CN109477119A

CN109477119A - 表达肝细胞生长因子的间充质干细胞及其用途

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Publication number: CN109477119A
Application number: CN201780022194.7A
Authority: CN
Inventors: 成永哲; 李纯旼; 金慧娟
Original assignee: Slbigen Inc
Current assignee: Slbigen Inc
Priority date: 2016-02-04
Filing date: 2017-02-06
Publication date: 2019-03-15
Also published as: US20190038717A1; US20220401518A1; KR20170093084A; KR101966057B1; WO2017135795A1

Abstract

本发明涉及：重组慢病毒载体，其包含编码肝细胞生长因子(HGF)蛋白的基因；以及用使用该载体产生的慢病毒转染的细胞。本发明的重组慢病毒包含编码HGF蛋白的基因，用该慢病毒转染的宿主细胞保持高细胞增殖率。因此，通过用该慢病毒转染而表达HGF的间充质干细胞可以有用地用作细胞治疗剂。

Description

表达肝细胞生长因子的间充质干细胞及其用途

技术领域

本发明涉及包含编码肝细胞生长因子(HGF)蛋白的基因的重组慢病毒载体，和以使用该载体产生的慢病毒转染的细胞。

背景技术

全球范围内正在开发利用细胞的治疗，特别是干细胞治疗市场呈稳步上升趋势，并且年平均增长率为11.7％。

作为成体干细胞的间充质干细胞(MSCs)是可分化成骨、软骨、肌肉、脂肪和成纤维细胞的多能细胞。另外，MSCs可以相对容易地从各种成体组织例如骨髓、脐带血和脂肪来获得。MSCs的特征在于其迁移到炎症或损伤部位的能力，这也是作为用于递送治疗药物的递送载体的巨大优势。此外，可以通过抑制免疫细胞如T细胞、B细胞、树突细胞和自然杀伤细胞的功能来调节人体的免疫功能。另外，MSCs具有可以相对容易地在体外培养的优势，因此，正在积极地对使用MSCs作为细胞治疗剂进行研究。

然而，尽管MSCs具有这些优势，但在生产可在临床上用作细胞治疗剂的MSCs中存在以下问题。首先，由于MSCs的增殖存在限制，因此难以大量生产MSCs。其次，由于所获得的MSCs是异源的，因此难以在每次生产中保持相同的效果。第三，单独使用MSCs是无效的。另一方面，韩国专利第1585032号公开了一种含有在水凝胶中培养的间充质干细胞的细胞治疗剂。上述文献提供了一种组合物，该组合物可以通过在分离间充质干细胞以用作细胞治疗剂的步骤中缩短预处理过程而直接给药。然而，完全没有提到上述的间充质干细胞的问题和解决所述问题的方法。因此，有必要研究可用作细胞治疗剂的间充质干细胞。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供包含编码HGF蛋白的基因的重组慢病毒和用上述重组慢病毒转染的宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供包含上述重组慢病毒或宿主细胞的药物组合物。

问题的解决方案

根据本发明的一个目的，提供一种重组慢病毒载体，其包含编码HGF蛋白的基因。

此外，根据本发明的另一个目的，提供一种重组慢病毒，其包含编码HGF蛋白的基因。

此外，根据本发明的另一个目的，提供用上述重组慢病毒转染的宿主细胞。

此外，根据本发明的另一个目的，提供用于预防或治疗血管疾病的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的上述重组慢病毒。

此外，根据本发明的另一个目的，提供用于预防或治疗血管疾病的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的上述宿主细胞。

发明的有益效果

用本发明的包含编码HGF蛋白的基因的重组慢病毒转染的宿主细胞表达HGF并保持高细胞增殖率。另外，可以抑制异常分化，并且可以阻止肿瘤形成的可能性，表明高安全性。因此，表达HGF的宿主细胞可用作细胞治疗剂。

附图说明

图1是比较永生化MSCs和非永生化MSCs的细胞增殖率的图：

imMSC：永生化MSC；

MSC：非永生化MSC；

X轴：潜伏期；和

Y轴：累积群体倍增水平(PDL)。

图2是插入pBD-4慢病毒载体中的基因构建体的结构的示意图：

TRE：包含四环素反应元件的启动子；

HGF：肝细胞生长因子；

RSVp：RSV启动子；和

Hygro^R：对潮霉素具有抗性的基因。

图3是示出用含有HGF基因的慢病毒转染的永生化MSCs的细胞增殖率的图。

X轴：潜伏期；和

Y轴：累积PDL。

图4示出HGF在BM-34A(保藏的菌株)中的表达。泳道1显示标记，泳道2和3显示BM-34A，泳道4显示阴性对照，泳道5显示阳性对照。

图5是示出处于三个不同代次的BM-34A细胞系中HGF蛋白的表达比的图。

图6是示出通过传代培养获得的BM-34A细胞的测量的PDL的图。

图7示出BM-34A细胞系的导入基因的细胞的核型分析结果。

具体实施方式

下文将详细描述本发明。

本发明提供重组慢病毒载体，其包含编码HGF蛋白的基因。

如本文所用，术语“肝细胞生长因子(下文中，称为HGF)”蛋白是被称为分散因子或肝细胞生成素A的肝素结合糖蛋白。肝细胞生长因子蛋白由各种间充质细胞产生并促进细胞增殖。此外，已知HGF调节内皮细胞的生长和血管平滑肌细胞的迁移并诱导血管生成。

根据本发明的HGF蛋白可以是人源蛋白。HGF蛋白是由69kDa的α链和34kDa的β链组成的异二聚体蛋白，并且可以在α链中包含四个kringle结构。本发明的HGF蛋白可以是具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。HGF蛋白可以与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有约70％、80％、90％、95％或更高的同源性。同时，编码HGF蛋白的基因可以是具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的多核苷酸。此外，编码HGF蛋白的核苷酸序列可以与SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有约70％、80％、90％、95％或更高的同源性。

如本文所用的术语“慢病毒载体”是一种逆转录病毒，是单链RNA形式的载体，并且也可以互换地称为慢病毒转移载体。慢病毒载体可以插入感染的靶细胞的基因组DNA中，以稳定表达基因，并可将该基因转移至有丝分裂和非有丝分裂细胞。由于载体不诱导人体的免疫应答，因此其表达继续。另外，与作为常规病毒载体的腺病毒载体相比，具有可以递送大尺寸的基因的优势。

慢病毒载体可以进一步包含编码胸苷激酶(TK)蛋白的基因。TK蛋白质是通过使ATP的γ-位的磷酸结合至胸苷来催化胸苷酸生成反应的酶，由此胸苷转化为三磷酸盐形式。经修饰的胸苷不能用于DNA复制，并且已知经修饰的胸苷诱导含有该经修饰的胸苷的细胞死亡。用于本文的TK蛋白可以是任何已知序列之一。根据一种实施方式，TK蛋白可以是具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽。同时，编码TK蛋白的基因可以是具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的多核苷酸。

本发明的重组慢病毒载体可以通过启动子来调节装载到该载体上的基因的表达。启动子可以是巨细胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人延伸因子-1α(EF-1α)或四环素反应元件(TRE)启动子。根据一种实施方式，重组慢病毒载体可以通过一个启动子来调节HGF蛋白的表达。该启动子与编码待表达蛋白质的基因可操作地连接。

根据一种实施方式，HGF蛋白可以与TRE启动子连接。TRE启动子可以通过四环素反式激活因子(tTA)蛋白来激活与该启动子连接的基因的转录。具体地，当不存在四环素或多西环素时，tTA蛋白结合至TRE启动子并激活转录，而当存在四环素或多西环素时，tTA蛋白不能结合至TRE启动子并激活转录。因此，可以通过添加或消耗四环素或多西环素来调节HGF蛋白的表达。

术语“可操作地连接”是指特定多核苷酸与另一多核苷酸连接，使得该特定多核苷酸可以执行其功能。编码特定蛋白质的基因与启动子可操作地连接的措辞意味着该基因连接成使得该基因可以通过该启动子的作用转录成mRNA并翻译成蛋白质。

本发明提供一种重组慢病毒，其包含编码HGF蛋白的基因。

该重组慢病毒可以通过以下步骤获得：用本发明的慢病毒载体、包装质粒和包膜质粒转化宿主细胞；从转化的宿主细胞中分离出慢病毒。

术语“包装质粒”和“包膜质粒”可以提供辅助构建体(例如，质粒或分离的核酸)，用于由本发明的慢病毒载体产生慢病毒，以进行有效转染。这种构建体含有用于在宿主细胞中制备并包装慢病毒载体的有用元件。上述元件包括：结构蛋白，例如gag前体；加工蛋白，例如pol前体；蛋白酶；外壳蛋白；和在宿主细胞中制备蛋白质和产生慢病毒颗粒所必需的表达和调节信号等。

对于重组慢病毒的生产，可以使用由Clontech Laboratories Inc.提供的Lenti-X慢病毒表达系统(Lenti-X Lentiviral Expression System)、由Addgene提供的包装质粒(例如pRSV-Rev、psPAX、pCI-VSVG、pNHP等)或包膜质粒(例如pMD2.G、pLTR-G、pHEF-VSVG等)。此外，本发明提供用上述重组慢病毒转染的宿主细胞。

术语“转染”是指通过病毒感染递送装载在重组慢病毒载体中的基因。

根据本发明的宿主细胞可以是人胚胎干细胞(hES)、骨髓干细胞(BMSC)、间充质干细胞(MSC)、人神经干细胞(hNSC)、角膜缘干细胞、或口腔粘膜上皮细胞。根据本发明的一种实施方式，该宿主细胞可以是间充质干细胞。

术语“间充质干细胞(MSC)”是指能够分化成包括骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的各种细胞的多能基质细胞。间充质干细胞可以分化成特定器官的细胞，例如骨、软骨、脂肪、肌腱、神经组织、成纤维细胞和肌细胞。这些细胞可以从脂肪组织、骨髓、外周血、脐带血、骨膜、真皮、中胚层衍生的组织等中分离或纯化。

所述宿主细胞可通过以下方法制备：

1)用包含hTERT和c-myc基因的慢病毒对宿主细胞进行初次感染；

2)用包含tTA基因的慢病毒对初次感染的宿主细胞进行二次感染；和

3)用包含HGF基因的慢病毒对二次感染的宿主细胞进行三次感染。

在步骤1)中，hTERT和c-myc是使宿主细胞永生化的基因。也可以使用除hTERT和c-myc之外的称为永生化基因的基因。根据一种实施方式，hTERT和c-myc蛋白可以分别是具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。同时，编码hTERT和c-myc蛋白的基因可以分别是具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:6的核苷酸序列的多核苷酸。

在步骤2)中，tTA是能够调节靶蛋白表达的基因，所述靶蛋白意指四环素反式激活因子。如本文所用的Tet-off系统可以根据如上所述的存在或不存在四环素或多西环素来调节靶蛋白的表达。

根据与上述步骤3)对应的一种实施方式，通过用包含HGF基因的慢病毒三次感染永生化MSC来制备和获得表达HGF基因的细胞。将制备的细胞命名为BM-34A，并于2017年1月6日保藏在韩国生命科学与生物技术研究院(Korea Research Institute of Bioscience&Biotechnology，KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for TypeCultures)，保藏号为KCTC 13183BP。

本发明提供用于预防或治疗血管疾病的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的上述重组慢病毒或宿主细胞。

如本文所用的术语“血管疾病”是指可能由血管老化或丧失弹性而引起的疾病。本发明的重组慢病毒或宿主细胞可通过HGF的表达来显示出血管生成作用，因此可用于治疗各种血管疾病。

血管疾病是冠状动脉、脑血管、外周动脉疾病等疾病，该血管疾病可以选自心绞痛、心肌梗塞、动脉硬化、动脉粥样硬化、结节性动脉周围炎、高安氏动脉炎、血管闭塞、中风、脑出血、脑梗塞、脑水肿和缺血性疾病。

所述药物组合物是一种细胞治疗剂，并且可以进一步包含配制所述药物组合物所必需的药学上可接受的运载体、添加剂或赋形剂。所述运载体可以是通常用于制备药物的运载体，其可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。

此外，本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的添加剂，所述药学上可接受的添加剂选自润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂及其组合。

基于本发明的药物组合物的总重量，可以包括量为约1wt％至约99.99wt％，优选约90wt％至约99.99wt％的运载体，并且可以包括量为约0.1wt％至约20wt％的药学上可接受的添加剂。所述药物组合物可以通过根据常规方法用药学上可接受的运载体和赋形剂配制而制备成单位剂量，或者可以通过填充到多剂量容器中来制备。本文中，所述制剂可以是溶液、悬浮液、糖浆或在油或水性介质中的乳液的形式，或者是提取物、粉剂、粉状药物、颗粒剂、片剂或胶囊的形式，并且可以另外含有分散剂或稳定剂。

本发明还提供了如上所述的用于预防或治疗血管疾病的方法，包括将本发明的药物组合物给药至对象的步骤。

所述对象可以是哺乳动物，特别是人。该药物组合物的给药途径和剂量可以根据患者的状况和副作用的存在以各种方式和量来调节以给药至对象，并且最佳给药方法和剂量可以由本领域技术人员在合适的范围内选择。此外，所述药物组合物可以与已知对要治疗的疾病具有治疗效果的其他药物或生理活性物质联合给药，或者可以与其他药物配制成组合制剂的形式。当该药物组合物经胃肠外给药时，给药的实例包括皮下、眼、腹膜内、肌内、口服、直肠、眶内、脑内、颅内、脊柱内、脑室内、鞘内、鼻内、静脉内、心脏内给药。

上述给药可以给药一次或多次，一至三次，特别是以两次分开的剂量给药。在重复给药的情况下，可以以12至48小时，24至36小时的间隔给药，更特别地，以24小时的间隔给药。在慢病毒的情况下，，可以以1.0×10⁶至1.0×10¹²TU，特别是以1.0×10⁸至1.0×10¹⁰TU的量对成人进行给药。另一方面，在细胞的情况下，可以以1.0×10⁵至1.0×10¹¹个细胞，特别地，以1.0×10⁷至1.0×10⁹个细胞的量对成人进行给药。当剂量高时，可以每天给药数次。

本发明的方式

下文参考实施例更详细地描述本发明。对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于说明目的，并且本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例1.永生化间充质干细胞(MSCs)的制备

1-1.含有永生化基因的慢病毒载体的制备

为了使MSC永生化，制备分别含有永生化基因c-Myc和hTERT的慢病毒载体。在此，将表达tTA蛋白的基因构建体一起插入以使用Tet-off系统。

首先，通过用CMV启动子代替pWPT载体(Addgene，USA)表达盒中的EF启动子并将RSV启动子添加到其下游，制备pBD慢病毒载体。

c-Myc基因(SEQ ID NO:6)和胸苷激酶(TK)基因(SEQ ID NO:4)通过IRES连接，然后插入pBD慢病毒载体中，从而可以通过CMV启动子来调节表达。该构建的载体命名为pBD-1。

另一方面，将hTERT基因(SEQ ID NO:8)插入pBD慢病毒载体中，从而可以通过CMV启动子来调节表达。向其中插入对zeomycin具有抗性的基因(ZeoR；SEQ ID NO:14)，从而可以通过RSV启动子来调节表达。该构建的载体命名为pBD-2。

另外，将tTA(四环素反式激活因子)基因(SEQ ID NO:10)插入pBD慢病毒载体中，从而可以通过CMV启动子来调节表达。向其中插入对嘌呤霉素具有抗性的基因(PuroR；SEQID NO:12)，从而可以通过RSV启动子来调节表达。该构建的载体命名为pBD-3。

1-2.含有永生化基因的慢病毒的产生

使用实施例1-1中构建的慢病毒载体，通过以下方法产生含有永生化基因的慢病毒。

首先，使用补充有10％胎牛血清的DMEM，在150mm培养皿中培养Lenti-X细胞(Clontech Laboratories，USA)。同时，使用EndoFree Plasmin Maxi试剂盒(Qiagen，USA)从DH5α大肠杆菌细胞中提取并定量慢病毒载体。

用PBS洗涤培养的Lenti-X细胞，然后向其中添加3ml TrypLE^TMSelect CTS^TM(Gibco，USA)。将细胞在37℃下放置约5分钟，然后验证其脱落。通过向其中添加7ml补充有10％胎牛血清的DMEM来中和脱离的细胞。将中和的细胞收集在50ml管中，并以1,500rpm离心5分钟。移除所得上清液，通过向其中添加10ml补充有10％胎牛血清的DMEM来重悬细胞。用血细胞计数器对悬浮细胞计数，然后以1.2×10⁷个细胞的量分配到150mm的培养皿中。当将分配的细胞培养至细胞饱和度为约90％时，用12μg的慢病毒载体、12μg的psPAX(Addgene；表达gag-pol，包装质粒)和2.4μg的pMD.G质粒(Addgene；表达VSVG，包膜质粒)的混合物转化细胞。为了促进转化，使用脂质体(Invitrogen，USA)和PLUS试剂(Invitrogen，USA)。转化6小时后，用补充有10％胎牛血清的DMEM更换培养基。在另外培养48小时后，收集上清液。

将获得的上清液与慢病毒浓缩试剂盒(Lenti-X浓缩器，Clontech Laboratories，USA)混合，然后在4℃下培养过夜。在4℃和4,000rpm的条件下离心2小时以获得病毒，然后将病毒重悬于0.5ml不含FBS的DMEM中。结果，分别制备由pBD-1、pBD-2和pBD-3慢病毒载体产生的浓度为4.0×10⁸TU/ml、2.0×10⁸TU/ml和1.2×10⁹TU/ml的慢病毒。

1-3.永生化间充质干细胞的制备

使用含有实施例1-2中产生的永生化基因的慢病毒制备永生化MSCs。

首先，通过以下方法来制备骨髓衍生的MSCs。具体地，从健康供体的髂嵴获得骨髓抽出物。将抽出物与20IU/ml肝素在无菌容器中混合以抑制凝结。将骨髓混合物溶液在4℃，739g的条件下离心7分钟，然后移除上清液，将所得物与10倍量(按体积计)的无菌水混合。将得到的混合物在相同条件下再次离心，得到细胞团块。将获得的团块悬浮于补充有20％FBS和5ng/ml的b-FGF(100-18B，Peprotech，USA)的DMEM-低葡萄糖(11885-084，Gibco，USA)中，然后将其分配到培养瓶内。在37℃，5％CO₂的条件下将细胞培养24至48小时，然后更换新培养基。将细胞传代培养，同时以3至4天的间隔用新培养基更换培养基。培养2周后，使用荧光细胞分析仪证实MSCs。

使用Retronectin(Clontech Laboratories，USA)用实施例1-2中产生的pBD-1慢病毒以100MOI感染上述制备的MSCs。通过相同的方法用pBD-2慢病毒载体以100MOI感染已感染的细胞。感染后，通过向稳定化细胞的培养基中添加500μg/ml的zeomycin来选择用pBD-2慢病毒感染的细胞。

用pBD-3慢病毒载体以100MOI感染选择的细胞。感染后，通过向稳定化细胞的培养基中添加1μg/ml嘌呤霉素来选择用pBD-3慢病毒感染的细胞。

结果，含有永生化基因的MSCs和不含永生化基因的MSCs的细胞增殖率如图1所示。如图1所示，用含有永生化基因c-myc和hTERT的慢病毒感染的MSCs即使在培养120天后仍保持高细胞增殖率。另一方面，非永生化MSCs(MSC)的细胞增殖率在培养40天后迅速下降。

实施例2.含有HGF基因的慢病毒的构建

2-1.含有HGF基因的慢病毒载体的构建

将HGF基因(SEQ ID NO:2)插入如上产生的pBD慢病毒载体中。在此，将插入的HGF基因设计为由TRE启动子调节。TRE启动子可以根据有无添加多西环素来调节与TRE启动子连接的基因的表达。

在此，插入具有潮霉素抗性的基因(HygroR；SEQ ID NO:16)，从而可以通过RSV启动子来调节该基因的表达。构建的载体命名为pBD-4，基因构建体的结构如图2所示。

2-2.含有HGF基因的慢病毒的产生

使用实施例2-1中构建的含有HGF基因的慢病毒载体，通过与实施例1-2中所述相同的方法来制备慢病毒。将产生的慢病毒制备为3.5×10⁸TU/ml的浓度。

实施例3.用含有HGF基因的慢病毒感染的MSC的制备

3-1.用含有HGF基因的慢病毒转染的MSC的制备

通过用实施例2-2中构建的含有HGF基因的慢病毒感染实施例1-3中制备的永生化MSC来制备表达HGF基因的细胞。通过与实施例1-3中所述相同的方法进行感染。感染后，通过向稳定化细胞的培养基中添加25μg/ml的潮霉素来选择感染了pBD-4慢病毒的细胞。在补充有2μg/ml的多西环素(631311，Clontech，USA)的培养基中培养选择的细胞，从而在培养期间抑制HGF蛋白的表达。

培养选择的细胞以形成克隆。培养从形成的克隆中获得的单克隆细胞以建立细胞系，将该细胞系命名为BM-34A。将细胞系BM-34A于2017年1月6日保藏于韩国生命科学与生物技术研究院(KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心，保藏号为KCTC 13183BP。结果，建立的细胞系的增殖率如图3所示。表明BM-34A细胞系稳定增殖。

3-2.检测BM-34A细胞系的导入基因的测试

将建立的细胞系BM-34A的样品在37℃的恒温水浴中解冻约1分钟，转移至含有9ml的PBS的15ml管中，并以1,500rpm进行细胞沉降处理5分钟。在完全移除PBS后，将团块悬浮在200μl的PBS中，并转移到1.5ml管中。用Tissue(MN，740952.250)制备gDNA，如表1所示制备混合物，然后通过如下表2所示的步骤进行PCR。在此，加入100ng的BM-34A质粒DNA作为阳性对照，并用1μl的dW作为阴性对照。

[表1]

正向引物(SEQ ID NO:17)(10pmol/μl，BM163)	1μl
		反向引物(SEQ ID NO:18)(10pmol/μl，BM151)	1μl
样品(100ng/μl)	1μl
		dW	17μl
总体积	20μl

[表2]

将1％琼脂糖凝胶置于电泳试剂盒中。将10μl的DNA大小标记物载入第一个孔中，并将每个10μl的BM-34A样品(x2)、阴性对照和阳性对照分别以上述顺序载入后面的孔中。此后，在100V下电泳20分钟，并拍摄凝胶照片。结果如图4所示。

如图4所示，两个BM-34A细胞系样品均显示与阳性对照相同大小(1.0kb)的PCR产物。3-3.建立的细胞系中HGF蛋白表达的鉴定

通过ELISA分析检测实施例3-1中建立的BM-34A细胞系中的HGF蛋白表达。

具体地，将细胞在不含多西环素的培养基中培养两天。将BM-34A细胞系以1×10⁵个细胞、总体积1ml接种在12孔板上。48小时后，获得约1ml细胞培养基，并使用人HGFDuoSet ELISA试剂盒(R&D systems，DY294，USA)对该细胞培养基进行分析。根据每个试剂盒中包含的手册进行实验。为了检测每个代次的表达率是否没有变化，分析了三个不同代次的细胞。分析结果如图5所示，在24小时期间，在移除多西环素的培养基中约1×10⁵个细胞中诱导的HGF蛋白表达水平如下表3所示。

[表3]

靶蛋白	表达水平
		HGF	47.72ng/ml

如图5所示，发现在移除多西环素的培养基中所培养的BM-34A细胞系中表达HGF。如表3所示，在本发明的BM-34A细胞系中表达约47.72ng/ml的HGF蛋白。

3-4.细胞群体倍增水平(PDL)分析

使用含有2μg/ml多西环素的培养基将BM-34A细胞系以4×10⁵个细胞接种于T75瓶中。通过进行约3或4天传代培养来获得细胞，并对细胞总数进行计数。接种相同数量的细胞，每3至4天测量PDL。使用以下等式1计算PDL，结果示于图6中。在等式1中，X代表初始PDL，I代表接种在血管中的细胞的初始数量，Y代表最终细胞产量或生长期结束时的细胞数量。

[等式1]

PDL＝X+3.222(log Y-log I

如图6所示，即使在长期传代培养中也观察到稳定的生长。

3-5.细胞核型分析

为了检测在BM-34A细胞系中导入了基因的细胞的染色体异常，委托EONE生命科学研究所(韩国)进行分析，并且该分析按照方案进行。分析结果如图7所示。

如图7所示，在基因导入BM-34A细胞系的细胞的染色体中未观察到异常，因此确定为正常核型。

<110> 斯比根公司

<120> 表达肝细胞生长因子的间充质干细胞及其用途

<130> PCB701007SLB

<150> KR 2016-0014454

<151> 2016-02-04

<160> 18

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 728

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HGF的氨基酸序列

<400> 1

Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu

1 5 10 15

Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln

20 25 30

Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr

35 40 45

Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val

50 55 60

Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu

65 70 75 80

Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys

85 90 95

Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe

100 105 110

Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys

115 120 125

Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys

130 135 140

Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His

145 150 155 160

Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr

165 170 175

Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser

180 185 190

Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu

195 200 205

Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp

210 215 220

His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro

225 230 235 240

His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp

245 250 255

Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr

260 265 270

Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys

275 280 285

Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu

290 295 300

Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile

305 310 315 320

Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu

325 330 335

His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn

340 345 350

Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr

355 360 365

Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp

370 375 380

Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met

385 390 395 400

Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp

405 410 415

Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala

420 425 430

Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His

435 440 445

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys

450 455 460

Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu

465 470 475 480

Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val

485 490 495

Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg

500 505 510

Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp

515 520 525

Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr

530 535 540

Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys

545 550 555 560

Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly

565 570 575

Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp

580 585 590

Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu

595 600 605

Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn

610 615 620

Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu

625 630 635 640

Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu

645 650 655

Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp

660 665 670

Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu

675 680 685

Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly

690 695 700

Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile

705 710 715 720

Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser

725

<210> 2

<211> 2187

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HGF的核苷酸序列

<400> 2

atgtgggtga ccaagctgct gcccgccctg ctgctgcagc acgtgctgct gcacctgctc 60

ctgctgccca tcgccatccc ctacgccgag ggccagagaa agagaagaaa caccatccac 120

gagttcaaga agagcgccaa gaccacactg atcaagatcg accccgccct gaagatcaag 180

accaagaagg tgaacaccgc cgaccagtgc gccaacagat gcaccagaaa caagggcctg 240

cccttcacct gcaaggcctt cgtgttcgac aaggccagaa agcagtgcct gtggttcccc 300

ttcaacagca tgagcagcgg cgtgaagaag gagttcggcc acgagttcga cctgtacgag 360

aacaaggact acatcagaaa ctgcatcatc ggcaagggca gaagctacaa gggcaccgtg 420

agcatcacca agagcggcat caagtgccag ccctggagca gcatgatccc ccacgagcac 480

agcttcctgc ccagcagcta cagaggcaag gacctgcagg agaactactg tagaaaccct 540

agaggcgagg agggcggacc ctggtgcttc accagcaacc ccgaggtgag atacgaggtg 600

tgcgacatcc cccagtgcag cgaggtggag tgcatgacct gcaacggcga gagctacaga 660

ggcctgatgg accacaccga gagcggcaag atctgccaga gatgggacca ccagaccccc 720

cacagacaca agttcctgcc cgagagatac cccgacaagg gcttcgacga caattactgc 780

aggaaccctg atggccagcc cagaccctgg tgctacaccc tggaccccca caccagatgg 840

gagtactgcg ccatcaagac ctgcgccgac aacaccatga acgacaccga cgtgcccctg 900

gagacaaccg agtgcatcca gggccagggc gagggctaca gaggcaccgt gaacaccatc 960

tggaacggca tcccctgcca gaggtgggat agccagtacc cccacgagca cgacatgacc 1020

cccgagaact tcaagtgcaa ggacctgaga gagaattact gtaggaatcc cgacggcagc 1080

gagagcccct ggtgcttcac aaccgacccc aacatcagag tgggctactg cagccagatc 1140

cccaactgcg acatgagcca cggccaggac tgctacagag gcaacggcaa gaactacatg 1200

ggcaacctga gccagaccag aagcggcctg acctgcagca tgtgggacaa gaacatggag 1260

gacctgcaca gacacatctt ctgggagccc gacgccagca agctgaacga gaactactgc 1320

agaaatcccg acgacgacgc ccacggccct tggtgctaca ccggcaaccc cctgatcccc 1380

tgggactact gccccatcag cagatgcgag ggcgacacca cacccaccat cgtgaacctg 1440

gaccaccccg tgatctcctg cgccaagacc aagcagctga gagtggtgaa cggcatcccc 1500

accagaacca acatcggctg gatggtgagc ctgagataca gaaacaagca catctgcggc 1560

ggcagcctga tcaaggagag ctgggtgctg accgccagac agtgcttccc cagcagagac 1620

ctgaaggact acgaggcctg gctgggcatc cacgacgtgc acggcagagg cgacgagaag 1680

tgcaagcagg tgctgaacgt gagccagctg gtgtacggcc ccgagggcag cgacctggtg 1740

ctgatgaagc tggccagacc cgccgtgctg gacgacttcg tgagcaccat cgacctgccc 1800

aactacggct gcaccatccc cgagaagacc agctgcagcg tgtacggctg gggctacacc 1860

ggcctgatca actacgacgg cctgctgaga gtggcccacc tgtacatcat gggcaacgag 1920

aagtgcagcc agcaccacag aggcaaggtg accctgaacg agagcgagat ctgcgccggc 1980

gccgagaaga tcggcagcgg cccctgcgag ggcgactacg gcggccctct ggtgtgcgag 2040

cagcacaaga tgagaatggt gctgggcgtg atcgtgcccg gcagaggctg cgccatcccc 2100

aacagacccg gcatcttcgt gagagtggcc tactacgcca agtggattca caagatcatc 2160

ctgacctaca aggtgcccca gagctaa 2187

<210> 3

<211> 376

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TK的氨基酸序列

<400> 3

Met Ala Ser Tyr Pro Cys His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala

1 5 10 15

Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg

20 25 30

Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Leu Glu Gln Lys Met Pro Thr

35 40 45

Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr

50 55 60

Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr

65 70 75 80

Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Gln Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr

85 90 95

Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile

100 105 110

Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met

115 120 125

Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Val Gly

130 135 140

Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile

145 150 155 160

Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg

165 170 175

Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala

180 185 190

Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu

195 200 205

Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly

210 215 220

Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly

225 230 235 240

Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Trp

245 250 255

Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala

260 265 270

Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu

275 280 285

Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu

290 295 300

Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg

305 310 315 320

Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys

325 330 335

Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln Thr His Val

340 345 350

Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe

355 360 365

Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn

370 375

<210> 4

<211> 1131

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TK的核苷酸序列

<400> 4

atggccagct acccctgtca ccagcacgcc agcgccttcg accaggccgc tagaagcaga 60

ggccacagca acagaagaac cgccctgaga cccagaagac agcaggaggc cacagaggtg 120

agactggagc agaagatgcc caccctgctg agagtgtaca tcgatggacc ccacggcatg 180

ggcaagacca caacaaccca gctgctggtg gccctgggca gcagagacga catcgtgtac 240

gtgcccgagc ccatgaccta ctggcaggtg ctgggagcca gcgagaccat cgccaacatc 300

tacaccacac agcacagact ggaccagggc gagatcagcg ccggcgacgc tgccgtggtg 360

atgaccagcg cccagatcac aatgggcatg ccctacgccg tgaccgatgc cgtgctggct 420

ccccacgtgg gcggagaggc cggcagcagc cacgcccctc cccctgccct gaccctgatc 480

ttcgacagac accccatcgc cgccctgctg tgctaccccg ccgctagata cctgatgggc 540

agcatgacac cccaggccgt gctggccttc gtggccctga tcccccctac cctgcccggc 600

accaacatcg tgctgggcgc cctgcccgag gacagacaca tcgacagact ggctaagaga 660

cagagacccg gcgagagact ggacctggcc atgctggccg ccatcagaag agtgtacggc 720

ctgctggcca acaccgtgag atacctgcag ggaggcggca gctggtggga ggactggggc 780

cagctgagcg gcaccgccgt gcctccccag ggcgccgagc cccagagcaa cgccggccct 840

agaccccaca tcggcgacac cctgttcacc ctgtttagag cccccgagct gctggccccc 900

aacggcgacc tgtacaacgt gttcgcctgg gccctggacg tgctggccaa gagactgaga 960

cccatgcacg tgttcatcct ggactacgac cagagccccg ccggctgcag agatgccctg 1020

ctgcagctga ccagcggcat ggtgcagacc cacgtgacca cacccggcag catccccacc 1080

atctgcgacc tggccagaac ctttgccaga gagatgggcg aggccaactg a 1131

<210> 5

<211> 454

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> c-Myc的氨基酸序列

<400> 5

Met Asp Phe Phe Arg Val Val Glu Asn Gln Gln Pro Pro Ala Thr Met

1 5 10 15

Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp

20 25 30

Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln

35 40 45

Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp Ile

50 55 60

Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser Arg

65 70 75 80

Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe Ser

85 90 95

Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala Asp

100 105 110

Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln

115 120 125

Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile

130 135 140

Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu Val

145 150 155 160

Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly Ser

165 170 175

Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr

180 185 190

Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val

195 200 205

Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala

210 215 220

Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser

225 230 235 240

Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His

245 250 255

Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu

260 265 270

Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro

275 280 285

Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys

290 295 300

Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His

305 310 315 320

Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro Ala

325 330 335

Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile Ser

340 345 350

Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn

355 360 365

Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu

370 375 380

Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu

385 390 395 400

Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala

405 410 415

Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu

420 425 430

Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln

435 440 445

Leu Arg Asn Ser Cys Ala

450

<210> 6

<211> 1365

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> c-Myc的核苷酸序列

<400> 6

atggatttct ttcgcgtcgt cgagaaccag cagccacccg ccactatgcc tctgaacgtg 60

tcttttacta acaggaacta tgatctggat tacgacagcg tgcagcccta cttctattgc 120

gatgaggaag agaactttta tcagcagcag cagcagagcg agctgcagcc acctgcacct 180

tccgaagaca tttggaagaa attcgagctg ctgcctacac cacccctgtc tccaagtcgg 240

agaagcggcc tgtgttcacc cagctacgtg gccgtcactc ctttcagcct gaggggggac 300

aatgatggcg ggggaggctc cttttctaca gccgatcagc tggaaatggt gactgagctg 360

ctggggggag acatggtcaa ccagagcttc atttgcgatc ctgacgatga aacttttatc 420

aagaacatca tcatccagga ctgtatgtgg tcaggcttta gcgccgctgc aaagctggtg 480

tctgagaaac tggcaagtta tcaggccgct cggaaagata gtgggtcacc taacccagct 540

agaggacact ccgtgtgctc tacaagctcc ctgtacctgc aggacctgag cgcagccgct 600

tccgagtgta ttgatccctc cgtggtcttc ccctatcctc tgaatgactc tagttcaccc 660

aagagttgcg catcacagga cagctccgcc ttttcacctt ctagtgatag cctgctgtca 720

agcactgaat cctctccaca gggcagccca gagccactgg tgctgcatga agagacccct 780

ccaaccacaa gttcagattc cgaagaggaa caggaggacg aggaagagat cgatgtggtc 840

tctgtggaaa agcgccaggc tccaggaaaa cgaagcgagt ccggctctcc aagtgcagga 900

ggacactcca agccacctca ttctcccctg gtgctgaaaa ggtgccacgt ctccacccac 960

cagcataact acgcagcccc accctctaca cgaaaggact atccagctgc aaagcgcgtg 1020

aaactggata gcgtgagagt cctgaggcag atcagtaaca atcggaagtg tacttcaccc 1080

agaagctccg acaccgaaga gaacgtgaaa aggcgcaccc ataatgtcct ggaacgccag 1140

cgacggaatg agctgaagag gtccttcttt gccctgcgcg atcagattcc tgaactggag 1200

aacaatgaga aggctccaaa agtggtcatt ctgaagaaag ccacagctta catcctgtct 1260

gtgcaggccg aagagcagaa actgatcagt gaagaggacc tgctgagaaa acgcagggaa 1320

cagctgaaac ataaactgga acagctgaga aactcttgtg cttaa 1365

<210> 7

<211> 1132

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hTERT的氨基酸序列

<400> 7

Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser

1 5 10 15

His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly

20 25 30

Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg

35 40 45

Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro

50 55 60

Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu

65 70 75 80

Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val

85 90 95

Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro

100 105 110

Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr

115 120 125

Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val

130 135 140

Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val

145 150 155 160

Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr

165 170 175

Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly

180 185 190

Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg

195 200 205

Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg

210 215 220

Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg

225 230 235 240

Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp

245 250 255

Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val

260 265 270

Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala

275 280 285

Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His

290 295 300

Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro

305 310 315 320

Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly

325 330 335

Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro

340 345 350

Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser

355 360 365

Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His

385 390 395 400

Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg

405 410 415

Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln

420 425 430

Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu

435 440 445

Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe

450 455 460

Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser

465 470 475 480

Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser

485 490 495

Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met

500 505 510

Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys

515 520 525

Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe

530 535 540

Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe

545 550 555 560

Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr

565 570 575

Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His

580 585 590

Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln

595 600 605

His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile

610 615 620

Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val

625 630 635 640

Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser

645 650 655

Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg

660 665 670

Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg

675 680 685

Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro

690 695 700

Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile

705 710 715 720

Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln

725 730 735

Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His

740 745 750

Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp

755 760 765

Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser

770 775 780

Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu

785 790 795 800

Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His

805 810 815

Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro

820 825 830

Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp

835 840 845

Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu

850 855 860

Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala

865 870 875 880

Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys

885 890 895

Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu

900 905 910

Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe

915 920 925

Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser

930 935 940

Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe

945 950 955 960

Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly

965 970 975

Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn

980 985 990

Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln

995 1000 1005

Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln

1010 1015 1020

Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala

1025 1030 1035 1040

Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu

1045 1050 1055

Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp

1060 1065 1070

Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr

1075 1080 1085

Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser

1090 1095 1100

Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn

1105 1110 1115 1120

Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp

1125 1130

<210> 8

<211> 3399

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hTERT的核苷酸序列

<400> 8

atgcccagag ctcccagatg cagagccgtg agaagcctgc tgagaagcca ctacagagag 60

gtgctgcccc tggccacctt cgtgagaaga ctgggacccc agggctggag actggtgcag 120

agaggcgacc ccgcagcctt tagagccctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180

gacgccagac ctcctcccgc tgcccccagc ttcagacagg tgagctgcct gaaggagctg 240

gtggccagag tgctccagag actgtgcgag agaggcgcca agaacgtgct ggcctttggc 300

ttcgccctgc tggatggagc cagaggcgga cctcccgagg ccttcaccac aagcgtgaga 360

agctacctgc ccaacaccgt gaccgatgcc ctgagaggct ccggcgcctg gggcctgctc 420

ctgagaagag tgggcgacga cgtgctggtg cacctgctgg ccagatgcgc cctgttcgtg 480

ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcggacccc ctctgtacca gctgggagcc 540

gccacccagg caagaccccc tccccacgcc tctggaccca gaagaagact gggctgcgag 600

agagcctgga accacagcgt gagagaggct ggcgtgcccc tgggcctgcc cgcccctggc 660

gccagaagaa gaggcggcag cgccagcaga agcctgcccc tgcccaagag acccagacgc 720

ggcgccgctc ccgagcctga gagaacaccc gtgggccagg gcagctgggc ccaccccggc 780

agaaccagag gacccagcga cagaggcttc tgcgtggtga gccctgccag acccgccgag 840

gaggccacca gcctggaggg cgccctgagc ggcaccagac acagccaccc cagcgtgggc 900

agacagcacc acgccggccc tcctagcacc agcagacccc ccagaccttg ggacaccccc 960

tgcccccctg tgtacgccga gaccaagcac ttcctgtaca gcagcggcga caaggagcag 1020

ctgagaccca gcttcctgct gagctccctg agacccagcc tgaccggcgc cagaagactg 1080

gtggagacca tcttcctggg cagcagaccc tggatgcccg gcacccccag aagactgccc 1140

agactgcccc agagatactg gcagatgaga cccctgttcc tggagctgct gggcaaccac 1200

gcccagtgcc cctacggcgt gctgctgaag acccactgcc ccctgagagc tgccgtgacc 1260

cccgcagctg gcgtgtgcgc cagagagaag ccccagggca gcgtggccgc tcccgaggag 1320

gaggacaccg atcccagaag actggtgcag ctgctgagac agcacagcag cccctggcag 1380

gtgtacggct tcgtgagagc ctgcctgaga agactggtgc ctcccggcct gtggggcagc 1440

agacacaacg agagaagatt cctgagaaac accaagaagt tcatcagcct gggcaagcac 1500

gccaagctga gcctccagga gctgacatgg aagatgagcg tgagagactg cgcctggctg 1560

aggagaagcc ctggcgtggg ctgcgtgccc gccgccgagc acagactgag agaggagatc 1620

ctggccaagt ttctgcactg gctgatgagc gtgtacgtgg tggagctgct gagaagcttc 1680

ttctacgtga ccgagaccac attccagaag aacagactgt tcttttacag gaagagcgtg 1740

tggagcaagc tccagagcat cggcatcaga cagcacctga agagagtgca gctgagagag 1800

ctgagcgagg ccgaggtgag acagcacaga gaggccagac ccgccctgct gaccagcaga 1860

ctgagattca tccccaagcc cgatggcctg agacccatcg tgaacatgga ctacgtggtg 1920

ggagccagaa cctttagaag agagaagaga gccgagagac tgaccagcag agtgaaggcc 1980

ctgttcagcg tgctgaacta cgagagagcc agaagacccg gcctgctggg cgccagcgtg 2040

ctgggcctgg acgacatcca cagagcctgg agaaccttcg tgctgagagt gagagcccag 2100

gaccctcctc ccgagctgta cttcgtgaag gtggacgtga ccggcgccta cgacaccatc 2160

ccccaggaca gactgaccga ggtgatcgcc agcatcatca agccccagaa cacctactgc 2220

gtgagaagat acgccgtggt gcagaaggcc gcccacggcc acgtgagaaa ggccttcaag 2280

agccacgtga gcaccctgac cgacctccag ccctacatga gacagttcgt ggcccacctc 2340

caggagacca gccccctgag agatgccgtg gtgatcgagc agagctcttc cctgaacgag 2400

gcctccagcg gcctgttcga cgtgttcctg agattcatgt gccaccacgc cgtgagaatc 2460

agaggcaaga gctacgtgca gtgccagggc atcccccagg gcagcatcct gagcaccctg 2520

ctgtgcagcc tgtgctacgg cgacatggag aacaagctgt tcgctggcat cagaagagac 2580

ggcctgctgc tgagactggt ggacgacttc ctgctggtga ccccccacct gacccacgcc 2640

aagaccttcc tgagaaccct ggtgagaggc gtgcccgagt acggctgcgt ggtgaacctg 2700

agaaagaccg tggtgaactt tcccgtggag gacgaggccc tgggcggcac cgccttcgtg 2760

cagatgcccg cccacggcct gtttccctgg tgcggcctgc tcctcgacac cagaaccctg 2820

gaggtgcaga gcgactacag cagctacgca agaaccagca tcagagccag cctgaccttc 2880

aacagaggct tcaaggccgg cagaaacatg agaagaaagc tgttcggcgt gctgagactg 2940

aagtgccaca gcctgttcct ggacctccag gtgaacagcc tccagaccgt gtgcaccaac 3000

atctacaaga tcctgctgct ccaggcctac agattccacg cctgcgtgct ccagctgccc 3060

ttccaccagc aggtgtggaa gaatcccacc ttcttcctga gagtgatcag cgacaccgcc 3120

agcctgtgct acagcatcct gaaggccaag aatgccggca tgagcctggg cgccaagggc 3180

gccgctggac ccctgcccag cgaggccgtg cagtggctgt gccaccaggc cttcctgctg 3240

aagctgacca gacacagagt gacctacgtg cccctgctgg gcagcctgag aaccgcccag 3300

acccagctga gcagaaagct gcctggcaca accctgaccg ccctggaggc agccgcaaac 3360

cccgccctgc ccagcgactt caagaccatc ctggactag 3399

<210> 9

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> tTA的氨基酸序列

<400> 9

Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu

1 5 10 15

Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln

20 25 30

Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys

35 40 45

Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His

50 55 60

Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg

65 70 75 80

Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly

85 90 95

Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr

100 105 110

Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu

115 120 125

Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys

130 135 140

Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr

145 150 155 160

Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu

165 170 175

Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu

180 185 190

Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Gly Pro

195 200 205

Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala

210 215 220

Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp

225 230 235 240

Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Gly

245

<210> 10

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tTA的核苷酸序列

<400> 10

atgtcaaggc tggataaaag caaagtgatt aactccgctc tggaactgct gaacgaagtc 60

ggcattgagg ggctgaccac acgcaagctg gcacagaagc tgggagtgga gcagcccacc 120

ctgtactggc acgtgaagaa caagcgcgcc ctgctggacg ccctggccat cgagatgctg 180

gatcggcacc acacacactt ctgccctctg gagggcgaga gctggcagga cttcctgcgg 240

aacaatgcca agagctttag atgtgccctg ctgtcccaca gggatggagc aaaggtgcac 300

ctgggcacca gaccaacaga gaagcagtac gagaccctgg agaaccagct ggccttcctg 360

tgccagcagg gcttttctct ggagaatgcc ctgtatgccc tgagcgccgt gggacacttc 420

accctgggat gcgtgctgga ggaccaggag caccaggtgg ccaaggagga gagagagaca 480

cctaccacag actccatgcc ccctctgctg aggcaggcca tcgagctgtt tgatcaccag 540

ggcgccgagc cagccttcct gtttggcctg gagctgatca tctgcggcct ggagaagcag 600

ctgaagtgtg agtctggagg accagcagat gccctggacg atttcgacct ggatatgctg 660

cccgccgacg ccctggacga ttttgatctg gacatgctgc ctgctgatgc cctggatgat 720

tttgacctgg atatgctgcc tggataa 747

<210> 11

<211> 199

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PuroR的氨基酸序列

<400> 11

Met Thr Glu Tyr Lys Pro Thr Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp Asp Val

1 5 10 15

Pro Arg Ala Val Arg Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Pro Ala

20 25 30

Thr Arg His Thr Val Asp Pro Asp Arg His Ile Glu Arg Val Thr Glu

35 40 45

Leu Gln Glu Leu Phe Leu Thr Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly Lys Val

50 55 60

Trp Val Ala Asp Asp Gly Ala Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu

65 70 75 80

Ser Val Glu Ala Gly Ala Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala

85 90 95

Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu Gly Leu

100 105 110

Leu Ala Pro His Arg Pro Lys Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val

115 120 125

Gly Val Ser Pro Asp His Gln Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val

130 135 140

Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu

145 150 155 160

Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asn Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe

165 170 175

Thr Val Thr Ala Asp Val Glu Val Pro Glu Gly Pro Arg Thr Trp Cys

180 185 190

Met Thr Arg Lys Pro Gly Ala

195

<210> 12

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PuroR的核苷酸序列

<400> 12

atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta 60

cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac 120

cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac 180

atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag 240

agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt 300

tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag 360

cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc 420

agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg 480

gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc 540

gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga 600

600

<210> 13

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ZeoR的氨基酸序列

<400> 13

Met Ala Lys Leu Thr Ser Ala Val Pro Val Leu Thr Ala Arg Asp Val

1 5 10 15

Ala Gly Ala Val Glu Phe Trp Thr Asp Arg Leu Gly Phe Ser Arg Asp

20 25 30

Phe Val Glu Asp Asp Phe Ala Gly Val Val Arg Asp Asp Val Thr Leu

35 40 45

Phe Ile Ser Ala Val Gln Asp Gln Val Val Pro Asp Asn Thr Leu Ala

50 55 60

Trp Val Trp Val Arg Gly Leu Asp Glu Leu Tyr Ala Glu Trp Ser Glu

65 70 75 80

Val Val Ser Thr Asn Phe Arg Asp Ala Ser Gly Pro Ala Met Thr Glu

85 90 95

Ile Gly Glu Gln Pro Trp Gly Arg Glu Phe Ala Leu Arg Asp Pro Ala

100 105 110

Gly Asn Cys Val His Phe Val Ala Glu Glu Gln Asp

115 120

<210> 14

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ZeoR的核苷酸序列

<400> 14

atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgatgtggc cggagcggtc 60

gagttctgga ccgaccggct cgggttcagc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt 120

gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac 180

aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 240

gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 300

ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 360

gaggagcagg actaa 375

<210> 15

<211> 345

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HygroR的氨基酸序列

<400> 15

Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile

1 5 10 15

Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu

20 25 30

Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu

35 40 45

Arg Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Arg Tyr Val Tyr

50 55 60

Arg His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ile Pro Glu Val Leu Asp Ile

65 70 75 80

Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ala Gln

85 90 95

Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu

100 105 110

Gln Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser

115 120 125

Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr

130 135 140

Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro His Val Tyr

145 150 155 160

His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln

165 170 175

Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg

180 185 190

His Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu Thr Asp Asn

195 200 205

Gly Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met Phe Gly Asp

210 215 220

Ser Gln Tyr Glu Val Ala Asn Ile Phe Phe Trp Arg Pro Trp Leu Ala

225 230 235 240

Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu

245 250 255

Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp

260 265 270

Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp

275 280 285

Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val

290 295 300

Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly

305 310 315 320

Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg

325 330 335

Pro Arg Ala Lys Glu Val Gly Arg Val

340 345

<210> 16

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HygroR的核苷酸序列

<400> 16

atgaagaagc ccgaactcac cgctaccagc gttgaaaaat ttctcatcga gaagttcgac 60

agtgtgagcg acctgatgca gttgtcggag ggcgaagaga gccgagcctt cagcttcgat 120

gtcggcggac gcggctatgt actgcgggtg aatagctgcg ctgatggctt ctacaaagac 180

cgctacgtgt accgccactt cgccagcgct gcactaccca tccccgaagt gttggacatc 240

ggcgagttca gcgagagcct gacatactgc atcagtagac gcgcccaagg cgttactctc 300

caagacctcc ccgaaacaga gctgcctgct gtgttacagc ctgtcgccga agctatggat 360

gctattgccg ccgccgacct cagtcaaacc agcggcttcg gcccattcgg gccccaaggc 420

atcggccagt acacaacctg gcgggatttc atttgcgcca ttgctgatcc ccatgtctac 480

cactggcaga ccgtgatgga cgacaccgtg tccgccagcg tagctcaagc cctggacgaa 540

ctgatgctgt gggccgaaga ctgtcccgag gtgcgccacc tcgtccatgc cgacttcggc 600

agcaacaacg tcctgaccga caacggccgc atcaccgccg taatcgactg gtccgaagct 660

atgttcgggg acagtcagta cgaggtggcc aacatcttct tctggcggcc ctggctggct 720

tgcatggagc agcagactcg ctacttcgag cgccggcatc ccgagctggc cggcagccct 780

cgtctgcgag cctacatgct gcgcatcggc ctggatcagc tctaccagag cctcgtggac 840

ggcaacttcg acgatgctgc ctgggctcaa ggccgctgcg atgccatcgt ccgcagcggg 900

gccggcaccg tcggtcgcac acaaatcgct cgccggagcg cagccgtatg gaccgacggc 960

tgcgtcgagg tgctggccga cagcggcaac cgccggccca gtacacgacc gcgcgctaag 1020

gaggtaggtc gagtttaa 1038

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BM163正向引物

<400> 17

tacatcatgg gcaacgagaa 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BM151反向引物

<400> 18

tcgtcctgca gttcattcag 20

Claims

1.一种重组慢病毒载体，其包含编码肝细胞生长因子(HGF)蛋白的基因。

2.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述HGF蛋白是具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的多肽。

3.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述载体包含启动子。

4.根据权利要求3所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述启动子是巨细胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人延伸因子-1α(EF-1α)或四环素反应元件(TRE)启动子。

5.一种重组慢病毒，其包含编码HGF蛋白的基因。

6.根据权利要求5所述的重组慢病毒，其特征在于，所述慢病毒通过以下步骤获得：

用权利要求1所述的慢病毒载体、包装质粒和包膜质粒转化宿主细胞；

从转化的宿主细胞中分离出慢病毒。

7.一种宿主细胞，其用根据权利要求5所述的重组慢病毒感染。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是间充质干细胞。

9.一种用于预防或治疗血管疾病的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的根据权利要求5所述的重组慢病毒。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述血管疾病选自心绞痛、心肌梗塞、动脉硬化、动脉粥样硬化、结节性动脉周围炎、高安氏动脉炎、血管闭塞、中风、脑出血、脑梗塞、脑水肿和缺血性疾病。

11.一种用于预防或治疗血管疾病的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的根据权利要求7所述的宿主细胞。