KR20080042747A - 신규한 융합 단백질, 이를 발현하는 세포주 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 알부민과 인간 에리스로포이에틴(Erythropietin, EPO)이 링커에 의해 연결된 알부민-EPO 융합 단백질, 이를 발현하는 발현 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환되어 상기 융합 단백질을 고효율로 발현하는 재조합 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 에리스로포이에틴 융합 단백질은 GGSGG 반복 아미노산 서열을 가지는 링커를 포함하여 인간 EPO의 효력을 보장하는 유동성을 확보하였으며, 인간 알부민을 사용하여, 생산, 안정성 및 정제상의 이점을 갖는다. 본 발명의 융합 단백질은 기존의 EPO에 비해 생체 내 반감기가 3배 이상 증가되었으며, 적혈구 전구세포 형성을 촉진하는 능력이 월등하다. 따라서 본 발명의 융합 단백질은 빈혈의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.
에리스로포이에틴, 인간 알부민, 융합 단백질, 링커

Description

신규한 융합 단백질, 이를 발현하는 세포주 및 이의 제조 방법{A novel fusion protein, cell lines expressing the same and preparation method thereof}
본 발명은 인간 알부민과 인간 에리스로포이에틴(Erythropietin, EPO)이 링커에 의해 연결된 알부민-EPO 융합 단백질, 이를 발현하는 발현 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환되어 상기 융합 단백질을 고효율로 발현하는 재조합 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
적혈구의 생성(Erythropoiesis)은 일정 시간 후 파괴되는 적혈구를 보충하기 위해 인체 내에서 일생 동안 지속적으로 일어난다. 적혈구 조혈은 적절한 조직 산소화에는 충분하지만 혈액 순환을 방해하지는 않는 수의 적혈구가 혈액 내에 존재하도록 매우 정확히 조절되는 생리적인 기작이다. 이러한 적혈구의 형성은 골수에서 EPO이라는 호르몬의 조절 하에 일어난다. EPO는 적혈구 전구세포의 수용체에 결합하여 적혈구의 생성 및 분화를 촉진하는 조혈인자로서, 세포내 칼슘이온 농도의 증가, DNA 생합성의 증가 및 헤모글로빈 생성 자극 등을 일으킨다. 따라서 이러한 EPO는 적혈구의 생성이 적거나 결핍된 것을 특징으로 하는 혈액 질환의 진단 및 치 료에 유용하게 사용될 수 있어 신장병 환자의 빈혈, 미숙아의 빈혈, 갑상선기능부전으로 인한 빈혈, 영양실조로 인한 빈혈 및 암, 류마티스 관절염, 만성 신장기능이상, 후천성 면역 결핍, 골수이식과 연관된 빈혈 등의 치료제로 사용된다(Carnot et al., Comp. Rend., 143:384, 1906, Winearles et al., Lancett, 22:1175, 1986, Winearles et al., Lancet, 22:1175, 1986).
EPO는 분자량 30,000 내지 34,000의 산성 당단백질이며, 3가지 형태, 즉 알파, 베타 및 아시알로(asialo) 형태로 생성될 수 있다. EPO는 아미노산 Asn 24, Asn 38 및 Asn 83의 위치에서 3개의 N 연결 당쇄와 Ser 126 위치에 하나의 뮤신형(mucin-type) O-연결 당쇄를 가지며, 단백질 부분만의 분자량은 약 18,000으로 고유의 등전점을 갖는다(Wang et al., Encocrionology, 116, 2286, 1985). 이러한 EPO의 생체내 활성도는 생체내 반감기와 비례한다. 생체 내에서의 반감기는 EPO가 갖는 당쇄의 말단에 위치하는 시알산(sialic acid)의 함량과 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 EPO의 생체내 활성은 당쇄의 존재에 의해 크게 좌우된다. 그러므로 당화능이 전혀 없는 대장균이나, 당화능은 있지만 주로 만노즈형(mannose)의 당단백질을 생성하는 효모나 곤충세포의 경우에는 인간 EPO와 같은 시알산이 풍부한 당단백질을 생성시키기에는 그 기능성이 낮아 인간 EPO를 제조하기 위해서는 적절하지 못하다. 따라서, 인간의 당단백질과 유사한 구조를 가지며, 인체 내에서 항원성 등을 유발시키지 않고 안정하며 높은 생체내 활성을 나타낼 수 있는 당 구조를 생성하는 포유동물 세포주를 숙주세포로 선택하여야 한다. 기존의 대장균이나 효모와 같은 숙주세포에서 재조합 생산된 경우 생체 안정성이나 생물학 적 활성도를 갖지 않으므로 동물세포주인 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: 이하, CHO라 칭한다) 세포주에 형질감염시켜 재조합 단백질을 생산하는 것이 가장 적절한 것으로 알려져 있다.
하지만, 이러한 인간 EPO는 체내 투여 시 빠르게 제거되어 장시간에 걸쳐 효력을 나타내지 못한다. 특히 만성 신부전증 환자에서는 신장 사구체 내에서 걸러지지 않고 소변으로 배출되거나 혈액 내에서 항원으로 인식되어 소멸되고, 또한 간에서 만노즈 수용체에 의해 파괴된다. 따라서, 환자는 이와 같은 EPO 제제를 보다 빈번하게 투여 받아야 하는 어려움이 존재한다.
한편, 인간 알부민은 생체세포나 체액 중에 넓게 분포되어 있는 단순 단백질로서, 전체 단백질 중 약 60%를 차지하고 있고 혈장에 가장 풍부하게 존재하며 간에서 합성된다. 이는 혈장 콜라겐의 삼투압 유지, 독물 중화 및 산-염기 평형 유지에 관여하며 체내 안정성이 뛰어나고 반감기가 긴 단백질로 알려져 있다. 또한, 비특이적 결합을 통해 다수의 약물 또는 화학 물질을 운반하는 역할을 한다. 이러한 인간 알부민이 생리활성펩타이드와 연결되어 융합 단백질을 형성하는 경우, 결합된 생리활성펩타이드의 반감기를 증가시키는 것으로 알려져 있다(대한민국 등록 특허 제10-0227167호, 대한민국 공개 특허 제10-2004-0089609호 등).
이에, 본 발명자들은 EPO의 생체 내 활성도를 증진시킬 수 있는 새로운 방법을 개발하던 중, 인간 알부민 전체 또는 인간 알부민의 일부와 EPO를 연결하여 EPO 결합체를 제작하되, 이때 두 단백질을 GGSGG가 반복되는 아미노산 서열을 갖는 링커로 연결시킴으로써, EPO의 체내 수용체에의 결합을 방해하지 않도록 EPO와 알부 민의 두 단백질 사이를 물리적으로 분리시키고 또한 EPO 본래의 특성 및 단백질 3차 구조에의 영향을 최소화한 융합 단백질을 제조하였다. 이와 같이 제조된 융합 단백질은 유럽 표준품 EPO와 비교하여 동등 이상의 효력을 가지면서, 생체 내 반감기가 3배 이상 증가되었으며, 적혈구 생성 촉진 능력이 획기적으로 증가되었음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 인간 알부민과 인간 에리트로포이에틴이 (GGSGG)n의 아미노산 서열을 갖는 링커에 의해 연결된 알부민-EPO 융합 단백질(n=3 내지 5의 정수)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 세포주를 제작, 배양하여 상기 융합 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 포함하는 빈혈 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 사용된 단수 형태에는 하나의 지시 대상물을 직접적이고 명시적으로 제한하지 않는 한 복수 지시 대상물이 포함됨을 주지해야 한다.
용어 "또는" 은 명확하게 달리 언급하지 않는 한 용어 "및/또는"과 상호교환적으로 사용된다.
용어 "융합 단백질"은 2가지 이상의 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 융합 단백질은 별개의 단백질로부터 유래된 아미노산 부분들 간의 아미노산의 연결성 영역을 포함할 수도 있다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 부분 또는 전장의 단백질을 포함할 수 있는 단백질 분자를 기재하기 위해 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)이다. 이 용어는 단일 가닥 핵산, 이중 가닥 핵산, 및 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 유사체로부터 만든 RNA 및 DNA를 포함하기 위해 사용된다.
본 발명은 인간 알부민과 인간 에리트로포이에틴이 (GGSGG)n의 아미노산 서열을 갖는 링커에 의해 연결된 알부민-EPO 융합 단백질(n=3 내지 5의 정수)을 제공한다. 상기 n은 GGSGG의 아미노산 서열이 반복되는 회수를 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 상기 n은 4일 수 있다.
본 발명에서 "링커"는 2개의 단백질 또는 폴리펩타이드를 연결시켜주는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명에서 "인간 알부민"은 인간 알부민의 하나 또는 그 이상의 작용 활성(예, 생물학적 활성)을 갖는 전장 인간 알부민 단백질 또는 인간 알부민 단백질 의 부분, 또는 그들의 변이체를 모두 포함한다.
마찬가지로, 본 발명에서 "인간 EPO"는 인간 EPO의 하나 또는 그 이상의 작용 활성(예, 생물학적 활성)을 갖는 전장 인간 EPO 단백질 또는 인간 EPO 단백질의 부분, 또는 그들의 변이체를 모두 포함한다.
특히, 본 발명에서, 알부민 '부분'은 생체 내에서 비-융합 상태에 있는 EPO의 반감기에 비하여 융합 단백질 내의 EPO의 반감기를 생체 내에서 안정화하고 연장하기에 충분한 길이 또는 구조를 포함하는 알부민 부분을 말한다. 바람직하게는, 인간 알부민 부분은 전장 알부민의 N-말단으로부터 전장 알부민 길이의 약 1/3 이상을 포함하며, 더욱 바람직하게는 하나 이상의 도메인을 포함한 것이다. 인간 알부민 부분을 융합 단백질에 사용하는 경우, 전체 단백질의 분자량을 낮추고 재조합시의 수율도 개선할 수 있다는 측면에서 바람직할 수 있다.
단백질의 N-말단 또는 C-말단으로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산을 제거하면 EPO나 알부민 단백질 또는 융합 단백질의 하나 또는 그 이상의 생물학적 기능의 변형이나 손실을 야기할 수 있으나, 다른 치료활성 또는 기능 활성(예를 들어 생물학적 활성, 다중결합능력 또는 리간드 결합능)은 여전히 남을 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 융합 단백질의 제조를 위해 단백질의 신호 펩타이드 또는 번역 종결 코돈을 제거하였음에도 불구하고 EPO 융합 단백질로서의 완전한 활성을 보유함을 확인할 수 있다. N-말단 또는 C-말단의 잔기가 결여된 특정 폴리펩타이드가 완전한 활성을 보유하는지는 본 명세서에 기술된 방법 및 이 기술분야에 알려진 통상의 방법에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
상기 링커를 사용하는 경우 본 발명에 의한 융합 단백질의 유동성이 확보되어 EPO 본래의 특성과 단백질 3차 구조에 영향을 주지 않게 된다.
본 발명의 융합 단백질은 인간 알부민의 C-말단과 인간 EPO의 N-말단이 상기 링커에 의해 연결되도록 제조되거나, 또는 인간 알부민의 N-말단과 인간 EPO의 C-말단이 상기 링커에 의해 연결되도록 제조될 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 상기 융합 단백질은 인간 알부민의 C-말단과 인간 EPO의 N-말단이 상기 링커에 의해 결합된 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 3의 핵산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 5의 핵산 서열을 가질 수 있다.
하나의 아미노산을 암호화하는 코돈은 다수 개이므로 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 상기 예시된 핵산 서열 외의 다른 코돈에 의해 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 모든 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 인간 알부민 유전자, (GGAGGAAGCGGAGGA)n의 핵산 서열을 갖는 링커 및 인간 에리스로포이에틴 유전자를 포함하고, 상기 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터(n은 3 내지 5의 정수)를 제공한다.
본 발명에서 "벡터"는 제2 핵산 분자를 특정 세포에 수송하기 위해 사용될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 본 발명에 있어서, 용어 "벡터"는 벡터가 이러한 벡터 내로 삽입된 핵산 서열의 적어도 일부로부터 유래된 단백질을 생산할 수 있는 발현 벡터를 포함한다. 이러한 "벡터"는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바람직하게는 플라스미드 벡터일 수 있다.
적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있으며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며, 코딩 서열과 인프레임(in frame)이 있어야 한다.
일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 원핵세포에는 lac, tac, T3 및 T7 프로모터가 있으나 이로 제한되지는 않는다. 진핵세포에는 원숭이 바이러스 40(SV 40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV), 예를 들면 HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 루 사코마 바이러스(RSV) 프로모터뿐만 아니라, β-액틴 프로모터, 인간 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴, 인간 메탈로프로테인 유래의 프로모터가 있으나 이것으로 제한되지는 않는다. 또한, 조절 서열들이 숙주 세포 시스템과 상용가능한 경우, 목적 유전자 서열과 정상적으로 관련된 프로모터 또는 조절 서열을 사용하는 것 또한 가능하다.
또한 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 항생제 또는 약물 내성을 부여해주는 생성물을 코드화하는 유전자가 보편적인 선택성 마커로 사용되는데 원핵세포의 경우 β-락타마아제 유전자(암피실린 내성) 및 Tet 유전자(테트라사이클린 내성) 및 진핵세포의 경우 네오마이신(G418 또는 제네티신), gpt(미코페놀산), 암피실린 및 하이그로마이신 내성 유전자에서 사용될 수 있다. 디히드로폴레이트 환원 효소 마커 유전자는 다양한 숙주에서 메토트렉세이트에 의해 선택될 수 있다. 숙주의 영양요구성 마커의 유전자 생성물을 코드화하는 유전자, 예를 들어, LEU2, URA3 및 HIS3는 효모에서 선택성 마커로서 종종 사용된다. 그리고 바이러스(예를 들어, 바쿨로바이러스) 또는 파지 벡터 및 레트로바이러스 벡터와 같은 숙주 세포의 게놈 내로 삽입될 수 있는 벡터도 사용 가능하다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 발현 벡터는 종결 코돈이 삭제된 알부민 전체 또는 부분 유전자, (GGAGGAAGCGGAGGA)n의 핵산 서열을 갖는 링커, 신호 서열이 삭제된 인간 EPO 및 제오신-내성 유전자(Zeocin-resistance gene)를 포함하는, 인간 알부민 전체 EPO(Albumin Full Linker EPO, 이하 AFLE라 함) 발현 벡터 또는 인간 알부민 부분 EPO(Albumin Domain1 Linker EPO(이하 ADLE라 함) 또는 Albumin Domain2 Linker EPO(이하 ADLE2라 함)) 발현 벡터일 수 있다.
또한, 본 발명의 한 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 1의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 3의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 5의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 발현벡터의 지도는 도 3에 도시된 디하이드로폴레이트 환원효소 (dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포주를 제공한다.
본 발명의 세포주는 원핵 세포주 또는 진핵 세포주일 수 있으며, 바람직하게는 동물세포주이다. 이러한 동물세포주로는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주, 원숭이 신장 세포7(COS7) 세포주, NSO 세포주, SP0/2 세포주, W138, 어린 햄스터 신장(BHK) 세포주, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 293 세포를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 세포주는 인간 알부민 유전자, (GGAGGAAGCGGAGGA)n의 핵산 서열을 갖는 링커 및 인간 에리스로포이에틴 유전자를 포함하고, 상기 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터(n은 3 내지 5의 정수)에 의해 형질전환된 세포주일 수 있다.
동물세포주에서 재조합 단백질을 생산하기 위해 형질전환을 시도함에 있어 발현량이 적어 높은 생산성을 나타내기 어려운 경우, 이를 해결하기 위해 세포주 내 유전자 증폭법을 이용하는데, 가장 대표적인 것이 디하이드로폴레이트 환원 효소(Dihydrofolate reductase) 또는 글루타민 합성효소를 이용한 유전자 증폭법이다. 본 발명의 한 실시예에서는인간 알부민 유전자, (GGAGGAAGCGGAGGA)n의 핵산 서열을 갖는 링커 및 인간 에리스로포이에틴 유전자를 포함하는 발현 벡터와 함께 DHFR 효소를 발현하는 유전자를 형질전환시킴으로써, 본 발명에 따른 재조합 단백질의 생산이 크게 증가된 세포주를 확립할 수 있었다. 이 세포주를 한국생명공학연구원 유전자은행(대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지)에 2006년 10월 27일자에 수탁번호 KCTC 11014BP(ADLE 발현 세포주) 및 KCTC 11015BP(AFLE 발현 세포주)로 기탁하였다.
따라서, 본 발명은 또한 인간 알부민 유전자, (GGAGGAAGCGGAGGA)n의 핵산 서열을 갖는 링커 및 인간 에리스로포이에틴 유전자를 포함하고, 상기 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터(n은 3 내지 5의 정수) 및 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질 전환된 세포주를 제공한다.
상기 세포주는 dhfr 유전자가 결손된 CHO/dhfr-일 수 있다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC 11014BP 또는 수탁번호 KCTC 11015BP의 세포주를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 발현 벡터에 클로닝하는 단계; 상기 클로닝된 발현 벡터로 세포주를 형질 전환시키는 단계; 및 상기 형질전환된 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 세포주의 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 사용하는 세포주에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이러한 방법에는 인산 칼슘 침전, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에서 세포주의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 세포주에 따라 이루어 질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 세포주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양을, 배양방법에 따라 회분식과 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다, 배양에 사용되는 특정한 세포주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.
세포 배양에 있어 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유 및 코코넛유과 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산 및 레놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같 은 알코올 및 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.
또한 상기 배지에는 메톡트렉세이트(methotexate, MTX)와 같은 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제가 첨가될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명은 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터 및 디하이드로폴레이트 환원 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 dhfr 유전자가 결손된 세포주를 형질전환시키고, 상기 형질전환된 세포주를 메토트렉세이트를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질의 고발현 제조방법을 제공한다.
본 발명의 실시예에서, 본 발명자는 두 가지 형태의 상기 언급된 인간 알부민 전체-링커-EPO(AFLE)와 인간 알부민 부분-링커-EPO(ADLE 또는 ADLE2)의 포유동물 발현 벡터를 도 2와 같이 제작하여 확인하였으며, dhfr 유전자가 삽입된 발현 벡터와 동시에 디하이드로폴레이트 환원효소 결핍된 CHO 세포주(CHO-dhfr(+))인 CHO DUKK-11에 발현시켜 형질감염시킨 후, 고농도의 메톡트렉세이트를 포함하는 배지에서 선별배양하여 EPO가 안정적으로 고발현되는 세포주(수탁번호 KCTC 11014BP(ADLE 발현 세포주) 및 KCTC 11015BP(AFLE 발현 세포주))를 확립하였다. 이 후, 상기 재조합 인간 알부민 전체-링커-EPO 또는 알부민 부분-링커-EPO 융합 단백질 고발현 세포주를 롤러 병 배양을 통해 배양함으로써 대량의 배양액을 확보하고 이온 교환수지로 정제한 후 본 발명의 재조합 단백질을 수득하였다. EPO에 의존적인 F-36E 세포주를 이용하여 상기에서 제조된 본 발명의 재조합 단백질의 효력을 유럽 국제 표준 EPO와 비교한 결과, 유럽 표준품 EPO와 동등 이상의 효력을 나타내며, 유럽 표준품 EPO에 비해 3배 이상 증가된 반감기 및 월등한 적혈구 전구세포 생성 촉진 활성을 가짐을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 융합 단백질 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 다양한 형태로 제제화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 정맥내, 동맥내, 경피, 피내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구 또는 안구내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물을 주사용 제제로 제제화하는 경우, 이를 위해 사용되는 주사용 완충액 및 기타 보조제 성분은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 조성물에 대한 주사용 제제는 주사용 완충액 외에, 예를 들어 용해보조제, pH 조정제, 현탁제 등의 기타 보조제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 주사용 완충액은 생리식염수 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제제 형태는 또한 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 또는 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕괴제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 신장병 환자의 빈혈, 미숙아의 빈혈, 갑상선기능부전으로 인한 빈혈, 영양실조로 인한 빈혈 및 암, 류마티스 관절염, 만성 신장기능이상, 후천성 면역 결핍, 골수 이식과 연관된 빈혈 등을 포함한 빈혈의 예방 또는 치료를 위해 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 빈혈의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 상기 융합 단백질의 용도를 제공한다. 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 상기 약제학적 조성물은 이러한 의약의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 포유동물에게 치료상 유효량의 상기 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 성분 또는 약제학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, EPO을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.2㎍/kg~20㎍/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다. 또한 상기 약제학적 조성물은 공지의 빈혈 치료제와 병용 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 에리스로포이에틴 융합 단백질은 GGSGG 반복 아미노산 서열을 가지는 링커를 포함하여 인간 EPO의 효력을 보장하는 유동성을 확보하였으며, 인간 알부민을 사용하여, 생산, 안정성 및 정제상의 이점을 갖는다. 본 발명의 융합 단백질은 기존의 EPO에 비해 생체 내 반감기가 3배 이상 증가되었으며, 적혈구 전구세포 형성을 촉진하는 능력이 월등하다. 뿐만 아니라 인간 에리스로포이에틴의 변형체인 폴리에틸렌글리콜 변형체나 당 구조 변형체 등에서 확인된 항원성이나 발암성을 최대한 감소시킬 수 있어 안전하다. 따라서 본 발명의 융합 단백질은 빈혈의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명을 하기 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 하기 실시예에서는 도 1에 예시된 인간 알부민-링커-EPO 융합 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하고, 상기 벡터에 의해 형질전환된 재조합 세포주를 제조하여, 인간 알부민과 인간 에리스로포이에틴이 링커에 의해 연결된 융합 단백질을 생산하는 방법을 예시적으로 보 여준다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<실시예 1, 2, 3> 인간알부민유전자와 인간에리스로포이에틴유전자가 링커에 의해 연결된 핵산서열을 포함하는 벡터의 제조
실시예 1은, 인간알부민 부분 유전자(서열번호 10)와 인간에리스로포이에틴유전자가 링커에 의해 연결된 핵산서열을 포함하는 pcDNA3.1/Zeo(+)-ADLE 벡터를 제조한 것이고, 실시예 2는, 인간알부민 전체 유전자(서열번호 7)와 인간에리스로포이에틴유전자가 링커에 의해 연결된 핵산서열을 포함하는 pcDNA3.1/Zeo(+)-AFLE 벡터를 제조한 것이며, 실시예 3은, 인간알부민 부분 유전자(서열번호 12)와 인간에리스로포이에틴유전자가 링커에 의해 연결된 핵산서열을 포함하는pcDNA3.1/Zeo(+)-ADLE2 벡터의 제조를 제조한 것이다.
편의상 상기 세개의 실시예를 통합하여 기재한다.
(1) 단백질 번역 종결 코돈이 제거된 인간 알부민 전체 유전자의 확보
인간 간 섬유 아세포종인 HepG2 세포주에서 RNA 분리 kit(QIAGEN)를 이용하여 mRNA를 분리하고, 분리 역전사 효소(Invitrogen)를 이용하여 mRNA로부터 인간 알부민 전체 유전자의 cDNA를 합성하였다.
역전사 연쇄 중합반응 : cDNA 합성용
역전사 중합반응 완충액 (5X) : 10㎕
Oligo dT 프라이머: 5 nM
DTT : 1mM
총 RNA : 2㎍
RTase : 5 units
인간 알부민 단백질의 C-말단에 인간 EPO 단백질을 융합시키기 위해, 우선 단백질 번역 종결 코돈이 제거된 인간 알부민 전체 유전자(서열번호 7, nt7-1833)를 제조하였다. 이를 위해 다음과 같이 NheI 제한효소 인식 시퀀스가 부착된 상부 프라이머(서열번호 8)와 HindIII 제한효소 인식 시퀀스가 부착되고 종결 코돈이 제거된 말단 프라이머(서열번호 9)를 합성하고, 이들을 이용하여 연쇄중합반응을 수행하였다.
ALB-DsF(서열번호 8): GCT AGC ATG AAG TGG GTA ACC TTT ATT TCC
NheI 제한효소 인식 시퀀스
ALB-DfR(서열번호 9): AAG CTT GTA AGC CTA AGG CAG CTT GAC TTG
HindIII 제한효소 인식 시퀀스
유전자 연쇄 중합반응
연쇄 중합반응 완충액 (10X): 2㎕
dNTP 각각25mM : 2㎕
상단 프라이머(10pmoles) : 0.5pmole
말단 프라이머(10pmoles): 0.5pmole
주형 cDNA : 100pg
Taq polymerase: 1unit
그 결과 얻어진 NheI과 HindIII를 포함하고 종결 코돈이 제거된 인간 알부민 전체 유전자를 클로닝 벡터(T Easy vector, Promega)에 연쇄중합반응 결과물인 유전자 말단의 TA염기의 상보결합을 이용하여 삽입하고 연결하였다. 상기 재조합 벡터를 열 충격 방식으로 DH5α 대장균에 넣어 유전자를 삽입하고, 암피실린 100㎍/mL을 LB 배양액에 첨가하여 선택 배양을 통해 단백질 번역 종결 코돈이 제거된 인간 알부민 전체 유전자(서열번호 7, nt.7-1833)가 삽입된 클로닝 벡터를 보유하는 대장균을 선별하였다.
(2) 단백질 번역 종결 코돈이 제거된 인간 알부민 부분 유전자의 확보
단백질 번역 종결 코돈이 제거된 인간 알부민 부분 유전자(서열번호 10, nt.7-639)를 얻기 위해, 상기 (1)과 같은 방법을 통해 Nhe I 제한효소 인식 시퀀스가 부착된 상부 프라이머(서열번호 8)와 HindIII 제한효소 인식 시퀀스가 부착되고 종결코돈이 제거된 말단 프라이머(서열번호 11)를 이용하여 연쇄중합반응을 수행한 후, 실시예 1과 같은 과정을 통해 상기 단백질 번역 종결 코돈이 제거된 인간 알부민 부분 유전자(서열번호 10, nt.7-639)가 도입된 클로닝 벡터를 보유하는 대장균을 선별하였다.
ALB-D1R(서열번호 11) : AAG CTT GAT CCC GAA GTT CAT CGA GCT TTG
HindIII 제한효소 인식 시퀀스
또한, 단백질 번역 종결 코돈이 제거된 인간 알부민 부분 유전자(서열번호 12,(nt.7-1216))를 얻기 위해, 상기 (1)과 같은 방법을 통해 Nhe I 제한효소 인식 시퀀스가 부착된 상부 프라이머(서열번호 8)와 HindIII 제한효소 인식 시퀀스가 부착되고 종결코돈이 제거된 말단 프라이머(서열번호 13)를 이용하여 연쇄중합반응을 수행한 후, 상기 (1)과 같은 과정을 통해 상기 단백질 번역 종결 코돈이 제거된 인간 알부민 부분 유전자(서열번호 12,(nt.7-1216))가 도입된 클로닝 벡터를 보유하는 대장균을 선별하였다.
ALB-D2R(서열번호 13) : AAG CTT GAG GTT TAA ATT CAT CGA ACA CTT T
HindIII 제한효소 인식 시퀀스
(3) 단백질 신호 서열이 제거된 인간 에리스로포이에틴의 유전자의 확보
링커에 의해 인간 알부민 단백질의 C-말단에 융합될 인간 EPO 단백질은 단백질 신호서열이 불필요하므로, 인간 태아의 간 게놈 DNA 라이브러리(human fetal liver genomic DNA library, 미국 ATCC 37333)로부터 단백질 신호 서열이 삭제된 501개의 올리고뉴클레오타이드의 인간 에리스로포이에틴 유전자 (서열번호 14)를 클로닝하였다.
상기 클로닝을 위해 린 등(Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7580, 1985) 이 발표한 EPO 게놈 유전자 서열을 참고하여, cDNA 합성을 위한 하기 단백질 신호 서열 프라이머(서열번호 15, 16)를 이용하였다.
EcoR V/EPO-F(서열번호 15): GAT ATC GCC CCA CCA CGC CTC ATC TGT
EcoR V 제한효소 인식 시퀀스
Apa I/EPO-R(서열번호 10): GGG CCC ACC TGG TCA TCT GTC CCC TGT C
Apa I 제한효소 인식 시퀀스
EcoRV와 ApaI을 이용하여 상기 인간 에리스로포이에틴 유전자를 클로닝 벡터(T-vector)에 삽입 결합시켰으며, dye-termination 유전자 서열 분석 방법으로 서열을 확인하였다(서열번호 14).
다음, 클로닝 벡터(T-vector)에서 인간 에리스로포이에틴 유전자를 EcoRV와 ApaI으로 절단하고, 동시에 동물세포 발현 벡터인 pcDNA3.1/Zeo(+)를 EcoRV와 ApaI로 절단하였다. 아가로우스 겔 전기영동을 통해 목표 유전자의 밴드를 확인한 후 분리한 인간 에리스로포이에틴 유전자를 pcDNA3.1/Zeo(+)에 삽입하고, 결합 효소를 이용하여 연결하여 EPO 유전자가 삽입되어 있는 pcDNA3.1/Zeo(+)-EPO를 제작하였다.
결합 후, dye-termination 유전자 서열 분석 방법으로 제작된 인간 에리스로포이에틴 유전자와 pcDNA3.1/Zeo(+)의 일부 서열을 분석하고, 다시 제한효소를 이용하여 인간 에리스로포이에틴 유전자를 절단해 내어 전기영동을 통하여 유전자의 분자량을 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.(레인 1은 pcDNA3.1/Zeo(+) 발현 벡터를, 레인 2는 단백질 마커를, 레인 3은 링커-에리스로포이에틴 유전자 단편임.)
전기 영동은 Tris-Acetate-Ethylenediaminetetra acetic acid(TAE) 완충액을 이용하여 아가로우스 1% 겔을 제조하고 각각 10㎕의 소화 결과물을 100V로 전개하였다.
(4) 링커의 제조
TAKARA사에 의뢰하여 GGSGG가 4번 반복되는 아미노산 서열(서열번호 18)을 갖는 링커를 합성하였다. 링커는 링커의 핵산서열(서열번호 17) 양 말단에 EcoRI과 EcoRV 제한효소 인식 시퀀스가 결합된 형태로, 링커의 핵산서열(서열번호 17) 외에 제한 효소 염기를 포함하여 72 염기의 뉴클레오타이드로 구성되어 있다. 상기 링커를 pUCK19에 삽입하여 pUCK19-linker를(Takara, Japan) 제작하였다.
링커의 아미노산 서열: (EcoRI)-GGSGGGGSGGGGSGGGGSGG-(EcoRV)
링커의 핵산 서열:
GAATCC(EcoRI)-GGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGA-GATATC(EcoRV)
(5) 링커와 인간 에리스로포이에틴 유전자의 연결
인간 에리스로포이에틴 유전자가 삽입되어 있는 pcDNA3.1/Zeo(+)-EPO와 링커가 삽입되어 있는 pUCK19-linker를 EcoRI과 EcoRV로 절단하여 링커와 선형의 pcDNA3.1/Zeo(+)-EPO 발현 벡터를 얻었다. 아가로우스 겔 전기영동을 통해 링커와 인간 에리스로포이에틴 유전자의 밴드를 확인하여 분리하고, 링커를 선형의 pcDNA3.1/Zeo(+)-EPO의 프로모터와 에리트로포이에틴 단백질 번역 서열 사이에 삽입하였다. 다시 제한효소 EcoRI과 EcoRV를 이용하여 소화 분리하여 링커와 선형 pcDNA3.1/Zeo(+)-EPO 발현벡터의 분자량을 확인하였다. 최종적으로 dye-termination 유전자 서열 분석 방법을 이용하여 링커-에리스로포이에틴 유전자가 삽입된 pcDNA3.1/Zeo(+)-LE를 제작하였다(도 2 참조).
(6) 링커 에리스로포이에틴과 인간 알부민 유전자의 연결
상기 (2)에서 제조된 인간 알부민 부분 유전자(서열번호 10(nt. 7-639))가 삽입된 클로닝 벡터와 상기 (5)에서 제조된 링커-에리스로포이에틴 발현 벡터인 pcDNA3.1/Zeo(+)-LE를 제한효소 NheI과 HindIII를 이용하여 절단시킨 후, 인간 알부민 부분 유전자를 선형의 pcDNA3.1/Zeo(+)-LE 발현 벡터의 프로모터와 링커-에리스로포이에틴의 상위부분(upstream)에 결합 효소를 이용하여, 삽입하여 연결하였다(도 2 참조). 유전자간 염기서열상의 단백질 번역시의 불필요한 아미노산과 펩타이드 밀림 현상을 제거하기 위하여 pcDNA3.1/Zeo(+) 내에 존재하는 제한효소 HindIII와 EcoRI 사이의 불필요한 서열을 제거하여 pcDNA3.1/Zeo(+)-ADLE를 제작하였다. dye-termination 유전자 서열 분석 방법으로 인간 알부민 부분과 링커-에리 스로포이에틴과의 융합유전자(ADLE)의 서열을 확인하였다(ADLE 유전자의 아미노산 서열: 서열번호 4, ADLE 융합 단백질의 핵산 서열: 서열번호 3).
pcDNA3.1/Zeo(+)-ADLE를 제작방법과 동일한 방식으로, 인간 알부민 부분 링커 에리스로포이에틴 유전자 발현 벡터인 상기 pcDNA3.1/Zeo(+)-ADLE 에서 제한효소 NheI과 HindIII를 이용하여 알부민 부분 유전자(서열번호 10, nt. 7-639)만을 소화 제거하는 한편, 알부민 전체 유전자(서열번호 7, nt. 7-1833)가 삽입된 클로닝 벡터를 제한 효소 NheI과 HindIII를 이용하여 소화시킨 후 인간 알부민 전체 유전자를 pcDNA3.1/Zeo(+)-LE에 삽입 연결하여 pcDNA3.1/Zeo(+)-AFLE를 제작하였다. dye-termination 유전자 서열 분석 방법으로 인간 알부민 전체와 링커-에리스로포이에틴과의 융합유전자(AFLE)의 서열을 확인하였다(AFLE 유전자의 아미노산 서열: 서열번호 2, AFLE 융합 단백질의 핵산 서열: 서열번호 1)
또한, 상기 pcDNA3.1/Zeo(+)-AFLE를 제작하는 방법과 동일하게 알부민 부분 유전자(서열번호 12, nt. 7-1216)가 삽입된 클로닝 벡터를 제한 효소 NheI과 HindIII를 이용하여 소화시킨 후 인간 알부민 부분 유전자(서열번호 12, nt. 7-1216)를 pcDNA3.1/Zeo(+)-LE에 삽입 연결하여 pcDNA3.1/Zeo(+)-ADLE2를 제작하였다.
dye-termination 유전자 서열 분석 방법으로 인간 알부민 부분과 링커-에리스로포이에틴과의 융합유전자(ADLE2)의 서열을 확인하였다(ADLE2유전자의 아미노산 서열: 서열번호 6, ADLE2 융합 단백질의 핵산 서열: 서열번호 5).
도 5의 (A)에 인간 알부민 전체 또는 부분유전자(AFLE, ADLE, 또는 ADLE2)를 알부민이 발현되는 세포주로부터 mRNA를 회수하여 전체 또는 부분 유전자를 합성한 뒤 T-EASY 클로닝 벡터에 삽입된 유전자를 다시 제한 효소를 이용하여 절단 한 후 아가로스 1%로 전기영동한 결과(A)를 나타내었다.(M은 1kbp 래더, 레인1은 인간알부민부분유전자(도메인1), 레인2는 인간알부민부분유전자(도메인2), 레인3은 전체알부민임.) 그 결과 인간알부민 전체 또는 부분유전자(AFLE, ADLE, 및 ADLE2)를 확인하였다.
또한, 도 5의 (B)에 인간 알부민 전체 또는 부분과 링커-에리스로포이에틴 융합 유전자(AFLE, ADLE)의 발현 벡터를 NheⅠ과 EcoRⅠ의 제한효소로 절단한 후 아가로스 1%로 전기영동한 결과를 나타내었다.(도 5의 (B)에서 레인 1은 유전자 마커, 레인 2는 pcDNA3.1/Zeo(+) 발현 벡터, 레인 3은 레인 2의 발현 벡터와 링커-에리스로포이에틴, 레인 4는 인간 알부민 전체 유전자, 그리고 레인 5는 인간 알부민 부분 유전자(도메인1)를 나타냄.) 그 결과 ADLE와 AFLE의 분자량 및 포유동물 발현 벡터인 pcDNA3.1/Zeo(+)와의 결합을 확인하였다.
결과적으로, 인간 알부민 전체 또는 부분과 링커 펩타이드 그리고 에리트로포이에틴이 연속적인 하나의 융합 단백질로 번역될 수 있는 동물 세포 발현 벡터가 클로닝 되었음을 확인하였다.
<실시예 4,5,6> 실시예 1, 2, 3에서 제조된 벡터에 의해 형질전환된 세포주 제조
실시예 4는, 실시예 1에서 제조된 pcDNA3.1/Zeo(+)-ADLE 벡터에 의해 형질전 환된 CHO세포주를 제조한 것이고, 실시예 5는, 실시예 2에서 제조된 pcDNA3.1/Zeo(+)-AFLE 벡터에 의해 형질전환된 CHO세포주를 제조한 것이며, 실시예 6은, 실시예 3에서 제조된 pcDNA3.1/Zeo(+)-ADLE2 벡터에 의해 형질전환된 CHO세포주를 제조한 것이다.
편의상 상기 세개의 실시예를 통합하여 기재한다.
(1) CHO 세포주의 유전자 삽입형질 감염
상기 실시예 1, 2, 3 에서 제조된 재조합 발현 벡터인 pcDNA3.1/Zeo(+)-ADLE, pcDNA3.1/Zeo(+)-ADLE2 또는 pcDNA3.1/Zeo(+)-AFLE를 CHO 세포(Chinese hamster ovary cell)에 각각 형질감염시켰다.
구체적으로, 디하이드로폴레이트 환원 효소(DHFR)가 결핍된 CHO 세포주(CHO-dhfr-)인 CHO(DUKX-11) 세포주(ATCC CRL-9096)를 전배양한 후, 2 × 105 ~ 106cells/㎖ 농도로 60 mm 조직배양 접시에 접종한 후 밤새(overnight) 배양하였다. 실시예 6에서 제조된 각각의 재조합 발현 벡터 DNA 0.5 ㎍과 디하이드로폴레이트 환원 효소 유전자가 삽입된 발현 벡터인 pSV2-DHFR 0.5㎍을 Opti-MEM 50㎕에 섞고 1.5㎕의 리포펙틴(LipofectinTM, Gibco BRL)을 Opti-MEM 50㎕에 섞어 100㎕의 감염 용액을 제조하여 상온에서 10분 동안 반응시킨 후, 두 용액을 서로 혼합하여 다시 상온에서 20분 동안 반응시켜 리포펙틴-DNA 복합체를 형성하였다. 이 복합체를 60mm 배양접시에 미리 준비된 CHO DUKX-11 세포주에 처리하여 6시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 처리하였다.
그 후, 감염 시도된 세포주가 있는 60mm 배양접시에 IMDM/우태아혈청 10% 배양액 2mL을 처리하여 24시간의 후기 단백질 발현 시간을 부여하여 삽입된 유전자의 발현을 유도하였다. 배양이 끝나면, 트립신(trypsin)-EDTA를 이용하여 세포를 탈착시켜 원심분리를 통해 세포를 회수하고, IMDM/우태아혈청 10%/MTX 2nM 그리고 제오신 50㎍/mL이 첨가된 선별 배양을 이용하여 96well 배양접시에 1000개의 세포가 되도록 하여 약 7일간 배양하였다. 이때 사용된 선별 마커는 제오신과 MTX로, 제오신은 알부민 EPO가 삽입된 벡터의 삽입유무를 확인하기 위함이며, MTX는 차 후, 단백질의 고발현 세포주를 확립하기위한 도구로서 초기선별부터 MTX의 감수성이 있게끔 하기 위함이다. 그리고 각각의 배양 well에 대해 효소면역 결합 분석법(이하 실시예8에서 실시한 방법과 동일한 방식임.)을 이용하여 ADLE와 ADLE2 그리고 AFLE의 단백질이 발현하는지를 확인하여 재조합 세포주를 선별하였다.
(2) 형질감염된 세포의 효소면역측정법에 의한 인간 알부민 에리스로포이에틴발현 세포주 선별
상기 (1)에서 획득된 세포주에서 재조합 단백질 발현수준을 효소면역측정법에 의하여 조사하였다. 효소면역 측정을 위하여, 24시간 전에 2㎍/mL 농도로 항 EPO 단일클론 항체를 코팅 완충용액에 희석하여 maxisop 플레이트(NUNC)에 100㎕씩 분주하여 4℃에서 반응시키고 트리스가 0.05%함유된 인산염 완충용액(PBST) 세척용액으로 가볍게 세척하여 준비하였다.
그리고 국제표준액(BRP EPO) 및 상기 형질감염체들의 배양액 시료 100 ㎕ 씩을 상기 항 EPO 단일클론 항체가 부착된 플레이트에 첨가하여 잘 혼합한 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 각 well의 잔여 반응액을 제거하고 세척용액으로 200㎕씩 3회 세척한 후, 각 웰에 100mL씩 토끼에서 제작된 항 EPO항체(R&D system)를 1㎍/mL의 농도로 탈지분유가 5% 첨가된 반응 용액에 희석하여 사용하였다.
1차 항체를 첨가하여 다시 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 반응액을 제거하고 세척용액으로 200㎕씩 3회 세척한 후 잔여액을 모두 제거한 후, 효소접합 항 토끼 항체를 웰당 100㎕ 첨가하여 다시 실온에서 1시간 동안 반응하였다. 그리고, 다시 반응 후 반응액을 제거하고 세척용액으로 200㎕씩 3회 세척한 후 잔여액을 모두 제거한 후, 기질-발색용액(TMB, KPL) 100㎕씩을 가하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 1N 황산을 각각 100㎕씩 첨가하여 효소반응을 정지시킨 후 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
표준액의 역가(ng/mL)를 횡축, 흡광도(A450nm)를 종축으로 하여 표준곡선을 작성하고, 이 표준곡선으로부터 국제표준액과 형질감염체들의 배양액 시료 각각의 흡광도에 따른 인간 EPO 함유량(ng/mL)을 구하였다. 상기방법은 세포주의 선별방법일 뿐만 아니라, 고발현 세포주의 단백질 발현율을 확인하는 기본 방법이다.
그 결과, 알부민-링커-에리스로포이에틴이 정상적으로 발현되는 세포주들을 선별하였다.
(3) MTX를 이용한 고발현 세포주 유도
상기 (2)에서 재조합단백질 발현을 확인한 형질감염 세포주는 도 6의 방법으로 MTX를 2배 내지 4배 가량 증가시켜 세포가 고사하지 않도록 각 단계에서 약 3주간 배양하여 MTX에 적응시키면서 진행하였다. MTX 농도는 대략 1 ~ 2μM까지 배양하면서, 배양 중 단위세포당 발현하는 재조합 단백질의 농도를 효소면역 측정법(상기 실시예 8에서 실시한 방법과 동일한 방식임.)에 의해 측정하였고 아래 식과 같은 Q값을 확인하였다.
Q= 재조합 단백질 ng/ 세포/ 일수 (AFLE, ADLE or ADLE2 ng/Cells/day)
그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.
그 결과, ADLE2 발현 세포주(도 7의 (A)), ADLE2 발현 세포주(도 7의 (B)) 및 AFLE 발현 세포주(도 8) 모두 시간이 경과함에 따라 Q 값이 증가하였다.
상기 방법으로 얻은 알부민 전체-링커-EPO 융합단백질을 고발현하는 세포주를 한국생명공학연구원 유전자은행에 2006년 10월 27일 ADLE 발현 세포주는 수탁번호 KCTC 11014BP로 AFLE 발현 세포주는 수탁번호 KTCT 11015BP로 기탁하였다.
<실시예 7, 8, 9> 인간 알부민과 인간 에리스로포이에틴(Erythropietin, EPO)이 링커에 의해 연결된 알부민-EPO 융합 단백질의 생산
실시예 7에서는, pcDNA3.1/Zeo(+)-ADLE 벡터에 의해 형질전환된 실시예 4의 인간 알부민-링커-인간 에리스로포이에틴 발현 세포주로부터 부분알부민-EPO 융합단백질(ADLE)을 생산하였고, 실시예 8은, pcDNA3.1/Zeo(+)-AFLE 벡터에 의해 형질 전환된 실시예 5의 인간 알부민-링커-인간 에리스로포이에틴 발현 세포주로부터 전체알부민-EPO 융합단백질(AFLE)을 생산하였으며, 실시예 9는, pcDNA3.1/Zeo(+)-ADLE2 벡터에 의해 형질전환된 실시예 6의 인간 알부민-링커-인간 에리스로포이에틴 발현 세포주로부터 부분알부민-EPO 융합단백질(ADLE2)을 생산하였다.
편의상 상기 세개의 실시예를 통합하여 기재한다.
(1) 단백질 생산
인간 알부민-링커-인간 에리스로포이에틴(이하 ADLE/ADLE2/AFLE라 칭함) 발현 세포주로부터 MTX에 의해 선별된 CHO세포의 고발현을 유도한 클론 ADLE, ADLE2 및 AFLE의 세포주 배양액으로부터 이온교환수지와 흡착수지를 이용하여 단백질을 정제하였다.
상기 정제한 단백질을 단백질 전기영동과 웨스턴 블럿 분석(Western blot analysis)을 통하여 확인하였다.
구체적으로, 상기 세포주를 우태아 혈청이 결핍된 무혈청 배양액인 proCHO5(complex)를 이용하여 롤러 병 배양을 통해 배양하고, 그로부터 얻어진 배양액을 원심분리하여 균체와 배양 상등액을 분리하였다. 상기 배양 상등액 시료에 5X 샘플완충용액(125 mM Tris-HCl, 5% SDS, 50% glycerol, 1 ㎎/㎖ bromophenol blue)을 1 : 4의 비율로 혼합하고, 10% 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)의 웰에 30㎕ 씩 처리하여 2개의 동일 시료를 전개하였다.
전기영동이 끝난 후, 전개된 단백질 겔을 전기블럿터(electroblotter, Novagen)를 이용하여 피브이디에프(PVDF, invitrogen)로 이동시켰다. 상기 단백질이 전이된 PVDF 막을 반응 완충액(5% 탈지유 및 0.05% Tween 20을 함유하는 TBS 용액)에 넣어 상온에서 2시간 동안 교반 시킨 후, 세척액(0.1% Tween 20을 함유하는 TBS 용액)으로 10분 동안 3회 세척하였다. 세척이 끝난 PVDF막을 인간 EPO 1차 항체인 항 인간-EPO 토끼 다클론 항체(anti-human EPO antibody, R&D)와 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 세척액(0.1% Tween20을 포함하는 TBS 용액)으로 세척한 후 2차 항체인 HRP 결합 항-토끼 염소 항체(goat anti-rabbit IgG antibody conjugated horse redish phospatase, PIERCE)와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.
반응이 끝난 후, 세척액으로 3회 세척한 후 TMB 웨스턴 블럿용 기질을 첨가하여, 밴드가 육안으로 확인될 때까지 흔들어 발색이 확인되면 PVDF 막을 증류수로 세척하여 반응 종결 후 건조시켜 판독하였다.
도 9의 (A)에 알부민 전체 또는 부분과 링커-에리스로포이에틴(AFLE, ADLE) 융합 단백질의 웨스턴 블럿(western blot)의 결과를 나타내었다. (레인 1은 단백질 마커, 레인 2는 ADLE 배양액, 레인 3은 ADLE 정제액, 레인 4는 AFLE 배양액, 레인 5는 AFLE 정제액 및 레인 6은 유럽 표준품 EPO를 나타냄.) 또한, 도 9의 (B)에 알부민 전체 또는 부분과 링커-에리스로포이에틴(AFLE, ADLE, ADLE2) 융합 단백질의 전기영동(PAGE) 후 실버로 염색한 사진(좌)과 웨스턴 블럿(western blot) 결과(우)를 나타내었다.(M은 단백질 마커, 레인 1은 ADLE 정제액, 레인 2는 ADLE2 정제액, 레인 3은 AFLE 정제액, 레인 4는 유럽 표준품 EPO를 나타냄.)
그 결과, 도 9의(A) 및 (B)에서 볼 수 있는 바와 같이 인간 알부민 에리스로 포이에틴 단백질은 CHO 세포주에서 안정적으로 발현되는 것을 확인하였고, 그 분자량 또한 예상 위치에서 나타나는 것을 확인하였다.
(2) 롤러 병 배양방법을 이용한 대량생산
상기 실시예 4, 5, 6의 (3)에서 얻어진 세포주를 175T 배양 용기에 배양하여 2L 원형 롤러 병에 약 2X 107개의 세포를 접종하고, 배양액 IMDM에 10% 우태아 혈청, 제오신 50㎍/mL 및 MTX가 포함되어 있는 배양액 약 150mL를 현탁하여 약 24시간 롤러 병에 부착시키고, 병의 세포가 고루 부착하고 세포가 가득 차게 증식하면, 인산염 완충 용액에 2번 세척한 후, 무혈청 배양액 (proCHO5) 200mL로 배양액을 갈아 약 3일간 배양한다.
롤러의 회전 속도는 8 rph로 하며, 37℃에 이산화탄소는 약 5%로 배양한다.
그 결과, 세포주에 따라 차이는 있지만 3번의 배치 동안 각각 배양액 200mL을 회수하였고, 매 배치의 생산되는 재조합 단백질 ADLE와 ADLE2 그리고 AFLE는 큰 변화 없이 회수됨을 확인하였다.
(3) 크로마토그래피를 이용한 재조합 인간 알부민 에리스로포이에틴의 정제
상기 (2)의 롤러 병에서 성장시킨 CHO 세포로부터 세포외로 분비된 재조합 인간 알부민 에리스로포이에틴을 적절하게(ADLE/ADLE2 5배, AFLE 10배) 농축 및 투석, 여과시킨 후, 하기의 크로마토그래피 과정을 수행하였다.
먼저 강 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 상기 배양 농축액 (ADLE,ADLE2,AFLE)을 평형화 용매(20 mM 트리스, pH 9.0)와 탈착용매 (20mM 트리스 + 1 M 염화나트륨, pH 9.0)를 이용한 단계적 탈착 방법을 이용하였다. 이 중 탈착용매가 0.3 M 염화나트륨을 포함하였을 때, 대부분의 목적 재조합 단백질이 탈착되었다.
그 결과, HPLC로 정제한 재조합 단백질의 순도를 측정한 바, ADLE, ADLE2 그리고 AFLE 모두 95% 이상의 순도를 갖는 재조합 단백질임을 확인하였다.
<본 발명의 융합단백질의 효과 확인 실험>
(1) EPO 의존 세포주인 F-36E와 UT-7을 이용한 효과 확인 실험
F-36E 세포주는 일본의 RIKEN 세포주 은행에서 분양받았고, UT-7 세포주는 독일의 미생물보존은행(DSMZ)에서 분양받았다. F-36E 세포주는 에리스로포이에틴이 약 5.0 IU/mL의 농도로 존재해야만 증식이 가능한 에리스로포이에틴 의존성 세포주이며, UT-7 세포주는 과립세포-대식세포 집락자극인자 (GM-CSF)가 5ng/mL의 농도로 존재해야만 증식이 가능한 세포주이다. 96웰 플레이트 배양 접시에 F-36E 세포주를 약 1 X 103개씩 분주하고 배양액으로 각각 RPMI1640에 5% 우태아 혈청을 포함시킨 조건배양액을 각각 100㎕씩 사용하였다. 또한, UT-7세포주도 96웰 플레이트 배양 접시에 약 1 X 103개씩 분주하고 배양액으로 IMDM에 20% 우태아 혈청 을 포함시킨 조건배양액을 각각 100㎕씩 사용하였다. F-36E세포주와 UT-7 세포주 모두 음성 대조군으로 PBS(Phosphate Buffered Saline)를 사용하고 양성 대조군으로 유럽 표준품 에리스로포이에틴(BRP cat# E1515000, European Directorate for the Quality of Medicine & Healthcare (EDQM))을 사용하였다. F-36E의 경우 유럽 표준품 에리스로포이에틴, 실시예 7,8,9의 (3)에서 제조한 AFLE, 또는 ADLE 재조합단백질을 각각 0.15 -100 IU/mL의 농도로 48시간 동안 처리하였다. 이는 F36E 세포주의 doubling time을 약 40시간으로 확인하였기 때문이다. 그리고 UT-7 세포주의 경우 유럽 표준품 에리스로포이에틴, 당 구조를 추가하여 EPO의 반감기를 연장시킨 EPO analog인 다베포이에틴-알파(Dabepoietin-α), 실시예 7, 8, 9의 (3)에서 제조한 AFLE, ADLE 또는 ADLE2 재조합단백질을 각각 1.2 ~ 0.15 IU/mL 의 농도로 72시간 동안 처리하였다.
그리고 배양되어진 F36E와 UT-7 세포주의 세포 활성 테스트를 위하여 MTS/PMS(50:1) 활성 테스트 용액을 100㎕의 배양액에 각각 20㎕씩 첨가하여 다시 90분간 더 배양한 후 OD 490nm에서 값을 측정하여, 각각의 실험군에 세포주 활성도를 측정하였다.
그 결과를 도 10의 (A) 및 (B)에 나타내었다.
도 10의 (A)는 F-36E 세포주를 이용하여 유럽 표준품 EPO, AFLE 및 ADLE 각각의 실험군의 세포주 활성도를 측정한 결과이다. 또한, 도 10의 (B)는 UT-7 세포주를 이용하여 유럽 표준품 EPO, 다베포이에틴-알파(Dabepoietin-α), AFLE, ADLE, ADLE2 각각의 실험군의 세포주 활성도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
그 결과, 본 발명에 AFLE, ADLE 및 ADLE2 재조합단백질은 유럽 표준품 에리 스로포이에틴과 동등한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 재조합 인간 알부민 EPO 융합 단백질의 생체 내 안정성 확인 실험
실험동물은 한림동물에서 구입한 SD-Rats (수컷, 6주령, 몸무게 200~250g)을 이용하였다. 실험에 사용한 동물은 각기 개별 케이지를 사용하여 12시간 간격으로 밤낮을 조절하고, 22 ± 2℃ 항온, 55 ± 15% 항습을 유지하였다. 물과 사료는 자율 급식으로 하였다.
실험군은 총 5군으로 각각의 실험군(n=5)에 유럽 표준품 EPO(standard EPO), 당 구조를 추가하여 EPO의 반감기를 연장시킨 EPO analog인 다베포이에틴-알파(Dabepoietin-α), AFLE, ADLE2 또는 ADLE를 약 4ug/kg으로 대퇴부 정맥 삽관입술을 통해 정맥주사 하였으며, 혈중 EPO의 농도는 ELISA를 통해 확인하였다. 혈액은 안와정맥을 통해 5, 15, 30, 60, 120, 240, 360 그리고 480분에 각각 헤파린 처리하여 채혈하였다. 혈액은 상온에서 40분간 방치하고, 3000 r.p.m.으로 5분간 원심분리한, 상층 혈청을 인산버퍼를 이용하여 10배 희석하여 분석에 이용하였다.
도 11에서 볼 수 있는 바와 같이, 유럽 표준품 EPO(●), 다베포이에틴-알파(●), 그리고 AFLE(▼), ADLE2(▲) 그리고 ADLE(■) 의 생체내 안정성을 확인한 결과, 유럽 표준품 EPO는 혈청내 잔류량이 시간에 따라 급격히 감소하는 경향을 보였고, ADLE의 경우는 정맥주사 후, 480분경에 약 0.4 ng/mL, ADLE2는 약 0.7ng/mL, 다베포이에틴-알파와 AFLE는 1.0 ng/mL을 나타냈다. 즉, AFLE는 다베포이에틴-알파와 유사한 혈중 분해기울기를 보이며, ADLE의 경우 유럽 표준품 EPO 보다는 높은 안정성을 보이나, AFLE 및 ADLE2보다는 낮은 안정성을 보여 주었으며, ADLE2는 AFLE 보다는 조금 낮은 안정성을 보여 주었고 ADLE보다는 우수한 안정성을 보여 주었다. 또한, 재조합 인간 알부민 EPO의 생체 내 반감기는 유럽 표준품 EPO 대비 3배 이상 증가하는 것으로 나타났다.
(3) 재조합 인간 알부민 EPO의 생체내 적혈구 전구세포 생성촉진 효과확인실험
한림동물로부터 구매한 normocythaemic mice (B6D2F1, 무게 20~30 g)를 각 실험군 당 8마리로 나누고, 각각의 실험군에 표준 EPO, AFLE, ADLE2, ADLE 또는 다베포이에틴-알파를 80, 40 그리고 20 IU/mL의 농도로 피하주사 하였다. 그리고 4일 후, 각각의 실험군의 안구정맥에서 약 1mL의 혈액을 채혈하고, 2㎕의 Reti-STATTM을 첨가하여 볼텍싱하여 20분간 반응시켰다. 적혈구 전구세포의 생성을 확인하기 위해 Culters FACS 분석기(Beckman, USA)를 이용하여, 30,000개의 세포를 포집하여 측정하였다.
그 결과, 유럽 표준품 EPO 투여군의 적혈구 전구세포의 증가는 80IU에서 약 4~7%인 반면, AFLE투여군은 평균12%가 증가 하였고, 다베포이에틴-알파 투여군 역시 평균 11% 증가 하는 것을 확인하였다. 40 IU과 20IU 에서도 AFLE가 유럽 표준품 EPO보다 적혈구전구세포의 생성을 보다 월등히 촉진하는 것을 관찰하였다. 상기 결과를 PLA1.2(Pla2.0)을 이용하여 투여 unit 값 대비 적혈구 전구세포의 증식 정도의 직선형을 분석하고, 그 결과를 도 12 내지 도 15에 나타내었다. 그 결과 다베포 이에틴의 경우 표준 EPO대비 12.7배(도 12), AFLE는 32배(도 13), ADLE2는 약 9.2배(도 14), ADLE는 약 3.6배 증가(도 15)하는 것으로 확인하였다.
또한, 표 1에 재조합 인간 알부민 EPO의 효력을 비교하였다.
이는 표준 EPO가 130,000IU/mg의 역가를 가질 때, AFLE와 ADLE2 그리고 ADLE는 각각 4218991IU/mg과 1196769IU/mg 그리고 408486IU/mg의 포텐시 값(potency values)를 갖는 것을 의미한다 (표 1).
군(group) 스탠다드, IU/mg 포텐시 비 (Potency Ratio) 미지의 포텐시 추정치(Estimated Unknown Potency)(raw material), IU/mg
EU표준품(BRP) 130000 1.000
다베포이에틴-알파 12.772 1660396.076
AFLE 35.454 4218991.345
ADLE2 9.206 1196769.188
ADLE 3.142 408486.602
도 1은 인간 알부민-링커-EPO 융합 유전자의 모식도를 나타낸다.
도 2는 도 1의 융합 유전자를 포함하는 발현 벡터의 제작 지도를 보여준다.
도 3은 디하이드로폴레이트 환원효소 (dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자가 삽입된 발현 벡터의 지도를 나타낸다.
도 4는 도 2에 나타낸 링커-에리스로포이에틴 발현 벡터 pcDNA3.1/Zeo(+)-LE 를 BamHⅠ과 ApaⅠ의 제한 효소를 이용하여 절단한 후 전기영동한 결과를 보여준다.
도 5는 인간 알부민 전체 또는 부분유전자를 전기영동한 결과(A)와 도 2에 나타낸 인간 알부민 전체 또는 부분과 링커-에리스로포이에틴 융합 유전자(AFLE, ADLE)의 발현 벡터를 NheⅠ과 EcoRⅠ의 제한효소로 절단한 후 전기영동한 결과(B)를 나타낸다.
도 6은 MTX를 이용하여 알부민-링커-에리스로포이에틴 융합 단백질을 고발현하는 세포주를 유도하는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 7은 도 6에 의거한 방법으로 제작된 ADLE2 클론의 인간 알부민 EPO 재조합 융합단백질의 발현량(A) 및 ADLE 클론의 인간 알부민 EPO 재조합 융합단백질의 발현량(B)을 나타내는 것이다.
도 8은 도 6에 의거한 방법으로 제작된 AFLE 클론의 인간 알부민 EPO 재조합 융합단백질의 발현량을 나타내는 것이다.
도 9는 알부민 전체 또는 부분과 링커-에리스로포이에틴(AFLE, ADLE) 융합 단백질의 웨스턴 블럿(western blot) 결과(A)와 알부민 전체 또는 부분과 링커-에리스로포이에틴(AFLE, ADLE, ADLE2) 융합 단백질의 웨스턴 블럿(western blot) 결과(B)를 나타낸다.
도 10은 F-36E 세포주를 이용하여 유럽 표준품 EPO, AFLE 및 ADLE 각각의 실험군의 세포주 활성도를 측정한 결과(A)와 UT-7 세포주를 이용하여 유럽 표준품 EPO, AFLE, ADLE, ADLE2 각각의 실험군의 세포주 활성도를 측정한 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 11은 유럽 표준품 EPO, 다베포이에틴-알파, AFLE, ADLE 및 ADLE2투여군의 혈중 EPO의 농도를 ELISA를 통해 조사한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 12는 유럽 표준품 EPO 및 다베포이에틴-알파 투여군의 적혈구 전구세포 증가를 FACS 분석기를 이용하여 조사한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 13은 유럽 표준품 EPO 및 AFLE 투여군의 적혈구 전구세포 증가를 FACS 분석기를 이용하여 조사한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 14는 유럽 표준품 EPO 및 ADLE 투여군의 적혈구 전구세포 증가를 FACS 분석기를 이용하여 조사한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 15는 유럽 표준품 EPO 및 ADLE2 투여군의 적혈구 전구세포 증가를 FACS 분석기를 이용하여 조사한 결과를 보여주는 그래프이다.
<110> Boryung Pharm. 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tgctgataaa 600 gctgcctgcc tgttgccaaa gctcgatgaa cttcgggatg aagggaaggc ttcgtctgcc 660 aaacagagac tcaagtgtgc cagtctccaa aaatttggag aaagagcttt caaagcatgg 720 gcagtagctc gcctgagcca gagatttccc aaagctgagt ttgcagaagt ttccaagtta 780 gtgacagatc ttaccaaagt ccacacggaa tgctgccatg gagatctgct tgaatgtgct 840 gatgacaggg cggaccttgc caagtatatc tgtgaaaatc aagattcgat ctccagtaaa 900 ctgaaggaat gctgtgaaaa acctctgttg gaaaaatccc actgcattgc cgaagtggaa 960 aatgatgaga tgcctgctga cttgccttca ttagctgctg attttgttga aagtaaggat 1020 gtttgcaaaa actatgctga ggcaaaggat gtcttcctgg gcatgttttt gtatgaatat 1080 gcaagaaggc atcctgatta ctctgtcgtg ctgctgctga gacttgccaa gacatatgaa 1140 accactctag agaagtgctg tgccgctgca gatcctcatg aatgctatgc caaagtgttc 1200 gatgaattta aacctcttgt ggaagagcct cagaatttaa tcaaacaaaa ttgtgagctt 1260 tttgagcagc ttggagagta caaattccag aatgcgctat tagttcgtta caccaagaaa 1320 gtaccccaag tgtcaactcc aactcttgta gaggtctcaa gaaacctagg aaaagtgggc 1380 agcaaatgtt gtaaacatcc tgaagcaaaa agaatgccct gtgcagaaga ctatctatcc 1440 gtggtcctga accagttatg tgtgttgcat gagaaaacgc cagtaagtga cagagtcacc 1500 aaatgctgca cagaatcctt ggtgaacagg cgaccatgct tttcagctct ggaagtcgat 1560 gaaacatacg ttcccaaaga gtttaatgct gaaacattca ccttccattc agatatatgc 1620 acactttctg agaaggagag acaaatcaag aaacaaactg cacttgttga gcttgtgaaa 1680 cacaagccca aggcaacaaa agagcaactg aaagctgtta tggatgattt cgcagctttt 1740 gtagagaagt gctgcaaggc tgacgataag gagacctgct ttgccgagga gggtaaaaaa 1800 cttgttgctg caagtcaagc tgccttaggc ttacaagctt ggtaccgagc tcgcggagga 1860 agcggaggag gaggaagcgg aggaggagga agcggaggag gaggaagcgg aggagatatc 1920 gccccaccac gcctcatctg tgacagccga gtcctggaga ggtacctctt ggaggccaag 1980 gaggccgaga atatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcttgaatga gaatatcact 2040 gtcccagaca ccaaagttaa tttctatgcc tggaagagga tggaggtcgg gcagcaggcc 2100 gtagaagtct ggcagggcct ggccctgctg tcggaagctg tcctgcgggg ccaggccctg 2160 ttggtcaact cttcccagcc gtgggagccc ctgcagctgc atgtggataa agccgtcagt 2220 ggccttcgca gcctcaccac tctgcttcgg gctctgggag cccagaagga agccatctcc 2280 cctccagatg cggcctcagc tgctccactc cgaacaatca ctgctgacac tttccgcaaa 2340 ctcttccgag tctactccaa tttcctccgg ggaaagctga agctgtacac aggggaggcc 2400 tgcaggacag gggacagatg a 2421 <210> 2 <211> 806 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of AFLE fusion protein <400> 2 Ala Ser Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser 1 5 10 15 Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu 20 25 30 Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu 35 40 45 Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp 50 55 60 His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val 65 70 75 80 Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe 85 90 95 Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu 100 105 110 Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe 115 120 125 Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro 130 135 140 Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe 145 150 155 160 Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr 165 170 175 Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr 180 185 190 Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu 195 200 205 Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu 210 215 220 Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp 225 230 235 240 Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu 245 250 255 Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys 260 265 270 His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys 275 280 285 Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys 290 295 300 Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu 305 310 315 320 Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val 325 330 335 Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe 340 345 350 Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser 355 360 365 Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu 370 375 380 Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe 385 390 395 400 Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln 405 410 415 Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala 420 425 430 Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr 435 440 445 Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys 450 455 460 Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser 465 470 475 480 Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser 485 490 495 Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro 500 505 510 Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe 515 520 525 Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu 530 535 540 Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys 545 550 555 560 His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp 565 570 575 Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr 580 585 590 Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala 595 600 605 Leu Gly Leu Gln Ala Trp Tyr Arg Ala Arg Gly Gly Ser Gly Gly Gly 610 615 620 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ile 625 630 635 640 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 645 650 655 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 660 665 670 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 675 680 685 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 690 695 700 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 705 710 715 720 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 725 730 735 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 740 745 750 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 755 760 765 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 770 775 780 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 785 790 795 800 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 805 <210> 3 <211> 1227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence of ADLE fusion protein <400> 3 gctagcatga agtgggtaac ctttatttcc cttctttttc tctttagctc ggcttattcc 60 aggggtgtgt ttcgtcgaga tgcacacaag agtgaggttg ctcatcggtt taaagatttg 120 ggagaagaaa atttcaaagc cttggtgttg attgcctttg ctcagtatct tcagcagtgt 180 ccatttgaag atcatgtaaa attagtgaat gaagtaactg aatttgcaaa aacatgtgtt 240 gctgatgagt cagctgaaaa ttgtgacaaa tcacttcata ccctttttgg agacaaatta 300 tgcacagttg caactcttcg tgaaacctat ggtgaaatgg ctgactgctg tgcaaaacaa 360 gaacctgaga gaaatgaatg cttcttgcaa cacaaagatg acaacccaaa cctcccccga 420 ttggtgagac cagaggttga tgtgacgtgc actgcttttc atgacaatga agagacattc 480 ttgaaaaaat acttatatga aattgccaga agacatcctt acttttatgc cccggaactc 540 cttttctttg ctaaaaggta taaagctgct tttacagaat gttgccaagc tgctgataaa 600 gctgcctgcc tgttgccaaa gctcgatgaa cttcgggatc aagcttggta ccgagctcgc 660 ggaggaagcg gaggaggagg aagcggagga ggaggaagcg gaggaggagg aagcggagga 720 gatatcgccc caccacgcct catctgtgac agccgagtcc tggagaggta cctcttggag 780 gccaaggagg ccgagaatat cacgacgggc tgtgctgaac actgcagctt gaatgagaat 840 atcactgtcc cagacaccaa agttaatttc tatgcctgga agaggatgga ggtcgggcag 900 caggccgtag aagtctggca gggcctggcc ctgctgtcgg aagctgtcct gcggggccag 960 gccctgttgg tcaactcttc ccagccgtgg gagcccctgc agctgcatgt ggataaagcc 1020 gtcagtggcc ttcgcagcct caccactctg cttcgggctc tgggagccca gaaggaagcc 1080 atctcccctc cagatgcggc ctcagctgct ccactccgaa caatcactgc tgacactttc 1140 cgcaaactct tccgagtcta ctccaatttc ctccggggaa agctgaagct gtacacaggg 1200 gaggcctgca ggacagggga cagatga 1227 <210> 4 <211> 408 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of ADLE fusion protein <400> 4 Ala Ser Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser 1 5 10 15 Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu 20 25 30 Val Ala His Arg Phe Lys Asp 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Ser Arg Val Leu Glu Arg 245 250 255 Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala 260 265 270 Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val 275 280 285 Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu 290 295 300 Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln 305 310 315 320 Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His 325 330 335 Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg 340 345 350 Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser 355 360 365 Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe 370 375 380 Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly 385 390 395 400 Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg 405 <210> 5 <211> 1803 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence of ADLE2 fusion protein <400> 5 gctagcatga agtgggtaac ctttatttcc cttctttttc tctttagctc ggcttattcc 60 aggggtgtgt ttcgtcgaga tgcacacaag agtgaggttg ctcatcggtt taaagatttg 120 ggagaagaaa atttcaaagc cttggtgttg attgcctttg ctcagtatct tcagcagtgt 180 ccatttgaag atcatgtaaa attagtgaat gaagtaactg aatttgcaaa aacatgtgtt 240 gctgatgagt cagctgaaaa ttgtgacaaa tcacttcata ccctttttgg agacaaatta 300 tgcacagttg caactcttcg tgaaacctat ggtgaaatgg ctgactgctg tgcaaaacaa 360 gaacctgaga gaaatgaatg cttcttgcaa cacaaagatg acaacccaaa cctcccccga 420 ttggtgagac cagaggttga tgtgatgtgc actgcttttc atgacaatga agagacattt 480 ttgaaaaaat acttatatga aattgccaga agacatcctt acttttatgc cccggaactc 540 cttttctttg ctaaaaggta taaagctgct tttacagaat gttgccaagc tgctgataaa 600 gctgcctgcc tgttgccaaa gctcgatgaa cttcgggatg aagggaaggc ttcgtctgcc 660 aaacagagac tcaagtgtgc cagtctccaa aaatttggag aaagagcttt caaagcatgg 720 gcagtagctc gcctgagcca gagatttccc aaagctgagt ttgcagaagt ttccaagtta 780 gtgacagatc ttaccaaagt ccacacggaa tgctgccatg gagatctgct tgaatgtgct 840 gatgacaggg cggaccttgc caagtatatc tgtgaaaatc aagattcgat ctccagtaaa 900 ctgaaggaat gctgtgaaaa acctctgttg gaaaaatccc actgcattgc cgaagtggaa 960 aatgatgaga tgcctgctga cttgccttca ttagctgctg attttgttga aagtaaggat 1020 gtttgcaaaa actatgctga ggcaaaggat gtcttcctgg gcatgttttt gtatgaatat 1080 gcaagaaggc atcctgatta ctctgtcgtg ctgctgctga gacttgccaa gacatatgaa 1140 accactctag agaagtgctg tgccgctgca gatcctcatg aatgctatgc caaagtgttc 1200 gatgaattta aacctcaagc ttggtaccga gctcgcggag gaagcggagg aggaggaagc 1260 ggaggaggag gaagcggagg aggaggaagc ggaggagata tcgccccacc acgcctcatc 1320 tgtgacagcc gagtcctgga gaggtacctc ttggaggcca aggaggccga gaatatcacg 1380 acgggctgtg ctgaacactg cagcttgaat gagaatatca ctgtcccaga caccaaagtt 1440 aatttctatg cctggaagag gatggaggtc gggcagcagg ccgtagaagt ctggcagggc 1500 ctggccctgc tgtcggaagc tgtcctgcgg ggccaggccc tgttggtcaa ctcttcccag 1560 ccgtgggagc ccctgcagct gcatgtggat aaagccgtca gtggccttcg cagcctcacc 1620 actctgcttc gggctctggg agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca 1680 gctgctccac tccgaacaat cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc 1740 aatttcctcc ggggaaagct gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac 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Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr 180 185 190 Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu 195 200 205 Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu 210 215 220 Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp 225 230 235 240 Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu 245 250 255 Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys 260 265 270 His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys 275 280 285 Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys 290 295 300 Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu 305 310 315 320 Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val 325 330 335 Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe 340 345 350 Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser 355 360 365 Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu 370 375 380 Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe 385 390 395 400 Asp Glu Phe Lys Pro Gln Ala Trp Tyr Arg Ala Arg Gly Gly Ser Gly 405 410 415 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 420 425 430 Asp Ile Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg 435 440 445 Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala 450 455 460 Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val 465 470 475 480 Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu 485 490 495 Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln 500 505 510 Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His 515 520 525 Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg 530 535 540 Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser 545 550 555 560 Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe 565 570 575 Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly 580 585 590 Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg 595 600 <210> 7 <211> 1827 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> whole gene of human albumin deleted the protein translation stop codon(for AFLE) <400> 7 atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60 gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120 gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180 gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240 gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300 gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360 gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420 agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480 aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540 tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600 tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660 agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720 gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780 gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840 agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900 gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960 gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020 aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080 aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140 ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200 tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260 cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320 caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380 tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440 ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc 1500 tgcacagaat ccttggtgaa caggcgtcca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560 tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620 tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt gaaacacaag 1680 cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag 1740 aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt 1800 gctgcaagtc aagctgcctt aggctta 1827 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALB-DsF primer <400> 8 gctagcatga agtgggtaac ctttatttcc 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALB-DfR primer <400> 9 aagcttgtaa gcctaaggca gcttgacttg 30 <210> 10 <211> 633 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> partial gene of human albumin deleted the protein translation stop codon(for ADLE) <400> 10 atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60 gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120 gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180 gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240 gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300 gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360 gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420 agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480 aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540 tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600 tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gat 633 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALB-D1R primer <400> 11 aagcttgatc ccgaagttca tcgagctttg 30 <210> 12 <211> 1222 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> partial gene of human albumin deleted the protein translation stop codon(for ADLE2) <400> 12 gctagcatga agtgggtaac ctttatttcc cttctttttc tctttagctc ggcttattcc 60 aggggtgtgt ttcgtcgaga tgcacacaag agtgaggttg ctcatcggtt taaagatttg 120 ggagaagaaa atttcaaagc cttggtgttg attgcctttg ctcagtatct tcagcagtgt 180 ccatttgaag atcatgtaaa attagtgaat gaagtaactg aatttgcaaa aacatgtgtt 240 gctgatgagt cagctgaaaa ttgtgacaaa tcacttcata ccctttttgg agacaaatta 300 tgcacagttg caactcttcg tgaaacctat ggtgaaatgg ctgactgctg tgcaaaacaa 360 gaacctgaga gaaatgaatg cttcttgcaa cacaaagatg acaacccaaa cctcccccga 420 ttggtgagac cagaggttga tgtgatgtgc actgcttttc atgacaatga agagacattt 480 ttgaaaaaat acttatatga aattgccaga agacatcctt acttttatgc cccggaactc 540 cttttctttg ctaaaaggta taaagctgct tttacagaat gttgccaagc tgctgataaa 600 gctgcctgcc tgttgccaaa gctcgatgaa cttcgggatg aagggaaggc ttcgtctgcc 660 aaacagagac tcaagtgtgc cagtctccaa aaatttggag aaagagcttt caaagcatgg 720 gcagtagctc gcctgagcca gagatttccc aaagctgagt ttgcagaagt ttccaagtta 780 gtgacagatc ttaccaaagt ccacacggaa tgctgccatg gagatctgct tgaatgtgct 840 gatgacaggg cggaccttgc caagtatatc tgtgaaaatc aagattcgat ctccagtaaa 900 ctgaaggaat gctgtgaaaa acctctgttg gaaaaatccc actgcattgc cgaagtggaa 960 aatgatgaga tgcctgctga cttgccttca ttagctgctg attttgttga aagtaaggat 1020 gtttgcaaaa actatgctga ggcaaaggat gtcttcctgg gcatgttttt gtatgaatat 1080 gcaagaaggc atcctgatta ctctgtcgtg ctgctgctga gacttgccaa gacatatgaa 1140 accactctag agaagtgctg tgccgctgca gatcctcatg aatgctatgc caaagtgttc 1200 gatgaattta aacctcaagc tt 1222 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALB-D2R primer <400> 13 aagcttgagg tttaaattca tcgaacactt t 31 <210> 14 <211> 501 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO sequence in which the signal sequence is deleted <400> 14 gccccaccac gcctcatctg tgacagccga gtcctggaga ggtacctctt ggaggccaag 60 gaggccgaga atatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcttgaatga gaatatcact 120 gtcccagaca ccaaagttaa tttctatgcc tggaagagga tggaggtcgg gcagcaggcc 180 gtagaagtct ggcagggcct ggccctgctg tcggaagctg tcctgcgggg ccaggccctg 240 ttggtcaact cttcccagcc gtgggagccc ctgcagctgc atgtggataa agccgtcagt 300 ggccttcgca gcctcaccac tctgcttcgg gctctgggag cccagaagga agccatctcc 360 cctccagatg cggcctcagc tgctccactc cgaacaatca ctgctgacac tttccgcaaa 420 ctcttccgag tctactccaa tttcctccgg ggaaagctga agctgtacac aggggaggcc 480 tgcaggacag gggacagatg a 501 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoR V/EPO-F primer <400> 15 gatatcgccc caccacgcct catctgt 27 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apa I/EPO-R primer <400> 16 gggcccacct ggtcatctgt cccctgtc 28 <210> 17 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence of linker(between albumin and EPO) <400> 17 ggaggaagcg gaggaggagg aagcggagga ggaggaagcg gaggaggagg aagcggagga 60 60 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of linker(between albumin and EPO) <400> 18 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly 20

Claims (27)

  1. 인간 알부민과 인간 에리스로포이에틴(Erythropietin, EPO)이 (GGSGG)n의 아미노산 서열을 갖는 링커에 의해 연결된 알부민-EPO 융합 단백질(n은 3 내지 5의 정수).
  2. 제1항에 있어서, 상기 n이 4인 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
  7. 제6항에 있어서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 서열번호 1의 핵산 서 열을 갖는 핵산.
  8. 제6항에 있어서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 서열번호 3의 핵산 서열을 갖는 핵산.
  9. 제6항에 있어서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 서열번호 5의 핵산 서열을 갖는 핵산.
  10. 인간 알부민 유전자, (GGAGGAAGCGGAGGA)n의 핵산 서열을 갖는 링커 및 인간 에리스로포이에틴 유전자를 포함하고, 제1항의 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터(n은 3 내지 5의 정수).
  11. 제10항에 있어서, 상기 발현 벡터가 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  12. 제10항에 있어서, 상기 발현 벡터가 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  13. 제10항에 있어서, 상기 발현 벡터가 서열번호 5의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  14. 제10항에 있어서, 상기 발현 벡터가 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 발현 벡터.
  15. 제10항의 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포주.
  16. 제10항의 발현 벡터 및 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질 전환된 세포주.
  17. 제14항의 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포주.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주는 CHO인 세포주.
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 세포주는 dhfr 유전자가 결손된 CHO/dhfr- 인 세포주.
  20. 수탁번호 KCTC 11014BP의 세포주.
  21. 수탁번호 KCTC 11015BP의 세포주.
  22. 제1항 또는 제2항의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 발현 벡터에 클로닝하는 단계; 상기 클로닝된 발현 벡터로 세포주를 형질전환시키는 단계; 및 상기 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 제1항 또는 제2항의 융합 단백질의 제조 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 세포주는 dhfr 유전자가 결손된 세포주이고, 상기 세포주에 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터 및 디하이드로폴레이트 환원 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 상기 세포주를 형질전환시키고, 상기 형질전환된 세포주를 메토트렉세이트를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  26. 빈혈의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 용도.
  27. 포유동물에게 치료상 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 융합 단백 질을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료 방법.
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Cited By (2)

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KR20180075698A (ko) * 2011-09-23 2018-07-04 블루버드 바이오, 인코포레이티드. 개선된 유전자 치료 방법
CN111139263A (zh) * 2018-11-06 2020-05-12 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种高效制备长效干扰素的方法

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