JPH09121851A - 不滅化胎仔海馬細胞およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 神経に活性な薬剤をスクリーニングするのに
役立つ細胞株の提供。 【解決手段】 胎仔海馬細胞の特異的癌遺伝子での感染
により作製される、グルタミン酸レセプターを初めとす
る神経伝達物質のためのレセプターを含む安定な特性を
発現する不滅化マウス細胞株。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特定の癌遺伝子を
コードするレトロウイルスでの胎仔海馬細胞の感染によ
り作製され、そして神経伝達物質のためのレセプターを
初めとする安定な特性を発現する不滅化マウス細胞株を
開示する。

【０００２】

【従来の技術】広範囲にわたる神経学的変性（一例では
脳卒中）を治療するための神経活性性薬剤を開発する目
的では、高速で信頼性の高いスクリーニング方法を実現
可能とすることが極めて重要である。これらの方法によ
り新規の化合物の迅速選択が簡便となり、それらの化合
物をその後には一層複雑なインビトロおよびインビボで
のモデルで更に詳細に検査することができる。多くの神
経学的障害では、神経伝達物質（例えばグルタミン酸）
のためのレセプターが神経細胞死をもたらす最終経路に
関与しているかもしれず；幾つかの事例ではそのような
レセプターの過剰刺激が細胞内カルシウムレベルの過剰
増加をもたらすかもしれず、そのことにより細胞が死滅
する。従ってこのような破壊的経路を妨害する方法（例
えばレセプターアンタゴニスト）の開発が治療学的には
非常に重要であるかもしれない。このような物質をスク
リーニングするためには２つの主要な実験的アプローチ
が一般的には適用されており、それらは：１）未処理組
織の切片もしくは細胞培養物のいずれかにおける適切な
神経細胞への化合物の適用、あるいは２）適切な遺伝子
のトランスフェクションを介して目的のレセプターもし
くはチャンネルを発現するように予め誘導化させてある
非神経細胞（例えば、繊維芽細胞もしくは卵細胞）への
適用、である。両事例においても、適用された物質に対
する反応を検査するのには単一細胞における電気生理学
的測定法が一般的に用いられる。最初の方法には、イン
ビボでの状況に最も近似するにもかかわらず、初期培養
が煩雑かつ長時間を要するものであり、そしてそのため
重要である可能性のある大量の化合物をスクリーニング
することが困難になってしまうという欠点が存在する。
第二のアプローチでは、たとえ安定な形質導入物が利用
可能であったとしても、その形質転換化細胞が神経起源
のものではないという欠点が存在する。形質転換された
遺伝子産物の、細胞の内側のシグナル伝達経路との相互
作用は生理学的状況を厳密には模倣することにはならな
いかもしれない。それに加え、目的のレセプター（その
大半が複数のサブユニットで構成されている）がクロー
ン化されている必用がある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】これらの問題を克服す
るためには、目的のレセプターおよびチャンネルを発現
し、かつ物質の不朽の源として作用する安定な不滅化神
経細胞株が利用可能であれば非常に有利であろう。この
ような株を凍結保存物として維持し、解凍し、そして有
望な神経作用性物質を取得することができる細胞培養物
として再構成することが可能であろう。それに加え多数
の細胞を取得することができ、そのことにより生化学的
方法を用いるスクリーニングが容易となるだろう。多く
の刊行物において不滅化神経細胞株の作製方法が記載さ
れているものの、本発明において我々が記載するような
細胞株内での高比率の細胞による神経伝達物質レセプタ
ーの安定な発現は未だに達成されてはいない。

【０００４】なお、上記課題と関連する知見を以下に紹
介する。神経性もしくは両能性の特徴を有する幾つかの
細胞株が数々のグループにより記載されている。Ｂａｒ
ｔｌｅｔｔら（１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３２５５−３２５９）はマ
ウス胎仔神経上皮から、その初代細胞をｃ−ｍｙｃ癌遺
伝子を含むレトロウイルスで感染させることにより不滅
化細胞株を作製した。その細胞株は安定な形態および正
常神経上皮について知られるものに適合する抗原発現を
示した。分化は、その培養培地への酸性もしくは塩基性
繊維芽細胞成長因子の添加により誘導され得た。この細
胞は、神経膠線維酸性蛋白質を発現する神経膠星状細胞
か、あるいはＡ２Ｂ５マーカーについて陽性でありかつ
ニューロフィラメントを含むニューロンかのいずれかに
分化した。ＢｉｒｒｅｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９
９０、Ｎｅｕｒｏｎ ４：１８９−２０１）はｖ−ｍｙ
ｃ含有性レトロウイルスを用いて交感神経副腎前駆細胞
を不滅化させた。ＮＧＦおよびＦＧＦの存在下では低い
パーセンテージの細胞がＮＧＦ−依存性後有糸分ニュー
ロンに分化した。Ｒｙｄｅｒら（１９８９、Ｊ．Ｎｅｕ
ｒｏｂｉｏｌ． ２１：３５６−３７５）は、ｖ−ｍｙ
ｃ癌遺伝子を発現するレトロウイルスベクターを使用
し、そして標的細胞として生後マウスの嗅球および小脳
もしくは生後ラットの大脳皮質の有糸分裂前駆細胞を感
染させて神経細胞株を作製した。前記の内の後二つの組
織の感染により自律的に神経性および神経膠性表現型を
示す多能性クローン化細胞がもたらされ、そして小脳株
はインビボで移植した際にはニューロンおよび神経膠細
胞へと分化した（Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９
２、Ｃｅｌｌ ６８：３３−５１）。大脳皮質の感染に
より神経膠細胞特性の致死クローンがもたらされた。Ｒ
ｅｎｆｒａｎｚら（１９９１、Ｃｅｌｌ ６６：７１３
−７２９）はラット海馬の胎仔前駆細胞を起源とするネ
スチン陽性細胞株の樹立法を記載した。その細胞は、Ｓ
Ｖ４０ Ｔ抗原含有性レトロウイルスの温度感受性対立
遺伝子をコードするレトロウイルスを用いて不滅化され
た。この細胞が新生仔の海馬および小脳内に移植され、
そしてニューロンおよび神経膠細胞に典型的な形態を示
した。下記の２グループが伝達物質レセプターを発現す
る細胞株を記載した：Ｅｖａｒｄら（１９９０、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：３０６２−３０６
６）は新生仔マウス線条をＳＶ４０ Ｔ癌遺伝子発現性
レトロウイルスを用いて不滅化させた。彼らは両能性か
つ形成性の膠質−ニューロン前駆体を取得した。培養条
件に依存して、その細胞は神経膠線維酸性蛋白質もしく
はニューロフィラメントのいずれかを発現した。幾つか
の細胞は免疫蛍光分析により判定したところによると、
アドレナリン作動性、Ｄ１およびＤ２ドーパミン作動
性、ムスカリン作動性、ならびに５−ヒドロキシトリプ
タミン タイプ２ セロトニン作動性のレセプターを発
現したし、そしてリン酸イノシトールの測定値は神経伝
達物質の存在下で増大する。Ｍｏｒｉｍｏｔｏら（１９
９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８
７：３５１８−３５２１）はＨＴ−４細胞上の機能性Ｎ
−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプターを、神経伝達
物質の取り込みおよび分泌速度により同定した。ＨＴ−
４は、ＳＶ−４０ Ｔ含有性レトロウイルスベクターで
の不滅化により作製されるマウス線条を起源とするクロ
ーン性神経株である。

【０００５】最近ではＹｏｕｋｉｎら（１９９３、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９０：２１７４
−２１７８）が、単一細胞からのパッチ−クランプ技術
を用いる電気生理学的記録法により示した際にテラトカ
ルシノーマ細胞を起源とするＮＴ２ヒト細胞株がＮ−メ
チル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）および非−ＮＭ
ＤＡグルタミン酸レセプターを発現することを証明し
た。しかしながら公開されたデータからは、その株の内
のどのくらいの数の細胞が神経伝達物質の適用に対する
それらの電気生理学的応答を示すかは明らかではない。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、安定な不滅化
神経細胞株およびそれらに由来するクローンの作製法を
記載する。これらの株およびクローンは、生化学的およ
びイメージ的技術により検出した際には正常なニューロ
ンにより発現されるレセプターと類似の特性を示す神経
伝達物質レセプターを発現する。これらの細胞株および
クローンは液体窒素中で凍結および保存し、そしてそれ
らの特性に変化をもたらすことなく培養物中で再樹立さ
せることができる。これらは数カ月にもおよぶ継続継代
培養を経ても培養物中では安定であり、継代時に増殖す
ることができ、そしてある範囲の神経伝達物質のための
レセプターを発現する。それに加え、所定の抗原および
特異的処理による電気生理学的特性の発現により判定し
たところ、それらを誘導化させてより神経的な表現型へ
と分化させることができる。取得された細胞数（これら
の細胞は神経伝達物質に対して反応する）により生化学
的および電気生理学的スクリーニング方法の利用が可能
となる。

【０００７】具体的には、これらの細胞は有望な神経防
御性活性を有する化合物をスクリーニングするための有
用な道具となる。細胞を興奮毒性性作用物質（例えば、
グルタミン酸）と共に所定の期間インキュベートするこ
とにより細胞死が誘導される。細胞死の防御により測定
される神経防御は様々なメカニズムにより達成されるか
もしれない。これらの細胞には多種多様の神経伝達物質
レセプターおよびイオンチャンネルが備わっているた
め、それらの細胞により異なるメカニズムの作用を有す
る化合物を検査するための一般的適用可能なシステムが
提供される。

【０００８】それに加え、これらの細胞は、カルシウ
ム、ナトリウム、およびカリウムチャンネルを初めとす
る神経性タイプのイオンチャンネルを発現するため、そ
れらを用いてこれらのチャンネルの特異的調節物質をス
クリーニングすることができ、このことは脳虚血、気分
障害、精神病、および認識欠乏を初めとする様々なＣＮ
Ｓ（中枢神経系）障害の治療に有用であるかもしれな
い。それらの細胞は更に様々な神経伝達物質レセプター
を保持し、そしてそのためレセプター関連性過程を研究
するのに適する。それに加え、これらの細胞株を用いて
インビトロでの海馬中での個別の段階の神経性分化を研
究することができ、同様に分化の関わる因子のためのア
ッセイとしてこれらを用いることもできる。

【０００９】インビトロでの分析後には細胞株を動物内
に移植して、インビボでの分化能に関わる情報を発生さ
せることができる。その細胞株を一般的には移植以前に
操作することが可能であるという事実により、動物内で
の細胞の動態における特定の遺伝子変化の効果を分析す
ることが可能となる。これらには、例えば神経防御性も
しくは再生支援性因子の分泌のような、これらの操作細
胞株の有望な治療能が含まれるかもしれない。

【００１０】本発明に従う細胞株は１９９５年８月８日
および１０日に、 ＤＳＭ−ＤＥＵＴＳＣＨＥ ＳＡＭＭＬＵＮＧ ＶＯＮ ＭＩＫＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＥＮ ＵＮＤ ＺＥＬＬＫＵＬＴＵＲＥＮ ＧｍｂＨ Ｍａｓｃｈｅｎｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ ３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ Ｇｅｒｍａｎｙ に、受託番号ＡＣＣ ２２２３、ＡＣＣ ２２３０、Ａ
ＣＣ ２２３１、ＡＣＣ２２３２、およびＡＣＣ ２２
３３として寄託してある。

【００１１】方法 海馬ニューロンの初期培養 海馬はＥ１６日令マウスから採取した。細胞培養は、ラ
ットについてＤｏｔｔｉにおいて記載される方法（Ｄｏ
ｔｔｉ ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ
ｉ． ８；１４５４−１４６８）に従い、以下に説明さ
れるマウス用の改変後に開始した。髄膜除去後に海馬組
織を、０．３％トリプシンを用いて１５分間、３７℃で
解離させた。その後、細胞をＨＢＳＳ^-中で３度、５分
間、３７℃で洗浄し、そして様々な直径の火炎処理パス
ツールピペットを用いて処理することにより解離させ
た。その後にこの細胞をＭＥＭ／ＨＳ中に再懸濁させ、
そしてｐＬＬコートされたガラスカバースリップ（１１
ｍｍのカバースリップ当たり２〜４×１０⁴細胞）もし
くはペトリ皿（６０ｍｍ直径あたり３〜５×１０⁵細
胞、ＮＵＮＣ社、Ｄｅｎｍａｒｋ）上でプレート培養し
た。細胞の付着後（５時間〜一晩）、培地をＮ２−培地
（２５ｍＭ ＮａＨＣＯ₃、０．６％グルコース、２０
ｎＭ グルタミン、１％ アルブミン、１ｍＭ ピルビ
ン酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌ トランスフェリ
ン、５μｇ／ｍｌ インシュリン、２０ｎＭプロゲステ
ロン、１００μＭ プトレッシン、３０ｎＭ 亜セレン
酸ナトリウムを含むＭＥＭ）に交換し、そしてシトシン
アラビノシド（Ｓｉｇｍａ社、５×１０^-6Ｍ）を２〜３
日間添加して増殖性神経膠細胞を死滅化させた。ワック
スフィートを用いてカバースリップ上に撒種させた生後
初期の神経膠細胞の培養物をフィーダー細胞として添加
した。一週間に一度、２／３の培地を交換した。

【００１２】ｖ−ｍｙｃ遺伝子もしくはｅｇｆｒ−ｎｅ
ｕ−遺伝子を発現するレトロウイルスでの初期マウス海
馬細胞の感染を介する不滅化細胞株の誘導ｅｇｆｒ−ｎｅｕ ハイブリッド癌遺伝子およびネオマイ
シン遺伝子をマウスモロニー白血病ウイルス（Ｍｏｕｓ
ｅ Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）
の長い末端反復構造の制御下に、そしてｅｇｆｒ−ｎｅ
ｕ癌遺伝子を追加的に内部単純疱疹チミジンキナーゼプ
ロモーター（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｔｈｙｍ
ｉｄｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｐｒｏｍｏｔｏｒ）（Ｔ
Ｋ）の制御下に含むプロデューサー細胞株ＧＰＥ−ｅｇ
ｆｒ−ｎｅｕ（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９９５、Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ７：１２４５−１２６
５）を、１０％のウシ胎仔血清を含むイーグル（Ｅａｇ
ｌｅｓ）培地のダルベッコー（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）
改変物（ＤＭＥＭ）中で培養した。マウスモロニー白血
病ウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｌｅｕｋｅ
ｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）の長い末端反復構造の制御下でｖ
−ｍｙｃ癌遺伝子およびネオマイシン遺伝子を発現する
ｐｓｉ２プロデューサー細胞株（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ
ａｌ．、１９８５、ＥＭＢＯ Ｊ． ４：６６３−６６
６）を１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中で培養し
た。レトロウイルス含有性上清をほぼ集密状態の細胞培
養物から１６〜１８時間後に回収した。海馬細胞（６０
ｍｍのペトリ皿当たり１×１０⁷細胞）は、６μｇ／ｍ
ｌ ポリブレン（Ｓｉｇｍａ社、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ、
Ｂ．Ｒ．Ｄ．）、ならびにＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）；
β−ＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）、およびＮＧＦ（１０ｎｇ
／ｍｌ）の存在下で４〜６時間、レトロウイルス含有性
上清に関する３７℃下での調製後に即時インキュベート
した。その後に細胞を、１％のウマ血清、ならびにＥＧ
Ｆ（１０ｎｇ／ｍｌ）；β−ＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）、
およびＮＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むＮ２−培地（今
後Ｎ２⁺−培地と称される）中で３７℃下で２日間イン
キュベートし、その後に０．３ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８
（Ｓｉｇｍａ社、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ、Ｄ）の存在下でネ
オマイシン耐性について感染化細胞の選択を行った。生
存細胞を１％のウマ血清を含むＳＡＴＯ−培地中、３７
℃で培養した。培地の３分の２を３〜４日毎に交換し、
ＥＧＦをｅｇｆｒ−ｎｅｕウイルスで感染させた細胞の
培地に２日毎に添加した。

【００１３】細胞株のクローニング 様々な樹立化細胞株の細胞を、０．０１％ トリプシン
／０．０２％ ＥＤＴＡでペトリ皿から放出させ、そし
て１０％ ウマ血清を含むＢＭＥ中での洗浄段階（４
℃、８００ｒｐｍで１０分間）後に、非常に低い希釈率
でＮ２⁺培地中に再懸濁させた。極細火炎処理パスツー
ルピペットを用いてその稀釈化細胞懸濁物を、ウエルに
一つの細胞のみを含む培地一滴が含まれるように９６−
ウイルプレート中に撒種した（この作業は顕微鏡下で制
御される）。その後これらのウエルにフィーダー細胞、
すなわち胸腺細胞もしくは皮質性神経膠細胞のいずれか
（ウエル当たり２００，０００細胞）を添加した。培養
物中２週間後に、増殖性細胞クローンを、０．３ｍｇ／
ｍｌ Ｇ４１８を含むＮ２⁺培地を用いて５〜８日間か
ける選択を行った。これらの細胞をＮ２⁺培地中で継代
し、そしてアリコートを永久保存物として凍結した。

【００１４】胸腺フィーダー細胞 ４〜６週令のメスＮＭＲＩマウスからの胸腺細胞を以下
の要領で調製した：胸腺を取り出し、そして単一細胞懸
濁物を調製し、その後にその細胞を、１０％のウマ血清
を含むＢＭＥ培地中で洗浄し、そしてその後にウエル当
たり２００，０００細胞の密度で９６ウエルプレート
（ＮＵＮＣ社、Ｄｅｎｍａｒｋ）内でプレート培養し
た。

【００１５】新生仔皮質からのフィーダー細胞としての
初期神経膠細胞 皮質からの神経膠細胞を、生後０〜１日目のマウスを用
いて調製した。骨頭切除術後に皮質を髄膜から取り出し
かつ遊離させた。この組織を、第一段階としてハンクス
（Ｈａｎｋ’ｓ）緩衝化塩溶液（ＨＢＳＳ^-）中の１％
トリプシンを３７℃下で１５分間、そして第二段階と
してＨＢＳＳ^-中の０．２％ トリプシン、０．０２％
ＥＤＴＡを３７℃で１５分間用いる２つのトリプシン
化段階により解離させた。その後に上清を除去し、そし
てＨＢＳＳ^-での洗浄段階の後に０．５％ ＤＮＡｓｅ
を添加した。その後に細胞を様々な直径の火炎処理パス
ツールピペットを用いる倍散により解離させた。イーグ
ル（Ｅａｇｌ’ｓ）の基本培地（ＢＭＥ／ＨＳ）中での
８００ｒｐｍで１０分間の洗浄段階後、ペレットを最少
必須培地（ＮａＨＣＯ₃ ２５ｍＭ、２０ ｎＭ グル
タミン、１０％ ウマ血清、０．６％ グルコースを含
むＭＥＭ／ＨＳ；Ｇｉｂｃｏ社）中に再懸濁させ、そし
てｐＬリシン−コートされたペトリ皿（６０ｍｍ直径当
たり１〜２×１０⁷細胞；ＮＵＮＣ社、Ｄｅｎｍａｒ
ｋ）内、もしくはワックスドットフィート（４２〜４４
℃でのパラフィン固形化、Ｍｅｒｋ社）を用いるｐＬＬ
コートされた（０．０１％）ガラス製カバースリップ
（カバースリップ当たり１×１０⁴細胞）上のいずれか
でプレート培養した。

【００１６】分化の誘導化 成長因子もしくは他の分化誘導性作用物質の存在下での
実験のために、初期細胞培養物もしくは不滅化細胞株を
以下のものの内の一つもしくは組み合わせ物の存在下で
培養した：β−ＦＧＦ １ｎｇ／ｍｌ（Ｃｏｌｌａｂｏ
ｒａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ社）、ＥＧＦ ５ｎｇ／
ｍｌもしくは１０ｎｇ／ｍｌ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉ
ｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、ＮＧＦ（１０ｎｇ／ｍ
ｌ、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
社）、一リン酸ジブチルサイクリックアデノシン（ｄｂ
ｃＡＭＰ、１ｍＭ、Ｓｉｇｍａ社、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒ
ｇ）、レチノイン酸（５μＭ；Ｓｉｇｍａ社）、ＩＬ−
７（５０Ｕ／ｍｌ）、ＴＧＦα（５ｎｇ／ｍｌ）。

【００１７】初期細胞および不滅化細胞クローンの同時
培養 様々な細胞クローンの不滅化細胞を、皮質神経膠細胞も
しくは小脳からの顆粒細胞のいずれかと共に同時培養し
た。この初期細胞を既述の要領で６０ｍｍのペトリ皿内
でプレート培養し、そしてその細胞クローンの細胞をｐ
ＬＬ−コート化されたガラス製カバースリップ上で、そ
の初期細胞と不滅化細胞との間の短い距離を維持するた
めのワックスフィートを用いてプレート培養した。

【００１８】このワックスドットは以下の要領で調製し
た：オートクレーブにかけたパラフィンを微細ピペット
を用いてカバースリップ上に斑点状に乗せてカバースリ
ップ当たりに３つの小さなドットを作製した。ドットの
固形化後にそのカバースリップをｐＬＬで少なくとも３
０分間、３７℃でコートし、そして適切な培地で洗浄し
てから細胞をプレート培養した。

【００１９】顆粒細胞ニューロン 顆粒細胞はＫｅｉｌｈａｕｅｒら（１９８５、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１６：７２８−７３０）により記載される要領
で調製した。パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）遠心分離段
階により濃縮された細胞を最終的には、追加的に１０％
のウマ血清、２５ｍＭ ＫＣｌ、および０．６％ グル
コースを含む改変化ＳＡＴＯ培地（Ｔｒｏｔｔｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．、１９８９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅ
ｓ． ２２：３６９−３８３）中に再懸濁させた。２日
の培養の後にシトシンアラビノシド（１０^-5Ｍ）をその
培地に添加していずれかの残存性非神経性細胞を死滅化
させた。同時培養調査のためには１〜２×１０⁷細胞を
ペトリ皿内で培養した（６０ｍｍ直径、Ｎｕｎｃ社、Ｄ
ｅｎｍａｒｋ）。

【００２０】抗体 どの細胞タイプがその培養物内に存在するかを測定する
ために、以下の抗体を用いた：神経膠線維酸性細胞蛋白
質（ＧＦＡＰ、Ｄａｋｏ社、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）に対するウサギモノクローナル抗体；Ｏ−２Ａ
神経膠前駆細胞（Ｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９８３、
Ｎａｔｕｒｅ ３０３：３９０−３９６；１９８４；Ｄ
ｅｖ．Ｂｉｏｌ． １０６：５３−６０）、幾つかの神
経膠星状細胞（Ｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９８３、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３０３：３９０−３９６；Ｓｃｈｎｉｔｚ
ｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ １９８１、Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． １：４５７−４７０）、お
よびニューロン（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ ｅｔ ａ
ｌ．、１９７９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．（ＵＳＡ） ７６：４９１３−４９１７）により発
現されるＡ２Ｂ５抗原に対するマウスモノクローナル抗
体；稀突起膠細胞、後期段階の前駆細胞、およびシュワ
ン（Ｓｃｈｗａｎｎ）細胞を認識するＯ４抗原に対する
マウスモノクローナル抗体（Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ ｅｔ
ａｌ．、１９８１、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．８３：３２８
−３３８；Ｓｏｍｍｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ
１９８１、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ． ８３：３１１−３２
７；Ｔｒｏｔｔｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ、１
９８９、Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ． ４６：１１５
−１２２）；ブロモデオキシウリジンに対するＦＩＴＣ
−結合化マウスモノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ社、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）；ニューロンおよびシュワン（Ｓｃｈｗａｎ
ｎ）細胞を認識するモノクローナルラットＬ１抗体（Ｒ
ａｔｈｊｅｎ ａｎｄ Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ、１９８
４、ＥＭＢＯ Ｊ． ３：１−１０）；ガングリオシド
Ｄ３認識性神経膠前駆細胞および初期段階の神経外肺葉
性細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＬＢ１（Ｒｅ
ｙｎｏｌｄｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎ、１９８８、Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０２：４０９−４２５）；ネス
チンに対するポリクローナル抗体（Ｅ．Ａａｋｕ−Ｓａ
ｒｋａｓｔｅ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄ
ｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、から寄贈された）；１
６０ｋＤ形態のニューロフィラメントを認識するモノク
ローナル抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ社；Ｇｅｒｍａｎｙ）；高分子量ｋＤ形態のニューロ
フィラメントの初期リン酸化形態を認識するモノクロー
ナル抗体（Ｐｅｎｎｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９
９１、Ｅｘｐｔｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １１１：２５
−３５）；ビメンチンに対するモノクローナル抗体（Ｄ
ｉａｎｏｖａ社、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；
微小管結合化蛋白質ｔａｕを認識するモノクローナル抗
体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社；Ｇｅ
ｒｍａｎｙ）；シナプトフィシン（Ｓｙｎａｐｔｏｐｈ
ｙｓｉｎ）に対するマウスモノクローナル抗体（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社；Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）；ニューロン特異的エノラーゼを認識するポリクロ
ーナル抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社、Ｈａｍｂｕｒｇ；Ｇｅ
ｒｍａｎｙ）；微小管結合性蛋白質２に対するモノクロ
ーナル抗体（ＭＡＰ−２；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ社；Ｇｅｒｍａｎｙ）。モノクローナル抗
体は硫酸アンモニウム沈殿およびリン酸緩衝化食塩水
（ＰＢＳ）に対する透析によりハイブリドーマ培養物上
清から調製したか、あるいは商品として入手可能であっ
た。

【００２１】ＦＩＴＣ−もしくはＴＲＩＴＣ−結合化抗
−マウス、抗−ラット、抗−ヤギ抗体、もしくは抗−ウ
サギ抗体は、ＤＡＫＯ社、Ｃａｐｐｅｌ社（Ｄｅｎｋｅ
ｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、もしくはＤｉａｎｏｖ
ａ社からのものであった。間接蛍光免疫法のための培養
物の染色は、Ｓｃｈｎｉｔｚｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈａｃ
ｈｎｅｒ（１９８１）により記載される要領で実施し
た。

【００２２】ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り
込みを用いる分裂性細胞内でのＤＮＡ合成の検出 ｐＬＬ−コートされたカバースリップ（１〜２×１０⁵
細胞／カバースリップ）上でプレート培養した初期海馬
細胞をＮ２⁺−培地中１５時間、ＢｒｄＵ（５μＭ）を
添加して培養した。その後にこの細胞をリン酸緩衝化食
塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、第一抗体（Ｌ１）と共に２
０分間インキュベートし、そしてＰＢＳ中での洗浄段階
後にヤギ抗−マウスＴＲＩＴＣと共にインキュベートし
た。その後にこの細胞を３０分間、ＰＢＳ中の氷冷０．
５％パラホルムアルデヒド中で、そしてそれに次いで室
温で２０分間ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で
固定化させた。ＰＢＳ中での洗浄段階後、その細胞を２
０分間、４Ｎ ＨＣｌ／０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０中
で、そしてそれに次いで５分間、０．１Ｍ Ｂｏｒａｘ
中でインキュベートした。ＰＢＳ中での更に進んだ洗浄
段階後には、その細胞を３０分間、ＢｒｄＵに対するＦ
ＩＴＣ−結合化モノクローナル抗体と共にインキュベー
トした。ＰＢＳ中での洗浄後、その細胞を蛍光顕微鏡下
で検査した。

【００２３】ウイルス産生の検査 Ψ２を基にするベクター（ｖ−ｍｙｃ）での感染の結果
得られる全不滅化細胞株およびクローンを、挿入された
遺伝子を保持する感染性ウイルスの放出について、３Ｔ
３繊維芽細胞（１×１０⁷細胞／６０ｍｍペトリ皿）を
海馬細胞株からの上清中、ポリブレンの存在下で周期的
に検査し、そしてその後に培養培地（ＤＭＥＭプラス１
０％ウシ胎仔血清）を含むＧ４１８中での選択段階を実
施した。Ｇ４１８耐性３Ｔ３細胞数は全く観察されなか
った。

【００２４】Ｃａ²⁺−像映撮影法 蛍光プローブ：細胞内カルシウム濃度の動的変化をフラ
（Ｆｕｒａ）−２蛍光プローブ（Ｒｏｅ ｅｔ ａ
ｌ．、１９９０、Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ １１：６
３−７３）を用いて測定した。この蛍光染料を選択した
理由は、その選択性、高量子収率、および吸光率のため
である。フラ（Ｆｕｒａ）−２はアセトキシメチルエス
テルとして生細胞内に浸透し、そして細胞内エステラー
ゼによる加水分解後にはその細胞内に捕捉される。フラ
（Ｆｕｒａ）−２のカルシウム感受性遊離酸は細胞の内
側のカルシウムイオンに結合することが可能である。フ
ラ（Ｆｕｒａ）−２は３８０ｎｍに最大励起波長を有
し、そしてフラ（Ｆｕｒａ）−２／カルシウム複合体は
３４０ｎｍにピークを示す。細胞内カルシウム濃度の変
化は３４０ｎｍと３８０ｎｍとの励起波長、および５１
０ｎｍの発光波長での蛍光ビデオイメージを記録するこ
と、ならびに３４０ｎｍのもので３８０ｎｍのデジタル
化ビデオイメージの灰体値を割算することにより算出し
た。

【００２５】フラ（Ｆｕｒａ）−２での細胞のローディ
ング：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の２ｍＭ
フラ（Ｆｕｒａ）−２−アセトキシメチルエステルを含
む保存溶液を５〜１０μＭに、１．５％のウシ血清アル
ブミンおよび５ｍＭの塩化カルシウムを含む無血清最少
必須培地（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅ
ｄｉｕｍ）（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）で５〜１０μＭに希
釈した。細胞をファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）９６ウエル
プレート中で４５〜６０分間、３７℃でインキュベート
した。その後にこの細胞をＮ−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（Ｈ
ＥＰＥＳ、５ｍＭ）緩衝化サイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）
溶液（１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ
ＣａＣｌ₂、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＮａＨＣＯ
₃、１１ｍＭ グルコースを含むＨＥＰＥＳ緩衝化塩溶
液）中で２度洗浄した。

【００２６】イメージング法：１００μｌのサイロード
（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液をそのプレートのウエルに添加
し、そして細胞を順次、蛍光顕微鏡（Ｎｉｃｏｎ Ｄｉ
ａｐｈｏｔ社）下で３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの光に
露出させた。露出時間は１００ｍ秒であった。３秒間隔
での一連のビデオイメージが取得され、そしてイメージ
分析用コンピューター（Ｌｅｉｃａ社、Ｑｕａｎｔｉｍ
ｅｔ ５７０）のイメージボード中のデジタル化写真と
して保存された。８枚のイメージを取得した後に検査物
質を適用させた。細胞の灰体レベルは蛍光強度に相当
し、その灰体レベルを記録されたビデオイメージにおい
て測定した。「３８０ｎｍイメージ」の測定された灰体
レベルを「３４０ｎｍのイメージ」の灰体レベル（平均
化イメージからかもしくは個々の細胞からかのいずれか
の値）で分割することにより比率を決定した。平均化さ
れた結果については、灰体値は全体像にわたって測定し
た。

【００２７】第二メッセンジャー法 ホスホイノシチド加水分解は、³Ｈ−リン酸イノシトー
ルの蓄積を測定することにより決定した。細胞をウエル
当たり１００００細胞の密度で４８−ウエルプレート
（Ｃｏｓｔｅｒ社）内でプレート培養し、そして３７
℃、７％ ＣＯ₂下で４〜５日間インキュベートした。
その後に細胞をｍｌの培地当たり４μＣｉのｍｙｏ−２
−³Ｈ−イノシトールでのインキュベーションによりラ
ベル化した（比活性：１０〜２０μＣｉ／ｍモル：Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ社）。２４時間後にＬｉＣｌ（１０ｍＭの
最終濃度）を細胞に１時間添加した。その後にアゴニス
トを指示される濃度で添加した。インキュベーション
は、その培地を２００μｌの氷冷メタノールで置換する
ことにより１時間後に停止させた。４００μｌの蒸留水
を添加し、そして試料を直接ＡＧ−１Ｘ８イオン交換カ
ラム（ＡＧ−１Ｘ８樹脂：ＢｉｏＲａｄ社）にかけた。
遊離イノシトールおよびグリセロホスホリル−イノシト
ールを１６ｍｌの蒸留水、次いで１０ｍｌの５ｍＭ 四
ホウ酸二ナトリウム、６０ｍＭ ギ酸ナトリウムで洗い
落とした。全³Ｈ−リン酸イノシトール（ＩＰ１、ＩＰ
２、ＩＰ３）を７ｍｌの１００ｍＭ ギ酸、１Ｍ ギ酸
アンモニウムで溶出させた。溶出させた³Ｈ−リン酸イ
ノシトールの放射活性を、１３ｍｌの液体シンチレーシ
ョンカクテル（Ｕｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄ；Ｃａｎｂｅｒ
ｒａＰａｃｋａｒｄ社）の添加後に液体シンチレーショ
ン計測により決定した。測定は各実験値について三重実
験で実施された。未処理対照を１００％として設定し、
そして他の値をこの値に相関させて算出した。

【００２８】カラムは以下の要領で調製した：１ｍｌピ
ペットの先端に各先端当たり一つのガラスビーズ（Ｒｏ
ｔｈ社）を充填し、その後に５００μｌのＡＧ−１Ｘ８
樹脂を添加した。この樹脂を空気で圧縮し、そして２７
０μｌの海砂を乗せた。使用するまでそれらのカラムは
４℃下で保存した。

【００２９】電気生理学 電気生理学的設定：膜電流は完全細胞レコーディング形
態でのパッチクランプ技術（Ｈａｍｉｌｌ ｅｔ ａ
ｌ．、１９８１、Ｐｆｌｕｅｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．３９
１：８５−１００）で測定した。電流シグナルは通常の
エレクトロニクス（ＥＰＣ−９増幅器、ＨＥＫＡ Ｅｌ
ｅｋｔｒｏｎｉｋ ＧｍｂＨ社、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ、
Ｇｅｒｍａｎｙ）で増幅させ、１０ｋＨｚでフィルター
にかけ、そしてＩＢＭ ＡＴ−可変式コンピューターシ
ステム（これは刺激電流発生器としても作用する）に連
結されているインターフェースにより５ｋＨｚで試料採
取を行った。

【００３０】溶液および電極：標準的ベージング溶液は
以下のものを含んでいた（ｍＭ表示）：ＮａＣｌ １５
０、ＫＣｌ ５、ＭｇＣｌ₂ １．８、ＨＥＰＥＳ
５、およびグルコース １０。幾つかの実験では等モル
量のＮａＣｌを５ｍＭ ＢａＣｌ₂で置き換えた。レコ
ーディングピペットは約５ＭΩ（Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ
社、Ｍａｌｓｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の抵抗を有し
ていた。そのピペットは以下のものを含んでいた（ｍＭ
表示）：ＫＣｌ １４０、ＣａＣｌ₂ ０．５、ＥＧＴ
Ａ ５、ＭｇＣｌ₂ ２、およびＨＥＰＥＳ １０。ｐ
Ｈは７．４に調製した。幾つかの実験ではピペット溶液
は電位活性化電流の寄与を最少にさせるように設計され
ていた。この場合、リガンド活性化電流を調査したとこ
ろ、ピペット溶液は以下のものを含んでいた（ｍＭ表
示）：ＣｓＣｌ １４０、ＥＧＴＡ １０、およびＨＥ
ＰＥＳ １０。

【００３１】リガンドは細胞外塩溶液中に溶解されてお
り、そしてＵ字管アプリケーションシステムを介して適
用した。リガンド誘導化電流を記録するためには膜電位
を−７０ｍＶに固定させた。電位活性化電流の測定のた
めには細胞を−７０ｍＶに保ち、そして毎秒毎に膜を５
０ｍ秒の脱分極もしくは過分極テストパルスを通して−
１７０と＋２０ｍＶとの間の電位にステップさせた。

【００３２】

【実施例】

細胞株とクローンとのまとめ 以下の細胞株およびクローンが本発明内に含まれる： １．）レトロウイルスベクター： ＨＮＭＭＣＶ １３．１ ＨＮＭＭＣＶ １４．１ ＨＮＭＭＣＶ １１．２ を発現するｖ−ｍｙｃ癌遺伝子を用いる感染段階から取
得される細胞株。

【００３３】ＨＮＭＭＣＶ １３．１．ＦおよびＨＮＭ
ＭＣＶ １３．１．Ｅは細胞株ＨＮＭＭＣＶ １３．１
に由来するクローンである。

【００３４】ＨＮＭＭＣＶ １１．２．Ｏは細胞株ＨＮ
ＭＭＣＶ １１．２に由来するクローンである。

【００３５】ＨＮＭＭＣＶ １４．１．Ａは細胞株ＨＮ
ＭＭＣＶ １４．１に由来するクローンである。

【００３６】２．）レトロウイルスベクター： ＨＣｅ／ｎＸＶ を発現するｅｇｆｒ−ｎｅｕハイブリッド遺伝子を用い
る感染段階から取得される細胞株。

【００３７】ＨＣｅ／ｎＸＶＢは細胞株ＨＣｅ／ｎＸＶ
に由来するクローンである。

【００３８】マウス海馬からの初期培養物の樹立 胎仔日令Ｅ１６からのマウスを取得して「材料および方
法」に記載される要領で海馬を調製した。フィーダー細
胞の使用により放出された因子を介する細胞間の相互作
用が可能になるが、細胞から細胞への直接的な接触は排
除される。このシステムの助けを借りることでマウス海
馬細胞を少なくとも２１日間培養物中に維持することが
可能となる。この細胞は最初には多くのラメリポディウ
ムを産生するが、これはその後には減少して幾つかの異
なる過程へと変化して行き、培養物中で長期間を経た後
には分化および肥厚化を遂げて行く。

【００３９】初期海馬細胞の特徴決定 海馬細胞を、免疫蛍光技術を用いる様々なマーカーの発
現について分析した。以下の抗体を用いた：ＧＦＡＰ、
ネスチン、ニューロフィラメント（１６０ｋＤ；リン酸
化形態）、ＭＡＰ−２、ｔａｕ、シナプトフィシン、Ｌ
Ｂ１、Ｌ１、ビメンチン、Ｏ４、Ａ２Ｂ５、ニューロン
特異的エノラーゼ（Ｎｅｕｒｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
Ｅｎｏｌａｓｅ）。結果が表１にまとめられている。

【００４０】海馬細胞の不滅化および選択 培養物を、分裂性前駆細胞からの発達を既に遂げてしま
っている成熟細胞の存在について、ＢｒｄＵと共に１６
時間インキュベーションした後２〜７日目の培養物中で
既に発達を遂げてしまっている細胞内のＤＮＡ内へのＢ
ｒｄＵの取り込みを調査することにより分析した。神経
星状起源の内の幾つかのＧＦＡＲ−陽性細胞、前駆体様
起源の多くのネスチン−陽性細胞、およびニューロン起
源の少数のＬ１−陽性細胞が検出された。不滅化細胞株
は初期培養物から、ｖ−ｍｙｃもしくはｅｇｆｒ−ｎｅ
ｕ癌遺伝子を含む様々なレトロウイルスベクターを用い
て、「材料および方法」において以前に記載される要領
で樹立した。生存性でありかつ首尾よく不滅化された細
胞をそれらのマーカー特性について分析し、そして既述
の要領でクローン化した。

【００４１】ｖ−ｍｙｃおよびｅｇｆｒ−ｎｅｕの両方
の癌遺伝子含有性ベクターを使用することで数々の安定
な細胞株が作製され、これらを数カ月間にわたり継代す
ることが可能であった。これらの細胞株の細胞は、扁平
細胞のみか、もしくは扁平および両極細胞のいずれかで
構成されている一方で、両極細胞は形態学的にはプレー
ト培養後２日目の初期海馬細胞に類似していた。

【００４２】ｖ−ｍｙｃおよびｅｇｆｒ−ｎｅｕ癌遺伝
子含有性レトロウイルス構築物を起源とする細胞株につ
いてはそれらのマーカー発現についての特性決定を行っ
た。結果が表１および２に示される。ｖ−ｍｙｃ癌遺伝
子を含む細胞株は様々な細胞タイプからできていた。細
胞株ＨＮＭＭＣＶ １３．１、ＨＮＭＭＣＶ １１．
２、およびＨＮＭＭＣＶ １４．１は主に両極形態を有
する一方で、それらの細胞の内の僅かなパーセンテージ
のものが扁平かつ神経星状細胞様であった。これらの細
胞株を、初期海馬細胞について用いたのと同様のマーカ
ーの発現について調査した。まとめると、全細胞株は多
くのビメンチン−およびネスチン−陽性細胞、ならびに
僅かなパーセンテージのＬＢ１−およびＧＦＡＰ−陽性
細胞を含んでいた（表１）。

【００４３】ｅｇｆｒ−ｎｅｕ癌遺伝子を発現する細胞
株は主に非常に扁平かつ未分化様の見かけ上の形態を示
した。ほぼ全ての細胞がビメンチン−およびネスチン−
陽性であり、比較的高いパーセンテージのものがＡ２Ｂ
５、ＧＦＡＰ、およびＬＢ１を発現し、そして僅かな細
胞がＯ４およびＭＡＰ−２について陽性であった（表
２）。

【００４４】

【表１】

【００４５】

【表２】

【００４６】細胞クローン 細胞株は「材料および方法」に記載される要領でクロー
ン化させた。数回にわたる継代の後に安定な細胞クロー
ンが、ｖ−ｍｙｃ含有性細胞株およびｅｇｆｒ−ｎｅｕ
含有性細胞株の両方から樹立された。これらのクローン
を源の細胞株と同一のマーカーについて特徴決定した。
ｖ−ｍｙｃ含有性レトロウイルスベクターで不滅化させ
た細胞株を起源とするクローンについての結果が表１に
示される。全てのクローンはネスチンおよびビメンチン
の顕著な発現を示し、その細胞の内の幾つかはＧＦＡＰ
−もしくはＬＢ１−陽性であった。

【００４７】ｅｇｆｒ−ｎｅｕ発現性レトロウイルスベ
クターで不滅化させた細胞株を起源とするクローンの特
徴が表４に示される。

【００４８】不滅化細胞株およびクローンの分化の誘導 インビトロでの分化を誘導するために、以下の因子の数
々の組み合わせ物を用いた：レチノイン酸（ＲＡ、１０
μＭ）、ＮＧＦ、β−ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＬ−７、ＴＧ
Ｆα、ｄｂｃＡＭＰ（１ｍＭ）。それに加え、生後０〜
１日目のマウスから取得される皮質神経膠細胞および生
後６日目のマウスから取得される顆粒ニューロンとの同
時培養の効果を調査した。

【００４９】ｖ−ｍｙｃ発現性細胞株およびクローンの
分化 １ｍＭ ｄｂｃＡＭＰが細胞の部分的分化を誘導した。
これらの細胞は一層進行した分化を遂げた状態の形態を
示し、マーカーであるビメンチンの発現は低下し、そし
て特に細胞株ＨＮＭＭＣＶ １１．２の細胞はそれらの
変化に加えてニューロン的性質であるＭＡＰ−２の発現
の誘導を示した（表３）。

【００５０】

【表３】

【００５１】

【表４】

【００５２】ｅｇｆｒ−ｎｅｕ発現性細胞株およびクロ
ーンの分化 ＥＧＦの非存在下ではこの癌遺伝子の活性は負の方向に
調節されており、この細胞株の細胞は顕著な形態学的分
化を示した。多くの細胞がニューロンに典型的な様式
か、あるいは稀な事例では稀突起膠細胞に典型的な様式
でのかなり巧みに分岐された過程過程を発現した。マー
カー特性により判定したところ細胞株ＨＣｅｇｆｒ−ｎ
ｅｕ ＸＶはニューロン特性を発現した（表４）。

【００５３】Ｃａ^2-イメージング実験 細胞に、培養３日目〜７日目の間の時点でフラ（Ｆｕｒ
ａ）２／ＡＭをかけた。多数のアゴニストを、細胞内カ
ルシウムの上昇をもたらす細胞表面上の特異的レセプタ
ーを活性化させるそれらの能力について検査した。細胞
質内でのカルシウム濃度の上昇は細胞膜内での特異的カ
ルシウムチャンネルの活性化後か、カルシウムイオンが
通過可能なイオンチャンネルに直接共役する神経伝達物
質レセプター（すなわち、ＮＭＤＡもしくはＡＭＰＡタ
イプのグルタミン酸レセプター）の活性化後か、あるい
はシグナルを細胞の内側の様々な酵素の活性を調節する
特異的Ｇ蛋白質の活性化を通して伝達させるレセプター
の活性化により生じることがあり得る（Ｃｏｎｎｏｒ、
Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ １４（１９９３）、１８５
−２００；Ｃｒｏｕｃｈ ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｙ、Ｍｅ
ｄｉｃａｌ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ． １３（１９９３）、１
０５−１２３）。ホスホリパーゼＣの活性化により第二
メッセンジャーであるジアシルグリセロールおよびイノ
シトール三リン酸が細胞膜内のリン脂質から生じる。カ
ルシウムイオンを保持する内部ベシクル上に位置するレ
セプターへのイノシトール三リン酸の結合により、細胞
質内のカルシウムイオンの濃度の一過性上昇がもたらさ
れる（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ｍ．Ｊ． １９９３、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３６１：３１５−３２５）。

【００５４】これらの細胞を、中枢神経系における多種
多様の神経伝達物質レセプターに対して様々な特異性を
有する多数のアゴニストと共にインキュベートした。具
体的にはグルタミン酸レセプターの様々なサブタイプに
対する特異的リガンドを検査した。グルタミン酸および
アスパラギン酸は哺乳類の中枢神経系における主要興奮
性神経伝達物質であると考えられている（Ｎｉｃｈｏｌ
ｌｓ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１２（１９９
３）６１３−６３１）。グルタミン酸のためのレセプタ
ーは、カチオン−ゲート化イオンチャンネルに直接共役
するレセプター（イオンチャンネル型レセプター）、な
らびにＧ蛋白質に結合するレセプター（代謝性レセプタ
ー）、および第二メッセンジャーシステムを活性化させ
るレセプターに分類することができる（Ｈｏｌｌｍａｎ
ｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３４２（１９８９）、
６４３−６４８；Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４９（１９９０）、１５８０−１５８５；
Ｐｉｎ，Ｊ．Ｐ． ａｎｄ Ｄｕｖｏｉｓｉｎ，Ｒ．、
１９９５、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ３４：
１−２６）。

【００５５】

【表５】

【００５６】様々なグルタミン酸レセプターサブユニッ
トに対するアゴニストを既述のクローンおよび細胞株と
共にインキュベートした際には様々なシグナルが記録さ
れた（表５）。１０μＭ〜１０ｍＭのグルタミン酸の、
細胞クローンＨＮＭＭＣＶ１３．１．Ｆ、ＨＮＭＭＣＶ
１３．１．Ｅ、ＨＮＭＭＣＶ １１．２．Ｏ、もしく
はＨＮＭＭＣＶ １４．１．Ａへの適用により、細胞質
内のカルシウム濃度の有意な上昇がもたらされた。例え
ばα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソ
オキサゾール−プロピオン酸（ＡＭＰＡ、最高１ｍＭま
で）もしくはカイニン酸（最高１ｍＭまで）のようにイ
オンチャンネル型グルタミン酸レセプターを活性化する
ことができるアゴニストは、細胞クローンＨＮＭＭＣＶ
１３．１．Ｆ、ＨＮＭＭＣＶ １３．１．Ｅ、ＨＮＭ
ＭＣＶ １１．２．Ｏ、もしくはＨＮＭＭＣＶ １４．
１．Ａ、ならびに未分化のＨＣｅ／ｎＸＶ．Ｂ細胞内の
細胞内カルシウム濃度の一過性の上昇は一つの例外を除
いてもたらすことはなく、その例外とは：カイニン酸の
存在下では未分化のＨＣｅ／ｎＸＶ．Ｂ細胞における再
現的カルシウムシグナルが存在したことである。グルタ
ミン酸（１００μＭ）の適用後に記録されるシグナル
は、イオンチャンネル型グルタミン酸レセプターを選択
的に遮断する６−ニトロ−７−シアノキノキサリン−
２，３−ジオン（ＣＮＱＸ、１００μＭ）による拮抗作
用は受けなかった。カルシウム伝達性特性を有するグル
タミン酸レセプターの他のイオンチャンネル型サブクラ
ス（Ｋｕｔｓｕｗａｄａ、Ｎａｔｕｒｅ ３５８（１９
９２）、３６−４１）を選択的に活性化するＮ−メチル
−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ；最高５００μＭま
で）は、これらの細胞では有意なカルシウムシグナルを
もたらさなかった。電気生理学的記録法で測定される高
速不活性性シグナルはこのシステムでは可視化されない
のかもしれない。これらの実験（カイニン酸についての
未分化ＨＣｅ／ｎＸＶ．Ｂ細胞の例外は存在するもの
の）から、イオンチャンネル型グルタミン酸レセプター
の発現は起こりそうもないように思われる。グルタミン
酸レセプターの他のサブクラスに対するアゴニストであ
る代謝性グルタミン酸レセプター（Ｔａｎａｂｅ、Ｎｅ
ｕｒｏｎ ８（１９９２）、１６９−１７９）も既に、
それらが細胞内カルシウム濃度の一過性上昇を活性化す
る濃度について検査されている。代謝性グルタミン酸レ
セプターの活性化および対応するＧ蛋白質の活性化後
に、細胞膜内のホスホリパーゼＣの活性化を通してこの
一過性上昇が生じるのかもしれない（Ｂｏｃｋａｅｒ
ｔ、Ｆｕｎｄ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７（１
９９３）、４７３−４８５）。例えば、１Ｓ３Ｒ−アミ
ノ−シクロプロパン−１，３−ジカルボキシレート（１
Ｓ３Ｒ−ＡＣＰＤ）およびＬ−カルボキシシクロプロピ
ルグリシン（Ｌ−ＣＣＧｌ）のような代謝性グルタミン
酸レセプターに対するアゴニストは両方とも強力（未分
化ＨＣｅ／ｎＸＶ．Ｂ細胞中では弱いシグナル）かつ一
過性に生じる細胞内カルシウム濃度の増加をもたらす
（表５）。これらの結果により、ＨＮＭＭＣＶ １３．
１．Ｅ、ＨＮＭＭＣＶ １３．１．Ｆ、ＨＮＭＭＣＶ
１１．２．Ｏ、ＨＮＭＭＣＶ １４．１．Ａ、ならびに
程度は劣るにせよ未分化のＨＣｅ／ｎＸＶ．Ｂ細胞は、
イオンチャンネル型タイプのレセプターではなく代謝性
タイプのレセプターに相当するグルタミン酸レセプター
を発現するようである。

【００５７】他の神経伝達物質レセプターのための多数
の特異的アゴニストが既に細胞に適用されている。セロ
トニン（様々なセロトニン神経伝達物質レセプターのた
めのアゴニスト（Ｐｅｒｏｎｔｋａ １９９３、Ｊ．Ｍ
ｅｕｒｏｃｈｅｍ． ６０：４０８−４１６）、最高１
ｍＭまで）およびドーパミン（様々なドーパミン神経伝
達物質レセプターに特異的、（Ｓｉｂｌｅｙ １９９
２、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ． １
３：６１−６９）、最高１ｍＭまで）は、１３．１．
Ｆ、１３．１．Ｅ、１１．２．Ｏ、１４．１．Ａ、もし
くはＨＣｅ／ｎＸＶ．Ｂ細胞では特異的シグナルはもた
らさなかった（表５）。カルバコール（ムスカリン様タ
イプのアセチルコリンレセプターに結合するＧ蛋白質に
特異的（Ｍｉｌｌｉｇａｎ １９９４、Ｔｒｅｎｄｓ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ． １４：４１３−４１
８）、最高１ｍＭまで）はＨＣｅ／ｎＸＶ．Ｂ細胞では
再現的シグナルを示したが、検査した他の細胞ではその
ようなシグナルは示されなかった。

【００５８】第二メッセンジャー実験 ＨＮＭＭＣＶ １４．１．Ａ細胞により発現される代謝
性グルタミン酸レセプター（一つもしくは複数）（ｍＧ
ｌｕＲ）の薬理学特性決定を行った。イノシトール三リ
ン酸蓄積におけるｍＧｌｕＲの数々の既知のアゴニスト
の効果を検査した。Ｌ−グルタミン酸、キスカル酸、イ
ボテン酸、および１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤはイノシトール
三リン酸蓄積における濃度依存的相加を引き起こした。
Ｄ−グルタミン酸は効果を示さなかった。用量反応性の
関係からＥＣ５０値は各々５０μＭ（Ｌ−グルタミン
酸）、２０ｎＭ（キスカル酸）、５μＭ（イボテン
酸）、および２０μＭ（１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤ）である
と算出された。これらのデータにより、以下の能力等級
がもたらされた：Ｑａ＞Ｉｂｏ＞１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤ
＞Ｇｌｕ。Ｌ−グルタミン酸が最も有望なアゴニストで
あった。イボテン酸、１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤ、およびキ
スカル酸の最大反応はグルタミン酸について観察された
ものと比較するとやや劣っていた。

【００５９】電気生理学 リガンド活性化電流：中枢神経系中の多種多様な興奮性
および阻害性神経伝達物質レセプターについて様々な指
向性を有する多数の特異的アゴニストを調査した。細胞
株間には多種多様の有意な伝達物質特異性および感受性
が存在するものの、一般的に単純化させた記載は以下の
ようなものとなり得る：ナトリウム電流を示す細胞は多
様な物質と反応し、同時に大きなリガンド活性化電流を
示す。ナトリウム電流を示さない細胞は、より少数のア
ゴニストに対して一層微弱な反応を示す傾向がある（表
６）。

【００６０】

【表６】

【００６１】様々なアゴニストにより誘導されたリガン
ド活性化電流の薬理学的および電気生理学的特性を、大
きな振幅の反応を示す細胞クローン、すなわち分化を遂
げたＨＣｅ／ｎＸＶ．Ｂ細胞において詳細に分析した。
カルシウムイメージング実験に関しては、様々なグルタ
ミンアゴニストがＨＣｅ／ｎＸＶ．Ｂ細胞における明確
な内向き電流を誘導した。ＡＭＰＡ（１００μＭ）、Ｎ
ＭＤＡ（１ｍＭ）、カイニン酸（１ｍＭ）、およびグル
タミン酸（１ｍＭ）は、様々なピーク増幅を示す反応を
誘導した。幾つかの細胞はＮＭＤＡおよび／またはＡＭ
ＰＡには反応しなかった。それとは対照的に、ＨＮＭＭ
ＣＶ １３．１．Ｅ、ＨＮＭＭＣＶ １４．１．Ａ、お
よび未分化のＨＣｅ／ｎＸＶ．Ｂ細胞は僅かばかりの内
向き電流を誘導したに過ぎなかった。カイニン酸により
活性化される電流を媒介するイオン種を同定するため、
および予測されるカイニン酸／ＡＭＰＡレセプターのサ
ブユニット構成成分を解明するために、カイニン酸反応
の逆転電位を決定した。従って膜を、−１００、−８
０、−６０、−４０、−２０、０、＋２０、および＋４
０に脱分極もしくは過分極させた。カイニン酸に関して
取得されるＩ／Ｖ曲線は直線であり、かつ０ｍＶで逆転
しており、このことにより直線電流／電位関係の原因と
なるＧｌｕＲ−Ｂサブユニットの存在が示された。

【００６２】イオンチャンネル型伝達物質レセプターの
中でもＧＡＢＡは中枢神経系における主な阻害性伝達物
質である。グルタミン酸レセプターに関しては、ＧＡＢ
Ａレセプターは、イオンチャンネル型レセプター（いわ
ゆるＧＡＢＡ_Aレセプター）および代謝性レセプター
（ＧＡＢＡ_Bレセプター）に分類することができる。Ｈ
Ｃｅ／ｎＸＶ．Ｂ細胞のＧＡＢＡ反応を特異的ＧＡＢＡ
_Aレセプターアゴニストであるムスシモールにより模倣
することができ、かつアンタゴニストであるビククリン
により遮断することができた。ＧＡＢＡ活性化電流の逆
転電位は＋１０ｍＶに近く、この値は予測されたＣｌ^-
等価電位に適合した。これらの実験により、ＨＣｅ／ｎ
ＸＶ．Ｂ細胞はＧＡＢＡに対する顕著な反応を示し、こ
の反応はＧＡＢＡ_A−レセプターにより媒介されること
が証明された。グルタミン酸とは対照的に、これらのレ
セプターは未分化のＨＣｅ／ｎＸＶ．Ｂ細胞およびＨＮ
ＭＭＣＶ １４．１．Ａ細胞中にも存在する。しかしな
がらこれらの細胞、および類似のＧＡＢＡ−反応を示す
多くの細胞のＧＡＢＡ反応のピーク増幅間には大きな変
動が示された。

【００６３】最後に、アセチルコリンの適用後には、Ｈ
ＮＭＭＣＶ １４．１．Ａおよび未分化のＨＣｅ／ｎＸ
Ｖ．Ｂ細胞の内の少数部分のみがアセチルコリン誘導化
内向き電流を示したに過ぎなかった。

【００６４】電位活性化電流：電位活性化電流の存在も
しくは非存在を検査する目的で、断片化細胞を電位固定
プロトコールを用い、−７０ｍＶから開始する一連の脱
分極および過分極電位に各々固定化させた。全種類の細
胞の脱分極化は電圧変化段階中に遅延増加を示す外向き
電流成分を活性化した。しかしながら分化を遂げたＨＣ
ｅ／ｎＸＶ．Ｂ細胞は追加的高速活性性および不活性性
内向き電流を示すことがよくあり（表６）、これは恐ら
くはナトリウム電流であると思われ、このことによりそ
れらの細胞は電流固定条件下で活性電位を生じることが
可能となるのであろう。この電流は、細胞株ＨＮＭＭＣ
Ｖ １４．１．Ａからの細胞および未分化のＨＣｅ／ｎ
ＸＶ．Ｂ細胞には観察されなかった。−８０ｍＶと比較
して一層陰性寄りの電位への過分極は追加的な内向き電
流成分を活性化した。この内向きに修正された電流は一
層強い陰性電位では不活化され、そしてナトリウム内向
き電流を示す細胞内ではあまり顕著ではなかった。

【００６５】本発明の主な特徴または態様は以下のとお
りである。

【００６６】１． 代謝性グルタミン酸レセプターを発
現する不滅化海馬細胞。

【００６７】２． 受託番号ＡＣＣ ２２２３、ＡＣＣ
２２３０、ＡＣＣ ２２３１、ＡＣＣ ２２３２、お
よびＡＣＣ ２２３３としてＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍ
ｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ
ｎに寄託されている、前記１に記載の細胞。

【００６８】３． 医療薬のスクリーニングのための、
前記１および２に記載の細胞の使用。

【図面の簡単な説明】

【図１】分化を遂げたＥＧＦ除去後７日目のＸＶ．Ｂ細
胞。左側はピペット溶液内でのＣｓＣｌの存在および非
存在下での２つの異なる細胞の電位固定記録値である。
電位固定プロトコールを用いると、膜は−７０ｍＶの保
持電位から増加脱分極および過分極電位までに各々固定
されている。ＣｓＣｌの非存在下では細胞は高速ナトリ
ウム電流の活性化および遅延した外向き修正性カリウム
電流を伴って大きな脱分極化に反応するが、この反応は
ＣｓＣｌの存在下では遮断される。右側は対応する細胞
が電流固定化に付されている。適切な電流注入の時点で
は活性電位が誘発された。ＣｓＣｌ存在下での延長され
た再分極化に留意されたい。中央には分化を遂げた典型
的な細胞が示されている。

【符号の説明】

表の簡単な説明 表に用いられる記号および略称の記述： 以下の抗原を認識する抗体： Ａ２Ｂ５：神経膠前駆細胞、幾つかの神経膠星状細胞、
およびニューロンにより発現される表面ガングリオシド ＬＢ１：稀突起膠細胞、後期段階の神経膠前駆細胞、お
よびシュワン（Ｓｃｈｗａｎｎ）細胞上の表面脂質 Ｏ４：稀突起膠細胞、後期段階の神経膠前駆細胞、およ
びシュワン（Ｓｃｈｗａｎｎ）細胞上の表面分子 Ｌ１：ニューロンおよびシュワン（Ｓｃｈｗａｎｎ）細
胞により発現される表面糖蛋白質 ＧＦＡＰ：神経膠線維酸性蛋白質；神経膠星状細胞によ
り発現される細胞内蛋白質 ＮＳ：ネスチン；神経性前駆細胞により発現される細胞
内蛋白質 ＶＩＭ：ビメンチン；神経性前駆細胞により発現される
細胞内蛋白質 ＮＦ−１６０：ニューロフィラメントの１６０ｋＤ形
態；ニューロンにより発現される細胞内蛋白質 ＮＦ−Ｐ：ニューロフィラメントの高分子量ｋＤ形態の
初期リン酸化形態；ニューロンにより発現される細胞内
蛋白質 ｔａｕ：微小管結合化蛋白質ｔａｕ ｓｙｎａｐｔｏ：シナプトフィシン ＮＳＥ：ニューロン特異的エノラーゼ ＭＡＰ−２：微小管結合化蛋白質−２ 更に別の略称： ＤＩＶ：インビトロでの日数 ＋ｄｂｃＡＭＰ：１ｍＭのジブチリルサイクリックアデ
ノシン一リン酸の存在下で培養される ＋もしくは（ｏｒ）−ＥＧＦ：表皮成長因子の存在もし
くは非存在下で培養される ＋ニューロン（ｎｅｕｒｏｎｓ）：小脳顆粒細胞と同時
培養される ＮＧＦ：神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆ
ａｃｔｏｒ） β−ＦＧＦ：塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ
ＦｉｂｒｏｂｌａｓｔＧｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ） ＥＧＦ：表皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗ
ｔｈ Ｆａｃｔｏｒ） ｎ．ｄ．：非実施 記号： （＋）：１〜１０％陽性細胞 ＋：１０〜３０％陽性細胞 ＋＋：３０〜７０％陽性細胞 ＋＋＋：７０〜１００％陽性細胞 −：非陽性細胞

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 トマス・ミユラー ドイツ53113ボン・エアメカイルシユトラ ーセ36 (72)発明者 アルノ・フリートル ドイツ51427ベルギツシユグラートバツ ハ・イムヒルゲルスフエルト53 (72)発明者 トマス・グラザー ドイツ51491オフエラート・ビーデンホフ ８ (72)発明者 ジヤクリン・トロツター ドイツ69121ハイデルベルク・モーツアル トシユトラーセ19 (72)発明者 マリオン・ユング ドイツ78464コンスタンツ・マイナウシユ トラーセ48アー (72)発明者 エバ−マリア・アルベルス ドイツ69117ハイデルベルク・ハウプトシ ユトラーセ22

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 代謝性グルタミン酸レセプターを発現す
   る不滅化海馬細胞。