CN103203025A - 一种基因修饰的间充质干细胞在肺纤维化治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

一种基因修饰的间充质干细胞在肺纤维化治疗中的应用，涉及生物技术和基因治疗领域，包括骨髓或脐带来源的间充质干细胞(mesenchy mal stem cell，MSC)的体外分离培养和扩增，重组腺病毒Ad-HGF介导肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)体外修饰MSC。基因修饰的MSC移植C57小鼠，干预放射所致肺损伤和纤维化，其可减少肺泡腔多种蛋白的渗出，包括白蛋白、IgM等；可减轻肺脏局部炎症反应，并抑制TNF-α和可溶性ICAM-1等多种因子表达；可抑制促纤维化因子TGF-β、胶原蛋白基因col1α1和col 3α1的表达，减少肺组织胶原纤维的沉积。内源性HGF和及其受体cmet表达的结果，表明可诱导内源性HGF表达和内源性MSC归巢到损伤部位。因此，采用HGF修饰的MSC治疗多种病因引起的肺损伤及其纤维化意义重大。

Description

一种基因修饰的间充质干细胞在肺纤维化治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体为基因修饰间充质干细胞在肺纤维化治疗中的应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)在体内外可以诱导分化为多种细胞，可以改善多种损伤组织的结构与功能。MSC在多种肺脏损伤疾病中(包括肺纤维化)都体现出了其治疗潜能。在药物诱导的动物肺损伤模型中，通过血循环应用骨髓MSC能有效减轻肺脏损伤和纤维化。同时，MSC的以下特点使其在肺损伤引起的肺纤维化治疗中具有独特的优势：(1)无移植排斥反应：MSC属于免疫赦免细胞；(2)MSC可归巢至受损伤的肺脏局部，且可在刺激因子的作用下获得肺泡上皮细胞的表型；(3)调节炎性反应：MSC通过其免疫抑制功能(抑制免疫细胞如树突状细胞、T淋巴细胞、NK细胞等的激活)和改变细胞因子在疾病炎性过程中的表达谱(如抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等多种炎性细胞因子基因及蛋白的表达；抗炎性细胞因子IL-10、IL-4等分泌增多)来发挥其抗炎作用；(4)抗凋亡：通过释放细胞因子发挥其抗凋亡作用；(5)促血管生成：通过释放血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)，肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)，胰岛素样生长因子(insulin like growth factor，IGF-1)等来发挥其促进血管生成作用；(6)抑制纤维化相关基因和蛋白的表达：包括I型和III型胶原、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP-1)和金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP-1)等。

肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)是一种多功能的生长因子，它在体内参与并主导促血管生成、抑制纤维化、抑制细胞凋亡和抗炎等病理生理学过程，在肺脏修复过程中具有以下几方面的生理作用：(1)促进肺泡上皮细胞的增殖、迁移和形态发生而利于肺泡修复；(2)抑制炎症因子的表达：如可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)等；(3)抑制细胞凋亡：通过激活PI3K/Akt信号途径、SPK-S1P信号途径等来发挥其抗凋亡作用；(4)抑制纤维化效应：通过抑制促纤维化因子TGF-β的生成及其诱导的信号转导：激活β-catenin和p42/p44MAPK信号途径，诱导环加氧酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)表达，进一步促进前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)的产生来发挥抗纤维化作用；(5)促进血管生成：通过促进血管内皮细胞增殖及血管生成增加血液灌流，改善局部的血液供应与低氧发生。而近期研究报道，HGF重组蛋白可以预防缺血再灌注导致的肺脏损伤；肺泡管HGF基因高表达可以抑制博莱霉素导致的肺纤维化，表明HGF是防治肺损伤及其引起的纤维化的理想的细胞生长因子。

MSC和HGF均是防治肺损伤和纤维化的理想措施和手段。但是，它们的应用均存在局限性。MSC植入体内后脱离了特殊的培养环境，通过微循环渗透方式摄取营养，而营养所及范围在100-200μm之间。因此，90％以上的细胞在植入的几天内因营养缺乏而很快死亡，细胞并不能很好发挥其抗炎、抗凋亡、促增殖等功能。而重组HGF结构复杂，体内代谢快，为了获得HGF在损伤肺部的高浓度就需要持续大剂量给予重组蛋白。因此，采用基因治疗策略，用携带HGF的重组腺病毒修饰MSC治疗肺损伤及其引起的肺纤维化，具有干细胞治疗和细胞生长因子治疗的双重优势，并发挥协同作用。一方面通过血液循环移植，间充质干细胞最初大部分蓄留或归巢于损伤的肺脏，在发挥干细胞修复作用的同时，使局部高表达HGF，同时发挥HGF的生物学作用；而高表达HGF又可以促进骨髓MSC的存活、增殖以及内源性MSC的迁移和归巢，从而加强MSC的治疗效果。

发明内容

本发明的目的在于提供HGF基因修饰的间充质干细胞的新用途，即在肺损伤及其纤维化中的新应用。

本发明实现上述目的的技术方案是HGF修饰的间充质干细胞在放射性肺损伤及纤维化治疗中的应用。

本发明所属的HGF为人肝细胞生长因子，其基因序列记载于Miyazawa K，Tsubouchi H，Naka D，et al.molecular cloning and sequenceanalysis of cDNA for human hepatocyte growth fator.Biochem.Biophys.Res.Commun.1989，163(2)：967-973.；所述的间充质干细胞为骨髓或脐带来源间充质干细胞。

本发明所述的HGF修饰的间充质干细胞制备方法为：

(1)采用细胞内质粒DNA同源重组法制备重组腺病毒Ad-HGF：将人HGF基因克隆到穿梭质粒pXCJL1-cmv/pA的多克隆位点；然后与腺病毒载体GT4050通过脂质体共转染HEK293细胞，使其进行细胞内同源重组，于HEK293细胞包装获得重组腺病毒Ad-HGF。

(2)扩增Ad-HGF，并采用CsCl密度梯度离心进行纯化和滴度测定；

(3)分离、纯化骨髓或者脐带MSC，体外培养至第3代，Ad-HGF以150感染复数(MOI)的强度感染第3代MSC。

本发明获得的HGF修饰的MSC，分别采用ELISA检测HGF的表达；流式细胞术检测表面分子；Dy670染料法检测细胞增殖；缺氧模型检测细胞抗凋亡性能。

本发明采用HGF修饰的MSC干预放射性肺损伤及纤维化的方法是，于γ射线照射后1h内尾静脉注射HGF修饰的MSC。HGF修饰的MSC可以归巢到损伤肺脏的局部，并表达HGF。HGF不但能够发挥抗炎、抑纤维化、促肺泡上皮细胞增殖等生物学效应，还能促进移植的MSC细胞的存活和增殖，同时诱导内源性HGF的大量表达，并趋化内源性MSC聚集到损伤部位；而MSC则能够发挥其免疫调节作用，减轻损伤局部的炎症，包括抑制炎症因子和促纤维化因子的分泌等。在HGF和MSC的联合作用下，可有效减轻肺脏损伤，抑制胶原纤维的沉积，从而达到治疗目的。

附图说明

附图1穿梭质粒pXCJL1-cmv/pA-HGF构建图。

附图2Real-time PCR检测MSC治疗后肺脏局部人HGF的表达：MSCs-Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。

附图3流式细胞检测MSC细胞的表面分子：MSCs-Null为Ad-Null修饰的MSC；MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC；conrol为不标抗体的阴性对照。

附图4Dy670染色法检测MSC细胞的增殖能力：control为Dye670处理MSC细胞后即刻检测结果；MSCs-HGF 48h为感染Ad-HGF后48h检测结果；MSCs-HGF 96h为感染Ad-HGF后96h检测结果；MSCs-Null 48h为感染Ad-Null后48h检测结果；MSCs-Null 96h为感染Ad-Null后96h检测结果。

附图5HGF对MSC细胞凋亡的作用：1为常氧培养的MSC对照；2为低氧培养的Ad-Null感染的MSC细胞；3为低氧培养的Ad-HGF感染的MSC细胞。

附图6C57小鼠放射性肺损伤动物模型建立：A为正常对照的HE染色；B为照射后28天的HE染色；C为照射后6个月的HE染色；D为照射后6个月的天狼猩红染色。

附图7ELISA测定肺灌洗液中总蛋白、白蛋白和IgM(1个月)：A为总蛋白；B为白蛋白；C为IgM。radiation为PBS治疗组；MSCs-Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。

附图8ELISA测定血清中TNF-α表达结果：radiation为PBS治疗组；MSCs-Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。

附图9Real-time PCR检测MSC治疗1个月后肺脏局部TNF-α表达结果：MSCs-Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。

附图10ELISA测定血清中ICAM表达结果：radiation为PBS治疗组；MSCs-Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。

附图11MSC治疗后肺脏局部col1a1的表达：control为正常对照；radiation为PBS治疗组；MSCs-Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。

附图12MSC治疗后肺脏局部col3a1的表达：control为正常对照；radiation为PBS治疗组；MSCs-Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。

附图13ELISA检测小鼠血清中TGF-β的表达结果：radiation为PBS治疗组；MSCs-Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。

附图14Real-time PCR检测MSC治疗1个月后肺脏局部TGF-β的表达结果：MSCs-Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。

附图15HGF对照射诱导的肺泡上皮细胞凋亡的保护作用(治疗后14天)：A为正常对照；B为PBS治疗组；C为Ad-Null修饰的MSC治疗组；D为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。

附图16Real-time PCR检测肺脏局部内源性HGF表达的结果：Non-radiation为正常对照；radiation为PBS治疗组；MSCs-Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。

附图17免疫组化检测肺脏局部c-met表达的结果：A为PBS治疗28天；B为PBS治疗6个月；C为Ad-Null修饰的MSC治疗28天；D为Ad-Null修饰的MSC治疗6个月；E为Ad-HGF修饰的MSC治疗28天；B为Ad-HGF修饰的MSC治疗6个月。

附图18Real-time PCR检测肺脏局部c-met表达的结果：Non-radiation为正常对照；radiation为PBS治疗组；MSCs-Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。

附图19Real-time PCR检测肺脏局部的S1P受体表达的结果：A为S1P受体1；B为S1P受体3；C为S1P受体5。radiation为PBS治疗组；MSCs-Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。28days为治疗后28天；6months为治疗后6个月。

具体实施方式

实施例1重组腺病毒-肝细胞生长因子(Ad-HGF)的制备和纯化

其方法是目的基因将人HGF基因克隆到穿梭质粒pXCJL1-cmv/pA的多克隆位点，获得pXCJL1-cmv/pA-HGF；然后与腺病毒载体GT4050通过脂质体共转染HEK293细胞，使其进行细胞内同源重组，于HEK293细胞包装获得重组腺病毒Ad-HGF。基因组水平鉴定正确后，进行扩增、纯化和滴度测定。

(1)穿梭质粒pXCJL1-cmv-HGF的构建：

首先用PCR方法从人胎盘cDNA文库中扩增肝细胞生长因子cDNA，将PCR产物克隆至pBluescript SK(pSK)载体的BamHI和SalI酶切位点中，命名为pSK-HGF。以限制性内切酶Apa I酶切质粒pBLUESCRIPTSK-HGF后，用DNA聚合酶Klenow大片段将该端补平，然后再用Not I酶切，回收大小约2.2kb的DNA片段(HGF cDNA)；将HGF cDNA克隆至pXCJL1-CMV/pA载体的Hind III和Not I位点之间，从而获得携带人肝细胞生长因子基因表达盒以及腺病毒基因组左端序列的穿梭质粒pXCJL1-CMV/pA-HGF(如附图1)。根据pXCJL1-CMV/pA的酶切图谱和结构图谱，结合pXCJL1-CMV/pA-HGF的构建过程，用Hind III和Sal I双酶切pXCJL1-CMV/PA-HGF，0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，进行鉴定。

(2)重组腺病毒Ad-HGF的制备、纯化和滴度测定

通过脂质体介导的方法使鉴定正确的穿梭质粒pXCJL1-CMV/HGF/P和腺病毒质粒GT4050共转染293细胞，使其进行细胞内同源重组，产生重组腺病毒。普通显微镜观察细胞形态改变，9天可见噬斑形成，并逐渐扩大，直至12d出现完全病变。收集细胞和上清，反复冻溶3次后收集上清，获得重组腺病毒Ad-HGF。采用Hirt法提取病毒基因组DNA，并经PCR鉴定正确。经大量扩增后，采用氯化铯密度梯度离心纯化，并保存于10％甘油的Hank’s液中备用。

紫外分光光度计法(波长260nm)和有限稀释法(Median TissueCulture Infective Dose，TCID50)分别测定辅助腺病毒Ad5/F11p-HV的颗粒滴度(Viral Particle Units per Milliliter，vp/ml)，纯度(OD260nm/280nm)和感染滴度(Infection Units per Milliliter，IU/ml)。结果如表1所示。

表1重组腺病毒Ad-HGF的纯度和滴度测定结果

实施例2骨髓间充质干细胞的分离、培养、扩增和基因修饰

(1)骨髓间充质干细胞分离培养

肝素抗凝的正常人骨髓用1ml注射器过滤后，加入PBS稀释骨髓，充分混匀，按照1∶1比例将骨髓细胞悬液小心加于淋巴细胞分离液Ficoll液面之上，1600rpm离心30min；吸出单个核细胞层，用两倍体积的PBS稀释，混匀，2000rpm离心8min；用PBS再洗细胞1次；用完全培养基(α-MEM+10％FBS)重悬细胞计数后按2×10⁵cells/cm²密度分瓶培养；72h后换液，去除未贴壁细胞。以后每3-4天换液。细胞生长至80％汇合时，胰酶消化传代，记为第1代(P1)，当传代至第3代时，可用于本实验研究。

(2)脐带间充质干细胞分离培养

将新鲜脐带放入大培养皿中，PBS冲洗2遍，洗净表面血液。去除羊膜及血管：用组织剪将脐带剪成2cm左右的小段，每段用眼科剪纵向剖开，用血管钳去除脐带内三根血管(两条动脉、一条静脉)，同时去除脐带外层羊膜。将分离好的脐带用眼科剪剪成约1mm³大小的组织块，取适量放入无菌培养皿中，覆盖70％培养皿的底面积。加入含10％胎牛血清的Alpha-MEM培养基，左右摇晃1min，使组织块分散均匀。放入5％CO²37℃培养箱中培养。第5天半量换培养基，继续培养10天左右有长梭形细胞从组织块边缘长出；14天左右待细胞团长至约50％时倒掉组织块，同时收集细胞传代培养。

(3)人间充质干细胞表面分子检测

采用流式细胞术检测分离得到的人间充质干细胞表面分子，结果显示CD29、CD73、CD166及HLA I类分子(HLA-ABC)的表达率在95％以上，CD105表达率为22％左右；而HLA II类分子(HLA-DR)、内皮细胞标志CD31、血细胞标志CD34和CD45则成阴性，以上结果证实我们获得的细胞具有间充质干细胞的性质。

(4)人间充质干细胞分化能力检测

成骨分化能力检测：

将对数生长期培养细胞接种于24孔细胞培养板(1.5×104cells/孔)，加入标准诱导剂(Dex 100nM+β-GP 10mM+AsAP 0.05mM)进行成骨分化诱导，每3天换液，第14天应用BCIP/NBT染色试剂盒进行碱性磷酸酶(ALP)染色、应用4-NPP法检测ALP活性，第21天应用邻甲酚酞络合酮比色试剂盒检测钙沉积。结果显示，诱导后ALP活性和钙沉积俊明显提高，提示有大量成骨细胞生成。

成脂肪分化能力检测：

将对数生长期培养细胞接种于24孔细胞培养板(1.5×10⁴cells/孔)，加入标准诱导剂(Dex 1uM+IBMX 0.5mM+消炎痛100uM)进行脂肪分化诱导，每3天换液，第8天进行Oil-Red O染色，结果可见脂滴均呈红色深染，说明有大量脂肪细胞生成。

成软骨分化能力检测：

应用微滴培养方法进行软骨分化诱导将浓缩的细胞悬液10ul(8×10⁶cells/ml)滴至6孔细胞培养板中心处，置于37℃贴壁2h，将软骨分化诱导液(α-MEM+1％FBS+6.25ug/ml胰岛素+50nM维生素C磷酸盐+10ng/ml TGF-β1+1％抗生素)轻轻覆盖于细胞团上，诱导维持2周。然后进行阿辛蓝染色。结果显示，其具有软骨分化能力。

(5)MSC的体外修饰

重组腺病毒Ad-HGF以150MOI感染第四代MSC。

实施例3HGF修饰的MSC生物学性能检测

150MOI Ad-HGF感染MSCs后48h，ELISA检测HGF的表达水平；流式细胞术检测细胞表面分子的改变；Dy670染料法检测细胞增殖能力的改变；低氧诱导模型检测HGF的抗凋亡效应。

(1)HGF表达水平检测

Ad-HGF感染MSCs后，采用ELISA检测HGF的表达，结果显示，Ad-HGF感染后，HGF的表达水平逐渐升高，直至第7天(如附图2所示)。

(2)HGF修饰对MSC细胞表面分子的影响

采用流式细胞术检测多种表面分子CD29、CD73、CD166、HLA-AB、CD105、HLA-DR、CD31、CD34和CD45的表达，结果表明，感染Ad-HGF对MSC表面分子的表达没有影响(如附图3所示)。

(3)HGF修饰对MSC增殖能力的影响

Dy670染料检测Ad-HGF感染后MSC的增殖能力。结果表明，感染Ad-HGF对MSC的增殖能力没有影响(如附图4所示)。

(4)HGF的抗凋亡效应

在1％氧含量的条件下培养MSC，建立凋亡诱导模型，结果显示，1％氧培养2h可诱导MSC凋亡，而Ad-HGF修饰后，可明显降低其凋亡细胞比例(如附图5所示)。

实施例4HGF修饰的MSC对放射性肺损伤和纤维化的治疗作用

首先，采用γ射线照射建立放射性肺损伤和纤维化模型；然后，采用尾静脉注射方式，于照射后1h内给予HGF修饰的MSC进行治疗；分别于照射后1d、3d、7d、14d、28d和6m，观察HGF的表达、组织病理改变、炎症因子表达改变等。

(1)C57小鼠放射性肺损伤和纤维化模型的建立

以6-8周雌性C57小鼠为研究对象，采用20Gyγ射线于肺脏局部单次照射。组织病理切片检测表明，20Gyγ射线照射后28天，可见大量炎细胞的浸润；而在照射后6个月，可见肺间隔增宽和肺泡腔狭窄，天狼猩红染色表明，有大量胶原纤维沉积。结果表明，成功建立放射性肺损伤和纤维化模型(如附图6所示)。

(2)HGF修饰的MSC干预放射性肺损伤和纤维化

照射后1h内，采用尾静脉注射方式，分别将1×10⁶Ad-HGF、Ad-Null或Ad-Luciferase修饰的MSC移植给C57小鼠，以PBS作为对照。

(3)HGF修饰的MSC的肺脏归巢作用

结果显示，Ad-Luciferase感染的MSC移植后，可归巢到肺脏局部。且与正常对照相比，Ad-Luciferase感染的MSC归巢到放射损伤小鼠的肺脏局部的数量更多，存活时间更长。

(4)HGF修饰的MSC对肺渗透性的保护作用

结果表明，Ad-Null和Ad-HGF修饰的MSC可以减少照射引起的蛋白渗出，其中Ad-HGF的效果更佳(如附图7所示)。

(5)HGF修饰MSC的抗炎作用

结果显示，Ad-Null和Ad-HGF修饰的MSC均有一定的抗炎效应，如降低血清和肺脏局部的炎症因子表达，包括TNF-α和ICAM-1等。但是，HGF修饰的MSC具有更强的抗炎效应(如附图8-10所示)。

(6)HGF修饰MSC的抑纤维化作用

结果显示，Ad-HGF修饰的MSC能够减少肺脏组织胶原的沉积，降低I型和III型胶原的表达水平(如附图11和12所示)。此外，还能降低局部和血清中促纤维化因子TGF-β的表达水平(如附图13-14所示)。

上述结果表明，HGF修饰的MSC比Ad-Null修饰的MSC具有更强的治疗效果，其中，抗炎和抑制纤维化是其主要方式。

实施例5HGF修饰的MSC治疗放射性肺损伤和纤维化的机制

通过检测HGF修饰MSC治疗后，肺脏上皮细胞凋亡的改变，内源性HGF表达、HGF受体c-met表达和S1P受体的改变，初步探索其机制。

(1)HGF修饰MSC可明显降低肺脏上皮细胞的凋亡

结果显示，γ射线局部照射可引起肺上皮细胞的大量凋亡，而Ad-Null和Ad-HGF修饰的MSC可减轻其凋亡，且HGF修饰的MSC具有更强的抗凋亡效应(如图15所示)。

(2)HGF修饰MSC治疗可提升内源性HGF和HGF受体的表达

结果显示，Ad-Null和Ad-HGF修饰MSC的治疗，可诱导小鼠内源性HGF的表达，其中HGF修饰MSC的表达水平更高(附图16所示)。此外，HGF的受体c-met的表达量也大幅提升(附图17-18所示)。

(3)HGF修饰MSC治疗可提高局部S1P受体1的表达

SPK-S1P信号是HGF发挥生物学功能的主要信号通路。结果表明，HGF修饰MSC治疗后，肺脏局部S1P受体1表达水平明显上升，而其他受体的表达没有明显改变(如附图19所示)。

上述结果表明，HGF修饰的MSC治疗放射性肺损伤和纤维化，可能通过诱导内源性HGF和HGF受体的表达，进而通过SPK-S1P信号通路发挥抗凋亡、抑制纤维化及促增殖等效应。

综上所述，HGF修饰的MSC可归巢到损伤肺脏的局部，并表达HGF。通过分泌多种细胞因子发挥抗炎、抑纤维化、促肺泡上皮细胞增殖等生物学效应；同时诱导内源性HGF的大量表达，并趋化内源性MSC聚集到损伤部位，修复受损肺脏局部。总之，HGF和MSC可在肺损伤及其引起的纤维化治疗中，发挥协同效应。

Claims (3)

1.HGF基因修饰的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)在肺损伤及纤维化治疗中的应用；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，治疗肺损伤及纤维化的MSC来源于脐带或骨髓，并通过感染150MOI的重组腺病毒获得HGF修饰的MSC；

3.根据权利要求2所述的肺损伤及纤维化，包括放射性肺损伤、矽肺、尘肺等多种急、慢性肺损伤。

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