ES2242941T3 - Celulas madre indiferenciadas programables de origen monocitario, su obtencion y uso. - Google Patents
Celulas madre indiferenciadas programables de origen monocitario, su obtencion y uso.Info
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Abstract
Proceso para la producción de células madre indiferenciadas programables de origen monocitario humano, CARACTERIZADO PORQUE consiste en: (a) Multiplicar los monocitos de sangre humana aislada en un medio de cultivo adecuado que contiene el factor de crecimiento celular M-CSF, ; (b) Cultivar los monocitos durante o después de la etapa a) con un medio de cultivo que contiene IL-3; y (c) Obtener las células madre humanas adultas indiferenciadas programables, separando las células del medio de cultivo.
Description
Células madre indiferenciadas programables de
origen monocitario, su producción y uso.
La invención se refiere a células madre adultas
indiferenciadas programables, derivadas de monocitos humanos, así
como su producción y su uso para la producción de células y tejidos
corporales. Según una forma de realización particularmente preferida
de la invención, estas células son células madre humanas autólogas,
es decir que la célula de origen monocitario procede del mismo
paciente que debe ser tratado con la célula madre producida a partir
de la célula de origen o con las células corporales producidas a
partir de esta célula madre.
En el estado actual de la técnica, el término
"células madre" designa las células que:
(a) tienen capacidad de autorrenovación y
(b) tienen capacidad de formar por lo menos uno y
en muchos casos numerosos tipos de células especializadas gracias a
su capacidad de división asimétrica (véase Donovan, P.J., Gearhart,
J., Nature 414: 92-97 (2001)). El término
"pluripotente" designa las células madre que pueden
diferenciarse esencialmente en todos los tipos de células posibles
del cuerpo humano y animal. Hasta ahora, tales células madre sólo se
pueden obtener a partir de tejidos embrionarios o de carcinomas
embrionarios (tumor testicular) (véase Donovan, P.J., Gearhart, J.,
véase más arriba). El uso de células madre embrionarias ha sido
objeto de muchos debates públicos, especialmente en Alemania y es
considerado extremadamente problemático. Además de la problemática
ética y jurídica relacionada con las células madre embrionarias,
también el uso terapéutico de tales células se encuentra con
dificultades. En la naturaleza, las células madre embrionarias
proceden de organismos donadores, que son heterólogas con respecto a
los potenciales receptores de las células o tejidos diferenciados
(denominados en lo sucesivo células diana o tejidos diana
somáticos), desarrollados a partir de estas células. Por tanto, es
previsible que tales células diana inicien en los receptores
potenciales una respuesta inmunológica inmediata de rechazo.
Las células madre también se pueden aislar de
diferentes tejidos de individuos adultos, es decir diferenciados. En
el estado actual de la técnica, tales células madre se denominan
"células madre adultas multipotentes". Desempeñan un papel en
la regeneración de tejidos y en la hemostasis corporal. La
diferencia sustancial entre las células madre embrionarias
pluripotentes y las células madre adultas multipotentes radica en la
cantidad de tejidos diferenciados que se pueden obtener de las
respectivas células. La causa de esto es, probablemente, que las
células madre pluripotentes proceden de espermatozoides o de células
que pueden producir esperma, mientras que las células madre adultas
multipotentes proceden del cuerpo o del soma de individuos adultos
(véase Donovan, P.J., Gearhart, J., véase más arriba, pág.94), que
no son aptas para producir esperma.
Sin embargo, la verdadera problemática en torno a
la obtención y el uso de células madre adultas reside en la rareza
de estas células. Por ejemplo, en la médula ósea sólo se encuentran
células madre en una proporción de 1:10.000, en la sangre
periférica, de 1:250.000 y en el hígado en una proporción de
1:100.000. Por lo tanto, la obtención de tales células madre es muy
trabajosa y gravosa para el paciente. Por otra parte, hasta ahora no
es posible generar grandes cantidades de células, como las que se
requieren para la terapia clínica, con gastos aceptables.
A esto se contrapone una demanda constantemente
creciente de posibilidades de tratamiento de ingeniería de tejidos
para tejidos destruidos o de terapias celulares con el fin de
sustituir células epiteliales, musculares, de los músculos
cardíacos, del hígado, de islote, nerviosas, neuronas, óseas, de
cartílagos, endotelios y adiposas.
En este contexto, es determinante el desarrollo
previsible del perfil de edad y enfermedades de la población del
mundo occidental, lo que lleva a esperar un cambio drástico en los
próximos diez años en el sector de la sanidad de la población de
Europa occidental, incluyendo Estados Unidos y Canadá. Sólo en la
República Federal de Alemania, el desarrollo demográfico prevé para
el año 2015, un aumento de 21% de la población de
45-64 años de edad y de 26% en la franja de edades
de más de 65 años. Esto permite suponer un cambio de la estructura
de la población de pacientes y de la variedad de enfermedades que
necesitarán tratamiento. Previsiblemente, aumentará el número de
enfermedades del sistema cardio-vascular
(hipertensión, infarto de miocardio), las enfermedades vasculares
por ateroesclerosis y afecciones del metabolismo, enfermedades
metabólicas como diabetes mellitus, enfermedades metabólicas
hepáticas, enfermedades funcionales renales, así como enfermedades
del esqueleto óseo y los cartílagos provocadas por degeneración
condicionada por la edad y enfermedades degenerativas del cerebro
por pérdida de células neuronales y gliales y requerirá conceptos de
tratamiento innovadores.
Estos datos explican los inmensos esfuerzos
nacionales e internacionales de investigación y desarrollo por parte
de especialistas para obtener células madre que puedan ser
programadas para actuar como células diferenciadas características
de tejidos (hígado, huesos, cartílagos, músculos, piel, etc.).
Por lo tanto, el objeto de la invención es
obtener células madre adultas cuya generación no provoque problemas
éticos y/o jurídicos, que se puedan obtener rápidamente para su uso
en terapias programadas en las cantidades necesarias y con costes de
fabricación aceptables y que al ser usadas como "terapéutico
celular" no provoquen o sólo provoquen efectos secundarios
insignificantes en el paciente tratado en cuanto a rechazo celular e
inducción de tumores, especialmente de tumores malignos.
Según la invención, este objeto se resuelve por
medio de la preparación de células indiferenciadas programables a
partir de monocitos humanos que a continuación se denominan
"células madre" para los propósitos de la invención. El término
"indiferenciación" es conocido para el experto en la técnica
correspondiente, véase por ejemplo Weissman I.L., Cell 100:
157-168, Figura 4, (2000). Significa la restitución
de una célula corporal adulta ya especializada (diferenciada) al
estado de célula madre, es decir de una célula que a su vez puede
ser convertida (programada) en varios tipos de células.
Sorprendentemente se ha comprobado que el procedimiento según la
invención produce la indiferenciación de monocitos. Las células
madre producidas de esta manera pueden ser convertidas (programadas)
en numerosas células diana o tejidos diana diferentes, véanse los
ejemplos. Las células madre según la invención expresan, además del
antígeno de superficie CD14, característico de los monocitos
diferenciados, por lo menos uno, preferentemente dos o tres, de los
marcadores de pluripotencia típicos CD90, CD117, CD123 y CD135. De
manera particularmente preferida, las células madre producidas según
la invención expresan tanto el antígeno de superficie CD14 como
también los cuatro marcadores de pluripotencia CD90, CD117, CD123 y
CD135, véase ejemplo 2, tabla 1. Preferentemente, las células madre
humanas de la invención expresan el antígeno de superficie
monocito-específico asociado a la membrana CD14 y
por lo menos un marcador de pluripotencia del grupo formado por
CD117, CD123 y CD135. Más preferentemente Más preferentemente, las
células madre de la invención expresan un antígeno CD14 en
combinación con por lo menos el marcador de pluripotencia CD123 y/o
CD135. Menos de 3% y preferentemente menos de 1% de las células
madre según la invención expresan el antígeno CD34. Más
preferentemente, ninguna de estas células madre de la invención
expresan el antígeno CD34.De esta manera, se obtienen por primera
vez células madre adultas que en poco tiempo pueden ser
reprogramadas en tejidos, preferentemente autólogos.
La generación de las células madre de la
invención es absolutamente inofensiva para el paciente y, en caso de
utilización autóloga, es comparable a una autotransfusión. La
cantidad de células madre necesarias para las opciones terapéuticas
habituales (véase más arriba) (10^{8} a 10^{9} células) puede
prepararse de manera rentable en los 10 a 14 días posteriores a la
extracción de la sangre. Por otra parte, el producto celular
previsto para la terapia no provoca problemas inmunológicos, es
decir de rechazo en tratamientos autológicos, ya que preferentemente
las células y el receptor son genéticamente idénticos.
Asimismo, las células madre de la invención
demostraron no ser peligrosas en cuanto a la formación de malignomas
en experimentación y cultivos animales, un resultado que sólo se
debe al origen monocitario de la célula, de la cual derivan las
células madre de la invención.
Las etapas esenciales del procedimiento según la
invención para la producción de células madre indiferenciadas
programables de origen monocitario humano comprenden:
- (a)
- Aislar monocitos de sangre humana;
- (b)
- Multiplicar los monocitos en un recipiente de cultivo adecuado que contiene un medio de cultivo celular, el cual contiene el factor estimulante de colonias de macrófagos (denominado a continuación, M-CSF) y
- (c)
- Cultivar los monocitos en presencia de interleucina 3 (IL-3);
- (d)
- Obtener las células madre humanas indiferenciadas programables, separando las células del medio de cultivo.
De acuerdo con una forma de realización
particularmente preferida del procedimiento se agrega
M-CSF y IL-3 simultáneamente al
medio de cultivo celular en la etapa b).
Sin embargo, también es posible, solo
inicialmente, agregar M-CSF al medio de cultivo
celular en la etapa b) con el fin de multiplicar los monocitos y
agregar posteriormente IL-3 al medio de cultivo
celular.
Finalmente, el proceso de la etapa b) puede
desarrollarse de manera tal que, primeramente se multiplican los
monocitos en un medio de cultivo celular que solamente contiene
M-CSF, luego se separa el medio de las células y, a
continuación, se usa un segundo medio de cultivo celular que
contiene IL-3.
De acuerdo con una forma de realización preferida
de la invención, el medio de cultivo de la etapa b) se separa de las
células adheridas en el fondo del recipiente de cultivo y se
obtienen las células madre humanas indiferenciadas programables,
desprendiendo y aislando las células del fondo.
De acuerdo con una forma de realización preferida
de la invención, las células se cultivan además luego en presencia
de un compuesto de azufre. El cultivo puede realizarse en una etapa
separada del proceso, a continuación de la etapa de cultivo b)
descrita más arriba. Sin embargo, también puede llevarse a cabo en
la etapa b), agregando también el compuesto de azufre al medio de
cultivo, preferentemente al iniciar el cultivo.
Sorprendentemente el proceso de la invención
provoca la indiferenciación de los monocitos, con lo cual las
células madre adultas resultantes de la indiferenciación expresan,
además del antígeno de superficie CD14, típico de los monocitos
diferenciados, también por lo menos uno o más, preferentemente todos
los marcadores de pluripotencia CD90, CD117, CD123 y CD135 (véase
tabla 1). Preferentemente, las células madre de la invención
expresan el antígeno de superficie
monocito-específico asociado a la membrana CD14 y
por lo menos un marcador de pluripotencia del grupo formado por
CD117, CD123 y CD135. Más preferentemente, las células madre de la
invención expresan en antígeno CD14 en combinación con por lo menos
el marcador de pluripotencia CD123 y/o CD135. Menos de 3% y
preferentemente menos de 1% de las células madre de la invención
expresan el antígeno CD34. Con especial preferencia, ninguna de las
células madre de la invención expresan el antígeno CD34.
La expresión de los respectivos marcadores
(antígenos de superficie) puede probarse con anticuerpos
comercializados que tengan especificidad contra los respectivos
antígenos que se deben detectar y usando procedimientos de
inmunoensayo habituales, véase ejemplo 2.
Dado que durante el proceso de multiplicación e
indiferenciación las células se adhieren al fondo del respectivo
recipiente de cultivo, es necesario separar las células del medio de
cultivo de la etapa b) y desprenderlas del fondo después de terminar
la indiferenciación. Según una forma de realización preferida de la
invención, se desecha el sobrenadante del cultivo celular antes de
desprender las células adheridas al fondo y, a continuación, se
realiza preferentemente un lavado de las células adheridas con un
medio de cultivo fresco. Después del lavado se agrega nuevamente
medio de cultivo fresco sobre las células adheridas en el fondo, y
luego se procede a desprenderlas del fondo (véase ejemplo 13).
Según una forma de realización preferida, las
células se ponen en contacto con un disolvente orgánico
biológicamente aceptable, al final de la etapa c) y antes de la
etapa d). El disolvente orgánico, biológicamente aceptable puede ser
un alcohol con 1-4 átomos de carbono, prefiriéndose
el uso de etanol.
En otra forma de realización, al final de la
etapa c) y antes de la etapa d), las células se ponen en contacto
con la fase de vapor del disolvente orgánico biológicamente
aceptable.
Por otra parte, el desprendimiento también puede
llevarse a cabo de manera mecánica, aunque se prefiere un
procedimiento desprendimiento enzimático, por ejemplo con
tripsina.
Las células madre indiferenciadas programables
obtenidas de esta forma, que flotan libremente en el medio pueden
ser llevadas directamente al proceso de reprogramación o permanecer
algunos días en el medio de cultivo; en este último caso puede
agregarse al medio preferentemente una citoquina o LIF (factor
inhibidor de leucemia), para evitar la pérdida prematura de la
capacidad de programación (véase Donovan, P. J., Gearhart, J., véase
más arriba, página 94). Finalmente, las células pueden ser
congeladas para ser almacenadas sin perder su capacidad de
programación.
Las células madre según la invención se
diferencian de las células madre pluripotentes de origen embrionario
conocidas hasta ahora y de las células madre adultas conocidas de
diferentes tejidos porque, además del antígeno de superficie
monocito-específico asociado a la membrana
CD-14 tienen por lo menos un marcador de
pluripotencia del grupo formado por CD90, CD117, CD123 y CD135 en su
superficie.
Preferentemente, las células madre de la
invención expresan el antígeno de superficie
monocito-específico asociado a la membrana CD14 y
por lo menos un marcador de pluripotencia del grupo formado por
CD117, CD123 y CD135. Más preferentemente, las células madre de la
invención expresan el antígeno CD14 en combinación con por lo menos
el marcador de pluripotencia CD123 y/o CD135. Menos de 3% y
preferentemente menos de 1% de las células madre según la invención
expresan el antígeno CD34. Con especial preferencia ninguna de estas
células madre de la invención expresan el antígeno CD34.
Las células madre producidas de acuerdo con el
procedimiento de la invención pueden ser reprogramadas y convertidas
en cualesquiera células corporales. En el estado actual de la
técnica se conocen procedimientos para reprogramar células madre,
véase por ejemplo Weissman I.L., Science 287:
1442-1446 (2000) y Insight Review Articles Nature
414: 92-131 (2001), así como el manual "Methods of
Tissue Engineering", Ed. Atala, A., Lanza, R.P., Academic Press,
ISBN 0-12-436636-8;
Library of Congress, Tarjeta Nº 200188747.
Las células diana y/o tejidos diana somáticos,
aislados y diferenciados obtenidos por reprogramación de las células
madre según la invención llevan también el marcador CD14 de
diferenciación asociado a la membrana de los monocitos.
Además, menos de 3%, preferentemente menos de 1%
de estas células diana y/o tejidos diana somáticos según la
invención expresan el antígeno CD34. Muy preferentemente, ninguna de
estas células o tejidos expresan el antígeno CD34.
Como se muestra en el ejemplo 11, los hepatocitos
que derivan de las células madre según la invención expresan el
marcador de superficie CD14, típico de los monocitos, mientras que
simultáneamente producen la proteína albúmina, característica de los
hepatocitos. Los hepatocitos derivados de las células madre según la
invención son, por lo tanto, diferenciables de los hepatocitos
naturales. De la misma manera, se comprobó el marcador de superficie
CD14 asociado a la membrana en células productoras de insulina
derivadas de células madre según la invención (ejemplo
9).
9).
En una forma de realización de la invención, las
células madre indiferenciadas programables se usan para la
producción in vitro de células diana y tejidos diana (véase
ejemplos). También son objeto de la presente invención, por lo
tanto, las células de tejidos aisladas diferenciadas, que fueron
obtenidas por diferenciación (reprogramación) de las células madre
según la invención, y que llevan el antígeno de superficie CD14
asociado a la membrana.
Preferentemente, las células madre según la
invención se diferencian in vitro de manera sencilla y fiable
para dar las células diana deseadas, tales como por ejemplo
adipocitos (véase ejemplo 6), células neuronales y gliales (véase
ejemplo 3), células endoteliales (véase ejemplo 5), queratinocitos
(véase ejemplo 8), hepatocitos (véase ejemplo 7) y células de islote
(véase ejemplo 9, Islote de Langerhans), cultivando las células
madre en un medio que contiene el sobrenadante del medio de cultivo
en el que se han incubado las respectivas células diana y/o
fragmentos de las mismas (véase ejemplos 6 a 8). Este sobrenadante
se denominará en lo sucesivo, "medio acondicionado por células
diana".
Por lo tanto, para diferenciar (reprogramar) las
células madre indifereciadas de la invención puede llevarse a cabo
el siguiente procedimiento:
a) Triturar tejido que contiene las células diana
deseadas o que está formado de las mismas;
b) obtener las células de tejidos (células diana)
y/o fragmentos de las mismas;
c) incubar las células diana y/o fragmentos de
las mismas en un medio de cultivo apropiado;
d) recoger el sobrenadante del medio de cultivo
durante y después de la incubación como medio acondicionado por
células diana; y
e) se dejan crecer las células madre en presencia
del medio acondicionado por células diana para
reprogramar/diferenciar las células madre indiferenciadas.
Los medios de cultivo celulares estándar en las
células diana o tejido diana deseados pueden usarse como medio de
cultivo (véanse ejemplos). Preferentemente los medios contienen
factores de crecimiento, como por ejemplo factor de crecimiento
epidérmico.
La incubación de las células diana y/o fragmentos
de las mismas ("pellet celular") puede ser de 5 a 15,
preferentemente de 10 días. Preferentemente se retira el
sobrenadante, es decir, el medio acondicionado por células diana
después de 2 a 4 días en cada caso y se reemplaza por un medio
fresco. Los sobrenadantes obtenidos de esta forma pueden filtrarse
en forma estéril por separado o pueden ser reunidos y almacenados a
aproximadamente 20ºC o pueden usarse directamente para programar
células madre. Como se ha descrito anteriormente, la programación de
las células madre para obtener las células diana deseadas se realiza
dejando crecer células madre en presencia del medio acondicionado
con las respectivas células diana (véase ejemplos). Preferentemente
el medio de crecimiento contiene adicionalmente un factor de
crecimiento específico de las células diana, tal como por ejemplo el
factor de crecimiento de hepatocitos o el factor de crecimiento de
queratinocitos (véase ejemplos).
En una forma de realización de la invención, las
células madre indiferenciadas programables según la invención se
usan per se para la producción de un compuesto farmacéutico
adecuado para la producción in vivo de células diana y
tejidos diana.
Tales preparados farmacéuticos pueden contener
las células madre según la invención suspendidas en un medio
fisiológicamente aceptable. Los medios apropiados son, por ejemplo,
PBS (solución salina tampón fosfato) o suero fisiológico con un 20%
de solución de albúmina humana y similares.
Estos preparados farmacéuticos contienen células
madre indiferenciadas programables vitales según la invención, que
tienen en su superficie el marcador CD14 y por lo menos otro de los
marcadores multipotentes de células madre CD90, CD117, CD123 y/o
CD135, en una cantidad de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,
28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,
45, 46, 47, 48, 49 ó 50%, preferentemente 60 ó 70%, con especial
preferencia 80 ó 90% y muy preferentemente 100%, con respecto al
total de células presentes en el preparado, y opcionalmente, otros
adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables.
Las preparaciones de células madre pueden
contener células madre indiferenciadas programables vitales según la
invención en su superficie que presentan el marcador de superficie
CD14 y por lo menos otro de los marcadores pluripotentes de células
madre CD90, CD117, CD123 y/o CD135, en una cantidad de por lo menos
1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,
38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54,
55, 56, 57, 58 ó 59%, preferentemente por lo menos 60%, con respecto
al total de células presentes en el preparado; preferentemente, las
suspensiones de células están contenidas en un medio de cultivo o
transporte tolerable para las células, como por ejemplo PBS o RPMI,
etc., o se prefieren preparaciones celulares congeladas en un medio
de almacenamiento apropiado como por ejemplo RPMI con 50% solución
de albúmina humana y 10% DMSO.
La cantidad de células vitales y por lo tanto la
proporción de estas en las composiciones mencionadas anteriormente
puede ser determinada ópticamente usando técnicas de exclusión con
coloración con azul de triptano, ya que con esta coloración, las
células vitales se pueden diferenciar ópticamente de las células no
vitales.
Para la aplicación clínica, por regla general, es
irrelevante que una parte de las células presentes en el preparado
farmacéutico no cumpla los criterios de la invención,
correspondientes a las células madre indiferenciadas programables,
con la condición de que se encuentre presente una cantidad
suficiente de células madre funcionales. Sin embargo, también es
posible eliminar las células no indiferenciadas de tales preparados
mediante procedimientos conocidos en el estado actual de la técnica,
con los marcadores de superficie típicos de las células
indiferenciadas de la invención, para que los preparados contengan
las células deseadas en forma esencialmente pura. Un ejemplo de
proceso apropiado es el "Immuno magnetic bead sorting", véase
Romani y col., J. Immunol. Methods 196: 137-151
(1996).
Además, al ponerse en contacto directo con un
conjunto de células de un tipo celular específico, las células madre
poseen, in vivo, la capacidad de diferenciarse
espontáneamente y convertirse en células de ese tipo. En el estado
de la técnica se conocen procedimientos para la producción de
tejidos usando células rediferenciables o cuya diferenciación puede
cambiarse (ingeniería de tejidos). Por ejemplo, Wang, X. y col.
("Liver repopulation and correction of metabolic liver disease by
transplanted adult mouse pancreatic cells" Am. J. Pathol. 158
(2): 571-579 (2001)) demostraron que hasta
determinadas células adultas del páncreas del ratón están en
condiciones de convertirse en hepatocitos que pueden compensar
completamente el defecto metabólico en ratones FAH-
(fumaroilacetoacetato hidrolasa) deficientes. Otro ejemplo son los
experimentos de Lagasse y col., "Purified hematopoietic stem cells
can differentiate into hepatocytes in vivo", Nature
Medicine, 6 (11): 1229-1234 (2000). Los autores han
demostrado que células madre hematopoyéticas de la médula ósea están
en condiciones de convertirse en hepatocitos que pueden compensar
luego el defecto metabólico, después de haber sido transferidas
in vivo a ratones FAH-deficientes; véase
también el artículo general de Grompe M., "Therapeutic Liver
Repopulation for the Treatment of Metabolic Liver Diseases" Hum.
Cell, 12: 171-180 (1999).
Entre las formas de aplicación particularmente
preferidas para la diferenciación in vivo de las células
madre indiferenciadas según la invención se incluyen la inyección,
infusión e implantación de células madre en un conjunto de células
específico del cuerpo, para lograr que las células madre se
diferencien allí por contacto directo con el conjunto de células y
se conviertan en este tipo de células. Para la inyección o infusión,
las células pueden administrarse en PBS ("solución salina tampón
fosfato").
Entre los ejemplos de indicaciones relevantes en
este contexto mencionaremos: cirrosis hepática, insuficiencia
pancreática, insuficiencia renal aguda o crónica, hipofunciones
hormonales, infarto cardíaco, embolia pulmonar, apoplejía cerebral y
daños cutáneos.
Por lo tanto, una forma de realización preferida
de la invención es el uso de las células madre indiferenciadas
programables para la producción de diferentes composiciones
farmacéuticas destinadas al tratamiento de cirrosis hepática,
insuficiencia pancreática, insuficiencia renal aguda o crónica,
hipofunciones hormonales, infarto cardíaco, embolia pulmonar,
apoplejía cerebral y daños cutáneos.
Existen numerosos trabajos referidos al uso
terapéutico de las células diana que se pueden obtener a partir de
las células madre según la invención (véase arriba, Science 287:
1442-1446 (2000) y Nature 414:
92-131 (2001)).
Otra aplicación preferida es la inyección de
células madre indiferenciadas según la invención en el peritoneo,
para que se diferencien allí por influencia de las células
circundantes, en células peritoneales. Estas células pueden asumir
una función renal en la diálisis peritoneal de pacientes con
insuficiencia renal gracias a su membrana semipermeable, y segregar
sustancias renales en el peritoneo, desde donde se las elimina a
través de la diálisis.
Por lo tanto, también son objeto de la invención
las células diana y/o tejidos diana somáticos diferenciados y
aislados que se obtienen por reprogramación de las células madre y
que se caracterizan por el antígeno CD14 asociado a la membrana, del
que se excluyen los monocitos humanos. Estas células diana y/o
tejidos diana somáticos contienen preferentemente adipocitos,
neuronas y células gliales, células endoteliales, queratinocitos,
hepatocitos y células de islote.
Las células también pueden ser introducidas
directamente en los órganos que se deben reconstruir. La
introducción puede llevarse a cabo por medio de estructuras de
matriz que se recubren con capas de correspondientes células
diferenciadas o células capaces de diferenciarse. Las estructuras de
matriz son, por regla general, biodegradables, de manera que
desaparecen del cuerpo cuando las células recién introducidas se
incorporan en las células existentes. Desde este punto de vista, por
ejemplo, los transplantes celulares, preferentemente autólogos, en
forma de células de islote, hepatocitos, adipocitos, células
cutáneas, células musculares, de los músculos cardíacos, nerviosas,
óseas, endocrinas, etc. deben tenerse en cuenta para la
reconstrucción, por ejemplo después de resección quirúrgica parcial
de un órgano, para la reparación, por ejemplo después de un trauma o
para aplicaciones de apoyo, por ejemplo en caso de falta o
deficiencia de la función de un órgano.
Las células madre según la invención y las
células diana provenientes de las mismas también pueden usarse para
recubrir materiales implantables, a fin de aumentar la
biocompatibilidad. Por lo tanto, también son un objeto de la
invención, los materiales implantables recubiertos con las células
madre indiferenciadas programables o las células diana y/o tejidos
diana somáticos. Según una forma de realización de la invención,
estos materiales implantables son prótesis. En una forma de
realización especialmente preferida, estas prótesis son válvulas
cardíacas, prótesis vasculares, prótesis óseas y articulares.
Los materiales implantables también pueden ser
vehículos artificiales y/o biológicos que comprenden las células
madre indiferenciadas programables o las células diana. A este
respecto, los vehículos pueden ser bolsas o cámaras para ser
insertadas en el cuerpo humano.
En una forma de realización de la invención, se
usa una bolsa de este tipo, que contiene células de islote, que son
células somáticas diferenciadas de la invención, para producir una
estructura farmacéutica para usar como cámara de entrada artificial
de células de islote destinada al suministro de insulina.
Según otra forma de realización de la invención
se usa una bolsa o una cámara que contiene adipocitos, que son
células somáticas diferenciadas según la invención, para producir un
polímero artificial lleno de adipocitos como estructura farmacéutica
para reconstruir el pecho después de operaciones y en otras
indicaciones de corrección plástica y/o cosmética.
También se pueden usar, in vivo, sistemas
de cámara de entrada semipermeables provistos de células endocrinas
de orígenes muy diferentes, para el tratamiento de enfermedades
endocrinas, metabólicas o hemostáticas. Son ejemplos de tales
células endocrinas, aquellas que producen tiroxina, esteroides, ADH,
aldosterona, melatonina, serotonina, adrenalina, noradrenalina, TSH,
LH, FSH, leptina, colecistoquinina, gastrina, insulina, glucagón, o
factores de coagulación.
Por lo tanto, también son un objeto de la
invención los materiales implantables que son sistemas de cámara de
entrada semipermeables y contienen células diana somáticas
diferenciadas aisladas. Estos sistemas de cámara de entrada
semipermeables se usan en diferentes formas de realización de la
invención para la producción de una estructura farmacéutica
destinada al tratamiento in vivo de enfermedades endocrinas,
metabólicas o hemostáticas.
Las células diana que se obtienen de las células
madre según la invención pueden usarse además como cultivos
celulares biorreactores fuera del cuerpo, por ejemplo para llevar a
cabo reacciones de desintoxicación. Esta forma de uso es relevante,
especialmente en casos de dolencias agudas, por ejemplo como
biorreactor de hepatocitos en casos de insuficiencia hepática
aguda.
La producción de las estructuras descritas
anteriormente y la aplicación del procedimiento terapéutico
correspondiente ya ha sido descrito en numerosas ocasiones en el
estado de la técnica, véanse p.ej. los artículos generales de Lalan,
S., y col. "Tissue engineering and its potential impact on
surgery" World J. Surg. 25: 1458-1466 (2001);
Nasseri, B.A., y col. "Tissue engineering: an evolving
21st-century science to provide replacement for
reconstruction and transplantation" Surgery 130:
781-784 (2001) y Fuchs, J.R., y col., "Tissue
engineering: a 21st century solution to surgical reconstruction"
Ann. Thorac. Surg. 72: 577-591 (2001).
Finalmente, las células madre pluripotentes de la
invención abren un extenso campo para las modificaciones y terapias
transgénicas. Según una forma de realización preferida de la
invención, las células madre indiferenciadas programables per
se o las células diana y/o tejidos diana somáticas que
finalmente se diferencian de aquellas, se transfectan con uno o más
genes. De esta manera es posible recomponer y/o apoyar o volver a
incorporar uno o más genes que son necesarios para el mantenimiento
de rendimientos metabólicos en determinados órganos tales como el
hígado o los riñones. Por ejemplo, las células madre o los
hepatocitos derivados de aquellas pueden ser transfectados con el
gen FAH (fumaroilacetoacetato-hidrolasa). En el
modelo de ratón FAH-deficiente bastó con la
inyección intrasplénica de 1000 hepatocitos donadores
FAH-positivos para repoblar completamente el hígado
al cabo de 6 a 8 semanas y compensar completamente el defecto
metabólico que produce la cirrosis (véase Grompe, M., y col., Nat.
Genet. 12: 266 ff. (1996)).
De manera correspondiente, por la transfección de
las células madre o las respectivas células diana obtenidas de las
células madre por programación (por ejemplo células hematopoyéticas,
hepatocitos, células ováricas, células musculares, células
nerviosas, neuronas, células gliales, células cartilaginosas u
óseas, etc.) con genes resistentes a múltiples drogas posibilita la
quimioterapia radical ampliada en casos de enfermedades malignas por
la respectiva reconstrucción hematopoyética o se crea la resistencia
a la radiación.
A continuación la invención se explica
detalladamente:
El material de partida para el procedimiento
según la invención son monocitos de sangre humana. Preferentemente
se trata de monocitos autólogos, es decir monocitos procedentes de
la sangre del mismo paciente que será tratado con las células madre
según la invención o las células diana producidas a partir de
estas.
Para obtener los monocitos, la sangre puede ser,
en primer lugar, dividida en plasma y glóbulos blancos y rojos,
después del tratamiento habitual con un anticoagulante de la forma
conocida, preferentemente por centrifugación. Después de la
centrifugación, el plasma se encuentra en el sobrenadante; debajo se
encuentra una capa que contiene la totalidad de los glóbulos
blancos. Esta capa también se denomina "linfa cuajada". Debajo
se encuentra la fase que contiene los glóbulos rojos
(hematocrito).
A continuación se aísla la capa "linfa
cuajada" y se separa por ejemplo por centrifugación, según
procedimientos conocidos, para la obtención de los monocitos. Según
una variante preferida del proceso, la capa "linfa cuajada" se
aplica sobre un medio de separación de linfocitos (por ejemplo
Ficoll Hypaque) y se centrifuga. La fracción de los monocitos se
obtiene de la sangre después de más centrifugación y lavado (véase
ejemplo 1).
Entre los ejemplos de procedimientos alternativos
para la obtención de monocitos a partir de sangre completa se
cuentan los siguientes: "Fluorescence-Activated
Cell Sorting" (FACS), "Immunomagnetic Bead Sorting" (véase
Romani y col., J. Immunol. Methods 196: 137-151
(1996)) y "Magnetic-Activated Cell Sorting"
(MACS) o el denominado método Rosetting (véase
Gmelig-Meyling, F., y col., "Simplified procedure
for the separation of human T and non-T cells"
Vox Sang. 33: 5-8 (1977)).
Según la invención, los monocitos pueden
obtenerse de cualquier sangre humana aislada, por lo que la sangre
también puede proceder de órganos tales como el bazo, ganglios
linfáticos o médula ósea. La obtención de monocitos de órganos se
pone en práctica, sobre todo, cuando la separación de los monocitos
de la sangre humana, por ejemplo en casos de anemia o leucemia, no
es posible o no es posible en suficiente cantidad y en casos de
utilización alogénica, cuando en el marco de una extracción
multiorgánica se dispone del bazo como fuente para el aislamiento
de
monocitos.
monocitos.
Para la producción de una cantidad suficiente de
células madre según la invención, primeramente es necesario
multiplicar los monocitos. Con este fin pueden usarse medios de
crecimiento conocidos, apropiados para monocitos y según la
invención; el medio contiene M-CSF (factor
estimulante de colonias de macrófagos). El M-CSF
(también denominado CSF-1) es producido por
monocitos, fibroblastos y células endoteliales. La concentración de
M-CSF en el medio de cultivo puede ser de 2 a 20
\mug/l de medio de cultivo, preferentemente de 4 a 6 \mug/l y
más preferentemente de 5 \mug/l.
El M-CSF se fija en los
monocitos, en el receptor cFms específico (también denominado
CSF-1R), que se encuentra exclusivamente en la
superficie de los monocitos y solamente fija M-CSF.
(Sherr C.J., y col., Cell 41 (3):665-676 (1985)).
Dado que la interacción específica entre M-CSF y el
receptor induce la división de los monocitos, el medio en el que se
cultivan los monocitos contiene M-CSF o un análogo
del mismo que puede fijarse en el receptor y activarlo. Otros
factores de crecimiento como GM-CSF, factor
estimulante de colonia de monocitos granulocitos y
G-CSF factor estimulante de colonia de granulocitos
no son apropiados, ya que por falta de afinidad con el receptor cFms
no están en condiciones de inducir la división de los monocitos.
En una forma de realización particularmente
preferida del proceso, en la etapa b) se agregan simultáneamente
M-CSF e IL-3 al medio de cultivo
celular. La concentración de IL-3 en el medio puede
ser de 0,2 a 1 \mug/l, preferentemente de 0,3 a 0,5 \mug/l y muy
preferentemente de 0,4 \mug IL-3/l.
Sin embargo, también es posible agregar
primeramente solamente M-CSF al medio de cultivo en
la etapa b), y agregar IL-3 sólo después.
En otra forma de realización el recipiente de
cultivo contiene inicialmente un medio de cultivo celular que
solamente contiene M-CSF que, después de separar las
células, es sustituido por un segundo medio de cultivo celular que
contiene IL-3.
Según una forma de realización preferida de la
invención, en la etapa b) del proceso, las células se cultivan
adicionalmente en presencia de un compuesto de azufre, por ejemplo
un compuesto mercapto, que contiene por lo menos un grupo
hidrocarburo fijado en el azufre, donde dicho grupo(s)
hidrocarburo puede estar sustituido por uno o más grupos
funcionales. Los compuestos mercapto se definen como compuestos que
presentan por lo menos un grupo mercapto (-SH) unido al grupo
hidrocarburo. Usando adicionalmente un compuesto de azufre de este
tipo puede aumentar la cantidad de las células madre obtenidas por
indiferenciación de las células de origen monocitario que expresan
uno o más de los marcadores de células madre CD90, CD117, CD123 y
CD135.
Preferentemente, el/los grupo/s funcional/es
es/son grupos hidroxilo y/o amino. El compuesto de azufre es más
preferentemente 2-mercaptoetanol. Según otra forma
de realización preferida el compuesto de azufre es dimetilsulfóxido
(DMSO).
La cantidad de compuesto de azufre usado puede
ser de aprox. 4 a aprox. 200 \mumol/l, referido al azufre. Se
prefiere aprox. 100 \mumol/l.
Cuando se usa 2-mercaptoetanol el
medio de cultivo deberá contener aprox. 3 \mul a aprox. 13 \mul,
preferentemente aprox. 7 \mul
2-mercaptoetanol/l.
El tratamiento con IL-3 y en caso
necesario con el compuesto de azufre puede llevarse a cabo
simultáneamente o a continuación de la multiplicación de los
monocitos por cultivo con M-CSF, prefiriéndose la
multiplicación simultánea y el tratamiento con IL-3
y en caso necesario con un compuesto de azufre. El proceso de
multiplicación y diferenciación no deberá tardar más de 10 días,
mientras que el tratamiento con IL-3 y en caso
necesario con el compuesto de azufre deberá realizarse por lo menos
durante 3 y como máximo 10 días, preferentemente durante 6 días.
Por lo tanto, según la invención, en caso de
cultivar los monocitos en un medio de cultivo que contiene
simultáneamente M-CSF, IL-3 y
preferentemente un compuesto mercapto tarda, hasta el
desprendimiento de las células del fondo del recipiente de cultivo,
por lo menos 3 y como máximo 10 días, preferentemente 5 a 8 días y
muy preferentemente 6 días.
Si en una forma de realización preferida, el
proceso según la invención se lleva a cabo de manera que los
monocitos de la etapa b) se multiplican primeramente en un medio que
contiene solamente M-CSF, la multiplicación en dicho
medio de cultivo puede tardar por lo menos 2, preferentemente 3 y
con especial preferencia 4 días y un máximo de 7 días, y un cultivo
posterior en presencia de IL-3 y en caso necesario,
de un compuesto mercapto, otros 3 días. En este caso,
preferentemente el cultivo en un medio que solamente contiene
M-CSF sólo demandará un máximo de 4 días y a
continuación se realizará un cultivo en presencia de
IL-3 y en caso necesario, de un compuesto mercapto
durante 3, 4, 5 ó 6 días.
Para realizar conjuntamente la multiplicación y
la indiferenciación, como se describe en los ejemplos 2 y 13,
después de ser aislados, los monocitos se llevan a un medio que
contiene tanto M-CSF como también
IL-3 y preferentemente el compuesto de azufre,
especialmente mercaptoetanol o DMSO.
Gracias a sus propiedades adhesivas, los
monocitos y las células madre obtenidas a partir de ellos durante el
proceso se adhieren al fondo del recipiente de cultivo respectivo.
Según una forma de realización preferida de la invención, al final
de la etapa c) se separa el medio de cultivo de las células que se
encuentran adheridas en el fondo del recipiente de cultivo y se
desecha. A continuación se realiza preferentemente un lavado de las
células adheridas al fondo con un medio de cultivo y luego se cubren
las células con un medio de cultivo fresco (véase ejemplo 13).
El medio de cultivo usado en esta etapa puede ser
tanto el medio que se usa para la multiplicación e indiferenciación,
descrito más arriba, como un medio de cultivo celular estándar, por
ejemplo RPMI.
Según otra forma de realización preferida de la
invención, a continuación de la etapa c) y antes de la etapa d), las
células se ponen en contacto con un disolvente orgánico
biológicamente aceptable, a fin de aumentar la cantidad de células
madre que al final del proceso flotan libremente en el medio. La
cantidad de disolvente puede ser de 10 \mul a 1 ml.
Preferentemente, es un alcohol con 1-4 átomos de
carbono, prefiriéndose agregar especialmente etanol. Según otra
forma de realización particularmente preferida, las células se ponen
en contacto con la fase gaseosa del disolvente orgánico
biológicamente aceptable descrito más arriba, preferentemente con
vapor de etanol (véase ejemplo 2). El disolvente orgánico, más
preferentemente el vapor de etanol, se dejará actuar de 4 a 12
horas, preferentemente de 8 a 10 horas.
Preferentemente, el proceso de la invención se
lleva a cabo en recipientes de cultivo cuya superficie ha sido
recubierta previamente con suero de ternero fetal (FCS) (véase
ejemplo 2). Como alternativa, también puede usarse suero AB humano
de donadores masculinos. El recubrimiento con FCS puede realizarse
cubriendo la superficie de los recipientes de cultivo con FCS antes
de usarlos, y retirando de manera adecuada el FCS no adherido en la
superficie después de algunas horas, especialmente de 2 a 12 horas,
muy preferentemente de 7 horas.
Si a continuación de la etapa c), opcionalmente
después de cambiar el medio de cultivo, se lleva a cabo un
tratamiento con disolvente orgánico, las células ya empezarán a
desprenderse del fondo en esta etapa del proceso. El resto del
desprendimiento puede realizarse mecánicamente, por ejemplo con un
raspador de células, espátula o una pipeta (véase ejemplo 13).
Según una forma de realización preferida de
proceso, el desprendimiento total se logra aplicando una enzima
apropiada, por ejemplo tripsina (véase ejemplo 2). La solución de
tripsina (0,1 a 0,025 g/l, preferentemente 0,05 g/l) puede actuar
sobre las células durante 210 min a 35-39ºC,
preferentemente a 37ºC, en presencia de CO_{2}.
A continuación se bloquea la actividad de la
tripsina mediante un proceso estándar y las células madre
indiferenciadas programables que ahora flotan libremente pueden ser
obtenidas ahora mediante un proceso estándar, por ejemplo por
centrifugación y en una forma de realización particular, pueden ser
suspendidas después de la etapa d) en un medio de cultivo celular
apropiado. Se encuentran ahora a disposición, suspendidas en un
medio apropiado, por ejemplo en RPMI 1640 o DMEM, para su inmediata
diferenciación en las células diana deseadas. Sin embargo, también
pueden permanecer algunos días en el medio. En una forma de
realización preferida, cuando las células deben permanecer más de
aprox. 48 horas en el estado de células madre indiferenciadas
programables en el cultivo, el medio contiene una citoquina o
factor-LIF (factor inhibidor de la leucemia), véase
Nature 414: 94 (2001, Donovan, P.J., Gearhart, J., véase más
arriba). Las células madre pueden ser mantenidas en estado de
células madre indiferenciadas programables por lo menos durante 10
días en un medio que contenga dichos factores.
En una forma de realización preferida, las
células se suspenden en un medio líquido para un almacenamiento más
prolongado y a continuación, se congelan. En el estado de la técnica
se conocen protocolos para la congelación de células vivas, véase
Griffith M., y col. "Epithelial Cell Culture, Cornea, en Methods
of Tissue Engineering", Atala A., Lanza R.P., Academic Press
2002, Cap. 4, páginas 131 a 140. Un medio de suspensión preferido
para congelar las células madre según la invención es DMEM que
contiene FCS, véase ejemplo 2.
A continuación, la invención se explica y
describe más detalladamente por medio de ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
La composición de los medios y sustancias usadas
que no se define en los ejemplos, se indica a continuación:
1. Solución de penicilina/estreptomicina:
- 10.000 unidades de penicilina en forma de sal sódica de penicilina G y 1000 \mug estreptomicina en forma de sulfato de estreptomicina por ml solución fisiológica de cloruro sódico (NaCl 0,9%)
2. Tripsina-EDTA
- 0,5 g tripsina y 0,2 g EDTA (4 Na)/l
3. Insulina
- humana, recombinante, preparada en E. coli, aprox. 28 unidades/mg
4. RPMI 1640 (l x, líquido (11875) contiene
L-glutamina
- RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medio 1640, son formulaciones enriquecidas de gran aplicabilidad en células de mamíferos.
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,5cmReferencia: Moore G.E., y col., J.A.M.A. 19: 519 (1967)
\vskip1.000000\baselineskip
5. PBS (Solución salina tamponada con fosfato
Dulbecco) véase J. Exp. Med. 98:167 (1954):
Componentes | g/l | |
KCl | 0,2 | |
KH_{2}PO_{4} | 0,2 | |
NaCl | 8,00 | |
Na_{2}PHO_{4} | 1,15 |
6.2-Mercaptoetanol
Calidad para síntesis; Contenido > 98%,
densidad 1,115 a 1,116, véase por ejemplo Momo J., y col., J. Am.
Chem. Soc. 73: 4961 (1951).
7. Ficoll-Hypaque:
Medio para separación de linfocitos
(copolimerizado de sacarosa/epiclorhidrina Mg 400.000; densidad
1,077, ajustado con diatrizoato sódico).
8. Ácido retinoico:
Ácido vitamina A (C_{20}H_{28}O_{2}), 300
\mul en 1,5 ml PBS, correspondiente a 1 mM. Como medio para
programar neuronas y células gliales se usan 150 \mul para 10 ml
de medio (correspondiente a 10^{-6} M).
9. DMEM
Medio Eagle modificado Dulbecco (alta glucosa)
véase Dulbecco, R. y col., Virology 8: 396 (1959); Smith, J.D. y
col., Virology 12: 158 (1960); Tissue Culture Standards Committee,
In Vitro 6: 2 (1993)).
10. L-glutamina
- líquida: 29,2 mg/ml.
11. Colagenasa Tipo II:
- Véase Rodbell, M. y col., J. Biol. Chem. 239: 375 (1964).
12. Interleucina 3 (IL-3):
IL-3 humano recombinante de E.
coli (Yang Y.C. y col. Cell 47: 10 (1986); contiene 133
radicales aminoácidos que contienen IL-3 maduro y
134 radicales aminoácidos que incluyen la forma metionilo en una
relación de aprox. 1:2; masa molar calculada, aprox. 17,5 kD;
actividad específica 1 x 10^{3} U/\mug; (R&D, Catálogo Nº
203-IL).
13. Factor estimulante de colonias de macrófagos
(M-CSF).
M-CDF humano recombinante de
E. coli; contiene como monómero (18,5 Kd) 135 radicales
aminoácidos, incluyendo la metionina N-terminal; se
encuentra presente como homodímero con una masa molar de 37 Kd;
(SIGMA. Nrº catálogo M 6518).
\newpage
14. Anticuerpos:
Los anticuerpos usados en los ejemplos contra los
antígenos CD14, CD31, CD90, CD117, CD123, CD135 se encuentran
comercialmente disponibles. Se adquirieron de las siguientes
fuentes:
- CD14: DAKO, CD14 monoclonal de ratón anti-humano, monocito, clon TÜK4, Código Nr. M 0825, Lote 036 Edición 02.02.01;
- CD31: PharMingen International, CD31 monoclonal de ratón anti-rata (PECAM-1), Clon TLD 3A12, Nº Catálogo 22711D, 0,5 mg;
- CD90: Biozol Diagnostica, Serotec, CDw90 de ratón anti-humano, Clon Nº F15-42-1, MCAP90, lote 0699;
- CD117: DAKO, CD117 monoclonal de ratón anti-humano, kit-c, clon Nr. 104D2, Código Nº M 7140, Lote 016, Edición 04.05.00;
- CD123: Research Diagnostics Inc., Anticuerpos CD123 de ratón anti-humano, Clon 9F5, Catálogo Nº RDI-CD123-9F5;
- CD135: Serotec, CD135 de ratón anti-humano, MCA1843, Clon Nº BV10A4H2.
Para evitar la coagulación de la sangre y para
nutrir las células se mezclaron 450 ml de sangre completa en un
conjunto de 3 bolsas tipo cámara con 63 ml de una solución
estabilizadora que contenía 3,27 g de ácido cítrico, 26,3 g de
citrato trisódico, 25,5 g de dextrosa y 22,22 g de dihidroxifosfato
de sodio por litro de H_{2}O. El valor pH de la solución era de
5,6-5,8.
Luego se realizó una "fuerte centrifugación"
de esta mezcla para separar los componentes de la sangre a 4000 rpm
durante 7 minutos a 20ºC. De ello resultó una capa triple de los
componentes corpusculares y no corpusculares. Colocando el conjunto
de bolsas en una prensa prevista para tal fin, se prensaron los
eritrocitos en la bolsa inferior y el plasma en la bolsa superior,
permaneciendo la llamada "linfa cuajada" en la bolsa del medio
que contenía aproximadamente 50 ml del volumen.
Luego, los 50 ml de "linfa cuajada" recién
preparado se dividieron en 2 porciones de 25 ml cada una y se
cubrieron con 25 ml de medio de separación
Ficoll-Hypaque que previamente había sido trasvasado
a dos tubos Falcon de 50 ml.
Esta preparación se centrifugó
ininterrumpidamente durante 30 minutos a 2500 rpm. Los eritrocitos y
las células muertas aún presentes en la "linfa cuajada"
quedaron debajo de la fase Ficoll, mientras que los glóbulos blancos
incluyendo los monocitos quedaron separados como interfase blanca
sobre el Ficoll.
A continuación se pipeteó cuidadosamente la
interfase blanca de los monocitos y se mezcló con l0 ml de solución
fisiológica tamponada con fosfato (PBS).
Luego, esta preparación se centrifugó
ininterrumpidamente tres veces durante 10 min. a 1800 rpm,
pipeteando el sobrenadante después de cada centrifugación y
completando con PBS nuevo.
El sedimento celular acumulado en el fondo del
recipiente de centrifugación (tubo Falcon) contenía la fracción
celular mononuclear, es decir, los monocitos.
Tanto el cultivo y la multiplicación de los
monocitos por un lado, como la indiferenciación de las células por
otro lado, se realizó en una sola etapa en un medio nutriente de la
siguiente composición:
\vskip1.000000\baselineskip
Medio RPMI 1640 | 440 ml |
Suero fetal de ternero (FCS) | 50 ml |
Solución de penicilina/estreptomicina | 5 ml |
2-mercaptoetanol(solución madre) | 5 ml |
Volumen total | 500 ml |
El medio nutriente contenía además 2,5 \mug/500
ml de M-CSF y 0,2 \mug/500 ml de interleucina 3
(IL-3).
Los monocitos aislados en el ejemplo 1 se
colocaron en 5 cámaras de una placa de 6 pocillos (30 mm de diámetro
por pocillo) en una cantidad de aproximadamente 10^{5} células por
pocillo y se completaron con 2 ml del medio nutriente indicado con
anterioridad cada una. La placa de 6 pocillos había sido llenada
previamente con FCS inactivado puro y el FCS se había decantado
después de aproximadamente 7 horas, a fin de obtener de esta manera
una placa cubierta con FCS. La determinación de la cantidad de
células para la dosis exacta por pocillo se realizó por medio de
procedimientos conocidos, véase Hay R. J., "Cell Quantification
and Characterisation" en Methods of Tissue Engineering, Academic
Press 2002, capítulo 4, páginas 55-84.
La placa de 6 pocillos se cubrió con la tapa
correspondiente y se mantuvo durante 6 días en una incubadora a
37ºC. Las células se depositaron en el fondo de las cámaras después
de 24 horas. Cada dos días se pipeteó el sobrenadante y se llenaron
nuevamente las cámaras de la placa de 6 pocillos con 2 ml cada una
de medio nutriente fresco.
El sexto día se vertieron 2 ml de etanol al 70%
en la sexta cámara de la placa de 6 pocillos que estaba libre, se
cerró la placa de nuevo y se dejó en la incubadora otras 10 horas a
37ºC.
Posteriormente se pipeteó 1 ml de una solución de
tripsina diluida al 1:10 con PBS en cada una de las cámaras de la
placa con pocillos que contenían las células. La placa de pocillos
cerrada se dejó en la incubadora durante 5 minutos a 37ºC en 5% de
CO_{2}.
Posteriormente se bloqueó la actividad de la
tripsina agregando de 2 ml de medio RPMI 1640 en cada uno de los
pocillos. Se pipeteó todo el sobrenadante de cada una de las cámaras
(1 ml de tripsina + 2 ml de medio), se reunieron en un tubo Falcon
de 15 ml y se centrifugó durante 10 minutos a 1800 rpm. A
continuación se desechó el sobrenadante y el precipitado se mezcló
con medio RPMI 1640 nuevo (2 ml/10^{5} células).
Esta suspensión celular pudo utilizarse
directamente para la diferenciación y obtención de las distintas
células diana.
Como alternativa, después de centrifugar las
células y descartar el sobrenadante que contenía tripsina las
células se mezclaron con DMSO/FCS como medio de congelación y se
congelaron con una concentración de 10^{6}/ml.
El medio de congelación contenía 95% de FCS y 5%
de DMSO. Aproximadamente 10^{6} células se tomaron en 1 ml del
medio y se enfriaron en las siguientes etapas:
30 min. en hielo;
2 horas a -20ºC en cajas prerrefrigeradas de
telgopor;
24 horas a -80ºC en telgopor;
conservación en tubos con nitrógeno líquido
(N_{2}) a -180ºC.
Para la fenotipización inmunohistoquímica de la
población celular generada a partir de células madre indiferenciadas
programables de origen monocitario según el procedimiento anterior
se retiraron 10^{5} células y se fijaron como preparado de
citospina en portaobjetos para una posterior coloración histoquímica
(Watson, P. "A slide centrifuge; an apparatus for concentrating
cells in suspension on a microscope slide." J. Lab. Clin. Med.,
68: 494-501 (1966)). Tras esto, las células pueden
colorearse por medio de la técnica descrita por Cordell, J. L., y
col., (para bibliografía, véase más abajo) con el complejo rojo
APAAP. La dilución del anticuerpo primario agregado se produjo,
siempre que no se indicara lo contrario, en una relación de 1:100
con PBS, empleándose en cada caso 200 \mul de esta concentración
de anticuerpos. Como anticuerpos primarios se usaron anticuerpos
monoclonales contra los epitopes de antígeno celular enumerados en
la tabla 1. La figura 6 muestra preparados de citospina coloreados y
la correspondiente comprobación de los marcadores de células madre
CD90, CD117, CD123 y CD135.
Cordell J. L., y col. "Immunoenzymatic
labeling of monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline
phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase
(APAAP complexes)." J. Histochem. Cytochem. 32:
219-229 (1984).
CD14
Ferrero E., Goyert S. M.
"Nucleotide sequence of the gene encoding the monocyte
differentiation antigen, CD14" Nucleic Acids Res. 16:
4173-4173 (1988).
CD31
Newman P. J., Berndt M. C.,
Gorski J., White J. C. Il, Lyman S.,
Paddock C., Muller W. A.
"PECAM-1(CD31) cloning and relation to
adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily"
Science 247: 1219-1222 (1990).
CD90
Seki T., Spurr N., Obata F.,
Goyert S., Goodfellow P., Silver J. "The
human thy-1 gene: structure and chromosomal
location" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:
6657-6661 (1985).
CD117
Yarden Y., Kuang W.-J.,
Yang-Feng T., Coussels L.,
Munemitsu S., Dull T. J., Chen E.,
Schlessinger J., Francke U., Ullrich A.
"Human proto-oncogene c-kit: a new
cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified
ligand." EMBO J. 6: 3341-3351
(1987).
CD123
Kitamura T., Sato N., Arai
K., Miyajima A. "Expression cloning of the human
IL-3 receptor cDNA reveals a shared beta subunit for
the human IL-3 and GM-CSF
receptors." Cell 66: 165-1174
(1991).
CD135
Small D., Levenstein M., Kim
E., Carow C., Amn S., Rockwell P., Witte
L. Burrow C., Ratajazak M. Z., Gewirtz A. M.,
Civin C. I.
"STK-1, the human homolog of
Flk-2/Flt-3, is selectively
expressed in CD34+ human bone marrow cells and is involved in the
proliferation of early progenitor/stem cells."Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 91: 459-463 (1994).
Antígeno | Reacción de color | ||
Marcador de células madre | |||
CD90 | ++ | ||
CD117 | + | ||
CD123 | ++ | ||
CD135 | +(+) | ||
Marcador de diferenciación | |||
CD14 (monocitos) | + | ||
\begin{minipage}[t]{135mm} La graduación indicada corresponde a la positividad calculada del antígeno que se presenta a partir del día 4 hasta el día 9, luego de cultivar los monocitos en los medios correspondientes especificados y se realiza por comparación microscópica de las respectivas coloraciones de citospina con el control negativo (coloración sin anticuerpos primarios).\end{minipage} | |||
+ clara reacción de color de las células con el anticuerpo primario; | |||
++ fuerte reacción de color de las células con el anticuerpo primario. |
Se evaluaron solamente los preparados de
citospina que presentaban más del 70% de células vitales con una
morfología típica de células madre (véase la figura 6). Menos de 1%
de estas células expresan el antígeno CD34.
La preparación de neuronas y células gliales se
realizó en placas petri de 100 mm de diámetro. Para preparar las
placas petri se vertieron en cada bandeja 5 ml de suero de ternero
fetal inactivado puro (FCS), de modo que el fondo quedara cubierto.
A las 7 horas se pipeteó la parte de FCS no adherido al fondo de la
placa petri. Aproximadamente 10^{6} de las células preparadas de
acuerdo con el ejemplo 2 se vertieron en una de las placas petri
preparadas y se agregaron 10 ml de medio nutriente de la siguiente
composición:
Solución DMEM | 440 ml |
Suero de ternero fetal (FCS) | 50 ml |
1-glutamina | 5 ml |
Solución de penicilina (100 \mu/l)/estreptomicina (100 \mug/l) | 5 ml |
Volumen total | 500 ml |
El medio nutriente contenía además ácido
retinoico en una cantidad de 1 x 10^{-6} M/500 ml.
La reprogramación/diferenciación de las células
madre usadas para obtener neuronas y células gliales se produjo
dentro de un período de 10 días, renovando el medio a intervalos de
aproximadamente 3 días. Después de este período, gran parte de las
células se adhirieron al fondo de la cámara y podían desprenderse en
forma análoga -tal como se describió con anterioridad para las
células madre- con un tratamiento breve con tripsina.
Para una posterior caracterización
inmunohistoquímica de las células diana inducidas por células madre
indiferenciadas programables, las células madre generadas a partir
de monocitos (10^{5} células / tapa de vidrio) se colocaron en
vidrios de tapa (20 mm x 20 mm), que se habían colocado en el fondo
de las placas de 6 pocillos (30 mm de diámetro por cámara), y se
cultivaron con el medio nutriente con 2 ml por placa con pocillos.
Tras diferenciar las respectivas células diana, éstas se fijaron de
la siguiente manera: tras retirar el medio nutriente (sobrenadante)
se produjo la fijación de las células diana cultivadas luego de
agregar 2 ml de metanol que se dejó actuar durante 10 minutos. Luego
se pipeteó el etanol y las placas con pocillos se lavaron dos veces
con PBS (2 ml por vez). Después se colorearon las células mediante
la técnica descrita por Cordell, J. L., y col., "Immunoenzymatic
labeling monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline
phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase
(APAAP complexes)", J. Histochem. Citochem. 32:
219-229 (1994) con el complejo rojo APAAP. La
dilución del anticuerpo primario agregado se realiza, siempre que no
se especifique lo contrario, en una relación de 1:100 con PBS. Luego
se pipetearon 200 \mul de esta concentración de anticuerpos en
cada uno de los seis
pocillos.
pocillos.
Las células precursoras neuronales se comprobaron
por coloración celular con el anticuerpo contra el antígeno S100,
véase la imagen central de la figura 1 (x 200).
Las neuronas se comprueban por expresión
específica de sinaptofisina MAP2 ("proteína asociada microtubular
2") o neurofilamento 68 con los correspondientes anticuerpos
específicos (anticuerpos primarios 1:300 diluidos con PBS), imagen
derecha de la figura 1, x 200.
Las células gliales como, por ejemplo, los
astrocitos, se comprobaron por detección de GFAP ("proteína
asociada fibrilar glial") (anticuerpos primarios 1:200 diluidos
con PBS), imagen izquierda de la figura 1, x 200.
La separación de neuronas y células gliales se
realizó por medio de anticuerpos específicos contra MAP2 (neuronas)
o GFAP (células gliales), por medio de MACS (Magnetic Activated Cell
Sorting) según el procedimiento que se describe, por ejemplo, en
Carmiol S., "Cell Isolation and Selection" Methods of Tissue
Engineering, Academic Press 2002, capítulo 2, páginas
19-35.
Los tipos celulares que se hicieron visibles por
medio de la coloración se indican en la figura 1.
Para cultivar células endoteliales se usó una
matriz Matrigel© (Beckton y Dickinson, Heidelberg, DE). En este caso
se trata de una matriz de fibronectina, laminina y los colágenos I y
IV.
La matriz congelada se descongeló lentamente
durante un período de 12 horas a 4ºC en el refrigerador. De esta
manera se modificó su estado, es decir que la matriz originalmente
sólida se volvió esponjosa/líquida. En este estado se aplicó en una
placa de 48 pocillos (10 mm de diámetro por cámara) de manera de
cubrir el fondo de cada cámara.
Después de la aplicación, la placa se mantuvo
durante 30 minutos a temperatura ambiente, hasta que el gel se hubo
solidificado sobre el fondo, formando una capa adherente.
Posteriormente, se incubaron sobre Matrigel©
aproximadamente 1 X 10^{2} células por pocillo agregando el medio
nutriente (tal como se describió en el ejemplo 2).
A los 4-5 días se presentaron las
primeras cadenas celulares tubulares que al cabo de
6-8 días se habían desarrollado formando redes
celulares tridimensionales. En las células pudieron comprobarse los
marcadores endoteliales CD31 y el factor VIII con los anticuerpos
primarios específicos (200 \mul, 1:100 diluidos con PBS en cada
caso).
En un procedimiento alternativo, se aplicó la
matriz fluidificada en una prótesis vascular y luego se cubrió con
las células madre adultas indiferenciadas programables de acuerdo
con el ejemplo 2. Después de aproximadamente 6 días, se pudo
apreciar un pavimento endotelial que revestía la prótesis en forma
circular.
Las células endoteliales que se hicieron visibles
por coloración con los correspondientes anticuerpos específicos del
endotelio (véase más arriba) se muestran en la figura 2. En la
imagen central están representadas las células luego de una
incubación de 5 días en Matrigel©. Las primeras cadenas tubulares
unen cada uno de los grupos celulares. Las células marcadas de color
marrón oscuro expresan el antígeno CD31 (x 200 con filtro amarillo).
Luego de 8 días se forman progresivamente estructuras reticulares
tridimensionales (coloración de antígeno anti-CD31,
x 200 con filtro amarillo). A los 12 días, las células
neodiferenciadas CD31^{+} que se cultivaron en Matrigel©,
conforman un tubo tridimensional similar a un recipiente con
estructuras de paredes multicapas que recuerdan morfológicamente a
un recipiente. Se aprecia que casi todas las células expresan el
antígeno CD31 (coloración CD31, x 400, filtro azul), figura
derecha.
A: Para la programación/diferenciación de las
células madre adultas según el ejemplo 2 para obtener células grasas
se generó en primer lugar un medio acondicionado. Para ello se
prepararon 20 g de un tejido graso autólogo, es decir, de la misma
persona donante de cuya sangre provenían también los monocitos, de
la siguiente manera:
Primero se trituró el tejido graso en una placa
petri y los trozos de tejido triturado se pasaron por un tamiz
(diámetro de las aberturas 100 \mum).
La suspensión obtenida de esta manera se pasó
luego a una placa petri de 100 mm de diámetro y se agregaron 10 ml
de medio DMEM con un contenido de 30 mg de colagenasa tipo II. Para
que la colagenasa actuara sobre las células grasas se dejó reposar
la preparación aproximadamente 60 minutos a temperatura ambiente
(22ºC \pm 2ºC).
A continuación se pasó la mezcla a tubos Falcon
de 50 ml y los tubitos se centrifugaron durante 10 minutos a 1800
rpm.
Después de la centrifugación, se desechó el
sobrenadante y el pellet de células compuesto por adipositos y
células precursoras se tomó en 8 ml de un medio de la siguiente
composición y se incubó en placas petri (diámetro 100 mm) durante 10
días a 37ºC en una incubadora:
Solución DMEM | 444,5 ml |
Suero de ternero fetal (FCS) | 50,0 ml |
Solución de insulina | 0,5 ml |
Solución de penicilina (100 U/l)/estreptomicina (100 \mug/l) | 5,0 ml |
Volumen total | 500,0 ml |
La solución de insulina contenía 18 mg de
insulina (Sigma 1-0259) disueltos en 2 ml de agua
con vinagre (compuesta de 40 ml de H_{2}O y 0,4 ml de ácido
acético glacial). La solución se diluye con agua con vinagre en una
relación de 1:10.
Durante los 10 días de incubación, se formó el
medio acondicionado con células grasas (FCCM) como sobrenadante. El
sobrenadante se reemplazó a los 2 - 4 días por medio nutriente
nuevo. El FCCM obtenido al cambiar el medio se filtró en condiciones
estériles y se almacenó a -20ºC. Luego se colocaron 10 ml del FCCM
descrito con anterioridad con aproximadamente 10^{6} células madre
de acuerdo con el ejemplo 2, en una placa petri (diámetro 100 mm).
Las primeras células precursoras que contienen vacuolas grasas se
hicieron visibles a los 4 días (figura 3A). A los 6 días aparecieron
adipositos aislados coloreados con rojo Sudán (figuras 3B y C). A
los 10 días se produjo la agregación típica y se formaron grumos de
estas células, las que en este estadio ya se reconocían
macroscópicamente como tejido graso (figura 3D).
Las células grasas visibles por coloración en las
figuras 3A-3D se distinguen esencialmente de los
controles 3E y 3F: la figura 3E muestra las células monocitarias
originales que se cultivaron en el medio nutriente (como se indica
en el ejemplo 2) durante 6 días, pero sin el agregado de
IL-3 y 2-mercaptoetanol. Luego se
agregó el FCCM. Estas células no estaban en condiciones de
diferenciarse en células grasas. La figura F muestra células que se
cultivaron durante 6 días con un medio completo (de acuerdo con el
ejemplo 2), y que luego fueron tratadas con medio nutriente (de
acuerdo con el ejemplo 2) en lugar de FCCM durante otros 6 días más.
Por lo tanto, el FCCM contiene componentes que se requieren como
señalizadores de la diferenciación en células grasas.
El coloreado de las células con rojo Sudán en las
figuras 3A, B, C y D se lleva a cabo según la técnica descrita por
Patrick Jr., C. W., y col. "Epitelial Cell Culture: Breast", en
Methods of Tissue Engineering, Academic Press 2002, capítulo 4,
páginas 141-149.
B: Además de la fenotipización de las células
grasas por coloración con rojo Sudan, se realizó una caracterización
biomolecular de las células grasas a nivel del ARNm, a fin de
verificar si el programa genético de la célula grasa sufre una
correspondiente alteración después de la programación con el medio
acondicionador de células grasas y si son comprobables los
transcriptos típicos de ácido ribonucleico (ARNm) mensajero,
descritos para las células grasas, en las células grasas programadas
a partir de monocitos programables. Se amplificaron dos secuencias
de ARNm típicas para el metabolismo de las células grasas por medio
de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de sondas de ARN
aisladas de células madre indiferenciadas programables de origen
monocitario y, en una preparación de ensayo paralela de células
grasas programables, a saber "peroxisome proliferative activated
receptor gamma" (PPARG)-ARNm, (Tontonoz, P., y
col. "Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2,
lipid-activated transcription factor." Cell 79:
1147-1156 (1994), Código de acceso al Genbank; NM
005037) y "leptina (homólogo de obesidad, ratón)"-mRNA,(Zhang
Y., y col. "Positional cloning of the mouse obese gene and its
human homologue." Nature 372: 425-432 (1994),
Genbank, código de acceso: NM-000320).
El aislamiento del ARN necesario para este fin,
la metodología de transcripción inversa y las condiciones de la
amplificación por PCR de las secuencias de ARNm deseadas se llevaron
a cabo tal como se describen detalladamente en el estado de la
técnica, véase para ello Ungefroren H., y col., "Human pancreatic
adenocarcinomas express Fas and Fas ligand yet are resistant to
Fas-mediated apoptosis", Cancer Res. 58:
1741-1749 (1998).
Para ello se seleccionaron los correspondientes
cebadores preparados para la amplificación por PCR de forma tal que
los cebadores "directos" e "inversos" se unieran a las
secuencias de ARNm, cuyas áreas homólogas están en el gen
cromosómico en dos exones diferentes y están separadas entre sí por
un gran intrón. De esta manera se pudo asegurar que el fragmento de
amplificación obtenido proviene del ARNm contenido en la célula y no
de la secuencia existente en el ADN cromosómico. En particular, para
PPAR-\gamma y para leptina se seleccionaron las
siguientes secuencias de cebadores:
PPAR-\gamma: "cebador
directo"; 265-288 (secuencia genética
correspondiente en el exón 1), "cebador inverso":
487-465 (secuencia genética correspondiente en el
exón 2), de esta manera resulta un fragmento de amplificación de
487-265 bp = 223 bp, véase la figura 3G. Tal como se
desprende de la figura 3G, pueden comprobarse trazas de ARNm
PPAR-\gamma específico transcripto ya en la célula
madre programable y en la línea celular tumoral
HL-60 (de una línea celular de leucemia promieloica
humana), pero con una banda de señales significativamente menor que
en la propia célula grasa. Por el contrario, la proteína específica
de la célula grasa, leptina, sólo puede comprobarse en las células
grasas derivadas de las células madre programables a nivel del ARNm
por PCR de transcriptasa inversa.
Las células madre programables aplicadas para el
control (célula madre programable) y las líneas celulares tumorales
humanas HL-60, Panc-1 y
WI-38 no transcriben la leptina. Como controles
negativos se evaluaron en forma simultánea todas las preparaciones
sin el agregado de la transcriptasa inversa (célula grasa/-RT) y
sondas de H_{2}O. Comprobando el gen "de servicio" GAPDH en
los controles positivos se asegura que se haya realizado en forma
reglamentaria cada uno de los pasos de amplificación por PCR en cada
una de las preparaciones.
A: Para la programación de las células madre
indiferenciadas programables de origen monocitario de acuerdo con el
ejemplo 2 y convertirlas en células hepáticas se generó en primer
lugar un medio acondicionado. Para ello se prepararon 40 g de tejido
hepático humano de la siguiente manera:
Primero se lavó el tejido hepático varias veces
con PBS, a fin de liberarlo lo más posible de los eritrocitos. Luego
se trituró el tejido en una placa petri y se incubó con una solución
de disociación durante aproximadamente 45 minutos a temperatura
ambiente. La solución de disociación estaba compuesta por 40 ml de
PBS (suero fisiológico tamponado con fosfato), 10 ml de una solución
de tripsina 1:10 diluida con PBS y 30 mg de colagenasa de tipo II
(Rodbel M., y col. J. Biol. Chem. 239: 375 (1964)). Después de
incubar durante 45 minutos se pasaron los trozos de tejido por un
tamiz (véase el ejemplo 6).
A continuación se pasó la mezcla a un tubo Falcon
de 50 ml, se llenó hasta 50 ml con PBS y se centrifugó durante 10
minutos a 1800 rpm.
Después de centrifugar se descartó el
sobrenadante y se lavó el pellet celular que contenía las células
hepáticas nuevamente con 50 ml de PBS y se centrifugó. El
sobrenadante obtenido de esta manera se descartó nuevamente y el
pellet celular se tomó en 25 ml de un medio de la siguiente
composición y se incubó en frascos para cultivo celular (250 ml de
volumen) durante 10 días a 37ºC en incubadora:
Medio RPMI 1640 | 445,0 ml |
Suero de ternero fetal (FCS) | 50,0 ml |
Solución de insulina | 0,5 ml |
Solución de penicilina (100 U/l)/estreptomicina (100 \mug/l) | 5,0 ml |
Volumen total | 500,0 ml |
El medio nutriente contenía adicionalmente 5
\mug (10 ng/ml) de "factor de crecimiento epidérmico"
(Pascall, I.C. y col., J. Mol. Endocrinol. 12: 313 (1994)).
La composición de la solución de insulina fue como se describe en el
ejemplo 6.
Durante la incubación de 10 días, el medio
acondicionado con células hepáticas (LCCM) se convirtió en
sobrenadante. El sobrenadante se reemplazó a los 2 - 4 días por un
medio nutriente nuevo. El LCCM obtenido al cambiar el medio se
filtró en condiciones de estériles (filtro con un tamaño de poro de
0,2 \mum) y se almacenó a -20ºC.
A continuación, 1 X 10^{6} células madre
indiferenciadas se cultivaron con 10 ml de un medio de la siguiente
composición en una placa petri (\diameter 100 mm) o un frasco de
cultivo.
LCCM | 100 ml |
Solución de insulina (ejemplo 6) | 0,1 ml |
Factor de crecimiento epidérmico | 1 \mug |
Factor de crecimiento de hepatocitos | 2 \mug |
El factor de crecimiento de hepatocitos
(Kobayashi, Y. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 220: 7 (1996))
usó con una concentración de 40 ng/ml. Luego de algunos días se
pudieron observar alteraciones morfológicas en células planas,
poligonales o mono o diploides (figura 4A). A los 10 - 12 días se
pudieron identificar los hepatocitos generados a partir de las
células madre indiferenciadas por medio de una comprobación
inmunohistoquímica del antígeno específico hepático
alfa-fetoproteína (Jacobsen, G. K. y col., Am. J.
Surg. Pathol. 5: 257-66 (1981)), tal como se indica
en las figuras 4B y 4C.
B: Además de la fenotipización de los hepatocitos
por comprobación inmunohistoquímica de la
alfa-fetoproteína se realizó una caracterización
biomolecular de los hepatocitos a nivel del ARNm, a fin de verificar
si el programa genético de las células madre luego de la
correspondiente programación con el medio acondicionado con células
hepáticas usado sufre una correspondiente alteración y si son
comprobables como ácido ribonucleico mensajero (ARNm) descrito como
típico para las células hepáticas en los hepatocitos provenientes de
las células madre de la invención. Para esta finalidad se investigó
la presencia de cinco diferentes secuencias de ARNm típicas de los
hepatocitos por medio de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) en sondas de ARN aisladas a partir de células madre
indiferenciadas programables de origen monocitario y en una
preparación de ensayo paralela de células hepáticas obtenidas por
programación de las células madre. En particular, se trataba de ARNm
de albúmina de Homo sapiens (Laven, R. M., y col. "The
sequence of human serum albumin cDNA and its expression in E.
coli." Nucleic Acids Res. 9: 6103-6114,
(1981), código de acceso al Genbank: NM-000477),
ARNm de alfa-fetoproteína (Morinaga T., y col.
"Primary structures of human alpha-fetoprotein
and its mRNA." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:
4604-4608 (1983), código de acceso al Genbank:
V01514), ARNm de "Human carbamyl phosphatase synthetase I"
(Haraguchi, Y., y col. "Cloning and sequence of a cDNA encoding
human carbamyl phosphate synthetase I: molecular analysis of
hyperammonemia" Gene 107:335-340 (1991), código
de acceso del Genbank D90282), ARNm de "Homo sapiens
coagulation factor II" (trombina, F2) (Degen, S. J. y col.
"Characterization of the complementary deoxyribonucleic acid and
gene coding for human protrombin" Biochemistry 22:
2087-2097 (1983), código de acceso al Genbank
NM-000506), ARNm de "Homo sapiens
coagulation factor VII" (acelerador de conversión de protrombina
en suero, F7) (NCBI Annotation Project. Direct Submission,
06-Feb-2002, National Center for
Biotechnology Information, NIH, Betesda, MD 20894, EEUU, código de
acceso al Genbank XM-027508).
La aislamiento del ARN necesario para ello, la
metodología de transcripción inversa y las condiciones de la
amplificación por PCR de las secuencias de ARNm deseadas se
realizaron tal como se describe detalladamente en el estado de la
técnica, véase al respecto Ungefroren H., y col., "Human
pancreatic adenocarcinomas express Fas and Fas ligand yet are
resistant to Fas-mediated apoptosis" Cancer Res.
58: 1741-1749 (1998).
Los correspondientes cebadores para la
amplificación por PCR se seleccionaron de forma tal que los
cebadores "directos" e "inversos" se unan a las secuencias
de ARNm, cuyas áreas homólogas están en el gen cromosómico en dos
exones diferentes y están separadas entre sí por medio de un gran
intrón. De esta manera pudo asegurarse que el fragmento de
amplificación obtenido proviene del ARNm contenido en la célula y no
de la secuencia existente en el ADN cromosómico.
Se seleccionaron las secuencias de cebadores
indicadas a continuación; los resultados de cada uno de los análisis
de PCR se reproducen en la figura 4D. Las células madre
indiferenciadas programables de la invención se designan allí como
"célula madre programable" y los hepatocitos derivados de ellas
por programación, como "hepatocito programable".
Alfa-fetoproteína: cebador
"directo" : 1458-1478 (secuencia genética
correspondiente en el exón 1), cebador "inverso" :
1758-1735 (secuencia genética correspondiente en el
exón 2), de esta manera resulta un fragmento de amplificación de
1758-1458 bp = 391 bp, véase la figura 4D.
Tal como indica la figura 4, se puede programar
la célula madre programable, en la que no se pueden comprobar
transcriptos específicos de ARNm para
alfa-fetoproteína, en un hepatocito (hepatocito
programable), que contiene este transcripto de ARNm (banda positiva
con un peso molecular de 301 bp). Así se explica también la
posibilidad de comprobación inmunohistoquímica de la
alfa-fetoproteína, tal como se indica en las figuras
4B y 4C. Los controles positivos, o sea el tejido hepático humano y
la línea celular de tumor hepático HepG2, transcriben asimismo el
ARNm específico de la alfa-fetoproteína, como lo
comprueban las bandas de 301 bp.
Albúmina: cebador "directo":
1450-1473 (secuencia genética correspondiente en el
exón 1), cebador "inverso": 1868-1844
(secuencia genética correspondiente en el exón 2), de esta manera
resulta un fragmento de amplificación de 1868-1450
bp = 419 bp, véase la figura 4D.
La figura 4D ya muestra trazas de ARNm
albúmina-específico transcripto en la célula madre
programable, mientras que los hepatocitos obtenidos por programación
de las células madre y el tejido hepático normal así como la línea
celular tumoral HepG2 -ambos fueron utilizados como control
positivo- expresan fuertemente el ARNm, como se aprecia en las
marcadas bandas.
Carbamiolfosfatasa-sintetasa I:
cebador "directo": 3135-3157 (secuencia
genética correspondiente en el exón 1), "cebador inverso":
4635-4613 (secuencia genética correspondiente en el
exón 2), de esta manera resulta un fragmento de amplificación de
4635-3135 = 1500 bp, véase la figura 4D.
La carbamoilfosfato sintetasa I es una enzima
específica de un hepatocito, que desempeña un papel importante en la
metabolización de la urea en el llamado ciclo metálico de la urea.
Esta función desintoxicante queda garantizada por medio de los
hepatocitos funcionales. Tal como documenta la figura 4D, se pueden
apreciar tanto en los hepatocitos generados a partir de células
madre programables, como también en los controles positivos (tejido
hepático humano y la línea celular tumoral HepG2) las bandas de ARNm
específicas (1500 bp) para la
carbamoilfosfato-sintetasa I. La expresión algo más
débil de la banda de ARNm para los hepatocitos programados se
manifiesta a través de la falta de sustrato en la bandeja de
cultivo.
Factor de coagulación II: cebador "directo":
1458-1481 (secuencia genética correspondiente en el
exón 1), cebador "inverso": 1901-1877
(secuencia genética correspondiente en el exón 2), de esta manera
resulta un fragmento de amplificación de 1901-1458 =
444 bp, véase la figura 4D.
Esta proteína, asimismo específica de
hepatocitos, puede comprobarse únicamente en los hepatocitos
programados y en el control positivo de tejido hepático humano a
nivel del ARNm por expresión de bandas a 444 bp, mientras que la
célula madre programable no muestra esta banda, es decir, el gen no
se transcribe allí, tal como puede apreciarse en la figura 4D.
Factor de coagulación VII: cebador
"directo": 725-747 (secuencia genética
correspondiente en el exón 1), cebador "inverso":
1289-1268 (secuencia genética correspondiente en el
exón 2), de esta manera resulta un fragmento de amplificación de
1289-725 = 565 bp, véase la figura 4D.
Tal como el factor de coagulación II, esta
proteína también se transcribe únicamente en hepatocitos programados
y en el control positivo (tejido hepático humano) (véanse las bandas
a 656 bp), aun cuando es más débil que el factor de coagulación II.
Ni la célula madre programable ni el control negativo (H_{2}O)
muestran esta banda de ARNm específica.
Glicerinaldehído-deshidrogenasa:
Este gen también denominado "housekeeping gene" puede
comprobarse en cada célula eucariota y sirve como control de una
amplificación por PCR realizada reglamentariamente en todas las
sondas, la que se evalúa conjuntamente en forma paralela y se genera
con el agregado de una cantidad definida de ARN proveniente de cada
una de las sondas celulares.
Como controles negativos se evaluaron
simultáneamente las sondas de H_{2}O en todas las preparaciones.
Cuando el H_{2}O no está contaminado con ARN, durante la PCR no se
produce un producto amplificado y no se puede comprobar ninguna
banda (sirve así de contracontrol).
Para la programación de las células madre
indiferenciadas programables de origen monocitario de acuerdo con el
ejemplo 2 y convertirlas en células cutáneas se generó en primer
lugar un medio acondicionado. Para ello se prepararon
1-2 cm^{2} de piel entera humana de la siguiente
manera:
El material cutáneo se liberó en principio en
condiciones estériles del subcutis. El tejido se lavó un total de 10
veces con PBS en un recipiente estéril, agitando vigorosamente.
Luego del segundo lavado se liberó nuevamente el tejido de los
restos demarcados de tejido conectivo.
Luego se colocó el material cutáneo en una placa
petri de 60 mm de diámetro, allí se mezcló con 3 ml de una solución
de tripsina 1:10 diluida con PBS y se cortó en pequeños trozos
(aproximadamente 0,5 a 1 mm^{3}). Posteriormente se agregaron a la
mezcla nuevamente 3 ml de la solución de tripsina 1:100 diluida con
PBS y la mezcla se incubó a 37ºC durante 60 minutos agitando
intermitentemente.
Después se dejaron sedimentar las partículas más
grandes y el sobrenadante que contenía los queratinocitos se desechó
y se centrifugó a 800 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante
generado ahora se pipeteó y el pellet celular se tomó en 3 ml de un
medio de la siguiente composición y se incubó en placas petri
(\diameter 100 mm) durante 15 días en incubadora a 37ºC.
DMEM | 333,5 ml |
Suero de ternero fetal (FCS) | 50,0 ml |
Medio Ham F12 | 111,0 ml |
Solución de penicilina (100 U/l)/estreptomicina (100 mg/l) | 5,0 ml |
Solución de insulina (véase el ejemplo 6) | 0,5 ml |
Volumen total | 500,0 ml |
El medio nutriente contenía 5 \mug de factor de
crecimiento epidérmico (para una especificación exacta, véase el
ejemplo 7) y 5 mg de hidrocortisona (Ref. Índice Merck: 12,
4828).
Durante la incubación de 15 días, el medio
acondicionado con células de queratinocitos KCCM se convirtió en
sobrenadante. El sobrenadante se reemplazó luego de
2-4 días por un medio nutriente nuevo. El KCCM
obtenido al cambiar el medio se filtró en condiciones de esterilidad
y se almacenó a -20ºC.
1 X 10^{6} células madre indiferenciadas se
cultivaron luego con 10 ml de un medio de la siguiente composición
en una placa petri (\diameter 100 mm) o un frasco de cultivo.
KCCM | 100 ml |
Solución de insulina (véase el ejemplo 6) | 0,5 ml |
Factor de crecimiento epidérmico (EGF) | 1 \mug |
Hidrocortisona | 1 mg |
Factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) | 2,5 \mug |
El factor de crecimiento de queratinocitos se usó
en una concentración de 25 ng/ml, tal como describen Finch y col.,
Gastroenterology 110: 441 (1996).
Pasados algunos días se pudo observar una
modificación morfológica de las células. A los 6 días se pudieron
comprobar los antígenos específicos de los queratinocitos,
citoqueratina 5 y 6, ambas unidas por el anticuerpo primario
utilizado (Exp. Cell. Res. 162: 114 (1986)) (figura 5A). A los 10
días ya se produjo en el cultivo una adherencia entre células
individuales claramente mayor, lo que permitía identificar una
visible unión de tejido de células confluyentes (figura 5B).
La preparación de células productoras de insulina
se realizó en frascos de cultivo de un volumen de aproximadamente
250 ml y paredes planas (frascos de cultivo celular T75).
Aproximadamente 5 X 10^{6} de las células preparadas de acuerdo
con el ejemplo 13 se suspendieron en aproximadamente 5 ml del medio
de cultivo indicado a continuación (medio de diferenciación para
células productoras de insulina) y tras colocarlas en los frascos se
mezclaron con otros 15 ml de medio de cultivo. Para la
diferenciación de las células, los frascos se incubaron en
incubadora en posición horizontal a 37ºC y 5% de CO_{2}.
RPMI 1640 | 445 ml |
Suero de ternero fetal (FCS) | 50 ml |
Solución de penicilina (100 U/l)/estreptomicina (100 \mug/l) | 5 ml |
Nicotinamida | 620 mg |
Glucosa | 360 mg |
Volumen total | 500 ml |
El medio nutriente contenía además 10 ng/ml de
factor de crecimiento epidérmico y 20 ng/ml de factor de crecimiento
de hepatocitos.
Las células se adhieren al fondo del frasco de
cultivo dentro de la primera hora. La diferenciación de las células
madre se siguió por medio de la producción de insulina. A tal fin se
cambió el medio de cultivo a intervalos de aproximadamente 2 a 3
días, se recogió el respectivo sobrenadante celular y se congeló a
-20ºC. Las células adheridas al fondo del frasco de cultivo pudieron
desprenderse, tal como se describe en el ejemplo 2, por tripsinación
del fondo.
El contenido de insulina de los sobrenadantes
recogidos se midió con ELISA
(Enzyme-linked-immunosorbent-assay)
contra insulina humana (Bruhn H. D., Fölsch U. R. (eds.), Lehrbuch
der Labormedizin: Grundlagen, Diagnostik, Klinik Pathobiochemie
(1999), página 189) y se comparó con el valor de control del medio.
Los resultados reproducidos en la figura 8 muestran que las células
alcanzaron el pico máximo de producción de insulina a los 14 días de
cultivo. Las cantidades de insulina producidas por las células
tratadas en el curso de la diferenciación aumentaron luego de 14
días hasta 3 \muU/ml, mientras que en el medio de control no se
pudo detectar insulina humana. Las barras que aparecen en la figura
8 representan determinaciones triples de tres experimentos aislados
independientes.
Además de la determinación de la producción de
insulina en las células madre desprogramadas diferenciadas
productoras de insulina obtenidas según la invención, se determinó
la proporción de células productoras de insulina que, incluso tres
semanas después de realizada la indiferenciación expresan el
antígeno superficial específico de los monocitos CD14. Se demostró
que en gran parte (aproximadamente 30 al 40%) de estas células, aún
después de tres semanas de la indiferenciación se detectaba el
antígeno superficial específico de los monocitos CD14.
Como alternativa al uso de un medio acondicionado
con hepatocitos (LCCM), tal como se describe en el ejemplo 7, la
diferenciación de las células madre en hepatocitos se indujo
mediante el medio nutriente (Ha) indicado a continuación. La
preparación de hepatocitos a partir de células madre se realizó, a
su vez, en frascos de cultivo de un volumen de aproximadamente 250
ml y paredes planas (frascos de cultivo celular T75).
Aproximadamente 5 X 10^{6} de las células preparadas de acuerdo
con el ejemplo 13 se suspendieron en aproximadamente 5 ml del medio
de cultivo mejorado indicado a continuación (Ha, medio de
diferenciación para hepatocitos) y luego de colocarlas en los
frascos se mezclaron con otros 15 ml de medio de cultivo. Para la
diferenciación de las células, los frascos se incubaron en posición
horizontal en incubadora a 37ºC y 5% de CO_{2}.
Medio de diferenciación para los hepatocitos (Ha)
(modificado según Schwarz y col., "Multipotent adult progenitor
cells from bone marrow differentiate into functional
hepatocyte-like cells", J. Clin. Invest. 10
(109), 1291-1302 (2002)):
RPMI 1640 | 445 ml |
Suero de ternero fetal (FCS) | 50 ml |
Solución de penicilina (100 U/l)/estreptomicina (100 \mug/l) | 5 ml |
Volumen total | 500 ml |
El medio nutriente contenía además, 3 ng/ ml de
factor de crecimiento de fibroblastos 4 ("fibroblast growth
factor-4", FGF-4).
Las células se adhieren al fondo del recipiente
de cultivo dentro de la primera hora. La diferenciación de las
células madre se siguió por medio de la producción de albúmina. A
tal fin se cambió el medio de cultivo a intervalos de
aproximadamente 2 a 3 días, se recogieron los respectivos
sobrenadantes celulares y se congeló a -20ºC. Las células que se
adhieren al fondo del frasco de cultivo pudieron desprenderse por
tripsinación, tal como se describe en el ejemplo 2.
El contenido de albúmina del sobrenadante reunido
en los diferentes intervalos se midió por medio de ELISA
(Enzyme-linked-immunosorbent-assay)
contra albúmina humana (de acuerdo con el protocolo de la empresa
Bethyl Laboratories Inc. y Schwarz y col. a.a.O.) y se comparó con
el valor de control del medio. Los resultados reproducidos en la
figura 9 muestran que la producción de albúmina de las células
durante el período de 14 a 28 días de cultivo permaneció
aproximadamente constante. Las mediciones se realizaron en los días
0 (valor de control del medio),los días 14, 21, 28 y 30 con respecto
del momento en que se agregó el medio Ha. Los valores calculados en
cada caso fueron de aproximadamente 5 ng/ml, 450 ng/ml, 425 ng/ml,
440 ng/ml y 165 ng/ml. Las barras que aparecen en la figura 9
indican determinaciones triples de tres experimentos individuales
independientes.
La comprobación de la coexpresión de albúmina y
el antígeno específico de los monocitos CD14 en los hepatocitos
derivados de células madre indiferenciadas se realizó tanto por
coloración doble (A) como por análisis FACS (B).
A) Las células madre de la invención
diferenciadas en hepatocitos de acuerdo con el ejemplo 10 se
cultivaron en vidrios de tapa de una placa de 6 pocillos y se
fijaron con metanol tal como se describe en el ejemplo 4. A
continuación se realizó una doble coloración, a fin de comprobar la
expresión simultánea del antígeno CD14 (marcador fenotípico de
monocitos), por un lado, y de albúmina (marcador específico del
hígado), por otro.
Para ello se incubaron primeramente las células
tal como se describe en el ejemplo 4 con un anticuerpo primario
contra albúmina humana (cobayos contra albúmina humana) en una
dilución de 1:50 en PBS. Luego de una fase de lavado, las células se
incubaron con un anticuerpo secundario ratón
anti-rata, que fija el anticuerpo del cobayo,
también en una dilución de 1:50 en PBS durante 45 minutos. A
continuación se realizó el proceso de coloración de acuerdo con el
ejemplo 4 según el procedimiento de Cordell J. L., y col. (a.a.O.)
con el complejo rojo APAAP.
Para la segunda fase de coloración, las células
se incubaron con el anticuerpo primario ratón
anti-humano-CD14, y luego de una
fase de lavado según el ejemplo 4 se colorearon con el kit ABC de
estreptavidina de vectastaína (Vector) de acuerdo con el
procedimiento de Hsu, S. M., y col. "The use of antiavidin
antibody and
avidin-biotin-peroxidase complex in
immunoperoxidase technics" Am. J. Clin. Patol. 75 (6):
816-821 (1981) con el complejo DAB (marrón) (Vector
Laboratories).
Finalmente se realizó la contracoloración de
núcleo con hemalauna tal como se describe en el ejemplo 4, así como
la encapsulación en gelatina de glicerina Kaiser.
Los resultados se reproducen en la figura 10. La
figura muestra la expresión del antígeno CD14 con una coloración
marrón, que se reduce lentamente a medida que avanza la
transformación morfológica de las células en hepatocitos, mientras
que la expresión de albúmina aumenta como coloración roja a medida
que maduran los hepatocitos. La imagen Nº4 en la figura 10 muestra
las células luego de una estimulación de tres semanas con el medio
acondicionado con hepatocitos.
B) Paralelamente a la marcación doble, las
células madre de la invención diferenciadas en hepatocitos se
sometieron a un análisis FACS
("Fluorescence-activated cell sorting").
Primeramente se cosecharon las células madre de
la invención diferenciadas en hepatocitos de acuerdo con el ejemplo
10 desprendiéndolas mecánicamente del frasco de cultivo con un
raspador de células. Las células se lavaron cuidadosamente con PBS
del frasco y se lavaron dos veces en 10 ml de solución de PBS por
vez. Para ello, se colocaron las suspensiones de células en la
solución de PBS en un tubito de centrifugación de 15 ml y se
sedimentaron a 1600 revoluciones por minuto. El sedimento celular
resultante se diluyó con PBS de manera tal de que hubiera
exactamente 1 x 10^{5} células en 100 \mul de PBS.
A esta suspensión celular se agregaron luego 10
\mul de marcador de anticuerpo anti-CD14 marcado
con FITC (BD Pharmingen) o anticuerpo anti-albúmina
marcado con FITC (Beckmann) y anticuerpo
IgGl-ratón-anti-humano
inespecífico marcado con FITC. Luego de un período de incubación de
20 min se volvieron a suspender las células dos veces en 500 \mul
de PBS y se sedimentaron durante 5 minutos, cada vez a 1600
revoluciones y por último se aspiraron en 200 \mul de PS. Luego de
la resuspensión de las células se midió la fluorescencia con un
citómetro de flujo FACScalibur BD de la empresa BD Biosciences
(Franklin Lakes, NJ) (véase Bruhn H. D., Fölsch U. R. (eds.),
Lehrbuch der Labormedizin: Grundlagen, Diagnostik, Klinik
Pathobiochemie, 395-403 (1999); y Holzer U. y col.,
"Differential antigen sensitivity and costimulatory requirements
in human t1 and t2 antigen-specific CD4(+) cells
with similar TCR avidity" J. Immunol. 170 (3):
1218-1223 (2003)). La evaluación de los resultados
se realizó con el programa WinMDI de la empresa Microsoft siguiendo
el ejemplo de Marquez M. G., y col. "Flow cytometric analysis of
intestinal intra-epithelial lymphocytes in a model
of immunodeficiency in Wistar rats." Cytometry 41 (2):
115-122 (2000).
Los resultados del análisis FACS se han vertido
en la figura 11. La figura muestra la expresión del antígeno CD14
(línea superior) y el antígeno de albúmina (línea inferior), que se
midió en los monocitos indiferenciados (columna izquierda) y en las
células madre de la invención diferenciadas de los hepatocitos
(columna derecha). En los monocitos indiferenciados pudo comprobarse
una fuerte expresión del CD14, pero ninguna de la albúmina, mientras
que en los hepatocitos desarrollados a partir de monocitos
indiferenciados se pudo comprobar una expresión menor del CD14 y una
expresión muy fuerte de la albúmina.
Para clarificar en qué medida las células madre
programables sufren, in vivo, una diferenciación específica
luego de una inyección en el hígado, a través de la vena porta de un
animal receptor genéticamente idéntico una diferenciación específica
debido a los señalizadores existentes en el hígado, primeramente se
trataron hígados de ratas hembra LEW con retrorsina, a fin de
inhibir los hepatocitos existentes en el hígado (células
parenquimales hepáticas) en su actividad proliferativa (Ref. Lacone,
E., y col. "Longterm, near total liver replacement by
transplantation of isolated hepatocytes in rats treated with
retrorsine" Am. J. Pat. 153: 319-329 (1998)).
A tal fin, las ratas LEW recibieron una inyección
por vía intraperitoneal de 30 mg del alcaloide de pirrolicidina
retrorsina, dos veces en el curso de 14 días. Luego se realizó una
resección del 80% de los hígados pretratados de esta manera, seguida
de la administración de 5 x 10^{5} de las células madre
programables en 1 ml de PBS en la vena porta de los hígados
restantes. Las células madre se obtuvieron de monocitos de ratas
macho LEW, tal como se describió en el ejemplo 2. A los 5 días de la
administración de las células madre se realizó una biopsia de los
hígados para su evaluación histológica y para comprobar los tipos
celulares diferenciados de las células madre por medio de
hibridación in situ con fluorescencia (FISH) con sondas
específicas de cromosoma Y, tal como se describe detalladamente en
Hoebee, B.y col. "Isolation of rat
chromosome-specific paint probes by bivariate flow
sorting followed by degenerate oligonucleotide
primed-PCR." Cytogenet Cell Genet 66:
277-282 (1994).
La figura 7A muestra los hepatocitos positivos de
cromosoma Y (puntos rojos en el núcleo celular) derivados de células
madre de LEW macho el quinto día posterior a la inyección
intraportal de animales receptores hembras pretratados con
retrorsina que habían sufrido una resección de 80% del hígado. La
extracción selectiva de los mismo hígados el día 25 posterior a la
inyección de células madre indica la diferenciación de las células
madre en hepatocitos, células endoteliales y epitelios del conducto
biliar. En este momento, el tamaño del hígado ya había vuelto a
alcanzar su tamaño normal y > 90% de las células presentaban un
cromosoma Y. De aquí puede inferirse que las células madre
programables singénicas de origen monocitario inyectadas están en
condiciones de efectuar in vivo, una recomposición completa
del órgano hepático con una función metabólica normal. La figura 7C
muestra las respectivas curvas de supervivencia según
Kaplan-Meier (n = 4 por grupo), ratas tratadas con
células madre versus ratas receptoras no tratadas luego de la
aplicación de retrorsina y resección del 80% del hígado.
Los parámetros funcionales de la bilirrubina y el
amoníaco (NH_{3}) documentan la función metabólica total de los
animales tratados con células madre de larga supervivencia (figuras
7D y 7E).
Se realizó un cultivo y reproducción de monocitos
y la indiferenciación de las células en gran escala en frascos de
cultivo con el mismo medio nutriente usado para el cultivo en placas
con pocillos (véase el ejemplo 2). El medio nutriente contenía 2,5
\mug/500 ml de M-CSF (equivale a 2150 U) y 0,2
\mug/500 ml de interleucina 3 (IL-3).
Los monocitos aislados en el ejemplo 1 se
colocaron en el fondo de frascos de cultivo de un volumen de
aproximadamente 250 ml y paredes planas (frascos de cultivo celular
T75). Se pasaron aproximadamente 10 x 10^{6} células a cada uno de
los frascos y se completaron con 20 ml del medio nutriente indicado
más arriba. La determinación de la cantidad de células para la dosis
exacta por frasco se realizó según procedimientos conocidos, véase
Hay R. J., "Cell Quantification and Characterisation" en
Methods of Tissue Engineering, Academic Press (2002), capítulo 4,
páginas 55-84.
El frasco de cultivo celular se incubó durante 6
días en incubadora a 37ºC. Las células se depositaban a las 24 horas
en el fondo del envase. Cada dos días se retiró el sobrenadante y
los frascos se llenaron nuevamente con 20 ml de medio nutriente
nuevo.
El sexto día se enjuagaron los frascos con 10 ml
de PBS cada uno, después de haber pipeteado el medio nutriente. Con
este procedimiento se retiraron todas las células que no se habían
adherido al fondo de los frascos. Las células que crecieron
adheridas al fondo de los frascos se desprendieron con un raspador
de células. Las células sueltas se eliminaron de los frascos por
lavado con PBS y se reunieron en un tubo Falcon de 50 ml que se
centrífugo durante 10 minutos a 1800 rpm. El sobrenadante se desechó
y el sedimento se volvió a suspender en medio nuevo RPMI 1640 (2
ml/10^{5} células).
Esta suspensión celular pudo utilizarse
directamente para la diferenciación de diversas células diana.
Como alternativa, después de la centrifugación
las células se mezclaron con DMSO/FCS como medio de congelación y se
congelaron en una concentración de 10^{6}/ml.
El medio de congelación contenía 95% de FCS y 5%
de DMSO. Aproximadamente 10^{6} células se tomaron en 1 ml de
medio y se enfriaron en las siguientes etapas:
30 minutos sobre hielo;
2 horas a -20ºC en cajas de telgopor
prerrefrigeradas;
24 horas a -80ºC en telgopor;
almacenamiento en tubos en nitrógeno líquido
(N_{2}) a -180ºC
Claims (43)
1. Proceso para la producción de células madre
indiferenciadas programables de origen monocitario humano,
caracterizado porque consiste en:
- (a)
- Multiplicar los monocitos de sangre humana aislada en un medio de cultivo adecuado que contiene el factor de crecimiento celular M-CSF,;
- (b)
- Cultivar los monocitos durante o después de la etapa a) con un medio de cultivo que contiene IL-3; y
- (c)
- Obtener las células madre humanas adultas indiferenciadas programables, separando las células del medio de cultivo.
2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque en la etapa b) se agrega también un
compuesto mercapto al medio de cultivo.
3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 2,
caracterizado porque se usa un compuesto mercapto en el que
por lo menos un grupo carbono está unido al azufre, y en el que el
grupo(s) hidrocarburo puede estar sustituido/s por uno o
varios otros grupos funcionales.
4. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 2
ó 3, caracterizado porque, el compuesto mercapto es
2-mercaptoetanol o dimetilsulfóxido.
5. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1
a 4, caracterizado porque a continuación de la etapa b) y
antes de la etapa c), las células se ponen en contacto con un
disolvente orgánico biológicamente aceptable.
6. Proceso de acuerdo con la reivindicación 5,
caracterizado porque el disolvente orgánico biológicamente
aceptable es un alcohol con 1-4 átomos de
carbono.
7. Proceso de acuerdo con la reivindicación 6,
caracterizado porque el alcohol es etanol.
8. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 5
a 7, caracterizado porque las células se ponen en contacto
con la fase gaseosa del disolvente orgánico biológicamente
aceptable.
9. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1
a 8, caracterizado porque las células se suspenden en un
medio de cultivo celular apropiado a continuación de la etapa
c).
10. Proceso de acuerdo con la reivindicación 9,
caracterizado porque el medio es RPMI o DMEM.
11. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 9
ó 10, caracterizado porque el medio contiene una citoquina o
LIF.
12. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 9
a 11, caracterizado porque las células se suspenden en un
medio líquido y a continuación se congelan.
13. Proceso de acuerdo con la reivindicación 12,
caracterizado porque el medio es un medio de cultivo
celular.
14. Células madre indiferenciadas, programables,
de origen monocitario humano caracterizadas por el antígeno
de superficie monocitario específico CD14 y al menos un marcador de
pluripotencia seleccionado del grupo compuesto por CD117, CD123 y
CD135.
15. Composición farmacéutica, que contiene las
células madre indiferenciadas, programables de acuerdo con la
reivindicación 14.
16. Uso de las células madre indiferenciadas,
programables de acuerdo con la reivindicación 14, para producir
células diana y tejidos diana in vitro.
17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16,
caracterizado porque
- a)
- se tritura tejido que contiene las células diana deseadas;
- b)
- se obtienen las células diana y/o fragmentos de las mismas del tejido triturado;
- c)
- se incuban las células diana y/o fragmentos de las mismas en un medio de cultivo apropiado;
- d)
- se recolecta el sobrenadante del medio de cultivo durante y después de la incubación como medio acondicionado por células diana; y
- e)
- se dejan crecer las células madre en presencia del medio acondicionado por células diana para reprogramar/diferenciar las células madre en las células madre deseadas.
18. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 16 ó
17 para la producción de adipocitos, neuronas y células gliales,
células endoteliales, queratinocitos, hepatocitos o células de
islote.
19. Proceso para la producción de células madre
programables indiferenciadas modificadas transgénicamente de origen
monocitario humano, caracterizado porque las células
producidas según las reivindicaciones 1 a 13 se transfectan con uno
o más genes.
20. Células madre de acuerdo con la
reivindicación 14 caracterizadas porque las células madre
programables indiferenciadas son modificadas transgénicamente por
transfección con uno o más genes.
21. Composición que contiene células madre
indiferenciadas programables de acuerdo con las reivindicaciones 14
ó 20 en un medio adecuado.
22. Uso de las células madre indiferenciadas
programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la
preparación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento de la
cirrosis hepática.
23. Uso de las células madre indiferenciadas
programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la
preparación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento de la
insuficiencia pancreática.
24. Uso de las células madre indiferenciadas
programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la
preparación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento de la
insuficiencia renal aguda y crónica.
25. Uso de las células madre indiferenciadas
programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la
preparación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento de
hipofunciones hormonales.
26. Uso de las células madre indiferenciadas
programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la
preparación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento del
infarto cardíaco.
27. Uso de las células madre indiferenciadas
programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la
preparación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento de la
embolia pulmonar.
28. Uso de las células madre indiferenciadas
programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la
preparación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento de la
apoplejía cerebral.
29. Uso de las células madre indiferenciadas
programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la
preparación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento de
daños cutáneos.
30. Uso de las células madre indiferenciadas
programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la
preparación de un compuesto farmacéutico apropiado para la
preparación in vivo de células y tejidos diana.
31. Tejidos diana somáticos y células de tejidos
diana somáticos aislados diferenciados, obtenidos por reprogramación
de las células madre de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20,
caracterizados por el antígeno de superficie CD14 asociado a
la membrana.
32. Células y/o tejidos diana somáticas de
acuerdo con la reivindicación 31, seleccionados del grupo formado
por adipocitos, neuronas y células gliales, células endoteliales,
queratinocitos, hepatocitos y células de islote.
33. Células diana y/o tejidos diana somáticas de
acuerdo con las reivindicaciones 31 ó 32, caracterizadas
porque se transfectan con uno o más genes.
34. Materiales implantables recubiertos con una
capa de las células madre indiferenciadas programables de acuerdo
con las reivindicaciones 14 ó 20 o las células diana y/o tejidos
diana somáticos de acuerdo con las reivindicaciones 31 a 33.
35. Materiales implantados de acuerdo con la
reivindicación 34, caracterizados porque los materiales son
prótesis.
36. Materiales implantables de acuerdo con la
reivindicación 35, caracterizados porque las prótesis se
seleccionan del grupo formado por válvulas cardíacas, prótesis
vasculares, prótesis óseas y de cartílagos.
37. Materiales implantables caracterizados
porque son materiales de soporte artificiales y/o biológicos que
contienen las células madre indiferenciadas programables de acuerdo
con las reivindicaciones 14 ó 20 o las células diana de acuerdo con
las reivindicaciones 31 a 33.
38. Materiales implantables de acuerdo con la
reivindicación 37, caracterizados porque los materiales de
soporte son bolsas o cámaras para su introducción en el cuerpo
humano.
39. Uso de una bolsa o una cámara de acuerdo con
la reivindicación 38 que contiene células de islote de acuerdo con
la reivindicación 32 para la producción de una estructura
farmacéutica adecuada para ser usada como cámara de entrada de
células de islote artificial para el suministro de insulina.
40. Uso de una bolsa o una cámara de acuerdo con
la reivindicación 38, que contiene adipocitos de acuerdo con la
reivindicación 32 para la producción de una estructura farmacéutica
que comprende polímeros artificiales llenos de adipocitos, adecuados
para reconstruir el pecho después de operaciones y en otras
indicaciones de corrección plástica y/o cosmética.
41. Materiales implantables de acuerdo con la
reivindicación 34 o 38, caracterizados porque son sistemas de
cámara de entrada semipermeables que contienen células diana
somáticas, aisladas, diferenciadas de acuerdo con las
reivindicaciones 31 ó 32.
42. Uso del sistema de cámara de entrada
semipermeable de acuerdo con la reivindicación 41 para la producción
de una estructura farmacéutica adecuada para el tratamiento in
vivo de enfermedades endocrinas, metabólicas o hemostáticas.
43. Uso de M-CSF y
IL-3 caracterizado porque es para la
producción de células madre indiferenciadas programables de origen
monocitario humano en un medio de cultivo.
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