JP2006122045A - 細胞株 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ECACC受託番号04091601、04110301、および04092302を有する細胞株のいずれかから得られる単離細胞。
【選択図】なし
Description
本発明は、治療、特に、卒中、ハンチントン病、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、および外傷性脳損傷を含む神経学的障害を処置するための移植において有用な細胞株の生成に関する。
卒中とは、脳領域に供給する動脈の閉塞または出血により最も共通して引き起こされる、突発性の神経学的欠損に与えられた名前である。脳のいずれかの領域が影響され得る。
・移植の標的である組織に特有の特定の細胞へ発生できる多能性細胞、
・1つの創始細胞からもたらされる細胞(クローン細胞)、
・正常な染色体を有する遺伝子上安定な細胞、
・インビトロおよびインビボで適当な細胞タイプへの分化能を有する細胞、
・多数に成長し、貯蔵できる細胞、
・安全、特に腫瘍形成能を示さない細胞、
・移植されると、遊走が組織損傷範囲に制限される細胞、
・認定された動物モデルにおいて効果を生じる細胞、
・起源が完全に証明されている細胞。
本発明は、移植治療において有用となる好ましい特徴を有する細胞株の開発に基づくものである。
本発明の第2の態様により、上で同定された細胞が治療において用いられる。
本発明の第3の態様により、上で同定された細胞が、脳細胞の喪失または損傷と関連する障害の処置のための医薬の製造において用いられる。
本発明は、移植治療に適し、かつ移植の時まで不死である細胞の製造を開示する。
細胞株の概略
c−MycERTAMを導入したヒト神経幹細胞は、12週齢の胎児皮質からもたらされたものである。該株を、ラミニンコート培養フラスコにて、所定の無血清「Reduced Modified Media」(組成については後述)を用いて、bFGF、EGF、4−ヒドロキシタモキシフェンの存在下で維持した。日常的培養において、該細胞株は倍加時間およそ2〜3日である。
分化後、MHCクラスIまたはクラスII抗原は発現されない。
強力なプロモーターによりもたらされるmyc−ERを生成するために、mycERTAM導入遺伝子を、サイトメガロウイルスプロモーター(CMV)およびネオマイシン耐性遺伝子を含有する、レトロウイルスベクターpLNCX−2(clontech)にさらにクローン化した。プラスミドDNAのpBabe−puro−myc−ERTAMを上述の通り増幅した。pBabe−puro−myc−ERTAM中のMyc−ERTAM配列を制限酵素EcoR Iにより切断した。myc−ERTAMの2.3kbフラグメントを単離し、pLNCX−2レトロウイルスベクターのStu I部位に平滑末端ライゲーションによりライゲーションし、pLNC−myc−ERTAMを生成した。pLNC−myc−ERTAM中のmyc−ERTAM遺伝子の向きを、BamH I、Xho I、およびBgl IIを用いた制限酵素切断により決定する。ストックプラスミドDNAのpLNC−myc−ERTAMを「マキシ・プレップ」により精製した。
TEFLY−AおよびTEFLY−RDウイルスパッケージング細胞株(CRC UKからライセンス許諾のもと得た;米国特許第6,165,715号;フランス、エヴリー、ジェネトンに保管されたGMP細胞バンクストック)を用いて、MMLVベースのレトロウイルスを産生した。細胞株は、gag、pol、およびenv遺伝子を保持している一方で、ウイルスゲノムを、操作する導入遺伝子の選択によりレトロウイルスプラスミドにおいて置き換えている。TEFLY−RDを用いて、TEFLY−A株を含む制限した感染性を有するウイルスをパッケージングさせる。TEFLY−Aを用いて、哺乳類細胞に対して広範囲の感染性を有する両種性ウイルスをパッケージング/生成した。
TEFLY−RD産生細胞を凍結ストックから起こし(revived)、新しい種ストックを確立した。拡大させたストックから、細胞150万個を10cmディッシュに播種し、pLNC−mycERTAMプラスミド12μgで、Fugene−6を用いて標準的方法によりトランスフェクションした。新たなTE培地をトランスフェクションした細胞に一晩加え、パッケージされたウイルスを細胞から翌朝回収した。この一過性のウイルス生成物を用いて、TEFLY−A産生株を感染させた。
CTXOE03を、臨床上使用するために、指定株を前進させるのに適した品質保証条件下で得た。供給材料として、ヒト神経幹細胞を、解剖後に12週齢の胎児皮質(GS031)から、機械的粉砕と組み合わせたトリプシンでの酵素消化により単離した。培養して確立した後、胎児神経細胞に、c−MycERTAMオンコジーンをコードする両種性レトロウイルスを感染させ、一定範囲のクローン集団および混合集団細胞株を単離した。
日常的培養条件下で細胞を凍結ストックから、通常T180培養フラスコ中2〜400万細胞数まで拡大させる。数回培地交換した後、該細胞をサブコンフレントまで継代する。過程の記録から、CTXOE03についての集団の倍加時間は3〜4日であると見積もった。この倍加時間は対数期成長のものより長く、継代培養過程中の細胞の喪失も含んでいる。
数回の研究を行い、c−mycERの4−ヒドロキシタモキシフェン条件制限を一貫して示した。成長因子の存在下または不存下での細胞成長は、培地中への4−ヒドロキシ−タモキシフェンの適用により増強された。この作用は、β−エストラジオールにより模倣されなかった。このことは、エストロゲン受容体上の選択的変異が機能的に維持されていることを示している。結果を図2に示す。
CTXOE03の表現型を免疫細胞化学を用いてプロファイルし、神経幹細胞マーカーであるネスチンについて染色し、次に分化の成熟マーカーであるβ−IIIチューブリン(神経)およびGFAP(星状細胞)について染色した。
細胞を4% パラホルムアルデヒド中で15分間、室温にて固定し、PBSを用いて洗浄し、次に0.1% Triton X/PBSを用いて15分間透過処理した。次に、非特異的結合を、PBS中の10% 正常ヤギ血清(NGS)で1時間、室温にてブロッキングした。次に、細胞に、ネスチンに対する抗体(1:200;Chemicon;MAB 5326)、β−IIIチューブリンに対する抗体(1:500;Sigma)、およびGFAPに対する抗体(1:5000;DAKO)を用いて、室温にて一晩プローブ結合させた。PBSで洗浄後、次に、それらを、1% NGS/PBSに溶解した、フィルター処理したアレクサヤギαマウス488(1:200;Molecular Probes)およびアレクサヤギαウサギ568(1:2500;Molecular Probes)を用いて、1時間、室温にて処理した。次に、それらをPBSを用いて洗浄し、蛍光顕微鏡での分析前に1μg/ml ヘキスト(Hoechst)33342(Sigma)を用いて、2分間対比染色した。
細胞株上でのMHC抗原の発現は、細胞のホストによる拒絶に対する感受性に関与し得る。本発明者らは、対照CTXOE03細胞および分化した(成長因子を使用せずに14日間)CTXOE03細胞上のMHCクラスIおよびIIの発現をプロファイルした。細胞を、4% パラホルムアルデヒド中で室温にて固定し、次に、メタノール中で−20℃にて20分間固定した。正常ヤギ血清を用いてブロッキングした後、1次抗体を1:100希釈;[クラスI,HLA−ABC番号7855(AbCam)またはクラスII,HLA−DR番号7856(AbCam)]にて加えた。CTXOE03は、対照細胞株OE33と対照的にクラスIIを発現しない。同様に、CTXOE03は、未分化細胞および分化細胞共に、クラスII発現陰性であった。
G結合核型分析
核型決定を以下の通り行った:
T25フラスコ培養物から、70〜80% コンフルエントな細胞を洗浄し、ブロモデオキシウリジンで染色し、コルチミド(Colcimid)で処理し、次に低張溶解の対象とした。次に、試料をメタノール:氷酢酸[3:1]中で固定し、−20℃にて保存した。次に、試料を分析し、正常な核型を有することを示した。G結合分析を5継代から40継代でおよそ10継代毎に行い、異常が検出されない、正常な二倍体染色体を得た。
サザンのトランスファーおよびハイブリダイゼーションを用いて、細胞株のゲノム内のレトロウイルスで形質導入した遺伝子構造物のクローン性および組込を、該構造物に特異的なプローブを用いたマッピングにより、研究することができる。ゲノムDNA(GDNA)をまず制限酵素を用いて切断し、生じたフラグメントをサイズによってアガロースゲル電気泳動により分離する。次に、DNAをインサイツで変性させ、ゲルから固体支持体(ニトロセルロースメンブレン)に移した。該メンブレンに接着したDNAを、構造物の特定の部分に対する32P標識DNAプローブにハイブリダイズさせ、該プローブに相補的なバンドをオートラジオグラフィーにより位置決定する。細胞株がクローンで、1箇所のみの組込部位を有すると、特定のサイズの1本のバンドのみが存在するだろうし、クローンでないと、異なる組込部位に対応する2本以上のバンドが存在するであろう。
CTXOE−03についてのサザンブロットは、この細胞株が6kbに存在する1本のバンドを有するクローンであることを示している。
標的細胞ゲノムへのレトロウイルスDNAの組込は、主として無作為な現象である。インバースPCRを幅広く用いて、多くの細胞株でのレトロウイルス導入遺伝子の組込部位が検出されてきた(Schmidt et al., ANNALS OF THE NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES. 2001. 938:146-155)。それはクローン性を同定するための強力なツールでもある。本明細書において、インバースPCRを用いて、CTXOE03株におけるpLNC−myc−ERTAM組込部位を同定した。
概略
c−MycERTAMを形質導入した神経幹細胞株を、12週齢の胎児線条体から得た。該株を、ラミニンコート培養フラスコにて、所定の無血清「Human Media」を用いて、bFGF、EGF、および4−ヒドロキシタモキシフェン存在下で維持する。日常的な培養において、細胞株は倍加時間3〜4日であるが、短期間の培養においては倍加時間20〜30時間が観察された。
本明細書に記載の株を、臨床上の使用のために、指定された株を前進させるのに安定な品質保証条件下で得た。供給材料として、ヒト神経幹細胞を、解剖後に妊娠12週齢の胎児(GS006)の線条体から、機械的粉砕と組み合わせたトリプシンでの酵素消化により単離した。培養して確立した後、これらの初代神経細胞を、c−MycERTAMオンコジーン(上でCTXOE03細胞株について上述)を用いたレトロウイルスの形質導入により形質転換し、一定範囲のクローン集団および混合集団細胞株を単離した。この一連の株全てを、ラミニンコート培養製品にて、Human Media(HM);下記の指定添加剤をプラスしたDMEM:F12を用いて得た。
日常的な培養条件下で、細胞を凍結ストックから、通常T180培養フラスコ中2〜400万細胞数に拡大させる。数回培地交換した後、細胞をコンフルエントまで継代する。過程の記録から、STROC05についての集団倍加時間は、3〜4日間であると見積もった(添付のグラフに示す)。この倍加時間は、対数期成長のものより長く、また継代中の細胞の喪失を含むものである。
STR0C05の表現型を免疫組織化学を用いてプロファイルし、神経幹細胞マーカーであるネスチンについて染色し、次に、分化の成熟マーカーであるβ−IIIチューブリン(神経)およびGFAP(星状細胞)について染色した。
STROC05についてのサザンブロット
2度の別々の実験でのデータによると、他の細胞株を用いて観察される明らかなバンドとは対照的に、プローブハイブリダイゼーションの証拠はない。
概略
不死化神経幹細胞株を、12週齢の胎児海馬からもたらした。該株をラミニンコート培養フラスコにて、所定の無血清「Reduced Modified Media」を用いて、bFGF、EGF、および4−ヒドロキシタモキシフェンの存在下で維持する。日常的な培養において、該細胞株は倍加時間約2日であり;短期間の培養においては倍加時間20〜30時間が観察される。
妊婦の血清学により、ドナーが主な感染症を有していないことが示される。
供給材料として、ヒト神経幹細胞を、解剖後、妊娠12週齢の胎児海馬から、機械的粉砕と組み合わせたトリプシンでの酵素切断により単離した。培養して確立した後、胎児神経細胞を、mycERTAMオンコジーンでのレトロウイルスの形質導入により形質転換し、一定範囲のクローン集団および混合集団産生細胞株を単離した。
日常的な培養条件下で、細胞を凍結ストックから、通常T180培養フラスコ中2〜400万細胞数まで拡大させる。数回培地を交換した後、細胞をコンフルエントまで継代する。過程の記録から、HPCOA07についての集団倍加時間は3〜4日であると見積もった。この倍加時間は、対数期成長のものより長く、そして継代中の細胞の喪失を含むものである。
HPCOA07についての対数期成長のより代表的な評価として、細胞増殖アッセイをCyquant蛍光ダイ(Molecular Probes)を用いてセットアップした。細胞数を、Tecan Magellan蛍光プレートリーダー;ex 480nm;em 520nmを用いて測定する。
細胞を、4〜5日間にわたり、倍加時間1〜2日で拡大させた(図3に示す)。
HPCOA07の表現型を免疫細胞化学を用いてプロファイルし、神経幹細胞マーカーであるネスチンについて染色し、次に、分化の成熟マーカーであるβ−IIIチューブリン(神経)およびGFAP(星状細胞)について染色した。
細胞をラミニンコート96ウェルプレートにセットアップし、成長因子プラス4−OHTをプラスしたRMMにて拡大させた。細胞を、成長因子および4−OHTを培地から取り除くことにより、7日間または14日日間分化させた。
核型決定分析
細胞は、正常雌性核型を有すると示された。
HPCOA07についてのサザンブロットは5kbの1本のバンドを示し、これは、この細胞株がクローンであることを示唆している。
CTXOE03幹細胞株は、ラットにおいてMCAo卒中後の欠損を低減する。
MCAo
オスSD(Sprague-Dawley)ラット(Charles Rivers)を、閉塞に先立ち、7日間、無制限の食事を与えて収容し(12:12時間 明・暗)、群化した。手順は、UK動物(科学的)手順法(1986)およびReNeuron Ltdの倫理的再検討プロセスに従った。
動物を、1本の前肢を自由にしたままで、テーブルトップまで移動させた。触毛がテーブルをなでると、同側の肢をテーブル上に置く。片側当たり3回なでた後の適当な肢の置き直し回数を記録した。
感覚運動機能不全の両側非対称性試験により、影響された前肢および影響されていない前肢の周りを覆った粘着性テープストリップ(〜1×6cm)と接触させ、取り除くのにかかる時間の格差を300秒間測定した。
ローターメーター(TSE GmbH)により、アンフェタミン(2.5mg/kg 皮下,Sigma)または生理食塩水投与に応答したモーター旋回非対称性を測定した。旋回の偏向性を、両方向の合計回転数で割った反右回り回転数として、計算した。
動物にペントバルビタール(Animalcare)を過剰投与し、ヘパリン添加生理食塩水を用いて心臓経由で流し、次に、0.2mol/L PBS中の4% パラホルムアルデヒドを用いて潅流した。脳を、30% スクロースにより凍結保護し、凍結ミクロトーム(Frigomobile:Leica)をスライドさせて、50μmの切片に切り出した。損傷体積を、シンプソンのルールにより20個の切片毎に、Image Pro Plus(Media Cybernetics)により分析したデジタル顕微鏡画像を使用して計算した。移植した細胞を、ヒトの核タンパク質に対して生じた抗体(HuNuc Chemicon Inc)を使用して同定した。移植した細胞の分化を、表現型マーカーである、神経線維およびKI−67をヒトタンパク質を用いた共局在決定により、決定した。1次抗体と一晩インキュベーションし、蛍光抗マウスまたは抗ウサギ2次抗体を1時間適用した。
両側非対称性試験の結果を、対象因子間としての群、および対象因子内としてのトライアル/日数を用いた両方向ANOVA(Prism)により分析した。t検定を用いて、ローターメーター試験における損傷前の能力対損傷後の能力を分析した。ローターメーター、ヒゲ、および損傷体積における群差について、1方向ANOVAを用いた。hoc検定後にボンフェロニーを用いて、群を比較した。
閉塞された動物は、著しい神経学的機能不全を閉塞後最初の7から14日間示した。この機能不全は中程度の体重減少(<30%)を伴って生じた。機能不全および体重減少は、通常、閉塞後14日以内に解消された。hoc後分析により、閉塞後7日目における体重減少は、本研究において全ての動物を分析したときの最終損傷体積に対応した(r=−0.705,p<0.0,001)。
全3つの閉塞群において、影響された肢と影響されていない肢との間で肢の置き直し回数に有意な差があった(p<0.0001)。偽群内において、肢の置き直しに差はなかった。偽群と閉塞された群との間で影響された肢の置き直しに有意な差があった(p<0.001 全ての群)。また、STROB05移植対照と卒中対照(p<0.01)、およびCTXOE03(p<0.001)移植群との間で影響された肢の置き直しに有意な差があった。STROB05群は、影響された肢についての偽群で観察された置き直しレベルに至らなかった。
対照;影響を受けた(左)肢上のテープを、卒中対照処置動物(これは偽STROB05より長くかっかた)およびCTXOE03移植群と接触させる時間に有意な差があった(p<0.01 全ての群,ANOVA)。また、偽動物(卒中対照より長くかかった)を含む群とCTXOE03群との間で、影響を受けていない肢上のテープを接触させる際に有意な差があった(p<0.05, ANOVA)。
生理食塩水:生理食塩水投与後の自発的旋回の非対称性は、移植後NAC処置群と比較して、CTXOE03および偽群で有意に低かった(p<0.05)。STROB05(p<0.01)およびCTXOE03(p<0.05)群での移植前の能力と比較して、移植後の自発的旋回の偏向性は有意に低減した。
ヒト細胞をSTROB05移植群とCTXOE03移植群の両方で同定した。たいていのSTROB05移植動物(7/9)で良好に生存していたが、CTXOE03動物では、9匹中たった2匹の動物で良好に生存していた。いずれの細胞株も、長期生存した動物のいずれにおいても神経細胞への分化を示さなかった。STROB05細胞は、実質外の腔領域におけるヒトの核タンパク質およびKI−67タンパク質発現(細胞分裂のマーカー)のある種の共局在性を有しており、このことは、局在の合図が細胞分裂を促進したことを示唆している。CTXOE03移植動物の1匹において、切片中への細胞の遊走を含む良好な遊走が生じた。
本研究は、ハンチントン病(HD)の部分モデルとしての片側(左側)キノリン酸線条体損傷により誘発された欠損を有するラットにおける、ヒトMycERTAM細胞株STROC05およびCTXOE03の作用を評価することを目的とする。
オスSD(Sprague-Dawley)ラット(Charles Rivers)を、手術に先立ち7日間、無制限の食事を与えて収容し(12:12 明・暗)、群化した。手順は、UK動物(科学的)手順法(1986)およびReNeuron Ltdの倫理的再検討プロセスに従った。
(1)AP=0.0;L=+3.5;V=−4.5、および(2)AP=+1.2;L=+2.8;V=−4.5
1)AP=0.0;L=+3.6;V=−5.5,−4.5、および(2)AP=+1.2;L=+2.8;V=−5.5,−4.5。
移植後6週間にて、ラットに行動試験を開始した。
体旋回試験(BST) ラットを実験装置前のオープンケージに入れ、尾の付け根を床面より上に10秒間持ち上げた。後肢が中線を動物の左または右にまたぐ、明瞭なキックとして定義される旋回を記録した。好ましくは、2回の実験、保持するために1回、そして記録するために1回を用いた。これにより内部実験信頼性が与えられた。ラットがまず損傷側(この場合、左)に旋回したら、旋回の強度についてスコア1〜3を記録した。対称性の旋回をスコア0と記録した。スコアの評定内信頼性は比較的低く、そのためこの質的測定値を、偏向性を測定するための結果の最終分析には用いず、% 左旋回を用いた。
ラットは一方の前肢を自由に、そして他方を固定し、自由な肢に隣接したヒゲがテーブルの側面を優しくなでた。ラットは即時にテーブルに触れることができた。しかしながら、片側性損傷のあるラットは、しばしば、損傷と対称性の肢をテーブルトップに置くことができなかった。各セッションは、片側について3回のトライアル(交互)からなった。ラットに、達したらスコア1を、そして5秒内に応答できなかったらスコア0を記録した。4回のセッションを移植後9〜10週間目の行動試験の最後に行った。
階段試験:
装置は、各段に球粒のためのへこみのある、2つの7段の階段に隣接したプラットホームにアクセスできるエントリーチャンバーからなる。ラットは、プラットホームを登ると、各段上の球粒(2 Coco Pops;Kellogs Ltd.)に至る。プラットホームの端にある狭い縁がラットが球粒を粉々にするのを防ぎ、十分な回復のためには、各側について右前肢および左前肢を用いて、球粒をつかみ、次に口まで持ち上げなければならない。ラットに、1セッション当たり5分間のトライアルを2回行った。ラットを損傷前にトレーニング(2セッション)し、損傷後(2セッション)および移植後(4セッション)に、BAT試験と同じ期間にわたり試験した。
潅流および切片法:
ラットを一時的に、0.1M リン酸ナトリウムバッファー(PBS,pH7.4)中の4% パラホルムアルデヒドで潅流し、脳を取り出し、固定剤中4℃で一晩保存し、次に、PBS中の30% スクロースに移した。連続切片50μmを凍結ミクロトーム上で切り出し、24ウェル培養プレート中のスクロース中に回収し、処理まで−20℃にて保存した。
損傷を、左線条体中のDARPP 32陽性細胞の喪失の程度として定量し:免疫反応の範囲および染色強度を、線条体のAP軸中を走るc.8切片を用いて測定した。
移植細胞を、Human Nuclear(HuNuc−Chemicon Inc)染色により同定し、次に、移植された線条体中の損傷評価のために用いたものと隣接する連続切片においてカウントした。注入部位に近い切片を主要な精査の焦点とした。
階段試験
全ての群にわたり、右肢より左肢で、より多くの球粒を回収した(p<0.05)。損傷されたラットは、STROC05移植群および対照群(p<0.01)よりすくない球粒を回収したので、群の間で実質的な差があった(p<.001)。
損傷されたラットは、6ブロックの移植後試験を通じて左に旋回する実質的な偏向性を示し、ゆえに群は左旋回の割合が異なる(p<0.001:図参照)。ゆえに、群の間で実質的な差があった:CTXOE03移植群とSTROC05移植群の両方、並びに対照群は、低減した偏向性(すなわち、c.50%が左および右へ旋回する)、および損傷されたラットとの実質的な差(p<0.01)を示した。左および右への実際の旋回数の点で、群とサイドとの間の相互作用(p<0.001)は、偏向性を損傷群において強調するが、対象群または移植群においてはしなかった。
損傷されたラットは、右側のヒゲ刺激に一貫して応答できなかったが、左肢でテーブルトップに達するのが、左側の刺激後、速くかつ正確であった。対照群および移植群は、両側の刺激に応答した。それゆえ、片側で有意に差があり(p<0.001)、群と片側との間の強力な対象(p<0.001)、並びに群の間で実質的な差があった(p<0.001)。対照群、およびSTROC05移植群およびCTXOEO3移植群は、損傷されたラットと差があった(p<0.001)。しかしながら、移植群の両方が、対照ラットより応答性がより低く(p<0.02)、それらはなおある種の怠慢を示した。
損傷の大きさおよび特異性
損傷は線条体を上手く標的とし、DARPP 32陽性細胞の欠如は別として組織の喪失はほとんどなく、いくぶんかの腔の拡大があった。細胞の喪失範囲は、損傷のみの群および移植群の両方で平均10m3であった。また、生存細胞を有する移植ラットと有しない移植ラットにおいて、損傷体積/強度に差は無かった。
生存HuNuc陽性細胞は、4/9のSTROC05移植ラットおよび5/12のCTXOE03移植ラットで観察された。良好な遊走が、移植物を有する動物の75%で観察された。長期間生存した移植細胞の神経細胞への明らかな分化は無かった。
本実施例は、2種類の制御されたヒトc−MycERTAM幹細胞株からなる移植物が、4血管閉塞法により誘発された虚血性海馬損傷後に欠損を示したラットにおいて、空間学習および記憶を改善できるか否かをみることを目的とするものである。虚血後、ラットに海馬(HPCOA07)および皮質(CTXOE03)株由来の細胞を移植した。6週間後、それらを、直径2mの円形プール中の水没したプラットホームを見つけることを、2トライアル/日で合計6日間訓練し、次に、その場所を思い起こすことを試験するために、プラットホームを取り除いて探知トライアルを行った。偽移植虚血ラットは、無虚血対照より、プラットホームを見つけるのに長くかかり、それを探知するのにより長く泳ぎ、プラットホームが位置するプールエリアではほとんど時を過ごさなかった。移植ラットの能力は、虚血対照と無虚血対照のものとの中間であり、一般にどちらとも有意な差は無かった。しかしながら、虚血ラットのレベルを上回る改善は、待ち時間および経路の長さのような鍵となる測定値における有意性と非常に密接に関連し、このことは、信頼性のある機能回復の可能性を示している。
手術−4血管閉塞法:ラットを電気焼灼機(Surgitron coagulator)による4 VOの対象とし、脊椎動脈にハロセイン麻酔(Merial Animal Health)し、頸動脈周辺を結んだ。翌日、軽いハロセインでの麻酔下で、頸動脈を持ち上げ、止血小鉗子動脈瘤クルップを用いて20分間固定した。麻酔を止めた後に立ち直り反射がないよう維持した、大脳の血流の低減を90%+示した。対照は、脊椎動脈を焼灼し、次に結ぶことで偽手術したが、頸動脈の血流の制限は行わなかった。体と頭の温度を直腸プローブおよび頭部プローブによりモニターし、1分毎に記録し、恒温毛布(Harvard Apparatus)および頭上のランプにより37±2℃に維持した。
AP:−3.3 L:+1.3 V:−2.8 2μl/部位
AP:−4.2 L:+3.4 V:−3.1
へデリバーした。
モリス水迷路 動物を、水面下2cmに水没したプラットホーム(直径9cmの円)を有し、24±2℃に保たれた温度の円形プール(2m)に入れた。動物を4箇所のスタート地点の1つに置き、最大1分間泳がせた。動物がプラットホームに登ってきたら、それらを10秒間そのままにし、取り出した。1分以内にプラットホームを見つけられなかった動物をプラットホーム上に置いた。動物をプラットホーム上に20秒間そのままにし、次に取り出した。泳いだ経路を画像分析システム(HVS Image, UK)により記録した。毎日の1セッション当たりトライアルを2回、8〜10分間の間隔で行った。訓練を、4日および3日をひとまとめにして、9日間行った。しかしながら、4日目に装置の破損により、信頼性のないデータ収集となったので、結果を破棄した。それゆえ、3日目で隔て、1〜3および4〜6をひとまとめにして、分析するデータを6日にわたり収集した。探知トライアルを、最後の習得トライアルの24時間後に行い、次に、翌日可視化したプラットホーム課題を行った。水面より上10cmに上げた円筒型の手がかりによりマークしたプラットホーム位置を用いたトライアルを3回行った。
潅流および切片法:
ラットを、一時的に0.1M ナトリウム緩衝溶液(PBS,pH7.4)中の4% パラホルムアルデヒドで潅流し、脳を取り出し、4℃で一晩固定し、次にPBS中の30% スクロースに移した。連続切片50μmを凍結ミクロトーム上で切り出し、24ウェル培養プレート中のスクロース中に回収し、処理まで−20℃で保存した。
細胞の喪失を、移植物/ビークル注入管の2箇所のレベルで、両側性に、CA1野の中央−側面の広がりを横切るNeuN標識皮質切片において定量した。これは、細胞体および樹状領域を示した。NeuN免疫反応範囲および染色強度の両方を測定した。
移植細胞をHuman Nuclear(HuNuc)染色により同定し、連続切片に隣接し、細胞の喪失を見積もるために用いた対象(RPI)と同じ領域由来の連続切片においてカウントした。
実験には、33匹のラット、CTXOE03移植物を有する10匹、HPCOA07移植物を有する9匹、4 VOかつ偽移植物を有する8匹、偽閉塞かつ偽移植物対照6匹を用いた。
移植後5から6週間、ラットを、水迷路中の水没したプラットホームを見つけることを、8〜10分間の間隔で2回のトライアル/日で訓練した。
虚血性損傷:CA1細胞の喪失の程度を、注射管によりマークした、樹状野および体性野を含む、2つのレベルで同定した。NeuN染色を、エリアにより、および免疫蛍光強度によりマッピングした。両方の測定値は、虚血群が対照で観察される細胞の20〜25%のみを保持していることを示した。損傷は一様であり、CA1野に局在し、同様に全ての群に及んだ。
障害物1〜3、4〜6を超えて、全6個のトレーニング用ブロックを越えてプラットホームを見つける平均時間は、4つの実験群のそれぞれにおいて、NeuN−IRの範囲および強度の両方でCA1細胞喪失の程度と相関した。各群内で、NeuN染色のいずれかの測定値による、CA1細胞の喪失の程度と、プラットホームを見つけ出すのにかかる時間の増大との間に関連は無かった。
本明細書に記載の3種類の異なる神経幹細胞株は、安定かつ拡大可能な、神経系疾患の患者への移植のための細胞供給源となることが示された。可能性のある治療範囲は、機能的回復を、一定範囲の脳疾患および変性の動物モデルにおいて示すことで、例証した。1種類より多くの疾患モデルにおける機能回復の際のこれらの細胞株の典型的な成功は、これらの細胞株の1種類以上が、種々の神経系疾患において機能を回復させ得ることを示す。
Claims (11)
- ECACC受託番号04091601、04110301、および04092302を有する細胞株のいずれかから得られる単離細胞。
- 治療に使用するための請求項1記載の細胞。
- 治療上有効な量の請求項1記載の細胞のいずれか、および医薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
- 脳細胞の喪失または損傷と関連する障害を処置するための医薬の製造における、請求項1記載の細胞の使用。
- 虚血または卒中を処置するための請求項4記載の使用。
- アルツハイマー病を処置するための請求項4記載の使用。
- 外傷性脳損傷を処置するための請求項4記載の使用。
- クロイツフェルト・ヤコブ病を処置するための請求項4記載の使用。
- 細胞の喪失または細胞の損傷と関連する障害の処置方法であって、請求項1記載の細胞を患者に移植することを含む、方法。
- 障害が請求項4から8のいずれかに記載されたもののいずれかである、請求項9記載の方法。
- 少なくとも1種類の生物剤または化学剤の神経系疾患または障害に対する作用を決定する方法であって、請求項1から3のいずれかに記載の細胞の培養物を、該剤と接触させ、次に、該剤の該細胞に対する作用を決定する、を含む方法。
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