CN1873012A - 重组腺相关病毒(rAAV)载体大规模生产新工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组腺相关病毒(rAAV)载体在GMP条件下大规模生产的新工艺,解决了腺相关病毒载体从实验室的小量生产,扩大到在GMP条件下的大规模工业化生产的系列难题,使腺相关病毒载体(携带基因治疗)药物的规模生产成于现实。生产工艺步骤包括:细胞种子扩大,细胞培养;质粒转染;营养更新;细胞收集;破壁和纯化;产品罐装和储存。新的质粒转染技术用在大规模生产上,既解决了腺相关病毒产业化生产,又克服辅毒带来的安全性问题。生产工艺具有良好的可控性和操作性,整个生产工艺保证了产品的生物活性,新工艺具有较高的经济效益。
Description
本发明用美国希望基因治疗有限公司和上海凯铱威机电有限公司的资金进行,因此,以上两家公司在本发明中拥有一些权利。
发明领域
本发明属于病毒基因工程领域,具体涉及GMP条件下重组腺相关病毒载体大规模生产的新工艺。
背景技术
二十世纪末,随着生命科学以及分子技术的迅猛发展,各种学科相互交叉渗透,人们对各疾病的病因及分子机制等深入的研究,新颖的基因治疗方法获得了突飞猛进的发展,并迅速走向成熟,批准进入临床实验的基因药物逐步增多,基因治疗的研究内容也从单基因的遗传病扩大到多基因的肿瘤,艾滋病,心血管疾病,神经系统疾病,自身免疫性疾病,内分泌疾病。因此,基因产品制备的实验室规模已不能满足基因药物商业化的需要,迫切需要开发基因药物的规模化、工业化生产工艺。鉴于腺相关病毒的优点和工业化生产的可控制性和可操作性。目前,腺相关病毒作为基因治疗的载体,正被诸多实验室和临床实验组看好。至今,重组腺相关病毒载体的制品工艺,大多采用有血清贴壁培养方法,该方法处于实验室阶段,距大规模工业化生产还有很大距离。本发明的目的是提供一种在GMP条件下重组腺相关病毒载体大规模生产新工艺,为重组腺相关病毒载体成为商业化基因药物提供生产平台。
腺相关病毒(Adeno-Associated Virus,AAV)是微小病毒科成员,基因组为4682个核苷酸组成的单链DNA,作于基因治疗的载体,它有一定的优势;AAV本身不引起任何人类疾病,到目前为止,尚未发现任何由AAV所致的人类疾病。病毒本身只有两个基因,即复制基因和编码衣壳蛋白的基因Cap,后者易于清除或降低细胞的毒性及T-淋巴细胞反应的危险性,AAV感染人体后,可在19号染色体上进行位点特异性整合,如果没有辅助病毒如腺病毒、疱症病毒或水痘病毒等共感染,野生型就潜伏在19号染色体上的特定部位(无功能区),直到辅助病毒出现后才复制;腺相关病毒的DNA能够稳定有效整合到人细胞基因组,而且有宽广的宿主范围,能潜伏感染非分裂期细胞,研究表明AAV能有效转导脑、骨骼肌、肝脏、肺、皮肤、视网膜、血管内皮。在猴子的实验中表达可持续5年以上。因此,AAV被认为是一种用于人类基因治疗很有前途的安全载体。
虽然,腺相关病毒作于基因治疗的载体有望唱主角,综观世界各国的研究室和代加工rAAV的公司,在生产工艺仍有许多明显的缺点。我国有关研究室在重组腺相关病毒的生产上仍不能跨越这一道门槛,制备rAAV病毒依靠辅毒刺激来激活rAAV活性,这样将带来安全性的问题和增加生产成本,至今离rAAV的大规模生产仍有距离。
为了实现重组腺相关病毒载体的大规模生产,本发明在生产工艺上作了诸多改进,改进的生产工艺包括:在GMP条件下,采用发酵罐悬浮培养方法;使用无血清培养工艺;质粒转染方法;快速纯化方法。本发明由于采用上述的生产工艺,具有明显的优点:
1)可进行大规模生产,能满足商业化的要求
2)生产的全过程可监控和自如操作
3)能充分保证产品的生物活性
4)用无血清培养液可减少由动物血清对产品带来的污染,增加产品的安全性和降低产品的毒性。
5)可由市场的需求来增减发酵罐的数量
6)由全控的发酵罐系统,减少人工和生产成本,增加生产效率
图面说明
图1是GMP条件下重组腺相关病毒载体的生产工艺和流程。
Claims (7)
1.重组腺相关病毒(rAAV,recombinant Adeno-Associated Virus)载体的大规模生产化工艺,其新颖性包括以下各步骤的多项参数的改进,具体生产工艺步骤如下:
(1)细胞种子扩大
取50L发酵罐所要的HEK293细胞库的种子细胞,接种HEK293至专用发酵罐中,发酵罐培养基在接种前预热至37℃,用二氧化碳来平衡培养液的pH,发酵罐在发酵培养中能自动检测各项参数指标(如:氧分压、二氧化碳分压、pH值、温度、葡萄糖浓度、氨浓度、呼吸比等),细胞在发酵罐中培养至所需的培养密度约需3-4天的时间,每天检测细胞生长的密度,中间的培养液更换和补充以程控仪表显示参数为依据,培养液为无血清培养液。培养工艺中本发明改进由转瓶到发酵罐大容量悬浮培养和无血清培养,用悬浮培养方法代替贴壁培养,使大规模培养更易操作,也降低了培养液自身带来的动物源性污染,提高产品的安全性。
(2)质粒转染
重组腺相关病毒(rAAV)载体包括ITRs携带目的基因功能区;AAV的Rep启动子和转录子系统Cap;腺相关病毒的辅助系统质粒是腺病毒的表面蛋白的基因,整个转染过程是包装质粒与HEK293共转染。当HEK293细胞培养到适当的密度,约占培养密度的80%左右,历时5天时间,将适量的rAAV质粒加入发酵罐中,进行转染培养。质粒行将转染时,发酵罐暂时停止转动,加入质粒后作轻微搅拌后,再停止一小时,再轻微搅拌几次,再停止一小时,在约5-6小时内,每小时作相同动作,使rAAV与HEK293细胞能很好地受到转染,直至大部分细胞受到转染。值得一提的是HEK293在发酵罐中培养的基本条件,尽量提供与体内生活条件相接近的培养环境,培养环境应具备以下几个因素:所有与细胞接触的设备、器材、溶液等,其中包括种子库细胞培养和放大培养及生产培养过程,都必须保持绝对无菌,避免细胞外微生物的污染,必须有充足的营养供应,绝对不能含有有害的物质,甚至极微量有害离子;保证有适量的氧气供应;及时清除细胞代谢产生的有害物质;有良好的适宜细胞生存的外界环境,包括渗透压、离子浓度、氨基酸浓度、氧分压、二氧化碳分压、葡萄糖浓度、pH值等,保持合适的细胞密度。
(3)营养更新(介质更新)
细胞在培养过程中由于细胞自我的代谢需要,将吸取营养物质,排出代谢产物,在大容量的培养过程中,要及时补充各种营养物质和氧气等,也要及时清除代谢产物如二氧化碳、氨等,特别在质粒转染前,要先更新和补充培养液,使质粒转染过程中,细胞能大多受到转染,增加转染率,进一步提高产量。
(4)细胞收集
当HEK293与rAAV质粒转染时,达到收集的时候时,将细胞全部收集。可收集程度的指标,依照抽样经显微镜下观察已有大量细胞产生报告基因Lacz比例,或肉眼观察,见大量细胞呈簇状,此时也可以收集细胞。将收集的细胞和培养液进行过滤或离心,富集细胞。
(5)细胞破壁和纯化
富集的细胞经匀浆机(或超声波)破壁,然后离心除去细胞碎片,作过柱的预处理,在快速纯化仪中快速过柱纯化,最后将病毒液转移至透析袋,在4℃下透析,后经安全性和生物活性检测,即得到所需的GMP条件下重组腺相关病毒载体的产品。
1.如权利要求所述的重组腺相关病毒载体的生产工艺,细胞生产培养系统由计算机全程控制的发酵罐进行。
2.如权利要求所述的重组腺相关病毒载体的生产工艺,细胞种植中的接种细胞为HEK293细胞,rAAV和HEK293细胞的繁殖和感染过程中,感染方法是质粒转染。HEK293与rAAV质粒转染率高达90%以上。
3.如权利要求所述的重组腺相关病毒载体的生产工艺,纯化技术采用AmershamBioscience Source 15Q或快速纯化技术。
4.如权利要求所述的重组腺相关病毒载体的生产工艺,产品以水剂(rAAV载体+保护液)和冻干的形式在4℃的冰箱或冰冻柜中保存、运输,以保证产品的生物活性。
5.如权利要求所述的重组腺相关病毒载体的生产工艺,重组体的目的基因是各种疾病有治疗作用的基因(DNA,RNA分子和寡核苷酸),其治疗范围包括:癌症、心脑血管疾病、老年性疾病、内分泌疾病、自身免疫性疾病、血液性疾病和遗传性疾病。
6.如权利要求所述的重组腺相关病毒载体(携带治疗基因)的产品的受试者是人。
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CNA2005100263455A CN1873012A (zh) | 2005-06-01 | 2005-06-01 | 重组腺相关病毒(rAAV)载体大规模生产新工艺 |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN102947453A (zh) * | 2010-01-28 | 2013-02-27 | 费城儿童医院 | 用于病毒载体纯化的可扩缩生产平台和用于基因治疗中的如此纯化的病毒载体 |
CN107245475A (zh) * | 2017-07-07 | 2017-10-13 | 广州派真生物技术有限公司 | 一种敲除aav受体的方法、敲除了aav受体的hek293细胞株及其应用 |
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2005
- 2005-06-01 CN CNA2005100263455A patent/CN1873012A/zh active Pending
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20061206 |