JP2004504024A - 前脂肪細胞系 - Google Patents
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Abstract
本発明は脂肪細胞に分化する能力を有する新規なヒト前脂肪細胞系に関する。特に、本発明は、白色脂肪組織に由来する脂肪細胞系、ならびに肥満、糖尿病および心血管疾患に対する薬物、食品成分および栄養補助剤の開発におけるその使用に関する。
Description
【0001】
本発明は、脂肪細胞に分化する能力を有するヒト前脂肪細胞系に関する。特に、本発明は、白色脂肪組織に由来する前脂肪細胞系、ならびに肥満、糖尿病および心臓血管疾患に対する薬剤、食品成分および栄養補助剤の開発におけるその使用に関する。
【0002】
肥満は米国国立衛生研究所によって公衆衛生上の危険要因であると宣言されている。肥満は余剰脂肪組織の存在として定義できるが、北米人口の約30〜50%、また、世界的に見ても人口の相当な割合が肥満に冒されている。肥満の影響、例えば、インシュリン非依存型糖尿病、冠状動脈疾病、高血圧症は、直接的に458億ドルのコストをもたらし、また例えば、休業などによってさらに230億ドルの間接コストをもたらしていると見積もられている。
【0003】
脂肪および炭水化物の過剰摂取は、肥満と高脂血症を引き起こし、最終的には高血圧症や動脈硬化症の発症にもつながると考えられている。したがって、脂肪および炭水化物の吸収を抑制し、蓄積した脂肪を減少させることが望ましいという点は強く認識されてきた。幼児はカロリーの過剰摂取環境に置かれると、脂肪細胞が増加して潜在的肥満と呼ぶべき状態になる。この理由から、特に幼児の脂肪細胞数増加の抑制は、子供において、したがって、成人においても肥満および肥満の併発症と呼ぶべき心臓血管疾患の予防に直接つながることが報告されている。
【0004】
この歴然とした健康問題と闘うには、予防と治療双方のアプローチが必要である。予防目的のためには、人の肥満への傾向性や感受性を予見し、測定できるようにすることが有用であろう。治療目的のためには、脂肪細胞の発達または分化を妨害する手段が非常に有益となるであろう。こうした望ましい目的はいずれもこれまでのところ達成されていないが、これは主として脂肪組織の発達の調節および制御(例えば脂肪細胞前駆体の増殖および分化)に関してほとんど知られていないためである。
【0005】
このような増殖および分化を制御する手段または物質をそれぞれ識別することは正常な脂肪組織の発達を理解するためにも、また、肥満のような脂肪組織発達の異常な状態を制御するためのアプローチを考えるためにも非常に重要である。
【0006】
ある物質が脂肪組織発達の生理学的調節に関係するかどうかを決定するためには、脂肪細胞またはその前駆体がこの因子に応答的であるか、また、最終的にはこの因子がin vivoで脂肪組織の発達を効率的かつ特異的に調節することができるかを調べればよいであろう。しかし、これまでは適切な研究ができていない。この事実は、主として、生体組織から得た正常な脂肪細胞の特性を示し、かつ、実験を行なうためにin vitroで長期間、培養できるヒト脂肪組織に由来する適当な組織または細胞がなかったためである。
【0007】
脂肪細胞すなわちアディポサイトは、脂肪組織の主要な部分を占める細胞集団であり、トリグリセリドの主要な貯蔵場所となっており、内分泌腺系細胞であるとみなされている。脂肪組織はトリグリセリドの形で身体のためのエネルギーを蓄える貯蔵庫となり、また、カロリーの摂取が同化作用の必要量以下に落ちた場合、この組織は遊離脂肪酸を放出することができる。食餌の摂取量増加に応じて身体はエネルギー・バランスを維持するため、通常自動的に活動によってエネルギー消費を増加させる。エネルギーは熱として放出することもできる。食餌の摂取を同化作用の活動とバランスさせる共通のエネルギー調節経路があり、これは大体は視床下部によって調整されている。現在では、脂肪細胞はこのプロセスにおいて積極的な役割を果たし、トリグリセリド新陳代謝をフィード・バックし、その調節を果たす分子もおそらく生産していることが明らかになっている。さらに、脂肪細胞は、末梢器官や中枢器官における重要な機能を調整するホルモンを分泌できる。最も良い例はレプチンであり、これは脂肪細胞によって分泌され、視床下部に存在する受容体を介してエネルギー代謝と満腹感を調節する。したがって、このような分子を発見して調べることは大変興味深いであろう。
【0008】
基本的に2つのタイプの脂肪組織、褐色脂肪組織および白色脂肪組織が存在し、これらは体内で全く異なる役割を果たしている。白色脂肪は余剰カロリー摂取分を貯蔵するように設計されており、褐色脂肪はユニークなシステムを用いて余剰カロリーを吸い上げ、それを使用して体温を生成する。しかし、白色脂肪細胞は熱発生の制御に関わる非結合性タンパク質を発現することが示された。白色脂肪組織だけが成人に存続するので、白色脂肪によって引き起こされた熱発生はエネルギー消費を増加させるかもしれない。
【0009】
したがって、本発明の目的は、体内における白色脂肪組織の役割をさらに調べる手段の提供にある。
【0010】
本発明の別の目的は白色脂肪組織に対する新規な薬剤または食物成分の影響の調査を可能にする手段を提供することである。
【0011】
上記の目的は、成熟白色脂肪細胞に分化する能力を有する一方、基本的に正常な白色脂肪細胞と同様な細胞特性を示す、白色脂肪細胞に由来する新規な前脂肪細胞系の提供により解決された。
【0012】
細胞系は、分子細胞生物学の発達、特に細胞内の活動、細胞外分子の作用および細胞−細胞相互作用の解明に重要な役割を果たしてきた。細胞系は、通常、種々の細胞の集まりである組織を外植し、細胞を分離し、対象とする細胞クローンを単離し、数世代にわたって全細胞数を増加させ、集団の血統が均一化するように、細胞クローンを培養することによって段階的に確立される。しかし、これらの細胞でも、in vitroの培養では老化開始前の限られた世代数しか継代できない。
【0013】
基本的に連続的に培養できる細胞は不死化細胞として知られている。これを培養することによって多くの細胞を含む均一な細胞集団が得られるので、不死化細胞は、非不死化細胞に優る多くの利点を有する。通常、不死化細胞系は、組換えウィルスまたはレトロウィルスによって調製されるが、こうした方法で不死化された細胞は細胞機能の点で何らかのバランスを欠いている。このため、不死化細胞系は、非常に多くの場合、前記の種類の細胞で通常見られる酵素または構造ポリペプチドを生産しないなど異なる同化作用のパターンを示し、それらが由来する細胞と実質的に異なっている。さらにそのために分化能力も強く影響を受ける。したがって、多くの種類の細胞は単離して連続的に培養することが困難なままであった。
【0014】
本発明は、分化成熟して白色脂肪細胞となる能力を有する新規な不死化細胞系を提供する。この白色脂肪細胞は生体組織から得た白色脂肪細胞と基本的に同一の形態学的パターン(例えば、ポリペプチド発現や細胞の外観によって示されるもの)を示すものである。
【0015】
本発明の前脂肪細胞系はインシュリン、トリヨードチロニン、デキサメタゾンおよびペルオキシソーム増殖剤応答性受容体(PPAR:peroxisome proliferator−activated receptors)のアクティベータなど、当業者には知られた化合物によって成熟白色脂肪細胞に分化することができる。このようにして得られた白色脂肪細胞は、次いで、トリグリセリド合成に関与する酵素(例えば、リポタンパク質リパーゼ、脂肪酸合成酵素、脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質、レプチン、アディプシン(adipsin)、アディポネクチン(adiponectin)、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ(PPARγ)、ホルモン感受性リパーゼなど)など、正常な白色脂肪細胞と同じ代謝マーカーを基本的に示す。白色脂肪細胞は、少なくとも12世代、好ましくは少なくとも20世代、より好ましくは少なくとも30世代、最も好ましくは少なくとも50世代を培養において維持することができる。
【0016】
好ましい実施形態によれば、細胞系はブダペスト条約に従い2000年7月13日にパストゥール研究所に寄託された細胞系(寄託番号:CNCM I−2520)または2001年4月27日に寄託された細胞系(寄託番号:CNCM I−2663)のいずれかである。
【0017】
本発明の細胞株を調製する方法は次のステップ(a)〜(e)を含む。
【0018】
ステップ(a)では、人間のドナーの適当な脂肪組織からin vitroに白色脂肪細胞を分離する。ドナーから得た1次組織は、最初に、存在する他の細胞から脂肪細胞を分離するように、例えば、コラゲナーゼを含む溶液で組織試料を処理し、引き続いてろ過、さらに遠心分離することによって脂肪細胞を他の細胞から分離するなどの処理を行う。
【0019】
次のステップ(b)では、ステップ(a)の中で得られた脂肪細胞を脱分化する。これは、例えばげっ歯動物脂肪細胞について前に記載されたいわゆる「天井培養法」(ceiling culture method)を使用して行うことができる(Sugihara H.,Yonemitsu N.,Miyabara S.,Yun K.1986.単房性脂肪細胞の1次培養:インビトロでの成長の特徴と分化特性の変化(Primary culture of unilocular fat cells:characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties.)、Differentiation,31:42〜49)。この方法では、上部まで培地で満たした培養フラスコに脂肪細胞を移し、これを上下逆さまにする。この条件下では、脂肪細胞は6日後には脂質小滴を失った繊維芽細胞状の細胞に自然に脱分化した。次いで、このようにして生じた脱分化脂肪細胞を前記と同じ培養条件下に増殖させると、活発に成長する前脂肪細胞が得られる。
【0020】
このように得られた前脂肪細胞を次のステップ(c)で不死化する。これは、組換えプラスミド、組換えウィルスまたはレトロウィルス(例えば、SV40ウィルス(サル・ウィルス)のラージT抗原遺伝子またはHPVウィルス(ヒト乳頭腫ウィルス)のE6またはE7の遺伝子を担持する組換えレトロウィルス・ベクター)などの組換えベクターに細胞を感染させることによって行なうことができる。別法では、組換えベクターはテロメラーゼ逆転写酵素(TERT)遺伝子(好ましくは不死化しようとする細胞種に由来するもの)を有する。後の方法の要点は、老化に伴う効果として知られている染色体テロメアの短縮を基本的に防止することにある。テロメアの維持および細胞の不死化はKiyonoら、Nature,396(1998),84〜88において上皮細胞について報告されており、その内容は言及により本願に組み込まれる。
【0021】
SV40ウィルス(サル・ウィルス)あるいはHPVウィルスのE6またはE7遺伝子およびTERT遺伝子による連続的感染もヒト前脂肪細胞の不死化の別法となる。
【0022】
続くステップ(d)では、確実に不死化した細胞を選択する。これは、例えば、ステップ(c)で得た細胞を単に数世代継代培養することにより、または、SV40ウィルス由来の遺伝子またはHPVウィルス由来の遺伝子など、不死化のために使用したベクターの遺伝子の有無について細胞を試験することにより行なうことができる。これは、抗体によるそれぞれの遺伝子の発現の検知により行ってもよいし、あるいはPCR技術による分析を含んでもよい。テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子の発現は、テロメラーゼ反復増幅プロトコル(TRAP)を適用することにより決定されるテロメラーゼ活性を測定することにより検知される。
【0023】
続くステップ(e)では、ベクターの導入によって確実に不死化していることが示された細胞について、その成熟白色脂肪細胞への分化能力を試験する。この目的のために、ステップ(d)で得られた細胞系を、細胞内脂質の染色によって検知できるように一般的な分化剤によって処理する。脂質の染色は、一般に、特異的に脂質を染色するオイルレッドO法によって行われる。
【0024】
本発明による細胞系は、白色脂肪細胞による、脂質の取り込みおよび放出の調節を制御する役割を調べたり、前脂肪細胞の成熟した脂肪細胞への分化を制御する物質の識別、または肥満、糖尿病および心臓血管疾患用について標的発現を制御する能力を有する化合物のスクリーニングなど、様々な目的に利用できる。特に、これらの細胞系は、レプチンなどのエネルギー代謝制御に関わる化合物の脂肪細胞による放出を調節し得る因子のスクリーニングに有用かもしれない。
【0025】
以下の例は本発明を例証するが、本発明はここに述べる特定の実施形態に限定されるものではない。
【0026】
実施例1 ヒト皮下脂肪組織からの脂肪細胞の採取
外科手術後、肥満の患者からの皮下脂肪組織の生検試料を、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM:Dulbecco’s modified Eagle’s medium)および10%のウシ胎仔血清(FCS)(Gibco BRL)、100μg/mlストレプトマイシン/ペニシリンおよび2mMグルタミンを補ったハム(Ham)F12培地(v/v)(Gibco BRL)の混合物を用いて室温で維持した。この培地を基本培地と呼ぶ。脂肪組織をミンチして小片とし、組織1グラムについて消化培地3mlを用い37℃で20分間消化した。消化培地は2mg/mlのコラゲナーゼ(Roche Biomedical)および20mg/mlのウシ血清アルブミン(シグマ)を含みDMEM培地に溶解したものである。
【0027】
FCS濃度20%とするために、等体積のFCSを添加して消化を停止した。消化された流体を異なる空孔率(250、100μm)のフィルタで2度ろ過し、1000rpmで10分間遠心分離した。脂肪細胞画分を薄い白色浮遊層として得、これを取り出して37℃の30mlリン酸塩バッファー中に入れた。他の汚染細胞の除かれた脂肪細胞画分を得るためにこの懸濁液を遠心分離した(1000rpm、10分間)。
【0028】
実施例2 1次脂肪細胞分化および増殖
20%FCS、10mg/mlストレプトマイシン/ペニシリンおよび2mMグルタミンを補ったハムF12培地(v/v)と混合したDMEMで25cm2フラスコを完全に満たし、このフラスコ中で約106個の脂肪細胞をインキュベートした。脂肪細胞が上面内部の表面に付着し得るようにフラスコを上下逆さまにした。適当な環境(37℃、湿度90%)で8日間培養した後、細胞は付着して前脂肪細胞に自然に脱分化し増殖し始めた。次いで、フラスコを本来の向きに戻し培地を取り除いた。上記の基本培地5mlをフラスコに加えた。2日後、これらの条件下で細胞を感染させた。
【0029】
実施例3 細胞不死化
1.レトロウィルスの生産
SV40ウィルス(サル・ウィルス)のラージT抗原遺伝子もしくはHPVウィルス(ヒト乳頭腫ウィルス)のE6/E7遺伝子またはヒト・テロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)を含む組換えレトロウィルス・ベクターを、選択マーカーとしてヒスチジノール遺伝子を含むpLHXSDレトロウィルス・ベクター(Stockschlaederら,Hum Gene Ther.2(1991),33〜39)のBamHIサイトに標準的な組み換えDNA技術によって挿入することにより構築した。
【0030】
両種指向性(amphotropic)パッケージング細胞系であるフェニックス(Phoenix)(Clontech)への組換えレトロウィルス・ベクターのトランスフェクション後、「ピンポン」感染により高タイター・ウィルスを製造するため同種指向性(ecotropic)パッケージング細胞系Psi2(ATCC)との共培養によって伝染性の組換えウィルス粒子を生成した(Lynch C,Miller D.1991.パッケージング細胞の様々な宿主手段との共培養による高ヘルパーウイルスフリーレトロウイルスベクターの製造(Production of high helper virus−free retroviral vectors by cocultivation of packaging cells with different host racipes.)、J.Virol.65:3887〜3890)。
【0031】
2.1次脂肪細胞の感染
前記のようにして製造した伝染性の組換えウィルス粒子を用いて、実施例2によって得た1次ヒト脱分化脂肪細胞を感染させた。細胞を20μg/ml DEAEデキストランの存在下、組換えウィルスとともに37℃(湿度90%)で3時間インキュベートした。感染後に、培地を基本培地と交換した。
【0032】
感染10日後に、1次クローンを吸引によって拾い上げ、別々に展開した。
SV40T抗原:
5’GGATTCAGTGGTGTATGACT;
5’AGGCACACTGTACTCATTCA;
E7:
5’GGAGATACACCTACATTGCA;
5’GATGGGGCACACAATTCCTA
(すべてMicrosynthから購入した)
を用いて、様々なクローン中のSV40T抗原またはE7遺伝子の発現をRT−PCRを使用して測定し、ヒトSV40T抗原(発癌遺伝子)に対するマウス単クローン抗体を利用した免疫染色によって測定した。テロメラーゼ活性をキムら、Science,266(1994),2011〜2015によるテロメラーゼ反復増幅プロトコル(TRAP)を適用して決定した。
【0033】
実施例4 感染した細胞の分化
実施例3で得た7SV40T抗原、E7、TERTまたはE7およびTERT陽性の細胞を、実施例1で定義した基本培地中でインキュベートして集密化させ、その段階で脂肪生成用混合物(カクテル)を培地に加えた。この混合物は、基本培地を含み、また850nMインシュリン、10μg/mlトランスフェリン、1nMトリヨードチロニン、500μMフェチュイン(fetuin)、33μMパントテン酸、1mMヘペス(Hepes)、15mM NaHC03および1μMデキサメタゾン、およびlμM BRL49653、PPARγアゴニストを補ったものである。次いで、細胞のインキュべーションを続けた。10日目には、集密化した細胞が細胞内脂質小滴(特異的染色で観察)を有する脂肪細胞的発現型を示し始めた。10%ホルムアルデヒドで固定した細胞をイソプロピルアルコールに溶解した染料とともに2時間インキュベートし、オイルレッドOで染色した。次いで、細胞を水で洗浄し顕微鏡で観察した。分化した脂肪細胞は、脂質小滴の蓄積に対応する細胞質中の赤い点で満たされた細胞として現われた。
【0034】
実施例5 分化した不死化ヒト前脂肪細胞中での細胞脂肪の発現
細胞系CNCM I−2550(前記実施例で得たものと同様)の集密化した不死化ヒト前脂肪細胞を、実施例4に記載した無血清化学培地で培養した。
【0035】
集密化後17日目に、細胞をハンク平衡塩溶液で洗浄し、RNeasy全RNA精製システム(Qiagen AG(スイス))を使用してRNAを抽出した。RT−PCR用第1鎖cDNA合成キット(AMV;Roche Biomedical、スイス)を使用し、オリゴd(T)15をプライマーとして用いて全RNA2μgの入力に対して逆転写を行った。興味のあるcDNAの増幅のために使用したプライマーは、Mycrosynth(ヴィンディッシュ(スイス))によって合成された。
【0036】
順方向および逆方向のプライマーの配列は以下のとおりであった:
【0037】
【0038】
PCR反応は、DNA熱サイクラー装置(Bioconcept、AlIschwil、スイス)中、98℃、1分、60℃、2分および72℃、2分の加熱を2サイクル、次いで、94℃、1分の変性ステップ、60℃、1分のアニーリングステップおよび72℃、2分の伸張ステップを28サイクル行った。
【0039】
内部対照としてアクチンプライマーを反応に含ませた。PCR産物(10μl)は、2%アガロース・ゲル上で分離し、エチジウムブロミドで染色することにより可視化した。
【0040】
結果は、調べた細胞系が、そのままの脂肪組織と本質的に同じようにそれぞれの脂肪細胞マーカーを発現することを明確に示している。
【図面の簡単な説明】
【図1】
前脂肪細胞を得た方法を概略的に示す図である。
【図2】
RT−PCRおよび免疫蛍光検査法によって分析した様々な不死化クローン中でのSV40ラージT抗原の発現を示す図である。
【図3】
様々な脂肪生成条件下での細胞分化を示す図である。
【図4】
細胞系中の脂肪細胞分化の様々なマーカーの発現パターンをヒト脂肪組織と比較して調べた実験結果を示す図である。
本発明は、脂肪細胞に分化する能力を有するヒト前脂肪細胞系に関する。特に、本発明は、白色脂肪組織に由来する前脂肪細胞系、ならびに肥満、糖尿病および心臓血管疾患に対する薬剤、食品成分および栄養補助剤の開発におけるその使用に関する。
【0002】
肥満は米国国立衛生研究所によって公衆衛生上の危険要因であると宣言されている。肥満は余剰脂肪組織の存在として定義できるが、北米人口の約30〜50%、また、世界的に見ても人口の相当な割合が肥満に冒されている。肥満の影響、例えば、インシュリン非依存型糖尿病、冠状動脈疾病、高血圧症は、直接的に458億ドルのコストをもたらし、また例えば、休業などによってさらに230億ドルの間接コストをもたらしていると見積もられている。
【0003】
脂肪および炭水化物の過剰摂取は、肥満と高脂血症を引き起こし、最終的には高血圧症や動脈硬化症の発症にもつながると考えられている。したがって、脂肪および炭水化物の吸収を抑制し、蓄積した脂肪を減少させることが望ましいという点は強く認識されてきた。幼児はカロリーの過剰摂取環境に置かれると、脂肪細胞が増加して潜在的肥満と呼ぶべき状態になる。この理由から、特に幼児の脂肪細胞数増加の抑制は、子供において、したがって、成人においても肥満および肥満の併発症と呼ぶべき心臓血管疾患の予防に直接つながることが報告されている。
【0004】
この歴然とした健康問題と闘うには、予防と治療双方のアプローチが必要である。予防目的のためには、人の肥満への傾向性や感受性を予見し、測定できるようにすることが有用であろう。治療目的のためには、脂肪細胞の発達または分化を妨害する手段が非常に有益となるであろう。こうした望ましい目的はいずれもこれまでのところ達成されていないが、これは主として脂肪組織の発達の調節および制御(例えば脂肪細胞前駆体の増殖および分化)に関してほとんど知られていないためである。
【0005】
このような増殖および分化を制御する手段または物質をそれぞれ識別することは正常な脂肪組織の発達を理解するためにも、また、肥満のような脂肪組織発達の異常な状態を制御するためのアプローチを考えるためにも非常に重要である。
【0006】
ある物質が脂肪組織発達の生理学的調節に関係するかどうかを決定するためには、脂肪細胞またはその前駆体がこの因子に応答的であるか、また、最終的にはこの因子がin vivoで脂肪組織の発達を効率的かつ特異的に調節することができるかを調べればよいであろう。しかし、これまでは適切な研究ができていない。この事実は、主として、生体組織から得た正常な脂肪細胞の特性を示し、かつ、実験を行なうためにin vitroで長期間、培養できるヒト脂肪組織に由来する適当な組織または細胞がなかったためである。
【0007】
脂肪細胞すなわちアディポサイトは、脂肪組織の主要な部分を占める細胞集団であり、トリグリセリドの主要な貯蔵場所となっており、内分泌腺系細胞であるとみなされている。脂肪組織はトリグリセリドの形で身体のためのエネルギーを蓄える貯蔵庫となり、また、カロリーの摂取が同化作用の必要量以下に落ちた場合、この組織は遊離脂肪酸を放出することができる。食餌の摂取量増加に応じて身体はエネルギー・バランスを維持するため、通常自動的に活動によってエネルギー消費を増加させる。エネルギーは熱として放出することもできる。食餌の摂取を同化作用の活動とバランスさせる共通のエネルギー調節経路があり、これは大体は視床下部によって調整されている。現在では、脂肪細胞はこのプロセスにおいて積極的な役割を果たし、トリグリセリド新陳代謝をフィード・バックし、その調節を果たす分子もおそらく生産していることが明らかになっている。さらに、脂肪細胞は、末梢器官や中枢器官における重要な機能を調整するホルモンを分泌できる。最も良い例はレプチンであり、これは脂肪細胞によって分泌され、視床下部に存在する受容体を介してエネルギー代謝と満腹感を調節する。したがって、このような分子を発見して調べることは大変興味深いであろう。
【0008】
基本的に2つのタイプの脂肪組織、褐色脂肪組織および白色脂肪組織が存在し、これらは体内で全く異なる役割を果たしている。白色脂肪は余剰カロリー摂取分を貯蔵するように設計されており、褐色脂肪はユニークなシステムを用いて余剰カロリーを吸い上げ、それを使用して体温を生成する。しかし、白色脂肪細胞は熱発生の制御に関わる非結合性タンパク質を発現することが示された。白色脂肪組織だけが成人に存続するので、白色脂肪によって引き起こされた熱発生はエネルギー消費を増加させるかもしれない。
【0009】
したがって、本発明の目的は、体内における白色脂肪組織の役割をさらに調べる手段の提供にある。
【0010】
本発明の別の目的は白色脂肪組織に対する新規な薬剤または食物成分の影響の調査を可能にする手段を提供することである。
【0011】
上記の目的は、成熟白色脂肪細胞に分化する能力を有する一方、基本的に正常な白色脂肪細胞と同様な細胞特性を示す、白色脂肪細胞に由来する新規な前脂肪細胞系の提供により解決された。
【0012】
細胞系は、分子細胞生物学の発達、特に細胞内の活動、細胞外分子の作用および細胞−細胞相互作用の解明に重要な役割を果たしてきた。細胞系は、通常、種々の細胞の集まりである組織を外植し、細胞を分離し、対象とする細胞クローンを単離し、数世代にわたって全細胞数を増加させ、集団の血統が均一化するように、細胞クローンを培養することによって段階的に確立される。しかし、これらの細胞でも、in vitroの培養では老化開始前の限られた世代数しか継代できない。
【0013】
基本的に連続的に培養できる細胞は不死化細胞として知られている。これを培養することによって多くの細胞を含む均一な細胞集団が得られるので、不死化細胞は、非不死化細胞に優る多くの利点を有する。通常、不死化細胞系は、組換えウィルスまたはレトロウィルスによって調製されるが、こうした方法で不死化された細胞は細胞機能の点で何らかのバランスを欠いている。このため、不死化細胞系は、非常に多くの場合、前記の種類の細胞で通常見られる酵素または構造ポリペプチドを生産しないなど異なる同化作用のパターンを示し、それらが由来する細胞と実質的に異なっている。さらにそのために分化能力も強く影響を受ける。したがって、多くの種類の細胞は単離して連続的に培養することが困難なままであった。
【0014】
本発明は、分化成熟して白色脂肪細胞となる能力を有する新規な不死化細胞系を提供する。この白色脂肪細胞は生体組織から得た白色脂肪細胞と基本的に同一の形態学的パターン(例えば、ポリペプチド発現や細胞の外観によって示されるもの)を示すものである。
【0015】
本発明の前脂肪細胞系はインシュリン、トリヨードチロニン、デキサメタゾンおよびペルオキシソーム増殖剤応答性受容体(PPAR:peroxisome proliferator−activated receptors)のアクティベータなど、当業者には知られた化合物によって成熟白色脂肪細胞に分化することができる。このようにして得られた白色脂肪細胞は、次いで、トリグリセリド合成に関与する酵素(例えば、リポタンパク質リパーゼ、脂肪酸合成酵素、脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質、レプチン、アディプシン(adipsin)、アディポネクチン(adiponectin)、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ(PPARγ)、ホルモン感受性リパーゼなど)など、正常な白色脂肪細胞と同じ代謝マーカーを基本的に示す。白色脂肪細胞は、少なくとも12世代、好ましくは少なくとも20世代、より好ましくは少なくとも30世代、最も好ましくは少なくとも50世代を培養において維持することができる。
【0016】
好ましい実施形態によれば、細胞系はブダペスト条約に従い2000年7月13日にパストゥール研究所に寄託された細胞系(寄託番号:CNCM I−2520)または2001年4月27日に寄託された細胞系(寄託番号:CNCM I−2663)のいずれかである。
【0017】
本発明の細胞株を調製する方法は次のステップ(a)〜(e)を含む。
【0018】
ステップ(a)では、人間のドナーの適当な脂肪組織からin vitroに白色脂肪細胞を分離する。ドナーから得た1次組織は、最初に、存在する他の細胞から脂肪細胞を分離するように、例えば、コラゲナーゼを含む溶液で組織試料を処理し、引き続いてろ過、さらに遠心分離することによって脂肪細胞を他の細胞から分離するなどの処理を行う。
【0019】
次のステップ(b)では、ステップ(a)の中で得られた脂肪細胞を脱分化する。これは、例えばげっ歯動物脂肪細胞について前に記載されたいわゆる「天井培養法」(ceiling culture method)を使用して行うことができる(Sugihara H.,Yonemitsu N.,Miyabara S.,Yun K.1986.単房性脂肪細胞の1次培養:インビトロでの成長の特徴と分化特性の変化(Primary culture of unilocular fat cells:characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties.)、Differentiation,31:42〜49)。この方法では、上部まで培地で満たした培養フラスコに脂肪細胞を移し、これを上下逆さまにする。この条件下では、脂肪細胞は6日後には脂質小滴を失った繊維芽細胞状の細胞に自然に脱分化した。次いで、このようにして生じた脱分化脂肪細胞を前記と同じ培養条件下に増殖させると、活発に成長する前脂肪細胞が得られる。
【0020】
このように得られた前脂肪細胞を次のステップ(c)で不死化する。これは、組換えプラスミド、組換えウィルスまたはレトロウィルス(例えば、SV40ウィルス(サル・ウィルス)のラージT抗原遺伝子またはHPVウィルス(ヒト乳頭腫ウィルス)のE6またはE7の遺伝子を担持する組換えレトロウィルス・ベクター)などの組換えベクターに細胞を感染させることによって行なうことができる。別法では、組換えベクターはテロメラーゼ逆転写酵素(TERT)遺伝子(好ましくは不死化しようとする細胞種に由来するもの)を有する。後の方法の要点は、老化に伴う効果として知られている染色体テロメアの短縮を基本的に防止することにある。テロメアの維持および細胞の不死化はKiyonoら、Nature,396(1998),84〜88において上皮細胞について報告されており、その内容は言及により本願に組み込まれる。
【0021】
SV40ウィルス(サル・ウィルス)あるいはHPVウィルスのE6またはE7遺伝子およびTERT遺伝子による連続的感染もヒト前脂肪細胞の不死化の別法となる。
【0022】
続くステップ(d)では、確実に不死化した細胞を選択する。これは、例えば、ステップ(c)で得た細胞を単に数世代継代培養することにより、または、SV40ウィルス由来の遺伝子またはHPVウィルス由来の遺伝子など、不死化のために使用したベクターの遺伝子の有無について細胞を試験することにより行なうことができる。これは、抗体によるそれぞれの遺伝子の発現の検知により行ってもよいし、あるいはPCR技術による分析を含んでもよい。テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子の発現は、テロメラーゼ反復増幅プロトコル(TRAP)を適用することにより決定されるテロメラーゼ活性を測定することにより検知される。
【0023】
続くステップ(e)では、ベクターの導入によって確実に不死化していることが示された細胞について、その成熟白色脂肪細胞への分化能力を試験する。この目的のために、ステップ(d)で得られた細胞系を、細胞内脂質の染色によって検知できるように一般的な分化剤によって処理する。脂質の染色は、一般に、特異的に脂質を染色するオイルレッドO法によって行われる。
【0024】
本発明による細胞系は、白色脂肪細胞による、脂質の取り込みおよび放出の調節を制御する役割を調べたり、前脂肪細胞の成熟した脂肪細胞への分化を制御する物質の識別、または肥満、糖尿病および心臓血管疾患用について標的発現を制御する能力を有する化合物のスクリーニングなど、様々な目的に利用できる。特に、これらの細胞系は、レプチンなどのエネルギー代謝制御に関わる化合物の脂肪細胞による放出を調節し得る因子のスクリーニングに有用かもしれない。
【0025】
以下の例は本発明を例証するが、本発明はここに述べる特定の実施形態に限定されるものではない。
【0026】
実施例1 ヒト皮下脂肪組織からの脂肪細胞の採取
外科手術後、肥満の患者からの皮下脂肪組織の生検試料を、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM:Dulbecco’s modified Eagle’s medium)および10%のウシ胎仔血清(FCS)(Gibco BRL)、100μg/mlストレプトマイシン/ペニシリンおよび2mMグルタミンを補ったハム(Ham)F12培地(v/v)(Gibco BRL)の混合物を用いて室温で維持した。この培地を基本培地と呼ぶ。脂肪組織をミンチして小片とし、組織1グラムについて消化培地3mlを用い37℃で20分間消化した。消化培地は2mg/mlのコラゲナーゼ(Roche Biomedical)および20mg/mlのウシ血清アルブミン(シグマ)を含みDMEM培地に溶解したものである。
【0027】
FCS濃度20%とするために、等体積のFCSを添加して消化を停止した。消化された流体を異なる空孔率(250、100μm)のフィルタで2度ろ過し、1000rpmで10分間遠心分離した。脂肪細胞画分を薄い白色浮遊層として得、これを取り出して37℃の30mlリン酸塩バッファー中に入れた。他の汚染細胞の除かれた脂肪細胞画分を得るためにこの懸濁液を遠心分離した(1000rpm、10分間)。
【0028】
実施例2 1次脂肪細胞分化および増殖
20%FCS、10mg/mlストレプトマイシン/ペニシリンおよび2mMグルタミンを補ったハムF12培地(v/v)と混合したDMEMで25cm2フラスコを完全に満たし、このフラスコ中で約106個の脂肪細胞をインキュベートした。脂肪細胞が上面内部の表面に付着し得るようにフラスコを上下逆さまにした。適当な環境(37℃、湿度90%)で8日間培養した後、細胞は付着して前脂肪細胞に自然に脱分化し増殖し始めた。次いで、フラスコを本来の向きに戻し培地を取り除いた。上記の基本培地5mlをフラスコに加えた。2日後、これらの条件下で細胞を感染させた。
【0029】
実施例3 細胞不死化
1.レトロウィルスの生産
SV40ウィルス(サル・ウィルス)のラージT抗原遺伝子もしくはHPVウィルス(ヒト乳頭腫ウィルス)のE6/E7遺伝子またはヒト・テロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)を含む組換えレトロウィルス・ベクターを、選択マーカーとしてヒスチジノール遺伝子を含むpLHXSDレトロウィルス・ベクター(Stockschlaederら,Hum Gene Ther.2(1991),33〜39)のBamHIサイトに標準的な組み換えDNA技術によって挿入することにより構築した。
【0030】
両種指向性(amphotropic)パッケージング細胞系であるフェニックス(Phoenix)(Clontech)への組換えレトロウィルス・ベクターのトランスフェクション後、「ピンポン」感染により高タイター・ウィルスを製造するため同種指向性(ecotropic)パッケージング細胞系Psi2(ATCC)との共培養によって伝染性の組換えウィルス粒子を生成した(Lynch C,Miller D.1991.パッケージング細胞の様々な宿主手段との共培養による高ヘルパーウイルスフリーレトロウイルスベクターの製造(Production of high helper virus−free retroviral vectors by cocultivation of packaging cells with different host racipes.)、J.Virol.65:3887〜3890)。
【0031】
2.1次脂肪細胞の感染
前記のようにして製造した伝染性の組換えウィルス粒子を用いて、実施例2によって得た1次ヒト脱分化脂肪細胞を感染させた。細胞を20μg/ml DEAEデキストランの存在下、組換えウィルスとともに37℃(湿度90%)で3時間インキュベートした。感染後に、培地を基本培地と交換した。
【0032】
感染10日後に、1次クローンを吸引によって拾い上げ、別々に展開した。
SV40T抗原:
5’GGATTCAGTGGTGTATGACT;
5’AGGCACACTGTACTCATTCA;
E7:
5’GGAGATACACCTACATTGCA;
5’GATGGGGCACACAATTCCTA
(すべてMicrosynthから購入した)
を用いて、様々なクローン中のSV40T抗原またはE7遺伝子の発現をRT−PCRを使用して測定し、ヒトSV40T抗原(発癌遺伝子)に対するマウス単クローン抗体を利用した免疫染色によって測定した。テロメラーゼ活性をキムら、Science,266(1994),2011〜2015によるテロメラーゼ反復増幅プロトコル(TRAP)を適用して決定した。
【0033】
実施例4 感染した細胞の分化
実施例3で得た7SV40T抗原、E7、TERTまたはE7およびTERT陽性の細胞を、実施例1で定義した基本培地中でインキュベートして集密化させ、その段階で脂肪生成用混合物(カクテル)を培地に加えた。この混合物は、基本培地を含み、また850nMインシュリン、10μg/mlトランスフェリン、1nMトリヨードチロニン、500μMフェチュイン(fetuin)、33μMパントテン酸、1mMヘペス(Hepes)、15mM NaHC03および1μMデキサメタゾン、およびlμM BRL49653、PPARγアゴニストを補ったものである。次いで、細胞のインキュべーションを続けた。10日目には、集密化した細胞が細胞内脂質小滴(特異的染色で観察)を有する脂肪細胞的発現型を示し始めた。10%ホルムアルデヒドで固定した細胞をイソプロピルアルコールに溶解した染料とともに2時間インキュベートし、オイルレッドOで染色した。次いで、細胞を水で洗浄し顕微鏡で観察した。分化した脂肪細胞は、脂質小滴の蓄積に対応する細胞質中の赤い点で満たされた細胞として現われた。
【0034】
実施例5 分化した不死化ヒト前脂肪細胞中での細胞脂肪の発現
細胞系CNCM I−2550(前記実施例で得たものと同様)の集密化した不死化ヒト前脂肪細胞を、実施例4に記載した無血清化学培地で培養した。
【0035】
集密化後17日目に、細胞をハンク平衡塩溶液で洗浄し、RNeasy全RNA精製システム(Qiagen AG(スイス))を使用してRNAを抽出した。RT−PCR用第1鎖cDNA合成キット(AMV;Roche Biomedical、スイス)を使用し、オリゴd(T)15をプライマーとして用いて全RNA2μgの入力に対して逆転写を行った。興味のあるcDNAの増幅のために使用したプライマーは、Mycrosynth(ヴィンディッシュ(スイス))によって合成された。
【0036】
順方向および逆方向のプライマーの配列は以下のとおりであった:
【0037】
【0038】
PCR反応は、DNA熱サイクラー装置(Bioconcept、AlIschwil、スイス)中、98℃、1分、60℃、2分および72℃、2分の加熱を2サイクル、次いで、94℃、1分の変性ステップ、60℃、1分のアニーリングステップおよび72℃、2分の伸張ステップを28サイクル行った。
【0039】
内部対照としてアクチンプライマーを反応に含ませた。PCR産物(10μl)は、2%アガロース・ゲル上で分離し、エチジウムブロミドで染色することにより可視化した。
【0040】
結果は、調べた細胞系が、そのままの脂肪組織と本質的に同じようにそれぞれの脂肪細胞マーカーを発現することを明確に示している。
【図面の簡単な説明】
【図1】
前脂肪細胞を得た方法を概略的に示す図である。
【図2】
RT−PCRおよび免疫蛍光検査法によって分析した様々な不死化クローン中でのSV40ラージT抗原の発現を示す図である。
【図3】
様々な脂肪生成条件下での細胞分化を示す図である。
【図4】
細胞系中の脂肪細胞分化の様々なマーカーの発現パターンをヒト脂肪組織と比較して調べた実験結果を示す図である。
Claims (12)
- 成熟して白色脂肪細胞となり、正常な白色脂肪細胞の細胞特性を本質的に示す能力を有するヒト前脂肪細胞系。
- 前記前脂肪細胞系から分化した脂肪細胞が、リポタンパク質リパーゼ、脂肪酸合成酵素、脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質、レプチン、アディプシン、アディポネクチン、ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体γおよびβ(PPARγ、β)ならびにホルモン感受性リパーゼについて、正常な脂肪細胞と本質的に同一の代謝パターンを示す請求項1に記載のヒト前脂肪細胞系。
- CNCM I−2520またはCNCM I−2663であるヒト前脂肪細胞系。
- (a)ヒト脂肪組織から細胞を分離するステップ、
(b)(a)で得た細胞を脱分化し、増殖して前脂肪細胞クローンを得るステップ、
(c)ステップ(b)で単離した前脂肪細胞クローンを不死化するステップ、
(d)不死化細胞を選択するステップ、および
(e)白色脂肪細胞に分化する能力を有する細胞を選択するステップ
を含む前記請求項のいずれかに記載の前脂肪細胞の調製方法。 - 不死化ステップが、SV40T抗原を担持する組換えベクターを用いて実行された請求項4に記載の方法。
- 不死化ステップが、HPVウィルスのE7遺伝子を担持する組換えベクターを用いて実行された請求項4に記載の方法。
- 不死化ステップが、テロメラーゼ法によって実行された請求項4に記載の方法。
- 不死化ステップが、HPVウィルスのE7遺伝子を担持する組換えベクターとテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子を担持するウィルスを組み合わせて実行された請求項4に記載の方法。
- ヒト白色脂肪細胞による脂質の取り込みおよび放出の調節を制御する物質を同定するための請求項1から請求項3までのいずれかに記載の細胞系の使用。
- 前脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化を制御する物質を同定するための請求項1から請求項3までのいずれかに記載の細胞系の使用。
- 肥満、心血管疾患および糖尿病に対する標的の発現を制御することができる化合物をスクリーニングするための請求項1から請求項3までのいずれかに記載の細胞系の使用。
- ヒト白色脂肪細胞からの任意の代謝産物またはホルモンの分泌を調節することができる化合物をスクリーニングするための請求項1から請求項3までのいずれかに記載の細胞系の使用。
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