CN111514165A - 基因增强型间充质干细胞在治疗慢性阻塞性肺疾病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基因增强型间充质干细胞在治疗慢性阻塞性肺疾病中的应用，涉及细胞药物领域。本发明公开了过表达HGF基因和/或decorin基因的基因增强型间充质干细胞在治疗慢性阻塞性肺疾病中的应用。本发明的研究显示过表达HGF基因和/或decorin基因的基因增强型间充质干细胞对慢性阻塞性肺疾病的治疗效果有明显的提高，该间充质干细胞可以作为治疗慢性阻塞性肺疾病的药物，为治疗慢性阻塞性肺疾病提供了一种新的思路和策略。

Description

基因增强型间充质干细胞在治疗慢性阻塞性肺疾病中的应用
技术领域
本发明涉及细胞药物领域，具体而言，涉及基因增强型间充质干细胞在治疗慢性阻塞性肺疾病中的应用。
背景技术
慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是一种以持续呼吸道症状及气流受限为主要特征的慢性肺部疾病。COPD患者气流受限主要由小气道疾病(阻塞性支气管炎)和肺实质破坏(肺气肿)共同引起。慢性炎症反应是COPD发生、发展的重要机制，在炎症导致的反复损伤与修复过程中，气道壁结构重构，引起胶原含量增加及瘢痕组织形成，造成细支气管周围纤维化和气道狭窄，最终导致固定性气道阻塞。最终会进展目前，COPD的治疗手段多以延缓病程进展和对症治疗为主，尚未发现可有效逆转肺部损伤的药物。
已有研究证实，不同类型的间充质干细胞在肺纤维化治疗中具有显著的疗效。肺纤维化作为一种常见的肺间质性疾病，是主要累及肺间质、肺泡和(或)细支气管的肺部弥漫性疾病，表现为弥散功能逐渐下降，亦可出现活动后胸闷气喘等临床症状。而慢阻肺是由小气道疾病(阻塞性支气管炎)和肺实质破坏(肺气肿)共同引起，常呈进行性加重，并伴有对有害颗粒或气体，主要是吸烟所致的肺部异常炎症反应。虽然严重的COPD患者往往伴有肺纤维化，但是，COPD与肺纤维化在发病机制、病程、临床症状等方面均存在较大差别。目前，尚未见基因修饰间充质干细胞用于慢阻肺治疗的报道。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因增强型间充质干细胞在治疗慢性阻塞性肺疾病中的应用，本发明提供的过表达HGF基因和/或decorin基因的基因增强型间充质干细胞，对慢性阻塞性肺疾病的治疗效果有明显的提高，本发明提供的基因增强型间充质干细胞可以作为治疗慢性阻塞性肺疾病的药物，为治疗慢性阻塞性肺疾病提供了一种新的思路和策略。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供基因增强型间充质干细胞在制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药物中的应用，所述基因增强型间充质干细胞过表达HGF基因和/或decorin基因。
本发明的研究显示，通过HGF基因或decorin基因修饰的间充质干细胞即过表达HGF基因或decorin基因间充质干细胞，其在治疗慢性阻塞性肺疾病具有更好的治疗效果。
可选地，在本发明的一些实施方式中，所述基因增强型间充质干细胞通过发挥如下功能中的一种或多种以实现慢性阻塞性肺疾病的治疗效果：
(1)抑制支气管肺泡灌洗液炎症；
(2)改善肺脏结构；
(3)改善肺脏功能。
本发明的研究显示，本发明的基因增强型间充质干细胞具有抑制支气管肺泡灌洗液炎症、改善肺脏结构和改善肺脏功能的功能，通过这些功能的发挥，实现对慢性阻塞性肺疾病的治疗。
可选地，在本发明的一些实施方式中，所述抑制支气管肺泡灌洗液炎症包括：减少中性粒细胞百分比、增加巨噬细胞百分比和/或减少炎症因子含量。
本发明的研究显示，在更为具体的功能层面上，本发明的基因增强型间充质干细胞具有减少中性粒细胞百分比、增加巨噬细胞百分比以及减少炎症因子含量的功能，起到抑制支气管肺泡灌洗液炎症的效果。
可选地，在本发明的一些实施方式中，所述炎症因子包括IL-1β、IL-2、TNF-α和/或IFN-γ中的至少一种。
可选地，在本发明的一些实施方式中，所述改善肺脏结构包括：抑制肺泡间隔增厚。
本发明的研究显示，在更为具体的功能层面上，本发明的基因增强型间充质干细胞能够明显抑制肺泡间隔增厚，改善肺脏结构。
可选地，在本发明的一些实施方式中，所述改善肺脏功能包括：降低肺静态顺应性、降低功能残气量、提升Cfvc50和/或提升FEV100/FVC。
本发明的研究显示，在更为具体的功能层面上，本发明的基因增强型间充质干细胞能够降低肺静态顺应性、降低功能残气量、提升Cfvc50和/或提升FEV100/FVC改善肺脏功能。
可选地，在本发明的一些实施方式中，所述基因增强型间充质干细胞通过如下方法制备得到：
将HGF基因和/或decorin基因导入间充质干细胞并使HGF基因和/或decorin基因在所述间充质干细胞内过表达。
可选地，在本发明的一些实施方式中，通过腺病毒将HGF基因和/或decorin基因导入所述间充质干细胞。
需要说明的是，在本发明所公开的内容基础上，本领域技术人员可以采用本领域其他熟知的基因工程技术将HGF基因和/或decorin基因导入间充质干细胞实现过表达，这对本来领域技术人员来说是容易实现，无论其采用何种方法将HGF基因和/或decorin基因导入间充质干细胞，其均是属于本发明的保护范围。
可选地，在本发明的一些实施方式中，通过腺病毒将HGF基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
可选地，在本发明的一些实施方式中，HGF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
可选地，在本发明的一些实施方式中，decorin基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
可选地，在本发明的一些实施方式中，decorin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
可选地，在本发明的一些实施方式中，所述间充质干细胞来源于脂肪、骨髓、牙髓或脐带。
可选地，在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为注射剂、鼻腔喷雾剂或滴鼻剂。
对于本发明所述药物的剂型，本领域技术人员可以根据实际需要合理选择，无论何种剂型，其均是属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供基因增强型间充质干细胞在制备如下任意一种制剂中的应用：(1)用于抑制支气管肺泡灌洗液炎症的制剂；(2)用于改善肺脏结构的制剂；(3)用于改善肺脏功能的制剂；所述基因增强型间充质干细胞过表达HGF基因和/或decorin基因。
可选地，在本发明的一些实施方式中，所述抑制支气管肺泡灌洗液炎症是指：减少中性粒细胞百分比、增加巨噬细胞百分比以及减少炎症因子含量；
可选地，在本发明的一些实施方式中，所述炎症因子包括IL-1β、IL-2、TNF-α和IFN-γ
可选地，在本发明的一些实施方式中，所述改善肺脏结构是指：抑制肺泡间隔增厚。
可选地，在本发明的一些实施方式中，所述改善肺脏功能是指：肺静态顺应性降低、功能残气量降低、Cfvc50上升以及FEV100/FVC上升。
再一方面，本发明提供一种治疗慢性阻塞性肺疾病的药物，其含有：基因增强型间充质干细胞；所述基因增强型间充质干细胞过表达HGF基因和/或decorin基因。
可选地，在本发明的一些实施方式中，所述基因增强型间充质干细胞通过如下方法制备：
将HGF基因和/或decorin基因导入间充质干细胞并使HGF基因和/或decorin基因在所述间充质干细胞内过表达。
可选地，在本发明的一些实施方式中，通过腺病毒将HGF基因和/或decorin基因导入所述间充质干细胞。
可选地，在本发明的一些实施方式中，通过腺病毒将HGF基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
可选地，在本发明的一些实施方式中，HGF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
可选地，在本发明的一些实施方式中，decorin基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
可选地，在本发明的一些实施方式中，decorin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例2四种不同来源间充质干细胞治疗COPD小鼠模型后，肺泡灌洗液中炎症细胞和蛋白渗出检测结果：A-细胞总数；B-中性粒细胞百分比；C-淋巴细胞百分比；D-巨噬细胞百分比；
图2为本发明实施例2四种不同来源间充质干细胞治疗COPD小鼠模型后，肺脏病理H&E染色结果：A-对照组；B-模型组；C-脂肪间充质干细胞治疗组；D-骨髓间充质干细胞治疗组；E-牙髓间充质干细胞治疗组；F-脐带间充质干细胞治疗组；
图3为本发明实施例2四种不同来源间充质干细胞治疗COPD小鼠模型后，肺脏组织H&E染色后，肺泡平均内衬间隔(mean linear intercept，MLI)测定结果；
图4为本发明实施例2四种不同来源间充质干细胞治疗COPD小鼠模型后，采用小动物肺功能仪(PFT系统)评估大鼠的肺功能：A-肺静态顺应性(Cchord)；B-功能残气量(Functional Residual Capacity，FRC)；C-第50毫秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV50/FVC)；D-第100毫秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV100/FVC)；
图5为本发明实施例3中脐带间充质干细胞P5代细胞核型检测结果；
图6为本发明实施例3中脐带间充质干细胞P5代细胞表型流式细胞术检测结果；
图7为本发明实施例5中基因增强型脐带间充质干细胞(UC-MSCs.HGF和UC-MSCs.DCN)治疗COPD小鼠模型后，肺脏组织H&E染色后，肺泡平均内衬间隔(mean linearintercept，MLI)测定结果；
图8为本发明实施例5中基因增强型脐带间充质干细胞(UC-MSCs.HGF和UC-MSCs.DCN)治疗COPD小鼠模型后，采用小动物肺功能仪(PFT系统)评估大鼠的肺功能：A-肺静态顺应性(Cchord)；B-功能残气量；C-达到50％肺活量时的肺顺应性(Cfvc50)；D-第50毫秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV50/FVC)；
图9为本发明实施例5中基因增强型脐带间充质干细胞(UC-MSCs.HGF和UC-MSCs.DCN)治疗COPD小鼠模型后，采用血细胞分析仪检测肺泡灌洗液中炎症细胞和蛋白渗出检测结果：A-细胞总数；B-中性粒细胞计数；C-淋巴细胞计数；D-巨噬细胞计数；
图10为本发明实施例5中基因增强型脐带间充质干细胞(UC-MSCs.HGF和UC-MSCs.DCN)治疗COPD小鼠模型后，采用多因子检测试剂盒检测肺泡灌洗液中炎症因子的结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
不同来源间充质干细胞的分离、培养、扩增和性能检测
(1)间充质干细胞的分离培养
牙齿经供者签署知情同意书后，在麻醉下无菌拔除无龋齿、无牙髓炎和牙髓坏死的第三磨牙。新鲜拔除的牙齿立即放入装有20ml无菌生理盐水的牙齿采集瓶中，24h内，采用胶原酶和分散酶联合消化法分离培养牙髓干细胞。
经产妇同意并签署知情同意书后，将脐带存于装有含有300mlα-MEM培养基的500ml无菌玻璃瓶中，于收集后24小时内，采用组织块贴壁培养法，分离脐带间充质干细胞。
经捐献者同意并签署知情同意书后，采集捐献者骨髓组织并置于无菌采集管中。采用Percoll分离法，分离骨髓单个核细胞；然后采用直接贴壁法分离骨髓间充质干细胞。
经供者同意并签署知情同意书后，采集供者脂肪组织，置于装有300mlα-MEM的500ml培养瓶中，于24h内采用胶原酶和胰蛋白酶联合消化法分离脂肪间充质干细胞。
(2)间充质干细胞的扩增及性能检测
分离获得的P0代间充质干细胞，以6000-8000细胞/cm2的密度进行传代，培养4d后，用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，继续传代。分别在P3代、P5代和P6代建立原始细胞库、工作细胞库和原液库。P6代细胞进行细胞表型检测，CD73、CD90和CD105表达阳性(>95％)，而CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR表达阴性(<2％)；同时，分化潜能检测的结果显示，四种不同来源的间充质干细胞均具有成脂和成骨分化能力。
实施例2
四种不同来源间充质干细胞治疗COPD模型小鼠的疗效评价
(1)模型建立及给药
C57BL/6J小鼠经检疫合格后，随机分为正常对照组(CTR)、模型组、脂肪MSCs组、骨髓MSCs组、牙髓MSCs组和脐带MSCs，利用烟雾暴露6个月，建立小鼠类慢阻肺动物模型，具体为：4-6周龄小鼠，适应一周后，采用国产平价香烟，于熏烟箱中进行全身暴露给予小鼠被动吸烟，每周香烟烟雾暴露6天，持续6个月。在烟雾暴露3个月开始细胞治疗，每月给药一次，给药剂量为1×106细胞/200μl/小鼠，共治疗3次，烟雾暴露6个月后取材评估治疗效果。具体为，制备间充质干细胞置于冰上保存，6h内给予细胞制剂200μl(5×106细胞/ml)进行治疗，烟熏后3个月、4个月和5个月分别给药一次，最后一次给药后1个月，即烟雾暴露6个月后取材评估治疗效果。
(2)治疗效果评价
模型组小鼠肺静态顺应性(Cchord)增大(P＜0.05)，第50微秒及100微秒用力呼气量与用力肺活量的比值(FEV50/FVC，FEV100/FVC)下降，支气管肺泡灌洗液炎症细胞总数﹑中性粒细胞显著升高(P<0.01)，肺泡平均内衬间隔(mean linear intercept，MLI)，增厚(P<0.05)(图1-4)。上述结果表明，已经成功建立了COPD小鼠模型。
不同来源间充质干细胞治疗后，支气管肺泡灌洗液炎症细胞总数﹑中性粒细胞计数显著低于模型组(P<0.05)，表明炎症反应得到有效抑制(图1)；肺脏组织进行H&E染色后，结果显示，肺泡结构相对完整，肺泡壁变薄，MLI下降，部分代偿性肺气肿形成，血管扩张充血，说明肺脏结构改善(图2-图3)；采用小动物肺功能仪(PFT系统)评估大鼠的肺功能，结果显示，肺静态顺应性降低、功能残气量(Functional Residual Capacity，FRC)减少、FEV50/FVC和FEV100/FVC上升，提示肺功能得到有效改善(图4)。其中，牙髓间充质干细胞在炎症调节方面具有更大优势，而脐带间充质干细胞则可以有效改善肺脏结构和功能。
实施例3
基因增强型脐带间充质的干细胞原液制备
(1)脐带间充质干细胞的制备
经供者签署知情同意书，在取得《医疗机构执业许可证》的具有供者筛查能力的医疗机构，由持有医师或护士执业证书的经验丰富的医护人员，按照诊疗常规，采集全长脐带，采集后迅速放入脐带采集瓶(装有300mlα-MEM培养基)中，24h内分离培养脐带间充质干细胞。具体方法为：剪碎牙冠后取牙髓组织，经生理盐水反复冲洗后剪碎成1mm3左右的小块；将脐带转移到盛有氯化钠注射液的30cm培养皿，减掉水肿或者破损处后，剪成2～3cm长度的小段；用镊子钝性分离脐带内三根血管并将羊膜去除；剪成0.5*0.5cm2左右的组织块，平铺到10cm培养皿中；待组织贴到培养皿后，加3ml无血清培养基轻轻摇匀；培养第一天(次日)，每个培养皿补加7ml对应的培养基，继续培养；培养第五天、十天，半量换液；培养第十五天，去除组织块，用重组胰蛋白酶消化收集细胞，得到P0代脐带间充质干细胞。
收集获得的P0代脐带间充质干细胞，以4000-8000细胞/cm2的密度进行传代，培养4d后，用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，继续传代；传代至P3代进行冻存，建立原始细胞库；复苏细胞后，以4000-8000细胞/cm2的密度进行接种，并传代至P5代，建立工作细胞库，细胞依据《人类细胞遗传学国际命名体制ISCN2009》的G显带法核型分析，证实其核型为46XY，表明脐带间充质干细胞染色体无异常；依据国际细胞治疗协会(ISCT)的表型检测标准，其具有间充质干细胞的特征，包括阳性表达CD105、CD73、CD90、HLA-ABC和CD29等表面分子(>95％)(图5)，阴性表达HLD-DR、CD14、CD31、CD11b和CD19等表面分子(<2％)；此外，其具有成脂和成骨分化潜能，前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)表达大于200pg/ml，符合质量要求(图5-图6)。
(2)重组腺病毒Ad.HGF或Ad.DCN的制备
将HGF基因序列(SEQ ID NO.1)或decorin基因序列(SEQ ID NO.3)正向克隆到穿梭质粒pshuttle-cmv的SalI和NotI限制性内切酶位点质检，形成由CMV启动子调控HGF或Decorin表达的表达框，获得穿梭质粒pshuttle-cmv-HGF或pshuttle-cmv-DCN；然后，采用Adeasy系统，将PmeI线性化的穿梭质粒pshuttle-cmv-HGF或pshuttle-cmv-DCN与骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183中同源重组获得重组腺病毒质粒pAd.HGF或pAd.DCN；脂质体转染PacI线性化的pAd.HGF或pAd.DCN，于HEK293细胞中包装获得复制缺陷型重组腺病毒Ad.HGF或Ad.DCN，经PCR、ELISA或Western-blotting鉴定可表达HGF或Decroin；经HEK293细胞中大量扩增后，采用CsCl密度梯度离心进行纯化，采用紫外分光光度法测定病毒颗粒滴度和纯度，采用半数组织培养感染剂量法(Median Tissue Culture Infective Dose,TCID50)测定病毒滴度，其纯度(OD260nm/OD280nm)在1.2-1.4质检，感染滴度/颗粒滴度大于1/100。
(3)基因增强型脐带间充质的干细胞原液制备
P5代脐带间充质干细胞复苏后，按照8000-16000细胞/cm2的密度接种175cm2的培养瓶，于置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养48h-72h，待细胞达到70％-80％融合度，加入50-150MOI(IU/细胞)的重组腺病毒载体(Ad.HGF或Ad.DCN)，共同孵育2-4h后，用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，采用无血清冻存液冻存细胞，即得到基因增强型脐带间充质干细胞：UC-MSCs.HGF和UC-MSCs.DCN的原液(P6)。
实施例4
基因增强型脐带间充质干细胞制剂制备
复苏实施例3中的P6代脐带间充质干细胞原液(UC-MSC)和增强型脐带间充质干细胞原液(UC-MSCs.HGF和UC-MSCs.DCN)，制备细胞制剂，具体为：将脐带间充质干细胞或增强型脐带间充质干细胞原液从液氮取出后，迅速放入37℃水浴融化，将其加入到2倍体积的生理盐水中，1500rpm-1800rpm离心收集细胞；细胞用两倍原体积的生理盐水重悬后，过100μm的细胞筛网；1500rpm-1800rpm离心收集细胞，用生理盐水按照5×106细胞/ml重悬细胞，获得细胞制剂。
实施例5
基因增强型脐带间充质干细胞治疗COPD模型小鼠的疗效评价
按照实施例2的方法，利用烟雾暴露6个月，建立小鼠类慢阻肺动物模型。在烟雾暴露3个月开始细胞治疗，每月给药一次，给药剂量为1×106细胞/100μl/小鼠，共治疗3次。具体为，制备细胞制剂置于冰上保存，6h内给予细胞制剂200μl(5×106细胞/ml)进行治疗，烟熏后3个月、4个月和5个月分别给药一次，最后一次给药后1个月，即烟雾暴露6个月后取材评估治疗效果。
(1)肺功能评价：采用小动物肺功能仪(PFT系统)评估大鼠的肺功能，分别检测了肺容量指标、呼吸力学指标和肺通气功能指标。包括肺功能残气量(functional residualcapacity,FRC)、静态肺顺应性(Cchord)和达到50％VC时的肺顺应性(Cfvc50)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)、第50毫秒和100毫秒用力呼气容积等。
(2)肺部炎症检测：将采集过血液的小鼠固定好，充分暴露胸部。将蝴蝶针一端插入小鼠气管直至适宜深度，另一端连接1ml注射器，每次向右肺部缓慢打入0.4ml的生理盐水，共6次。每次打入生理盐水反复抽吸1-2次，将收集到的肺泡灌洗液置于冰上。①裂解红细胞后，采用细胞计数仪，计数细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的数量；②收取肺泡灌洗液后，采用BioRad公司多因子检测试剂盒，检测多种炎症因子的表达水平，如，IL-1β、IL-2、TNF-α和IFN-γ等。
(3)肺泡间隔厚度检测：取肺脏组织，进行H&E染色后，检测肺泡间隔增厚情况。
结果如图7-图10所示：
与未经修饰的脐带间充质干细胞(与模型组比，p<0.05)相比，两种基因修饰后的脐带间充质干细胞对肺泡间隔增厚的抑制作用更加显著(与模型组相比，UC-MSCs.HGF组p<0.001；UC-MSCs.DCN组p<0.01；图7)。此外，可以看出，相较于decroin基因修饰，HGF基因修饰在抑制肺泡间隔增厚功能上更具有优势。
与未经修饰的脐带间充质干细胞相比，两种基因修饰可在一定程度上增强脐带间充质干细胞对肺脏功能的改善作用，包括降低肺静态顺应性、降低功能残气量、降低Cfvc50、提升FEV50/FVC等(图8)。例如，未经修饰的脐带间充质干细胞虽可改善Cfvc50和FEV50/FVC，但与模型组相比无统计学差异；而两种基因修饰的脐带间充质干细胞对FEV50/FVC，以及decorin修饰脐带间充质干细胞对Cfvc50的改善作用均具有统计学差异(p<0.001)。值得注意的是，相较于HGF基因修饰，decroin基因修饰在降低肺静态顺应性、降低Cfvc50两项指标上具有更加明显的优势。
与未经修饰的脐带间充质干细胞相比，两种基因修饰后的脐带间充质干细胞在抑制炎症反应上效果也比较明显，例如，将decroin基因修饰后的脐带间充质干细胞在降低中性粒细胞百分比和提高巨噬细胞百分比上优势明显，效果显著(与模型组相比，p<0.01，图9)；另外，根据图10的结果可以看出，两种基因修饰后的脐带间充质干细胞能够减少炎症因子的表达，包括IL-1β、IL-2、TNF-α和IFN-γ；其中，decroin基因修饰在降低TNF-α上具有优势，HGF基因修饰在降低IL-2上具有优势；
通过上述实验，从整体上来看，经decroin基因或HGF基因修饰后，能够增强脐带间充质干细胞治疗慢性阻塞性肺疾病的效果；不同的是，在具体的指标上，decroin基因修饰或HGF基因修饰各自有各自的优势；例如decroin基因修饰具有更加显著的抗炎作用，HGF基因修饰则在促进肺脏组织再生与重构，改善肺脏结构以及改善肺脏功能上具有显著的优势。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京三有利和泽生物科技有限公司
<120> 基因增强型间充质干细胞在治疗慢性阻塞性肺疾病中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2220
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatccgccag cccgtccagc agcaccatgt gggtgaccaa actcctgcca gccctgctgc 60
tgcagcatgt cctcctgcat ctcctcctgc tccccatcgc catcccctat gcagagggac 120
aaaggaaaag aagaaataca attcatgaat tcaaaaaatc agcaaagact accctaatca 180
aaatagatcc agcactgaag ataaaaacca aaaaagtgaa tactgcagac caatgtgcta 240
atagatgtac taggaataaa ggacttccat tcacttgcaa ggcttttgtt tttgataaag 300
caagaaaaca atgcctctgg ttccccttca atagcatgtc aagtggagtg aaaaaagaat 360
ttggccatga atttgacctc tatgaaaaca aagactacat tagaaactgc atcattggta 420
aaggacgcag ctacaaggga acagtatcta tcactaagag tggcatcaaa tgtcagccct 480
ggagttccat gataccacac gaacacagct ttttgccttc gagctatcgg ggtaaagacc 540
tacaggaaaa ctactgtcga aatcctcgag gggaagaagg gggaccctgg tgtttcacaa 600
gcaatccaga ggtacgctac gaagtctgtg acattcctca gtgttcagaa gttgaatgca 660
tgacctgcaa tggggagagt tatcgaggtc tcatggatca tacagaatca ggcaagattt 720
gtcagcgctg ggatcatcag acaccacacc ggcacaaatt cttgcctgaa agatatcccg 780
acaagggctt tgatgataat tattgccgca atcccgatgg ccagccgagg ccatggtgct 840
atactcttga ccctcacacc cgctgggagt actgtgcaat taaaacatgc gctgacaata 900
ctatgaatga cactgatgtt cctttggaaa caactgaatg catccaaggt caaggagaag 960
gctacagggg cactgtcaat accatttgga atggaattcc atgtcagcgt tgggattctc 1020
agtatcctca cgagcatgac atgactcctg aaaatttcaa gtgcaaggac ctacgagaaa 1080
attactgccg aaatccagat gggtctgaat caccctggtg ttttaccact gatccaaaca 1140
tccgagttgg ctactgctcc caaattccaa actgtgatat gtcacatgga caagattgtt 1200
atcgtgggaa tggcaaaaat tatatgggca acttatccca aacaagatct ggactaacat 1260
gttcaatgtg ggacaagaac atggaagact tacatcgtca tatcttctgg gaaccagatg 1320
caagtaagct gaatgagaat tactgccgaa atccagatga tgatgctcat ggaccctggt 1380
gctacacggg aaatccactc attccttggg attattgccc tatttctcgt tgtgaaggtg 1440
ataccacacc tacaatagtc aatttagacc atcccgtaat atcttgtgcc aaaacgaaac 1500
aattgcgagt tgtaaatggg attccaacac gaacaaacat aggatggatg gttagtttga 1560
gatacagaaa taaacatatc tgcggaggat cattgataaa ggagagttgg gttcttactg 1620
cacgacagtg tttcccttct cgagacttga aagattatga agcttggctt ggaattcatg 1680
atgtccacgg aagaggagat gagaaatgca aacaggttct caatgtttcc cagctggtat 1740
atggccctga aggatcagat ctggttttaa tgaagcttgc caggcctgct gtcctggatg 1800
attttgttag tacgattgat ttacctaatt atggatgcac aattcctgaa aagaccagtt 1860
gcagtgttta tggctggggc tacactggat tgatcaacta tgatggccta ttacgagtgg 1920
cacatctcta tataatggga aatgagaaat gcagccagca tcatcgaggg aaggtgactc 1980
tgaatgagtc tgaaatatgt gctggggctg aaaagattgg atcaggacca tgtgaggggg 2040
attatggtgg cccacttgtt tgtgagcaac ataaaatgag aatggttctt ggtgtcattg 2100
ttcctggtcg tggatgtgcc attccaaatc gtcctggtat ttttgtccga gtagcatatt 2160
atgcaaaatg gatacacaaa attattttaa catataaggt accacagtca tagctgaagt 2220
<210> 2
<211> 728
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
85 90 95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100 105 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115 120 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
130 135 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145 150 155 160
Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr
165 170 175
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser
180 185 190
Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu
195 200 205
Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp
210 215 220
His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro
225 230 235 240
His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp
245 250 255
Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr
260 265 270
Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys
275 280 285
Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu
290 295 300
Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile
305 310 315 320
Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu
325 330 335
His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn
340 345 350
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr
355 360 365
Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp
370 375 380
Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met
385 390 395 400
Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp
405 410 415
Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala
420 425 430
Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His
435 440 445
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys
450 455 460
Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu
465 470 475 480
Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val
485 490 495
Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg
500 505 510
Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp
515 520 525
Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr
530 535 540
Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys
545 550 555 560
Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly
565 570 575
Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp
580 585 590
Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu
595 600 605
Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn
610 615 620
Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu
625 630 635 640
Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu
645 650 655
Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp
660 665 670
Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu
675 680 685
Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly
690 695 700
Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile
705 710 715 720
Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
725
<210> 3
<211> 1080
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaaggcca ctatcatcct ccttctgctt gcacaagttt cctgggctgg accgtttcaa 60
cagagaggct tatttgactt tatgctagaa gatgaggctt ctgggatagg cccagaagtt 120
cctgatgacc gcgacttcga gccctcccta ggcccagtgt gccccttccg ctgtcaatgc 180
catcttcgag tggtccagtg ttctgatttg ggtctggaca aagtgccaaa ggatcttccc 240
cctgacacaa ctctgctaga cctgcaaaac aacaaaataa ccgaaatcaa agatggagac 300
tttaagaacc tgaagaacct tcacgcattg attcttgtca acaataaaat tagcaaagtt 360
agtcctggag catttacacc tttggtgaag ttggaacgac tttatctgtc caagaatcag 420
ctgaaggaat tgccagaaaa aatgcccaaa actcttcagg agctgcgtgc ccatgagaat 480
gagatcacca aagtgcgaaa agttactttc aatggactga accagatgat tgtcatagaa 540
ctgggcacca atccgctgaa gagctcagga attgaaaatg gggctttcca gggaatgaag 600
aagctctcct acatccgcat tgctgatacc aatatcacca gcattcctca aggtcttcct 660
ccttccctta cggaattaca tcttgatggc aacaaaatca gcagagttga tgcagctagc 720
ctgaaaggac tgaataattt ggctaagttg ggattgagtt tcaacagcat ctctgctgtt 780
gacaatggct ctctggccaa cacgcctcat ctgagggagc ttcacttgga caacaacaag 840
cttaccagag tacctggtgg gctggcagag cataagtaca tccaggttgt ctaccttcat 900
aacaacaata tctctgtagt tggatcaagt gacttctgcc cacctggaca caacaccaaa 960
aaggcttctt attcgggtgt gagtcttttc agcaacccgg tccagtactg ggagatacag 1020
ccatccacct tcagatgtgt ctacgtgcgc tctgccattc aactcggaaa ctataagtaa 1080
<210> 4
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Lys Ala Thr Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu
20 25 30
Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro
35 40 45
Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val
50 55 60
Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro
65 70 75 80
Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile
85 90 95
Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu
100 105 110
Val Asn Asn Lys Ile Ser Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu
115 120 125
Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu
130 135 140
Pro Glu Lys Met Pro Lys Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn
145 150 155 160
Glu Ile Thr Lys Val Arg Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met
165 170 175
Ile Val Ile Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu
180 185 190
Asn Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala
195 200 205
Asp Thr Asn Ile Thr Ser Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr
210 215 220
Glu Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser
225 230 235 240
Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser
245 250 255
Ile Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg
260 265 270
Glu Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu
275 280 285
Ala Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile
290 295 300
Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys
305 310 315 320
Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr
325 330 335
Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala
340 345 350
Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys
355

Claims (10)

1.基因增强型间充质干细胞在制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药物中的应用，其特征在于，所述基因增强型间充质干细胞过表达HGF基因和/或decorin基因。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因增强型间充质干细胞通过发挥如下功能中的一种或多种以实现慢性阻塞性肺疾病的治疗效果：
(1)抑制支气管肺泡灌洗液炎症；
(2)改善肺脏结构；
(3)改善肺脏功能。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制支气管肺泡灌洗液炎症包括：减少中性粒细胞百分比、增加巨噬细胞百分比和/或减少炎症因子含量；
优选地，所述炎症因子包括IL-1β、IL-2、TNF-α和IFN-γ中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述改善肺脏结构包括：抑制肺泡间隔增厚。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述改善肺脏功能包括：降低肺静态顺应性、降低功能残气量、提升Cfvc50和/或提升FEV100/FVC。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述基因增强型间充质干细胞通过如下方法制备得到：
将HGF基因和/或decorin基因导入间充质干细胞并使HGF基因和/或decorin基因在所述间充质干细胞内过表达；
优选地，通过腺病毒将HGF基因和/或decorin基因导入所述间充质干细胞；
优选地，HGF基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，HGF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1.所示；
优选地，decorin基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
优选地，decorin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
优选地，所述间充质干细胞来源于脂肪、骨髓、牙髓或脐带。
7.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂、鼻腔喷雾剂或滴鼻剂。
8.基因增强型间充质干细胞在制备如下任意一种制剂中的应用：(1)用于抑制支气管肺泡灌洗液炎症的制剂；(2)用于改善肺脏结构的制剂；(3)用于改善肺脏功能的制剂；其特征在于，所述基因增强型间充质干细胞过表达HGF基因和/或decorin基因。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制支气管肺泡灌洗液炎症是指：减少中性粒细胞百分比、增加巨噬细胞百分比和/或减少炎症因子含量；
优选地，所述炎症因子包括IL-1β、IL-2、TNF-α和/或IFN-γ；
优选地，所述改善肺脏结构是指：抑制肺泡间隔增厚；
优选地，所述改善肺脏功能是指：肺静态顺应性降低、功能残气量降低、Cfvc50上升和/或FEV100/FVC上升。
10.一种治疗慢性阻塞性肺疾病的药物，其特征在于，其含有：基因增强型间充质干细胞；所述基因增强型间充质干细胞过表达HGF基因和/或decorin基因；
优选地，所述基因增强型间充质干细胞通过如下方法制备：
将HGF基因和/或decorin基因导入间充质干细胞并使HGF基因和/或decorin基因在所述间充质干细胞内过表达；
优选地，通过腺病毒将HGF基因和/或decorin基因导入所述间充质干细胞；
优选地，HGF基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，HGF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，decorin基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
优选地，decorin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
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