CN106661592A - 以重组血清型9禽腺病毒载体形式的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含具有插入的至少一个外源核苷酸序列的血清型9禽腺病毒载体(FAdV‑9)，以及药学上可接受的媒介物、佐剂和/或赋形剂的重组疫苗，所述至少一个外源核苷酸序列编码目的疾病的至少一种抗原，并替换腺病毒基因组非必需区，其中编码目的疾病的至少一种抗原并替换腺病毒基因组非必需区的至少一个外源核苷酸序列位于491和2782个核苷酸之间。该疫苗的载体对于工业规模生产是稳定的。同样地，即使当该疫苗与针对马立克氏病的疫苗组合施用时，两种疫苗产生不受彼此之间的干扰影响的足够的免疫应答。以相同的方式，重组疫苗的有效性不受母源抗体的影响，并且即使仅一次施用也能够诱导早期和持久的保护性应答。

Description

以重组血清型9禽腺病毒载体形式的疫苗
技术领域
本发明涉及基于病毒载体的疫苗，并且更特别地涉及基于血清型8禽腺病毒重组载体的疫苗。
背景技术
腺病毒是线性、双链、DNA病毒，直径70-90nm，无包膜，并且具有二十面体形状的衣壳，所述衣壳由240个六邻体、12个五邻体和从每个二十面体顶点延伸的纤维形成。这些六邻体、五邻体和纤维代表主要腺病毒抗原，以及决定其血清型的那些。
腺病毒基因组大小约为30-45kb，并且具有四个早期区(E1、E2、E3和E4)和五个晚期区(L1-L5)。
腺病毒已分离自不同物种，两种主要属是分离自鸟的禽腺病毒属(Aviadenovirus)和分离自哺乳动物的哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)。
腺病毒视为用于疫苗生产的重组载体的良好候选物，因为它们是高度传染性的，并且其中许多不是致病性的。另外，腺病毒载体可有效地翻译大尺寸基因，并在动物中生成延长的免疫应答。然而，还已知腺病毒特异性结构需要研究每个物种的异源基因的具体插入位点，并且当转换成重组病毒载体时，实际上不可能概括出不同已知腺病毒的生物学行为。
迄今为止，尤其是人、猿、禽、猪腺病毒已被用作可能用作重组疫苗的载体。特别地，已知禽腺病毒(FadV)是用于制备重组疫苗的潜在候选者。然而，如下所述，由于不能以所需稳定性达到其大规模生产，一般抑制了在商业水平上，特别是在兽医工业中成功利用它们的可能性，因为腺病毒的生产由细胞系进行，其产量通常非常差，或其性质阻止在连续传代中获得病毒载体的稳定性，由此很容易理解，现在在禽腺病毒中不存在载体化疫苗。
例如，国际公开号WO94/24268描述了具有插入的至少一个异源核苷酸序列的FAdV重组载体，并且所述FAdV重组载体可用于在对疾病敏感的鸟类中生成免疫应答。根据该文件，可适合于待替换或插入的异源基因的腺病毒基因组的非必需区是位于基因组右末端处的那些，优选位于(97和99.9μ)中的0.0038和0.0039之间的区域。根据该文件，重组疫苗显然可与针对其他病毒的疫苗(例如马立克氏病或新城疫的那种)组合利用，而无这种的证据。另外，在该文件中，也未示出在用于大规模生产的细胞系中的连续传代后获得的腺病毒行为。
此外，美国专利号6,296,852描述了血清型9FAdV载体(FAdV-9)，在其中进行了核苷酸异源序列插入病毒基因组的非必需区。这些区域可以是位于基因组左端和/或右端的非编码区，优选在(60和100μ)中的0.0023和0.0039之间的位于右端(3')上的区域处。关于WO94/24268文件，尽管该专利鉴定了用于外源基因的潜在插入的另一个更宽的区域，但它未示出其在细胞系中连续传代之后的行为且特别是其完整性。
在另一个文件中(Corredor,J.C.和Nagy,E.,the non-essential left endregion of the fowl adenovirus 9genome is suitable for foreign gene insertion/replacement.Virus Research.第149卷，167-174；2010)，公开了FAdV-9基因组的5'端非必需区也可以是用于通过外源基因插入或替换以产生重组载体的合适位点。例如，用编码增强绿色荧光蛋白(EGFP)的基因替换位于491-2782个核苷酸之间的非必需区，获得这样的载体之一。然而，该文件与其他文件一样，未显示当将编码疾病抗原的外源基因插入其中，并且通过在合适的细胞系统中复制它们以获得重组体疫苗时，所构建的病毒载体是否稳定，因为该文件仅显示了报道基因表达并缺乏体内测定；此外它没有提及组成或针对目的疾病的保护水平。
如可见的，已知FAdV基因组的非必需区代表外源核苷酸序列可被插入或替换的潜在位点。然而，现有技术中描述的载体具有在以工业水平生产重组疫苗时不稳定的缺点，这是由于在细胞培养物中的不同传代后插入的异源基因的丧失。
此外，在现有技术中，已避免了腺病毒载体在鸟类主要是家禽治疗中的用途，这是由于其干扰针对马立克氏病的疫苗，所述疫苗在禽类工业中广泛使用。马立克氏病(EM)是由影响驯养禽类的疱疹病毒引起的状况，引起引发腿或翅膀麻痹的淋巴增殖性疾病，和淋巴样肿瘤以及死亡。为了预防这种疾病，主要是皮下或卵内应用单价或多价活性疫苗。
为了降低成本并在施用时达到更高的效率，有时优选至少两种疫苗的联合施用。然而，尽管如上述国际公开号WO94/24268的文件揭示了利用与马立克氏病疫苗组合的腺病毒的可能性；但后续研究已证明，当分析死亡率和由两种疾病对鸟类(如商业性母鸡)产生的病变(优选长期)时，腺病毒疫苗和马立克氏病毒疫苗具有严重的场内干扰。
目前，现在已知通过同时应用针对EM的全病毒疫苗与在腺病毒载体中的重组疫苗，针对EM的疫苗可能由于下述机制而干扰重组疫苗：a)不同的复制动力学；b)疫苗竞争相同的细胞类型用于其在鸟类中的复制；和c)EM病毒在鸟类中引起免疫抑制。显然，如果要克服这种干扰并且为了实现针对与重组疫苗的外源基因相关的疾病的有效疫苗接种，则有必要施用更高剂量的所述重组疫苗或降低针对EM的疫苗的剂量(Breedlove等人,Avianinfluenza adenovirus-vectored in-ovo vaccination；target embryo tissues andcombination with Marek's disease vaccine.Avian Disease.第55卷，667-673；2011)。然而，同样的Breedlove等人的参考文献显示，增加腺病毒重组疫苗的剂量可引起对针对EM的疫苗的暂时干扰，这使得其无效，在该领域中引起严重的问题。这意味着，迄今为止，基于重组腺病毒病毒载体的疫苗无法用不干扰由马立克氏病疫苗赋予的保护的外源基因配制，或反之亦然。
同样地，母源抗体是可潜在地引起对疫苗干扰的另一种因素。虽然母源抗体赋予对新生动物的保护，但是它们的存在可抑制或降低疫苗效应，造成由此产生的免疫应答是非最佳的。
一般在疫苗开发中发现的另一个挑战是根据用于疫苗的配方，其中实现保护和所述保护的持续时间。
赋予早期保护，即，在从应用开始的极短时间内的保护的疫苗，也将具有短期效应，因为保护水平将迅速下降，使得需要定期再次接种疫苗。相比之下，赋予持久或长期保护的疫苗将需要更多的时间来实现保护(晚期保护)，尽管所述保护将持续更长的时间，通常需要较少的再次接种疫苗以实现所需的保护效应。通常，为了在一组动物中实现持久保护，有必要应用早期保护疫苗与晚期保护疫苗的组合，以避免动物在其整个发育过程中生病的可能性。
在现有技术中，已知活性病毒疫苗通常赋予快速或早期保护，因为其在从其应用开始的短时间范围内实现可接受的但不持久的保护水平。另一方面，还已知灭活的病毒疫苗赋予比活性病毒更持久的保护，但不需要长时间来实现它，即，保护很迟，并且在许多情况下它们也需要再次接种疫苗，虽然较不频繁。
例如，Stine等人(Evaluation of inactivated newcastle disease,aviandiseases，第24卷，第1期(1980年1月-3月)，第99-111页)评价了针对NDV的三种疫苗：乳液中的灭活疫苗、Al(OH)3中吸附的灭活疫苗和活的商业疫苗，发现活性疫苗比灭活疫苗早一周在小鸡中产生HI滴度，而乳液中的灭活疫苗产生持续的免疫应答。
同样地，Folitse等人(Efficacy of combined killed-in-oil emulsion andalive newcastle disease vaccines in chickens,Avian Diseases，第42卷，第1期(1998年1月-3月)，第173-178页)提及，存在在油中乳化的NDV灭活疫苗在先前用活性疫苗接种的鸟类中诱导高且持续水平的循环抗体的报道。同样地，他们提及在施用与针对相同疾病的活性疫苗组合的NDV灭活疫苗时，获得高抗体应答的原因可能是由于下述事实：开始时活病毒快速复制，引发初次免疫应答，随后为灭活疫苗的抗原的连续但缓慢的释放，其行为类似于增强剂量。
此外，Toro等人(Avian influenza mucosal vaccination in chickens withreplication-defective recombinant adenovirus vaccine,Avian Diseases 55:43–47,2011)评价了由不含能够复制的腺病毒的重组腺病毒疫苗赋予的保护，所述腺病毒将表达在其密码子中最佳化的禽流感H5基因，所述疫苗应用于5日龄产蛋型鸟类，并且在一些情况下当它们变成15日龄时再次接种疫苗。结果显示仅再次接种疫苗的鸟类才发展出高抗体滴度。这些滴度可从9日龄开始检测到，在32日龄时达到其最大值。
以类似的方式，存在正如马立克氏病毒格外提供早期和持久保护两者的一些活性病毒。然而，马立克氏病毒可用作载体，并且在现有技术中，已证明仅一次应用就能实现针对马立克氏病的早期和持久的保护，但对于插入的外源抗原，它不实现早期保护，而是仅呈现晚期和持久的保护。
由现有技术可见，无法成功地利用腺病毒且特别是现有技术中的血清型9禽腺病毒FAdV-9，作为用于在工业规模上具有任何外源基因的用于鸟类的重组疫苗，尽管已描述了不同的插入位点，一方面是由于在连续传代后其在细胞系上的繁殖未达到足够的稳定性的事实，并且另一方面是由于马立克氏病疫苗干扰腺病毒的作用机制或反之亦然的事实，在现有技术中已明确避免了与马立克氏病疫苗组合使用腺病毒的原因。此外，无法获得实现对于插入在仅一次应用的病毒载体中的外源抗原的早期和持久保护两者的病毒重组疫苗。
发明内容
考虑到现有技术的缺点，本发明的一个目的是提供在血清型9禽腺病毒中的重组疫苗，其中所述载体在工业水平下制造时是稳定的。
本发明的另一个目的是提供重组疫苗，即使它与针对马立克氏病的疫苗组合施用，两种疫苗均产生不受彼此之间的干扰影响的足够的免疫应答。
本发明的另外一个目的是提供重组疫苗，所述重组疫苗的有效性不受母源抗体影响，并且诱导最佳的免疫应答。
本发明的另外一个目的是依靠重组疫苗，所述重组疫苗诱导保护性(即，在从其应用开始的前19天内)和持续的(即，直到其应用后至少90天)保护性应答。
本发明的另外一个目的是依靠重组疫苗，伴随仅一次应用，所述重组疫苗就实现了与插入在所述疫苗中包含的病毒载体中的外源抗原相关的疾病的早期和持久保护两者。
附图说明
视为本发明特征的新颖方面在所附权利要求中得到特别确认。然而，当与附图相关联地阅读时，一些实施例、特征及其一些目的和优点由详细描述将得到更好地理解，在所述附图中：
图1A是根据本发明构建的具有禽流感HA插入物的FAdV-9重组病毒的DNA限制性图谱。
图1B是琼脂糖凝胶，其中显示了通过限制性酶消化获得的，根据本发明构建的具有禽流感HA插入物的FAdV-9重组病毒的DNA片段。
图1C是未感染的CeLi细胞培养物，以及用根据本发明构建的具有禽流感HA插入物的FAdV-9重组病毒感染的细胞培养物。
图2A显示了根据本发明构建的具有包涵体的具有肝炎纤维4插入物的FAdV-9重组病毒的DNA限制性图谱。
图2B是琼脂糖凝胶，其中显示了通过限制性酶消化获得的，根据本发明构建的具有包涵体的具有肝炎纤维4插入物的FAdV-9重组病毒的DNA片段。
图2C是未感染的CeLi细胞培养物，以及用根据本发明构建的具有包涵体的具有肝炎纤维4插入物的FAdV-9重组病毒感染的细胞培养物。
图3A显示了根据本发明构建的具有禽传染性喉气管炎病毒的糖蛋白B插入物的FAdV-9重组病毒的DNA限制性图谱。
图3B是琼脂糖凝胶，其中显示了通过限制性酶消化获得的，根据本发明构建的具有禽传染性喉气管炎病毒的糖蛋白B插入物的FAdV-9重组病毒的DNA片段。
图3C是未感染的CeLi细胞培养物，以及用根据本发明构建的禽传染性喉气管炎病毒的糖蛋白B插入物的FAdV-9重组病毒感染的细胞培养物。
图4A是根据本发明构建的具有新城疫病毒的HN蛋白插入物的FAdV-9重组病毒的DNA限制性图谱。
图4B是琼脂糖凝胶，其中显示了通过限制性酶消化获得的，根据本发明构建的具有新城疫的HN蛋白插入物的FAdV-9重组病毒的DNA片段。
图4C是未感染的CeLi细胞培养物，以及用根据本发明构建的具有新城疫的HN蛋白插入物的FAdV-9重组病毒感染的细胞培养物。
图5A是插入在基因组的38,807和40,561个核苷酸之间的具有新城疫病毒的HN蛋白插入物的FAdV-9重组病毒的DNA限制性图谱。
图5B是琼脂糖凝胶，其中显示了通过限制性酶消化获得的，插入在基因组的38,807和40,561个核苷酸之间的具有新城疫病毒的HN蛋白插入物的FAdV-9重组病毒的DNA片段。
图5C是琼脂糖凝胶，其中显示了通过限制性酶消化获得的，在CeLi细胞培养中2次传代后，插入在基因组的38,807和40,561个核苷酸之间的具有新城疫病毒的HN蛋白插入物的FAdV-9重组病毒的DNA片段。
图6是显示了在卵内免疫的轻型品种商业小鸡(CRL)的血凝抑制(IH)结果的图，其中血清在1日龄(DE)时获得。
图7是显示了在卵内免疫的CRL小鸡的IH结果的图，其中血清在10DE时获得。
图8是显示了在孵化18天(DI)后或在1DE时在卵内免疫的CRL小鸡的IH结果的图，其中血清在19DE时获得。
图9是显示了在18DI或1DE时在卵内免疫，且在10DE时再次接种疫苗的CRL小鸡的IH结果的图，其中血清在19DE时获得。
图10是显示了在18DI或1DE时在卵内免疫的CRL小鸡的IH结果的图，其中血清在31DE时获得。
图11是显示了在18DI或1DE时在卵内免疫且在10DE时再次接种疫苗的CRL小鸡的IH结果的图，其中血清在31DE时获得。
图12是显示了在18DI或1DE时在卵内免疫的CRL小鸡的IH结果的图，其中血清在38DE时获得。
图13是显示了在18DI或1DE时在卵内免疫且在10DE时再次接种疫苗的CRL小鸡的IH结果的图，其中血清在38DE时获得。
图14是显示了在18DI或1DE时在卵内免疫的CRL小鸡的IH结果的图，其中血清在45DE时获得。
图15是显示了在18DI或1DE时在卵内免疫且在10DE时再次接种疫苗的CRL小鸡的IH结果的图，其中血清在45DE时获得。
图16是显示了在1DE时免疫，伴随或不伴随在10DE时的再次疫苗接种，且在19DE时攻击的CRL小鸡的效力结果的图。
图17是显示了在1DE时免疫，伴随或不伴随在10DE时的再次疫苗接种，且在31DE时攻击的CRL小鸡的效力结果的图。
图18是显示了在1DE时免疫，伴随或不伴随在10DE时的再次疫苗接种，且在93DE时攻击的CRL小鸡的效力结果的图。
图19是显示了在1DE时免疫，伴随或不伴随在10DE时的再次疫苗接种的CRL小鸡的IH结果的图，其中血清在19DE时获得。
图20是显示了在1DE时免疫，伴随或不伴随在10DE时的再次疫苗接种的CRL小鸡的IH结果的图，其中血清在31DE时获得。
图21是显示了在1DE时免疫，伴随或不伴随在10DE时的再次疫苗接种的CRL小鸡的IH结果的图，其中血清在93DE时获得。
图22是显示了在1DE和10DE时免疫并在31DE时攻击的无特定病原体(LPE)的小鸡的效力结果的图。
图23是显示了在1DE和10DE时免疫的LPE小鸡的IH结果的图，其中血清在31DE时获得。
具体实施方式
在本发明的开发期间，已发现包含具有插入的至少一个外源核苷酸序列的血清型9禽腺病毒载体(FAdV-9)以及药学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂的重组疫苗提供了针对目的疾病的合适保护，所述至少一个外源核苷酸序列编码所述目的疾病的至少一种抗原，并替换具体地位于491-2782个核苷酸之间的腺病毒基因组非必需区，当以工业规模生产时结果也是稳定的，因为在细胞培养中进行连续传代时，腺病毒载体不丧失插入的外源核苷酸序列。同样地，令人惊讶的是，即使与马立克氏病全病毒疫苗组合施用，该重组疫苗在接种疫苗的鸟类中也不丧失功效，并且当与该重组疫苗一起施用时，马立克氏病疫苗也不丧失功效。以相同的方式，本发明的重组疫苗具有以下优点：其有效性不受新生动物中的母源抗体影响，并且伴随仅一次应用，提供了早期和持久的保护。
在这个意义上，为了本发明的目的，认为早期保护是从应用疫苗起19天内实现的保护，而持久保护是直到应用疫苗后至少90天实现的保护。
使用的腺病毒载体可以是活的(活性的)或灭活的。术语活的或活性的意指重组载体维持其复制能力，而灭活的意指具有外源核苷酸序列的腺病毒重组载体已丧失复制能力。利用本领域众所周知的物理或化学程序，例如用甲醛或β-丙内酯的化学灭活，执行重组载体的灭活(Office International des Epizooties 2008).Newcastle Disease.OIEManual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals.OfficeInternational des Epizooties.France，第576-589页)。
如上所述，所使用的载体是包括任何毒株的血清型9禽腺病毒(FAdv-9)。优选地，FAdV-9选自具有GenBank登录号EU979376、AF083975、HQ697594、AF508958、AF339923、EU847634、EU847629、EU847628、DQ323986、AY683550、EU847635、NC_000899和AC_000013的毒株。
现在，关于外源核苷酸序列，它编码目的疾病的至少一种抗原，优选地所述抗原是选自以下的至少一种疾病的：禽流感、具有包涵体的肝炎、禽传染性喉气管炎、新城疫、法氏囊感染、传染性支气管炎、由偏肺病毒(MPNV)引起的疾病、马立克氏病、禽传染性贫血或其大小允许插入腺病毒载体的任何其他基因。更优选地，利用禽流感基因。
在本发明的一个具体实施例中，外源核苷酸序列由编码选自18个血凝素亚型或流感病毒的免疫原性变体的禽流感病毒的血凝素(HA)的基因组成，所述基因更优选编码以下中的至少一种：所述蛋白质的亚型H1、H2、H3、H5、H6、H7或H9；包涵体肝炎病毒，血清型4和8的纤维和六邻体；禽传染性喉气管炎病毒(LTI)的糖蛋白B(gB)和糖蛋白D(gD)；新城疫病毒的HN和F蛋白；法氏囊的VP2蛋白病毒感染；传染性支气管炎病毒的S1和S2蛋白；偏肺病毒(MPNV)的F蛋白；以及禽传染性贫血的VP1、VP2和VP3蛋白。
同样地，外源核苷酸序列可包含编码与用作病毒载体的FAdV-9不同的禽腺病毒的至少一种抗原的基因。
包含本发明的目的外源基因的疫苗腺病毒载体可通过目的核苷酸序列的PCR扩增来制备，以便能够其后在腺病毒载体内部插入已扩增的核苷酸序列，在所述腺病毒载体中位于491-2782个核苷酸之间的非必需基因组区已被消除。使用分子生物学中的标准克隆技术进行外源基因插入和腺病毒非必需区的缺失。将因此产生的感染性克隆转染到细胞培养物中，以生成重组病毒。
病毒在适合于其生长的任何系统中复制，例如禽起源的永生化肝细胞(CeLi)、商业细胞系或明确设计用于生长腺病毒，直到达到至少所需的病毒浓度以便实现抗原应答，优选至少105.0DICC 50％/剂量，更优选至少106.0DICC 50％/剂量。
例如，重组病毒可在用特定培养基生长的CeLi系细胞中，利用静态生长系统，在细胞培养瓶中，在微载体中，在大规模细胞生产系统中或在Roller瓶系统中复制，直到免疫过氧化物酶测试时的滴度达到106.0DICC50％/剂量的最小值。在相同种类的细胞中进行5至10次不知情传代后可达到该滴定。此外，可将收获物离心，分级并维持冷冻，从而获得所谓的主种子(MS)。
使用主种子，对相同的细胞执行进一步的传代以制备生产种子(SP)，并且由此再一次传代用于制备疫苗。
因此，本发明包括血清型9禽腺病毒重组病毒(FAdV-9)的主种子，所述FAdV-9具有插入的外源核苷酸序列，所述外源核苷酸序列编码目的疾病抗原并替换具体地位于491-2782个核苷酸之间的腺病毒基因组非必需区；所述主种子在细胞培养中6至11次传代后获得。
现在，在其中疫苗是活的或活性的实施例中，它是活性病毒，优选选自天然无致病性禽腺病毒，具有低致病性或通过本领域已知的程序减毒。另一方面，当疫苗是灭活的时，一旦达到实现抗原应答所需的病毒浓度，它就伴随病毒的灭活进行。优选地，灭活通过本领域中众所周知的物理或化学程序，优选通过甲醛或β-丙内酯的化学灭活进行。
在本发明的疫苗是活的或活性的情况下，药学上可接受的媒介物是水性溶液，优选选自包含TPGA稳定剂(海藻糖、磷酸盐、谷氨酸盐、白蛋白)的水性溶液；包含蛋白胨稳定剂的水性溶液；和包含脱脂乳的水性溶液。
当本发明的疫苗是灭活的时，药学上可接受的媒介物优选是水性溶液或乳液。更特别地，所使用的媒介物优选是水-油、油-水或水-油-水(WOW)乳液，优选水-油-水乳液。
关于活的或活性疫苗的施用，这可肌内、鼻内、皮下、通过喷洒、雾化、通过饮用水经口、或在每种情况下利用合适的手段和方式在卵内执行。如果它是灭活疫苗，则其肌内或皮下施用，优选皮下施用。
同样地，本发明的重组疫苗可以单一剂量，以两个或更多个剂量，单独或与其他重组或非重组疫苗(活的(活性的)或灭活的)，例如针对马立克氏病的疫苗联合施用。
同样地，即使当本发明的疫苗以单一剂量或应用施用时，它实现与由插入在所述疫苗中包含的病毒载体中的外源核苷酸序列编码的抗原相关的目的疾病的早期和持久保护两者。
在一个另外的实施例中，本发明描述了包含根据本发明的血清型9禽腺病毒载体(FAdV-9)的多价重组疫苗，所述载体具有插入的至少两个外源核苷酸序列，所述至少两个外源核苷酸序列编码来自相同目的疾病或不同目的疾病的至少两种抗原，并且替换具体地位于491-2782个核苷酸之间的腺病毒基因组非必需区。
在本发明的一个实施例中，本发明描述了多价疫苗，其包含根据本发明的基于血清型9禽腺病毒载体(FAdV-9)的第一疫苗，所述载体具有插入的至少一个外源核苷酸序列，所述至少一个外源核苷酸序列编码目的疾病的至少一种抗原，并且替换具体地位于490-2782个核苷酸之间的腺病毒基因组非必需区；以及根据本发明的基于血清型9禽腺病毒载体(FAdV-9)的至少第二疫苗，所述载体具有至少一个外源核苷酸序列，所述至少一个外源核苷酸序列编码相同目的疾病或不同目的疾病的与第一疫苗的至少一种抗原不同的至少一种抗原，并且替换具体地位于491-2782个核苷酸之间的腺病毒基因组非必需区。多价疫苗可以活的或活性的或灭活的形式存在。
同样地，本发明考虑了多价疫苗，所述多价疫苗包含与根据本发明的基于血清型9禽腺病毒载体(FAdV-9)的至少一种疫苗组合的马立克氏病全病毒疫苗，所述载体具有插入的外源核苷酸序列，所述外源核苷酸序列编码目的疾病抗原，并且替换具体地位于491-2782个核苷酸之间的腺病毒基因组非必需区。多价疫苗可以活的或活性的或灭活的形式存在。
此外，在本发明的另一个方面，本发明公开了针对动物疾病的疫苗接种方法，所述疫苗接种方法包括向动物提供根据本发明的重组疫苗，所述重组疫苗包含血清型9禽腺病毒载体(FAdV-9)，所述载体具有插入的外源核苷酸序列，所述外源核苷酸序列编码目的疾病抗原，并且替换具体地位于491-2782个核苷酸之间的腺病毒基因组非必需区；以及药学上可接受的媒介物、佐剂和/或赋形剂；其中所述疫苗能够在动物中生成免疫应答。
外源核苷酸序列编码目的疾病的抗原，优选来自选自以下的至少一种疾病：禽流感、具有包涵体的肝炎、禽传染性喉气管炎、新城疫、法氏囊感染、传染性支气管炎、由偏肺病毒(MPNV)引起的疾病、马立克氏病、禽传染性贫血或其大小允许插入腺病毒载体的任何其他基因。优选地，使用禽流感抗原。
优选地，外源核苷酸序列由编码选自18个血凝素亚型或流感病毒的免疫原性变体的禽流感病毒的血凝素(HA)的基因组成，所述基因更优选编码以下中的至少一种：所述蛋白质的亚型H1、H2、H3、H5、H6、H7或H9；包涵体肝炎病毒，血清型4或8的纤维和六邻体；禽传染性喉气管炎病毒的糖蛋白B(gB)和糖蛋白D(gD)；新城疫病毒的HN和F蛋白；法氏囊的VP2蛋白病毒感染；传染性支气管炎病毒的S1和S2蛋白；偏肺病毒(MPNV)的F蛋白；以及禽传染性贫血的VP1、VP2和VP3蛋白。
同样地，为了实现合适的保护，重组疫苗的所需浓度为105.0DICC50％/剂量，更优选至少106.0DICC50％/剂量。
活的或活性的重组疫苗可肌内、鼻内、皮下、通过喷洒、雾化、通过饮用水经口、或在每种情况下利用合适的手段和方式在卵内施用。如果它是灭活疫苗，则其肌内或皮下施用，优选皮下施用。同样地，本发明的重组疫苗可以单一剂量或者以两个或更多个剂量，单独或与其他重组或非重组疫苗(活的(活性的)或灭活的)，例如针对马立克氏病的疫苗组合施用。
同样地，即使当本发明的疫苗以单一剂量或应用施用时，它实现与由插入在所述疫苗中包含的病毒载体中的外源核苷酸序列编码的抗原相关的目的疾病的早期和持久保护两者。
本发明通过下述实例将得到更好地理解，所述实例仅为了举例说明性目的而显示，以允许正确理解本发明的优选实施例，而不暗示不存在可基于上文公开的详细描述实践的其他未示出的实施例。
实例
实例1.FAdV-9载体的生成
首先，通过反向遗传学生成并且含有区域FV1(包含在1-491个核苷酸之间)和FV2(包含在2,782-7,453个核苷酸之间)的包含SEQ ID NO:1的FAdV-9 45kb基因组具有其2,291pb的非必需区去除，所述非必需区包含在491-2,782个核苷酸之间，即在基因组的5'末端处；此外，目的基因特有的SwaI位点插入491位点处。将该基因组亚克隆到pBg质粒中，以在其末端处获得独特的限制性位点，以允许在培养物中生成活的病毒。
此外，通过PCR技术使用寡核苷酸将EcoRV位点引入FV-2中，从而获得中间体pΔL2.4。在该中间体中，包含在4,391和7,453个核苷酸之间的原始基因组片段缺失，保留了2,100pb的重组臂。此外，PCR EcoRV-EcoRV的片段被克隆分流到来自AdEASY的pShuttle中，用EcoRV-Pmel切除。保持EcoRI位点。
在491核苷酸处的SwaI位点中，使用CMV、poliLinker和PoliA克隆来自pVAX的表达盒，并且所述表达盒还含有克隆目的基因所特有的PmeI位点，由此获得目的感染性克隆。在细胞培养中感染性克隆的转染生成目的重组病毒。
实例2.在细胞培养中生成rFAdV9-435重组病毒rFAdV9-435
根据实例1中描述的方法，获得具有来自低致病性禽流感病毒VIABP-H5N2，毒株435(rFAdV9-435)的H5基因插入物的FAdV-9感染性克隆，具有GenBank登录号FJ864690，并且包含序列SEQ ID NO:2。
首先，为了获得主种子(SM)，使rFAdV9-435在细胞培养瓶(静态系统)中用DMEMF12+Glutamax培养基生长的CeLi系细胞中复制。在对相同细胞类型执行7次不知情传代后，达到106.0DICC50％的免疫过氧化物酶测试时滴度。使收获物在500g下离心20分钟，并将其在1.5mL冷冻管中分级，所述冷冻管在-70℃至-80℃的温度下保持深度冷冻。
对SM进行测试以排除细菌、禽类支原体、真菌和酵母菌的存在，以及证明所述MS不含禽类病毒。
此外，在无特殊病原体的小鸡(SPF)中测试SM，以便测定其无害性、效力、免疫原性和生成合适的保护和免疫原性所需的最小剂量。
用主种子对相同细胞(CeLi)执行进一步的传代，用于制备生产种子。
实例3.其他重组病毒的生成
按照上述相同的方法，根据表1中所示获得另外的FAdV-9重组病毒：
表1.用不同插入物生成的FAdV-9重组病毒。
这些重组载体通过XhoI消化进行表征。在图1A中，显示了rFAdV9-H7IA重组载体的DNA限制性图谱；4.7kb条带显示了在其中克隆异源基因的限制性片段。在图1B中，可观察到3629bp，其对应于禽流感HA基因，证明rFAdV9-H7IA重组载体确实具有插入的该基因，并且此外，所述载体在细胞培养中10次传代后是稳定的。在图1C中，在左侧上，可观察到未感染的CeLi细胞培养物，而在右侧上，可观察到由rFAdV9-H7IA重组载体在具有1.1x 106UFP的病毒滴度的CeLi细胞中的繁殖引起的致细胞病变效应，指示它由于所述重组载体在CeLi细胞培养物中稳定和正常地表现的事实而生成良好的致细胞病变效应。
此外，在图2A中，显示了rFAdV9-Fib HCI重组载体的DNA限制性图谱；1.4kb条带显示了在其中克隆异源基因的限制性片段，而在图2B中可见1652pb条带，对应于具有血清型4包涵体的肝炎的Fib4基因，显示rFAdV9-Fib HCI重组载体确实具有插入的该基因，并且此外，所述载体在细胞培养中10次传代后是稳定的。最后，在图2C中，在左侧上，可观察到未感染的CeLi细胞培养物，而在右侧上，可观察到由rFAdV9-Fib HCl重组载体在具有1.4x105UFP的病毒滴度的CeLi细胞中的繁殖引起的致细胞病变效应，指示它由于所述重组载体在CeLi细胞培养物中稳定和正常地表现的事实而生成良好的致细胞病变效应。
在图3A中，显示了rFAdV9-gBLT重组载体的DNA限制性图谱；5.6kb条带显示了在其中克隆异源基因的限制性片段。图3B显示了4,573pb条带，对应于禽传染性喉气管炎的gB基因，证明rFAdV9-gBLT重组载体确实具有插入的该基因，并且所述载体在细胞培养中10次传代后是稳定的。在图3C中，在左侧上，可观察到未感染的CeLi细胞培养物，而在右侧上，可观察到由rFAdV9-gBLT重组载体在具有2.6x 106UFP的病毒滴度的CeLi细胞中的繁殖引起的致细胞病变效应。上文指示该重组载体在CeLi细胞培养中是稳定的。
在图4A中，显示了rFAdV9-HN重组载体的DNA限制性图谱；4.8kb条带显示了在其中克隆异源基因的限制性片段。图4B显示了996bp条带，对应于新城疫的HN基因，其中显示rFAdV9-HN重组载体确实具有插入的该基因，并且所述载体在细胞培养中10次传代后是稳定的。在图4C中，在左侧上，可观察到未感染的CeLi细胞培养物，而在右侧上，可观察到由rFAdV9-HN重组载体在具有1.3x 106UFP的病毒滴度的CeLi细胞中的繁殖引起的致细胞病变效应。上文指示该重组载体在CeLi细胞培养中是稳定的。
实例4.根据其他已知的腺病毒载体生成FAdV-9重组载体
将45kb基因组的FAdV-9克隆到质粒pWE-15中；该基因组具有串联的两个重复嵌段，称为TR-1(位于37,648和37,812个核苷酸之间)和TR-2(位于38,707和40,561个核苷酸之间，即在3'末端处的(60和100μ)中的0.0023和0.0039之间)，这是其病毒复制所不需要的。其后，将pWE-15中的该基因组亚克隆到质粒pBg内，以便在基因组末端处添加PacI位点，其可用于在细胞培养中的病毒生成期间使DNA线性化。
为了生成中间体，通过PCR扩增TR-2区并克隆在细菌质粒pTRE-2中，在两端处具有独特的I-Ceul和PI-SceI位点。其后，插入含有CMV-polilinker以指导新城疫病毒HN基因表达的表达盒，从而获得感染性克隆pFΔTR2-CMV HN。
通过感染性克隆在CeLi细胞培养中的转染获得rFΔTR2-CMV HN重组病毒。
在图5A中，能够观察到rFΔTR2-CMV HN重组载体的DNA限制性图谱；3,473kb条带显示了在其中克隆异源基因的限制性片段。图5B显示了用Xhol的DNA消化条带，指示对应于新城疫病毒的HN基因的3,473bp，其中证明rFΔTR2-CMV HN重组载体确实具有插入的该基因。然而，在图5C中，可观察到对应于HN基因的3,473bp条带在CeLi细胞培养中2次传代后消失，具有1.1x 104UFP的病毒滴度，这证明rFΔTR2-CMV HN载体伴随在细胞培养中的传代而丧失外源基因插入物，由此导致不稳定并且不适合工业生产的重组疫苗。
实例5.对于具有禽流感的H5插入物的FAdV-9重组病毒活性的疫苗的生产方法： rFAdV9-435
CeLi系细胞在Roller系统中稳定培养。为此，将来自工作细胞库(BCT)的第32代小瓶在T25小瓶中解冻。以1:3的比率进行3次连续传代，每次2-3天以便恢复到生长速度(TD＝24小时)。一旦恢复生长速度，细胞就在T75和T225盒(1:3比率)中增殖，并且当获得80％汇合时，用根据实例2获得的生产种子感染细胞，其中感染复数(moi)为0.1DICC50％/mL。在感染后5天，将具有其内容物的小瓶在-70℃下冷冻24小时。随后，将它们解冻，回收内容物并在500g下离心20分钟。它根据产生的体积进行包装。
收获物通过免疫过氧化物酶进行滴定，并且它通过添加收获的流体，加上TPGAcbp作为稳定剂来配制，以便达到105.3DICC50％/剂量。将实验疫苗在-20℃至-30℃的温度下保持冷冻直至使用。
实例6.连同或不连同针对马立克氏病的疫苗一起应用的rFAdV9-435重组活性疫 苗的体内评价
进行研究，目的在于测定本发明的活性疫苗的有效性，并且证明当与针对马立克氏病的疫苗组合施用于鸟类时，它既不受影响也不影响。疫苗在卵内和皮下施用。
为此，根据表2中所示，采用270只1日龄(DE)的Leghorn轻型品种商业小鸡(CRL)，分成9组，每组30只。
rFAdV9-435活性疫苗在孵化18(DI)天后经由尿囊腔(Ai)在卵内应用，其中对于组2和6单独使用106.1DICC50％/0.2mL的比率，并且对于组1和5与针对马立克氏毒株HVT的疫苗混合并组合应用。另一方面，执行在颈中部和上部皮下(SC)在出生后一天(DE)应用疫苗的实验，以用rFAdV9-435疫苗以106.1DICC50％/0.2mL的比率免疫。对于组4和8施用单独的疫苗；并且对于组3和7与针对马立克氏毒株HVT的疫苗混合并组合应用。最后，在10DE组，组5至8用106.5DICC50％/0.5mL的rFAdV9-435疫苗再次SC接种疫苗。
表2.使用rFAdV9-435疫苗的处理组。
将动物饲养在隔离单元中，其中在19、31和45DE时，对它们进行攻击，将每组分成各10只小鸡的三个亚组，用于每次攻击。
攻击病毒是高致病性禽流感病毒VIAAP-H5N2，毒株A/小鸡/Querétaro，其用PBS调整至pH 7.2，以便将0.3mL中的107.5DIEP50％应用于每只小鸡，每只小鸡在每只眼睛上应用0.06ml(两滴)且在每个鼻孔中应用0.09ml(3滴)所接受的体积。
实例6A.效力评价
在攻击后的10天期间每天观察所有组，以评估临床数据；根据表3中的数据单独检查每只小鸡，并用数值评分。
表3.用VIAAP-H5N2攻击后的临床数据的每日评估。
临床体征 轻度 重度
结膜炎 1 2
结膜炎+羽毛粗乱 3 4
结膜炎+羽毛粗乱+嗜睡 5 6
死亡 7 -
每个实验组的临床数据严重性(MCDS)的最大值对应于个体值相加的平均值。在10个观察日期间在累积基础上评估死亡率(M)，将临床信号的最大值调整为100％。
在10个观察日之一中，组的最大发病率(MM)等于病鸟的最大百分比。发病指数(IMb)如下计算：
例如：
对在19、31和45DE时用VIAAP-H5N2攻击的小鸡的死亡率(PM)和IMb的保护结果呈现于表4中。
表4.在用rFAdV9-435接种疫苗并用VIAAP-H5N2攻击的CRL小鸡中的效力结果。
如可见的，效力结果证实了本发明的rFAdV9-435疫苗用于控制H5N2禽流感的功效，并且它们建议其可用于控制其他禽流感亚型。
同样地，这些结果证实，当组合应用时，针对马立克氏病的疫苗的混合物和应用不干扰rFAdV9-435活性疫苗。
实例6B.免疫原性评价
血凝抑制测试(IH)的结果显示，疫苗接种和对照组两者针对VIA-435的抗原(Ag)的抗体水平显示极高水平的母源抗体，在1DE时获得的鸟血清中为29.0至29.3(图6)，并且对于在10DO时获得的血清为28,6至28.8(图7)。
在来自所有组(对照组和接种疫苗组两者，包括在卵内免疫或在DE时伴随在10DE时rFAdV9-435的再次疫苗接种的那些)的在19DE时获得的血清的情况下，检测到的抗体水平范围为23,6至24.6(图8和9)。
上文结果显示所检测的抗体的水平对应于未被疫苗施用rFAdV9-435诱导的母源抗体。然而，正如上文提及的，对于不同组，在19DE时的早期攻击赋予的PM为90％至100％，这指示本发明的疫苗的有效性不受针对VIA-435的母源抗体影响。另外，它们提示其能够刺激细胞类型特异性免疫反应，在攻击前生成保护，这匹配指出细胞免疫对病毒性疾病控制很重要的科学文献。
此外，如图10中可见的，对于在31DE时获得的血清，结果指示在卵内免疫的组对于IH测试不呈现可检测的抗体应答，而对于在DE时免疫的组，检测到可归于rFAdV9-435疫苗的抗体水平，其中对于组5和6，滴度为26.3和25.8，与导致平均值22.1的未接种疫苗的对照组形成对比。
如图11中所示，在用10DE时再次接种疫苗的卵内免疫的组的情况下，检测到中等水平的疫苗rFAdV9-435诱导的抗体，对于组5和6滴度分别为24.4和24.0。相比之下，未接种疫苗的对照组导致102.1的IH抗体滴度平均值，这在技术上视为负滴度。在DE时免疫的组的情况下，伴随在10DE时的再次疫苗接种，结果对于组7和8分别为26.9和26.8，提示存在记忆性免疫应答。
在38D时获得的血清的情况下，图12中的结果指示对于在卵内免疫的组，rFAdV9-435疫苗首次允许检测到针对VIA-435Ag的所述抗体组；更具体地，对于组1为24.4并且对于组2为24 . 1。另一方面，对于在DE时免疫的组，与导致平均值21 . 2的未接种疫苗的对照组形成对比，抗体水平对于组3和4分别导致28.8和28.4的滴度。
由此参考伴随在10DE时的再次疫苗接种在卵内免疫的组(图13)，对于rFAdV9-435疫苗检测到诱导抗体的水平，其中对于组3和4，滴定分别为25.5和26.1，与导致平均值101.2的未接种疫苗的对照组形成对比。在DE时免疫的组的情况下，伴随在10DE时的再次疫苗接种，结果对于组7和8分别为28.9和28.4，这指示即使在38DE时，抗体水平对于所有组仍保持上升。
最后，对于在45DO时获得的血清，结果指示如图14中可了解的，对于在卵内免疫的组，rFAdV9-435疫苗允许检测到针对VIA-435Ag的抗体，对于组1为24.3并且对于组2为24.6，而对于组3和4，抗体水平分别导致28.4和28.1的滴度，与导致平均值20.8的未接种疫苗的对照组形成对比。
伴随在10DE时的再次疫苗接种的在卵内免疫的组中(图15)，检测到由rFAdV9-435疫苗诱导的抗体水平，其中对于组5和组6，滴定分别为26.6和26.8，与导致平均值100.8的未接种疫苗的对照组形成对比。对于在DE时免疫的组的情况下，伴随在10DE时的再次疫苗接种，结果对于组7和8分别为29.6和210.0；这指示即使在45DE时，抗体水平对于组5和6也保持在相同水平下，而对于组7和8，该抗体水平保持增加。
如由上文可观察到的，这些结果指示根据本发明制备的rFAdV9-435疫苗具有诱导用于IH测试的可检测抗体水平的能力，对于在卵内接种疫苗的组，对于在卵内免疫并在10DE时再次接种疫苗的组，检测从31DE起始。然而，对于在DE时接种疫苗、不含再次疫苗接种的组，检测也从31DE开始给予，但其滴度高于在卵内接种疫苗并在10DE时再次接种疫苗的组的滴度；对于在DE时接种疫苗并在10DE时再次接种疫苗的组，检测到的抗体水平在此时未揭示重要的回忆性应答。
在38DE(在卵内接种疫苗)时首次检测到关于组1的抗体水平，并且对于组3(在DE时的疫苗接种)，检测到抗体水平中的增加，这指示rFAdV9-435疫苗甚至在38DE时也保持增加体液应答。同样地，在38DE时，对于伴随在10DE时的再次疫苗接种的在卵内接种疫苗的组，注意到抗体水平中的增加高于仅接受在卵内剂量的组的那种；而对于在DE时接种疫苗的组，伴随在10DE时的再次疫苗接种，与仅接受在DE时的一个剂量的组形成对比，在38DE时的抗体增加不显著。
在45DE时，对于具有在卵内的单一剂量疫苗的组和具有在DE时的单一剂量疫苗的组两者，抗体水平保持实际上与38DE相同，这指示对于这些组，在38DE时获得通过IH测试的最大水平的可检测的循环抗体。然而，对于在卵内和在出生后一天接种疫苗的组，伴随在10DE时的再次疫苗接种，仍检测到抗体水平中的重要增加。
实例7.伴随在93DE时的攻击，单独或与针对马立克氏病的疫苗组合应用的 rFAdV9-435重组活性疫苗的体内评价
执行第二项研究以测定本发明的活性疫苗的有效性。
根据表5中所示，将疫苗经由SC施用于180只CRL小鸡，所述CRL小鸡分为6组，每组30只；与本发明的疫苗组合使用的针对马立克氏病的HVT疫苗是具有4200UFP/mL滴度的商业疫苗，并且它根据商业实验室指示采用。
为了下述实例的目的，认为1小鸡剂量(DP)对应于以DICC50％表示的以对数标度施用于每只鸟的剂量指数；例如，如果施用107.1DICC50％的一个剂量，则这等价于7.1DP。
将动物饲养在隔离单元中，其中在19、31和93DE时，用0.3mLVIAAP-H5N2(毒株A/小鸡/Querétaro/14588-19/95)经眼和通过鼻孔，对它们进行攻击，对每只小鸡应用在0.3mL中的108.0DIEP50％。
表5.使用rFAdV9-435疫苗的处理组。
实例7A.效力评价
在每次攻击后的10天期间每天观察所有组。为了执行临床评价，单独检查每只小鸡，并根据表3，根据观察到的临床变化对它给予数值。
M和IMb根据实例6A中所示的进行计算。结果显示于图16至18中。
在19DE时的早期攻击之前的效力结果指示，rFAdV9-435载体化疫苗经由SC与马立克氏病疫苗稀释剂本身中的HVT疫苗以0.2mL与7.1DP的比率组合或单独应用，生成以70％的死亡率的保护(PM)，伴随分别为18.4％和19.3％的低IMb。该结果证实rFAdV9-435疫苗的免疫原性潜力不受针对马立克氏病的HVT疫苗影响。
在19DE时的早期攻击之前的效力结果显示，连同马立克氏病HVT疫苗或单独应用的rFAdV9-435载体化疫苗生成70％至90％之间的PM和低IMb(参见图16)。该结果证实rFAdV9-435疫苗的免疫原性潜力不受针对马立克氏病的HVT疫苗影响。
同样地，这些结果指示rFAdV9-435疫苗在出生后一天6.1DP的仅一次应用，赋予鸟类的保护类似于当施用7.1DP的单次应用时，或当在10DE时施用第二剂量时。
在31DE时的攻击的情况下，图17中观察到的结果指示单独或与针对马立克氏病的HVT疫苗组合，经由SC应用的rFAdV9-435载体化疫苗生成100％的PM以及在所有免疫组中几乎为零的IMb，其中还证实rFAdV9-435疫苗的免疫原性潜力不受针对马立克氏病的HVT疫苗影响。
同样地，观察到rFAdV9-435疫苗的6.1DP的单次应用足以赋予针对在31DE时的攻击的极佳保护。
以相同的方式，在图18中，在93DE时的晚期攻击之前的效力结果指示，单独或与针对马立克氏病的HVT疫苗组合应用的本发明的载体化疫苗生成100％的PM和几乎为零的IMb。据此，显示rFAdV9-435疫苗保持相同的免疫原性潜力至少直到93DE，即使利用在出生后一天施用的6.1DP的单一剂量。
实例7B.免疫原性评价
在19、31和03DE时，从所有组中获得血清样品，将其保持在-20℃直至使用。在IH测试中，使血清的连续二倍稀释液面临4个血凝素单位(UHA)的VIABP-435。
结果概括于图19至21中，其中可观察到PM和IMb结果的类似物，因为对于在19、31和93DE时执行的攻击，在免疫组中测量的抗体水平对于所有测试的疫苗是相似的。
实例8.与经由SC应用相比较，经由IM应用的rFAdV9-435重组活性疫苗的功效，以 及在羽毛毛囊上的马立克氏病的HVT病毒的检测
根据表6中所示，采用330只LPE小鸡，所述LPE小鸡分成22组，每组15只。在1DE时以及在出生后不同的小时(HE)和DE时(除了未接种疫苗的对照组之外)，施用单独或与针对马立克氏病的HVT商业疫苗组合的疫苗，所述HVT商业疫苗具有4200UFP/mL的滴度，并且它根据商业实验室指示采用。
将鸟饲养在隔离单元中，其中在31DE时，用0.3mL VIAAP-H5N2(毒株A/小鸡/Querétaro/14588-19/95)经眼和通过鼻孔，对它们进行攻击，对每只小鸡应用108.0DIEP50％的剂量。
表6.使用rFAdV9-435疫苗和/或HVT的处理组。
实例8A.马立克氏病毒HVT毒株检测
在疫苗接种后15天(PV)，获得来自免疫组和未接种疫苗的对照组各自的五只小鸡的三个羽毛毛囊，并用于以1:5的比率与以pH 7.2的PBS制备浸渍团块，并对样品执行PCR和PCRtr测试。测试结果显示于表7中。
表7.由使用rFAdV9-435和/或HVT疫苗的处理组获得的结果
如可观察到的，使用不同的疫苗接种日程表，用单独的针对马立克氏病的HVT毒株疫苗或rFAdV9-435接种疫苗的所有组都对羽毛毛囊上的HVT病毒检测特异性的PCR测试呈阳性结果。相比之下，仅用rFAdV9-435免疫的组和未接种疫苗的对照组对于相同的PCR/HVT测试呈阴性结果。
关于PCRtr结果，仅用HVT疫苗接种疫苗的组的结果为9.7x 106.0，而对于具有应用HVT和rFAdV9-435的不同日程表的所有疫苗接种组，结果从1.6x 106 . 0到8.3x 106 . 0不等。在专一地用rFAdV9-435接种疫苗的组和未接种疫苗的对照组的情况下，结果是阴性的。
根据rFAdV9-435疫苗(SC或IM)和马立克氏病的HVT病毒病原(SC)的施用途径，PCR和PCRtr两者的结果均指示HVT疫苗病毒可在不同器官中适当地复制，且最终容纳在羽毛毛囊中，由此在PCRtr测试中检测到的以10为底的对数中的差异(非显著性)并不指示rFAdV9-435疫苗干扰HVT病毒复制，或其在生物中的病毒载量或循环到了一个避免合适的HVT疫苗免疫应答的程度。
实例8B.效力评价
在攻击后(PD)的10天期间每天观察所有组。为了执行临床评价，单独检查每只小鸡，并根据表3，根据观察到的临床变化对它给予数值。
PM和IMb根据实例6A中所示的进行计算。结果也显示于表7中。
效力结果指示经由SC或IM应用的rFAdV9-435疫苗，连同或不连同HVT疫苗且使用不同的疫苗接种日程表，能够在所有情况下生成极佳的100％PM和几乎为零的IMb，与PM为0％伴随100％的最大IMb的未接种疫苗的对照组形成对比。
基于来自实例8A和8B的结果，可以说针对马立克氏病的HVT毒株疫苗和针对IAAP-H5N2的rFAdV9-435疫苗可联合采用，而不影响两种疫苗中的任一种的免疫应答。
实例9.与经由SC应用相比较，经由IM应用的rFAdV9-435重组活性疫苗的功效
根据表8形成各10只LPE小鸡的5组，其中4组接种疫苗，并且1组留作未接种疫苗的对照组。
将小鸡饲养在隔离单元中，并且在31DE时，用0.3mL VIAAP-H5N2(毒株A/小鸡/Querétaro/14588-19/95)经眼和通过鼻孔，对它们进行攻击，对每只小鸡应用7.5DP。
表8使用rFAdV9-435疫苗的处理组。
实例9A.效力评价
在10天PD期间每天观察所有组。为了执行临床评价，单独检查每只小鸡，并根据表3，根据观察到的临床变化对它给予数值。
PM和IMb根据实例6A中所示的进行计算。结果显示于图22中。
在31DE时用VIAAP-H5N2攻击之前的效力结果指示，在G1和G2时在出生后一天经由IM应用的rFAdV9-435载体化疫苗赋予100％的PM以及分别为1.2和2.3的IMb。经由SC免疫的来自G3和G4的结果是100％PM以及1.3和2.6的IMb，这证实了用于rFAdV9-435疫苗施用的SC途径以及IM途径的可行性。
实例9B.免疫原性评价
在31DE时，从所有组中获得血清样品，将其保持在-20℃直至使用。在IH测试中，使血清的连续二倍稀释液面临4个血凝素单位(UHA)的VIABP-435。
IH测试结果显示于图23中。在31DE时获得的血清分别反映对于G1、G2、G3和G4为24 . 6、25 . 1、24 . 5和24.8的平均值，指示与攻击前鸟的保护的高度关联。
这些结果证实，当经由IM施用和经由SC施用时，本发明的疫苗同样有效地诱导循环抗体。
实例10.rFAdV9-gB重组活性疫苗针对禽传染性喉气管炎的体内评价
以与实例5中描述的相似的方式，制备在具有禽传染性喉气管炎(LTI)的糖蛋白B插入物的禽腺病毒载体中的重组疫苗，称为rFAdV9-gB疫苗，并测试其有效性。
采用90只LPE小鸡，分成9组，每组10只，1个未接种疫苗的对照组，1个未接种疫苗的对照和非攻击组，以及用下述疫苗免疫的7组：a)rFAdV9-gB疫苗；和b)具有鸡胚修饰的活性病毒(CEP-LTI)的商业疫苗。根据表9中所示，对组进行免疫。
将动物饲养在隔离单元中，并在31DE时用高病毒载量LTI病毒(vvLTI)，USA 63,140毒株攻击，将所述毒株以在0.3mL中3.9DP的剂量率应用于每只小鸡，对每只眼应用两滴，并且对每个鼻孔应用3滴。
表9.使用FAdV9-gB疫苗的处理组
实例10A.效力评价
在9天PD期间每天观察所有组。为了执行临床评价，单独检查每只小鸡，并根据表3，根据观察到的临床变化对它给予数值。
M和IMb根据实例6A中所示的进行计算。结果显示于表10中。
在接种疫苗的LPI小鸡的不同组中观察到的IMb结果指示9天PD，伴随vvLTI，临床体征一般具有低至中等强度，低于对于G8未接种疫苗对照组观察到的那些。
对于经由SC用7.1和/或7.5DP的rFAd9-gB疫苗免疫的G1、G2和G3，IMb分别为6.2、6.1和3.5，而对于用10倍剂量低的rFAdV9-gB疫苗(6.1和/或6.5DP)免疫的G4、G5和G6组，获得分别为6.5、6.3和5.2的类似IMb(表10)。这些结果指示使用10倍剂量低的rFAdV9-gB载体化疫苗不表现出显著差异，以便保护接种疫苗的鸟不出现免疫鸟中LT的临床体征。另一方面，它们显示具有LTI病毒的gB插入物的本发明的重组疫苗rFAdV9-gB，显示预防对喉和气管的损伤略微劣于CEP-LTI商业疫苗的结果。
关于M，它在任一组中均未观察到。
表10.rFAdV-gB疫苗功效
实例10B.对肉眼可见损伤预防的效力评价
在攻击后九天，处死来自所有组的鸟，检查来自每组中的鸟的喉和气管，以测定是否存在肉眼可见损伤(在喉和气管粘膜下层上的浆液性渗出物和点状出血的存在)，比较与指定数目五(+++++)的未接种疫苗但受攻击的G8以及指定数目零(-)的既未接种疫苗也未受攻击的对照组(称为G9)的肉眼可见变化程度。
还显示在表10中的在接种疫苗的LPE小鸡的不同组中观察到的肉眼可见损伤预防结果，指示用rFAdV9-gB疫苗免疫的所有组(甚至对于其中应用10倍剂量低的该疫苗的G4、G5和G6)，显示类似的肉眼可见损伤保护指数，非常接近于由CEP-LTI商业疫苗生成的保护。
这些结果证实，使用10倍剂量低的rFAdV9-gB在降低免疫鸡上的肉眼可见损伤的出现方面不表现出显著差异，并且能够获得接近于用由完整病毒制备并在鸡胚中繁殖的商业疫苗获得的那些的结果，而不承担它所带来的风险。
根据上文描述，可见血清型9禽腺病毒载体中的重组疫苗已被设计为具有稳定的重组疫苗，即使当与马立克氏病疫苗组合施用时也是有效的，并且其功效不受母源抗体的存在影响，并且对于本领域技术人员显而易见的是，根据上文描述且在附图中所示出的血清型9禽腺病毒载体中的重组疫苗及其用途的实施例，仅是举例说明性的而不是本发明的限制，因为能够对其细节考虑若干改变而不背离本发明的范围。例如，已在实验上显示，能够实现在具有多种外源基因的细胞培养物的连续传代中的稳定性，并且能够利用不同类型的可接受的媒介物用于疫苗制剂。
因此，除了现有技术要求和所附权利要求的范围之外，不应认为本发明受到限制。
序列表
<110> 墨西哥禽类实验室
<120> 以重组血清型9禽腺病毒载体形式的疫苗
<130> PCT15-1044
<150> PCT/IB2014/063809
<151> 2014-08-08
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 593
<212> DNA
<213> 禽腺病毒9
<400> 1
atgggagcca cctacttcga catcaagggc gttctagaca gaggaccttc ttttaaacca 60
tacggaggaa ccgcatacaa tcccctcgcg ccccgcgaag cctttttcaa caattggctt 120
gagtcagagc cgaacaagac cgtcattacg gggttaatga ccacccccta ccgaaacgac 180
caggggaaca agaccaatac tgctgacgta gttaatagcg tgtcgggagt ttatccgaac 240
cccaatctcg gaccctgcat cagcgagatg ggagcactgg atgatgcaac tgctgacctt 300
gtcggctttg cgggacggtt tgcgaaagtt acaaacgaga atacgcgttt ggcatacgga 360
gcgtatgtga aaccgttgaa aaacgatggt tcgcagtcat taaaccccac tccttactgg 420
gtaatggaca agactgacgc caagtatctg ggcgtgatgg ccgtggaaga tttcagcacc 480
agtctcacct atccggacag cttgttaatc cctccgccct cggactactc aaccgttaac 540
acgggcgcaa tgaaagcaaa ccgtcctaac tacatcggtt tcagagataa ctt 593
<210> 2
<211> 1695
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒
<400> 2
atggaaagaa tagtgattgc ctttgcaata atcagcattg ttacaggtga ccaaatctgc 60
attggttatc atgcaaacaa ttcaacaaaa caagttgata caatcatgga aaagaatgtg 120
acggtcacac atgctcagga catactagaa aaagaacaca atggaagact ctgcagtctt 180
aaaggagtaa agcccctcat cctgaaggat tgcagcgtag ctgggtggat tctgggaaat 240
cctatgtgtg gtgaattcct gaatgtgccg gaatggtcat acattgtgga gaaagacaac 300
ccatccaatg gcctgtgtta ccctggaaac ttcgacaatt atgaagaatt gaagcattta 360
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acaagaggct tatttggagc aatagctgga ttcatagaag gggggtggca aggaatggtg 1080
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gaatctacac agaaagcaat taatggaatc actaataaag tcaactcaat cattggcaaa 1200
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tacgataagg tccgactcca actgagagat aatgcaaaag aactaggcaa cggatgcttt 1440
gaattctacc acaagtgtga caatgaatgc atggaaagtg tgagaaatgg aacgtatgat 1500
tacccacaat actcaaaaga gtcaaaactg aatagagagg aaatagaagg ggtcaaatta 1560
gaatcaacag ggacttatca gatactttca atctattcaa cagtggcgag ttccctagca 1620
ctggcaatca tggtagctgg tctatctttt tggatgtgct ccaatggatc attgcagtgc 1680
agaatttgca tctaa 1695

Claims (23)

1.一种重组疫苗，所述重组疫苗包含具有插入的至少一个外源核苷酸序列的血清型9禽腺病毒载体(FAdV-9)，以及药学上可接受的媒介物、佐剂和/或赋形剂，所述至少一个外源核苷酸序列编码目的疾病的至少一种抗原，并替换腺病毒基因组非必需区，其特征在于所述外源核苷酸序列位于491和2782个核苷酸之间。
2.根据权利要求1所述的重组疫苗，其中所述FAdV-9载体是活的(活性的)或灭活的。
3.根据权利要求1所述的重组疫苗，其中所述FAdV-9载体包含序列SEQ ID NO:1。
4.根据权利要求1所述的重组疫苗，其中所述外源核苷酸序列编码选自以下的目的疾病的至少一种抗原：禽流感、具有包涵体的肝炎、禽传染性喉气管炎、新城疫、法氏囊感染、传染性支气管炎、由偏肺病毒(MPNV)引起的疾病、马立克氏病、禽传染性贫血或其大小允许插入所述FAdV-9载体的任何其他基因(gen)。
5.根据权利要求4所述的重组疫苗，其中所述外源核苷酸序列编码包含以下的组的抗原：禽流感病毒的血凝素(HA)；包涵体肝炎病毒，血清型4和8的纤维和六邻体；禽传染性喉气管炎病毒(LTI)的糖蛋白B(gB)和糖蛋白D(gD)；新城疫病毒的HN和F蛋白；法氏囊的VP2蛋白病毒感染；传染性支气管炎病毒的S1和S2蛋白；偏肺病毒(MPNV)的F蛋白；以及禽传染性贫血的VP1、VP2和VP3蛋白。
6.根据权利要求5所述的重组疫苗，其中所述禽流感病毒的HA选自所述蛋白质的H1、H2、H3、H5、H6、H7或H9亚型中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的重组疫苗，其中所述外源核苷酸序列包含编码与用作病毒载体的所述FAdV-9不同的禽腺病毒的至少一种抗原的基因。
8.根据权利要求1所述的重组疫苗，其中为了实现抗原应答所需的病毒浓度为至少105.0DICC50％/剂量。
9.根据权利要求8所述的重组疫苗，其中为了实现所述抗原应答所需的病毒浓度为至少106.0DICC50％/剂量。
10.根据权利要求2所述的重组疫苗，其中当所述疫苗是活的(活性的)时，所述药学上可接受的媒介物是水性溶液，优选选自包含TPGA稳定剂(海藻糖、磷酸盐、谷氨酸盐、白蛋白)的水性溶液；包含蛋白胨稳定剂的水性溶液；和包含脱脂乳的水性溶液。
11.根据权利要求2所述的重组疫苗，其中当所述疫苗是灭活的时，所述药学上可接受的媒介物是水性溶液或乳液。
12.根据权利要求11所述的重组疫苗，其中所述药学上可接受的媒介物是水-油乳液；油-水乳液；或水-油-水乳液。
13.根据权利要求2所述的重组疫苗，其中所述活的或活性疫苗被制备为肌内、鼻内、皮下、通过喷雾、雾化、经口或通过饮用水或卵内施用。
14.根据权利要求2所述的重组疫苗，其中所述灭活疫苗被制备为肌内或皮下施用，优选皮下施用。
15.根据权利要求1所述的重组疫苗，所述重组疫苗包含马立克氏病全病毒疫苗。
16.根据权利要求1所述的重组疫苗，所述重组疫苗包含具有插入的至少两个外源核苷酸序列的FAdV-9载体，所述至少两个外源核苷酸序列编码来自相同目的疾病或不同目的疾病的至少两种抗原，并且替换位于491和2782个核苷酸之间的所述腺病毒的基因组非必需区。
17.根据权利要求1所述的重组疫苗，所述重组疫苗包含基于FAdV-9载体的至少第二疫苗，所述FAdV-9载体具有插入的至少一个外源核苷酸序列，所述至少一个外源核苷酸序列编码相同目的疾病或不同目的疾病的与所述第一疫苗的至少一种抗原不同的至少一种抗原，并且替换位于491和2782个核苷酸之间的所述腺病毒的基因组非必需区。
18.一种血清型9禽腺病毒重组病毒(FAdV-9)的主种子，所述FAdV-9具有插入的外源核苷酸序列，所述外源核苷酸序列编码目的疾病抗原并替换位于491和2782个核苷酸之间的腺病毒基因组非必需区，其中它在细胞培养中6至11次传代后获得。
19.血清型9禽腺病毒载体(FAdV-9)用于制备能够在动物中生成免疫应答的重组疫苗的用途，所述FAdV-9具有插入的外源核苷酸序列，所述外源核苷酸序列编码目的疾病抗原并替换位于491和2782个核苷酸之间的腺病毒基因组非必需区。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述重组疫苗以单一剂量或者以两个或更多个剂量施用。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述重组疫苗以单一剂量施用。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述重组疫苗单独施用或者与其他重组或非重组、活的(活性的)或灭活疫苗联合施用。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述重组疫苗与针对马立克氏病的疫苗联合施用。
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