JP4988559B2 - 細胞の調製 - Google Patents
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Description
本発明は、閉鎖系での形質導入及び遺伝子改変型細胞の選択のための方法に関する。
現在、通常は形質導入及び遺伝子改変型細胞の選択に開放系が使用されている。しかし、係るシステムは時間がかかるものであり得、かつかなりの汚染リスクに関連し得る。これは特に、細胞を臨床設定で用いる予定である場合、及び高用量が要求される場合である。係る要求の一例は、同種骨髄移植に使用するための、ドナーT細胞の製造である。
本発明は、閉鎖系で細胞を操作しかつ培養する方法を提供することによって上記問題を回避する。開放系から閉鎖系への転換により、生産物のスケールアップ及び臨床用途のための生産物の安全性の改善が可能になる。
(i)場合により該細胞を解凍すること;
(ii)場合により該細胞を刺激すること;
(iii)該細胞に遺伝子構築物を形質導入すること;
(iv)形質導入した細胞を選択すること;及び
(v)該形質導入した細胞を増殖しかつ回収すること、
を含み、その際、ステップ(i)〜(v)を閉鎖系で実施する、上記方法が提供される。
1)臨床グレードの閉鎖使い捨てキット(Cell Washer Disposable Set, Baxter, コードR4R9811)で細胞操作するためのCytoMateTM Cell Processing System(Nexell Therapeutic Inc.の商標)(Baxter, コードR4R9860);
2)形質導入細胞の選択のためのIsolexTM 300 Magnetic Cell Separation System。
解凍後の、ドナーリンパ球からのDMSOの洗い出し
本発明は、臨床グレードの閉鎖使い捨てキットで細胞操作用の装置を用いることにより、完全な閉鎖系で細胞操作しかつ培養する方法を提供する。
5つの実験の内の4つにおけるサンプルの出発量は15〜20mlの範囲であり、わずか1つの実験のみ、出発サンプルは解凍バッファーで100mlの総量まで希釈した。
バッグ又はフラスコにおける、異なるリンパ球刺激の細胞増殖への効果
閉鎖系での細胞増殖を評価するために、異なる方法(いずれも組換えIL-2の存在下でOKT(登録商標)3(Orthoclone, Janssen-Cilag S.p.A.)及びDynabeads(登録商標)CD3/CD28 T細胞Expander(Dynal Biotech, コード番号111.31)による)でリンパ球を刺激する幾つかの実験を行った。例えば可溶性CD3/CD28抗体又は異なるサイトカインカクテルによる別の刺激を考慮することができる。
細胞形質導入用のベクター
遺伝子療法のための遺伝子改変型細胞の製造に導く全ての実験はレトロウイルスベクターを用いて実施した。
開放系におけるレトロウイルスベクターによる形質導入ステップは、臨床研究において実施され、また本発明者らの、スピノキュレーションプロトコールを用いた遺伝子改変型細胞の製造の開放系方法においても実施される。
リンパ球形質導入
細胞刺激後の第2ステップは細胞形質導入である。
実施例1に詳細に記載されるように、本発明の一態様は、臨床グレードの閉鎖使い捨てキットで細胞操作用の装置を用いた、完全な閉鎖系での細胞操作及び培養方法を提供する。
形質導入後のリンパ球培養
レトロウイルス上清との24時間のインキュベーション後、細胞培養のために細胞を回収し、バッグ中の細胞培地に懸濁した。培養培地は刺激に使用されるものと同一である:自己由来の血漿3%、グルタミン1%及びIL-2(範囲:100〜600 IU/ml)で補充したX-Vivo 15。
このステップでは、細胞の洗浄及び濃縮が、濾過済み洗浄バッグ、バッファーバッグ及び廃棄バッグに接続されたスピニング・メンブレンからなる滅菌の使い捨てセットで、実施例4に記載されるように実施される。形質導入されたリンパ球を含むサンプルバッグ及び細胞培養のための最終バッグがこのセットに無菌的に接続される。既に言及したように、このシステムはGMP環境での細胞の処理を可能にする。
先の実施例で記載されるように、形質導入ステップ後、2日間の培養の間に、遺伝子改変した部分集団はΔLNGFR細胞表面分子を発現する。この分子は磁気ビーズシステムを用いて遺伝子改変型部分集団の選択を可能にする。
本願の開示は閉鎖系で以下のステップを実施するためにCytoMateTMを用いる:培養培地の洗い出し及び細胞濃縮、細胞懸濁液の抗NGFレセプター抗体とのインキュベーション、過剰な抗体の洗い出し並びにビーズインキュベーションのための細胞の濃縮。
感作細胞(抗NGFレセプターと共にインキュベートした)である先のプロセスの最終産物は、今度はバッグ中で濃縮される。このバッグは、常磁性マイクロスフィア(ビーズ)及び磁石を備えた装置(磁気細胞分離機)を用いた選択ステップを開始するために、第2の管材セットと無菌的に接続することができる。無菌の非発熱性使い捨てセットは孔のある円筒型の150mlチャンバーから成る。このチャンバーは2つの管材システム(吸い込み管路及び吐き出し管路)を具備するY字接合子を通じてボトムに恒久的に接続される。いずれの管路も2つの釘接続部を有し、これは細胞懸濁液を含有するバッグ(サンプルバッグ)とワーキングバッファーを含有するバッグとを吸い込み管路を通じてこのチャンバーへ取り付けるための接続部、及び最終細胞収集バッグと廃棄バッグとを吐き出し管路を通じてチャンバーへ取り付けるための接続部である。
サンプルの出発量は、約80mlに予め洗浄したビーズの添加量を加えた総量約100mlを洗浄する、CytoMateTMにより実施される洗浄及び感作ステップに左右される。130mlの量は、管材セットチャンバーの量が150mlであることから過剰とすべきではない。20mlの残存量が細胞とビーズとの良好な混合に必要とされる。
Dynabeads(登録商標)(Baxter)M-450ヒツジ抗マウスIgGは、その表面に共有結合した精製された親和性ヒツジ抗マウスIgGを有する、常磁性のポリスチレンビーズである。滅菌の非発熱性懸濁液はex-vivo用途のみである。このため、ビーズは細胞懸濁液から除去する必要がある。上述したように、選択の翌日にロゼット細胞は細胞培地にビーズを放出する。その後、細胞懸濁液は細胞培養物からビーズを除去するために磁気細胞分離システムで処理される。
選択後のリンパ球培養
ビーズの分離後、細胞は24時間培養される。選択した集団の均一性を試験するために、細胞がトリパンブルー染色を用いてカウントされ、ΔLNGFR発現がFACS分析によって評価される。
このステップでは、最終産物が回収され、培養培地を排除するために洗浄され、そしてその後、患者へ注入するために又は将来の注入用に凍結するために、50〜60mlの最終量で濃縮される。
開放系と閉鎖系の比較
先の実施例で詳細に記載されるように、本発明は臨床用途のために標準化された安全な閉鎖系での形質導入及び遺伝子改変型細胞の選択方法を提供する。
Claims (15)
- 遺伝子構築物をT細胞に形質導入し、遺伝子改変した細胞を選択する方法であって、閉鎖系で形質導入及び選択を実施することを含み、流体の手動輸送なく、自動化流体管理装置を用いて、前記細胞を洗浄し、濃縮し、形質導入し、及び再懸濁し、且つ常磁性ポリスチレンビーズを使用する形質導入した細胞の免疫磁気選択を含み、前記ビーズは前記細胞の免疫グロブリン選択後に該細胞から除去される、上記方法。
- T細胞を改変する方法であって、
(i)前記細胞に遺伝子構築物を形質導入すること;及び
(ii)ポリスチレンビーズを使用する免疫磁気選択を用いて形質導入した細胞を選択すること、ここで前記ビーズは前記細胞の免疫グロブリン選択後に該細胞から除去される;
を含み、その際、ステップ(i)及び(ii)を閉鎖系で実施し、且つ流体の手動輸送なく、自動化流体管理装置を用いて、前記細胞を洗浄し、濃縮し、形質導入し、及び再懸濁する、上記方法。 - ステップ(i)前に、閉鎖系において前記細胞を解凍し、及び/又は前記細胞を刺激することを含む、請求項2に記載の方法。
- ステップ(ii)後に、閉鎖系において前記形質導入した細胞を増殖し、且つ回収することを含む、請求項2又は3に記載の方法。
- 遺伝子構築物がレトロウイルスベクターである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- レトロウイルスベクターがMLV由来のベクターである、請求項5に記載の方法。
- レトロウイルスベクターが細胞表面マーカーをコードする、請求項5又は6に記載の方法。
- 細胞表面マーカーがΔLNGFRである、請求項7に記載の方法。
- 前記方法がフィブロネクチン又はそのキモトリプシン断片を用いた形質導入ステップを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法がヒトフィブロネクチンの組換えペプチドを用いた形質導入ステップを含み、該組換えペプチドがCH-296である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が単一の装置を使用するものである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、細胞濃縮、細胞洗浄、形質導入、培地交換及び形質導入細胞の免疫磁気選択用の2以上の装置を使用するものである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、
(I)細胞濃縮、細胞洗浄、形質導入及び培地交換用の第1装置;及び
(II)形質導入細胞の免疫磁気選択用の第2装置、
を使用するものである、請求項12に記載の方法。 - 装置間の細胞の輸送を密閉バッグ及び無菌接続を用いて実施する、請求項12又は13に記載の方法。
- 段階的に使用者が規定可能なプログラミングを可能にする完全な閉鎖系において、スピニング・メンブレンが、バッファーの向流循環に対して細胞濾過を保証し、且つ異なるバッグへ接続される、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
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