JP2008545376A - 細胞ベースの治療に関する材料及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)それらは特殊化しておらず、且つ明らかな特異的発生上の作用を有しない。
(ii)老化したまたは静止状態を経た他の初代細胞種と異なり、それらは培養下で長期間自己増殖し得る。しかし、幹細胞はそれ自身で再生し得る。
(iii)それらは特異的機能を備える特殊化した細胞種(例えば、神経細胞、β細胞、心筋細胞)をもたらし得る。
(i)すべての血液細胞種をもたらす造血系幹細胞;
(ii)骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、及び腱におけるもの等の他の種類の結合組織細胞をもたらす骨髄間質細胞;
(iii)神経細胞、星状膠細胞、及び乏突起膠細胞をもたらす神経幹細胞;
(iv)腸陰窩における吸収細胞、杯細胞、パネート細胞、及び腸内分泌細胞を産生する腸上皮幹細胞;
(v)ケラチノサイト、毛嚢、及び表皮を産生する皮膚幹細胞;
によって例証され得る。
[はじめに]
世界中で1億5000万人の人々が糖尿病に罹患している。インシュリン治療にもかかわらず、網膜症、腎症、及びニューロパチー等の晩期合併症は稀ではない。死体からの島の移植はI型糖尿病の問題を処理する一つの手段を提供するが、これは入手できる臓器の不足により危ういものである。幹細胞治療はこれらの問題に取り組むための可能性のある手段を提供する。この技術が十分に機能的なβ細胞を産生し得るかどうかは、依然として明らかではない。
膵管を12月齢のアルビノスイス(Albino Swiss)ラットから単離し、CMRL培地中に播種する前に細かく刻んだ。培養下で約5週間後に、コンフルエントの単層としてパスファインダー細胞が出現した。その後、これらを回収しPBSで洗浄した。
0.2μmフィルターキャップ付きのT75培養フラスコ(Corning社, UK)中に、10%ウシ胎児血清(Sigma社, Poole, UK)、2 mMグルタマックス、1.25μg/mLアムホテリシンB、及び100μ/mL/100μg/mLペニシリン/ストレプトマイシン(すべてInvitrogen社, Paisley, UK)を補充した20 mLのCMRL 1066培地(Invitrogen社, Paisley, UK)中で、37℃で5% CO2大気中での培養下で、PCを維持する。
前述のように、培養された細胞を洗浄しトリプシン処理する。次いで、それらを1000×rpmで10分間遠心分離し、生じた細胞ペレットをPBS中に再懸濁する。次いで、トリパンブルー(Invitrogen社, Paisley, UK)生存率カウントを行い、次いで、100,000〜1,000,000細胞/mLを、暗所4℃で45分間、0.2% BSA/PBS中の1/75希釈のマウス抗ラットCD90抗体(Serotec社, Kidlington, UK)100μLで標識する。次いで、それらを0.2% BSA/PBS中で1000×rpmで3回洗浄及び遠心分離した後、暗所4℃で45分間、5%ブロッキング血清を補充した0.2% BSA中の1/15希釈のFITC接合ウサギ抗マウス免疫グロブリンの(Fab)2断片(Dako Cytomation社, Ely, UK)100μLの添加によって標識する。二次抗体のみのコントロールも用意する。前述のように洗浄及び遠心分離した後、生じた細胞ペレットを1 mLのPBSに再懸濁し、Beckman Coulter XLフローサイトメトリー(Beckman Coulter社, High Wycombe, UK)を用いて陽性細胞のパーセンテージを確認する。
0日目にC57BL/6マウス(n=5)をStreptotozocin(STZ:250 mg/kg)の注入によって糖尿病にした。3日目に当該尾静脈中に750,000個のPCを注入した。コントロール動物には生理食塩水または同じ数のC57BL/6の骨髄細胞を注入する。3日おきに血中グルコースをモニターした。
0日目にC57BL/6マウス(n=4)をStreptotozocin(STZ:250 mg/kg)の注入によって糖尿病にした。血中グルコース。
細胞のリポフスチン含有量を、560-590 nm領域で青色発光するフローサイトメトリーを用いて評価した。当該発光ピークの平均値として読み取り値を算出し、任意の単位で表した。
下記のようにパスファインダー細胞を過酸化物質の侵襲にさらし、メーカーの指示に従って、WSTアッセイ(Roche社, Switzerland)によって増殖能を評価した。
メーカーの忠告に従って、細胞毒性検出キット(Cytotoxicity Detection Kit:Roche社, Nonnenwald, Germany)を用いてLDH細胞毒性アッセイを実施した。
乳房縮小術を受けた患者由来の1 cm断片の乳房組織のサンプルを、10%ウシ胎児血清(Sigma社, Poole, UK)、2 mMグルタマックス、1.25μg/mLアムホテリシンB、及び100μ/mLペニシリン/ストレプトマイシン(すべてInvitrogen社, Paisley, UK)を補充した5 mLのCMRL 1066培地中に移した。当該組織を無菌条件下で手術用メスの刃を用いて細かく刻み、次いでコラゲナーゼIV(10 mL HBSS中に0.05 g)で5-12時間処理した。これらを16ゲージのニードルを用いて採取し、37℃で5% CO2大気中で、T25組織培養フラスコ中の前記培地中で平板培養した。
細胞を1つのT75あたり0.25及び0.5×106細胞、並びに0.1×105細胞で平板培養した。
肝細胞培地:
10 ng/mL線維芽細胞成長因子4(Sigma社)、1×ITS(Gibco社)、100μ/mLペニシリン/ストレプトマイシン、及び0.2%ウシ血清アルブミンを補充したDMEM:F12。
一次抗体−マウス抗ラットCD90(Serotec社)
ダイナビーズ・ヤギ抗マウスIgG(Dynal Biotech社)
バッファー1:PBS(Ca2+及びMg2+不含/0.1% BSA及び2 mM EDTA pH 7.4)
メーカープロトコールによると要するに、ダイナビーズ洗浄手順:所望の量の再懸濁したダイナビーズをエッペンドルフに移し、等量または少なくとも1 mLのバッファー1を添加する。チューブを磁気中に1分間放置し、上清を除く。磁気からはずし、元の容量のバッファー1中に再懸濁する。106個の標的細胞あたり1μgの一次抗体を添加する。2-8℃で10分間インキュベーションする。1×107細胞あたり2mLのバッファー1を添加することによって細胞を洗浄し、8分間300×gで遠心分離する。上清を除く。1×107細胞/mLでバッファー1中に当該細胞を再懸濁する。
1×107細胞/mLのサンプルあたりダイナビーズを25μL添加する。穏やかな傾斜をつけ且つ回転させながら2-8℃で20分間インキュベーションする。結合していない細胞の補足を制限するために、バッファー1で当該容量を倍加する。当該チューブを磁気中に2分間放置する。
上清を除き、以下の手順:1)1×107ダイナビーズあたり1 mLのバッファー1を添加し;2)チューブを磁気中に1分間放置し、上清を除く;を用いてビーズに結合した細胞を穏やかに4回洗浄する。
維持用培養培地中に細胞を再懸濁し、組織培養フラスコ中で平板培養する。
1×107細胞/mLのサンプルあたりダイナビーズを50μL添加する。穏やかな傾斜をつけ且つ回転させながら2-8℃で30分間インキュベーションする。結合していない細胞の補足を制限するために、バッファー1で当該容量を倍加する。当該チューブを磁気中に2分間放置する。
結合していない細胞を含む上清を新しいチューブに移す。磁気中にさらに1分間再び放置する。結合していない細胞を含む上清を移し、維持用培養培地へ添加し、組織培養フラスコ中で平板培養する。
実験における使用前に、それぞれの選別された集団について2回MACsを実施した。実験における使用前に、すべての選別された集団を蛍光活性化フローサイトメトリーで調べた。
105細胞/ウェルの密度で6ウェルプレート上で細胞を増殖させた。播種後約72-96時間の時点で(コンフルエントになった時点で)、細胞をPBS中で洗浄し、1 mLの2%ホルムアルデヒド/0.2%グルタルアルデヒド中で、室温で10分間、固定する。無菌PBSで2回すすぎ、37℃(CO2なし)でインキュベーションし、新しいSAβGal染色液の脱水を防ぐためにパラフィルムで包み、以下のように(終濃度を表す)準備する。
溶液1 mLあたり
・1 mg X-gal
・5 mM フェリシアン化カリウム
・5 mM フェロシアン化カリウム
・2 mM MgCl2
・150 mM NaCl
・40 mMクエン酸及びリン酸ナトリウムpH 6(当該6ウェルのうちの1つにおいて、染色の有効性を保証するためのポジティブコントロールとしてpH 4を用いた。)
RNA用の初期設定後、GeneQuantキャピラリー分光光度計(Pharmacia Biotech社)を用いてRNAを定量化した。濃度を260 nmで測定し、純度を吸光度260/280 nm比率として見積もった。
リアルタイムPCR(Taqman社)用の一本鎖cDNA合成を、SuperScriptTM一本鎖合成システム(Invitrogen社)を用いて実施した。
関心のある遺伝子のmRNA発現パターンをモニターするために、cDNA定量化分析に相対的定量的リアルタイムPCRを用いた。ABIプリズム(登録商標)7700シークエンス検出システムを用いて、当該分析を実施した。すべての場合において、18S RNA遺伝子コントロールと比較して老化関連遺伝子発現を測定した。
プライマー及びプローブ配列(5’ -3’)
18s:
正方向プライマー acctggttgatcctgccagtag
逆方向プライマー agccattcgcagtttcactgtac
プローブ: FAM-tcaaagattaagccatgcatgtctaagtacgcac-TAMRA
正方向プライマー tttcagcggttgtaccagtgtct
逆方向プライマー catattcaaaatgtgctgctgaatt
プローブ: FAM-ctccaggagcggctgcccc-TAMRA
正方向プライマー gagccacaggcaccatgtc
逆方向プライマー cggcatactttgctcctgtgt
プローブ: FAM-cctggtgatgtccgacct-TAMRA
正方向プライマー tccctcatcagcaaggca
逆方向プライマー gatccgtctggcctgtctt
プローブ: FAM-tagccaccccacgactgc-TAMRA
In vitorモデルとして静的刺激試験を用いて、グルコースの種々の濃度に応答してインシュリンを分泌する島様クラスターの能力を調べた。
当該実験には4つのストック溶液が必要とされた。ストック溶液1を、脱イオン水500 mL中に13.44 gの塩化ナトリウム(ANALR BDH社)を溶解することによって作製した。ストック溶液2を、脱イオン水500 mL中に4.03 gの重炭酸ナトリウム(SIGMA社)、0.75 gの塩化カリウム(SIGMA社)、及び0.41 gの塩化マグネシウム(SIGMA社)を溶解することによって作製した。ストック溶液3を、脱イオン水500 mL中に0.74 gの塩化カルシウム(SIGMA社)を溶解することによって作製した。ストック溶液4を、脱イオン水500 mL中に59.5 gのHEPES(N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-2-エタンスルホン酸)(SIGMA社)を溶解することによって作製し、当該pHをpH 7.4に補正した。
37℃で5% CO2、95%大気インキュベーターからプレートを取り出し、培地を除去し、G3(カルバコール不含)を用いて3回洗浄した。すべての群の細胞間で同程度のレベルの代謝活性を引き起こすために、すべてのウェルに2 mLのG3を添加し、当該プレートを5% CO2及び95%大気の条件下で、37℃で60分間、インキュベーションした。次いで、前記G3溶液を除去し、2 mLのG3、G10、及びG20グルコース濃度物を適切なウェルに二重反復で(in duplicate)添加した。
ラットインシュリンELISAキット(Mercodia社)を用いて、当該上清中のインシュリン濃度を測定した。当該キットは、固相の、2つのモノクローナル抗体がインシュリン分子上の別々の抗原決定基に対して向けられている二部位酵素直接サンドイッチ免疫アッセイ技術である。メーカーの忠告に従って、当該アッセイを実施した。
各ウェル中の上清中に放出されたインシュリンの量は、各ウェル中に存在する細胞の量に依存する。各ウェル中に放出されたインシュリンを標準化するために、当該上清インシュリン濃度を各ウェルに対するタンパク質濃度で割った。次いで、インシュリン濃度を1分間あたりタンパク質1 mgあたりに放出されるインシュリンの量(pg)として表した。
CMRL中で5週間培養された細かく刻まれた管は、PC単層の形成をもたらした。これらの細胞の細胞形態を、図1に示される光学顕微鏡写真によって判定し得る。これらの細胞を、免疫細胞化学(ICC)及びRT-PCRによって特徴づけした。
適切な培地中での増殖により、PCを培養してin vitroにおいて島を産生し得る。当該フラスコからピペットによってCMRL培地を完全に除去すること及び任意の過剰な血清を取り除くために室温で5分間、10 mLのHBSS(前記参照)を添加することによって、PC細胞は分化する。前記HBSSの除去後、ペニシリン/ストレプトマイシン(前記参照)、アムホテリシン(前記参照)、0.2% BSA、10 mMナイアシンアミド、10 ng/mLケラチノサイト成長因子(すべてSigma社, Poole, UK)、及びITS-X:−(インシュリン10 mg/L、トランスフェリン5.5 mg/L、亜セレン酸ナトリウム6.7μg/L)(Invitrogen社, Paisley, UK)を補充したDMEM/F12培地(Invitrogen社, Paisley, UK)20 mLを前記T75培養フラスコに添加する。次いで、当該細胞をCO2インキュベーター内で37℃で維持し、当該培養培地を20 mLの新しい培地で1週間に2回置換した。これらは、血清の存在または非存在下で島クラスター(図8.1)または神経細胞を産生する。
[PCの増殖特性]
パスファインダー細胞は指数関数的増殖を示し、集団倍増時間の増加を示さず、且つ増殖停滞期の非存在を示す(図12)。
リポフスチンは、複製細胞のリソソーム中に年齢とともに次第に蓄積する非分解性の自己蛍光色素である。その蓄積は、増大した酸化的侵襲の条件下で加速されることが報告されている。上昇したリポフスチン含有量を有するより大きな細胞は、典型的に老化現象を示す(図13)。当該パスファインダー集団中の平均リポフスチン含有量は、連続的継代とともに低下を示す。しかし、一貫した細胞集団をサイズによって選択する際にFACsげーティングプロトコールを使用した場合、リポフスチン含有量に有意な変化はなかった。これらのデータは、高いリポフスチン含有量を有し且つ老化細胞のサイズ特性を示す明らかなPCの亜集団が存在することを示している。残りの細胞は培養下で長期にわたりリポフスチン含有量に変化を示さないが、この亜集団は連続的継代とともに消滅する。
ES細胞と異なり(31)、パスファインダー細胞は、WSTアッセイで測定されたように、酸化的侵襲に対する感受性を示す。前記WSTアッセイは、細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるテトラゾリウム塩のホルマザンへの切断に基づいている。生存細胞数の増大は、当該サンプル中のミトコンドリアデヒドロゲナーゼの全体的な活性の増加をもたらす。酵素活性の増強は、形成されるホルマザン色素の量の増加をもたらす。生存細胞によって産生されたホルマザン色素を、当該色素溶液の吸光度を440 nmで測定することによってマルチウェル分光光度計により定量化した。
SAβGalは、哺乳類細胞中の酸化ストレスに対する古典的バイオマーカーであり、増大する酸化的損傷とともに蓄積する。それは、生物学的老化に対するバイオマーカーとして提案されており、且つ増加する生活年齢にともなってヒト組織中で増大することが観察されている。本発明者は、培養下での増加する継代にともなうPC中のSAβGal発現の増加を観察した(図15)。このSAβGal発現パーセンテージは、長期の連続継代とともに有意に減少した(図15)。さらに、継代16回以降、SAβGalを発現する細胞のパーセンテージは10%より低いままであった(図15)。これは、非老化細胞または優れた抗酸化防御力を有するものに特有の性質である。
当該LDHアッセイは、損傷した細胞から放出される乳酸脱水素酵素(LDH)の活性の測定に基づいて細胞毒性を定量化する方法を提供する。LDHは、乳酸とピルビン酸の相互変換を触媒する酸化還元酵素である。それは安定であり、且つすべての細胞中に存在する細胞質酵素である。細胞原形質膜への損傷は、細胞培養上清中へのLDHの急速な放出をもたらす。当該アッセイは、NADH連結酵素反応におけるテトラゾリウム塩INTのホルマザンへの還元に基づくものであり、それは水溶性であり且つ492 nmで最大の吸収を示す。生成された赤色の強度は、増大したLDH活性の存在下で増加する。図18は、0-300μMの範囲にわたるH2O2の増加する濃度による負荷後の、PC中のLDH活性の平均レベルを示している。
25μM H2O2で処理されたPCの分子解析は、当該WST、LDH、SAβGal、及びリポフスチン試験を支持するデータを提供する。
ネスチン(RT-PCRによって測定されるような)及び多数の他のマーカー(表3及び4)の発現に基づいて、PCを同定及び特徴づけした。しかし、フローサイトメトリーによって評価される場合、ネスチンの発現状態のパスファインダー集団をネスチン陰性の細胞の50%までと混合する。以下のマーカーのプロファイルは、ネスチン及び表1に記載される他のマーカーの存在または非存在という状況で得られるように提供される。
CD90 〜50%+
CD49f 〜90%+
CD24 低い
CD147 〜90%+
CD45 陰性
CD44 低い
CD71 陰性
CD31 陰性
CD117 (a.k.a c-Kit)陰性
ビメンチン 非常に低い
ABCG2 陰性
CK 19 陰性
低い=5%以下の細胞がマーカーを発現している。
非常に低い=2.5%以下がマーカーを発現している。
CD90 〜15%+
CD49f 〜95%+
CD24 〜60%+
CD147 〜90%+
CD45 陰性
CD44 低い
CD71 低い
CD31 陰性
CD117 陰性
ABCG2 低い
CK 19 非常に低い
当該選別されなかった集団から連続希釈によって単離された細胞を、神経前駆体細胞を含む多くの他の細胞種を産生するために使用することができる。このことは、成体膵臓由来の細胞に対して驚くべきことである。これを、神経前駆体細胞の不純物のない細胞集団の産生を示している図20に示す。
パスファインダー細胞は、肝細胞分化培地中で増殖させ得る。確立した肝細胞分化培地(材料及び方法を参照)中で増殖させた場合、CD90+及びCD90−の両方の細胞は形態変化を示し(図21)、且つRT-PCRによって評価されるように、肝胆汁マーカーのサイトケラチン19を発現する。分化培地中で増殖させたCD90−細胞の形態は、典型的に肝臓のものである。
CD90 陰性
CD49f 〜95%+
CD24 〜80%+
CD147 〜80%+
CD45 陰性
CD44 〜60%+
CD71 低い
CD31 陰性
CD90 +
CD49f 〜95%+
CD24 陰性
CD147 〜90%+
CD45 陰性
CD44 〜85%+
CD71 低い
CD31 陰性
C-KIT 陰性
ラット膵臓の処理に用いたものと同じ通常の手順によって(材料及び方法を参照)、多くのヒト組織を処理してPCを単離した。これを、成人ヒト乳房由来の細胞の単離によって例示することができる。
適切な分化培地中で増殖させた場合(材料及び方法を参照)、PCを島に分化させることができる。産生された島は、in vitroにおいてそうするように刺激された場合、グルコースへの暴露によってインシュリンを放出する。図24は、増大するグルコース濃度(3-20 mM)の存在下での、前記島のインシュリン放出プロファイルを示す。当該データは、未分化細胞と比べて、前記島からの統計的により高レベルなインシュリン放出を示す(p< 0.001)。
以下の材料を、細胞培養物の欧州コレクション(Porton Down, Salisbury Wiltshire, UK, SP4 0JG)に寄託した。
材料:成体ラットPC
ECACC番号:Q6203
寄託日:2005年5月12日
<配列ID>
Claims (39)
- 細胞がネスチン陽性であり且つ血清の存在下でマトリゲルフリー培養系において増殖し得る、成体組織に由来する単離細胞集団。
- 前記細胞がPDX-1陰性である、請求項1に記載の単離細胞集団。
- 前記成体組織が膵臓、骨髄、心臓、乳房、肝臓、または腎臓組織である、請求項1または2に記載の単離細胞集団。
- 前記成体組織がヒトのものである、請求項3に記載の単離細胞集団。
- 前記成体組織が膵臓のものである、請求項4に記載の単離細胞集団。
- 2005年5月12日にECACCにおいて登録番号Q6203の下で寄託された細胞を含む、請求項5に記載の単離細胞集団。
- 製薬上許容し得るキャリアとともに、請求項1から6のいずれか一項に記載の単離細胞集団を含む製薬組成物。
- 成体哺乳動物組織を培養する工程及び出現した細胞集団単層を単離する工程を含む、成体哺乳動物組織由来の多能性幹細胞集団の単離方法。
- 前記成体哺乳動物組織が膵臓、乳房、肝臓、及び腎臓からなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記組織がヒトのものである、請求項8または9に記載の方法。
- 前記細胞集団が請求項1から6のいずれか一項に記載の単離細胞集団である、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組織がCMRL-1066培地(Sigma社;C-0422)中で培養される、請求項8から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組織が管全体を含む成体膵管に由来する、請求項8から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記管組織が当該培養工程で役立つように細かく刻まれている、請求項13に記載の方法。
- 請求項8から14のいずれか一項に記載の方法によって産生可能な成体細胞集団。
- 細胞変性または年齢関連性の組織変化に関連する疾患状態の治療方法であって、請求項1から6のいずれか一項に記載の細胞集団または請求項7に記載の製薬組成物を、前記疾患または年齢関連性疾患を有する患者へ投与する工程を含む方法。
- 前記細胞を前記患者へ静脈内投与する、請求項16に記載の方法。
- 前記細胞を当該疾患部位または年齢関連性の変性部位へ移植する、請求項16に記載の方法。
- 前記疾患が膵臓細胞、神経細胞、心臓血管細胞、上皮細胞、肝臓細胞、筋細胞、網膜細胞、毛嚢、または腎臓細胞の変性に関連する、請求項16から18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患が糖尿病(I及びII型)、パーキンソン病、アルツハイマー病、腎臓疾患、眼疾患、肝臓疾患、または心臓血管疾患である、請求項19に記載の方法。
- 前記細胞のドナー及び前記患者が同一種である、請求項16から18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者がヒトである、請求項21に記載の方法。
- 前記細胞のドナーがラットであり、且つ前記患者がヒトである、請求項14から18のいずれか一項に記載の方法。
- PC集団を準備する工程、任意的に表3に示された1つ以上のマーカーを用いたPC細胞亜集団を選択する工程、及び細胞分化をもたらす環境下で細胞の前記亜集団を培養する工程を含む、特定の分化した細胞集団の産生方法。
- 得られたPC細胞、並びにそれに由来する移植のための分化及び未分化の細胞の集団について移植のための適合性を評価する工程をさらに含み、前記工程が前記細胞集団において表4に示された1つ以上のマーカーの存在を検出することを含む、請求項24に記載の方法。
- 医療的または美容的処置の方法における使用のための、請求項1から6のいずれか一項に規定される単離幹細胞集団。
- 細胞変性に関連する疾患状態を治療するための医薬の調製における、請求項1から6のいずれか一項に規定される単離幹細胞集団の使用。
- 前記疾患が糖尿病、肝臓疾患、腎臓疾患、眼疾患、心臓血管疾患、またはパーキンソン病である、請求項27に記載の使用。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の細胞集団または請求項7に記載の製薬組成物を、美容的な組織増強を必要とする患者へ投与する工程を含む美容的な組織増強方法。
- 前記美容的な組織増強が細胞変性または年齢関連性の組織変化に関連する状態を治療することである、請求項29に記載の方法。
- 前記組織増強が四肢または臓器の再生または交換である、請求項29または30に記載の方法。
- 前記細胞を前記患者へ静脈内投与する、請求項30または31に記載の方法。
- 前記細胞を年齢関連性の変性細胞の部位または侵襲部位へ移植する、請求項30または31に記載の方法。
- 前記細胞のドナー及び前記患者が同一種である、請求項29から33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者がヒトである、請求項34に記載の方法。
- 前記細胞のドナーがラットであり、且つ前記患者がヒトである、請求項29から33のいずれか一項に記載の方法。
- 美容的な組織増強のための治療の準備における、請求項1から6のいずれか一項に記載の単離細胞集団の使用。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の細胞集団の分泌された細胞因子の獲得方法であって、適切な培地中で前記細胞集団を培養する工程及び前記培地から前記因子を単離する工程を含む方法。
- 細胞変性に関連する疾患状態を治療するための医薬の調製における、請求項1から6のいずれか一項に記載の細胞集団から得られる細胞因子の使用。
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