JP2000504584A - 細胞の遺伝子修飾のための調節可能なレトロウイルス系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ｖ−ｍｙｃオンコジーンが、テトラサイクリンによって制御されるトランス作用因子、およびｔｅｔオペレター配列に融合されたヒトサイトメガロウイルスの最少プロモーターによって駆動される新規な調節可能レトロウイルスベクターであって、成人のニューロン原始細胞の不死化に有用な調節可能レトロウイルスベクターが提供される。高力価の組換えレトロウイルスを産生するプロデューサー細胞系もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞の遺伝子修飾のための調節可能なレトロウイルス系 政府支援研究に関する記述 本発明は、米国国立衛生研究所の許可番号PO1 AG10435 号の支援を受けて達成 された。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。 発明の分野 本発明は神経生物学の一般分野に属し、一般にニューロン細胞の不死化および ／または分化に有用な試薬に関する。 発明の背景 中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞は大雑把にニューロンまたは神経膠細胞のいずれ かに分類される。神経膠細胞はさらに星状膠細胞および稀突起膠細胞に分類され る。成人の脳ではＣＮＳのわずかの種類の細胞のみが分裂することが報告されて おり、インビトロでは良好な生存を示さない。初代培養は性状的に不均一になり がちであるが、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）中で成長させることによ って細胞培養として樹立された。しかしながら、脳の種々の領域由来のクローン 細胞系であって、さらにニューロンに分化することができるクローン細胞系を作 製することは重要であり、オンコジーンで細胞を不死化させてそのようなクロー ン系を得ることが必要であろう。 ＣＮＳには何百種類もの異なる細胞およびそれらの成長および分化に影響を及 ぼす多くの種々の神経栄養因子が存在する。細胞の種類およびその細胞が存在す る脳の領域に応じて、異なる神経栄養因子またはその特異的組合せがその細胞の 生存、増殖および分化に影響を与える。ＣＮＳの細胞は、種々の神経伝達物質、 神経栄養因子、およびその環境中の他の分子と反応する。 最近、何人かの研究者によって脳の多様な領域から種々の発達段階の原始細胞 が分離され不死化された。嗅覚原始細胞および小脳原始細胞がウイルスのｍｙｃ （ｖ−ｍｙｃ）オンコジーンを用いて不死化され、ニューロン表現型および神経 膠細胞表現型の両方を併せもつ多潜在能性細胞系が得られた(Ryderら、Ｊ．Neur o biology，21:356(1990))。スナイダーら(Snyderら、Cell，68:33(1992))による 同様な研究の結果、マウスの小脳に移植したときニューロンおよび神経膠細胞に 分化する多潜在能性ニューロン細胞系が得られた。これらｖ−ｍｙｃ不死化小脳 細胞系（マウス外胚葉（ＥＧＬ）から樹立）は、同じクローン内ですら異なる形 態および異なる細胞型特異的抗原を示した。他の研究では、ネズミの神経上皮細 胞がｃ−ｍｙｃを含むレトロウイルスで不死化され、成長因子で分化を誘導して 神経膠細胞およびニューロン細胞と同様な分化細胞型が形成された(Barlettら、 Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:3255(1988))。 ＣＮＳ細胞集団、および特にニューロン原始細胞系の大規模製造および維持を 可能にする長期インビトロ培養系が必要とされている。この培養系は長期間にわ たって増殖し、継代培養が可能であり、所望であれば、分化を誘発することがで きる。そのような均質なインビトロ細胞培養は、細胞集団の研究、これら細胞間 の相互作用、およびこれら細胞に対する種々の神経活性組成物の効果を研究する ために極めて貴重であろう。 発明の要旨 本発明は、原始細胞として培養するか又は分化を誘発することができる原始ニ ユーロン細胞に感染することができる組換えレトロウイルスの製造に有用な、新 規な調節可能レトロウイルスベクターを提供する。第一の特徴として本発明はベ クターを提供するが、このベクターは、異種遺伝子、例えばｖ−ｍｙｃオンコジ ーンおよび調節可能核酸配列を含む調節可能ベクターである。例えば、該ベクタ ーは、テトラサイクリンの付加によって調節することができる。本発明はまた、 パッケージング細胞系をベクターで核酸感染(transfect)させて産生するか、又 は第一のパッケージング細胞系によって産生したウイルスで第二のパッケージン グ細胞系を感染させて産生する組換えレトロウイルスを産生するプロデューサー 細胞系を含む。さらにまた本発明に含まれるものは、本発明の組換えレトロウイ ルスで感染させることによって得られた不死化原始ニユーロン細胞である。 さらに、本発明は原始ニユーロン細胞の分化を誘発する方法を提供する。 図面の簡単な説明 図１は、本発明の典型的なベクター、LINXv-mycの構造の模式図である。末端 反復配列（ＬＴＲ）；テトラサイクリン制御トランス作用因子 (transactivator )(ｔＴＡ))；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）；脳心筋炎ウイ ルス内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；ｔＴＡ−依存プロモーター（Ｐ_{hCMV *-1} ）。 図１Ｂは、３．５ｋｂ ｖ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの模式図を示す。このｍＲＮＡ はテトラサイクリンの非存在下で転写される。 図１Ｃは、３．５ｋｂ ｖ−ｍｙｃ ｍＲＮＡのテトラサイクリン存在下での ｔＴＡ−誘発転写の抑制を図解した模式図である。 図２Ａおよび２Ｂは、LINXv-mycレトロウイルスを感染させた成人海馬原始細 胞の単一クローン（ＨＣ２Ｓ２）由来の培養の写真を示す。ＨＣ２Ｓ２細胞はテ トラサイクリン非存在下で２日間（Ａ）およびテトラサイクリン存在下（１μｇ ／ｍｌ）で３日間（Ｂ）成長させた。 図２Ｃは、テトラサイクリン存在下または非存在下で成長させたＨＣ２Ｓ２細 胞のＬＴＲの転写物（７．８ｋｂ ｍＲＮＡ）およびP_hCMV*-1 の転写物（３． ５ｋｂ ｍＲＮＡ）のノザンブロット分析を示す。臭化エチジウムで染色したゲ ルの写真を内部標準として提示する。 図３は、ｖ−ｍｙｃおよびＢｒｄＵについての免疫蛍光染色を示す。ＨＣ２Ｓ ２細胞は、テトラサイクリン（ＴＣ）非存在下で１日（Ａ、Ｃ）およびテトラサ イクリン（１μｇ／ｍｌ）存在下で２日間（Ｄ）または３日間（Ｂ）成長させた 。 細胞を抗ｖ−ｍｙｃ抗体（Ａ、Ｂ）で染色するか又はＢｒｄＵで18時間インキュ ベートして抗ＢｒｄＵ抗体（Ｃ、Ｄ）で染色した。 図４は、ニューロンマーカーについての免疫蛍光染色を示す。ＨＣ２Ｓ２細胞 は、テトラサイクリン非存在下で１日（Ａ、Ｃ、Ｅ）およびテトラサイクリン（ １μｇ／ｍｌ）存在下で５日間（Ｂ、Ｄ、Ｆ）成長させた。細胞を抗ＮＦＨ抗体 （Ａ、Ｂ）、抗タウ抗体（Ｃ、Ｄ）および抗ＮｅｕＮ抗体（Ｅ、Ｆ）で染色した 。 図５は、テトラサイクリンの存在下または非存在下で成長させたＨＣ２Ｓ２細 胞で検出されるＧＡＤ（Ｅ）の胎児型（３５３ｂｐ）、ＧＡＤ（Ａ）の成人型（ ２６７ｂｐ）、リボソームタンパク質Ｌ２７ａ（２３４ｂｐ）、ＧＦＡＰ（１４ １ｂｐ）、ＮＦＨ（３０２ｂｐ）、ＮＦＬ（１５５ｂｐ）のＰＣＲ生成物のノザ ンブロットを示す。 図６Ａは、保持電位差(holding potential)−80ｍＶから−40、−20、０およ び20ｍＶのテスト電位差への脱分極によって誘発されたナトリウム電流を示す。 図６Ｂは、保持電位差−80mVから−40、−20、０および20ｍＶのテスト電位差 の脱分極によって誘発されたカルシウムチャネル電流を示す。 図６Ｃは、テトラサイクリン存在下または非存在下で成長させた後の平均ナト リウム（Ｉ_Na）およびカルシウムチャネル（Ｉ_Ba）電流密度を示す。電流密度は 、細胞の総静電容量で標準化した電流の大きさである。各棒線は16個（Ｉ_Na、＋ Ｔｃ）、12個（Ｉ_Na、−Ｔｃ）、10個（Ｉ_Ba、＋Ｔｃ）または11個（Ｉ_Ba、−Ｔ ｃ）の細胞の平均を示し、誤差の棒線はＳＥＭである。 好ましい実施態様の説明 本発明は、ニューロン原始細胞に感染することができる組換えレトロウイルス の製造に有用な調節可能レトロウイルスベクターを提供する。このレトロウイル ス感染ニューロン原始細胞は、その後原始細胞として培養されるか、又は分化を 誘発させることができる。このベクターは新規な調節可能レトロウイルスベクタ ーであって、トランス作用因子によって異種遺伝子の発現が調節される。このト ランス作用因子は、異種遺伝子の核酸配列に機能的に連結されているプロモータ ーを調節する。このベクターから産生される組換えレトロウイルスはニューロン 原始細胞の不死化及び／又はそのような細胞の分化に有用である。 レトロウイルスは、そのウイルスゲノムがＲＮＡであるＲＮＡウイルスである 。宿主細胞がレトロウイルスに感染すると、そのゲノムＲＮＡはＤＮＡ中間体に 逆転写され、この中間体ＤＮＡは非常に効率的に感染細胞の染色体ＤＮＡに組み 込まれる。組み込まれたこのＤＮＡ中間体はプロウイルスと称される。プロウイ ルスの転写および感染ウイルスへの構築は、適切なヘルパーウイルスの存在下、 または夾雑(contaminating)ヘルパーウイルスの同時産生がなくとも被包化させ ることができる適切な配列を含む細胞系において生じる。 レトロウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは３つの遺伝子を有する。す なわちｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖであり、２つの末端反復（ＬＴＲ）配列がこ れらに接している。ｇａｇ遺伝子は内部構造（マトリックス、キャプシドおよび ヌクレオキャプシド）タンパク質をコードし、ｐｏｌ遺伝子はＲＮＡ依存ＤＮＡ ポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードし、ｅｎｖ遺伝子はウイルスエンベロープ 糖タンパク質をコードする。５'および３'ＬＴＲは、ビリオン（virion）ＲＮＡ の転写及びポリアデニル化を促進する。ＬＴＲはウイルス複製に必要な他の全て のシス−作動性配列を含んでいる。 本発明の組換えレトロウイルスは、天然のウイルスの構造性、感染性遺伝子の いくつかが除去され、その代わりに標的細胞に送り込まれるべき核酸配列で置換 されるという方法で遺伝子修飾される。このウイルスに細胞が感染した後、ウイ ルスはその核酸を細胞に注入し、レトロウイルスの遺伝物質が宿主細胞のゲノム に組み込まれる。この転移されたレトロウイルスの遺伝物質は、宿主細胞内で続 いて転写されタンパク質に翻訳される。 第一の特徴として、本発明は、調節用トランス作用因子成分をコードする核酸 ；任意の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；選択可能マーカー；異種遺伝子 に機能的に連結する調節用成分；異種遺伝子核酸配列および逆転写と組み込みに 必要なシス−作動性核酸配列を有するレトロウイルスベクターを提供する。 異種核酸配列は調節用核酸配列、例えばプロモーター配列に機能できるように 連結されている。本明細書で用いるとき、“異種”核酸配列という用語は、異質 な種に由来する配列を指すか、または同じ種の場合には、その本来の形態が実質 的に修飾されている配列を指す。また別には、細胞内で通常は発現されない非改 変核酸配列は異種核酸配列である。長期組織培養のために原始細胞を不死化させ たい場合には、異種遺伝子は典型的には、ｖ−ｍｙｃのようなオンコジーンであ る。また別には、異種遺伝子は、正常なニューロン細胞機能において重要なタン パク質生成物、例えばドーパミン産生におけるチロシンヒドロキシラーゼ；アセ チルコリン産生のためのコリンアセチルトランスフェラーゼをコードすることが できる。細胞の遺伝子修飾のために、いずれの異種遺伝子も本発明のベクターで クローン化することができる。 異種遺伝子と機能的に連結されているプロモーターは、いずれのウイルス遺伝 子プロモーターまたはハウスキーピング遺伝子プロモータでもよく、例えばサイ トメガロウイルス（ＣＭＶ）ＬＴＲ、ＤＨＦＲ、ＳＶ４０の極初期(immediate early)遺伝子、モロニーネズミ白血病ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスのＬＴ Ｒプロモーターが含まれる。このプロモーター配列は、この核酸配列にとって異 種でも同種でもよい。ウイルスまたは組織特異的プロモーターを含む広範囲のプ ロモーターを利用できる。細胞または組織特異的プロモーターは、特定の細胞集 団における遺伝子配列の集中的発現のために用いることができる。本発明に適切 なホ乳類およびウイルスプロモーターは当技術分野で入手可能である。しかしな がら、異種遺伝子と機能的に連結されたプロモーターは、調節可能トランス作用 成分に応答するものでなければならない。 好ましい態様として、レトロウイルスベクターの核酸は、テトラサイクリン制 御トランス作用因子（ｔＴＡ）；内部リボソーム進入部位（ＩＰＥＳ）；選択可 能マーカー；テトラサイクリンオペレーターに機能できるように連結されたヒト サイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター；並びに逆転写および組み込み に必要なシス−作動性核酸配列をコードする。本発明の代表的なベクターの例を 図１Ａに示す。これはＡＴＣＣ Ｘ（アメリカ菌培養集積所(American Type Cul ture Collection)、Rockville，MD20852）として寄託されている。 本明細書で用いるとき、“機能できるように連結される”という用語は、プロ モーター配列と該プローモーター核酸配列によって調節される構造遺伝子との間 の機能的な連結を指す。機能的に連結されているプロモーターは、該構造遺伝子 によって、又は本発明の好ましい態様では異種遺伝子の核酸配列によってコード されるポリペプチドの発現を制御する。核酸配列の制御と発現のために“機能で きるように連結される”という要件が満たされる限り、ベクターの成分の方向性 または配置は厳密なものではない。 例えば大腸菌トランスポゾン１０でコードされるｔｅｔ耐性オペロンの制御成 分がテトラサイクリン−調節可能ベクター系の産生に用いられる。本発明の例示 ベクターでは、原核細胞ｔｅｔリプレッサーは、該リプレッサーを単純ヘルペス ウイルスＶＰ１６タンパク質の活性化領域（Ｃ−末端）と融合することによって 真核細胞トランス作用因子に変換される。このトランス作用因子は、ｔｅｔオぺ レーター配列に融合させた最少プロモーターP_hCMV*-1 からの転写を強力に活性 化させる(Gossenら、Proc．Natl．Acad．Scl．USA，89:5547(1992))。テトラサ イクリン制御トランス作用因子（ｔＴＡ）の合成はＰ_hCMV*-1 プロモーターを活 性化させ、ｖ−ｍｙｃオンコジーンはテトラサイクリン制御態様でこのプロモー ターから発現される。モロニーネズミ肉腫ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）が 、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用することによってｔＴＡおよびネ オマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）の両方を含むｍＲＮＡの 転写に用いられるのが好ましい。他のウイルスＬＴＲも用いることができるが、 それらは当業者には周知である。ｎｅｏの代わりに用いることができる他の選択 可能マーカー遺伝子には、例えばアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、 ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランス フェラーゼ（ＨＰＨ）およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラ ーゼ（ＸＧＰＲＴ，ｇｐｔ）が含まれる。 本明細書で用いるとき、“調節可能”という用語は、１つの成分が負の態様で 活性化される、即ち“ダウンレギュレートされる（down-regulated）”か、また は正の態様で活性化される、即ち“アップレギュレートされる(up-regulated)” ことを意昧する。好ましいベクターは、低濃度のテトラサイクリンがｔＴＡによ る転写活性化を停止させる、言い換えればｔＴＡが“ダウンレギュレートされる ”という意昧でｔｅｔ調節可能である。これによって機能的に連結された異種遺 伝子のプロモーターによる異種遺伝子発現（例えばｖ−ｍｙｃ）が続いて抑制さ れ、さらに例えば原始細胞を最終的にニューロンに分化させることができる。本 明細書に記載するテトラサイクリン系に類似する他の同様な調節可能トランス作 用成分は当業者には既知であろう。同様に、転写アクチベーターは“アップレギ ュレード”させることができ、その結果異種遺伝子の発現を増加させる。例えば 、ｖ−ｍｙｃ発現を誘発させるために、ｔｅｔリプレッサー突然変異体を調節可 能ｔＴＡに挿入することができる（例えばGossenら、Science，268:1766(1995) を参照のこと、この文献は参考として本明細書に含まれる）。 本発明のベクターを用いて、ニューロン原始細胞の感染に用いることができる 組換えレトロウイルスを産生することができる。したがって本発明の他の特徴と して、パッケージングされたウイルス粒子を産生するために、適切なパッケージ ング宿主細胞系を本発明のベクターで核酸感染させる。本発明のレトロウイルス ベクターは、その産物がウイルス粒子を構成する構造遺伝子をコードしない。レ トロウイルスプラスミドから感染性ウイルス粒子を産生するために、ｇａｇ、ｐ ｏｌ、およびｅｎｖによってコードされるウイルス構造タンパク質がパッケージ ング用細胞系によって供給される。このベクターはパッケージング配列、ψを含 み、したがってベクターＲＮＡが優先的にパッケージングされる。 当技術分野で標準的な方法によって産生される組換えレトロウイルスは不完全 であるので、感染性ベクター粒子を産生するためには補助が必要である。この補 助は典型的には、例えばこの失われたウイルス機能を提供するヘルパーパッケー ジング細胞系を用いることによって提供される。これらのプラスミドには、被包 化のためにＲＮＡ転写物をパッケージングメカニズムに認識させるヌクレオチド 配列が欠けている。パッケージングシグナルが欠失しているヘルパー細胞系には ネズミエコトロピック(ecotropic)系、例えばＰｓｉ−２（Ψ２）、ΨＣＲＥ、 ＧＰ＋Ｅ−８６およびΩＥ、ネズミアンホトロピック(amphotropic)系、例えば ＰＡ３ｌ７、ＰＡｌ２、ΨａｍおよびΨＣＲＩＰが含まれるが、これらに限定さ れるものではない（Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最 新プロトコル）、第１巻(1995)、Ausubel ら編、Greene Publish．Assoc．& Wil ley Interscience刊、Ch.9を参照のこと）。適切な細胞系は、ゲノムがパッケー ジングされないため空のビリオンを産生する。パッケージングシグナルは完全で あるが構造遺伝子が対象である他の遺伝子によって置換されている、そのような 細胞にレトロウイルスベクターが導入されると、このベクターはパッケージング されてベクタービリオンを産生することができる。 感染性ウイルスのストックは、本発明の好ましいベクターのプラスミドによっ てコードされるクローン化ベクターから、当該レトロウイルスベクタープラスミ ドを複製不完全ベクター用パッケージング細胞系に核酸感染させることによって 作製される。一旦ベクターが細胞系に入ると、該プラスミドによってコードされ るウイルスＬＴＲプロモーターから転写が進行し、ＲＮＡウイルスのゲノムが生 成される。続いてウイルスゲノムはウイルスの構造タンパクによって被包化され 、細胞表面から出芽することによって感染性ウイルス粒子が産生される。細胞に よょて産生された上清はウイルスストックを含む。 パッケージング細胞系はウイルス産生に用いられるが、高力価のウイルススト ックの持続的供給源として安定なプロデューサー細胞系を産生することが好まし い。核酸感染させたパッケージング細胞からベクタープラスミドが安定的に組み 込まれた細胞を選択することができる。それらを薬剤選択に付し、さらに生じた 薬剤耐性細胞をウイルス産生についてスクリーニングする。または、上記のよう にパッケージング細胞系から収穫した一過性産生ウイルスを集め、別のパッケー ジング系に感染させるのに用いて“交叉感染”を実施することができる。例えば 、本発明のこの方法では、最初にパッケージング細胞系Ｐｓｉ−２を核酸感染さ せ、この細胞系によって産生されたウイルスを用いてアンホトロピック細胞パッ ケージング細胞系、ＰＡ３１７を感染させる。細胞をＧ４１８耐性について選別 し、コロニーをｖ−ｍｙｃの産生および高力価の組換えレトロウイルスの産生に ついて選別する。 ある態様として、本発明は、上記のように産生されるパッケージされたウイル スを産生するパッケージング細胞系とともにそのパッケージされた組換えレトロ ウイルス自体も含む。ウイルスを産生する第一または第二のパッケージング細胞 系もまた“プロデューサー”細胞系と称される。したがって、本発明は、本明細 書に述べるベクターを含むパッケージング細胞系と、本明細書で述べる感染性組 換えレトロウイルスを産生するプロデューサー細胞系の両方を含む。本発明の代 表的なプロデューサー細胞系は実施例２に記載されている。他のプロデューサー 細胞系は、その実施例で述べる方法を利用して作製することができる。他の態様 として、本発明は、該プロデューサー細胞系によって産生された組換えレトロウ イルスを含む。本発明の組換えレトロウイルスは、単にニューロン原始細胞だけ でなく胎児および成人の一切の細胞型に感染することができることは理解されよ う。 本発明はまた、ニューロン原始細胞に異種核酸配列を導入し発現させる方法を 提供する。この方法は、細胞に本発明の組換えウイルスを感染させ、細胞内で該 異種核酸を発現させることを含む。したがって、本発明は、ニューロン原始細胞 を含む細胞の遺伝子修飾のための一般的方法を提供する。例えば、オンコジーン 、例えばｖ−ｍｙｃの導入によってニューロン原始細胞を不死化させ、その後こ の 細胞を長期にわたって培養し、その間ｖ−ｍｙｃ遺伝子を発現させる。または、 細胞を遺伝子修飾し、特定の遺伝子産物、例えばチロシンヒドロキシラーゼの産 生のために遺伝子を発現させることができる。 本発明はまた、ニューロン原始細胞の分化を誘発する方法を提供する。この方 法は、上述のように、プロデューサー細胞系によって産生されたレトロウイルス を原始ニューロン細胞に感染させ、細胞の分化が許容される条件下で、さらに分 化が許容されるために適切な時間、成長させることを含む。 細胞は、下記で考察するように培養条件（例えば適切な培養液、血清、成長因 子）下で、さらに分化を誘発するために十分な時間成長させる。当技術分野の技 術によって、ニューロン原始細胞が分化したか否かは容易に決定できる。例えば 、種々の前駆細胞のニューロン細胞マーカー、例えばビメンチンおよびネスチン は未分化細胞に存在し、分化細胞には存在しない。対照的に、例えばタウ、Ｎｅ ｕＮグルタミン酸デカルボキシラーゼ、および神経フィラメント２００ｋＤタン パク質（ＮＦＨ）のような細胞マーカーは分化ニューロンの指標である。免疫学 的または分子生物学的技術（例えばノザンブロット）を用いて、ニューロン細胞 マーカーを同定することができる。細胞はまた、再生活動電位(regenerative ac tion potential)を興奮させる大量のナトリウムおよびカルシウム電流の発現に よって分化について解析することができる（実施例５参照）。 神経系には、各々明瞭に区別される特性を有する数百の異なる種類の細胞が存 在する。各種類の細胞は、異なる組合せの神経伝達物質および神経栄養因子を産 生し、それに対して応答する。神経系の細胞は成人の脳では分裂しないし、イン ビトロでは処理または成長因子がなければ一般に長期にわたっては生存できない 。したがって、本発明の方法は原始細胞の長期培養の作製を提供する。ニューロ ンへの分化の誘発に用いることができるニューロン原始細胞は実質的に脳および 脊髄のいずれの領域からも単離できる(Palmerら、Mol．Cell．Neurosci.，6:476 (1995))。胚組織も成人の組織も用いることができる。“原始細胞”は、自己再 生の能力をもち、多くの種類の細胞（成人のニューロンを含む）に分化できる分 裂する細胞である。 原始ニューロンを含む組織は、胎児または成人のいずれの神経組織からでも得 ることができる。これらの組織には、海馬、小脳、脊髄、皮質（例えば運動皮質 または体性感覚皮質）、線条、前脳基底部（コリン作動性ニューロン）、腹側中 脳（黒質の細胞）、および青斑（中枢神経系の神経アドレナリン細胞）、および 視床下部が含まれる。実施例３は成人細胞の不死化を示すが、同じ技術が胎児細 胞の不死化に用いられた。 原始ニューロン細胞の成長と増殖を支援するために、本発明の原始ニューロン 細胞培養用液体培地には、塩基性線維芽細胞成長因子のような成長因子が補充さ れる。 可溶性因子との相互反応の他に、ニューロン細胞を含むほとんどの細胞はイン ビボで細胞外マトリックスと接触している。細胞外マトリックスは、局所的に分 泌され細胞間間隙に入り組んだネットワークを作る相互作用能をもつタンパク質 および多糖類分子の複雑な装置である。したがって、細胞外マトリックスタンパ ク質を培養容器表面に添加することによって、インビボの細胞外マトリックスに 厳密に対応する態様で培養神経細胞を付着させる不溶性マトリックスが形成され る。本発明の細胞は、容器、例えば培養皿またはフラスコの表面を多塩基性アミ ノ酸組成物で被覆し、最初の付着を可能にすることによって製造できるのが好ま しい。そのような組成物は当技術分野で周知であり、ポリオルニチンおよびポリ リジンが含まれる。最も好ましくは、本発明の多塩基性アミノ酸はポリオルニチ ンである。さらに、容器の表面を既知の細胞外マトリックスタンパク組成物で被 覆し、ニューロン細胞の成長能および基質での一連の変化を形成する能力を強化 することができる。そのような組成物にはラミニン、コラーゲンおよびフィブロ ネクチンが含まれる。多塩基性アミノ酸と一緒に用いることができる他の細胞外 マトリックスタンパクは当業者には明白であろう。 本発明の原始ニューロン細胞または分化ニューロン細胞は、ニューロンの生物 学的機能に影響を与える神経薬理学化合物のスクリーニング手段として有用であ る。したがって他の態様として、本発明はニューロンに影響を与える組成物を以 下のようにして同定する方法を提供する。被験組成物およびニューロンを含む成 分を相互作用させるために十分な条件下でインキュベートし、続いてニューロン に対する組成物の影響を測定する。ニューロンに対して認められる作用は抑制性 または刺激性のどちらかであろう。例えば、神経伝達物質に類似するか、または レセプターに結合し作動性または拮抗性作用を示し、それによってニューロンの 生物学的反応を抑制もしくは刺激する神経活性化合物は、本発明の方法を用いて 同定することができる。生物学的反応の出現は、当技術分野で周知の標準的技術 を用いてモニターできる。例えば、生物学的反応の抑制または刺激は、ニューロ ンのある種の遺伝子の発現レベルによって同定できる。そのような遺伝子にはｆ ｏｓ、ｍｙｃまたはｊｕｎのような初期反応遺伝子(M．Greenberg & Ｅ．Ziff,N ature，311:433(1984)；「腫瘍遺伝子(Oncogene)」、Burck ら編、Springer-Ver lag 刊、New York(1988))が含まれる。他の遺伝子（細胞表面マーカーをコード するものを含む）もまた、ニューロンに対する本発明の神経薬理学的化合物の作 用を示す指標として用いることができる。そのような作用の測定方法には、ＲＮ Ａのノザンブロット分析（転写）、タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（翻訳） 、〔 ³Ｈ〕−チミジン取り込み（ＤＮＡ合成）および抗体反応（細胞内および細 胞外ともに）が含まれる。他の通常用いられる方法は当業者には自明であろう。 ニューロン細胞に影響を与えることが既に分かっているものと同様に作用する 神経活性薬剤もしたがって同定できる。例えば、重要な抑制伝達物質、ガンマア ミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の作用を増強または刺激するヴァリウム（Vallum）と同じ ように不安を軽減する新規な薬剤を同定できる。プロザックのような抗うつ剤は セロトニン（広範囲の機能を有するインドールアミン）の作用を強化する。他の 薬剤も本発明の方法にしたがってニューロンを用いて容易に同定できる。他の例 には精神活性化合物が含まれる。例えば、コカインはドーパミンの作用を促進す る一方、ある種の抗精神病薬はこのカテコールアミンに拮抗するか又はそれを抑 制する。他の例として、大脳皮質全体に分布するアセチルコリンレセプターを活 性化させるニコチンがある。したがって、脳の適切な領域に存在する原始ニュー ロン細胞由来のニューロンを用いることによって、種々のレセプターに結合し、 ニューロン細胞に対して同様な作用を生じるであろうと思われる薬剤および栄養 因子を同定することができる。 本発明はまた、ニューロン細胞疾忠をもつ対象者に治療上有効量の原始ニュー ロン細胞を投与することによって、その対象者を処置する方法を提供する。本明 細書で用いられる“治療上有効”という用語は、ニューロン疾患の原因を改善す るために十分なニューロン量を意昧する。“改善する”とは、当該治療を受ける 患者のニューロン疾患の有害な影響を減少させることを意味する。例えば、パー キンソン氏病の患者では、治療上有効量のチロシンヒドロキシラーゼ産生細胞を 投与することが望ましいであろう。本発明の対象者は好ましくはヒトであるが、 ニューロン疾患をもついずれの動物も本発明のニューロンで治療できることは想 像に難くないであろう。最初の原始ニューロン細胞は、治療を受ける対象者の種 と同じ種のニューロン組織から得るのが好ましい。 ニューロン疾忠をもつ対象者を処置する方法は、その疾忠を有するＣＮＳ領域 にニューロン原始細胞を脳内移植することを伴う。必要な場合には、原始ニュー ロン細胞は遺伝子操作され外因性遺伝子を含むことができる。疾患は病気または 外傷（損傷）のどちらかに由来するものであろう。ニューロン原始細胞の移し変 え、即ち“移植”は、中枢神経系への、または脳室内もしくはホストの脳表面の 硬膜下への細胞の移植を伴う。そのような移植方法は当技術分野では周知であり 、「ホ乳類ＣＮＳの神経移植（“Neural Grafting in the Mammalian CNS”）」 、Bjorklund & Stenevi 編(1985)（この文献は参考として本明細書に含まれる） に記載されている。移植方法には、移植時点で脳柔組織にくっつけて配置できる ようにホストの脳内にある組織を注射または沈着させることによって達成される 柔組織内移植（すなわちホストの脳内）が含まれる。 受容者の脳の選択領域に本発明のニューロン原始細胞を投与することは、硬膜 に穴を開け貫通させてマイクロシリンジの針が挿入できるようにすることによっ て実施できる。または、ニューロン原始細胞を脊髄領域の鞘内に注射することが できる。本発明の原始ニューロン細胞を調製することにより、脳および脊髄内の いずれの所定部位へもこれらの細胞を移植することが可能となり、同じ細胞懸濁 物を用いて幾つかの異なる部位へ同時に多くの移植を実施でき、かつ解剖学的に 異なる領域に由来する細胞の混合が可能となる。本発明は、以前には利用できな かった増殖する原始ニューロン細胞およびこれら原始ニューロン細胞の産生培養 系を提供してインビトロ遺伝子移転、その後のインビボ移植のために十分な数の 細胞を成長させることによって種々のニューロン組織を移植する方法を提供する 。 ニューロン疾患の処置に用いられる、本発明の方法によって産生した原始ニュ ーロン細胞は、場合によって外因性遺伝子を含んでもよい。これら遺伝子は、例 えばオンコジーン、レセプターをコードする遺伝子、またはリガンドをコードす る遺伝子である。そのようなレセプターには、ドーパミン、ＧＡＢＡ、アドレナ リン、ノルアドレナリン、セロトニン、グルタメート、アセチルコリンおよび上 記に述べたような他の神経ペプチドと反応するレセプターが含まれる。ニューロ ン疾患に対して治療的効果を提供しえるリガンドの例には、ドーパミン、アドレ ナリン、ノルアドレナリン、アセチルコリン、ガンマアミノ酪酸およびセロトニ ンが含まれる。ドナーとなる原始ニューロン細胞によって分泌された後必要なリ ガンドの拡散および取り込みは、対象者のニューロン細胞がそのような遺伝子産 物の産生において不完全である疾患で有益であろう。神経栄養因子、例えば神経 成長因子（ＮＧＦ）を分泌するように遺伝子修飾された原始ニューロン細胞は、 処置しなければ死を免れないコリン作動性ニューロンの変性を防止するために用 いることができる。または、脳幹神経節の疾患、例えばパーキンソン氏病の対象 者に移植されるべき原始ニューロン細胞は、ドーパミン前駆体Ｌ−ＤＯＰＡをコ ードする外因性遺伝子を含むように修飾することができる。パーキンソン氏病の 特徴は中脳黒質のドーパミンニューロンの消失であり、該ニューロンの主要標的 器官は脳幹神経節である。または、ドーパミンを産生する黒質ニューロン細胞に 由来するニューロンをパーキンソン氏病患者の脳に導入し、“天然の状態で”ド ーパミンを産生する細胞を提供できる。 本発明の方法で同様に処置できる他のニューロン疾患にはアルツハイマー病、 ハンチントン氏病、卒中発作によるニューロンの損傷、および脊髄損傷が含まれ る。アルツハイマー病の特徴は前脳基底部のコリン作動性ニューロンの変性であ る。これらのニューロンの神経伝達物質はアセチルコリンであり、これはニュー ロンの生存に必要である。コリン作動性ニューロンまたはこれらニューロンの生 存を促進する因子のための外因性遺伝子を含むニューロンの移植は、既に述べた ように本発明の方法によって達成できる。卒中発作の後、海馬のＣＡ１内の細胞 の選択的消失が大脳皮質細胞の消失とともに認められるが、これはこのような患 者で認識機能および記憶の消失を引き起こすであろう。一旦同定が完了すれば、 ＣＡ１細胞の死をもたらす分子を本発明の方法によって抑制することができる。 例えば、アンチセンス配列または拮抗因子をコードする遺伝子を原始ニューロン 細胞に導入し、脳の海馬領域に移植できる。 ニューロン疾患をもつ対象者を処置する方法はまた、ＣＮＳの疾患の処置に有 用な他の治療方法と組み合わせて原始ニューロン細胞を移植することを含む。例 えば、原始ニューロン細胞は、例えば成長因子、ガングリオシド、抗生物質、神 経伝達物質、神経ホルモン、毒素、軸索促進分子および代謝拮抗物質、並びにこ れら分子の前駆体（例えばドーパミン前駆体Ｌ−ＤＯＰＡ）のような薬剤ととも に同時投与することができる。 以下の実施例は説明のためであり本発明を限定するものではない。これら実施 例は使用可能な典型的なものであるが、当業者は既知の他の方法もまた用いるこ とができよう。 実施例 ベクターの構築 レトロウィルスベクターＬＩＮＸｖ−ｍｙｃを以下のように構築した：ｔＴａ のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（１．０２ｋｂ）をｐＵＨＤ１５−１（ Gossenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:5547(1992))から切り出し、ｐＨＥ ＮＡ（Palmerら、Nucl．Acids Re.，21:3451(1993)）の脳心筋炎ウイルス内部リ ボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の直ぐ上流に挿入した。得られたｔＴＡ、ＩＲＥ Ｓおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼを含むＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩ フラグメント（２．７８ｋｂ）をＬＸＳＨＤ（Stockschlaederら、Human Gene T herapy，2:33(1991))のポリリンカー部位（Ｈａｐ１及びＢａｍＨＩ）に挿入し た。続いてＳＶ４０初期プロモーターとヒスチジノールデヒドロゲナーゼｃＤＮ ＡまでのＬＸＳＨＤ部分をＰ_hCMV*-1 −ｖ−ｍｙｃ（３．３２ｋｂ）フラグメン トで置換した。Ｐ_hCMV*-1 はｐＵＨＤ１０−３に由来し、ｖ−ｍｙｃ（７）Ｓａ ｃＩ−ＳｐｈＩフラグメント（２．８７ｋｂ）はｐＭＣ３８（ＡＴＣＣ，ロック ビル、メリーランド）に由来する。代表的なベクターを、本出願の出願日前にア メリカ菌培養集積所（ロックビル、メリーランド、ＵＳＡ）に寄託した。 以下の細胞系を、アメリカ菌培養集積所（1301 Parklawn Drive，Rockville, MD，20852，USA）（ＡＴＣＣ）に1996年２月16日に寄託した： 細胞系（培養） ＡＴＣＣ受託番号 ＬＩＮＸｖ−ｍｙｃ Ｘ 寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およ び条約に付随する規則（ブダペスト条約）の規定にしたがって行われた。出願人 は寄託の日から30年間、生命活性を有する培養の維持を保証する。生物は、関連 米国特許の発行、または一切の米国もしくは外国特許出願の公開の何れか早いも のに際して、公衆に対する培養の子孫の永遠かつ制限のない利用可能性を保証す るブダペスト条約の規定の下にＡＴＣＣによって利用に供されるであろう。さら に出願人は、35ＵＳＣ§122 およびそれに関する規則（37ＣＦＲ§1.14および特 に８８６ＯＧ６３８を含む）にしたがい、米国特許商標庁長官が権利を有すると 決定した者に対して培養の子孫の利用可能性を保証する。 寄託培養が適切な条件下で培養されたときに、死滅または消失もしくは破壊し た場合、通知に際して寄託培養は速やかに同じ培養であって生命活性を有する試 料と差し替えられる。寄託株の利用可能性は、一切の政府の監督機関の下でその 特許法にしたがって付与された権利に違反する、本発明を実施する権利と解釈し てはならない。細胞培養 全てのパッケージング細胞系およびプロデューサー細胞系は、10％ウシ胎児血 清添加ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Dulbecco's modified Eagle's medium）で培養された。Ｐｓｉ−２細胞に、ＬＩＮＸｖ−ｍｙｃプラスミドＤＮ Ａ10μｇを標準的なリン酸カルシウム法によって核酸感染させた。核酸感染後２ 日でＰｓｉ−２細胞から採集したウイルス含有培養液を用いて、アンホトロピッ クＰＡ３１７細胞を感染させた。感染後１日して細胞を１：10の割合で分割し、 プレートで培養してＧ４１８(400μｇ／ｍｌ)耐性について選別した。８日間選 別した後コロニーを釣り上げ、ベクターの適切な組み込み、ｖ−ｍｙｃの産生お よびレトロウイルス力価について検査した。 ラット成獣（３か月齢）の海馬から細胞を単離し、既に報告された方法(J．Ra y & F．Gage，J．Neurosci.，14:3548(1994))に以下のような修飾を加えて培養 した。酵素による分解後組織から単離した細胞をＤＭＥＭ：Ｆ−１２（１：１） 高グルコース培養液（10％ウシ胎児血清含有）(Irvine Scientific)に再浮遊さ せ、続いて被覆していないプラスチックの組織培養フラスコに平板培養した（１ ×10⁶ 細胞／75ｃｍ² フラスコ）。細胞を37℃で５％ＣＯ₂ インキュベータで成 長させた。その次の日、血清含有培養液を、Ｎ２補充物（５μｇ／ｍｌインスリ ン、50μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、20ｎＭプロジェステロン、100μＭプ トレシン、30ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、2.5ｍＭグルタミン(GIBCO)）および20 ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２（ヒトの組換え体）を含む血清非含有ＤＭＥＭ：Ｆ１２ 培養液と交換した。互いに融合するまでに成長した（コンフルエント）培養細胞 をポリオルニチン／ラミニン被覆プレートに継代して培養した。増殖を続ける培 養（19回の継代によって約１年間維持）を１：３の割合で分割し、１日後にプロ デユーサー細胞系の条件付け培養液１容とＤＭＥＭＥ：Ｆ１２（Ｎ２補充物、２ ０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２および４μｇ／ｍｌポリブレン含有）２容の混合物を 用いて20時間感染させた。感染細胞を１：４の比で分割してＧ４１８(100μｇ／ ｍｌ) の存在下で選別した。ノザンブロット分析 全ＲＮＡをＣｓＣｌ−グアニジニウムチオシアネート法(Ausubelら、Short Pr otocols in Molecular Biology，142頁(1989))によって単離した。全ＲＮＡの15 μｇをホルムアルデヒド−アガロース(1.5％) ゲルで分離し、マグナグラフ（Ma gnagraph）ナイロン膜に移し、ランダムプライミングで作製したｖ−ｍｙｃまた はシクロフィリン（ｐＢ１Ｂ１５）をプローブとして用いて調べた。免疫蛍光染色 ポリオルニチン／ラミニンで被覆したラブテック(Lab-Tek)ガラスチャンバー スライド（Nunc）上にテトラサイクリン（１μｇ／ｍｌ）の存在下、非存在下で 細胞を播種し、１日（テトラサイクリン非存在下）または５日（テトラサイクリ ン存在下）間培養し、続いて４％パラホルムアルデヒドで10分間固定した。細胞 を４％ロバ血清および 0.3％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ中の一次抗体 とともに４℃で一晩、続いてフルオレセイン（ＦＩＴＣ）共役二次抗体（Jackso n Immunoresearch Laboratories，Inc.；１：500で使用）で室温で４時間連続し てインキュベートした。スライドを 2.5％1,4-ジアゾビシクロ[2.2.2] オクタン 含有9.6 ％ポリビニルアルコールおよび24％グリセロール中に置いた。用いたモ ノクローナル抗体は、タウ（Boehringer Mannheim 製、１：250 で使用）、神経 フィラメント２００ｋＤａ（ＮＦＨ）（クローンＲＴ９７、Boehringer Mannhei m 製、２ｍｇ／ｍｌで使用）、ＮｅｕＮ（１：５で使用、Mullenら、Developmen t，116:201(1992)）に対するもので、ポリクローナル抗体は、ビメンチン（Amer sham製、１：10で使用）、グリア原線維酸性タンパク（ＧＦＡＰ）（Chemicon I nternational製、１：2000で使用）、ネスチン（１：10,000で使用）およびｖ− ｍｙｃ(Upstate Biotechnology製、１：8000で使用) に対するものである。ブロ モデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の免疫蛍光染色のために、細胞をＢｒｄＵ（Am ersham，１：1000で使用）で18時間インキュベートし、95％エタノール／５％酢 酸で固定し、続いてモノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体（Amersham，未希釈）でイン キュベートした。免疫反応性は、抗マウスビオチン付加ＩｇＧに続いてストレプ トアビジンーテキサスレッド共役物を用いて検出した。 クリプトン／アルゴンレーザーを搭載し、ツァイス (Zeiss)湾曲(Axiovert)顕 微鏡に連結したバイオラッド（BioRad）ＭＲＣ600 共焦点顕微鏡を用いて、細胞 の共焦点顕微鏡画像を得た。画像は、各チャネルのために適切な励起フィルター と適合するＫ１／Ｋ２フィルターブロックを用いて連続的に収集した。微分干渉 対比光学における透過光画像を、透過野検出器を用いて蛍光シグナルの表示で捕 らえた。バックグラウンドの蛍光シグナルを排除するための装置の設定は、一次 抗体が省略されているネガティブ・コントロールのウェルに対して実施し、他の ウェルを陽性シグナルについて画像化する前にゲインレベルおよびブラックレベ ルを、このネガティブ・コントロールウェルから発する一切のシグナルを排除す るように調節した。収集したデジタル画像はアドーブフォトシヨップ (Adobe Ph otoshop)3.0 で合成し、フジックスピクトログラフィー（FujixPictrography）3 000にプリントした。位相差画像は、Ｔ−Ｍａｘフィルムを用いてニコンダイア フォト（Nikon Diaphot）で撮影し、ネガはリーフルミナ (Leaf Lumina)を用い てデジタル化した。これらの画像は上記のようにプリントした。ＲＴ−ＰＣＲ分析 プライマーとしてランダム６量体（10μＭ）を用いて、全ＲＮＡの100 ｎｇを 反応混合物20ｍｌ（10ｍＭトリス−Ｃｌ (ｐＨ8.4)、50ｍＭ ＫＣｌ、3.8ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、各々につき１ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、 および20Ｕ RNasin (Promega)を含む）中でトリ骨髄芽球症ウイルスの逆転写酵 素 (Promega)により逆転写した。42℃で75分後、95℃で５分間熱不活化して反応 を終結させた。ＰＣＲ増幅について、数セットの特異的オリゴヌクレオチド対（ 10ｎｇ／μｌ）を、上記の反応混合物および５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（ Perkin Elmer）とともに反応混合物 100μｌ（10ｍＭトリス−Ｃｌ (pH8.4)、50 ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ および２μＣｉ〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰを含む ）中でインキュベートした。サイクルパラメーターは、94℃２分間、60℃２分間 、および72℃２分間で23サイクル、それに続く最後の10分間の72℃でのインキュ ベーシュンであった。各反応の40μｌを８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動と それに続くオートラジオグラフィーによって分析した。ラットリボソームタンパ ク質Ｌ２７ａのためのプライマーを用いるコントロール実験（内部標準）によっ て、増幅ＰＣＲ生成物の量は、２３サイクルの増幅後、投入ＲＮＡ量と正比例す ることがわかった。２つのプライマー間のゲノムＤＮＡの配列は、ＲＮＡから得 られる生成物と夾雑ゲノムＤＮＡとの区別のためにそれら配列が１つまたは２つ のイントロンを含むように選択された。以下のオリゴヌクレオチドをプライマー として用いた（ヌクレオチドの位置は括弧内に示す）。ラットリボソームタンパ ク質Ｌ２７ａ（Woolら、Biochem Biophys．Acta，1050:69(1990))５’プライマ ー：５'-ATCGGTAAGCACCGCAAGCA-3'（69〜88）（配列番号：１）；３’プライマ ー：５'-GGGAGCAACTCCATTCTTGT-3'（302〜283）（配列番号：２）；ラットＧＦ ＡＰ（Woolら、Biochem Biophys．Acta，1050:69(1990)）５’プライマー：５'- ACCTCGGCACCCTGAGGCAG-3'（459〜478）（配列番号：３）；３’プライマー：５' -CCAGCGACTCAACCTTCCTC-3'（599〜580）（配列番号：４）；ラットグルタミン酸 デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）（Wyborskiら、Mol．Brain Res.，8:193(1990)） ５’プライマー：５'-AAGGTTTTGGACTTCCACCAC-３'（589〜609）（配列番号：５ ）；３’プライマー：５−CATAAGAACAAACACGGGTGC-3'（855〜835）（配列番号： ６）；ラットＮＦＨ(Breenら、FEBSLett.，241:213(1988))５’プライマー：５ ’-GAGGAGATAACTGAG TACCG-３'（247〜266）（配列番号：７）；３’プライマー：５'-CCAAAGCCAATCC GACACTC-３'（548〜529）（配列番号：８）。電気生理学 完全細胞の形状のパッチクランプ術を用いて電圧量により閉じられる電位依存 性電流（voltage-gated currents）を調べた。ピペット（３−から５−ＭΩ抵抗 ）をボラレックス (Boralex)ガラス（Rochester ScientificCo.）から引き出し 、シルガード (Sylgard（Dow CorningCorp.))で被覆し炎でつや出しした。108 ｍＭメタンスルホン酸セシウム、４ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、９ｍＭ ＥＧＴＡ（エチ レングリコールビス（ｂ−アミノエチルエーテル）−N,N,N',N'-四酢酸）、９ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ（４-（２-ヒドロキシエチル）−１-ピペラジンエタンスルホン酸 ）、４ｍＭ ＡＴＰ、14ｍＭリン酸クレアチン（トリス塩）、0.3ｍＭ ＧＴＰ （トリス塩）および50Ｕ／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ (水酸化セシウムでｐ Ｈ7.4)を含む内部溶液をこのピペットに満たした。先ず、すべての細胞の記録を 浴液（タイロード液： 150ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、10ｍＭグルコース、10ｍＭ ＨＥＰＥＳ (ＮａＯＨでｐＨ7.4)、２ｍＭ Ｃ ａＣｌ₂ 、およびいくつかの場合には４ｍＭ ＢａＣｌ₂ を添加）中で確立した 。ナトリウム電流は、この浴液に特徴がある一方、カルシウム電流は、160ｍＭ 塩化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ−Ｃｌ）、10ｍＭ ＢａＣｌ₂ および10 ｍＭＨＥＰＥＳ (ＴＥＡ−ＯＨでｐＨ7.4)、添加１μＭテトロドトキシン (ＴＴ Ｘ、Sigma)を含む外部溶液で評価した。外部溶液は一連の微量毛細管（内径 140 μｍ）から流れ、重力によって駆動され液の交換は500mｓｅｃで完了した。すべ ての細胞電流は、アキソパッチ（Axopatch）200 Ａパッチクランプ増幅器および BASIC-FASTLAB インターフェースシステム (INDEC Systems)を用いて記録した。 電位依存電流は10ＫＨｚでフィルターに通し (４極ベッセルローパス(4-pole Be ssel low-pass))、25μs（ナトリウム電流）または50μｓ（カルシウム電流）毎 にデジタル化した。典型的には直列抵抗補償は、非補償容量過渡電流（崩壊時間 定数を細胞の静電容量で割る）から、または容量過渡電流（capacity transient ）を零にするために用いた電位差計から測定した直列抵抗の80〜95％について用 いた。残存する電圧量誤差（電流×非補償直列抵抗として計算）が１ｍＶ未満で あり、かつテスト脱分極の増加にしたがいピーク電流の増加が減少することによ って判断したとき、電圧量コントロールが適切である場合にのみ、データをナト リウムおよびカルシウム電流として受け入れた。得られた電位差は、内部溶液と タイロード溶液との間の液体結合部電位差−10ｍＶとして補正した。ここでピペ ット電流は細胞上で封入する前に零にした。ナトリウムおよびカルシウムチャネ ル電流は、−80ｍＶから−90ｍＶの高脱分極によって誘発した適切に増加させた 電流を減じることによって漏出電流および許容電流について修正した。全ての実 験は21〜25℃で実施した。統計データは平均±ＳＥＭとして与えられる。 実施例２ プロデューサー細胞系の作製 大腸菌トランスポゾン１０のtｅｔ−耐性オペロンの制御成分を用いて、テト ラサイクリン−調節可能ベクター系を作製した（Gossenら、上掲書(1992); Goss enら、Trends Biochem．Sci.，18:471(1993)）。このベクターでは、原核細胞ｔ ｅｔリプレッサは、このリプレッサを単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパクの 活性化ドメイン（Ｃ−末端）と融合させることによって真核細胞のトランス作用 因子に変換された。このトランス作用因子は、ｔｅｔオペレータ配列（Gossenら 、上掲書(1992)）と融合した最少プロモーターＰ_hCMV*-1 からの転写を強力に活 性化させる。このプロモーターはＨｅＬａ細胞または遺伝子導入マウスのほとん どの組織で極めて低い基礎活性を有するが、ｔＴＡの合成ばＰ_hCMV*-1 プロモー ターを活性化させる (Gossenら、上掲書(1992); Gossenら、上掲書(1993);Efrat ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，92:3576(1995); Furthら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，91:9302(1994))。このベクター系を用いて、レトロウイルスベクタ ーを構築し、テトラサイクリンによる調節様式でｖ−ｍｙｃオンコジーンをＰ_{hC MV*-1} プロモーターから発現させた（図１Ａ）。モロニーネズミ肉腫ウイルスの 末端反復配列（ＬＴＲ）は、脳心筋炎ウイルス内部リボソーム進入部位（ＩＲＥ Ｓ）によってｔＴＡおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺 伝子の両方を含む７．８ｋｂ ｍＲＮＡを転写した（図１Ｂ）。ｔＴＡは、テト ラサイクリンの非存在下でハイブリッドプロモーターに存在するｔｅｔオペレー ター配列と結合し、Ｐ_hCMV*-1 からの転写を促進して３．５ｋｂのｍＲＮＡ（こ れは ｖ−ｍｙｃ腫瘍タンパク質を生成する）を生じる（図１Ｂ）。テトラサイクリン （１μｇ／ｍｌ）はｔＴＡの機能をほぼ完全に抑制し、ｖ−ｍｙｃの産生を抑圧 した（図１Ｃ）。ＬＩＮＸｖ−ｍｙｃレトロウイルスを産生するアンホトロピッ クプロデューサー細胞系を選別し成長させた。このウイルスはＮＩＨ３Ｔ３細胞 に対して10⁵ ｃｆｕ／ｍｌの力価を有し、へルパーウイルスを含んでいなかった 。 実施例３ 不死化ニューロン原始細胞の単離 成獣ラット海馬の培養細胞にＬＩＮＸｖ−ｍｙｃレトロウイルスを感染させ、 安定な核酸感染体を選択した。幾つかのコロニーからなる培養、ＨＣ２は、１μ ｇ／ｍｌテトラサイクリンの添加後３日でニューロンの形態（長い突起を有する 小型のフエーズブライトな（phase bright）細胞）を有する幾つかの細胞を示し た。ＨＣ２細胞を低密度（１：1000）で播種し、単一コロニーを単離した（ＨＣ ２Ｓ２）。胎児の原始細胞の感染に用いたものと同じプロトコルを用いて胎児の 不死化ニューロン原始細胞を得た。 図２は、ＬＩＮＸｖ−ｍｙｃレトロウイルスに感染させた成獣の海馬原始細胞 の単一クローン（ＨＣ２Ｓ２）由来の培養を示す。ＨＣ２Ｓ２細胞は、テトラサ イクリンの非存在下（２Ａ）で２日間成長させ、テトラサイクリン（１μｇ／ｍ ｌ）の存在下（２Ｂ）で３日間成長させた。テトラサイクリンの非存在下または 存在下で成長したＨＣ２Ｓ２細胞のＬＴＲからの転写物（７．８ｋｂのｍＲＮＡ ）およびＰ_hCMV*-1 からの転写物（３．５ｋｂのｍＲＮＡ）が、ノザンブロット 分析によって示された。臭化エチジウムで染色したゲルの写真を内部標準として 供する。 ＨＣ２Ｓ２細胞は多角形で非常に短い突起を有していた（図２Ａ）。これらの 細胞はただ１つのレトロウイルスゲノムの組み込み部位を有し、したがって単一 コロニーと考えられることがサザンブロット分析によって示された。ＨＣ２Ｓ２ 細胞は非常に迅速に成長し（倍加時間は12時間）、成長に対する接触抑制を受け なかった。しかしながら、テトラサイクリン１μｇ／ｍｌを添加して２日後に細 胞は分裂を停止した。テトラサイクリンの添加後３日までに、殆どの細胞はフェ ースブライトとなり、さらに突起を伸ばし始め、この突起は互いに連絡を開始し た（図２Ｂ）。テトラサイクリン非存在下で成長させたとき、実質的に全てのＨ Ｃ２Ｓ２細胞はＢｒｄＵを取り込むことがＢｒｄＵ取り込み実験によって示され た。しかしながら、２日間テトラサイクリンで処理し続いてＢｒｄＵとともにイ ンキュベートした場合、この標識を取り込んだ細胞は１〜２％のみであった（図 ３Ｄ）。 テトラサイクリン非存在下で成長させたＨＣ２Ｓ２細胞では、大量の３．５ｋ ｂのｖ−ｍｙｃ転写物が産生されることがノザンブロット分析で示された。しか しながら、転写物の量はテトラサイクリン添加後に減少した。これらの結果から 、テトラサイクリンは、ＨＣ２Ｓ２細胞でハイブリッドプロモーターからのｖ− ｍｙｃの転写を調節することを示唆した（図２Ｃ）。ＬＴＲプロモーターからの 転写もまた減少した（図２Ｃ）。タンパク質レベルでは、ＨＣ２Ｓ２細胞の核内 のｖ−ｍｙｃ腫瘍タンパク質の発現もまた、テトラサイクリン添加後にダウンレ ギュレートされた（図３Ａ、Ｂ）。テトラサイクリンによるｖ−ｍｙｃ産生の抑 圧はＨＣ２Ｓ２細胞の分裂を停止させ、分化を誘導させるために十分であったが 、オンコジーンの抑圧は完全ではなかった。 実施例４ ｖ−ｍｙｃ産生の抑圧は不死化ニューロン原始細胞を ニューロンに分化させるために十分である 増殖条件下および分化条件下でのＨＣ２Ｓ２細胞におけるニューロン前駆細胞 マーカー、ネスチンおよびビメンチン並びにニューロンマーカー、タウ、Ｎｅｕ Ｎおよび神経フィラメント２００ｋＤタンパク（ＮＦＨ）の発現を調べた。 図３は、ｖ−ｍｙｃおよびＢｒｄＵに対する免疫蛍光染色を示す。ＨＣ２Ｓ２ 細胞はテトラサイクリンの非存在下で１日（Ａ、Ｃ）、テトラサイクリン（１μ ｇ／ｍｌ）の存在下で２日（Ｄ）または３日（Ｂ）成長させた。細胞は、抗ｖ− ｍｙｃ抗体（Ａ、Ｂ）で染色するか、またはＢｒｄＵとともに18時間インキュベ ートして抗ＢｒｄＵ抗体（Ｃ、Ｄ）で染色した。 図４はニューロンマーカーの免疫蛍光染色を示す。ＨＣ２Ｓ２細胞はテトラサ イクリンの非存在下で１日（Ａ、Ｃ、Ｅ）、テトラサイクリン（１μｇ／ｍｌ） の存在下で５日（Ｂ、Ｄ、Ｆ）成長させた。細胞を抗ＮＦＫ抗体（Ａ、Ｂ）、抗 タウ抗体（Ｃ、Ｄ）、および抗ＮｅｕＮ抗体（Ｅ、Ｆ）で染色した。テトラサイ クリンの非存在下で成長させたとき、細胞はネスチンおよびビメンチンを発現し た。幾つかの細胞の細胞質が抗ＮＦＨ抗体で染色されたが（図４Ａ）、抗タウ抗 体または抗ＮｅｕＮ抗体で染色された細胞は認められなかった（図４Ｃ、Ｅ）。 テトラサイクリンの添加後５日して、ほとんど全ての培養細胞はＮＦＨ陽性とな り、半分以上の細胞がタウおよびＮｅｕＮ陽性になった（図４Ｂ、Ｄ、Ｆ）。細 胞体とともに突起は、抗ＮＦＨ抗体および抗タウ抗体によって染色され（図４Ｂ 、Ｄ）、核は抗ＮｅｕＮ抗体によつて染色された（図４Ｆ）。しかしながら、ネ スチンおよびビメンチン染色は細胞内にもはや存在しなかった。 図５は、テトラサイクリンの非存在下または存在下で成長させたＨＣ２Ｓ２細 胞で検出されたＧＡＤ（Ｅ）胎児型（３５３ｂｐ）、ＧＡＤ（Ａ）成人型（２６ ７ｂｐ）、リボソームタンパク質Ｌ２７ａ（２３４ｂｐ）、ＧＦＡＰ（１４１ｂ ｐ）、ＮＦＨ（３０２ｂｐ）、ＮＦＬ（１５５ｂｐ）のＰＣＲ産物を示す。 免疫学的実験と平行して、ＨＣ２Ｓ２細胞による分化ニューロン細胞マーカー の発現をＰＣＲ分析によって示した。プライマーのデザインによって、リボソー ムタンパク質Ｌ２７ａについては２３４ｂｐ（７）ＰＣＲ産物が予想され、ＧＡ Ｄの成人型については２６７ｂｐ，ＧＡＤの胎児型については３５３ｂｐ、ＧＦ ＡＰについては１４１ｂｐ、ＮＦＨについては３０２ｂｐのＰＣＲ産物が予想さ れた。ＧＡＤのプライマーデザインにより、胎児型ＧＡＤ（これは不活性な短縮 型酵素である）と成人型ＧＡＤ（これは活性酵素である）とを識別することがで きる (Bondら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:8771(1990))。ＰＣＲ実験は、 テトラサイクリン添加後３日で分化ＨＣ２Ｓ２細胞で両方の型のＧＡＤおよびｍ ＲＮＡが顕著に増加することを示した（図４）。非常に僅かのＮＦＨ ＰＣＲ産 物がテトラサイクリンとともに成長させたＨＣ２Ｓ２細胞で検出され、極めて僅 かの細胞のみが抗ＮＦＨについて免疫反応陽性であったという発見と対応した。 しかしながら、テトラサイクリンの添加後ＮＦＨＰＣＲ産物の増加があった（図 ５）。ＧＦＡＰ ｍＲＮＡはテトラサイクリンの存在下、非存在下で成長させた 細胞で検出することができた（図５）。 実施例５ 不死化細胞はｖ−ｍｙｃ産生の抑圧後 ナトリウムおよびカルシウム電流を発現する 増殖条件下および分化条件下で成長させた後のＨＣ２Ｓ２細胞の電気生理学的 記録は、分化ＨＣ２Ｓ２細胞がニューロンであるということのまた別の証拠を提 供する。 図６は、テトラサイクリンの非存在下（−Ｔｃ）または存在下（＋Ｔｃ）で６ 日間、20ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２とともに成長させたＨＣ２Ｓ２細胞を示す。保 持電位差−80ｍＶからテスト電位差−50、−30、−10、10および30ｍＶの脱分極 によって誘発されたナトリウム電流（６Ａ）。保持電位差−80ｍＶからテスト電 位差−40、−20、０および20ｍＶの脱分極によって誘発されたカルシウムチャネ ル電流（６Ｂ）。テトラサイクリンの存在下または非存在化で成長させた後の平 均ナトリウム（Ｉ_Na）電流およびカルシウムチャネル（Ｉ_Ba）電流密度（６Ｃ） 。電流密度は、全細胞の静電容量に対して標準化した電流の大きさである。各棒 線は16個（Ｉ_Na、＋Ｔｃ）、12個（Ｉ_Na、−Ｔｃ）、10個（Ｉ_Ba、＋Ｔｃ）また は11個（Ｉ_Ba、−Ｔｃ）の細胞の平均を示し、誤差棒線はＳＥＭである。 増殖条件下（ＦＧＦ−２、−Ｔｃ）および分化条件下（ＦＧＦ−２、＋Ｔｃ、 ６日間）で成長させた後、完全細胞電圧量クランプでＨＣ２Ｓ２細胞を調べた。 増殖条件下では、細胞は休止状態で実質的にナトリウム電流を示さず（５±１ｐ Ａ／ｐＦ、12個の細胞）、またカルシウム電流も示さなかった（４±１ｐＡ／ｐ Ｆ、11個の細胞）。テトラサイクリンとともに成長させた後、実質的なナトリウ ムおよびカルシウム電流が存在した（図６ＡおよびＢ；＋Ｔｃ）。回復ナトリウ ムおよびカルシウム電流の密度（図６Ｃ）は、それぞれ96±18ｐＡ／ｐＦ（16個 の細胞）および21±３ｐＡ／ｐＦ（10個の細胞）であり、分化ラツト胎児海馬の 一次培養細胞で存在するものと同様であった。ナトリウムおよびカルシウム電流 は、−40ｍＶよりも正の電圧量で活性化され、それぞれ−10±２ｍＶ（10個の細 胞）および−３±２ｍＶ（４個の細胞）でピークに達し、78±２ｍＶ（８個の細 胞）および55±９ｍＶ（３個の細胞）で逆転した。分化ＨＣ２Ｓ２細胞の回復ナ トリウム電流はニューロン型であり、中央点−60±１ｍＶ（14個の細胞）および 迅速な消長動態（ピークへの時間は0.8±0.1ｍｓｅｃ、13個の細胞）をもつ電 圧依存型の不活性化を示した。さらに、回復ナトリウム電流は１μＭのＴＴＸに よって遮断される（95±１％抑制、６個の細胞）。ナトリウム電流誘発と同時に 、ＨＣ２Ｓ２細胞はテトラサイクリンによる分化後に活動電位を興奮させる能力 を獲得する。まとめ ＨＣ２Ｓ２細胞のニューロンへの分化を、細胞の形態学的および免疫細胞化学 的性状によって示した。フェーズブライトな細胞体および互いに連絡しあう長く 細い突起をもち、特異的ニューロンマーカー（タウ、ＮＦＨおよびＮｅｕＮ）を 発現するニューロンが観察された。さらに、温度感受性ｔｓＡ５８によって不死 化された細胞と異なり、ＨＣ２Ｓ２細胞は分化に際してネスチン発現を停止する （データは示さず）。電気生理学的実験は、ＨＣ２Ｓ２細胞のニューロンへの分 化についての更なる証拠を提供した。テトラサイクリン処理細胞は大量のナトリ ウム電流および活動電位を興奮させる能力を獲得した。さらにまた、誘発された ナトリウム電流はニューロン型であり、迅速な消長動態および不活性化中点−61 ｍＶ（神経膠細胞の−80から−85ｍＶの中点と比較、Barresら、Neuron，2:375( 1989))を示す。回復カルシウム電流は高閾値クラスで、活性化が電圧依存で不活 性化は欠如している（Beanら、Drugs in development，2:61(1993)）。したがっ て、分化ＨＣ２Ｓ２細胞はＣＮＳニューロンに必須の機能的特性（すなわち、ナ トリウム電流（これは活動電位の開始と伝播に必要である）およびカルシウム電 流 (これは神経伝達物質の遊離に必要である))を示す。総合すれば、これらの結 果は、ＨＣ２Ｓ２細胞は不死化ニューロン原始細胞に由来し、ｖ−ｍｙｃオンコ ジーンの抑圧後にニューロンに分化することができる。さらにまた、これらの細 胞は成人の海馬に由来するので、ニューロンの分化の潜在能力をもつ原始細胞は 成人の神経系に存在し、それらはインビトロで単離および成長させやすい。ｖ− ｍｙｃオンコジーンの過剰発現によるダウンレギュレーションによって誘発され る細胞周期の制止およびそれに続くニューロンへの分化のメカニズムを研究する ことがここに可能となった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レイ、ジャゾダラ アメリカ合衆国 92130 カリフォルニア 州 サン ディエゴ コルテ デ ラ シ エナ 4184 (72)発明者 ホシマル、ミノル 滋賀県志賀町小野朝日２―13―６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．調節可能トランス作用因子成分；選択可能マーカー；異種遺伝子；異種遺伝 子に機能できるように連結された調節成分；並びに逆転写および組み込みに必要 なシス作動性核酸配列をコードする核酸を有するレトロウイルスベクター。 ２．トランス作用因子成分がテトラサイクリンによって制御されるトランス作用 因子（ｔＴＡ）である請求項１記載のベクター。 ３．調節可能成分に機能できるように連結されているプロモーターが末端反復配 列（ＬＴＲ）である請求項１記載のベクター。 ４．異種遺伝子に機能できるように連結されている調節成分がプロモーターであ る請求項１記載のベクター。 ５．異種遺伝子に機能できるように連結されているプロモーターがヒトサイトメ ガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターである請求項１記載のベクター。 ６．異種遺伝子がオンコジーンである請求項１記載のベクター。 ７．オンコジーンがｖ−ｍｙｃである請求項６記載のベクター。 ８．内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに有する請求項１記載のベクタ ー。 ９．選択可能マーカーが、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒド ロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラ ーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびキサンチングアニンホスホ リボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ，ｇｐｔ）からなる群から選ばれる請 求項１記載のベクター。 10．ベクターがＡＴＣＣ Ｘである請求項１記載のベクター。 11．適切なパッケージングホスト細胞に請求項１記載のベクターを核酸感染させ る工程、及び組換えウイルスを回収する工程を有する組換えレトロウイルスの製 造方法。 12．請求項11記載の方法によって産生された組換えレトロウイルス。 13．該細胞が請求項11記載の方法によって産生された組換えレトロウイルスを産 生する細胞。 14．請求項１記載のベクターを含む細胞。 15．請求項12記載のレトロウイルスを含む細胞。 16．該細胞がニューロン原始細胞である請求項15記載の細胞。 17．ニューロン原始細胞に請求項12記載の組換えレトロウイルスを感染させる工 程、及び該細胞がニューロンに分化することができるように適切な時間、良好な 条件下で該細胞を成長させる工程を有するニューロン細胞の分化を誘発する方法 。 18．該細胞に請求項12記載の組換えレトロウイルスを感染させる工程、及び異種 核酸配列を該細胞内で発現させる工程を有する、ニューロン原始細胞で異種核酸 配列を導入し、さらにこれを発現させる方法。 19．異種核酸配列がオンコジーンである請求項18記載の方法。 20．オンコジーンがｖ−ｍｙｃである請求項19記載の方法。