CN101760446B - 制备单核细胞型干细胞的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种细胞分离，培养，扩增的方法及应用，具体是指单核细胞型干细胞的制备方法及在制备药物中的应用。本发明通过从人的血液中分离单核细胞，在含有细胞生长因子的培养基中培养和扩增单核细胞，从培养基中分离得到单核细胞型干细胞。本发明的优点是使用的原料来源广泛，使用效果好，以及在治疗过程中更安全、可靠。而且能够进行自体移植。本发明对医疗的发展、疾病的治疗具有广泛的用途。

Description

制备单核细胞型干细胞的方法及应用

技术领域

本发明涉及细胞分离，培养，扩增的方法及应用，具体是指单核细胞型干细胞的制备方法及在制备药物中的应用。

技术背景

多功能性的干细胞是人体的一种宝贵资源。干细胞被广泛用来进行研究，药物生产和药物治疗，其中包括骨髓干细胞移植。干细胞可以用来研究信号系统调节分化过程，也可以用来查明并测试药物的有效性和毒副作用，或用于更换由于疾病或环境的影响而损坏的组织。然而，当前多能干细胞生物学和药用前景存在着很大的缺点和争议。

使用来自胎儿，脐带或体外受精胚胎组织的多能干细胞会引起伦理和法律问题，同时还会带来感染的问题和免疫排斥的问题。特别是胚胎干细胞还有一些特定的缺点。举例来说，胚胎干细胞要通过若干中间阶段才成为需要的细胞类型来治疗某种特定疾病。此外，胚胎干细胞可能会被受捐助人的免疫系统所排斥，因为胚胎干细胞的捐助人和受捐助人往往不是同一个人。

其中一个能规避这些问题的方法是利用自体干细胞，优选外周血。骨髓细胞中有部分细胞能够逆向分化成血液细胞系以外的其他细胞。然而，最近的研究提出对这一结果提出质疑，这样的逆向分化，可能是成熟细胞与干细胞融合产生的新的干细胞。重要的是，从骨髓中获取干细胞往往是一个痛苦和繁琐的过程。

因此，需要发明出一个分离，培养，保持，扩增，分化为干细胞的方法(尤其是容易提取的成人干细胞)，并培养成各种细胞类型以用于多种用途。这些用途可能包括但不限于使用自体干细胞来治疗疾病和改善疾病带来的症状。

发明内容

本发明提供了一个由单核细胞制成干细胞的方法。本发明还包括制备，扩增和使用该种单核细胞型干细胞和该种干细胞衍生物的方法。本发明中的单核细胞型干细胞来自于外周血，外周血转化生成的干细胞具有很高的成本效益。这些单核细胞型干细胞可以很容易进行体外扩增。本发明中的单核细胞型干细胞可以用来治疗疾病，改善与任何与此类疾病有关的症状。

本发明提供的分离单核细胞和转化方法包括分离外周血单核细胞和用细胞因子处理单核细胞。这些细胞因子包括M-细胞集落刺激因子(M-CSF)，白介素-6(IL-6)和白血病抑制因子(LIF)。在这些细胞因子培养下，单核细胞扩增分化成多功能性干细胞。处理前的单核细胞可以是经过冷冻复苏的细胞，而处理后的单核细胞型干细胞也可以冷冻保存。

本发明中的单核细胞型干细胞具有明显的干细胞表现型，这些表现型至少包括一种下面的细胞表面标志(MAC-1，CD14，CD34，CD40和CD45)，或至少能够生产一种细胞因子(IL-13，IL-6和IL-12p70)，或显示出吞噬活性，或显示淋巴细胞活化活性，或显示对胰蛋白酶，乙二胺四乙酸的耐受性，或显示对利多卡因的敏感性。获取的单核细胞型干细胞的表现型中，优选吞噬活性，其次是至少有一个以上细胞表面标志，其次是生产上面的任意一种细胞因子，其次是显示淋巴细胞活化活性，其次是显示对胰蛋白酶，乙二胺四乙酸的耐受性，其次是显示对利多卡因的敏感性。

本发明获取的单核细胞型干细胞至少表达下面各种细胞表面抗原的一种：MAC-1，CD14，CD34，CD40和CD45。本发明获取的多功能干细胞优选不表达CD la和CD83的细胞。

本发明提供的方法包括分离和获取单核细胞型干细胞，和对干细胞用诱导分化剂进行有效的诱导分化。本发明优选使用用于扩增和维持的培养液进行诱导分化。本发明优选人的单核细胞型干细胞，本发明也包括使用冷冻保存的单核细胞型干细胞和单核细胞型干细胞分化的功能细胞。

本发明还提供了一种识别细胞类型的方法和根据上述方法鉴定出的分化的功能细胞。本发明对细胞扩增，分化的描述是本行业中具备普通技能的人士所通常理解的含义。例如，本发明对单核细胞型干细胞的维持，增长和分化为神经细胞所采用的神经细胞生长因子，维持，增长和分化的条件有非常详细的描述。

本发明还对单核细胞型干细胞的维持，增长和分化为血管内皮细胞，上皮细胞，T，NK淋巴细胞，巨噬细胞和肝细胞所采用的细胞生长因子，维持，增长和分化的条件有非常详细的描述。本发明的单核细胞型干细胞包括但不仅仅局限于人，也包括其它哺乳动物的来源。

本发明的单核细胞型干细胞用于治疗的疾病包括但不限于阿尔茨海默氏症，帕金森氏症，老年痴呆症，多发性硬化症，与年龄有关的中枢神经系统(CNS)，包括时间，日期，位置或身份混乱，和/或最近的记忆丧失，获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)的相关性痴呆，脑损伤，囊肿，自体免疫疾病，细菌感染，脓肿，病毒感染，脑肿瘤，癫痫，神经创伤，手术切口，糖尿病溃疡，血友病溃疡，静脉曲张溃疡，固体血管源性肿瘤，白血病，血管瘤，听神经瘤，神经纤维瘤，沙眼，化脓性肉芽肿，类风湿性关节炎，牛皮癣，糖尿病性视网膜病变，早产儿视网膜黄斑变性，角膜移植排斥反应，新生血管性青光眼，晶状体后纤维组织增生，虹彩，毛细血管，韦伯综合症，心肌血管盲目性新生，新生血管，毛细血管扩张，血友病，血管纤维瘤，肉芽，上皮细胞新增生，克罗恩病，化学，热，感染或自身免疫引起的肠道损伤，化学品，热，感染或自身免疫引起的皮肤损伤，系统性红斑狼疮，艾滋病，关节炎，胰岛素依赖型糖尿病，器官特异性自身免疫性疾病，风湿性关节炎，肠炎病，桥本甲状腺炎，甲亢病，接触性皮炎，牛皮癣，排斥反应，移植物抗宿主疾病，结节病，胃肠道过敏，嗜酸细胞增多，结膜炎，肾小球肾炎，驱虫感染，瘤型麻风病，糖尿病，高雪氏病，尼曼匹克症，寄生感染，癌症的免疫系统紊乱，化工(包括毒品和酒精)，物理，感染，或自身免疫引起的肝，肝癌，肝损害，癌症。本发明的单核细胞型干细胞与单核细胞型干细胞分化的功能细胞联合使用，可用于治疗上述疾病或改善与上述疾病有关的症状。

本发明提供了分离来自外周血的单核细胞，以及培养，扩增和分化成为单核细胞型干细胞的方法。本发明还提供了使用这种细胞治疗各种疾病或改善至少一种或更多这类疾病症状的方法。本发明的多功能成体干细胞来自于单核细胞，优选人类，也可以是家畜，宠物或其他哺乳动物。单核细胞来源的干细胞可被诱导分化成仍具有分化能力的细胞，或末端分化细胞，包括巨噬细胞，TNK淋巴细胞，上皮细胞，内皮细胞，神经细胞或肝细胞(即具备这种细胞的特征)。

本发明的单核细胞型干细胞的一个重要优点是能够进行自体移植。使用能进行自体移植的单核细胞型干细胞可以降低免疫排斥反应的危险和疾病的传播。此外，单核细胞型干细胞具有扩增的能力，从而产生足够数量的细胞，满足治疗疾病和改善与上述疾病有关的症状的需要。因此，本发明提供的方法比现有的方法更加有效。本行业内具有普通技能的人士根据常规方法能够很容易确定单核细胞型干细胞的剂量和给药方式。因此，存储，扩增和分化单核细胞型干细胞对于进行自体移植具有非常宝贵的价值。

本发明的另一个优点是外周血来源丰富，可以安全，经济的得到。此外，外周血很容易再生，可以能提供持续的自体来源。该项发明的另一个好处是单核细胞型干细胞来源于成人，不存在胚胎干细胞面临的道德和伦理的争议。本发明所涉及的专业术语是本行业内具备普通技能的人士所通常理解的含义。常用术语的定义在所有分子生物学书中可以找到，例如，Benjamin Lewin，Genes VIII，Oxford University Press，2004(ISBN 0-13-145140-5)；或者Ronald Hoffman，Hematology Basic Principles and Practice，Elsevier(ISBN978-0-443-06715-0)。

本发明提供了本行业内具备普通技能的人士所能够理解的制备单核细胞型干细胞的步骤和方法(一)分离外周血单核细胞，(二)用M-CSF，IL-6和LIF培养外周血单核细胞(三)在合适的细胞培养条件下扩增单核细胞型干细胞。M-CSF的剂量是(25-200纳克/毫升)，IL-6的剂量是(10-50纳克/毫升)，LIF的剂量是(100-2000活性单位/毫升)。优选50纳克/毫升的M-CSF，20纳克/ml的IL-6和1000活性单位/毫升LIF。

用于本发明的M-CSF，IL-6或LIF可以是天然来源，可以是人工合成，也可以是M-CSF，IL-6或LIF的具备功能的蛋白质片断。M-CSF，IL-6或LIF可单独使用也可以加上适当的缓冲剂后联合使用。本行业内具备普通技能的人士有能力决定出上述蛋白来源使用的剂量。

本发明利用一个或多个生长因子来扩增单核细胞型干细胞。同样的，本发明也利用一个或多个生长因子来分化单核细胞型干细胞成为功能细胞。本行业内具备普通技能的人士会认识到一个或更多的用来扩增的生长因子也可以用来分化单核细胞型干细胞。本发明中的生长因子包括，但不仅限于，巨噬细胞集落刺激生长因子(M-CSF)，白细胞介素-6(IL-6)和白血病抑制因子(LIF)。作为生长因子和/或分化诱导的化合物包括但不限于，脂多糖(LPS)，佛波13-脂(PMA)，干细胞生长因子(SGF)，重组人白细胞介素-2(IL-2)，白介素-3(IL-3)，表皮生长因子(EGF)，β-神经生长因子(NGF)，重组人血管内皮生长因子异构体(VEGF)的，和肝细胞生长因子(HGF)。生长因子用来扩增和分化的浓度为：LPS，0.5-1.0纳克/毫升；PMA，1-160纳摩/升(nmol/L)。；IL-2，500-2400活性单位/毫升；bNGF，50-1，600纳克/毫升；VEGF，12.5-100ng/ml；EGF，10-200纳克/毫升；HGF，25-200纳克/毫升。

细胞表面抗原和细胞标志的识别工作可以通过任何已知的方法来完成，其中包括免疫标记。下面所列的抗体可以单独使用也可以混合使用：MAC-1，CD14，CD34，CD40，CD45，CDla和CD83。免疫标记的方法是本行业内具备普通技能的人士所通常使用的方法。

荧光成像用于监测或检测细胞的方法是是本行业内具备普通技能的人士所通常使用的方法。例如，自动激发和发射装置，多维成像装置，和许多软件可用于荧光成像。通常荧光强度与细胞中蛋白或其他的分子的量成正比。

本发明采用但不限于下面所列出的针对以下抗原的单克隆抗体：IL-1，IL-3，IL-6，IL-10，CD14，CD34，CD40分子，CD45，HLA-DR，CDla，CD83，血管性血友病的因子(vWF)，角蛋白(Pan Ab-1)，细胞角蛋白7，微管相关蛋白IB，白介素-12p70，肿瘤坏死因子-1(TNF-a)，肿瘤坏死因子-受体1。此外，IgG15，IgG2A，IgG2B，神经元特异性烯醇化酶(NSE)，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)VEGF R2也在本发明中使用。

经过适当的分化诱导，单核细胞型干细胞有能力分化成多种细胞类型。例如，将200纳克/毫升bNGF加入单核细胞型干细胞培养后，在适当的生长条件下，单核细胞型干细胞分化成神经细胞。神经细胞的诱导分化的因子可能包括，但不仅限于，神经生长因子，脑源性神经营养因子，碱性成纤维细胞生长因子，色素上皮细胞衍生因子，或维甲酸。

又例如，将50纳克/毫升血管内皮生长因子加入单核细胞型干细胞培养后，在适当的生长条件下，单核细胞型干细胞分化成血管内皮细胞。血管内皮细胞的诱导分化的因子可能包括，但不仅限于胰岛素样生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。

又例如，将100纳克/毫升上皮细胞表皮生长因子加入单核细胞型干细胞培养后，在适当的生长条件下，单核细胞型干细胞分化成上皮细胞。上皮细胞的诱导分化的因子可能包括，但不仅限于：高浓度钙离子，视黄酸，酸钠，维生素C，PMA，干扰素γ。

又例如，将1纳克/毫升LPS和1200活性单位/毫升IL-2加入单核细胞型干细胞培养后，在适当的生长条件下，单核细胞型干细胞分化成巨噬细胞和T淋巴细胞。上皮细胞的诱导分化的因子可能包括，但不仅限于：IL-4和IL-12和IL-18，CDS抗体，PMA，干扰素γ。

又例如，将50纳克/毫升肝细胞生长因子加入单核细胞型干细胞培养后，在适当的生长条件下5-7天，单核细胞型干细胞分化成肝细胞。肝细胞的诱导分化的因子可能包括，但不仅限于：视黄酸，苯巴比妥，二甲基亚砜，地塞米松，地塞米松和丁酰环磷酸腺苷。

本发明的单核细胞型干细胞除了其他用途外，还可以用来补充因为疾病引起的细胞减少的症状(例如癌症治疗)，或者更换损坏的组织。举例来说，帕金森症引起的神经组织中破坏；手术切口引起的内皮细胞受损；高雪氏病引起的巨噬细胞受损；皮肤烧伤引起的上皮细胞受损；莱姆病引起的T淋巴细胞减少；肝硬化引起的肝细胞受损。此外，患先天遗传疾病的人可以移植经过基因重组技术修正后的单核细胞型干细胞。具备的增殖能力单核细胞型干细胞能够提供数量充足的干细胞用于移植。这比目前所采用的干细胞移植程序更加有效。

有益效果：本发明使用的原料来源广泛，使用效果好，以及在治疗过程中更安全、可靠。而且能够进行自体移植。

说明书附图

图1人单核细胞体外分化线性图显示单核细胞在M-CSF，LIF，IL-6经过5天的培养分化成为单核细胞型干细胞；A，未分化的单核细胞；B，分化后的单核细胞型干细胞。

图2单核细胞型干细胞扩增图显示单核细胞型干细胞在M-CSF，LIF，IL-6的作用下呈现性增长；对照组中未经细胞因子作用的单核细胞数量没有变化。

图3HLA-DR染色图显示脂多糖处理后的单核细胞型干细胞分化为巨噬细胞；

A，HLA-DR抗体阴性对照；B，HLA-DR抗体染色。

图4脂多糖处理后单核细胞型干细胞HLA-DR，HLA-DQ，IL-10，TNF-α染色图显示脂多糖(LPS)处理后的单核细胞型干细胞分化为巨噬细胞。

图5单核细胞型干细胞分化的NK和T细胞对K562血液肿瘤细胞杀伤作用图；对照组中的细胞未经分化；单核细胞型干细胞在IL-2，IL-2和IL-15的分化作用下培养4天后，与K562血液肿瘤细胞按照5∶1的比例共同培养6小时。

图6Cadherin和Keratins染色图显示表皮生长因子处理后的单核细胞型干细胞分化为上皮细胞；A，Cadherin染色，B，Keratins染色，C，Cadherin染色，和Keratins染色重叠效果图，D，表皮生长因子处理后的单核细胞型干细胞的Cadherin和Keratins染色图；对照组未经表皮生长因子处理。

图7神经丝蛋白染色图显示神经细胞生长因子处理后的单核细胞型干细胞分化为神经细胞；神经细胞生长因子处理后的单核细胞型干细胞呈现出神经细胞的形状，神经丝蛋白染色进一步确认分化的细胞为神经细胞。

具体实施方式

下面对本发明的实施作具体说明：

实施例1从外周血中分离和培养单核细胞型干细胞。

抽取200毫升外周血，用RPMI 1640稀释同等体积，加入Ficoll-Hypaque，然后用贝克曼离心机离心(550g)30分钟，4℃。收获的白细胞层用RPMI 1640洗涤2-3次。这些细胞可以立即保存在液氮中，也可以进行培养分离单核细胞。按照2百万个细胞/毫升的浓度加入培养液稀释后，把细胞转入培养皿中培养8-12小时(37℃，8％CO2)，去掉浮动细胞，RPMI1640培养基冲洗5次。加入5-10毫升含10％小牛血清的RPMI 1640培养基，强力吹洗附着在培养皿上的细胞，得到90-95％纯的单核细胞。用抗体结合磁珠法可以进一步得到99％纯的单核细胞。单核细胞加入50纳克/毫升的M-CSF，1000活性单位/毫升LIF，20纳克/毫升的IL-6经过5天的培养，50％左右的细胞呈现出拉长的细胞形态，类似于纤维细胞，这些逆向分化的单核细胞被称为单核细胞型干细胞(图1)。

在这个例子中，单核细胞型干细胞的特征是对胰蛋白酶和/或EDTA或中性蛋白酶的消化作用有很强的耐受性。胰蛋白酶和/或EDTA，或中性蛋白酶处理60分钟也不能将单核细胞型干细胞从培养皿的表面剥离。因此，为了获得培养的单核细胞型干细胞，在加入利多卡因5-8分钟后，需要用移液管强力吹洗。本行业内具有普通技能的人士能够认识到M-CSF，LIF和IL-6可以在不同的生长条件被用来扩增单核细胞型干细胞(图2)，另外，虽然本发明所披露的特征足以区别单核细胞型干细胞于其他类型的细胞，本发明预计还会有更多的单核细胞型干细胞特征会被未来的工作所发现。

实施例2巨噬细胞，T淋巴细胞和NK细胞的分化

为了证实单核细胞型干细胞具备分化为T淋巴细胞的能力，经过50纳克/毫升的M-CSF，1000活性单位/毫升LIF，20纳克/毫升的IL-6处理14天的单核细胞加入5纳克/毫升的脂多糖(巨噬细胞激活因子)处理两天。经过这样处理后的单核细胞型干细胞被转化为巨噬细胞。这种转变通过以下的实验所证实，形态特征，HLA-DR，HLA-DQ的增加，IL-10和TNF-a的免疫染色(图3，图4)。

为了证实单核细胞型干细胞具备分化为T淋巴细胞的能力，经过50纳克/毫升的M-CSF，1000活性单位/毫升LIF，20纳克/毫升的IL-6处理14天的单核细胞加入1200活性单位/ml的IL-2(T淋巴细胞激活因子)培养4天。经过这样处理后的单核细胞型干细胞被转化为T淋巴细胞。这种转变通过以下的实验所证实。94％的干细胞表达CD3，在表达CD3的细胞中有70％的细胞表达CD8。IL-2诱导的细胞获得了杀死靶细胞能力。具备细胞毒性是功能性T淋巴细胞的一个重要标记。按照5∶1的效应细胞与靶细胞的比例，IL-2的诱导产生的淋巴细胞裂解40±7％，而对照组中只有5±3％的靶细胞被裂解(图5)。

为了证实单核细胞型干细胞具备分化为NK细胞的能力，经过50纳克/毫升的M-CSF，1000活性单位/毫升LIF，20纳克/毫升的IL-6处理14天的单核细胞加入1200活性单位/ml的IL-2和20纳克/毫升的IL-15(NK细胞激活因子)培养4天。经过这样处理后的单核细胞型干细胞被转化为NK细胞。这种转变通过以下的实验所证实。82％的干细胞表达CD56，在表达CD3的细胞中有70％的细胞表达CD16。IL-2和IL-15诱导的细胞获得了杀死靶细胞能力。具备细胞毒性是NK细胞的一个重要标记。按照5∶1的效应细胞与靶细胞的比例，IL-2的诱导产生的淋巴细胞裂解60±7％，而对照组中只有10±3％的靶细胞被裂解(图5)。

实施例3上皮细胞分化

为了证实单核细胞型干细胞具备分化为上皮细胞的能力，经过50纳克/毫升的M-CSF，1000活性单位/毫升LIF，20纳克/毫升的IL-6处理14天的单核细胞加入100纳克/毫升表皮生长因子(EGF)，培养4天。经过这样处理后的单核细胞型干细胞75％显示一个上皮细胞形态，71±4％的细胞在免疫染色后显示，68±5％的细胞显示E-cadherin阳性，这两种蛋白都是上皮细胞标记性蛋白。对照组只有4±1％pan-keratins阳性，3±2％E-cadherin阳性(图6)。因此，本发明的单核细胞型干细胞能够被诱导分化成非血细胞的其他类型细胞。本行业中具备普通技能的人士利用已知的常规技术能够确定合适的诱导分化剂量。

实施例4神经细胞分化

为了证实单核细胞型干细胞具备分化为神经细胞的能力，经过50纳克/毫升的M-CSF，1000活性单位/毫升LIF，20纳克/毫升的IL-6处理14天的单核细胞加入200纳克/，毫升bNGF(神经细胞生长因子)培养4天。经过这样处理后的单核细胞型干细胞90％显示出神经元形态，这些细胞有一个更小的细胞体和显示出轴状突起。5-8天之后，其中一些极长的轴状突起形成细胞与细胞的接触，并建立了一个神经网络。这些成熟的神经细胞免疫特征为神经元特异性烯醇化酶(NSE)，神经丝蛋白(NF)和微管相关蛋白-IB染色呈阳性，这些蛋白是众所周知的神经细胞标记(图7)。对照组很少或几乎没有发现神经细胞分化。本发明的单核细胞型干细胞能够被其他的诱导因子分化成神经细胞。本行业中具备普通技能的人士利用已知的常规技术能够确定合适的诱导分化剂量。

实施例5内皮细胞分化

为了证实单核细胞型干细胞具备分化为内皮细胞的能力，经过50纳克/毫升的M-CSF，1000活性单位/毫升LIF，20纳克/毫升的IL-6处理14天的单核细胞加入50纳克/毫升血管内皮生长因子(VEGF)培养4天。经过这样处理后的单核细胞型干细胞90％显示出内皮细胞排列形态。这些成熟的神经细胞免疫特征为VEGF-R2，VEGF-R3和von Willebrand’sFactor(vWF)染色呈阳性，这些蛋白是众所周知的内皮细胞标记。对照组很少或几乎没有发现内皮细胞分化。本发明的单核细胞型干细胞能够被其他的诱导因子分化成内皮细胞。本行业中具备普通技能的人士利用已知的常规技术能够确定合适的诱导分化剂量。

实施例6肝细胞分化

为了证实单核细胞型干细胞具备分化为肝细胞的能力，经过50纳克/毫升的M-CSF，1000活性单位/毫升LIF，20纳克/毫升的IL-6处理14天的单核细胞加入100纳克/毫升重组人肝细胞生长因子(HGF)培养4天。经过这样处理后的单核细胞型干细胞81％显示出圆形或椭圆形扁平形态。75±7％的细胞albumin染色呈阳性，35±4％的细胞染色cytokeratin 7呈阳性，这些蛋白是众所周知的肝细胞标记。对照组只有8±5％和3±5％的细胞albumin和cytokeratin 7染色呈阳性。本发明的单核细胞型干细胞能够被其他的诱导因子分化成肝细胞。本行业中具备普通技能的人士利用已知的常规技术能够确定合适的诱导分化剂量。

Claims (4)

1.制备单核细胞型干细胞的方法，其特征在于包括下述步骤：

a)从人的血液中分离单核细胞；

b)在含有细胞生长因子的培养基中培养和扩增单核细胞，其中的生长因子为50纳克/毫升的M-CSF，1000活性单位/毫升LIF，20纳克/毫升的IL-6，

c)从培养基中分离得到单核细胞型干细胞，单核细胞型干细胞：

显示对胰蛋白酶，乙二胺四乙酸，中性蛋白酶的消化作用的耐受性，同时还显示对利多卡因的敏感性。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述培养基为RPMI。

3.根据权利要求1所述方法所制备的单核细胞型干细胞在制药中的应用，其特征在于，用于制备巨噬细胞，T淋巴细胞，NK细胞，神经细胞，上皮细胞，内皮细胞，肝细胞。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于单核细胞型干细胞在制备治疗下列疾病的药物组合物中的用途：阿尔茨海默氏症，帕金森氏症，老年痴呆症，多发性硬化症，与年龄有关的中枢神经系统混乱，脑损伤，囊肿，自体免疫疾病，细菌感染，脓肿，病毒感染，脑肿瘤，癫痫，神经创伤，手术切口，糖尿病溃疡，血友病溃疡，静脉曲张溃疡，固体血管源性肿瘤，白血病，血管瘤，听神经瘤，神经纤维瘤，沙眼，化脓性肉芽肿，类风湿性关节炎，牛皮癣，糖尿病性视网膜病变，早产儿视网膜黄斑变性，角膜移植排斥反应，新生血管性青光眼，晶状体后纤维组织增生，虹彩，毛细血管，韦伯综合症，心肌血管盲目性新生，新生血管，毛细血管扩张，血友病，血管纤维瘤，肉芽，上皮细胞新增生，克罗恩病，化学、热、感染或自身免疫引起的肠道损伤，化学品、热、感染或自身免疫引起的皮肤损伤，系统性红斑狼疮，艾滋病，关节炎，胰岛素依赖型糖尿病，器官特异性自身免疫性疾病，风湿性关节炎，肠炎病，桥本甲状腺炎，甲亢病，接触性皮炎，牛皮癣，排斥反应，移植物抗宿主疾病，结节病，胃肠道过敏，嗜酸细胞增多，结膜炎，肾小球肾炎，驱虫感染，瘤型麻风病，糖尿病，高雪氏病，尼曼匹克症，寄生感染，癌症的免疫系统紊乱，化工、物理、感染、或自身免疫引起的肝癌、肝损害、癌症。

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