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Diese
Erfindung betrifft humane Präadipozyten-Zelllinien,
die zur Differenzierung in Fettzellen fähig sind. Im Einzelnen betrifft
die vorliegende Erfindung vom weißen Fettgewebe abstammende
Präadipozyten-Zelllinien
und ihre Verwendung bei der Entwicklung von Arzneimitteln und Nahrungsinhaltsstoffen
und -ergänzungen
gegen Adipositas, Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen.
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Die
Adipositas ist von den National Institutes of Health der USA zu
einem Risiko für
die Volksgesundheit erklärt
worden. Die Adipositas kann als das Vorhandensein von übermäßig viel
Fettgewebe definiert werden, wovon 30 bis 50 % der Bevölkerung
Nordamerikas und ein beträchtlicher
Anteil der Bevölkerung
weltweit betroffen sind. Man schätzt,
dass die Folgen der Adipositas, z. B. der nicht-insulinabhängige Diabetes,
die koronare Herzkrankheit und der Bluthochdruck, zu direkten Kosten
in Höhe
von 45,8 Milliarden Dollar und zusätzlichen indirekten Kosten
in Höhe
von 23 Milliarden Dollar, z. B. durch Arbeitsausfälle, geführt haben.
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Man
geht davon aus, dass die Aufnahme von zu viel Fett und Kohlenhydraten
zur Adipositas und Hyperlipidämie
führt und
letztlich sogar Bluthochdruck und Arteriosklerose hervorruft. Die
Unterdrückung
der Aufnahme von Fett und Kohlenhydraten und die Verringerung der
Fettakkumulation werden deshalb als äußerst wünschenswerte Ziele anerkannt.
Nach der Aufnahme von zu vielen Kalorien leiden Kleinkinder unter
einer Vermehrung der Adipozyten und geraten in den Zustand, den
man durchaus als potenzielle Adipositas bezeichnen könnte. Aus
diesem Grund wurde berichtet, dass die Unterdrückung der Zunahme der Adipozytenzahl,
insbesondere bei Kleinkindern, direkt zur Verhinderung der Adipositas
und der Herz-Kreislauf-Erkrankungen
führt,
die man durchaus als Komplikationen der Adipositas bei Kindern und
in der Folge bei Erwachsenen bezeichnen könnte.
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Für die Bekämpfung dieses
offensichtlichen Gesundheitsproblems sind sowohl prophylaktische
als auch therapeutische Ansätze
erforderlich. Für
prophylaktische Zwecke wäre
es nützlich,
in der Lage zu sein, die Neigung oder Anfälligkeit einer Person für Adipositas
vorherzusagen und zu bestimmen. Für therapeutische Zwecke wäre ein Mittel
zur Hemmung der Entwicklung oder Differenzierung von Adipozyten
(Fettzellen) von großem
Nutzen. Keines dieser erwünschten
Ziele ist bisher erreicht worden, was hauptsächlich daran liegt, dass wenig über die
Regulation und Steuerung der Entwicklung des Fettgewebes, z. B.
die Proliferation und Differenzierung von Adipozytenvorläufern, bekannt
ist.
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Die
Identifizierung von Mitteln bzw. Substanzen, die diese Proliferation
und Differenzierung steuern, ist für das Verständnis der Entwicklung des normalen
Fettgewebes und für
die Entwicklung von Ansätzen
zur Kontrolle anormaler Stadien der Entwicklung des Fettgewebes,
wie der Adipositas, sehr wichtig.
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Zur
Bestimmung, ob eine Substanz an der physiologischen Regulation der
Entwicklung des Fettgewebes beteiligt ist, können Untersuchungen durchgeführt werden,
ob die Adipozyten oder deren Vorläufer auf diesen Faktor ansprechen
und, letztlich, ob dieser Faktor effizient und spezifisch die Entwicklung
des Fettgewebes in vivo modulieren kann. Geeignete Studien konnten
bisher nicht durchgeführt
werden, was hauptsächlich auf
dem Fehlen geeigneter, von humanem Fettgewebe abstammender Gewebe
oder Zellen beruht, die Eigenschaften normaler Adipozyten aus lebendem
Gewebe aufweisen und für
die Durchführung
der Experimente in vitro über
einen längeren
Zeitraum kultiviert werden können.
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Fettzellen
oder Adipozyten, die Haupt-Zellpopulation des Fettgewebes, stellen
einen wichtigen Speicher für
Triglyceride dar, und sie werden als endokrine Zellen angesehen.
Das Fettgewebe stellt eine Energiereserve in Form von Triglyceriden
für den
Körper
bereit, und dieses Gewebe kann freie Fettsäuren abgeben, wenn die Kalorienaufnahme
unter den metabolischen Bedarf absinkt. Als Reaktion auf eine erhöhte Nahrungsaufnahme
erhöht
der Körper
normalerweise automatisch den Energieverbrauch durch Aktivität, um ein
Energiegleichgewicht aufrecht zu erhalten. Energie kann auch in
Form von Wärme
abgegeben werden. Es gibt verbreitete Wege zur Energieregulation,
die die Nahrungsaufnahme mit der metabolischen Aktivität ausbalancieren
und die hauptsächlich über den
Hypothalamus vermittelt werden. Es ist nun auch offensichtlich,
dass die Adipozyten eine aktive Rolle in diesem Prozess spielen
und wahrscheinlich Moleküle
bilden, die der Rückkopplung
dienen und eine Regulation des Triglyceridmetabolismus bewirken.
Weiterhin sind Adipozyten zur Sekretion von Hormonen, die Schlüsselfunktionen
in peripheren oder zentralen Organen modulieren, in der Lage. Das
beste Beispiel ist das Leptin, das von Adipozyten sekretiert wird
und über
Rezeptoren im Hypothalamus den Energiemetabolismus und die Sättigung
reguliert. Es wäre
deshalb äußerst interessant,
derartige Moleküle
finden und untersuchen zu können.
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Es
gibt im Wesentlichen zwei Typen von Fettgewebe, braunes und weißes, die
im Körper
recht unterschiedliche Aufgaben erfüllen.
US 6 071 747 betrifft immortalisierte
Zelllinien, die von braunem oder weißem humanem Fettgewebe abstammen,
einschließlich
von Präadipozyten-Zelllinien.
Immortalisierte Präadipozyten-Zelllinien
werden erzeugt durch: das Abtrennen der Zellen aus einem humanen
Fettgewebe, das Dedifferenzieren und die Proliferation der erhaltenen
Zellen zur Gewinnung eines Präadipozytenklons
und das Immortalisieren des Präadipozytenklons.
Das wurde für
braunes Fettgewebe gezeigt, das bei einer Karyotypanalyse normale
Chromosomen und die üblichen
funktionellen Eigenschaften aufwies. Differenziell exprimierte Gene, die
eine Rolle bei der Entwicklung brauner und weißer Präadipozyten spielen, wurden
von Boeuf S. et al., Physiol. Genomics 7 (2001), S. 15-25, identifiziert.
Zu diesem Zweck wurden Primärzellkulturen
von Fettzellen hergestellt und mittels einer Representational-Difference-Analyse
und eines DNA-Microarray-Screenings untersucht.
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Das
weiße
Fett ist so ausgelegt, dass es überschüssige Kalorien
speichert, während
das braune Fettgewebe ein einzigartiges System zur Beseitigung überschüssiger Kalorien
einsetzt und es zur Erzeugung von Körperwärme verwendet. Für weiße Adipozyten
wurde jedoch gezeigt, dass sie entkoppelnde Proteine exprimieren,
die an der Steuerung der Thermogenese beteiligt sind. Da nur das
weiße
Fettgewebe beim erwachsenen Menschen fortbesteht, könnte eine
durch das weiße
Fett induzierte Thermogenese den Energieverbrauch steigern.
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Ein
Ziel der Erfindung besteht demnach darin, Hilfsmittel zur weiteren
Untersuchung der Rolle des weißen
Fettgewebes im Körper
bereitzustellen.
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Ein
weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, Hilfsmittel bereitzustellen,
die eine Untersuchung der Wirkung von neuen Arzneimitteln oder Nahrungsinhaltsstoffen
auf das weiße
Fettgewebe ermöglichen.
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Das
obige Ziel ist durch die Bereitstellung neuartiger Präadipozyten-Zelllinien
erreicht worden, die von weißen
Fettzellen abstammen und die die Fähigkeit zur Differenzierung
in reife weiße
Fettzellen besitzen, wobei sie die gleichen Zelleigenschaften wie
normale weiße
Fettzellen aufweisen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine humane Präadipozyten-Zelllinie bereit,
die durch die folgenden Schritte erhalten werden kann: a) Abtrennen
von Zellen von einem menschlichen Fettgewebe, b) Dedifferenzieren
und Vermehren der in a) erhaltenen Zellen, um einen Präadipozytenklon
zu erhalten, c) Immortalisieren eines unter Schritt b) isolierten
Präadipozytenklons,
d) Selektionieren auf immortalisierte Zellen, und e) Selektionieren
auf Zellen, die in weiße
Fettzellen differenzieren können.
Die aus der Präadipozyten-Zelllinie
differenzierten Fettzellen zeigen ein Stoffwechselmuster von Lipoproteinlipase,
Fettsäuresynthase,
Adipocyte Fatty Acid Einding Protein, Leptin, Adipsin, Adiponectin,
den Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptoren γ und β (PPARγ, β) und der
Hormon-sensitiven Lipase, das mit dem normaler Fettzellen identisch
ist, wobei die Fettzellen Zelleigenschaften von normalen weißen Fettzellen
aufweisen.
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Figuren:
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1 zeigt
schematisch, wie die Präadipozyten-Zellen
erhalten wurden.
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2 zeigt
die Expression des großen
T-Antigens von SV40 in den verschiedenen, mittels RT-PCR und Immunfluoreszenz
analysierten immortalisierten Klonen.
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3 zeigt
die Zelldifferenzierung unter verschiedenen adipogenen Bedingungen.
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4 zeigt
die Ergebnisse von Experimenten, die das Expressionsmuster verschiedener
Marker der Adipozytendifferenzierung in der Zelllinie im Vergleich
zu humanem Fettgewebe untersuchen.
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Zelllinien
haben eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Molekular- und
Zellbiologie gespielt, insbesondere bei der Aufklärung intrazellulärer Aktivitäten, der
Wirkungen extrazellulärer
Moleküle
und von Zell-Zell-Wechselwirkungen. Zelllinien werden normalerweise
schrittweise etabliert über
die Explantation von Gewebe, das eine heterogene Zellpopulation
enthält,
die Abtrennung der Zellen, die Isolierung eines interessierenden
Zellklons und das Kultivieren des Zellklons, sodass die Gesamtzellzahl über mehrere
Generationen ansteigt und die Population bezüglich ihrer Abstammung einheitlich
ist. Trotzdem werden diese Zellen in einer In-vitro-Kultur nur für eine begrenzte
Anzahl von Passagen überleben,
ehe sie ins Seneszenzstadium eintreten.
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Zellen,
die praktisch kontinuierlich kultiviert werden können, kennt man als so genannte
immortalisierte Zellen. Immortalisierte Zellen haben viele Vorteile
gegenüber
nicht-immortalisierten
Zellen, da sie zur Bereitstellung einer Population aus einer großen Zahl
einheitlicher Zellen kultiviert werden können. Normalerweise werden
immortalisierte Zelllinien mithilfe eines rekombinanten Virus oder
eines Retrovirus erzeugt, wobei dieses Verfahren allerdings dazu
führt,
dass die so immortalisierten Zellen bezüglich ihrer zellulären Funktion
etwas unausgeglichen sind. In dieser Hinsicht unterscheiden sich
immortalisierte Zelllinien am häufigsten
insofern erheblich von den Zellen, von denen sie abstammen, als
sie ein anderes metabolisches Muster aufweisen und keine enzymatisch
aktiven oder strukturellen Polypeptide produzieren, die man normalerweise
im besagten Zelltyp findet. Darüber
hinaus wird dadurch auch das Potenzial zur Differenzierung stark
beeinflusst. Als Konsequenz daraus ist es für verschiedene Zelltypen immer
noch schwierig, sie zu isolieren und kontinuierlich zu kultivieren.
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Die
vorliegende Erfindung stellt nun neuartige immortalisierte Zelllinien
bereit, die in der Lage sind, in reife weiße Adipozyten zu differenzieren,
wobei diese weißen
Adipozyten das gleiche morphologische Muster aufweisen, z. B. bezüglich der
Polypeptidexpression oder des Aussehens der Zellen, wie aus lebendem
Gewebe erhaltene weiße
Adipozyten.
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Die
erfindungsgemäßen Präadipozyten-Zelllinien
können
mit Verbindungen, die in diesem Gebiet bekannt sind, wie Insulin,
Triiodthyronin, Dexamethason und Aktivatoren Peroxisomenproliferator-aktivierter
Rezeptoren (PPAR), in reife weiße
Adipozyten differenziert werden. Die so erhaltenen weißen Adipozyten
zeigen dann die gleichen metabolischen Marker wie normale weiße Fettzellen,
wie an der Synthese von Triglyceriden beteiligte Enzyme, z. B. die
Lipoproteinlipase und die Fettsäuresynthase,
das Adipocyte Fatty Acid Einding Protein, Leptin, Adipsin, Adiponectin,
die Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptoren γ (PPAR γ) und die hormonsensitive
Lipase. Die weißen
Adipozyten können
für wenigstens
12 Passagen, vorzugsweise wenigstens 20 Passagen, bevorzugter wenigstens
30 Passagen und am bevorzugtesten wenigstens 50 Passagen in Kultur
gehalten werden.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
ist die Zelllinie eine beliebige der Zelllinien, die gemäß dem Budapester
Vertrag mit dem Institute Pasteur am 13. Juli 2000 hinterlegt wurden
und die Hinterlegungsnummer CNCM I-2520 erhielten, oder die Zelllinie,
die am 27. April 2001 hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummer
CNCM 12663 erhielt.
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Das
Verfahren zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Zelllinien umfasst die
folgenden Schritte a) bis e).
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Im
Schritt a) werden weiße
Fettzellen in vitro aus einem geeigneten Fettgewebe eines humanen
Spenders isoliert. Das vom Spender erhaltene primäre Gewebe
wird zuerst so behandelt, dass die Adipozyten von anderen vorhandenen
Zellen abgetrennt werden, z. B. durch die Behandlung der Gewebeprobe
mit einer collagenasehaltigen Lösung
und das Abtrennen der Adipozyten von den anderen Zellen durch sukzessive
Filtrationen gefolgt von einer Zentrifugation.
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Im
nachfolgenden Schritt b) werden die im Schritt a) erhalten Fettzellen
dedifferenziert, was z. B. mittels des sogenannten „Ceiling-Culture-Verfahrens" erreicht werden
kann, das früher
für Nageradipozyten
beschrieben wurde (Sugihara H., Yonemitsu N., Miyabara S., Yun K.
1986. Primary culture of unilocular fat cells: characteristics of
growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation
31: 42-49). Gemäß diesem
Verfahren werden die Adipozyten in eine Kulturflasche transferiert,
die bis oben hin mit Kulturmedium gefüllt ist, und diese wird auf
den Kopf gestellt. Nach sechs Tagen bei diesen Bedingungen dedifferenzierten Adipozyten
spontan zu fibroblastenähnlichen
Zellen, die keine Lipidtröpfchen
enthielten. Die resultierenden dedifferenzierten Adipozyten lässt man
dann bei den gleichen Kulturbedingungen wie oben proliferieren,
wodurch aktiv wachsende Präadipozyten
erhalten werden.
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Im
nächsten
Schritt c) werden die so erhaltenen Präadipozyten immortalisiert.
Das kann durch das Infizieren der Zellen mit einem rekombinanten
Vektor, wie mit einem rekombinanten Plasmid, einem rekombinanten
Virus oder einem Retrovirus, z. B. einem rekombinanten retroviralen
Vektor, der das Gen des großen
T-Antigens des SV40-Virus (Simian-Virus) oder das E6- oder E7-Gen
des HPV-Virus (Human Papilloma Virus) trägt, erreicht werden. Gemäß einem
alternativen Verfahren trägt
der rekombinante Vektor die Telomerase-Reverse-Transcriptase (TERT)-Gene, die vorzugsweise
von der gleichen Spezies stammen wie die Zellen, die immortalisiert
werden sollen. Der Hauptinhalt des letzteren Verfahrens besteht
darin, dass im Wesentlichen eine Verkürzung der Telomere des Chromosoms
verhindert wird, ein Effekt, von dem gut bekannt ist, dass er von
einer Seneszenz begleitet wird. Die Aufrechterhaltung der Telomere
und die Immortalisierung von Zellen wurde für epitheliale Zellen von Kiyono
et al., Nature 396 (1998), 84-88, berichtet, und dieses Dokument
wird hier mit der entsprechenden Literaturstelle mit aufgenommen.
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Eine
sukzessive Infektion mit dem SV40-Virus (Simian-Virus) oder dem
E6- oder E7-Gen
des HPV-Virus und dem TERT-Gen stellt ebenfalls ein alternatives
Verfahren zur Immortalisierung humaner Präadipozyten dar.
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Im
nachfolgenden Schritt d) erfolgt eine Selektion auf Zellen, die
positiv bezüglich
einer Immortalisierung sind, was z. B. einfach durch das Kultivieren
der im Schritt c) erhalten Zellen über mehrere Passagen oder durch
das Testen der Zellen auf Gene des zur Immortalisierung eingesetzten
Vektors, wie auf Gene des SV40-Virus oder Gene des HPV-Virus, durchgeführt werden
kann. Das kann über
den Nachweis der Expression des betreffenden Gens mit Hilfe von
Antikörpern
erreicht werden, oder es kann eine Analyse mittels PCR-Techniken
beinhalten. Die Expression der Telomerase-Reverse-Transcriptase-Gene
wird über
die Messung der Telomeraseaktivität, die über den Einsatz des Telomerase
Repeat Amplification Protocol (TRAP) bestimmt wird, nachgewiesen.
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Im
nachfolgenden Schritt e) werden die Zellen, die durch die Einführung des
Vektors positiv bezüglich der
Immortalisierung geworden sind, auf ihre Fähigkeit zur Differenzierung
in reife weiße
Fettzellen getestet. Dazu werden die im Schritt d) erhaltenen Zelllinien
mit üblichen
Differenzierungsmitteln behandelt, sodass sie über die Anfärbung intrazellulärer Lipide
erkennbar werden. Die Lipidfärbung
wird üblicherweise
mit dem Ölrot-O-Verfahren
durchgeführt,
das spezifisch Lipide anfärbt.
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Die
aus der Präadipozyten-Zelllinie
differenzierten Fettzellen zeigen ein Stoffwechselmuster von Lipoproteinlipase,
Fettsäuresynthase,
Adipocyte Fatty Acid Einding Protein, Leptin, Adipsin, Adiponectin,
den Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptoren γ und β (PPARγ, β) und der
Hormon-sensitiven Lipase, das mit dem normaler Fettzellen identisch
ist, wobei die Fettzellen Zelleigenschaften von normalen weißen Fettzellen zeigen.
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Die
erfindungsgemäßen Zelllinien
können
für verschiedene
Zwecke eingesetzt werden, zum Beispiel als Hilfsmittel zur Untersuchung
der Rolle der Steuerung der Regulation der Lipidaufnahme und -abgabe
durch weiße
Adipozyten oder zur Identifizierung von Substanzen, die die Differenzierung
von Präadipozyten
in reife Adipozyten steuern, oder für das Screenen auf Verbindungen,
die in der Lage sind, die Expression von Zielen für die Adipositas,
den Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu steuern. Insbesondere
könnten
diese Zelllinien hilfreich für
das Screening auf Faktoren sein, die in der Lage sind, die Freisetzung
von Verbindungen, die an der Steuerung des Energiemetabolismus beteiligt
sind, wie Leptin, durch Adipozyten zu regulieren.
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Die
folgenden Beispiele werden die Erfindung veranschaulichen, ohne
sie auf die erwähnten
spezifischen Ausführungsformen
einzuschränken.
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Beispiel 1
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EXTRAKTION VON ADIPOZYTEN AUS HUMANEM
SUBKUTANEM FETTGEWEBE
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Nach
dem chirurgischen Eingriff wurde die Biopsie von subkutanem Fettgewebe
eines fettleibigen Patienten bei Raumtemperatur in eine Mischung
aus Dulbecco's Modified
Eagle's Medium (DMEM)
und Ham's-F12-Medium
(Vol./Vol.) (Gibco BRL), die mit 10 % fötalem Kälberserum (FKS) (Gibco BRL),
100 μg/ml Streptomycin/Penicillin
und 2 mM Glutamin supplementiert war, gegeben. Dieses Medium wurde
Basalmedium genannt. Das Fettgewebe wurde zu kleinen Stückchen zerkleinert
und 20 min bei 37 °C
in 3 ml Verdaumedium pro Gramm Gewebe verdaut. Das Verdaumedium
enthielt 2 mg/ml Collagenase (Roche Biomedical) und 20 mg/ml Rinderserumalbumin
(Sigma) gelöst
in DMEM-Medium.
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Der
Verdau wurde durch die Zugabe des gleichen Volumens an FKS gestoppt,
sodass eine FKS-Konzentration von 20 % erhalten wurde. Die Verdauflüssigkeit
wurde zweimal durch Filter unterschiedlicher Porosität (250,
100 μm)
filtriert und 10 min bei 1000 Upm zentrifugiert. Die Adipozytenfraktion
wurde in Form einer dünnen
und weißen
schwimmenden Schicht erhalten, die abgenommen und in 30 ml Phosphatpuffer
von 37 °C
gegeben wurde. Die Suspension wurde zentrifugiert (10 min bei 1000
Upm), wodurch eine Adipozytenfraktion erhalten wurde, die anderer
kontaminierender Zellen beraubt war.
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Beispiel 2
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DEDIFFERENZIERUNG UND PROLIFERATION PRIMÄRER ADIPOZYTEN
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Ungefähr 106 Adipozyten wurden in einer 25-cm2–Flasche,
die vollständig
mit DMEM gefüllt
war, das mit Ham's-F12-Medium
(Vol./Vol.) gemischt und mit 20 % FKS, 10 mg/ml Streptomycin/Penicillin
und 2 mM Glutamin supplementiert war, inkubiert. Die Flasche wurde
auf den Kopf gestellt, um es den Adipozyten zu ermöglichen,
sich an die obere innere Oberfläche
anzuheften. Nach 8 Tagen Kultivierung in der passenden Umgebung
(37 °C,
90 % Luftfeuchtigkeit) waren die Zellen angewachsen und hatten begonnen,
sich spontan zu Präadipozyten
zu dedifferenzieren und zu proliferieren. Die Flasche wurde dann
in die richtige Position gebracht, und das Medium wurde entfernt.
Es wurden 5 ml des oben beschriebenen Basalmediums in die Flasche
gegeben. Nach 2 Tagen bei diesen Bedingungen wurden die Zellen infiziert.
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Beispiel 3
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IMMORTALISIERUNG DER ZELLEN
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1. Erzeugung des Retrovirus
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Ein
rekombinanter retroviraler Vektor, der das Gen des großen T-Antigens
des SV40-Virus (Simian-Virus)
oder die Gene E6/E7 des HPV-Virus (Human Papilloma Virus) oder die
der humanen Telomerase-Reverse-Transcriptase (hTERT) trug, wurde über eine
Insertion mittels gentechnologischer Standardverfahren in die BamHI-Stelle
des retroviralen pLHXSD-Vektors (Stockschlaeder et al., Hum. Gene
Ther. 2 (1991), 33-39), der das Histidinol-Gen als Selektionsmarker
enthielt, konstruiert.
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Infektiöse rekombinante
Viruspartikel wurden durch die Transfektion des rekombinanten retroviralen Vektors
in die amphotrope Verpackungszelllinie Phoenix (Clontech), gefolgt
von dem Kokultivieren mit der ecotropen Verpackungszelllinie Psi2
(ATCC) zur Ermöglichung
einer „fing-Pong"-Infektion zur Erzielung
eines höheren
Virustiters, erzeugt (Lynch C., Miller D. 1991. Production of high
helper virus-free retroviral vectors by cocultivation of packaging
cells with different host racipes. J. Virol. 65: 3887-3890).
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2. Infektion primärer Fettzellen
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Wie
oben beschrieben hergestellte infektiöse rekombinante Viruspartikel
wurden zur Infizierung primärer
humaner dedifferenzierter Fettzellen, die gemäß Beispiel 2 erhalten worden
waren, eingesetzt. Die Zellen wurden 3 Stunden bei 37 °C (90 % Luftfeuchtigkeit)
mit dem rekombinanten Virus in Gegenwart von 20 μg/ml DEAE-Dextran inkubiert.
Nach der Infektion wurde das Kulturmedium gegen das Basalmedium
ausgetauscht.
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Zehn
Tage nach der Infektion wurden die ersten Klone durch Aufsaugen
gepickt und separat vermehrt. Die Expression der Gene des SV40-T-Antigens
oder von E7 in den verschiedenen Klonen wurde mittels RT-PCR unter
Einsatz von
SV40-T-Antigen: | 5' GGATTCAGTGGTGTATGACT, |
| 5' AGGCACACTGTACTCATTCA, |
E7: | 5' GGAGATACACCTACATTGCA, |
| 5' GATGGGGCACACAATTCCTA |
| (alle
bezogen von Microsynth) |
und einer Immunfärbung unter Verwendung monoklonaler,
gegen das humane SV40-T-Antigen gerichteter Mausantikörper (Oncogene)
bestimmt. Die Telomeraseaktivität
wurde über
den Einsatz des Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP)
nach Kim et al., Science 266 (1994), 2011-2015, bestimmt.
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Beispiel 4
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DIFFERENZIERUNG INFIZIERTER ZELLEN
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Man
ließ Zellen,
die für
das 7SV40-T-Antigen, E7, TERT oder E7 und TERT positiv waren und
wie im Beispiel 3 beschrieben erhalten worden waren, in dem Basalmedium,
wie es im Beispiel 1 definiert wurde, bis zur Konfluenz wachsen,
und dann wurde ein adipogener Cocktail zu dem Medium gegeben, der
das Basalmedium enthielt und mit 850 nM Insulin, 10 μg/ml Transferrin,
1 nM Triiodthyronin, 500 μM
Fetuin, 33 μM
Panthotensäure,
1 mM Hepes, 15 mM NaHCO3 und 1 μM Dexamethason
und 1 μM
BRL49653, einem PPARγ-Agonisten,
supplementiert war. Die Zellen wurden dann weiter inkubiert. Am
Tag 10 nach dem Erreichen der Konfluenz begannen die Zellen, einen
adipozytenartigen Phänotyp
mit intrazellulären
Lipidtröpfchen
zu zeigen, die durch eine spezifische Färbung nachgewiesen werden konnten.
Diese Ölrot-O-Färbung wurde
an mit 10 % Formaldehyd fixierten Zellen durchgeführt, die
2 Stunden mit dem in Isopropanol gelösten Farbstoff inkubiert wurden.
Die Zellen wurden dann mit Wasser und gewaschen und unter dem Mikroskop
inspiziert. Die differenzierten Adipozyten erschienen als Zellen,
die mit roten zytoplasmatischen Flecken, die die Akkumulation von Lipidtröpfchen widerspiegelten,
angefüllt
waren.
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Beispiel 5
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EXPRESSION VON ADIPOZYTEN IN DIFFERENZIERTEN
IMMORTALISIERTEN HUMANEN PRAADIPOZYTEN
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Konfluente
immortalisierte humane Präadipozyten
der Zelllinie CNCM I-2550 (erhalten wie in den vorhergehenden Beispielen)
wurden in einem serumfreien, im Beispiel 4 beschriebenen, chemisch
definierten Medium kultiviert.
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Am
Tag 17 nach dem Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen mit Hank's Balanced Salt Solution gewaschen,
und die RNA wurde mittels des RNeasy Total RNA Purification System
(Qiagen AG, Schweiz) extrahiert. Die reverse Transkription wurde
mit einem Einsatz von 2 μg
Gesamt-RNA mithilfe des Erststrang-cDNA-Synthese-Kits für die RT-PCR
(AMV, Roche Biomedical, Schweiz) mit Oligo-d(T)
15 als
Primer durchgeführt. Die
für die
Amplifizierung der interessierenden cDNAs eingesetzten Primer wurden
von Microsynth (Windisch, Schweiz) synthetisiert. Die Sequenzen der Vorwärts- und Rückwärts-Primer sahen folgendermaßen aus:
Actin | vorwärts 5'-GTTGCTATCCAGGCTGTG-3' |
rückwärts 5'-CATAGTCCGCCTAGAAGC-3' |
Adipsin | vorwärts 5'-TACAGCTGTCGGAGAAGG-3' |
rückwärts 5'-TTCTTGCGGTTGCCGCAAAC-3' |
Adiponectin | vorwärts 5'-GGGAGCTGTTCTACTGCTAT-3' |
rückwärts 5'-CTCCAATCCCACACTGAATG-3' |
Fettsäurebindungsprotein | vorwärts 5'-GGTACCTGGAAACTTGTCTC-3' |
rückwärts 5'-AACTTCAGTCCAGGTCAACG-3' |
Lipoproteinlipase
(LPL) | vorwärts 5'-TTTCTCTGTATGGCACCGTG-3' |
rückwärts 5'-TTCACAAATACCGCAGGTGC-3' |
Fettsäuresynthase
(FAS) | vorwärts 5'-GGTCTTGAGAGATGGCTTGC-3' |
rückwärts 5'-CAGGTTGACAGCAGCCAAGT-3' |
Peroxisomenproliferator-aktivierter Rezeptor δ (PPAR δ) | vorwärts 5'-TCAACGACCAGGTTACCCTTT-3' |
rückwärts 5'-CTTGATCCGCTGCATCATCT-3' |
Peroxisomenproliferator-aktivierter Rezeptor γ (PPAR γ) | vorwärts 5'-GTGCAGGAGATCACAGAGAT-3' |
rückwärts 5'-TTGCCAAGTCGCTGTCATCT-3' |
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Der
PCR-Ansatz wurde in einem DNA-Thermocycler (Bioconcept, Allschwil,
Schweiz) für
2 Zyklen 1 min bei 98 °C,
2 min bei 60 °C
und 2 min bei 72 °C
erhitzt und dann 28-mal durch einen Denaturierungsschritt von 1
min bei 94 °C,
einen Hybridisierungsschritt von 1 min bei 60 °C und einen Verlängerungsschritt
von 2 min bei 72 °C
zyklisiert.
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Actin-Primer
wurden als interne Kontrolle in der Reaktion mitgeführt. Die
PCR-Produkte (10 μl)
wurden auf einem 2 %-igen Agarosegel aufgetrennt und über eine
Ethidiumbromid-Färbung sichtbar
gemacht.
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Die
Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Expression der einzelnen Adipozytenmarker
durch die untersuchte Zelllinie mit der des Fettgewebes praktisch
identisch ist. SEQUENZPROTOKOLL
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