBFa2) 프로모터(줄기 세포 발현), CD14 프로모터(단핵구 세포 발현), CD43 프로모터(백혈구 및 혈소판 발현), CD45 프로모터(조혈 세포 발현), CD68 프로모터(대식세포 발현), 엔도글린 프로모터(내피 세포 발현), fms-관련 티로신 키나제 1(FLT1) 프로모터(내피 세포 발현), 인테그린, 알파 2b(ITGA2B) 프로모터(거핵구 발현), 세포내 부착 분자 2(ICAM-2) 프로모터(내피 세포 발현), 인터페론 베타(IFN-β) 프로모터(조혈 세포 발현), β-글로빈 LCR(적혈구 세포 발현), 글로빈 프로모터(적혈구 세포 발현), β-글로빈 프로모터(적혈구 세포 발현), α-글로빈 HS40 인핸서(적혈구 세포 발현), 안키린-1 프로모터(적혈구 세포 발현) 및 위스코트-알드리히(Wiskott-Aldrich) 증후군 단백질(WASP) 프로모터(조혈 세포 발현)가 포함된다.
한 가지 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 인간 β-글로빈 프로모터; 인간 베-글로빈 LCR 및 인간 α-글로빈 HS40 인핸서 및 안키린-1 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 세포 또는 조직 특이적 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "조건적 발현(conditional expression)"은, 이로써 제한되지 않지만, 유도성 발현; 억제성 발현; 특정한 생리학적, 생물학적 또는 질환 상태를 갖는 세포 또는 조직에서의 발현 등을 포함하는 모든 유형의 조건적 발현을 지칭할 수 있다. 이 정의는 세포 유형 또는 조직 특이적 발현을 배제하도록 의도된 것은 아니다. 본 발명의 특정한 실시양태는 목적 폴리뉴클레오티드의 조건적 발현을 제공하고, 예를 들면, 발현은 세포, 조직, 유기체 등을, 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 야기하거나 목적 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리뉴클레오티드의 발현의 증가 또는 감소를 야기하는 처리 또는 조건에 적용함으로써 조절된다.
유도성 프로모터/인핸서의 예시적 예로는, 이로써 제한되지 않지만, 글루코코르티코이드 또는 에스트로겐 수용체를 인코딩하는 유전자에 대한 프로모터와 같은 스테로이드-유도성 프로모터(상응하는 호르몬으로 처리함으로써 유도가능), 메탈로티오닌 프로모터(다양한 중금속으로 처리함으로써 유도가능), MX-1 프로모터(인터페론에 의해 유도가능), "진스위치" 미페프리스톤-조절가능한 시스템("GeneSwitch" mifepristone-regulatable system)[참조: Sirin et al., 2003, Gene, 323:67], 쿠메이트 유도성 유전자 스위치(WO 2002/088346), 테트라사이클린-의존성 조절 시스템 등이 포함된다.
조건적 발현은 또한, 부위-특이적 DNA 재조합효소를 이용함으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 특정한 실시양태에 따르면, 벡터는 부위-특이적 재조합효소에 의해 매개된 재조합을 위한 적어도 하나(통상 2개)의 부위(들)를 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "재조합효소" 또는 "부위-특이적 재조합효소"는 야생형 단백질[참조: Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707(1993)], 또는 이의 돌연변이체, 유도체(예를 들면, 재조합 단백질 서열 또는 이의 단편을 함유하는 융합 단백질), 단편 및 변이체일 수 있는, 하나 이상의 재조합 부위(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 30, 50개 등)를 수반하는 재조합 반응에 연루되는 소화성 또는 통합성 단백질, 효소, 보조-인자(co-factors) 또는 연관된 단백질을 포함한다. 본 발명의 특정한 실시양태에서 이용하기에 적합한 재조합효소의 예시적 예로는, 이로써 제한되지 않지만, Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, Tn3 리졸바제(resolvase), TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1, 및 ParA가 포함된다.
벡터는 광범한 종류의 부위-특이적 재조합효소 중의 임의의 것에 대한 하나 이상의 재조합 부위를 포함할 수 있다. 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터의 통합에 필요한 임의의 부위(들) 이외에도 부위-특이적 재조합효소에 대한 표적 부위가 존재하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "재조합 서열", "재조합 부위" 또는 "부위-특이적 재조합 부위"는 재조합효소가 인식하고 결합하는 특정한 핵산 서열을 지칭한다.
예를 들면, Cre 재조합효소에 대한 하나의 재조합 부위는 8개의 염기쌍 코어 서열의 측면에 있는 두 개의 13개 염기쌍 반전 반복부위(재조합효소 결합 부위로 작용함)를 포함하는 34개 염기쌍 서열인 loxP이다(참조: 문헌[Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527(1994)]의 도 1). 기타 예시적 loxP 부위에는, 이로써 제한되지 않지만, lox511(Hoess et al., 1996; Bethke and Sauer, 1997), lox5171(Lee and Saito, 1998), lox2272(Lee and Saito, 1998), m2(Langer et al., 2002), lox71(Albert et al., 1995) 및 lox66(Albert et al., 1995)이 포함된다.
FLP 재조합효소에 대한 적합한 인식 부위에는, 이로써 제한되지 않지만, FRT(McLeod, et al., 1996), F1, F2, F3(Schlake and Bode, 1994), F4, F5(Schlake and Bode, 1994), FRT(LE)(Senecoff et al., 1988), FRT(RE)(Senecoff et al., 1988)가 포함된다.
인식 서열의 다른 예는 재조합효소 효소 λ 인테그라제(Integrase), 예를 들면, phi-c31에 의해 인식되는 attB, attP, attL 및 attR 서열이다. φC31 SSR은 단지 이형 부위(heterotypic site) attB(길이 34bp) 및 attP(길이 39bp) 사이에서만 재조합을 매개한다[참조: Groth et al., 2000]. 각각 박테리아 및 파지 게놈 상의 파지 인테그라제에 대한 부착 부위에 대한 명칭인 attB 및 attP는 둘 다 φC31 호모다이머에 의해 결합될 것 같은 불완전한 반전 반복부위를 함유한다[참조: Groth et al., 2000]. 생성물 부위(product site)인 attL 및 attR은 추가의 φC31-매개된 재조합에 대해서 효과적으로 불활성이고[참조: Belteki et al., 2003], 이는 반응을 비가역적으로 만든다. 삽입을 촉진시키는 경우에, attB-보유 DNA는 게놈 attB 부위 내로 attP 부위 삽입보다 더 쉽게 게놈 attP 부위 내로 삽입하는 것으로 발견되었다[참조: Thyagarajan et al., 2001; Belteki et al., 2003]. 따라서, 대표적인 전략은, attP-보유 "도킹 부위(docking site)"를 규정된 유전자좌 내로 상동성 재조합시킨 다음, 삽입을 위한 attB-보유 유입 서열과 짝을 이루는 것으로 결정된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "내부 리보솜 도입 부위" 또는 "IRES"는, 시스트론(단백질 인코딩 영역)의 ATG와 같은 개시 코돈으로의 직접적인 내부 리보솜 도입을 촉진시키고 이에 의해 유전자의 캡(cap)-독립적 번역을 유도하는 요소를 지칭한다[참조: Jackson et al., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83 and Jackson and Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000]. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 의해 의도되는 벡터는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 목적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 다수의 폴리펩티드 각각의 효율적인 번역을 달성하기 위해서, 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 IRES 서열 또는 자가-절단성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 분리될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "코작 서열"은, 리보솜의 작은 아단위에 대한 mRNA의 초기 결합을 크게 촉진시키고 번역을 증가시키는 짧은 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 공통 코작 서열은 (GCC)RCCATGG이고, 여기서 R은 퓨린(A 또는 G)이다[참조: Kozak, 1986. Cell. 44(2):283-92, 및 Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48]. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 의해 의도되는 벡터는, 공통 코작 서열을 가지며 바람직한 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정의 실시양태에서, 벡터는 선택가능한 마커로 또한 불리우는 선택 유전자를 포함한다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 하이그로마이신, 메토트렉세이트, 제오신(Zeocin), 블라스토시딘(Blastocidin) 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, (c) 복잡한 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 인코딩하며, 예를 들면, 바실루스에 대한 D-알라닌 라세메이즈를 인코딩하는 유전자이다. 임의 수의 선택 시스템이 형질전환된 세포주를 회수하기 위해서 이용될 수 있다. 이들에는, 이로써 제한되지 않지만, 각각 tk- 또는 aprt-세포에서 이용될 수 있는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제[참조: Wigler et al., 1977. Cell 11:223-232] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제[참조: Lowy et al., 1990. Cell 22:817-823] 유전자가 포함된다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 세포에서 하나 이상의 폴리펩티드, 예를 들면, 글로빈, EpoR의 발현을 증가, 확립 및/또는 유지하기 위해 이용된다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머 및 이의 변이체 및 합성 유사체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교대로 이용된다. 따라서, 이들 용어는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 천연-발생 아미노산 폴리머 뿐만 아니라 상응하는 천연 발생 아미노산의 화학적 유사체와 같은 합성 비-천연 발생 아미노산인 아미노산 폴리머에 적용된다.
본 발명의 특정한 실시양태는 폴리펩티드 "변이체"를 포함한다. 인용되는 폴리펩티드 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 부가, 결실, 절단 및/또는 치환에 의해 기준 폴리펩티드로부터 구별되고 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드를 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 폴리펩티드 변이체는, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 보존적 또는 비-보존적일 수 있는, 하나 이상의 치환에 의해 기준 폴리펩티드와 구별된다.
특정 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드의 상응하는 서열과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아미노산의 부가 또는 결실은 기준 폴리펩티드의 C-말단 및/또는 N-말단에서 발생한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 결실은 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 105, 약 110, 약 115, 약 120, 약 125, 약 130, 약 135, 약 140, 약 145, 약 150, 약 155, 약 160, 약 165, 약 170개 또는 그 이상의 아미노산의 C-말단 절단물을 포함하고, 모든 개재 수의 아미노산, 예를 들면, 25, 26, 27, 29, 30 ... 100, 101, 102, 103, 104, 105 ... 170, 171, 172, 173, 174개 등을 포함한다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 치환, 결실, 절단 및 삽입을 포함하는 다양한 방법으로 변경될 수 있다. 이러한 조작을 위한 방법은 당해 기술분야에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들면, 기준 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 DNA 중의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발 및 뉴클레오티드 서열의 변경을 위한 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Kunkel (1985, Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), U.S. Pat. No. 4,873,192, Watson, J. D. et al., (Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987, 및 본원에서 인용된 참조문헌]. 목적하는 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침은 문헌[참조: Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)]의 모델에서 발견할 수 있다.
"숙주 세포"는 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 형질감염되거나 감염되거나 형질도입된 세포를 포함한다. 숙주 세포는 팩키징 세포, 생산자 세포, 및 바이러스 벡터로 감염된 세포를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터로 감염된 숙주 세포는 치료가 필요한 대상체에게 투여된다. 특정한 실시양태에서, 용어 "표적 세포"는 숙주 세포와 상호 교대로 이용되고, 목적하는 세포 유형의 형질감염된, 감염된 또는 형질도입된 세포를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 표적 세포는 조혈 세포, 예를 들면, 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포이다.
대규모 바이러스 입자 생산은 종종 합리적인 바이러스 역가를 달성하기 위해서 필요하다. 바이러스 입자는 전이 벡터를, 바이러스 구조 및/또는 보조 유전자, 예를 들면, gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx 또는 nef 유전자 또는 기타 레트로바이러스 유전자를 포함하는 팩키징 세포주 내로 형질감염시킴으로써 생산된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "팩키징 벡터"는, 팩키징 시그날을 결여하고 1, 2, 3, 4개 이상의 바이러스 구조 및/또는 보조 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 바이러스 벡터를 지칭한다. 전형적으로, 팩키징 벡터는 팩키징 세포 내에 포함되고, 형질감염, 형질도입 또는 감염을 통해 세포 내로 도입된다. 형질감염, 형질도입 또는 감염의 방법은 당해 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다. 본 발명의 레트로바이러스/렌티바이러스 벡터는 형질감염, 형질도입 또는 감염에 의해 팩키징 세포주 내로 도입되어 생산자 세포 또는 세포주를 생성시킬 수 있다. 본 발명의 팩키징 벡터는, 예를 들면, 칼슘 포스페이트 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공을 포함하는 표준 방법에 의해 인간 세포 또는 세포주 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 팩키징 벡터는 네오마이신, 하이그로마이신, 퓨로마이신, 블라스토시딘, 제오신, 티미딘 키나제, DHFR, Gln 신세타제 또는 ADA와 같은 우성 선택가능한 마커와 함께 세포 내로 도입되고, 이어서 적절한 약물의 존재하에서의 선택 및 클론의 단리가 수행된다. 선택가능한 마커 유전자는 팩키징 벡터에 의해, 예를 들면, IRES 또는 자체 절단성 바이러스 펩티드에 의해 인코딩하는 유전자에 물리적으로 연결될 수 있다.
바이러스 외피 단백질(env)은 세포주로부터 생성된 재조합 레트로바이러스에 의해 궁극적으로 감염 및 형질전환될 수 있는 숙주 세포의 범위를 결정한다. HIV-1, HIV-2, SIV, FIV 및 EIV와 같은 렌티바이러스의 경우에, env 단백질은 gp41 및 gp120을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 팩키징 세포에 의해 발현된 바이러스 env 단백질은 전술한 바와 같이 바이러스 gag 및 pol 유전자로부터 별개의 벡터 상에서 인코딩된다.
본 발명에서 이용될 수 있는 레트로바이러스-유래된 env 유전자의 예시적인 예로는, 이로써 제한되지 않지만, MLV 외피, 10A1 외피, BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, 에볼라(Ebola), 센다이(Sendai), FPV(조류 독감(Fowl plague) 바이러스) 및 인플루엔자 바이러스 외피가 포함된다. 유사하게는, RNA 바이러스[예를 들면, 피코르나비리다에(Picornaviridae), 칼시비리다에(Calciviridae), 아스트로비리다에(Astroviridae), 토가비리다에(Togaviridae), 플라비비리다에(Flaviviridae), 코로나비리다에(Coronaviridae), 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae), 라브도비리다에(Rhabdoviridae), 필로비리다에(Filoviridae), 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae), 분야비리다에(Bunyaviridae), 아레나비리다에(Arenaviridae), 레오비리다에(Reoviridae), 버나비리다에(Birnaviridae), 레트로비리다에(Retroviridae)의 RNA 바이러스 계열]로부터 뿐만 아니라 DNA 바이러스[헤파드나비리다에(Hepadnaviridae), 서코비리다에(Circoviridae), 파르보비리다에(Parvoviridae), 파포바비리다에(Papovaviridae), 아데노비리다에(Adenoviridae), 헤르페스비리다에(Herpesviridae), 폭시이리다에(Poxyiridae) 및 이리도비리다에(Iridoviridae) 과]로부터의 외피를 인코딩하는 유전자가 이용될 수 있다. 대표적인 예로는 FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, 래비스(Rabies), ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 및 EIAV가 포함된다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 바이러스를 슈도타이핑(pseudotyping)하기 위한 외피 단백질에는, 이로써 제한되지 않지만, 다음의 바이러스들이 포함된다: H1N1, H1N2, H3N2 및 H5N1(조류 독감)과 같은 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 로타바이러스, 노르워크(Norwalk) 바이러스 그룹의 임의의 바이러스, 장 아데노바이러스(adenoviruses), 파르보바이러스(parvovirus), 뎅기열(Dengue fever) 바이러스, 원숭이 두창(Monkey pox), 모노네가비랄레스(Mononegavirales), 광견병 바이러스, 라고스 배트(Lagos bat) 바이러스, 모콜라(Mokola) 바이러스, 두벤하게(Duvenhage) 바이러스, 유로피안 배트(European bat) 바이러스 1 및 2 및 오스트랄리안 배트(Australian bat) 바이러스와 같은 리사바이러스(Lyssavirus), 에페메로바이러스(Ephemerovirus), 베시큘로바이러스(Vesiculovirus), 수포성 구내염(Vesicular Stomatitis) 바이러스(VSV), 단순 포진 바이러스 유형 1 및 2, 수두 대상포진(varicella zoster), 사이토메갈로바이러스, 엡스타인-바르(Epstein-Bar) 바이러스(EBV), 인간 헤르페스바이러스(HHV), 인간 헤르페스바이러스 유형 6 및 8, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 파필로마 바이러스(papilloma virus), 쥐 감마헤르페스바이러스와 같은 헤르페스바이러스, 아레나바이러스(Arenaviruses), 예를 들면, 아르헨티나 출혈열(Argentine hemorrhagic fever) 바이러스, 볼리비아 출혈열 바이러스, 사비아(Sabia)-연관된 출혈열 바이러스, 베네주엘라 출혈열 바이러스, 라사열(Lassa fever) 바이러스, 마쿠포(Machupo) 바이러스, 림프구성 맥락수막염(Lymphocytic choriomeningitis) 바이러스(LCMV), 분야비리다에, 예를 들면, 크리미언-콩고(Crimean-Congo) 출혈열 바이러스, 한타바이러스(Hantavirus), 신장 증후군 야기 바이러스에 의한 출혈열, 리프트 밸리열(Rift Valley fever) 바이러스, 에볼라 출혈열 및 마르버그(Marburg ) 출혈열을 포함하는 필로비리다에(필로바이러스), 케이사누르 산림병(Kaysanur Forest disease) 바이러스를 포함하는 플라비비리다에, 옴스크(Omsk) 출혈열 바이러스, 진드기-매개 뇌염 야기 바이러스 및 파라믹소비리다에, 예를 들면, 헨드라(Hendra) 바이러스 및 니파(Nipah) 바이러스, 바리올라 메이저(variola major) 및 바리올라 마이너(variola minor)(천연두), 알파바이러스, 예를 들면, 베네주엘라 말 뇌염 바이러스, 동부형 말 뇌염(eastern equine encephalitis) 바이러스, 서부형(western) 말 뇌염 바이러스, SARS-연관된 코로나바이러스(SARS-CoV), 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 임의의 뇌염-야기 바이러스.
한 가지 실시양태에서, 본 발명은 VSV-G 당단백질로 슈도타입화된 재조합 레트로바이러스, 예를 들면, 렌티바이러스를 생산하는 팩키징 세포를 제공한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "슈도타입" 또는 "슈도타이핑"은 이의 바이러스 외피 단백질이 바람직한 특징을 갖는 다른 바이러스의 것으로 치환된 바이러스를 지칭한다. 예를 들면, HIV 외피 단백질(env 유전자에 의해 인코딩됨)은 통상적으로 바이러스를 CD4+ 제시 세포에 대해서 표적화하기 때문에, HIV는 HIV가 더 넓은 범위의 세포를 감염시키도록 하는 소포성 구내염 바이러스 G-단백질(VSV-G) 외피 단백질로 슈도타입화될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 렌티바이러스 외피 단백질은 VSV-G에 의해 슈도타입화된다. 한 가지 실시양태에서, 본 발명은 VSV-G 외피 당단백질로 슈도타입화된 재조합 레트로바이러스, 예를 들면, 렌티바이러스를 생산하는 팩키징 세포를 제공한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "팩키징 세포주"는 팩키징 시그날을 함유하지 않지만, 바이러스 입자의 정확한 팩키징에 필요한 바이러스 구조 단백질 및 복제 효소(예를 들면, gag, pol 및 env)를 안정적으로 또는 일시적으로 발현하는 세포주와 관련하여 이용된다. 임의의 적합한 세포주는 본 발명의 팩키징 세포를 제조하기 위해서 이용될 수 있다. 일반적으로, 세포는 포유동물 세포이다. 특정한 실시양태에서, 팩키징 세포주를 생산하기 위해 이용된 세포는 인간 세포이다. 이용될 수 있는 적합한 세포주에는, 예를 들면, CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, C3H 10T1/2 세포, FLY 세포, Psi-2 세포, BOSC 23 세포, PA317 세포, WEHI 세포, COS 세포, BSC 1 세포, BSC 40 세포, BMT 10 세포, VERO 세포, W138 세포, MRC5 세포, A549 세포, HT1080 세포, 293 세포, 293T 세포, B-50 세포, 3T3 세포, NIH3T3 세포, HepG2 세포, Saos-2 세포, Huh7 세포, HeLa 세포, W163 세포, 211 세포 및 211A 세포가 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 팩키징 세포는 293 세포, 293T 세포 또는 A549 세포이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 세포는 A549 세포이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "생산자 세포주"는, 팩키징 세포주 및 팩키징 시그날을 포함하는 전이 벡터를 포함하는, 재조합 레트로바이러스 입자를 생산할 수 있는 세포주를 지칭한다. 감염성 바이러스 입자 및 바이러스 저장 용액의 생산은 통상적인 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 바이러스 저장 용액을 제조하는 방법은 당해 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: Y. Soneoka et al.(1995) Nucl . Acids Res. 23:628-633, 및 N. R. Landau et al.(1992) J. Virol. 66:5110-5113]에 예시되어 있다. 감염성 바이러스 입자는 통상적인 기술을 이용하여 팩키징 세포로부터 수거될 수 있다. 예를 들면, 감염성 입자는 당해 기술분야에서 공지된 바와 같이 세포 용해, 또는 세포 배양물의 상청액의 수거에 의해 수거될 수 있다. 임의로, 수거된 바이러스 입자는 필요에 따라 정제될 수 있다. 적합한 정제 기술은 당해 기술분야에서 기술자에게 공지되어 있다.
형질감염이 아닌 바이러스 감염에 의해 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 이용한 유전자(들) 또는 기타 폴리뉴클레오티드 서열의 전달은 "형질도입"이라 치칭된다. 한 가지 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터는 감염 및 프로바이러스 통합을 통해서 세포 내에 형질도입된다. 특정의 실시양태에서, 세포가 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 이용한 감염에 의해 세포에 전달된 유전자 또는 기타 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다면, 세포, 예를 들면, 표적 세포는 "형질도입"된 것이다. 특정한 실시양태에서, 형질도입된 세포는 이의 세포 게놈 내에 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터에 의해 전달된 하나 이상의 유전자 또는 기타 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 하나 이상의 폴리펩티드를 발현하는 본 발명의 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 숙주 세포는 조혈 질환, 장애 또는 상태를 치료 및/또는 예방하기 위해 대상체에게 투여된다. 본 발명의 특정의 실시양태에 따라 이용될 수 있는 유전자 치료에서 바이러스 벡터의 이용에 관한 기타 방법은, 예를 들면, 문헌[참조: Kay, M. A.(1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S; Ferry, N. and Heard, J. M.(1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al.(1999) Liver 19:265-74; Oka, K. et al.(2000) Curr . Opin . Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. and Liu, J. M.(2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S.(1992) Crit . Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M.(1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. and Crystal, R. G.(1994) Ann. N.Y . Acad . Sci. 716:90-101; Strayer, D. S.(1999) Expert Opin . Investig . Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. and Bartlett, J. S.(2001) Curr . Cardiol . Rep. 3:43-49; and Lee, H. C. et al.(2000) Nature 408:483-8]에서 발견할 수 있다.
"증강" 또는 "촉진" 또는 "증가" 또는 "확장"이란 일반적으로, 비히클 또는 대조군 분자/조성물에 의해 유발된 반응과 비교하여 특정 세포 유형 또는 특이적 세포 계통에서, 또는 기타 세포 유형 또는 특이적 세포 계통에서 보다 큰 생리학적 반응(즉, 하향 효과)를 생산, 유도 또는 유발하는 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 벡터로 형질도입된 숙주 세포의 능력을 지칭한다. 측정가능한 생리학적 반응은, 그 중에서도 당해 기술분야 및 본원 기재의 이해로부터 명백한, 세포 확장, 생착, 생존, 호밍 및/또는 자자-재생의 증가를 포함할 수 있다. 한 가지 실시양태에서, 본 발명의 벡터로 형질도입된 조혈 줄기 세포는 전구 세포로의 생성을 제공하고, 당해 증가는 다른 세포 계통과 비교하여 하나의 계통, 예를 들면, 적혈구 계통의 전구 세포 수의 증가를 포함한다. 조혈 줄기 및/또는 전구 세포 생착, 생존력, 호밍, 자가-재생 및/또는 생체내 확장의 증가는 당해 기술분야에 공지된 방법, 예를 들면, 그 중에서도 유전자 발현, CFU-C 분석, CFU-S 분석, CAFC 분석 및 세포 표면 단백질 발현을 이용하여 확인할 수 있다. "증가된" 또는 "증강된" 양은 통상 "통계학적으로 유의한" 양이고, 비히클, 대조군 조성물에 의해 생산된 반응 또는 특정 세포 계통에서의 반응과 비교하여 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예를 들면, 500, 1000배)(1 사이 및 1 초과의 모든 정수 및 소수점, 예를 들면, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 등을 포함함)인 증가를 포함할 수 있다.
"감소" 또는 "저하" 또는 "저감" 또는 "경감"이란, 비히클 또는 대조군 분자/조성물에 의해 유발된 반응과 비교하여 특정 세포 유형 또는 특이적 세포 계통에서 또는 기타 세포 유형 또는 특이적 세포 계통에서 보다 낮은 생리학적 반응(즉, 하향 효과)를 생산, 유도 또는 유발하는 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 벡터로 형질도입된 숙주 세포의 능력을 일반적으로 지칭한다. "저하" 또는 "감소된" 양은 통상 "통계학적으로 유의한" 양이고, 비히클, 대조군 조성물에 의해 생산된 반응(기준 반응) 또는 특정 세포 계통에서의 반응과 비교하여 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예를 들면, 500, 1000배)(1 사이 및 1 초과의 모든 정수 및 소수점, 예를 들면, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 등을 포함함)인 감소를 포함할 수 있다.
"유지하다" 또는 "보존하다" 또는 "유지" 또는 "변화 없는" 또는 "실질적 변화 없는" 또는 "실질적 감소 없는"이란 비히클 또는 대조군 분자/조성물에 의해 유발된 반응 또는 특정 세포 계통에서의 반응과 비교하여 세포에서 보다 낮은 생리학적 반응(즉, 하향 효과)를 생산, 유도 또는 유발하는 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 벡터로 형질도입된 숙주 세포의 능력을 일반적으로 지칭한다. 비교가능한 반응은 기준 반응으로부터 유의적 차이 또는 측정가능한 차이가 없는 것이다.
관사 "하나"("a", "an") 및 "상기"("the")는 당해 관사의 하나 이상(즉, 적어도 하나)의 문법적 대상을 지칭하기 위해 이용된다. 예를 들면, 하나의 "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
대체용어(예를 들면, "또는")의 이용은 대체 대상 중의 하나, 둘 다 또는 이들의 모든 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "포함한다(include)" 및 "포함하다(comprise)"는 동의어로 이용된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수(dimension), 크기, 양, 중량 또는 길이의 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼까지 변화하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 한 가지 실시양태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 대략 ±15%, ±10%, ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, 또는 ±1%인 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
본 명세서 전체에 걸쳐서, 당해 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다(comprise)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 언급된 단계 또는 요소, 또는 단계 또는 요소의 그룹을 포함하지만, 어떤 다른 단계 또는 요소, 또는 단계 또는 요소의 그룹을 배제하지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. "~로 구성되는"은 문구 "~로 구성되는"에 이어지는 것이 무엇이든지 포함하며, 이들로 제한되는 것을 의미한다. 따라서, 문구 "~로 구성되는"은 열거된 요소가 필요하거나 필수적인 것이고, 존재할 수 있는 다른 요소가 없음을 나타낸다. "본질적으로 ~로 구성되는"은 문구 다음에 열거된 임의의 요소를 포함하고, 열거된 요소에 대한 개시에 명시된 활성 또는 작용을 저해하지 않거나 명시된 활성 또는 작용에 기여하는 기타 요소들로 제한되는 것을 의미한다. 따라서, 문구 "본질적으로 ~로 구성되는"은 열거된 요소가 필요하거나 필수적이지만, 임의적이고 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 아닌지의 여부에 따라 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 기타 요소가 없음을 나타낸다.
본 명세서 전체에 걸쳐 "하나의 실시양태" 또는 "실시양태", "특정한 실시양태", "관련 실시양태", "특정 실시양태", "추가의 실시양태" 또는 "추가 실시양태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 실시양태와 관련하여 기재된 특정한 양상, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시양태에 포함되는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸쳐 다양한 위치에서 상기 문구의 출현은 반드시 모두가 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니다. 더욱이, 특정한 특색, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시양태에서 모든 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
이하의 기재에서, 특정한 구체적 상세는 본 발명의 다양한 실시양태의 완전한 이해를 제공하기 위해서 기재되어 있다. 그러나, 본 기술분야의 기술자는 본 발명이 이들 상세 없이도 실행될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 본원에 기재된 구조 및 치환체의 다양한 조합으로부터 유도된 개개 벡터 또는 벡터 그룹은 마치 각각의 벡터 또는 벡터 그룹이 개별적으로 기재된 것과 동일한 정도로 본원에 의해 기재되어 있는 것으로 이해해야 한다. 따라서, 특정한 벡터 구조 또는 특정한 치환체의 선택은 본 발명의 범주 내에 포함된다.
C. 바이러스 벡터
레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터를 시험하여, 목적 유전자의 광범한 표적 세포의 게놈 내로의 안정한 도입을 위한 적합한 전달 비히클인 것으로 밝혀졌다. 본 발명은, 부분적으로, 하나 이상의 유전자를 세포에 전달하고 세포 내에서 당해 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 발현을 증가시키며 당해 벡터를 포함하는 특정 모집단 또는 세포 계통을 증가 또는 확장시키기 위해 이용될 수 있는 유전자 치료 벡터를 의도한다. 이러한 방식에서, 본 발명의 벡터는, 세포에서 폴리펩티드 발현을 동시에 증가시키지 않고 당해 벡터를 포함하는 특이적 세포 계통을 증가시키지 않는 종래의 벡터와 비교하여, 다수의 치료학적, 예방학적 및 개선적 이점을 제공한다.
본 발명은 추가로, 본 발명의 방법을 실행하기 위해서 이용될 수 있는 전이 벡터를 제공한다. 숙련된 기술자는 이러한 전이 벡터가 각종 상이한 바이러스 벡터를 이용하여 생산될 수 있음을 인지할 것이고, 특정한 실시양태에서 전이 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인데, 이는 부분적으로 렌티바이러스 벡터가 시험관내 및 생체내 모두에서 이식유전자의 비-분화 세포 내로의 효율적 전달, 통합 및 장기간 발현을 제공할 수 있기 때문이다. 다양한 렌티바이러스 벡터는 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Naldini et al.,(1996a, 1996b, 및 1998); Zufferey et al.,(1997); Dull et al., 1998, 미국 특허 제6,013,516; 및 5,994,136호; 이들 중의 어떤 것이라도 본 발명의 전이 벡터의 생산에 적당할 수 있다]. 일반적으로, 이들 벡터는 플라스미드-기반 또는 바이러스-기반이고, 치료학적 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 숙주 세포 내로 전이시키는데 필수적인 서열을 운반하도록 배열된다.
추가의 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 HIV 벡터이다. 따라서, 벡터는 인간 면역결핍-1(HIV-1), 인간 면역결핍-2(HIV-2), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 소 면역결핍 바이러스(BIV), 젬브라나병(Jembrana Disease) 바이러스(JDV), 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV), 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV) 등으로부터 유래될 수 있다. HIV 기반 벡터 골격(즉, HIV 시스-작용 서열 요소 및 HIV gag, pol 및 rev 유전자)은 일반적으로, HIV-기반 작제물이 인간 세포의 형질도입시에 가장 효율적이라는 점에서 본 발명의 대부분의 양상과 관련하여 바람직하다.
특정 예시적 실시양태는 조혈 장애, 예를 들면, 이상헤모글로빈증을 수정하는데 이용되는 벡터, 조성물 및 방법의 보다 상세한 기재를 포함하지만, 본 발명은 본 개시에 의해 제한되는 것으로 간주되어서는 않된다. 당해 기술분야의 기술자는 본원에서 설명된 원리가 다른 시스템, 예를 들면, 눈, 중추 신경계 및 말초 신경계를 포함하는 신경계; 순환계; 근육계; 골격계; 피부, 심장, 폐, 췌장, 간, 신장, 소장 등을 포함하는 기관에서 유전자 치료에 적용될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다.
한 가지 실시양태에서, 본 발명은 특정 세포 유형 또는 세포 계통에서 목적 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 발현 조절 서열, 및 절단된 에리트로포이에틴 수용체에 작동적으로 연결된 또 다른 발현 조절 서열을 포함하는 벡터, 예를 들면, 렌티바이러스 벡터를 제공한다. 어떠한 특정 이론에 구속되는 것을 원하지 않지만, 본 발명은, 부분적으로, 적합한 EpoR 작용제의 존재하에 절단된 에리트로포이에틴 수용체에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열이 절단된 에리트로포이에틴 수용체를 발현하는 세포에서 확장 또는 증가를 가능하게 한다는 것을 의도한다. 또한, 세포 유형 또는 세포 계통 발현 조절 서열의 이용은 폴리뉴클레오티드 발현을 단일 계통에서 세포 분화의 목적하는 단계로 제한함에 있어서 안전성 이점을 제공하고, 따라서 본 발명의 벡터는 바람직하지 않은 세포 유형에서 폴리펩티드의 이소성 발현을 취급하는 문제를 경감시킨다.
한 가지 실시양태에서, 치료학적 유전자 또는 폭적하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열은 절단된 에리트로포이에틴 수용체에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열과 동일한 세포 유형 또는 세포 계통에서 발현을 유도하는 동일한 발현 조절 서열 또는 발현 조절 서열일 필요는 없다. 또 다른 실시양태에서, 치료학적 유전자 또는 목적 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열은 절단된 에리트로포이에틴 수용체에 작동적으로 연결된 상이한 발현 조절 서열과 동일한 세포 유형 또는 세포 계통에서 발현을 유도한다. 추가 실시양태에서, 치료학적 유전자 또는 목적 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열은 절단된 에리트로포이에틴 수용체에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열과 동일한 세포 유형 또는 세포 계통에서 발현을 유도한다.
하나의 비제한적 예에서, 에리트로포이에틴 수용체의 편재성 발현은 발현되는 세포, 즉 모든 세포의 확장 또는 증가를 가능하게 할 것이다. 절단된 에리트로포이에틴 수용체의 편재성 발현을 지시하는 편재성 발현 조절 서열에는, 이로써 제한되지 않지만, 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 유전자 프로모터(CMV), 신장 인자 1 알파 프로모터(EF1-α), 포스포글리세레이트 키나제-1 프로모터(PGK), 유비퀴틴-C 프로모터(UBQ-C), 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 프로모터(CAG), 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제 프로모터(MC1), 베타 액틴 프로모터(β-ACT) 및 유인원 바이러스 40 프로모터(SV40)이 포함된다.
다른 비제한적 예에서, 에리트로포이에틴 수용체의 조건적 발현은 조건적으로 발현되는 세포의 확장 또는 증가를 가능하게 한다.
또 다른 비제한적 예에서, 절단된 에리트로포이에틴 수용체의 줄기 세포 특이적 발현은 발현되는 줄기 세포(줄기 세포에서 유래된 모든 세포 계통), 예를 들면, 조혈 줄기 세포의 확장 또는 증가를 가능하게 할 것이다. 절단된 에리트로포이에틴 수용체의 줄기 세포 특이적 발현을 지시하는 예시적 줄기 세포 특이적 발현 조절 서열에는, 이로써 제한되지 않지만, 배아 줄기 세포 프로모터, 신경 줄기 세포 프로모터, 중간엽 줄기 세포 프로모터, 간 줄기 세포 프로모터, 췌장 줄기 세포 프로모터, 심장 줄기 세포 프로모터, 신장 줄기 세포 프로모터 및 조혈 줄기 세포 프로모터가 포함된다.
또 다른 비제한적 예에서, 절단된 에리트로포이에틴 수용체의 세포 유형 또는 세포 계통 특이적 발현은, 또 다른 세포 유형 또는 세포 계통, 예를 들면, 비-표적 세포 유형 또는 세포 계통과 비교하여, 발현되는 특정 세포 유형 또는 세포 계통, 예를 들면, 표적 세포 유형 또는 세포 계통의 확장 또는 증가를 가능하게 할 것이다. 절단된 에리트로포이에틴 수용체의 발현을 지시하는 예시적 세포 유형 또는 세포 계통 특이적 발현 조절 서열에는, 이로써 제한되지 않지만, 조혈 줄기 세포 프로모터, 조혈 전구 세포 프로모터, 골수 세포 프로모터, 림프구 세포 프로모터, 혈소판 계통 프로모터, 비만 세포 프로모터, 적혈구신생 계통 프로모터, 과립구 계통 프로모터 및 단핵구 계통 프로모터가 포함된다.
예시적 표적 세포 계통은 조혈 세포 계통, 골수양 계통, 림프구 계통, 혈소판 계통, 적혈구 계통, 과립구 계통 프로모터 및 단핵구 계통을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 표적 세포 계통은 적혈구 세포 계통이다.
예시적 표적 세포 유형은 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 골수 전구 세포, 림프구 전구 세포, 혈소판 전구 세포, 적혈구 전구 세포, 과립구 전구 세포, 단핵구 전구 세포, 거핵아구, 전골수거핵구, 거핵구, 전구/혈소판, 전적아구, 호염기성 적아구, 다색성 적아구, 오르토크로마틱 적아구, 다색성 적혈구, 적혈구(RBC), 호염기성 전골수구, 호염기성 골수구, 호염기성 후골수구, 호염기구, 호중구 전골수구, 호중구 골수구, 호중구 후골수구, 호중구, 호산성 전골수구, 호산성 골수구, 대식세포, 수지상 세포, 림프아구, 전림프구, 천연 킬러(NK)-세포, 소형 림프구, T-림프구, B-림프구, 혈장 세포 및 림프계 수지상 세포를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 표적 세포 유형은 하나 이상의 적혈구 세포, 예를 들면, 전적아구, 호염기성 적아구, 다tor성 적아구, 오르토크로마틱 적아구, 다색성 적혈구 및 적혈구(RBC)이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 하나 이상 또는 모든 조혈 세포에서 목적 유전자의 발현을 증가시키고 하나 이상의 세포 유형, 예를 들면, 조혈 줄기 세포의 수를 증폭 또는 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 한 가지 실시양태에서, 당해 벡터는 목적 유전자에 작동적으로 연결된 조혈 세포 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서, 및 절단된 에리트로포이에틴 수용체(tEpoR)에 작동적으로 연결된 편재 조건적, 또는 세포 유형 또는 세포 계통 특이적 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 당해 벡터는 하나 이상의 레트로바이러스 LTR, 목적 유전자에 작동적으로 연결된 조혈 세포 발현 조절 서열, 및 절단된 에리트로포이에틴 수용체(tEpoR)에 작동적으로 연결된 편재성, 조건적, 또는 세포 계통 특이적 발현 조절 서열을 포함한다.
적합한 세포 유형 또는 세포 계통 특이적 발현 조절 서열에는, 이로써 제한되지 않지만, 조혈 세포 발현 조절 서열, 예를 들면, 조혈 줄기 세포 프로모터 및 조혈 전구 세포 프로모터가 포함된다. 목적 유전자 및/또는 tEpoR의 발현이 하나 이상의 적혈구 세포에서 요구되는 실시양태에서, 적합한 조혈 세포 발현 조절 서열에는, 이로써 제한되지 않지만, 적혈구 세포 특이적 프로모터 및 임의로 적혈구 세포 특이적 인핸서, 인간 β-글로빈 프로모터, 인간 β-글로빈 LCR, 또는 인간 α-글로빈 HS40 인핸서 및 안키린-1 프로모터가 포함된다.
세포 유형 또는 세포 계통 발현 조절 서열의 이용은 단일 계통에서 세포 분화의 목적하는 단계로 폴리뉴클레오티드의 발현을 제한함에 있어서 안전성 이점을 제공하고, 따라서 본 발명의 벡터는 바람직하지 않은 세포 유형에서 폴리펩티드의 이소성 발현을 취급하는 문제를 완화시킨다. 한 가지 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 LTR, 목적 유전자에 작동적으로 연결된 제1 적혈구 특이적 발현 조절 서열, 및 tEpoR에 작동적으로 연결된 제2 적혈구 특이적 발현 조절 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 제1 및 제2 적혈구 발현 조절 서열은 인간 β-글로빈 프로모터, 인간 β-글로빈 LCR, 및 인간 α-글로빈 HS40 인핸서 및 안키린-1 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 벡터의 설계는, 특정 조혈 질환, 장애 또는 상태를 치료, 예방 또는 완화시킬 목적으로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 본 발명은, 인간 α-글로빈, 인간 β-글로빈, 인간 δ-글로빈 및 인간 γ-글로빈 또는 이의 생물학적 변이체 또는 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 목적 유전자를 포함하는 이상헤모글로빈증의 유전자 치료를 위한 벡터를 의도한다. 한 가지 실시양태에서, 글로빈 유전자는 야생형 인간 β-글로빈 유전자, 인트론 서열의 하나 이상의 결실을 포함하는 결실된 인간 β-글로빈 유전자, 및 적어도 하나의 항겸상 아미노산 잔기를 인코딩하는 돌연변이된 인간 β-글로빈 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 치료되는 상태가 겸상 세포 이상헤모글로빈증인 경우, 목적 유전자는 항겸상 단백질일 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, "항겸상 단백질"은 겸상 세포 상태에서 적혈구의 겸상을 유도하는 병적 이벤트를 방지 또는 반전시키는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명의 한 가지 실시양태에서, 본 발명의 형질도입된 세포는 이상헤모글로빈증 상태를 갖는 대상체에게 항겸상 단백질을 전달하기 위해 이용된다. 항겸상 단백질은 또한 항겸상 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이된 β-글로빈 유전자를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 한 가지 이러한 글로빈 변이체는 코돈 87에서 트레오닌이 글루타민으로 돌연변이 된 것을 인코딩하는 인간 βA-글로빈 유전자((βA -T87Q)), 또는 인간 βA-글로빈 유전자이다. 기타 항겸상 아미노산 잔기는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명에서 유용할 수 있다(참조: 미국 특허 제6,051,402호; 미국 특허 제5,861,488호; 미국 특허 제6,670,323호; 미국 특허 제5,864,029호; 미국 특허 제5,877,288호; 및 문헌[참조: Levasseur et al., Blood 102:4312-4319(2003)]; 이들은 본원에서 참조로서 도입됨).
특정 실시양태에서, 적혈구 특이적 발현 조절 서열을 포함하는 벡터는 이상헤모글로빈증을 초과하여 연장하는 광범위한 질환을 치료, 예방 또는 개선하는데 이용된다. 적혈구 전구체는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 순환으로 분비되어 전신적으로 전달될 수 있는 유용한 세포 모집단이다. 이러한 생체내 단백질 전달의 예는 인간 인자 IX, 혈우병 B를 갖는 환자에서 누락되는 응고 인자이다[참조: A. H. Chang, et al., Molecular Therapy (2008), 이는 본원에서 참조로서 도입됨].
한 가지 실시양태에서, 본 발명의 벡터로 형질도입된 세포는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 단백질의 분비를 위한 "공장"으로 이용될 수 있다. 예를 들면, 적혈구 세포 특이적 발현 조절 서열을 포함하는 벡터는 HSC로부터 또는 배아 줄기 세포로부터 분화된 적혈구 세포로부터 단백질의 대규모 시험관내 생산에 이용될 수 있다.
이러한 방식으로 발현될 수 있는 목적 폴리뉴클레오티드에는, 이로써 제한되지 않지만, 아데노신 데아미나제, 리소좀 저장 질환에서 영향을 받은 효소, 아포지단백질 E, 뇌 유래 신경영양(neurotropihic) 인자(BDNF), 골형성 단백질 2(BMP-2 ), 골형성 단백질 6(BMP-6), 골형성 단백질 7(BMP-7), 카디오트로핀 1(CT-1), CD22, CD40, 모양체 신경영양 인자(CNTF), CCL1-CCL28, CXCL1-CXCL17, CXCL1, CXCL2, CX3CL1, 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF), 도파민, 에리트로포이에틴, 인자 IX, 인자 VIII, 상피 성장 인자(EGF), 에스트로겐, FAS-리간드, 섬유아세포 성장 인자 2(FGF-2), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF-2), 섬유아세포 성장 인자 4(FGF-2), 섬유아세포 성장 인자 5(FGF-5), 섬유아세포 성장 인자 6(FGF-6), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF-7), 섬유아세포 성장 인자 1(FGF-10), Flt-3, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 자극 인자(GM-CSF), 성장 호르몬, 간세포 성장 인자(HGF), 인터페론 알파(IFN-α), 인터페론 베타(IFN-β), 인터페론 감마(IFNg), 인슐린, 글루카곤, 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1), 인슐린 유사 성장 인자 2(IGF-2), 인터류킨 1(IL-1), 인터류킨 2(IL-2), 인터류킨 3(IL-3), 인터류킨 -4(IL-4), 인터류킨 5(IL-5), 인터류킨 6(IL-6), 인터류킨 7(IL-7), 인터류킨 8(IL-8), 인터류킨 9(IL-9), 인터류킨 10(IL-10), 인터류킨 11(IL-11), 인터류킨 12(IL-12), 인터류킨 13(IL-13), 인터류킨 15(IL-15), 인터류킨 17(IL-17), 인터류킨 19(IL-19), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1), 대식세포 염증 단백질 3a(MIP-3a), 대식세포 염증 단백질 3b(MIP-3b), 신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀 3(NT-3), 뉴로트로핀 4(NT-4), 부갑상선 호르몬, 혈소판 유래 성장 인자 AA(PDGF-AA), 혈소판 유래 성장 인자 AB(PDGF-AB), 혈소판 유래 성장 인자 BB(PDGF-BB), 혈소판 성장 인자 CC(PDGF-CC), 혈소판 유래 성장 인자 DD(PDGF-DD), RANTES, 줄기 세포 인자(SCF), 간질 세포 유래 인자 1(SDF-1), 테스토스테론, 형질전환 성장 인자 알파(TGF-a), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-b), 종양 괴사 인자 알파(TNF-a), Wnt1, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b, Wnt8c, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt14, Wnt15, 또는 Wnt16, 소닉 헤지호그(Sonic hedgehog), 데저트 헤지호그(Desert hedgehog) 및 인도 헤지호그(Indian hedgehog)가 포함된다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 절단된 에리트로포이에틴 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는, 내인성 에리트로포이에틴 수용체(EpoR)과 비교하여 tEpoR의 대사회전을 감소시키고, 내인성 에리트로포이에틴 수용체(EpoR)과 비교하여 tEpoR의 반감기를 증가시키고/시키거나, 미토겐 활성화된 시그날전달 경로의 기간을 증가시키는, C-말단 절단을 갖는 tEpoR, 예를 들면, MAPK, JAK/STAT, PI3K, AKT, RAS를 포함한다. 따라서, EpoR 작용제의 결합시에 tEpoR은 EpoR 발현 세포 또는 어떠한 EpoR을 발현하지 않는 세포와 비교하여 세포 증식 또는 세포의 확장을 증가시키는 미토겐 경로의 활성화를 유도한다. 어떠한 특정 이론에 구속되는 것을 원하지 않지만, EpoR에 대한 EEpoR 작용제, 예를 들면, 에리트로포이에틴(EPO)의 결합은 2개 수용체 아단위의 이량체화 및 관련된 야누스 키나제(Jak)2의 후속적 활성화를 유도하는 것으로 생각된다[참조: Witthuhn et al., 1993]. 이는 EpoR 중의 몇몇 티로신 잔기의 포스포릴화 및 SH2 함유 단백질의 점증을 유도하고, 이는 시그날 형질도입 경로의 몇몇 캐스케이드의 활성화, 특히 Ras/세포외 시그날-조절된 키나제(Erk)/미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK)(Torti et al., 1992) 경로 및 포스파티딜이노시톨 3 키나제/Akt 키나제 경로(Damen et al., 1995)의 활성화를 가져온다. Jak2는 또한 전사 (Stat)5 및 Stat3(Kirito et al., 1997)의 시그날 트랜스듀서 및 활성화인자를 포스포릴화시키고, 이어서 전사 인자로서 작용하고 EpoR 미토겐 효과를 매개하기 위해 핵으로 전위시킨다.
어떠한 특정 이론에 구속되는 것을 원하지 않지만, 본 발명은 세포에서 절단된 에리트로포이에틴 수용체의 발현이 전장 에리트로포이에틴 수용체를 발현하거나 에리트로포이에틴을 전혀 발현하지 않는 세포와 비교하여 증식 이점을 제공하는 것을 의도한다. tEpoR 폴리펩티드는 전장 EpoR보다 더욱 효율적으로 세포 표면으로 수송된다. 더욱이, 본 발명의 tEpoR 폴리펩티드는 C-말단에서 하나 이상의 보존된 티로신(Tyr) 포스포릴화 부위 및/또는 단백질 결합 부위를 결여한다. tEpoR의 한 가지 결과는 tTpoR이 미토겐 경로를 활성화시킬 수 있지만, EpoR의 발현을 통상 신속하게 탈포스포릴화하고 하향 조절하는 포스파타제를 효율적으로 점등시킬 수 없다는 것이다. 이 결과는 정상 EpoR과 비교하여 tEpoR을 통한 세포내 시그날 전달을 증가시키고, 세포 증식 또는 확장을 증가시키는 미토겐 활성화된 경로의 활성화를 증가시킨다.
대표적인 전장 EpoR의 아미노산 서열은 서열번호 19, 22, 25, 28, 31 및 34에 기재되어 있다. 절단된 EpoR은 당해 기술분야에 공지된 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 특히 절단된 EpoR은, 정지 코돈을 C-말단 Tyr 잔기에 또는 잔기 부근에 삽입하고, 따라서 절단된 EpoR의 생성 과정에서 Tyr 잔기를 제거 또는 돌연변이시킴으로써 제조될 수 있다.
예시적 인간 tEpoR 수용체는 C-말단 Tyr 잔기의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산 내에서 잔기에 또는 부근에 정지 코돈을 도입한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예시적 C-말단 Tyr 잔기는 서열번호 22에 기재된 바와 같은 Tyr(Y) 344, 402, 430, 432, 444, 461, 465 및 480을 포함한다(서열번호 22는 서열번호 19에 기재된 전장 인간 EpoR의 소수성 리더 서열을 구성하는 최초 24개 아미노산을 결여하고 있음에 주의한다).
예시적 쥐 tEpoR 수용체는 C-말단 Tyr 잔기의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산 내에서 잔기에 또는 부근에 정지 코돈을 도입한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예시적 C-말단 Tyr 잔기는 서열번호 28에 기재된 바와 같은 Tyr(Y) 343, 401, 429, 431, 442, 460, 464 및 479을 포함한다(서열번호 28은 서열번호 25에 기재된 전장 쥐 EpoR의 소수성 리더 서열을 구성하는 최초 24개 아미노산을 결여하고 있음에 주의한다).
예시적 랫트 tEpoR 수용체는 C-말단 Tyr 잔기의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산 내에서 잔기에 또는 잔기 부근에 정지 코돈을 도입한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예시적 C-말단 Tyr 잔기는 서열번호 34에 기재된 바와 같은 Tyr(Y) 343, 401, 429, 431, 442, 460, 464 및 479을 포함한다(서열번호 34는 서열번호 31에 기재된 전장 랫트 EpoR의 소수성 리더 서열을 구성하는 최초 24개 아미노산을 결여하고 있음에 주의한다).
생물학적 활성 절단된 EpoR의 특정 예로는, 이로써 제한되지 않지만, 서열번호 19, 22, 25, 28, 31 및 34에 기재된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 335, 1 내지 336, 1 내지 337, 1 내지 338, 1 내지 339, 1 내지 340, 1 내지 341, 1 내지 342, 1 내지 343, 1 내지 344, 1 내지 345, 1 내지 346, 1 내지 347, 1 내지 348, 1 내지 349, 1 내지 350, 1 내지 351, 1 내지 352, 1 내지 353, 1 내지 354, 1 내지 355, 1 내지 356, 1 내지 357, 1 내지 358, 1 내지 359, 1 내지 360, 1 내지 361, 1 내지 362, 1 내지 363, 1 내지 364, 1 내지 365, 1 내지 366, 1 내지 367, 1 내지 368, 1 내지 369, 1 내지 370, 1 내지 371, 1 내지 372, 1 내지 373, 1 내지 374, 1 내지 375, 1 내지 376, 1 내지 377, 1 내지 378, 1 내지 379, 1 내지 380, 1 내지 381, 1 내지 382, 1 내지 383, 1 내지 384, 1 내지 385, 1 내지 386, 1 내지 387, 1 내지 388, 1 내지 389, 1 내지 390, 1 내지 391, 1 내지 392, 1 내지 393, 1 내지 394, 1 내지 395, 1 내지 396, 1 내지 397, 1 내지 398, 1 내지 399, 1 내지 400, 1 내지 401, 1 내지 402, 1 내지 403, 1 내지 404, 1 내지 405, 1 내지 406, 1 내지 407, 1 내지 408, 1 내지 409, 1 내지 410, 1 내지 411, 1 내지 412, 1 내지 413, 1 내지 414, 1 내지 415, 1 내지 416, 1 내지 417, 1 내지 418, 1 내지 419, 1 내지 420, 1 내지 421, 1 내지 422, 1 내지 423, 1 내지 424, 1 내지 425, 1 내지 526, 1 내지 427, 1 내지 428, 1 내지 429, 1 내지 430, 1 내지 431, 1 내지 432, 1 내지 433, 1 내지 434, 1 내지 435, 1 내지 436, 1 내지 437, 1 내지 438, 1 내지 439, 1 내지 440, 1 내지 441, 1 내지 442, 1 내지 443, 1 내지 444, 1 내지 445, 1 내지 446, 1 내지 447, 1 내지 448, 1 내지 449, 1 내지 450, 1 내지 451, 1 내지 452, 1 내지 453, 1 내지 454, 1 내지 455, 1 내지 456, 1 내지 457, 1 내지 458, 1 내지 459, 1 내지 460, 1 내지 461, 1 내지 462, 1 내지 463, 1 내지 464, 1 내지 465, 1 내지 466, 1 내지 467, 1 내지 468, 1 내지 469, 1 내지 470, 1 내지 471, 1 내지 472, 1 내지 473, 1 내지 474, 1 내지 475, 1 내지 476, 1 내지 477, 1 내지 478, 1 내지 479, 1 내지 480, 1 내지 481, 1 내지 482, 1 내지 483, 1 내지 484, 1 내지 485, 1 내지 486, 1 내지 487, 1 내지 488, 1 내지 489, 1 내지 490, 1 내지 491, 1 내지 492, 1 내지 493, 1 내지 494, 1 내지 495, 1 내지 496, 1 내지 497, 1 내지 498, 1 내지 499, 또는 1 내지 500, 또는 이의 변이체를 포함하거나 이들로 이루어진 C-말단 절단된 EpoR이 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 tEpoR 폴리펩티드는 세포 증식 또는 세포 확장을 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 가능하게 하는 전장 EpoR 폴리펩티드의 최소 활성 단편을 포함한다.
tEpoR 폴리펩티드 변이체의 구체적인 예로는, 예를 들면, 서열번호 22에 기재된 바와 같은 Tyr(Y) 344, 402, 430, 432, 444, 461, 465 및 480, 서열번호 28 또는 34에 기재된 바와 같은 Tyr (Y) 343, 401, 429, 431, 442, 460, 464 및 479로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-말단 Tyr 잔기에서 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 갖는 tRpoR 폴리펩티드를 포함한다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 벡터는 약 50 내지 약 60개 아미노산, 약 80 내지 약 90개 아미노산 또는 약 85 내지 약 95개 아미노산, 또는 약 55, 약 83 또는 약 91개 아미노산의 C-말단 절단을 포함하는 tEpoR을 포함한다.
한 가지 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 적어도 하나의 변형된 또는 비변형된 레트로바이러스 LTR, 예를 들면, 렌티바이러스 LTR, 목적 유전자에 작동적으로 연결된 β-글로빈 프로모터 및 β-글로빈 유전자좌 조절 영역(LCR), 절단된 에리트로포이에틴 수용체(tEpoR)에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함한다. LTR의 적합한 변형에는, 이로써 제한되지 않지만, 5' LTR의 이종 프로모터, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 티미딘 키나제 프로모터 또는 유인원 바이러스 40(SV40) 프로모터로의 치환; 및 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같은 3' LTR의 하나 이상의 변형, 부가 및/또는 결실이 포함된다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드의 적혈구 발현은 인간 β-글로빈 프로모터, 인간 β-글로빈 LCR로부터 하나 이상의 DNAase I 과민 부위 2, 3 및 4를 포함하는 β-글로빈 LCR, 및/또는 인간 β-글로빈 3' 인핸서 요소를 이용하여 달성된다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 ?이 Psi 팩키징 서열(Ψ+), 중앙 폴리퓨린관/DNA 피판(cPPT/FLAP), 레트로바이러스 엑스포트 요소, 전사후 조절 요소, 절연 요소, 폴리아데닐화 서열, 선택가능한 마커 및 세포 자살 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 요소를 포함한다.
한 가지 실시양태에서, 벡터는 좌측(5') 레트로바이러스 LTR, Psi 팩키징 서열(Ψ+), 중앙 폴리퓨린관/DNA 피판(cPPT/FLAP), 레트로바이러스 엑스포트 요소, β-글로빈 프로모터, β-글로빈 유전자좌 조절 영역(LCR) 및 임의로 목적 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 3' β-글로빈 인핸서, 절단된 에리트로포이에틴 수용체(tEpoR)에 작동적으로 연결된 적혈구 세포 특이적 발현 조절 서열, 및 하나 이상의 절연 요소 또는 폴리아데닐화 서열을 포함하는 우측(3') 레트로바이러스 LTR을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 좌측(5') HIV-1 LTR, Psi 팩키징 서열(Ψ+), HIV-1 중앙 폴리퓨린관/DNA 피판(cPPT/FLAP), rev 반응 요소(RRE), β-글로빈 프로모터, β-글로빈 유전자좌 조절 영역(LCR), 및 임의로 목적 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 3' β-글로빈 인핸서, 절단된 에리트로포이에틴 수용체(tEpoR)에 작동적으로 연결된 적혈구 세포 특이적 발현 조절 서열, 및 하나 이상의 절연 인자 및 토끼 β-글로빈 폴리A 서열(rβgpA)를 포함하는 우측(3') 레트로바이러스 LTR을 포함한다.
숙련된 기술자는 치료학적 이식유전자 또는 목적 유전자가 표적 세포 유형 또는 세포 계통에서 발현되고 tEpoR이 확장되는 동일한 및/또는 상이한 표적 세포 유형 또는 세포 계통에서 발현되도록 다수의 다른 상이한 실시양태가 본 발명의 기존의 실시양태로부터 형성될 수 있음을 인식할 것이다.
D. 조성물 및 제형
본 발명은 추가로, 본 발명에 기재된 방법에 따라 생산된 형질도입된 세포 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이 "약제학적으로 허용가능한 담체"는, 생물학적으로 서용되는 세포 배양 배지를 포함하여, 생리학적으로 혼화성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 한가지 실시양태에서, 담체를 포함하는 조성물은 정맥내, 복강내 또는 근육내 투여에 적합할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체에는 비경구 투여, 예를 들면, 혈관내(정맥내 또는 동맥내), 복강내 또는 근육내 투여에 적합하다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균 주이용 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 이용은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 임의의 종래의 매질 또는 작용제가 형질도입된 세포와 비혼화성인 경우를 제외하고, 본 발명의 약제학적 조성물에서 이의 이용이 의도된다.
본 발명의 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 양식과 조합하여 세포 또는 동물에게 투여하기 위한 약제학적으로 허용되거나 생리학적으로 허용가능한 용액 중에서 제형화된, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 형질도입된 세포 등을 포함할 수 있다. 또한, 필요한 경우에, 본 발명의 조성물은, 예를 들면, 사이토킨, 성장 인자, 호르몬, 소분자 또는 다양한 약제학적 활성 작용제와 같은 기타 작용제와 함께 투여될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 조성물 내에 또한 포함될 수 있는 기타 성분에 대해 실질적으로 제한은 없으며, 단 추가의 작용제는 의도된 유전자 치료를 전달하는 조성물의 능력에 악영향을 미치지 않아야 한다.
본 발명의 약제학적 조성물에서, 약제학적으로 허용가능한 부형제 및 담체 용액의 제형은, 예를 들면, 경구, 비경구, 정맥내, 비내 및 근육내 투여를 포함하는 다양한 치료 섭생 및 제형에서 본원에 기재된 특정한 조성물을 이용하기 위한 적합한 투약 및 치료 섭생의 개발과 마찬가지로 당해 기술분야에서 기술자에게 공지되어 있다.
특정의 상황에서, 본원에 기재된 조성물은, 예를 들면, 미국 특허 제5,543,158호; 미국 특허 제5,641,515로 및 미국 특허 제5,399,363호(이들은 각각 본원에서 구체적으로 이의 전체가 참고로 도입된다)에 기재된 바와 같이 비경구적으로, 정맥내로, 근육내로 또는 복강내로 전달하는 것이 바람직하다. 유리 염기 또는 약물학적으로 허용된 염으로서의 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로즈와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 물 중에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 중에서 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 저장 및 이용의 통상적인 조건하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다.
주이용으로 이용하기에 적합한 약제학적 형태에는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균 주이용 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다(미국 특허 제5,466,468호; 이는 이의 전체가 본원에서 구체적으로 참고로 도입된다). 모든 경우에, 형태는 멸균되어야 하며, 용이한 시린지 충전가능성이 존재할 정도로 유체여야 한다. 이것은 제조 및 저장의 조건하에서 안정하여야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해서 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및/또는 식물유를 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅을 이용하거나, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기를 유지시키거나, 계면활성제를 이용함으로써 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등에 의해 용이하게 될 수 있다. 대부분의 경우에, 등장화제, 예를 들면, 당류 또는 나트륨 클로라이드를 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주이용 조성물의 연장된 흡수는 조성물에서 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 이용함으로써 유도될 수 있다.
수용액으로 비경구 투여하기 위해, 예를 들면, 용액은 필요한 경우에 적합하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코즈로 등장성이 되도록 한다. 이들 특정한 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 발명을 고려하여 당해 기술분야에서 숙련된 기술자에게 공지될 것이다. 예를 들면, 1회 투약량을 1㎖의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고, 1000㎖의 대량피하주사(hypodermoclysis) 유체에 첨가하거나, 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다[참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000]. 투약량에서의 약간의 변화는 치료될 대상체의 상태에 따라 필연적으로 발생할 것이다. 투여에 책임이 있는 사람은, 임의의 경우에, 개개 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다. 더욱이, 인간 투여의 경우에, 제제는 생물학적 제제 기준의 FDA 사무국(FDA Office of Biologics standards)에 의해 요구되는 것으로서 멸균성, 발열성 및 일반적인 안전성 및 순도 기준을 충족하여야 한다.
멸균 주이용 용액은 필요한 양의 활성 화합물을 필요한 것으로서 상기 열거된 다양한 기타 성분들과 함께 적절한 용매에 혼입시키고, 이어서 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산액 매질 및 상기 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주이용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이의 사전 멸균-여과된 용액으로부터의 활성 성분과 임의의 추가 바람직한 성분의 분말을 수득하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
본원에 기재된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은, 예를 들면, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산에 의해 형성되는 산부가염(단백질의 유리 아미노 그룹에 의해 형성됨)을 포함한다. 유리 카복실 그룹에 의해 형성된 염은 또한, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 페릭 하이드록사이드와 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 제형화시, 용액은 투약 제형과 양립가능한 방식으로, 치료학적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 제형은 주이용 용액, 약물-방출 캅셀제 등과 같은 다양한 투약형으로 용이하게 투여된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항균 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 성분을 위한 이러한 매질 및 작용제의 이용은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 양립가능한 경우를 제외하고는, 치료학적 조성물에서의 이의 이용이 의도된다. 보충 활성 성분이 또한 조성물 내에 혼입될 수도 있다.
문구 "약제학적으로 허용가능한"은, 인간에게 투여하면, 알레르기 또는 유사한 부반응을 야기하지 않는 분자 본체 및 조성물을 지칭한다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 조성물의 제조는 당해 기술분야에서 잘 이해되고 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주이용으로 제조되고; 주사하기 전에 액체 중에서 용액 또는 현탁액용으로 적합한 고체 형태로 제조될 수도 있다. 제제는 또한 유화될 수도 있다.
특정의 실시양태에서, 조성물은 비내 스프레이, 흡입 및/또는 다른 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달될 수도 있다. 유전자, 폴리뉴클레오티드 및 펩티드 조성물을 비내 에어로졸 스프레이를 통해서 폐에 직접 전달하는 방법은, 예를 들면, 미국 특허 제5,756,353호 및 미국 특허 제5,804,212호(이들은 각각 이의 전체가 본원에서 구체적으로 참고로 도입된다)에 기재되어 있다. 마찬가지로, 비내 미립자 수지(Takenaga et al., 1998) 및 라이소포스파티딜-글리세롤 화합물(미국 특허 제5,725,871호; 이의 전체가 본원에서 구체적으로 참고로 도입된다)을 이용한 약물의 전달도 또한 약제학적 기술분야에서 잘 알려져 있다. 마찬가지로, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지 매트릭스 형태의 경점막 약물 전달은 미국 특허 제5,780,045호(이의 전체가 본원에서 구체적으로 참고로 도입된다)에 기술되어 있다.
특정의 실시양태에서, 전달은 본 발명의 조성물의 적합한 숙주 세포 내로의 도입을 위해서 리포좀, 나노캅셀, 미립자, 미소구, 지질 입자, 소포체(vesicles), 임의로 CPP 폴리펩티드와의 혼합 등을 이용함으로써 일어날 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 전달을 위해서 지질 입자, 리포좀, 소포체, 나노구(nanosphere), 나노입자 등에 캅셀화시켜 제형화될 수 있다. 제형 및 이러한 전달 비히클의 이용은 공지되어 있는 통상의 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 제형 및 조성물은, 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 양식과 함께, 세포 또는 동물에게 투여하기 위해 약제학적으로 허용되거나 생리학적으로 허용가능한 용액(예를 들면, 배양 배지) 중에서 제형화된, 본원에 기재된 바와 같은 다수의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 소분자의 조합으로 이루어진 하나 이상의 억제제 및/또는 활성화제를 포함할 수 있다. 또한, 필요한 경우에, 본 발명의 조성물은 역시, 예를 들면, 세포, 다른 단백질 또는 폴리펩티드 또는 다양한 약제학적 활성 작용제와 같은 기타 작용제와 함께 투여될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따르는 제형 또는 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 다수의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 소분자의 조합과 접촉된 세포를 포함한다.
특정의 관점에서, 본 발명은 레트로바이러스(예를 들면, 렌티바이러스) 벡터를 포함하는(단, 이들로 제한되지 않는다) 바이러스 벡터 시스템의 전달(즉, 바이러스-매개된 형질도입)에 적합한 제형 또는 조성물을 제공한다.
생체외 전달을 위한 예시적인 제제는 또한, 칼슘 포스페이트, 전기천공, 열 쇼크 및 다양한 리포좀 제형(즉, 지질-매개된 형질감염)와 같은 당해 기술분야에서 공지된 다양한 형질감염제의 이용을 포함할 수 있다. 이하에 더 상세하게 기재된 바와 같은 리포좀은 수성 유체의 분획을 포획하는 지질 이중층이다. DNA는 자발적으로 양이온성 리포좀의 외부 표면에 회합하고(이의 전하에 의해), 이들 리포좀은 세포막과 상호작용할 것이다.
특정의 관점에서, 본 발명은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체(첨가제) 및/또는 희석제(예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 세포 배양 배지)와 함께 제형화된, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 조성물을 제공한다.
본 발명의 특정한 실시양태는 약제학적 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000]에 기재된 것과 같은 다른 제형을 포함할 수 있다.
E. 유전자 치료 방법
레트로바이러스 벡터는 유전자 치료의 개선된 방법을 제공한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "유전자 치료"는 폴리뉴클레오티드를, 유전자를 회복, 수정 또는 변형시키는 세포 게놈 내로 도입시키고/시키거나 유전자를 발현시키는 것을 지칭한다. 다양한 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 단일유전자 질환, 장애 또는 상태, 또는 조혈계의 질환, 장애 또는 상태를 갖는 것으로 진단되거나 의심되는 대상체에게 치유적, 예방적 또는 개선적 이점을 제공하는 폴리펩티드를 인코딩하는 치료학적 이식유전자를 발현하는 조혈 발현 조절 서열을 포함한다. 또한, 본 발명의 벡터는 특정 모집단 또는 세포 계통, 예를 들면, 적혈구 세포를 증가 또는 확장시키기 위해, 세포에서 절단된 에리트로포이에틴 수용체를 발현하는 또 다른 발현 조절 서열을 포함한다. 바이러스는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 세포를 감염 및 형질도입시킬 수 있다. 생체외 및 시험관내 실시양태에서, 형질도입된 세포는 이어서 치료가 필요한 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 벡터 시스템, 바이러스 입자 및 형질도입된 세포를 대상체에서 단일유전자 질환, 장애 또는 상태, 또는 조혈 시스템의 질환, 장애 또는 상태, 예를 들면, 이상헤모글로빈증을 치료, 예방 및/또는 개선시키기 위해 이용할 수 있는 것으로 의도한다.
본원에 이용된 바와 같이, "조혈"은 줄기 세포로부터 전구 세포의 형성 뿐만 아니라 전구 세포로부터 혈액 세포의 형성 및 발달을 지칭한다. 혈액 세포에는, 이로써 제한되지 않지만, 적혈구, 적혈구 세포(RBC), 망상적혈구, 단핵구, 호중구, 거핵구, 호산구, 호염기구, B-세포, 대식세포, 과립구, 마스트 세포, 혈소판 및 백혈구가 포함된다.
본원에 이용된 바와 같이, 용어 "이상헤모글로빈증" 또는 "이상헤모글로빈 상태"는 혈액에서 이상 헤모글로빈 분자를 존재를 수반하는 임의의 질환을 포함한다. 이상헤모글로빈증의 예에는, 이로써 제한되지 않지만, 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상 세포 질환(SCD), 겸상 세포 빈혈 및 지중해빈혈이 포함된다. 또한, 이상 헤모글로빈의 조합이 혈액에 존재하는 이상헤모글로빈증(예를 들면, 겸상 세포/Hb-C 질환)도 포함된다.
용어 "겸상 세포 빈혈" 또는 "겸상 세포 질환"은 적혈구의 겸상으로부터 발생하는 임의의 증후성 빈혈 상태를 포함하는 것으로 본원에서 정의된다. 겸상 세포 질환의 증상은 빈혈; 통증; 및/또는 신부전, 망막증, 급성-흉부 증후군, 허혈, 지속발기 및 발작과 같은 기관 이상을 포함한다. 본원에 이용된 바와 같이, 용어 "겸상 세포 질환"은 특히 HbS에서 겸상 세포 치환에 대해 호모접합체인 대상체에서 겸상 세포 빈혈에 따르는 다양한 임상적 문제를 지칭한다. 겸상 세포 질환의 용어 이용에 의해 본원에서 지칭되는 체질 증상 중에는 성장과 발달의 지연, 특히 폐렴에 기인하여 중증 감염을 발달시키는 증가된 경향, 비장 기능의 현저한 손상, 박테리아 순환의 효과적 정화 방지, 비장 조직의 재발 경색 및 최종적 파괴가 포함된다. 또한, 용어 "겸상 세포 질환"에는 근골격 통증의 급성 에피소드이고, 이는 주로 요추, 복부, 대퇴골 골간부에 영향을 미치고 굴곡에 대한 메카니즘 및 중증도에 있어서 유사하다. 성인에 있어서, 이러한 공격은, 연간 평균 1회 정도 발작하여 5 내지 7일간 지속하는 고약한 공격으로 산재된, 수주부터 수개월까지 짧은 기간의 경도 또는 중등도의 발작으로서 통상 나타난다. 이러한 위기를 유발하는 것으로 공지된 이벤트 중에는 산중독, 산소결핍증 및 탈수가 있고, 이들 모두는 HbS의 세포내 중합화를 강화시킨다[참조: J. H. Jandl, Blood: Textbook of Hematology, 2nd Ed., Little, Brown and Company, Boston, 1996, pages 544-545]. 본원에 이용된 바와 같이, 용어 "지중해빈혈"은 헤모글로빈의 합성에 영향을 미치는 돌연변이에 기인하여 발생하는 유전적 빈혈을 포함한다. 따라서, 당해 용어는 중증 또는 β 지중해빈혈과 같은 지중해빈혈 상태, 종중성 지중해빈혈, 중간성 지중해빈혈, α-지중해빈혈, 예를 들면, 헤모글로빈 H 질환으로부터 발생하는 임의의 증후성 빈혈이 포함된다.
본원에 이용된 바와 같이, "지중해빈혈"은 헤모글로빈의 결함적 생산을 특징으로 하는 유전성 질환을 지칭한다. 지중해빈혈의 예는 α 및 β 지중해빈혈을 포함한다. β 지중해빈혈은 베타 글로빈 사슬 중의 돌연변이에 의해 유발되고, 메이저 또는 마이너 형태로 발생할 수 있다. 메이저 형태의 β 지중해빈혈에서, 소아는 출생시에 정상이지만, 인생의 첫해 동안에 빈혈을 발달시킨다. 경증 형태의 β 지중해빈혈은 작은 적혈구 세포를 생산하고, 지중해빈혈은 글로빈 사슬로부터 유전자 또는 유전자들의 결실에 의해 유발된다.
α 지중해빈혈은 통상 HBA1 및 HBA2 유전자를 수반하는 결실로부터 발생한다. 이들 유전자 둘 다는 α-글로빈을 인코딩하고, 이는 헤모글로빈의 성분(아단위)이다. 각각의 세포 게놈 내에는 HBA1 유전자의 2개 카피 및 HBA2 유전자의 2개 카피가 있다. 그 결과, α-글로빈 유전자를 생산하는 4개 대립유전자가 있다. 상이한 유형의 α 지중해빈혈은 이들 대립유전자의 일부 또는 전부의 소실로부터 발생한다. Hb 바트 증후군, 즉 가장 중증 형태의 α 지중해빈혈은 모든 4개 α-글로빈 대립유전자의 소실로부터 발생한다. HbH 질환은 4개 α-글로빈 대립유전자 중의 3개의 소실에 의해 유발된다. 이들 2개 상태에서, α-글로빈의 결핍은 세포가 정상 헤모글로빈을 만드는 것을 방지한다. 대신에, 세포는 헤모글로빈 바트(Hb Bart) 또는 헤모글로빈 H(HbH)로 불리우는 이상 형태의 헤모글로빈을 생산한다. 이들 이상 헤모글로빈 분자는 산소를 신체 조직에 효과적으로 운반할 수 없다. 정상 헤모글로빈에 대한 Hb 바트 또는 HbH의 치환은 빈혈, 및 α 지중해빈혈과 관련된 기타 심각한 건강 문제를 유발한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자 치료 방법은 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상 세포 질환(SCD), 겸상 세포 빈혈, 유전성 빈혈, 지중해빈혈, β-지중해빈혈, 종중성 지중해빈혈, 중간성 지중해빈혈, α-지중해빈혈 및 헤모글로빈 H 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 이상헤모글로빈증을 치료, 예방 또는 개선시키는데 이용된다.
다양한 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터는 생체내에서 유전자 치료가 필요한 대상체의 세포, 조직 또는 기관에 직접 주사함으로써 투여된다. 다양한 기타 실시양태에서, 세포는 시험관내 또는 생체외에서 본 발명의 벡터로 형질도입되고, 임의로 생체외에서 확장된다. 이어서, 형질도입된 세포는 유전자 치료가 필요한 대상체에게 투여된다.
본 발명의 유전자 치료 방법에서 형질도입 및 투여하기에 적합한 세포에는, 이로써 제한되지 않지만, 줄기 세포, 전구 세포 및 분화된 세포가 포함된다. 특정의 실시양태에서, 형질도입된 세포는 배아 줄기 세포, 골수 줄기 세포, 제대 줄기 세포, 태반 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 심장 줄기 세포, 신장 줄기 세포, 조혈 줄기 세포이다.
다양한 실시양태에서, 줄기 세포의 이용이 바람직한데, 이는 이들이 생체내에서 특정한 생물학적 위치에 투여하면 적절한 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖기 때문이다. 용어 "줄기 세포"는 (1) 장기간 자가-재생(self-renewal), 또는 원래 세포의 적어도 하나의 동일한 카피를 생성시키는 능력, (2) 단일 세포 수준에서 다수의 및 일부의 경우에는 단지 하나의 특수화된 세포 유형으로의 분화, 및 (3) 조직의 생체내 기능적 재생이 가능한 미분화된 세포인 세포를 지칭한다. 줄기 세포는 이들의 발육 잠재력에 따라 전능성(totipotent), 다능성(pluripotent), 다분화성(multipotent) 및 올리고(oligo)/단분화성(unipotent)으로 하위 분류된다. "자가-재생"은 변화되지 않은 딸 세포를 생산하고 특수화된 세포 유형(효력)을 생성시키는 독특한 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 자가-재생은 두 가지 방법으로 달성될 수 있다. 비대칭 세포 분열은 부모 세포와 동일한 하나의 딸 세포, 및 부모 세포와 상이하고 전구 또는 분화된 세포인 하나의 딸 세포를 생산한다. 비대칭 세포 분열은 세포의 수를 증가시키지 않는다. 대칭 세포 분열은 2개의 동일한 딸 세포를 생산한다. 세포의 "증식" 또는 "확장"은 대칭적으로 분열하는 세포를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "다능성"은 신체 또는 체세포(즉, 적절한 배아)의 모든 계통을 형성하는 세포의 능력을 의미한다. 예를 들면, 배아 줄기 세포는 3개의 배아층, 즉 외배엽, 중배엽 및 내배엽 각각으로부터의 세포를 형성할 수 있는 다능성 줄기 세포 유형이다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "다분화성"은 하나의 계통의 다수의 세포 유형을 형성시키는 성체 줄기 세포의 능력을 지칭한다. 예를 들면, 조혈 줄기 세포는 혈액 세포 계통의 모든 세포, 예를 들면, 림프양 및 골수양 세포를 형성시킬 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "전구" 또는 "전구 세포"는 자가-재생하고 보다 성숙한 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 전구 세포는 다능성 및 다분화성 줄기 세포와 비교하여 감소된 효능을 갖는다. 다수의 전구 세포는 단일 계통을 따라서 분화하지만, 매우 광범위한 증식능을 가질 수 있다.
조혈 줄기 세포(HSC)는 유기체의 수명에 걸쳐서 성숙한 혈액 세포의 전체 레퍼토리를 생성시킬 수 있는 수임된(committed) 조혈 전구 세포(HPC)를 야기한다. 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 골수양(예를 들면, 단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포) 및 림프양 계통(예를 들면, T-세포, B-세포, NK-세포), 및 당해 기술분야에서 공지된 기타 세포를 포함하는 유기체의 모든 혈액 세포 유형을 생성시키는 다분화성 줄기 세포를 지칭한다[참조: Fei, R., et al., 미국 특허 제5,635,387호; McGlave, et al., 미국 특허 제5,460,964호; Simmons, P., et al., 미국 특허 제5,677,136호; Tsukamoto, et al., 미국 특허 제5,750,397호; Schwartz, et al., 미국 특허 제5,759,793호; DiGuisto, et al., 미국 특허 제5,681,599호; Tsukamoto, et al., 미국 특허 제5,716,827호]. 치사적으로 방사선 조사된 동물 또는 인간에게 이식되는 경우에, 조혈 줄기 및 전구 세포는 적혈구, 호중구-대식세포, 거핵구 및 림프양 조혈 세포 풀(pool)을 재집단화할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 형질도입된 세포는 골수, 제대혈 또는 말초 순환으로부터 단리된 조혈 줄기 및/또는 전구 세포이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 형질도입된 세포는 골수, 제대혈 또는 말초 순환으로부터 분리된 조혈 줄기 세포이다.
HSB는 특정의 표현형 또는 유전자형 마커에 따라 동정될 수 있다. 예를 들면, HSC는 이들의 작은 크기, 계통(lin) 마커의 결여, 로다민 123(rhodamineDULL, 또는 롤로로 불리움) 또는 Hoechst 33342와 같은 생체 염료에 의한 낮은 염색(부 모집단), 및 이들의 표면 상에 다양한 항원성 마커의 존재에 의해 동정될 수 있고, 이들 다수는 분화 계열의 클러스터에 속한다(예를 들면, CD34, CD38, CD90, CD133, CD105, CD45, Ter119 및 c-키트, 줄기 세포 인자용 수용체). HSC는 계통 결정을 검출하는데 통상 이용되는 마커에 대해 주로 음성이고, 따라서 종종 Lin(-) 세포로 지칭된다.
한 가지 실시양태에서, 인간 HSC는 CD34+, CD59+, Thy1/CD90+, CD38lo /-, C-키트/CD117+ 및 Lin(-)로서 특징지을 수 있다. 그러나, 모든 줄기 세포가 이들 조합에 의해 포함되는 것은 아니며, 이는 특정한 HSC가 CD34-/CD38-이기 때문이다. 또한 몇몇 연구는 최초의 줄기 세포가 세포 표면 상에 c-키트를 결여하고 있음을 시사한다. 인간 HSC의 경우, CD133은 초기 마커를 나타낼 수 있고, CD34+ 및 CD34- HSC 둘 다는 CD133+인 것으로 밝혀졌다. CD34+ 및 Lin(-) 세포는 조혈 전구 세포를 또한 포함한다는 것이 당해 기술분야에 공지되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 조혈 체계는 SKAM 코드에 의해 결정된다. SLAM(시그날 전달 림프구 활성화 분자) 부류는 >10 분자의 그룹이고, 이의 유전자는 염색체 1(마우스) 상의 단일 유전자좌에 주로 협력하여 배치되고, 모두는 면역글로불린 유전자 상과의 서브세트에 속하고, 최초에 T-세포 자극에 연루되는 것으로 생각된다. 이러한 부류는 CD48, CD150, CD244 등이고, CD150은 기초 구성원이고, 따라서 또한 slamF1, 즉 SLAM 부류 구성원 1로 불리운다. 조혈 체계에 대한 표시 SLAM 코드는 조혈 줄기 세포(HSC) - CD150+CD48-CD244-; 다능성 전구 세포(MPP) - CD150-CD48-CD244+; 계통-제한된 전구 세포(LRP) - CD150-CD48+CD244+; 공통 골수 전구세포(CMP) - lin-SCA-1-c-kit+CD34+CD16/32mid; 과립구-대식세포 전구세포(GMP) - lin-SCA-1-c-kit+CD34+CD16/32hi; 및 거핵구-적혈구 전구세포(MEP) - lin-SCA-1-c-kit+CD34-CD16/32low이다.
마우스에서, 스탠포드 대학의 어빙 베이스만 그룹(Irving Weissman's group)은 1988년에 마우스 조혈 줄기 세포를 단리하는 최초였고, 또한 마우스 조혈 체계를 구별하는 마커를 작동시키는 최초였다. 조혈 체계를 위한 마커는 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC) - CD34-, SCA-1+, Thy1.1+/lo, C-kit+, lin-, CD135-, Slamf1/CD150+; 단기 조혈 줄기 세포(ST-HSC) - CD34+, SCA-1+, Thy1.1+/lo, C-kit+, lin-, CD135-, Slamf1/CD150+, Mac-1(CD11b)lo; 초기 다능성 전구세포 - (초기 MPP) - CD34+, SCA-1+ , Thy1.1-, C-kit+, lin-, CD135+, Slamf1/CD150-, Mac-1 (CD11b)lo, CD4lo; 및 후기 다능성 전구세포(후기 MPP) - CD34+, SCA-1+ , Thy1.1-, C-kit+, lin-, CD135high, Slamf1/CD150-, Mac-1(CD11b)lo, CD4lo이다.
한 가지 실시양태에서, 조혈 세포는 CD105+Sca1+ 세포이다.
본 발명의 세포는 자가유래/자가발생성("자가") 또는 비-자가유래성("비-자가", 예를 들면, 동종이계(allogeneic), 동계발생성(syngeneic) 또는 이종발생성(xenogeneic))일 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, "자가유래"는 동일한 대상체로부터의 세포를 나타낸다. 본원에서 이용된 바와 같이, "동종이계"는 비교하는 세포와 유전적으로 상이한 동일한 종의 세포를 나타낸다. 본원에서 이용된 바와 같이, "동계발생성"은 비교하는 세포와 유전적으로 동일한 상이한 대상체의 세포를 나타낸다. 본원에서 이용된 바와 같이, "이종발생성"은 비교하는 세포와 상이한 종의 세포를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 세포는 동종이계이다.
본원에서 이용된 바와 같이, "대상체"는 본원의 다른 곳에 기재된 유전자 치료 벡터, 세포-기본 치료제 및 방법에 의해 치료될 수 있는 단일유전자 질환, 장애 또는 상태의 증상을 나타내는 모든 동물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는, 본원의 다른 곳에 기재된 유전자 치료 벡터, 세포-기본 치료제 및 방법에 의해 치료될 수 있는, 조혈계의 질환, 장애 또는 상태의 증상, 예를 들면, 이상헤모글로빈증을 나타내는 임의의 동물을 포함한다. 적합한 대상체(예를 들면, 환자)에는 실험실 동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼 또는 기니아 피그), 농장 동물 및 가축 또는 애완동물(예를 들면, 고양이 또는 개)이 포함된다. 비-인간 영장류 및, 바람직하게는, 인간 환자가 포함된다. 전형적인 대상체에는 유전자 치료에 의해 변조될 수 있는 하나 이상의 생리학적 활성의 비정상적 양("정상" 또는 "건강한" 대상체보다 더 낮거나 높은 양)을 나타내는 동물을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"은 질환 또는 병리학적 상태의 증상 또는 병리학에 대한 모든 유익하거나 바람직한 효과를 포함하며, 치료될 질환 또는 상태의 하나 이상의 측정가능한 마커의 최소 감소도 포함할 수 있다. 치료는 임의로, 질환 또는 상태의 증상의 감소 또는 개선, 또는 질환 또는 상태의 진행의 지연을 포함할 수 있다. "치료"는 질환 또는 상태, 또는 이의 연관된 증상을 반드시 완전히 근절하거나 치유하는 것을 나타내는 것은 아니다.
본원에서 이용된 바와 같이, "예방하다", 및 "예방된", "예방하는" 등의 유사한 단어들은 질환 또는 상태의 출현 또는 재발의 가능성을 방지, 억제 또는 감소시키는 접근방법을 나타낸다. 또한, 이는 질환 또는 상태의 발현 또는 재발을 지연시키거나, 질환 또는 상태의 증상의 출현 또는 재발을 지연시키는 것을 나타낸다. 본원에서 이용된 바와 같이, "예방" 및 유사한 단어들은 또한 질환 또는 상태의 발현 또는 재발 전에 질환 또는 상태의 강도, 영향, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "양"은 임상적 결과를 포함하는 유익하거나 바람직한 예방적 또는 치료학적 결과를 달성하기 위한 바이러스 또는 형질도입된 치료학적 세포의 "효과적인 양" 또는 "유효량"을 지칭한다.
"예방적 유효량"은 바람직한 예방적 결과를 달성하는데 효과적인 바이러스 또는 형질도입된 치료학적 세포의 양을 지칭한다. 필수적이지 않지만, 전형적으로 예방적 용량은 질환의 초기 단계에서 또는 그 이전에 대상체에서 이용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료학적 유효량보다 적다.
바이러스 또는 형질도입된 치료학적 세포의 "치료학적 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 바람직한 반응을 유발하는 줄기 및 전구 세포의 능력과 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한, 바이러스 또는 형질도입된 치료학적 세포의 모든 독성 또는 유해한 효과가 치료학적으로 유익한 효과보다 중요하지 않은 것이다. 용어 "치료학적 유효량"은 대상체(예를 들면, 환자)를 "치료"하는데 효과적인 양을 포함한다.
한가지 실시양태에서, 본 발명은, 목적 유전자에 작동적으로 연결된 세포 유형 또는 세포 계통 특이적 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서, 및 편재 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서, 또는 tEpoR에 작동적으로 연결된 세포 유형 또는 세포 계통 특이적 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서를 포함하는 벡터, 또는 본원의 다른 곳에서 논의된 본 발명의 또 다른 적합한 벡터로 형질도입된 하나 이상의 세포를, 예를 들면, 비경구로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에게 형질도입된 세포를 제공하는 방법을 제공한다.
특정의 실시양태에서, 대상체에서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법이 제공된다. 당해 방법은 목적 유전자에 작동적으로 연결된 조혈 세포 특이적 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서, 및 편재 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서, 또는 tEpoR에 작동적으로 연결된 세포 유형 또는 세포 계통 특이적 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서를 포함하는 벡터, 또는 본원의 다른 곳에서 논의된 본 발명의 또 다른 적합한 벡터로 형질도입된 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 세포 모집단을 투여하는 것을 포함한다.
한 가지 실시양태에서, 본 발명은, 목적 유전자에 작동적으로 연결된 조혈 세포 특이적 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서, 및 편재 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서, 또는 tEpoR에 작동적으로 연결된 세포 유형 또는 세포 계통 특이적 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서를 포함하는 벡터, 또는 본원의 다른 곳에서 논의된 또 다른 적합한 벡터로 형질도입된 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 세포 모집단을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 적혈구 세포 수를 선택적으로 확장시키는 방법을 제공하고, 여기서 조혈 줄기 세포의 적혈구 자손 세포의 수는 대상체에서 확장된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 백혈구 세포 또는 백혈구와 비교하여 적혈구 세포 또는 적혈구의 비율을 증가시키는 방법을 제공한다. 당해 방법은, 목적 유전자에 작동적으로 연결된 조혈 세포 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서, 및 편재 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서, 또는 tEpoR에 작동적으로 연결된 세포 유형 또는 세포 계통 특이적 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서를 포함하는 벡터, 또는 본원의 다른 곳에서 논의된 본 발명의 또 다른 적합한 벡터로 형질도입된 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 세포 모집단을 투여하는 것을 포함하고, 여기서, 조혈 줄기 세포의 적혈구 자손 세포의 비율은 대상체에서 조혈 줄기 세포의 백혈구 자손 세포와 비교하여 증가된다.
특정한 실시양태에서, 대상체에는 EPO가 투여되지 않고, 절단된 EpoR에 의해 매개된 세포 확장의 효능은 대상체에서 내인성 EPO 생산에 기인한다. 어떠한 특정 이론에 구속되는 것을 원하지 않지만, 본 발명은, 부분적으로, 지중해빈혈과 같은 이상헤모글로빈증을 앓고 있는 특정 대상체가 정상 대상체와 비교하여 혈장 EPO의 구성적으로 높은 수준, 예를 들면, 약 15배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배 또는 그 이상을 갖는 것을 의도한다. 따라서, 충분히 높은 수준의 EPO는 tEpoR을 발현하지 않고/않거나 내인성 EpoR을 발현하는 세포와 비교하여 tEpoR을 발현하는 세포의 수를 약 5배, 약 10배, 약 25배, 약 50배, 약 75배, 약 100배, 약 150배, 약 200배 또는 약 250배 또는 그 이상 증가 또는 확장시킨다. 또 다른 실시양태에서, 충분히 높은 수준의 EPO는 tEpoR을 발현하지 않고/않거나 내인성 EpoR을 발현하는 세포와 비교하여 tEpoR을 발현하는 세포의 수를 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 75배, 적어도 100배, 적어도 150배, 적어도 200배 또는 적어도 250배 또는 그 이상 증가 또는 확장시킨다.
특정한 실시양태에서, 대상체에는 또한 형질도입된 세포의 투여 전에, 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 EpoR 작용제, 예를 들면, EPO가 투여된다. 본원에 이용된 바와 같이, 용어 "에리트로포이에틴" 또는 "EPO"는 신장에서 생산된 당단백질을 지칭하고, 이는 적혈구 세포 생산(적혈구생성)의 자극에 관여하는 주요 호르몬이다. EPO는 골수에서 신탁된 적혈구 전구세포의 분열 및 분화를 자극한다. 정상 혈장 에리트로포이에틴 수준은 0.01 내지 0.03 단위/mL 범위이고, 저산소증 또는 빈혈 중에 100 내지 1000배까지 증가할 수 있다[참조: Graber and Krantz, Ann. Rev. Med. 29:51 (1978); Eschbach and Adamson, Kidney Intl. 28:1 (1985)]. 재조합 인간 에리트로포이에틴(rHuEpo 또는 에포이에틴 알파)는 EPOGENR(에포이에틴 알파, 재조합 인간 에리트로포이에틴)(Amgen Inc., Thousand Oaks, Calif.) 및 PROCRITR(에포이에틴 알파, 재조합 인간 에리트로포이에틴)(Ortho Biotech Inc., Raritan, N.J.)으로 상업적으로 시판되고 있다.
바람직한 실시양태에서, 대상체에는 EPO가 투여된다.
예시적 실시양태에서, 대상체에게 형질도입된 세포의 투여 후에, 대상체에는 치료 기간 동안 EPO가 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 마다, 매주, 격주, 매월, 격월, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 마다 또는 시간의 임의의 개재 빈도 마다 투여된다. 특정한 예시적 실시양태에서, 대상체에게 투여된 EPO의 용량은, 제한 없이, 약 100 내지 약 50000 단위(IU; 국제 단위)/주, 약 200 내지 약 40000 IU/주, 약 500 내지 약 30000 IU/주, 약 1000 내지 약 40000 IU/주, 약 1000 내지 약 30000 IU/주, 약 1000 내지 약 20000 IU/주, 약 5000 내지 약 40000 IU/주, 약 5000 내지 약 30000 IU/주, 약 5000 내지 약 20000 IU/주, 약 10000 내지 약 40000 IU/주, 약 10000 내지 약 30000 IU/주, 약 10000 내지 약 20000 IU/주, 또는 임의의 개재 범위의 IU/주이다.
특정한 예시적 실시양태에서, 대상체에게 투여된 EPO의 용량은, 제한 없이, 적어도 약 100 단위/주, 적어도 약 200 단위/주, 적어도 약 500 단위/주, 적어도 약 1000 단위/주, 적어도 약 5000 단위/주, 적어도 약 10000 단위/주, 적어도 약 20000 단위/주, 적어도 약 30000 단위/주, 적어도 약 40000 단위/주, 적어도 약 50000 단위/주, 또는 임의의 개재 범위의 IU/주이다.
특정한 예시적 실시양태에서, 대상체에게 투여된 EPO의 용량은, 제한 없이, 약 1 내지 약 500 IU/체중 kg/주, 약 10 내지 약 500 IU/체중 kg/주, 약 25 내지 약 500 IU/체중 kg/주, 약 50 내지 약 500 IU/체중 kg/주, 약 100 내지 약 500 IU/체중 kg/주, 약 100 내지 약 250 IU/체중 kg/주, 약 250 내지 약 500 IU/체중 kg/주, 또는 임의의 개재 범위의 IU/체중 kg/주이다.
특정한 예시적 실시양태에서, 대상체에게 투여된 EPO의 용량은, 제한 없이, 적어도 약 1 IU/체중 kg/주, 적어도 약 10 IU/체중 kg/주, 적어도 약 25 IU/체중 kg/주, 적어도 약 50 IU/체중 kg/주, 적어도 약 75 IU/체중 kg/주, 적어도 약 100 IU/체중 kg/주, 적어도 약 200 IU/체중 kg/주, 적어도 약 250 IU/체중 kg/주, 적어도 약 300 IU/체중 kg/주, 적어도 약 350 IU/체중 kg/주, 적어도 약 400 IU/체중 kg/주, 적어도 약 500 IU/체중 kg/주, 또는 임의의 개재 범위의 IU/체중 kg/주이다.
본 발명에 의해 제공된 다양한 방법에서, EPO 또는 또다른 EpoR 작용제의 존재하에 tEpoR의 발현은 tEpoR을 발현하지 않고/않거나 정상 EpoR을 발현하는 세포와 비교하여 tEpoR을 발현하는 세포의 모집단을 증가 또는 확장시킨다. 본원의 다른 곳에서 언급한 바와 같이, 모든 세포(편재 또는 조건적 발현) 또는 특정 세포 유형 또는 세포 계통에서 tEpoR 수용체를 발현하는 발현 조절 서열은 tEpoR을 발현하지 않고/않거나 정상 EpoR을 발현하는 세포와 비교하여 tEpoR 발현 세포의 확장을 유도할 것이다.
본 발명의 벡터 및 방법을 이용하여 확장된 예시적 세포에는, 이로써 제한되지 않지만, 배아 줄기 세포, 골수 줄기 세포, 제대 줄기 세포, 태반 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 심장 줄기 세포, 심장 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 골수 전구 세포, 림프구 전구 세포, 혈소판 전구 세포, 적혈구 전구 세포, 과립구 전구 세포, 단핵구 전구 세포, 거핵아구, 전골수거핵구, 거핵구, 전구/혈소판, 전적아구, 호염기성 적아구, 다색성 적아구, 오르토크로마틱 적아구, 다색성 적혈구, 적혈구(RBC), 호염기성 전골수구, 호염기성 골수구, 호염기성 후골수구, 호염기구, 호중구 전골수구, 호중구 골수구, 호중구 후골수구, 호중구, 호산성 전골수구, 호산성 골수구, 대식세포, 수지상 세포, 림프아구, 전림프구, 천연 킬러(NK)-세포, 소형 림프구, T-림프구, B-림프구, 혈장 세포 및 림프계 수지상 세포가 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 표적 세포 유형은 하나 이상의 적혈구 세포, 예를 들면, 전적아구, 호염기성 적아구, 다색성 적아구, 오르토크로마틱 적아구, 다색성 적혈구 및 적혈구(RBC)이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 벡터 및 방법을 이용하여 확장된 세포에는, 이로써 제한되지 않지만, 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포, 전적아구, 호염기성 적아구, 다색성 적아구, 오르토크로마틱 적아구, 다색성 적혈구 및 적혈구(RBC) 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
한 가지 실시양태에서, EPO 투여 후에, tEpoR을 발현하는 세포는, EPO 투여 전에 대상체에서 tEpoR을 발현하는 세포와 비교하여 또는 tEpoR을 발현하지 않고/않거나 내인성 EpoR을 발현하는 세포와 비교하여, 약 5배, 약 10배, 약 25배, 약 50배, 약 75배, 약 100배, 약 150배, 약 200배 또는 약 250배 또는 그 이상 확장된다.
또 다른 실시양태에서, EPO 투여 후에, tEpoR을 발현하는 세포는, EPO 투여 전에 대상체에서 tEpoR을 발현하는 세포와 비교하여 또는 tEpoR을 발현하지 않고/않거나 내인성 EpoR을 발현하는 세포와 비교하여, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 75배, 적어도 100배, 적어도 150배, 적어도 200배 또는 적어도 250배 또는 그 이상 확장된다.
특정한 실시양태에서, EPO 투여 후에, tEpoR을 발현하는 적혈구 세포는, EPO 투여 전에 대상체에서 tEpoR을 발현하는 적혈구 세포와 비교하여 또는 tEpoR을 포함하지만 tEpoR을 발현하지 않는 비-적혈구 세포와 비교하여, 약 5배, 약 10배, 약 25배, 약 50배, 약 75배, 약 100배, 약 150배, 약 200배 또는 약 250배 또는 그 이상 확장된다.
또 다른 실시양태에서, EPO 투여 후에, tEpoR을 발현하는 적혈구 세포는, EPO 투여 전에 대상체에서 tEpoR을 발현하는 적혈구 세포와 비교하여 또는 tEpoR을 포함하지만 tEpoR을 발현하지 않는 비-적혈구 세포와 비교하여, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 75배, 적어도 100배, 적어도 150배, 적어도 200배 또는 적어도 250배 또는 그 이상 확장된다.
어떠한 특정 이론에 구속되는 것을 원하지 않지만, 본 발명의 벡터, 조성물 및 방법에 의해 제공된 중요한 이점은 종래의 방법과 비교하여 보다 낮은 비율의 형질도입된 세포를 포함하는 세포 모집단을 투여함으로써 달성될 수 있는 유전자 치료의 높은 효능이다. 이는 형질도입된 세포에서 세포 유전자의 유해한 돌연변이, 형질전환 또는 암유전자 활성화의 감소된 변화와 관련된 중요한 안전성 이점을 제공한다.
형질도입된 세포는 골수 절제 치료법을 받거나 받지 않은 개체에서 골수 또는 제대혈 이식의 일부로서 투여될 수 있다. 한가지 실시양태에서, 본 발명의 형질도입된 세포는 화학적절제(chemoablative) 또는 방사성절제(radioablative) 골수 치료를 받은 개체에 대한 골수 이식으로 투여된다.
한가지 실시양태에서, 형질도입된 세포의 용량은 대상체에게 정맥내로 전달된다. 바람직한 실시양태에서, 형질도입된 조혈 줄기 세포는 대상체에게 정맥내로 투여된다.
특정한 실시양태에서, 환자는 1회의 단일 정맥내 용량으로 약 1 x 105 세포/㎏, 약 5 x 105 세포/㎏, 약 1 x 106 세포/㎏, 약 2 x 106 세포/㎏, 약 3 x 106 세포/㎏, 약 4 x 106 세포/㎏, 약 5 x 106 세포/㎏, 약 6 x 106 세포/㎏, 약 7 x 106 세포/㎏, 약 8 x 106 세포/㎏, 약 9 x 106 세포/㎏, 약 1 x 107 세포/㎏, 약 5 x 107 세포/㎏, 약 1 x 108 세포/㎏ 또는 그 이상의 형질도입된 세포, 예를 들면, 조혈 줄기 세포의 용량을 제공받는다. 특정한 실시양태에서, 환자는 1회의 단일 정맥내 용량으로 적어도 1 x 105 세포/kg, 적어도 5 x 105 세포/kg, 적어도 1 x 106 세포/kg, 적어도 2 x 106 세포/kg, 적어도 3 x 106 세포/kg, 적어도 4 x 106 세포/kg, 적어도 5 x 106 세포/kg, 적어도 6 x 106 세포/kg, 적어도 7 x 106 세포/kg, 적어도 8 x 106 세포/kg, 적어도 9 x 106 세포/kg, 적어도 1 x 107 세포/kg, 적어도 5 x 107 세포/kg, 적어도 1 x 108 세포/kg, 또는 그 이상의 형질도입된 세포, 예를 들면, 조혈 줄기 세포의 용량을 제공받는다.
특정의 실시양태에서, 환자는 약 1 x 105 세포/㎏ 내지 약 1 x 108 세포/㎏, 약 1 x 106 세포/㎏ 내지 약 1 x 108 세포/㎏, 약 1 x 106 세포/㎏ 내지 약 9 x 106 세포/㎏, 약 2 x 106 세포/㎏ 내지 약 8 x 106 세포/㎏, 약 2 x 106 세포/㎏ 내지 약 8 x 106 세포/㎏, 약 2 x 106 세포/㎏ 내지 약 5 x 106 세포/㎏, 약 3 x 106 세포/㎏ 내지 약 5 x 106 세포/㎏, 약 3 x 106 세포/㎏ 내지 약 4 x 108 세포/㎏, 또는 임의의 개재 용량의 세포/㎏의 형질도입된 세포, 예를 들면, 조혈 줄기 세포의 양을 제공받는다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 종래의 방법보다 견고하고 안전한 유전자 치료를 제공하고, 약 5% 형질도입된 세포, 약 10% 형질도입된 세포, 15% 형질도입된 세포, 약 20% 형질도입된 세포, 약 25% 형질도입된 세포, 약 30% 형질도입된 세포, 약 35% 형질도입된 세포, 약 40% 형질도입된 세포, 약 45% 형질도입된 세포 또는 약 50% 형질도입된 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 적혈구 세포의 모집단을 확장 또는 증가시키는 가능성을 갖는 줄기 세포, 예를 들면, 조혈 줄기 세포와 같은 형질도입된 세포를 제공한다. 특정한 실시양태에서, 조혈 줄기 세포는 본 발명의 벡터로 형질도입되고, 이상헤모글로빈증의 치료가 필요한 개체에게 투여된다. 조혈 줄기 세포는 적혈구 세포 기원이고, 따라서 바람직하다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 벡터, 조성물 및 방법은 생체외 유전자 치료 및 자가 이식을 이용한 유전자 치료의 개선된 방법을 제공한다. 한 가지 비제한적 예에서, 본 발명은 적혈구 특이적 전사 조절하에 인간 β-글로빈 및 절단된 에리트로포이에틴 수용체 또는 이들 둘 다를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터를 제공한다. 이러한 절단된 수용체는 인간 담체에서 tEpoR을 발현하는 세포 상에서 에리트로포이에틴에 대한 증강된 감수성 및 양성 증식 이점을 제공한다. 이상헤모글로빈증을 갖고 상승된 혈장 EPO 수준 또는 투여된 재조합 EPO를 갖는 대상체에 상기 벡터로 형질도입된 세포의 이식은 낮은 비율의 형질도입된/비형질도입된 세포의 경우에도 당해 질환의 장기간 수정을 제공한다.
본 발명은 이제 이하의 실시예에 의해 보다 상세히 기술될 것이다. 그러나, 본 발명은 다수의 상이한 형태로 구체화될 수 있으며, 본원에 제시된 실시양태로 제한되는 것으로 해석되지는 않아야 하고; 오히려, 이들 실시양태는 본 설명이 철저하고 완전하며 당해 기술분야에서 숙련된 기술자에게 본 발명의 범위를 충분히 전달할 수 있도록 제공된다.
실시예
실시예 1: 세포 배양, 형질도입 및 골수 세포 이식
몇몇 실시양태에서 5-플루오로우라실(5-FU)로 지칭되기도 하는 조혈 줄기 세포(HSC)는 사전에 4일 동안 150㎎/kg 5-FU(시그마 알드리히)가 주입되고 림프구(Lympholyte)-M 밀도 구배 정제(Cedarlane)에 제공된 수컷 공여자 마우스의 골수(BM) 세포로부터 수득했다. 특정 실시양태에서, HSC는 자성 비드(Miltenyi Biotec)를 이용하여 CD105+ Scal+ 세포를 분류함으로써 수컷 마우스 BM으로부터 정제시켰다. 수질 림프골수(Medullar lymphomyeloid) 및 적혈구 세포는 자성 비드(Miltenyi Biotec)를 이용하여 CD45 항원의 유무에 기초하여 정제하였다. 순도는 CD45와 Ter119 항원에 대한 항체를 이용하는 유동 세포계측법에 의해 확인했다.
에코트로픽 슈도타입화된 레트로바이러스 벡터는 Fugene(로슈 디아고노스틱스, 메일랑, 프랑스)을 이용하여 BOSC23 세포의 일시적인 형질감염에 의해 생성되었다. 에코트로픽 레트로바이러스 벡터 역가는 NIH3T3 세포 형질도입 2일 후에 유동 세포계측법에 의해 평가했다. 소포성 구내염 바이러스 당단백질-G로 슈도타입화된 재조합 렌티바이러스 벡터를 생성했다. 역가는 바이러스 상청액 1ml당 약 2 × 108 형질도입 단위였다.
형질도입 전에, 세포를 세척하고, 15% FCS, 100ng/㎖의 재조합 마우스 줄기 세포 인자, 6.25ng/mL의 인터류킨-3 및 10ng/mL의 인터류킨-6을 함유하는 α-MEM 배지(Invitrogen 사)에서 1-2 x 106 세포/㎖의 최종 농도로 현탁시키고, 37℃에서 성장시켰다. 모든 사이토킨은 페프로테크(Peprotech)에서 입수했다. 재조합 인간 에리트로포이에틴(rhEpo, 3U/mL, 로슈 파마)은 적혈구 세포 배양물에 첨가했다.
감마레트로바이러스 벡터(RV)에 의한 5-FU 세포의 형질도입은 40시간 후에 시작했다. 세포는 8g/㎖의 프로타민 설페이트(시그마-알드리히), 보체제거 혈청 및 사이토킨을 함유하는 α-MEM 배지에서 레트로넥틴(다카라) 코팅된 페트리 접시에서 희석되지 않은 레트로바이러스 상청액에 24시간 간격으로 2회 노출시켰다. 형질도입 2일 후에, 증강된 녹색 형광 단백질(eGFP) 양성 세포의 비율(유동 세포계측법에 의해 측정되고 4일후 변하지 않은 24%-32%)은 모의 형질도입 세포로 10%로 설정하였다. 4백만개 세포(4 x 105 eGFP 발현 세포 포함)를 치명적 방사선 조사된 β 지중해빈혈 수컷 마우스 Hbbth -1/ th -1에 정맥내로 주입했다. 이 실험에서, MOI는 1이었다(2회). β 지중해빈혈 수용자는 1100rad(3시간에 걸쳐 550rad의 분할 조사량)의 전체 신체 조사를 제공받았다.
세포는 세포 단리 16시간 후에 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다. 5-FU 세포는 프로타민 설페이트 및 사이토킨 보충된 StemPro-34 혈청 부재 배지(Invitrogen)에서 레트로넥틴 코팅된 페트리 접시 상의 벡터에 노출시켰다. 6시간 후, 세포는 트립신-EDTA 용액(캠브렉스 바이오사이언스) 및 세포 스크레퍼를 이용하여 수거하였다. 총 500,000-750,000개 형질도입된 5-FU 세포는 전체 신체 조사를 제공한 각 β 지중해빈혈 암컷 수용자에게 정맥내 주입하였다.
실험 1에서, MOI는 20이었고, β 지중해빈혈 수용자는 600rad(단회 조사량)를 제공받았다.
실험 2에서, 3 그룹의 마우스는 각각 0.3, 2, 또는 10의 MOI 및 1100rad(3시간 이상 550rad의 분할 조사량)로 형질도입된 세포를 제공받았다. LG로 형질도입된 세포에 의한 이식을 받은 β 지중해빈혈 마우스 및 LG/HA-Y1 마우스는 각각 LG- 및 LG/HA-Y1 마우스라고 명명되었다.
세 번째 실험에서, 200rad 양의 단일 조사 후, 4β 지중해빈혈 마우스에게 25,000 CD105+ Scal+ 세포를 각각 주입했다. 세포는 MOI 20에서 LG/HA-Y1로 형질도입했다. 시험관내 연구를 위해, 골수 적혈구(CD45-) 및 림프구/골수(CD45+) 세포는 MOI 50에서 LG/HA-Y1로 형질도입했다. RNA는 2일 후 추출하였다.
혈액 파라미터
혈액 샘플은 자동 세포 계수기(Cell Dyn 3700; 애보트 디아고노스틱)의 이용으로 헤모글로빈과 혈액 세포수를 분석하였다. 헤마토크릿 값은 수동 원심 분리 방법에 의해 수득하였다. 전체 헤모글로빈에 대한 수용성 헤모글로빈의 비율은 전체 용혈물 및 원심분리된(20,000g에서 5분) 용혈물의 상청액에서 Drabkin 시약(시그마-알드리히)으로 헤모글로빈을 측정하여 결정하였다. 에리트로포이에틴 농도는 인간 Epo 표준과 함께 Epo 모노클로날 효소 면역 분석 키트(Medac Diagnostika)를 이용하여 측정하였다. 마우스 및 인간 헤모글로빈은 양이온 교환 HPLC에 의해 분리하였다. 용혈물은 PolyCAT A 컬럼(PolyLC Inc) 상에서 주입했다. 용출은 15분 내에 7%로부터 70% 완충제 B로 2개의 트리스 완충제(완충제 A: 트리스 40mM, 아세트산으로 pH 6.5로 조정된 KCN 3mM, 완충제 B: 트리스 40mM, KCN 3mM, 아세트산으로 pH 6.5로 조정된 NaCl 200mM)의 선형 구배로 달성했다. 헤모글로빈은 418nm 파장에서 검출되었다.
유동 세포계측법
eGFP-양성 WBC는 RBC 용해 및 CD45.2(BD 바이오사이언스) 및 스트렙트아비딘-알렉사 플루오르 647(인비트로젠)에 대한 비오티닐화 항체로 표지한 후에 검출되었다. 세포내 인간 β-글로빈의 검출을 위해, RBC를 세척하고, 2% 포름알데히드에서 30분 동안 고정시키고, 50% 메탄올 및 50% 아세톤에서 30초 동안 투과시키고, 구체적으로 인간 HbA(PerkinElmerWallac)를 인지하는 FITC-표지된 항체로 염색시켰다. 골수 및 림프 BM 세포는 비오티닐화 항-CD45.2 및 PE 항-마우스 GR1/Mac1, 항-마우스 CD3, 또는 항-마우스 B220(모두 eBiosciences)로 검출시킨 후, 스트렙트아비딘-알렉사 플루오르 647 표지화를 수행했다. 적혈구 전구 세포를 항-마우스 Ter119 및 CD71 항원을 이용하여 동정했다.
정량적 PCR 및 RT-정량적 PCR 분석
게놈 DNA는 뉴클레오스핀 혈액 키트(매커레이 나겔)로 추출하였다. 백혈구(D) 사이에 공여자 수컷 세포의 분획과 벡터의 카피 수(V)를 정량적 PCR에 의해 측정하였고, 결과는 남성과 여성 세포로부터 게놈 DNA의 일련의 희석물 및 반수체 게놈당 통합 벡터의 하나의 카피를 함유하는 마우스 세포주로부터 게놈 DNA의 일련 희석액에 대한 결과와 비교하였다. 실시간 PCR은 7300 ABI 프리즘 검출 시스템(Applied Biosystems) 및 ROX를 함유하는 2X 정량적 PCR(qPCR) MasterMix(Eurogentec)를 이용하여 94℃에서 15초 동안 변성, 및 95℃에서 10분의 활성화 단계후 1분 동안 60℃에서 어닐링 및 신장으로 40 사이클을 수행했다. 프라이머 및 프로브는 표 1에 기재되어 있다.
[표 1]
실시간 PCR에 이용되는 프라이머 및 프로브
Figure pat00001
EpoR은 에리트로포이에틴 수용체를 나타내고; FAM, 6-카르복시플루오레세인 에스테르; LV, 렌티바이러스 벡터; NFQ, 비형광 퀀처; MGB, 미량 그루브 결합제; SRY, 성-결정 영역 Y 및 TAMRA, 테트라메틸-6-카르복시로다민. *어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems).
전체 RNA는 전체 RNA 정제 시스템(인비트로겐)을 PureLink 마이크로 내지 미디로 추출하고, cDNA를 Superscript III 첫번째-스트랜드 합성 수퍼 믹스(Invitrogen)로 합성하였다. 마우스(m) EpoR, mGAPDH 및 18s cDNA는 TaqMan 유전자 발현 분석(표 1)을 이용하여 정량하였다. 비교 Ct 방법(ΔΔCT)은 세포 유형 사이에 mEpoR 생산 수준을 비교하기 위해 이용했다. 역전사 효소 또는 샘플이 생략된 대조군 샘플이 포함되었다.
변형된 적혈구 세포의 증폭률
적혈구 세포 확장에 대한 tEpoR 및 β-글로빈의 효과는 말초 혈액에서 변형된 WBC 및 RBC 비율의 비교에 기초하여 계산하였다. 변형된 RBC의 비율(RBC%)은 항-인간 HbA 항체를 이용하여 유동 세포계측법으로 측정하였다. 변형된 WBC의 비율(%WBC)은 백혈구당 백터 카피 수(V) 및 공여자 남성 세포(D)의 비율로부터 측정했다. 이는 다음과 같이 계산하였다:
· 공여자 백혈구당 벡터 카피수 Vd= V/D;
· 공여자 세포 중의 변형된 WBC의 비율 %WBC+d는 포아존 법칙(Poisson law)에 따라 Vd로부터 측정했다: %WBC+d= [1 - exp(- Vd)] × 100]; 및
· 모든 백혈구 중 변형된 백혈구의 비율
%WBC+ = %WBC+d x D.
변형된 WBC가 생체내에서 비변형된 WBC 백혈구에 대해 장점 또는 단점을 갖지 않음을 가정하면, 변형된 적혈구에 제공된 생존 이점 및 골수에서 변형된 적혈구 세포에 부여된 생산 이점으로부터 변형된 적혈구 세포의 증폭률(FE)은 다음과 같이 계산되었다:
FE =(%RBC+/%RBC-)/(%WBC+/%WBC-)(방정식 1)
결과적으로, (%RBC+/%RBC-) = FE(%WBC+/%WBC-)(방정식 2), 및
%RBC+ 및 %WBC+ 사이의 쌍곡선 관계는 다음과 같이 기재된다:
%RBC+= {FE[(100/(FE-1)] ×%WBC+}/{[(100)/(FE-1)] +%WBC+}(방정식 3)
이 수학적 모델은 문헌[참조: Roberts et al., Ann NY Acad Sci. 2005; 1054: 423-428]으로부터 파생되고, WBC와 RBC의 파괴와 생산 사이의 정상 상태 균형을 가정한다.
변형된 백혈구가 tEpoR에 의해 영향받지 않았음을 평가하기 위해, 생체내 변형된 WBC 및 생체외 변형된 HC의 분획을 계산하고, 분할하고, LG- 및 LG/HA-Y1-형질도입 세포를 이용한 이식을 받은 마우스 사이를 비교했다.
통합 부위 분석
벡터-감염된 세포로부터 게놈 DNA를 정제하고, 링커를 파지 MuA의 트랜스포사제 및 MuA 인식 부위를 함유하는 합성 올리고뉴클레오티드로 처리하여 PCR을 위해 첨가하였다. 이어서, 통합 벡터에 인접한 게놈 DNA는 벡터 DNA 말단 및 링커에 상보적인 PCR 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. PCR 생산물의 서열 454/Roche 피로서열분석으로 측정하였고, 데이터를 큐레이트화하고 분석했다. Mu 전위 방법은 풍부화의 추정치를 제공하고, 여기서 단일 Mu 부위의 단리를 유도하는 시험관내 독립 Mu 통합 이벤트의 수는 상대적 풍부함을 보고한다. 몇 가지 경우에서, 통합 부위가 하나 이상의 마우스에서 발견되었다. 이러한 경우는 이식 전에 형질도입 세포의 성장 또는 PCR 동안 크로스오버 때문일 수 있다. 이러한 경우에, 통합 부위는 상대적 풍부함에 기초하여 단일 마우스에 할당했다. 프로토-암유전자의 통합 부위의 근접은 allOnco 데이터베이스(암 유전자 데이터 세트. microb230.med.upenn.edu/protocols/cancer-genes.html에서 이용가능함. 2011년 4월 5일 접근됨)로 비교하여 측정하였다.
통계 분석
2개 그룹 비교를 위해, 스튜던츠 t 시험 또는 맨-휘트니 순위-합계 시험을 이용했다. 2개 그룹 이상의 비교를 위해, 일원 변량 분석 및 순위 방법에 대한 홀름-시닥 또는 크루스칼-월리스를 이용했다. 선형 회귀는 상관 계수(R2) 및 P 값의 측정과 함께 데이터에 적용했다. 모든 시험은 SigmaPlot 버전 10.0 소프트웨어로 수행하였다. P <0.05를 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 2: tEpoR -발현 HC는 β 지중해빈혈 마우스에서 증식성 이점을 갖는다
배경
구조적으로 높은 수준의 혈장 Epo(정상 마우스 값의 20 내지 50배)를 갖는 β-지중해빈혈 마우스 모델을 이용하여, 동계 수용자에게 이식된 tEpoR을 편재하여 발현하는 벡터로 형질도입된 골수 세포의 확장을 시험했다.
EpoR cDNA 및 eGFP을 발현하는 감마레트로바이러스 벡터(γRV)를 작제했다. 이러한 γRV는 2개의 절단된 수용체(mEpoRY1-2 또는 mEpoRY1) 또는 eGFP만의 전장 쥐 EpoR(mEpoRY1-8)을 인코딩한다(도 1A-1C). 모든 작제물은 Ba/F3 세포에서 효율적 Epo 수용체를 발현하는 것으로 나타났다. mEpoRY1-8은 또한 UT7-GM 세포에서 기능성인 것으로 나타났다.
β 지중해빈혈 공여자로부터 BM 세포에 상기한 4 γRV를 형질도입하였다. 10% 유전적으로 변형된 세포를 포함한 4백만 세포는 치명적으로 조사된 β 지중해빈혈 수용자에게 주입했다.
결과
이식 20주 후, 각각 5.5% 및 3.1% eGFP-양성 RBC 및 WBC는 대조군 γRV로 변형된 세포로 이식된 마우스의 혈액에서 검출되었다(도 2A).
γRV/EpoRY1-8-형질도입 세포를 제공받은 마우스는 대조군 마우스에 비해 이들의 eGFP-양성 RBC(2.7%) 및 WBC(4.1%) 모집단의 현저한 증폭을 나타내지 않았다. 림프 및 골수 구획의 별도의 분석은 특정 조혈 세포 유형 증폭(도 9와 표 2)을 나타내지 않았다(도 9 및 표 2).
[표 2]
γRV/EpoRY-형질도입 세포를 제공받은 마우스는 각각 eGFP-양성 RBC 및 WBC의 39.2% 및 30.8% 증폭을 가졌다. 이것은 대조군와 비교하여 각각 변형된 RBC 및 WBC 비율의 7배(P = 0.021) 및 10배(P = 0.001) 증가를 나타낸다. γRV/EpoRY1-2를 제공받은 마우스에서, 변형된 RBC 및 WBC 비율의 평균 증폭 수준은 각각 8배 및 6배였다.
따라서, γRV/EpoRY1 및 γRV/EpoRY1-2 마우스에서 eGFP-양성 세포의 평균 백분율은 γRV/EpoRY1-8-형질도입된 그룹에서 관찰된 평균값과 크게 상이했다.
골수 세포는 WBC보다 RBC에서 큰 eGFP-양성 세포의 비율이 수용자 방사성내성 기억 림프 세포의 지속성 때문인지를 측정하기 위해 시험했다. eGFP-양성 세포의 비율의 중앙 값은 γRV/EpoRY1-2 마우스(P = .009) 및 γRV/EpoRY1의 동물에서 림프구보다 과립구/단핵 세포에서 더 큰 값의 경향을 나타냈다. eGFP-양성 세포의 비율은 적혈구 및 골수 구획 사이에 통계학적 차이가 없었고(표 3), tEpoR이 골수 세포에 비해 적혈구에서 우선적 효과를 발휘하지 않았다는 것을 나타냈다.
[표 3]
EpoR이 절단된 수용체보다 낮은 수준에서 발현되었는지의 여부를 측정하기 위해, 본 발명자들은 시험관내 성장된 및 이식후 형질도입된 HC에서 eGFP 평균 형광 강도(MFI)를 비교했다. 이식전 형질도입된 세포의 MFI는 모든 벡터와 동등했다(도 10). 이식 10일 후 eGFP 발현을 위해 분류된 CD45+ 세포에서 qRT-PCR에 의해 정량화된 EpoRY1 및 EpoRY1-8 mRNA는 유사했다. 그러나, 마우스에서, 골수 구획에서 γRV/EpoRY1 및 γRV(P = .031)와 γRV/EpoRY1 및 γRV/EpoRY1-8(P 0.017) 사이에 MFI의 통계학적 유의차가 있었다. 과립구에서 가장 큰 MFI를 갖는 4마리 마우스는 변형된 골수 세포의 가장 큰 비율을 가졌다. 임의의 세포 유형에서 γRV 및 γRV/EpoRY1-8 마우스 사이에서는 차이가 관찰되지 않았다.
더불어, 이러한 결과는, 야생형 EpoR을 갖는 선택의 부재가 EpoR의 낮은 발현 수준 때문이 아니라, 최고 수준의 EpoR-Y1을 발현하는 골수 세포가 절단된 EpoR의 낮은 수준을 발현하는 세포에 비해 선호되었기 때문이라는 것을 나타냈다. 혈액 계수(표 4)는 그룹 사이에서 통계학적 차이가 없었다. 그러나, 혈장 Epo 수준은 2개 다른 그룹(도 2B)보다 γRV/EpoRY1 및 γRV/EpoRY1-2 이식된 마우스에서 2.5배 더 낮았다(P = .005).
[표 4]
실시예 3: 키메라 HS40/ 안키린 프로모터는 β-글로빈/ LCR 렌티바이러스 벡터 내의 적혈구 특이적이다.
배경
렌티바이러스 벡터는 RBC의 구획에서 세포 확장을 제한하는 적혈구 세포 특이적 방식으로 tEpoR을 발현하도록 설계되었다. 적혈구 특이적 β-글로빈 프로모터/LCR 인핸서를 유도하는 인간 β-글로빈 유전자 및 tEpoR cDNA의 발현 카세트 둘 다를 함유하는 컴팩트 렌티바이러스 프로바이러스 내에서 전사 간섭의 가능한 효과를 평가하였다. tEpoR을 발현시키기 위해, 인간 β-글로빈 HS40 인핸서를 HA로서 명명되는 안키린-1 프로모터[참조: Moreau-Gaudry et al., Blood, 2001; 98(9):2664-2672]에 연결했다.
적혈구 특이성의 수준을 평가하기 위해, eGFP를 먼저 글로빈/LCR의 렌티바이러스 벡터 LG(도 1B)에 도입하여 LG/HA-eGFP 벡터를 수득했다. 렌티바이러스 벡터 HPV570은 eGFP를 편재하여 발현시키는 대조군 벡터로서 이용하였다. 정상 C57BL/6J-CD45.2 마우스로부터 BM 세포는 이러한 벡터로 형질도입하고, 유사유전자형 C57BL/6JCD45.1 마우스에게 주입했다.
결과
LG 벡터와 관련하여 HC 프로모터는 β-글로빈/LCR 카세트의 간섭 없이 고도의 적혈구 특이성을 나타낸다. 시험관내 성장된 세포의 분석은 각각 LG/HA-eGFP 및 HPV570에 대해 세포당 0.14 및 1.50 프로바이러스 카피를 나타냈다. 이식 5개월 후 순환 WBC에서 공여자 키메라현상은 유사했다(약 90% CD45.2-양성 WBC). 동일 시점에서, WBC(골수, T-림프구 및 B-림프구)의 eGFP-양성 말초 서브세트 및 eGFP-양성 RBC의 비율은 유동 세포계측법에 의해 측정하였다. 이식 6개월 후에, BM 및 흉선으로부터의 세포를 동일한 항체 뿐만 아니라 적혈구 계통에 대한 항체를 이용하여 유동 세포계측법으로 분석하였다. eGFP-양성 골수, 림프 및 적혈구 세포의 비율은 HPV570-변형된 세포에 의한 이식을 받은 마우스에서 동일한 반면, eGFP-양성 적아구 및 RBC의 비율은 LG/HA-eGFP-변형된 세포(도 3)에 의한 이식을 받은 마우스에서 골수 및 림프 eGFP 세포의 비율보다 훨씬 높았다.
eGFP가 tEpoR로 대체되었을 때 적혈구 특이적 발현이 유지되었다. 변형된 적혈구 및 비적혈구 세포에서 tEpoR 발현을 비교하였다. 비-β 지중해빈혈 마우스로부터 BM 세포는 범-백혈구 CD45 항원의 존재 또는 부재에 기초하여 정제한 다음, LG/HA-EpoRY1 벡터로 형질도입하였다. 2일 후, RNA를 추출하여 RT-qPCR에 의해 분석하였다. 형질도입된 적혈구 CD45-(> 99% Ter119+) 세포에서 tEpoRY1의 발현은 형질도입된 CD45+(<1% Ter119+) 세포보다 100배 더 컸다(각각 GAPDH 및 리보솜으로 표준화할 경우 147배 및 109배). 내인성 EpoR mRNA는 비형질도입된 CD45+ 또는 CD45- 세포에서 이러한 방법으로 검출되지 않고, 이는 적혈구 대 비적혈구 세포에서 관찰된 EpoR mRNA의 100배 증가가 이식유전자 EpoR로부터 생성되고 안키린 프로모터의 특이성으로부터 기인한다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 이식된 β 지중해빈혈 마우스에서 적혈구 특이적 EpoR 및 β-글로빈 동시발현 및 적혈구 세포의 선택적 확장
배경
γRV/EpoRY1 및 γRV/EpoRY1-2 벡터(도 1)의 실질적으로 유사한 효과를 고려하여, EpoRY1은 LG 벡터에 의한 후속적 마우스 이식 실험을 위한 것이었다.
LG 또는 LG/HA-Y1 벡터 중 하나로 형질도입된 동계 β 지중해빈혈 골수 세포가 이식된 β 지중해빈혈 마우스에서 RBC 및 WBC의 비율을 비교하였다. 혈액 세포 수, RBC 발현 인간 Hb의 비율, 인간 β-글로빈 발현 수준, 공여자 키메라현상 정도, 및 벡터 카피 수는 이식 40주 또는 35주 후에 측정하였다.
결과
RBC 대 WBC의 비율 사이의 관계가 제시되어 있다(도 4A-B). 값을 4개의 이론 곡선(실시예 1에서 "변형된 적혈구 세포의 증폭률" 단락에서 기재된 방정식 2 및 3으로부터 유도)과 비교하고, 여기서 변형된 RBC의 이론적 확장(FE)은 변형된 WBC의 확장보다 1배, 10배, 50배 또는 200배 더 클 것이다. 대부분의 LG/HA-EpoRY1 마우스의 경우, RBC+는 WBC에 비해 50배 및 200배 확장된 반면, 단지 LG 마우스의 RBC+는 WBC에 비해 단지 1배 내지 10배 사이에 확장되었다. LG/HA-EpoRY1 및 LG 마우스에 대한 중앙 적혈구 증폭률 FE는 각각 97.2(범위, 8.2-729.7) 및 5.0(범위, 0.5-14.4)(도 4C)이었다.
tEpoR 변형된 적혈구 세포의 명백한 이점은 적혈구 세포에 특이적이고 변형된 WBC에 제공된 단점이 없는 것으로 측정되었다. 또한, 이 tEpoR 변형된 WBC가 비변형된 WBC에 비해 장점을 갖지 않은 것으로 측정되었다. 공여자 WBC 중에서 WBC+의 비율을 측정하고, 이식 전(형질도입 후 10일, 재조합 인간 Epo 첨가 없음; 도 4D)에 형질도입된 벌크 HC의 분획과 비교했다. 분획의 중앙 비는 동등했고(P = .21), 1에 근접하며, 이는 생체내에서 비변형된 공여자 WBC 세포에 비해 변형된 WBC에 단점도 장점도 존재하지 않았음을 나타냈다. 카피 수는 또한 Epo와 함께 성장된 HC에서 측정되었고, Epo 없이 성장된 세포에서 측정된 것과 유사하며, 이는 Epo가 시험관내에서 형질도입된 세포에 증식 이점을 부여하지 않음을 나타냈다.
실시예 5: β 지중해빈혈 표현형의 수정은 치료학적 인간 β-글로빈을 발현하는 순환성 RBC의 비율에 상관된다.
배경
LG/HA-EpoRY1 벡터는 β-지중해빈혈 질환 표현형을 수정한다. β-지중해빈혈 질환 표현형은 LG 및 LG/HA-EpoRY1 마우스(LG 또는 LG/HA-EpoRY 형질도입된 골수 세포가 투여된 마우스) 모두에서 순환성 RBC의 소정의 비율에 대해 평가했다. RBC의 함수로서 혈액학적 파라미터, Hb 농도 뿐만 아니라 LG 및 LG/HA-EpoRY1 마우스의 RBC 및 망상적혈구 수를 기록했다. 이는 β-지중해빈혈 표현형의 수정이 LG 벡터로 증명되었고, 단 RBC+의 비율이 >40%였다는 것을 사전에 나타냈다.
결과
선형 회귀 분석은, 40% RBC+를 초과하는 임계치를 갖는 LG 마우스로부터, 그러나 모두 3마리 마우스로부터 수득된 데이터에 적용했다. RBC+의 수준 사이의 유의한 상관(도 5) 및 (1) 전체 Hb의 농도, (2) 인간 β-글로빈AT87Q의 농도, (3) RBC 수, (4) 망상적혈구 수 및 (5) 비장 중량의 표준화는 LG 형질도입된 골수 세포 그룹(도 6A) 내에서 발견되었다.
선형 회귀 분석은 40% RBC+ 초과 임계치를 갖는 LG/HA-EpoRY1 마우스로부터 수득된 데이터에 적용했다.
이식을 받은 LG/HA-EpoRY1 마우스에서 측정된 혈액학적 값의 대부분은 모든 측정된 파라미터에 상응하는 맞춤형 회귀 라인에 대한 95% 신뢰 구역 내에 속했다.
이어서, 적혈구 세포의 백분율은 5 LG, 5 LG/HA-EpoRY1 및 3 모의-이식된 마우스의 비장 내에서 측정하였다.
비장 크기의 감소는, 감소된 적혈구생성장애 및 향상된 말단 적혈구 세포 분화의 향상된 효율과 일치하여, 두 마우스 그룹에서 비장 적혈구 세포의 비율의 감소와 관련된다(도 5B). 더불어, 이 데이터는 β 지중해빈혈 표현형의 수정이, tEpoR 발현에 의해 제공된 보조적 이점과 함께, 두 LG 및 LG/HA-EpoRY1 그룹 마우스에 대해 유사한 비율로 치료학적 인간 β 글로빈을 발현시키는 순환성 RBC의 비율과 서로 상관된다는 것을 나타냈다.
실시예 6: RBC 확장은 최소 렌티바이러스 전이 및 2차 이식 후에 계통 제한되고 치료성이다 .
배경
치료학적 β-글로빈AT87Q 및 tEpoR의 공발현은 지중해빈혈에서 상승된 Epo 혈장 농도와 관련하여 RBC 확장을 유도하고, LG/HA-EpoRY1 대 LG 마우스에서 낮은 비율의 WBC+와 함께 증가된 정도의 표현형 수정을 제공한다. < 20% WBC+에서, 실질적으로 모든 LG/HA-EpoRY1 마우스는 수정된 표현형을 갖는다(도 6A). 8.3% LG/HA-EpoRY1 WBC+의 경우, 81.6%의 RBC는 변형된 적혈구 전구세포로부터 기원하고, 10.4% LG WBC+는 27% 이하의 RBC+를 생산했다(도 6B).
결과적으로, 8.3%의 평균 WBC+ 비율의 경우, LG/HA-EpoRY1 마우스의 평균 헤마토크릿 값(40.1%) 및 헤모글로빈 농도(12.7 g/dL)는 동등한 비율(10.4%)dml WBC+를 갖는 LG 마우스보다 훨씬 컷다(도 6B). 유사한 수정은 LG 마우스(평균 헤마토크릿 값, 40.2%; 헤모글로빈 농도, 12.5g/dL)에서 수득되지만, 보다 높은 비율의 WBC+(42.6%)를 필요로 했다. 최저 비율의 WBC+(3.3% ± 1.4%)를 갖는 LG/HA-EpoRY1 그룹의 4마리 마우스는 78.4% ± 20.1% RBC로 분포된 33.1% ± 5.6%의 평균 인간 β-글로빈AT87Q 수준을 갖는 반면, 최저 비율의 변형된 WBC(0.9%, 6.8%, 11.2% 및 13.3%)를 갖는 4마리 LG 마우스 중에서, 최고 비율의 WBC+ 발현된 검출가능한 인간 β-글로빈AT87Q(23.8% 및 12.2%)을 갖는 2마리 마우스 및 변형된 RBC의 백분율은 각각 1.0%, 6.0%, 42.3% 및 21.3%였다.
2차 BM 이식은 HSC 재증식이 고갈되는지를 평가하기 위해 및 장기간 연구에서 변형된 HS의 비율을 추가로 감소시키기 위해 1차 이식 40주 후에 1차 이식된 마우스의 HC로 수행했다. 11마리의 치사 조사된 암컷 마우스, 즉 모의 이식을 받은 3마리 마우스, 4마리 LG 1차 수용자 및 4마리 LG/HA-EpoRY1 1차 암컷 마우스에게 5백만 골수 세포를 제공했다. LG 및 LG/HA-EpoRY1 마우스의 HC는 이식을 받은 2차 동물에서 WBC+의 비율을 감소시키기 위해 모의 형질도입된 세포로 이식된 마우스 중의 하나로부터의 세포로 희석시켰다(표 5).
결과
2차 이식 후의 LG 벡터와 비교하여 LG/HA-EpoRY1으로 변형된 적혈구 세포의 증가된 증폭을 나타내는 데이타는 표 5에 요약되어 있다. 데이타는 2차 이식 10주 후에 LG(그룹 2) 및 LG/HA-EPORY1(그룹 3)-변형된 세포를 갖는 각각의 2차 이식된 마우스에 대해 제공되어 있다. 이식 10주 후에, 증폭률 FE는 LG 및 LG/HA-Y1 마우스의 경우에 각각 0 내지 12 및 48 내지 2374 범위였다. 실제로 LG 및 LG/HA-EpoRY1 그룹에서, WBC의 평균 이론적 비율은 WBC의 평균 측정된 비율과 유사했다.
[표 5]
WBC 중의 벡터 카피 수는 LG 및 LG/HA-Y1 마우스에서 유의적으로 차이가 없었다(표 6). 그러나, 인간 β-글로빈AT87Q를 발현하는 RBC의 평균 비율 및 인간 β-글로빈AT87Q의 혈액 농도는 LG 벡터(17.8% 적혈구에 분포된 5.9% 인간 β-글로빈AT87Q)의 경우보다 LG/HA-EpoRY1 벡터(75.9% 적혈구에 분포된 26.1% 인간 β-글로빈AT87Q)의 존재하에 더욱 컸다. 계산은 LG/HA-EpoRY1 벡터의 경우에 RBC+ 모집단의 확장 때문에 차이가 있고, 하이브리드 헤모글로빈(인간 β-글로빈AT87Q 및 마우스 β-글로빈) 중의 적혈구내 RBC 함량이 LG/HA-EpoRY1 및 LG 마우스 그룹(각각 4.8 및 4.6pg) 둘 다에 대해 유사하기 때문임을 나타냈다. 놀랍게도, 빈혈 및 기타 파라미터의 고효율적 수정은 LG 벡터가 아니라 LG/HA-EPORY1으로 이식된 β 지중해빈혈 마우스에서 관찰되었다(표 6). 추가로, 2차 이식 실험에서도, 광범위한 HC 분열 후에, 적혈구 계통으로 제한 유지된 세포 확장을 가져왔다는 것은 마찬가지로 예상외이다.
[표 6]
실시예 7: 적혈구 세포 확장은 자가-조절된다.
배경
다양한 조혈 계통은 LG 및 LG/HA-EpoRY1 벡터로 형질도입된 세포를 이용한 이식을 받은 β 지중해빈혈 마우스의 말초혈 및 BM에서 계통 특이적 항체를 이용한 유동 세포계측법으로 분석했다.
결과
CD45.2-양성 세포 중에서 T 림프구, B-림프구 및 골수구의 평균 비율은 이식을 받은 LG 및 LG/HA-EpoRY1 마우스 사이에서 유의차가 없었다(도 7A). 혈장 Epo 농도 및 RBC+의 수는, tEpoR의 존재 또는 부재와 독립적으로(도 7B), 역으로 상관되었고, 이는 tEpoR의 존재가 혈장 Epo에 의한 변형된 적혈구 세포 생산의 조절을 손상시키지 않음을 나타낸다.
RBC+ 및 WBC 또는 혈소판(도시되지 않음) 계수의 비율 사이에는 어떠한 상관관계도 관찰되지 않았고, 2개 마우스 그룹 사이에는 WBC(P = .125) 및 혈소판(P = .254) 계수에서 관찰된 유의차가 없었다(도 7C). 마우스의 비장, 간, 폐, 신장, 심장, BM 및 흉선의 조직학적 절편을 이식 10개월 후에 분석했다. 신생 세포 침윤은 관찰되지 않았다.
세포 증식에 대한 벡터 통합의 가능한 효과를 조사하기 위해, LG/HA-EpoRY1 벡터로 형질도입된 세포로 5개월 전에 이식을 받은 4마리 β 지중해빈혈 마우스의 세포에 대해 삽입 부위 분석을 수행했다. 마우스는, 세포 증식을 위한 압력을 최대화하고 이에 의해 세포 증식 또는 생존을 촉진시키는 유전자의 삽입 활성화의 효과를 검출하는 기회를 최대화하기 위해 저용량 방사선 조사(200rad)로 조절한 후에 비교적 소수의 HSC을 이용한 이식을 받았다. 이식 5개월 후에, 각 마우스의 림프골수(CD45+) 및 적혈구(CD45_) 세포를 분류하고, 게놈 DNA를 추출하고, 통합 부위 서열을 결정했다.
통합 부위는 시험관내에서 Mu-매개된 전위의 이용으로 분석했다. 정제된 Mu 트랜스포사제 단백질은 최소 표적 서열 특이성을 갖기 때문에, 통합 부위의 회수는 제한 효소를 이용한 게놈 DNA 절단을 수반하는 표준 방법보다 훨씬 덜 바이어스된다. 추가의 이점은 각각의 통합 부위와 관련된 독립적 전위 이벤트의 수가 본래 샘플 중의 당해 세포 클론의 비율의 평가를 제공한다는 것이다.
전체 2510개 서열 판독은 454/로슈 파이로시퀀싱으로 생성되었다. 부위는, 47개의 독특한 통합 부위를 포함하고 초기 접종된 세포의 낮은 수와 평행한, 전체 1070 독립적 Mu 전위 이벤트로부터 회수되었다. 림프골수 및 적혈구 세포 샘플에서 통합 부위 분포의 비교는, 소수를 샘플링하는 확률적 효과의 결과로서, 마우스 중에서 계통 사이에 다양한 정도의 공통성을 나타냈다(도 11).
삽입 이벤트의 분석은, LG/Ha-EpoRY1 벡터의 이용이 안전한 치료 방식이고 변형된 적혈구 세포의 성장이 특정 클론의 세포 성장 또는 증식 촉진된 신장에 수반된 유전자 부근의 통합에 기인하지 않음을 나타냈다. EpoR 시그날 전달 및, 클론 확장을 가져오는, 프로토-암유전자의 삽입 활성화 사이에는 어떠한 상호작용도 관찰되지 않았다. 세포 성장과 관련된 단일 유전자 부근의 통합 부위의 풍부화에 대한 어떠한 예도 없었다. 또한, 암-관련된 유전자의 목록(allOnco 데이타베이스)과 비교하여 최대 풍부 세포 클론(통합 부위에 의해 표시됨)의 분포를 분석했고, 클론 풍부화와 암-관련 유전자에 대한 근접 사이의 어떠한 관련도 밝혀지지 않았다(도 8A-B).
LG/HA-EpoRY1 세포에서 암유전자의 50kb 이내의 통합 부위의 비율은, β 지중해빈혈 마우스에서 이식 전 및 이식 9개월 후에, LG 벡터에 의해 변형된 쥐 HC에서 동정되고 이전 연구[참조: Ronen et al, Mol Ther, published online March 8, 2011]에 기재된 삽입 부위(IS) 비율과 비교했다. 세트 사이에서 통계학적 유의차는 암-관련 유전자로의 근접성에 대한 피셔 정확 검정에 의해 발견되지 않았다(도 8C).
추가로, LG/HA-EpoRY1-처리된 세포의 부위를 LG 형질도입된 세포의 부위와 비교하는 경우, 다른 유형의 게놈 특징에 대한 통합의 바이어스는 검출할 수 없다. 게늄 주석의 형태는 2개 벡터 사이의 삽입 부위에서 강력한 차이를 나타내지 않았다.
따라서, 이들 데이타는, 세포 성장 또는 증식에 관여하는 유전자 부근의 통합이 특정의 세포 클론의 신장을 촉진했다는 개념을 뒷받침하지 않는다.
상기 기재된 각종 실시양태를 조합하여 추가의 실시양태를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 언급되고/되거나 출원 데이터 시트에 수록된 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 공보 모두는 이들의 전체가 본원에 참고로 도입된다. 다양한 특허, 출원 및 공보의 개념을 채용하는 것이 필요한 경우, 실시양태들의 양상을 변형시켜 추가의 실시양태들을 제공할 수 있다.
상기 상세한 설명의 관점에서 실시양태에 대한 이들 및 다른 변경이 이루어 질 수 있다. 일반적으로, 다음의 특허청구범위에서, 이용된 용어는 명세서 및 특허청구범위에 개시된 특정 실시양태로 특허청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 않되고, 이러한 특허청구범위가 자격을 부여하는 균등물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 실시양태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 특허청구범위는 당해 개시에 의해 제한되지 않는다.
<110> BLUE-BIRD BIO, INC. <120> IMPROVED GENE THERAPY METHODS <130> IPA140271-US-D1 <160> 38 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 576 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 actcttctgg tccccacaga ctcagagaga acccaccatg gtgctgtctc ctgccgacaa 60 gaccaacgtc aaggccgcct ggggtaaggt cggcgcgcac gctggcgagt atggtgcgga 120 ggccctggag aggatgttcc tgtccttccc caccaccaag acctacttcc cgcacttcga 180 cctgagccac ggctctgccc aggttaaggg ccacggcaag aaggtggccg acgcgctgac 240 caacgccgtg gcgcacgtgg acgacatgcc caacgcgctg tccgccctga gcgacctgca 300 cgcgcacaag cttcgggtgg acccggtcaa cttcaagctc ctaagccact gcctgctggt 360 gaccctggcc gcccacctcc ccgccgagtt cacccctgcg gtgcacgcct ccctggacaa 420 gttcctggct tctgtgagca ccgtgctgac ctccaaatac cgttaagctg gagcctcggt 480 ggccatgctt cttgcccctt gggcctcccc ccagcccctc ctccccttcc tgcacccgta 540 cccccgtggt ctttgaataa agtctgagtg ggcggc 576 <210> 2 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly 1 5 10 15 Lys Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg 20 25 30 Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp 35 40 45 Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala 50 55 60 Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala 65 70 75 80 Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro 85 90 95 Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala 100 105 110 His Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys 115 120 125 Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg 130 135 140 <210> 3 <211> 142 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Met Val Leu Ser Gly Glu Asp Lys Ser Asn Ile Lys Ala Ala Trp Gly 1 5 10 15 Lys Ile Gly Gly His Gly Ala Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg 20 25 30 Met Phe Ala Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp 35 40 45 Val Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala 50 55 60 Asp Ala Leu Ala Asn Ala Ala Gly His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala 65 70 75 80 Leu Ser Ala Leu 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Pro Cys Ser Glu Asn Leu 370 375 380 Ser Gly Pro Gly Asp Ser Val Asp Pro Ala Thr Met Asp Glu Gly Ser 385 390 395 400 Glu Thr Ser Ser Cys Pro Ser Asp Leu Ala Ser Lys Pro Arg Pro Glu 405 410 415 Gly Thr Ser Pro Ser Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser Ser 420 425 430 Lys Leu Leu Cys Pro Arg Ala Leu Pro Pro Glu Leu Pro Pro Thr Pro 435 440 445 Pro His Leu Lys Tyr Leu Tyr Leu Val Val Ser Asp Ser Gly Ile Ser 450 455 460 Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Gln Gly Val His Gly Asp Ser Ser 465 470 475 480 Asp Gly Pro Tyr Ser His Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Val Pro Asp Thr 485 490 495 Glu Pro Leu Arg Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser 500 505 <210> 32 <211> 452 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 32 Met Asp Gln Leu Arg Val Ala Arg Trp Pro Arg Val Ser Pro Leu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Ser Ser Pro Ser Leu Pro Asp 20 25 30 Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ser Arg Gly Ser Glu 35 40 45 Glu Leu Leu Cys Phe Thr Gln Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp 50 55 60 Glu Glu Ala Ala 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Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser Pro 275 280 285 Glu Asn Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn Phe Gln 290 295 300 Leu Trp Leu Leu Gln Arg Asp Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro Ser Ser 305 310 315 320 Pro Phe Pro Glu Asp Pro Pro Ala His Leu Glu Val Leu Ser Glu Arg 325 330 335 His Trp Gly Val Thr Gln Ala Gly Asp Ala Gly Ala Glu Asp Lys Gly 340 345 350 Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser Glu Arg Ala Gln Asp Thr Tyr Leu 355 360 365 Val Leu Asp Glu Trp Leu Leu Pro Arg Cys Pro Cys Ser Glu Asn Leu 370 375 380 Ser Gly Pro Gly Asp Ser Val Asp Pro Ala Thr Met Asp Glu Gly Ser 385 390 395 400 Glu Thr Ser Ser Cys Pro Ser Asp Leu Ala Ser Lys Pro Arg Pro Glu 405 410 415 Gly Thr Ser Pro Ser Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser Ser 420 425 430 Lys Leu Leu Cys Pro Arg Ala Leu Pro Pro Glu Leu Pro Pro Thr Pro 435 440 445 Pro His Leu Lys 450 <210> 33 <211> 424 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 33 Met Asp Gln Leu Arg Val Ala Arg Trp Pro Arg Val Ser Pro Leu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Ser Ser Pro Ser Leu Pro Asp 20 25 30 Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ser Arg Gly Ser Glu 35 40 45 Glu Leu Leu Cys Phe Thr Gln Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp 50 55 60 Glu Glu Ala Ala Asn Ser Gly Met Gly Phe Asn Tyr Ser Phe Ser Tyr 65 70 75 80 Gln Leu Glu Gly Glu Ser Arg Lys Ser Cys Arg Leu His Gln Ala Pro 85 90 95 Thr Val Arg Gly Ser Met Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp 100 105 110 Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Gln Val Thr Glu Ala Ser Gly 115 120 125 Ser Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu 130 135 140 Asp Ala Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Glu Glu Gly Ser His 145 150 155 160 Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Met Thr Thr His 165 170 175 Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Arg Ala Gly Gly Thr 180 185 190 Gln Arg Val Glu Val Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser Asn 195 200 205 Leu Arg Gly Gly Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met Ala 210 215 220 Glu Pro Ser Phe Ser Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Ala Ser 225 230 235 240 Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr Leu Ser Leu 245 250 255 Ile Leu Val Leu Ile Ser Leu Leu Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser 260 265 270 His Arg Arg Ala Leu Arg Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser Pro 275 280 285 Glu Asn Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn Phe Gln 290 295 300 Leu Trp Leu Leu Gln Arg Asp Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro Ser Ser 305 310 315 320 Pro Phe Pro Glu Asp Pro Pro Ala His Leu Glu Val Leu Ser Glu Arg 325 330 335 His Trp Gly Val Thr Gln Ala Gly Asp Ala Gly Ala Glu Asp Lys Gly 340 345 350 Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser Glu Arg Ala Gln Asp Thr Tyr Leu 355 360 365 Val Leu Asp Glu Trp Leu Leu Pro Arg Cys Pro Cys Ser Glu Asn Leu 370 375 380 Ser Gly Pro Gly Asp Ser Val Asp Pro Ala Thr Met Asp Glu Gly Ser 385 390 395 400 Glu Thr Ser Ser Cys Pro Ser Asp Leu Ala Ser Lys Pro Arg Pro Glu 405 410 415 Gly Thr Ser Pro Ser Ser Phe Glu 420 <210> 34 <211> 483 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 34 Ala Ser Ser Pro Ser Leu Pro Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ala Ser Arg Gly Ser Glu Glu Leu Leu Cys Phe Thr Gln Arg 20 25 30 Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp Glu Glu Ala Ala Asn Ser Gly Met 35 40 45 Gly Phe Asn Tyr Ser Phe Ser Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Ser Arg Lys 50 55 60 Ser Cys Arg Leu His Gln Ala Pro Thr Val Arg Gly Ser Met Arg Phe 65 70 75 80 Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu 85 90 95 Leu Gln Val Thr Glu Ala Ser Gly Ser Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile 100 105 110 His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu Asp Ala Pro Ala Gly Leu Leu Ala 115 120 125 Arg Arg Ala Glu Glu Gly Ser His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro 130 135 140 Pro Gly Ala Pro Met Thr Thr His Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser 145 150 155 160 Ala Gly Asn Arg Ala Gly Gly Thr Gln Arg Val Glu Val Leu Glu Gly 165 170 175 Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser Asn Leu Arg Gly Gly Thr Arg Tyr Thr 180 185 190 Phe Ala Val Arg Ala Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Ser Gly Phe Trp 195 200 205 Ser Ala Trp Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp 210 215 220 Pro Leu Ile Leu Thr Leu Ser Leu Ile Leu Val Leu Ile Ser Leu Leu 225 230 235 240 Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser His Arg Arg Ala Leu Arg Gln Lys 245 250 255 Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser Pro Glu Asn Glu Phe Glu Gly Leu Phe 260 265 270 Thr Thr His Lys Gly Asn Phe Gln Leu Trp Leu Leu Gln Arg Asp Gly 275 280 285 Cys Leu Trp Trp Ser Pro Ser Ser Pro Phe Pro Glu Asp Pro Pro Ala 290 295 300 His Leu Glu Val Leu Ser Glu Arg His Trp Gly Val Thr Gln Ala Gly 305 310 315 320 Asp Ala Gly Ala Glu Asp Lys Gly Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser 325 330 335 Glu Arg Ala Gln Asp Thr Tyr Leu Val Leu Asp Glu Trp Leu Leu Pro 340 345 350 Arg Cys Pro Cys Ser Glu Asn Leu Ser Gly Pro Gly Asp Ser Val Asp 355 360 365 Pro Ala Thr Met Asp Glu Gly Ser Glu Thr Ser Ser Cys Pro Ser Asp 370 375 380 Leu Ala Ser Lys Pro Arg Pro Glu Gly Thr Ser Pro Ser Ser Phe Glu 385 390 395 400 Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser Ser Lys Leu Leu Cys Pro Arg Ala Leu 405 410 415 Pro Pro Glu Leu Pro Pro Thr Pro Pro His Leu Lys Tyr Leu Tyr Leu 420 425 430 Val Val Ser Asp Ser Gly Ile Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Gly Ser 435 440 445 Gln Gly Val His Gly Asp Ser Ser Asp Gly Pro Tyr Ser His Pro Tyr 450 455 460 Glu Asn Ser Leu Val Pro Asp Thr Glu Pro Leu Arg Pro Ser Tyr Val 465 470 475 480 Ala Cys Ser <210> 35 <211> 428 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 35 Ala Ser Ser Pro Ser Leu Pro Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ala Ser Arg Gly Ser Glu Glu Leu Leu Cys Phe Thr Gln Arg 20 25 30 Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp Glu Glu Ala Ala Asn Ser Gly Met 35 40 45 Gly Phe Asn Tyr Ser Phe Ser Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Ser Arg Lys 50 55 60 Ser Cys Arg Leu His Gln Ala Pro Thr Val Arg Gly Ser Met Arg Phe 65 70 75 80 Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu 85 90 95 Leu Gln Val Thr Glu Ala Ser Gly Ser Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile 100 105 110 His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu Asp Ala Pro Ala Gly Leu Leu Ala 115 120 125 Arg Arg Ala Glu Glu Gly Ser His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro 130 135 140 Pro Gly Ala Pro Met Thr Thr His Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser 145 150 155 160 Ala Gly Asn Arg Ala Gly Gly Thr Gln Arg Val Glu Val Leu Glu Gly 165 170 175 Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser Asn Leu Arg Gly Gly Thr Arg Tyr Thr 180 185 190 Phe Ala Val Arg Ala Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Ser Gly Phe Trp 195 200 205 Ser Ala Trp Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp 210 215 220 Pro Leu Ile Leu Thr Leu Ser Leu Ile Leu Val Leu Ile Ser Leu Leu 225 230 235 240 Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser His Arg Arg Ala Leu Arg Gln Lys 245 250 255 Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser Pro Glu Asn Glu Phe Glu Gly Leu Phe 260 265 270 Thr Thr His Lys Gly Asn Phe Gln Leu Trp Leu Leu Gln Arg Asp Gly 275 280 285 Cys Leu Trp Trp Ser Pro Ser Ser Pro Phe Pro Glu Asp Pro Pro Ala 290 295 300 His Leu Glu Val Leu Ser Glu Arg His Trp Gly Val Thr Gln Ala Gly 305 310 315 320 Asp Ala Gly Ala Glu Asp Lys Gly Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser 325 330 335 Glu Arg Ala Gln Asp Thr Tyr Leu Val Leu Asp Glu Trp Leu Leu Pro 340 345 350 Arg Cys Pro Cys Ser Glu Asn Leu Ser Gly Pro Gly Asp Ser Val Asp 355 360 365 Pro Ala Thr Met Asp Glu Gly Ser Glu Thr Ser Ser Cys Pro Ser Asp 370 375 380 Leu Ala Ser Lys Pro Arg Pro Glu Gly Thr Ser Pro Ser Ser Phe Glu 385 390 395 400 Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser Ser Lys Leu Leu Cys Pro Arg Ala Leu 405 410 415 Pro Pro Glu Leu Pro Pro Thr Pro Pro His Leu Lys 420 425 <210> 36 <211> 400 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 36 Ala Ser Ser Pro Ser Leu Pro Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ala Ser Arg Gly Ser Glu Glu Leu Leu Cys Phe Thr Gln Arg 20 25 30 Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp Glu Glu Ala Ala Asn Ser Gly Met 35 40 45 Gly Phe Asn Tyr Ser Phe Ser Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Ser Arg Lys 50 55 60 Ser Cys Arg Leu His Gln Ala Pro Thr Val Arg Gly Ser Met Arg Phe 65 70 75 80 Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu 85 90 95 Leu Gln Val Thr Glu Ala Ser Gly Ser Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile 100 105 110 His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu Asp Ala Pro Ala Gly Leu Leu Ala 115 120 125 Arg Arg Ala Glu Glu Gly Ser His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro 130 135 140 Pro Gly Ala Pro Met Thr Thr His Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser 145 150 155 160 Ala Gly Asn Arg Ala Gly Gly Thr Gln Arg Val Glu Val Leu Glu Gly 165 170 175 Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser Asn Leu Arg Gly Gly Thr Arg Tyr Thr 180 185 190 Phe Ala Val Arg Ala Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Ser Gly Phe Trp 195 200 205 Ser Ala Trp Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp 210 215 220 Pro Leu Ile Leu Thr Leu Ser Leu Ile Leu Val Leu Ile Ser Leu Leu 225 230 235 240 Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser His Arg Arg Ala Leu Arg Gln Lys 245 250 255 Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser Pro Glu Asn Glu Phe Glu Gly Leu Phe 260 265 270 Thr Thr His Lys Gly Asn Phe Gln Leu Trp Leu Leu Gln Arg Asp Gly 275 280 285 Cys Leu Trp Trp Ser Pro Ser Ser Pro Phe Pro Glu Asp Pro Pro Ala 290 295 300 His Leu Glu Val Leu Ser Glu Arg His Trp Gly Val Thr Gln Ala Gly 305 310 315 320 Asp Ala Gly Ala Glu Asp Lys Gly Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser 325 330 335 Glu Arg Ala Gln Asp Thr Tyr Leu Val Leu Asp Glu Trp Leu Leu Pro 340 345 350 Arg Cys Pro Cys Ser Glu Asn Leu Ser Gly Pro Gly Asp Ser Val Asp 355 360 365 Pro Ala Thr Met Asp Glu Gly Ser Glu Thr Ser Ser Cys Pro Ser Asp 370 375 380 Leu Ala Ser Lys Pro Arg Pro Glu Gly Thr Ser Pro Ser Ser Phe Glu 385 390 395 400 <210> 37 <211> 61 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 37 atcgatttgc tgccccctag cgggggaggg acgtaattac atccctgggt ctagacagct 60 g 61 <210> 38 <211> 49 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 38 tgc tgccccctag cgggggaggg acgtaattac atccctggg 49

Claims (133)

  1. a) 좌측(5') 레트로바이러스 LTR;
    b) 목적 유전자에 작동적으로 연결된 조혈 세포 발현 조절 서열;
    c) 절단된 에리트로포이에틴 수용체(tEpoR)에 작동적으로 연결된 편재(ubiquitous) 발현 조절 서열; 및
    d) 우측(3') 레트로바이러스 LTR을 포함하는 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조혈 세포 발현 조절 서열이 조혈 줄기 세포 프로모터 또는 조혈 전구 세포 프로모터인, 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조혈 세포 발현 조절 서열이 적혈구 세포 특이적 프로모터 및 임의로 적혈구 세포 특이적 인핸서를 포함하는, 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조혈 세포 발현 조절 서열이 인간 β-글로빈 프로모터; 인간 β-글로빈 LCR; 및 인간 α-글로빈 HS40 인핸서 및 안키린-1(ankyrin-1) 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 편재 발현 조절 서열이 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 유전자 프로모터(CMV), 신장 인자 1 알파 프로모터(EF1-α), 포스포글리세레이트 키나제-1 프로모터(PGK), 유비퀴틴-C 프로모터(UBQ-C), 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 프로모터(CAG), 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제 프로모터(MC1), 베타 액틴 프로모터(β-ACT) 및 유인원 바이러스 40 프로모터(SV40)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 목적 유전자가 인간 β-글로빈, 인간 δ-글로빈 및 인간 γ-글로빈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 인간 β-글로빈 유전자가 코돈 87에서 트레오닌이 글루타민으로 돌연변이 된 것을 인코딩하는 인간 βA-글로빈 유전자((βA - T87Q)), 또는 인간 βA-글로빈 유전자인, 벡터.
  8. 제1항에 있어서, 상기 tEpoR가 C-말단 절단(truncation)을 포함하는, 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 상기 C-말단 절단이 내인성 에리트로포이에틴 수용체(EpoR)와 비교하여 tEpoR의 대사회전(turnover)을 감소시키는, 벡터.
  10. 제8항에 있어서, 상기 C-말단 절단이 내인성 에리트로포이에틴 수용체(EpoR)와 비교하여 tEpoR의 반감기를 증가시키는, 벡터.
  11. a) 좌측(5') 레트로바이러스 LTR;
    b) 목적 유전자에 작동적으로 연결된 제1 적혈구 세포 특이적 발현 조절 서열;
    c) tEpoR에 작동적으로 연결된 제2 적혈구 세포 특이적 발현 조절 서열; 및
    d) 우측(3') 레트로바이러스 LTR을 포함하는, 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 적혈구 세포 특이적 발현 조절 서열이 인간 β-글로빈 프로모터; 인간 β-글로빈 LCR; 및 인간 α-글로빈 HS40 인핸서 및 안키린-1 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 벡터.
  13. 제11항에 있어서, 상기 제2 적혈구 세포 특이적 발현 조절 서열이 인간 β-글로빈 프로모터; 인간 β-글로빈 LCR; 및 인간 α-글로빈 HS40 인핸서 및 안키린-1 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 벡터.
  14. 제11항에 있어서, 상기 목적 유전자가 인간 β-글로빈, 인간 δ-글로빈 및 인간 γ-글로빈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 상기 인간 β-글로빈 유전자가 야생형 인간 β-글로빈 유전자, 인트론 서열의 하나 이상의 결실을 포함하는 결실된 인간 β-글로빈 유전자, 및 적어도 하나의 항겸상(antisickling) 아미노산 잔기를 인코딩하는 돌연변이된 인간 β-글로빈 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 벡터
  16. 제15항에 있어서, 상기 인간 β-글로빈 유전자가 코돈 87에서 트레오닌이 글루타민으로 돌연변이 된 것을 인코딩하는 인간 βA-글로빈 유전자((βA - T87Q)) 또는 인간 βA-글로빈 유전자인, 벡터.
  17. 제11항에 있어서, 상기 tEpoR이 C-말단 절단을 포함하는, 벡터.
  18. 제11항에 있어서, 상기 tEpoR이 약 10 내지 약 100개 아미노산의 C-말단 절단을 포함하는, 벡터.
  19. 제11항에 있어서, 상기 tEpoR이 50 내지 60개 아미노산의 C-말단 절단을 포함하는, 벡터.
  20. 제11항에 있어서, 상기 tEpoR이 80 내지 90개 아미노산의 C-말단 절단을 포함하는, 벡터.
  21. 제11항에 있어서, 상기 tEpoR이 85 내지 95개 아미노산의 C-말단 절단을 포함하는, 벡터.
  22. 제11항에 있어서, 상기 tEpoR이 약 55, 약 83 또는 약 91개 아미노산의 C-말단 절단을 포함하는, 벡터.
  23. a) 좌측(5') 레트로바이러스 LTR;
    b) 목적 유전자에 작동적으로 연결된 β-글로빈 프로모터 및 β-글로빈 유전자좌 조절 영역(LCR);
    c) 절단된 에리트로포이에틴 수용체(tEpoR)에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열; 및
    d) 우측(3') 레트로바이러스 LTR을 포함하는, 벡터.
  24. 제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  25. 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 5' LTR 또는 3' LTR이 렌티바이러스 LTR인, 벡터.
  26. 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 5' LTR 및 3' LTR이 렌티바이러스 LTR들인, 벡터.
  27. 제24항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스가 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1), 인간 면역결핍 바이러스 유형 2(HIV-2), 비스나(visna) 바이러스, 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 소 면역결핍 바이러스(BIV) 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 벡터.
  28. 제24항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스가 HIV-1인, 벡터.
  29. 제1항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 5' LTR의 프로모터가 이종성 프로모터로 치환되어 있는, 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 상기 이종성 프로모터가 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 루스(Rous) 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 티미딘 키나제 프로모터 또는 유인원 바이러스 40(SV40) 프로모터인, 벡터.
  31. 제1항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 3' LTR이 하나 이상의 변형을 포함하는, 벡터.
  32. 제1항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 3' LTR이 하나 이상의 결실을 포함하는, 벡터.
  33. 제1항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 3' LTR이 자가-불활성화(SIN) LTR인, 벡터.
  34. 제23항에 있어서, 상기 β-글로빈 프로모터가 인간 β-글로빈 프로모터인, 벡터.
  35. 제23항에 있어서, 상기 β-글로빈 LCR이 인간 β-글로빈 LCR로부터 하나 이상의 DNAase I 과민 부위 2, 3 및 4를 포함하는, 벡터.
  36. 제23항에 있어서, 상기 목적 유전자가 글로빈 유전자인, 벡터.
  37. 제36항에 있어서, 상기 글로빈 유전자가 인간 β-글로빈, 인간 δ-글로빈 및 인간 γ-글로빈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 벡터.
  38. 제37항에 있어서, 상기 인간 β-글로빈 유전자가 야생형 인간 β-글로빈 유전자, 인트론 서열의 하나 이상의 결실을 포함하는 결실된 인간 β-글로빈 유전자, 및 적어도 하나의 항겸상 아미노산 잔기를 인코딩하는 돌연변이된 인간 β-글로빈 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 벡터.
  39. 제37항에 있어서, 상기 인간 β-글로빈 유전자가 코돈 87에서 트레오닌이 글루타민으로 돌연변이 된 것을 인코딩하는 인간 βA-글로빈 유전자((βA - T87Q)) 또는 인간 βA-글로빈 유전자인, 벡터.
  40. 제23항에 있어서, 인간 β-글로빈 3' 인핸서 요소를 추가로 포함하는, 벡터.
  41. 제23항에 있어서, 상기 발현 조절 서열이 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 유전자 프로모터(CMV), 신장 인자 1 알파 프로모터(EF1-α), 포스포글리세레이트 키나제-1 프로모터(PGK), 유비퀴틴-C 프로모터(UBQ-C), 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 프로모터(CAG), 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제 프로모터(MC1), 베타 액틴 프로모터(β-ACT ) 및 유인원 바이러스 40 프로모터(SV40)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 편재 발현 조절 서열인, 벡터.
  42. 제23항에 있어서, 상기 발현 조절 서열이, 인간 β-글로빈 프로모터, 인간 β-글로빈 LCR; 및 인간 α-글로빈 HS40 인핸서 및 안키린-1 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적혈구 특이적 발현 조절 서열인, 벡터.
  43. 제23항에 있어서, 상기 적혈구 특이적 발현 조절 서열이 인간 α-글로빈 HS40 인핸서 및 안키린-1 프로모터를 포함하는, 벡터.
  44. 제1항 내지 제43항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 Psi 팩키징 서열(Ψ+), 중앙 폴리퓨린관/DNA 피판(flap)(cPPT/FLAP), 레트로바이러스 엑스포트(export) 요소, 전사후 조절 요소, 절연 요소, 폴리아데닐화 서열, 선택가능한 마커 및 세포 자살 유전자를 추가로 포함하는, 벡터.
  45. 제1항 내지 제43항 중의 어느 한 항에 있어서, Psi 팩키징 서열(Ψ+), 중앙 폴리퓨린관/DNA 피판(cPPT/FLAP), 레트로바이러스 엑스포트 요소, 절연 요소 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는, 벡터.
  46. 제1항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 레트로바이러스 엑스포트 요소가 rev 반응 요소(RRE)인, 벡터.
  47. 제1항 내지 제46항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 cPPT/FLAP가 HIV-1로부터 인 것인, 벡터.
  48. 제1항 내지 제46항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 목적 유전자가 최적화된 코작 서열을 포함하는, 벡터.
  49. 제23항에 있어서, 상기 tEpoR가 최적화된 코작 서열을 포함하는, 벡터.
  50. 제1항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 최적 코작 서열이 (GCC)RCCATGG이고, R이 퓨린(A 또는 G)인, 벡터.
  51. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 3' LTR이 적어도 하나의 절연 요소를 포함하는, 벡터.
  52. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 3' LTR이 2개의 절연 요소를 포함하는, 벡터.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 서열번호 37의 뉴클레오티드 8-49에 기재된 절연 서열을 포함하는, 벡터.
  54. 제51항 또는 제52항에 있어서, 서열번호 38에 기재된 절연 서열을 포함하는, 벡터.
  55. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 서열이 AATAAA, ATTAAA, AGTAAA, 소 성장 호르몬 폴리A 서열(BGHpA) 및 토끼 β-글로빈 폴리A 서열(rβgpA)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 벡터.
  56. 제23항에 있어서, 상기 tEpoR이 C-말단 절단을 포함하는, 벡터.
  57. 제23항에 있어서, 상기 tEpoR이 약 10 내지 약 100개 아미노산의 C-말단 절단을 포함하는, 벡터.
  58. 제23항에 있어서, 상기 tEpoR이 50 내지 60개 아미노산의 C-말단 절단을 포함하는, 벡터.
  59. 제23항에 있어서, 상기 tEpoR이 80 내지 90개 아미노산의 C-말단 절단을 포함하는, 벡터.
  60. 제23항에 있어서, 상기 tEpoR이 85 내지 95개 아미노산의 C-말단 절단을 포함하는, 벡터.
  61. 제23항에 있어서, 상기 tEpoR이 약 55개, 약 83개 또는 약 91개 아미노산의 C-말단 절단을 포함하는, 벡터.
  62. a) 좌측(5') 레트로바이러스 LTR;
    b) Psi 팩키징 서열(Ψ+);
    c) 중앙 폴리퓨린관/DNA 피판(cPPT/FLAP);
    d) 레트로바이러스 엑스포트 요소;
    e) 목적 유전자에 작동적으로 연결된 β-글로빈 프로모터 및 β-글로빈 유전자좌 조절 영역(LCR);
    f) 절단된 에리트로포이에틴 수용체(tEpoR)에 작동적으로 연결된 적혈구 세포 특이적 발현 조절 서열; 및
    g) i) 하나 이상의 절연 요소 또는 ii) 폴리아데닐화 서열을 포함하는 우측(3') 레트로바이러스 LTR을 포함하는 벡터.
  63. a) 좌측(5') HIV-1 LTR;
    b) Psi 팩키징 서열(Ψ+);
    c) HIV-1 중앙 폴리퓨린관/DNA 피판(cPPT/FLAP);
    d) rev 반응 요소(RRE);
    e) 목적 유전자에 작동적으로 연결된 β-글로빈 프로모터 및 β-글로빈 유전자좌 조절 영역(LCR);
    f) 절단된 에리트로포이에틴 수용체(tEpoR)에 작동적으로 연결된 적혈구 세포 특이적 발현 조절 서열; 및
    g) i) 하나 이상의 절연 요소 및 ii) 토끼 β-글로빈 폴리A 서열(rβgpA)을 포함하는 우측(3') 레트로바이러스 LTR을 포함하는, 레트로바이러스 벡터.
  64. 제1항 내지 제63항 중의 어느 한 항의 벡터를 포함하는 조성물.
  65. 제64항에 있어서, 세포를 포함하는, 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 상기 세포가 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 성인 전구 세포 및 분화된 성체 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  67. 제65항에 있어서, 상기 세포가 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포인, 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 상기 줄기 세포 또는 전구 세포의 공급원이 골수, 제대혈, 태반 혈액 또는 말초 혈액인, 조성물.
  69. 제65항에 있어서, 상기 세포가 벡터로 형질도입되는, 조성물.
  70. 제65항에 있어서, 상기 벡터가 에피솜 벡터이거나, 세포의 게놈에 통합되지 않는, 조성물.
  71. 제65항에 있어서, 상기 벡터가 세포의 게놈에 통합되는, 조성물.
  72. 제71항에 있어서, 상기 통합이 게놈 내의 위치에 표적화되는, 조성물.
  73. 제1항 내지 제63항 중의 어느 한 항에 따르는 벡터로 형질도입된 세포를 포함하는 세포 모집단을 투여하는 것을 포함하는, 형질도입된 세포를 대상체에게 제공하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 형질도입된 세포가 조혈 줄기 세포를 포함하는, 방법.
  75. 제73항에 있어서, 상기 형질도입된 세포가 조혈 전구 세포를 포함하는, 방법.
  76. 제73항 내지 제75항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 모집단이 제1항 내지 제63항 중의 어느 한 항에 따르는 벡터로 형질도입된 5% 세포를 포함하는, 방법.
  77. 제73항 내지 제75항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 모집단이 제1항 내지 제63항 중의 어느 한 항에 따르는 벡터로 형질도입된 10% 세포를 포함하는, 방법.
  78. 제73항 내지 제75항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 모집단이 제1항 내지 제63항 중의 어느 한 항에 따르는 벡터로 형질도입된 25% 세포를 포함하는, 방법.
  79. 제73항 내지 제78항 중의 어느 한 항에 있어서, 에리트로포이에틴을 상기 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 세포의 모집단 및 에리트로포이에틴이 비경구적으로 투여되는, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 비경구 투여가 정맥내 투여인, 방법.
  82. 제79항에 있어서, 상기 세포의 모집단이, 에리트로포이에틴을 대상체에게 투여하기 전에, 대상체에게 투여되는, 방법.
  83. 제73항에 있어서, 상기 대상체가 이상헤모글로빈증(hemoglobinopathy)을 갖는, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 이상헤모글로빈증이 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상 세포 질환(SCD), 겸상 세포 빈혈, 유전성 빈혈, 지중해빈혈, β-지중해빈혈, 종중성 지중해빈혈, 중간성 지중해빈혈, α-지중해빈혈 및 헤모글로빈 H 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  85. 제23항, 제62항 또는 제63항 중의 어느 한 항에 따르는 벡터로 형질도입된 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 세포 모집단을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 이상헤모글로빈증을 치료하는 방법으로서,
    상기 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포, 또는 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 자손 세포가, 에리트로포이에틴의 투여 전의 대상체에서 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포 또는 자손 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴의 투여 후의 대상체에서 증가되는, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 세포 모집단이 골수, 제대혈, 태반 혈액 또는 말초 혈액으로부터 단리되는, 방법.
  87. 제85항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 5%가 형질도입되어 있는, 방법.
  88. 제85항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 10%가 형질도입되어 있는, 방법.
  89. 제85항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 25%가 형질도입되어 있는, 방법.
  90. 제85항에 있어서, 에리트로포이에틴을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 세포 모집단 및 에리트로포이에틴이 혈관내 투여되는, 방법.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 상기 투여가 정맥내인, 방법.
  93. 제85항 또는 제90항에 있어서, 상기 이상헤모글로빈증이 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상 세포 질환(SCD), 겸상 세포 빈혈, 유전성 빈혈, 지중해빈혈, β-지중해빈혈, 종중성 지중해빈혈, 중간성 지중해빈혈, α-지중해빈혈 및 헤모글로빈 H 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  94. 제85항 또는 제90항에 있어서, 상기 이상헤모글로빈증이 β-지중해빈혈인, 방법.
  95. 제85항 또는 제90항에 있어서, 상기 대상체가 골수 절제 화학치료 또는 방사선조사를 받았거나 받고 있는, 방법.
  96. 제85항 또는 제90항에 있어서, 상기 대상체에서 증가된 자손 세포가 적혈구 세포를 포함하는, 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 적혈구 세포가 적혈구 전구 세포인, 방법.
  98. 제96항에 있어서, 상기 적혈구 세포가 적혈구인, 방법.
  99. 제96항에 있어서, 상기 적혈구 세포가, 에리트로포이에틴 투여 전의 대상체에서 적혈구 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 후에 적어도 10배 증가되는, 방법.
  100. 제96항에 있어서, 상기 적혈구 세포가, 에리트로포이에틴 투여 전의 대상체에서 적혈구 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 후에 적어도 25배 증가되는, 방법.
  101. 제96항에 있어서, 상기 적혈구 세포가, 에리트로포이에틴 투여 전의 대상체에서 적혈구 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 후에 적어도 50배 증가되는, 방법.
  102. 제96항에 있어서, 상기 적혈구 세포가, 에리트로포이에틴 투여 전의 대상체에서 적혈구 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 후에 적어도 100배 증가되는, 방법.
  103. 제96항에 있어서, 상기 적혈구 세포가 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 비-적혈구 세포와 비교하여 적어도 25배 증가되는, 방법.
  104. 제96항에 있어서, 상기 적혈구 세포가 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 비-적혈구 세포와 비교하여 적어도 50배 증가되는, 방법.
  105. 제96항에 있어서, 상기 적혈구 세포가 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 비-적혈구 세포와 비교하여 적어도 100배 증가되는, 방법.
  106. 제96항에 있어서, 상기 적혈구 세포가 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 비-적혈구 세포와 비교하여 적어도 150배 증가되는, 방법.
  107. 제23항, 제62항 또는 제63항 중의 어느 한 항에 따르는 벡터로 형질도입된 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 세포 모집단을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 적혈구 세포 수를 선택적으로 확장시키는 방법으로서,
    상기 조혈 줄기 세포의 적혈구 자손 세포 수가 대상체에서 확장되는, 방법.
  108. 제23항, 제62항 또는 제63항 중의 어느 한 항에 따르는 벡터로 형질도입된 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함하는 세포 모집단을 투여하고 에리트로포이에틴을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 백혈구 세포와 비교하여 적혈구 세포의 비율을 증가시키는 방법으로서,
    상기 조혈 줄기 세포의 적혈구 자손 세포의 비율이 대상체에서 조혈 줄기 세포의 백혈구 자손 세포와 비교하여 증가되는, 방법.
  109. 제107항에 있어서, 에리트로포이에틴을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  110. 제108항에 있어서, 에리트로포이에틴을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  111. 제107항 내지 제110항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 모집단이 골수, 제대혈, 태반 혈액 또는 말초 혈액으로부터 단리되는, 방법.
  112. 제107항 내지 제110항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 5%가 형질도입되어 있는, 방법.
  113. 제107항 내지 제110항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 10%가 형질도입되어 있는, 방법.
  114. 제107항 내지 제110항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포의 25%가 형질도입어 있는, 방법.
  115. 제107항 내지 제110항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 모집단 및 에리트로포이에틴이 혈관내 투여되는, 방법.
  116. 제107항 내지 제110항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 정맥내인, 방법.
  117. 제107항 내지 제110항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 이상헤모글로빈증을 갖는, 방법.
  118. 제117항에 있어서, 상기 이상헤모글로빈증이 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상 세포 질환(SCD), 겸상 적혈구 빈혈, 유전성 빈혈, 지중해빈혈, β-지중해빈혈, 종중성 지중해빈혈, 중간성 지중해빈혈, α-지중해빈혈 및 헤모글로빈 H 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
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  120. 제107항 내지 제110항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 골수 절제 화학치료 또는 방사선조사를 받았거나 받고 있는, 방법.
  121. 제109항에 있어서, 상기 적혈구 자손 세포가, 에리트로포이에틴 투여 전의 대상체에서 적혈구 자손 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 후에 적어도 10배 증가되는, 방법.
  122. 제109항에 있어서, 상기 적혈구 자손 세포가, 에리트로포이에틴 투여 전의 대상체에서 적혈구 자손 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 후에 적어도 25배 증가되는, 방법.
  123. 제109항에 있어서, 상기 적혈구 자손 세포가, 에리트로포이에틴 투여 전의 대상체에서 적혈구 자손 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 후에 적어도 50배 증가되는, 방법.
  124. 제109항에 있어서, 상기 적혈구 자손 세포가, 에리트로포이에틴 투여 전의 대상체에서 적혈구 자손 세포와 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 후에 적어도 100배 증가되는, 방법.
  125. 제109항에 있어서, 상기 적혈구 자손 세포가 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 비-적혈구 세포와 비교하여 25배 증가되는, 방법.
  126. 제109항에 있어서, 상기 적혈구 자손 세포가 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 비-적혈구 세포와 비교하여 50배 증가되는, 방법.
  127. 제109항에 있어서, 상기 적혈구 자손 세포가 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 비-적혈구 세포와 비교하여 100배 증가되는, 방법.
  128. 제109항에 있어서, 상기 적혈구 자손 세포가 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 비-적혈구 세포와 비교하여 150배 증가되는, 방법.
  129. 제121항 내지 제128항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 적혈구 자손 세포가 적혈구를 포함하는, 방법.
  130. 제110항에 있어서, 상기 RBC가 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 WBC와 비교하여 적어도 25배 증가되는, 방법.
  131. 제110항에 있어서, 상기 RBC가 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 WBC와 비교하여 적어도 50배 증가되는, 방법.
  132. 제110항에 있어서, 상기 RBC가 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 WBC와 비교하여 적어도 100배 증가되는, 방법.
  133. 제110항에 있어서, 상기 RBC가 에리트로포이에틴 투여 후의 대상체에서 WBC와 비교하여 적어도 150배 증가되는, 방법.
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