WO2000024866A2 - Lignee cellulaire multipotente du stroma medullaire humain, et ses utilisations - Google Patents

Lignee cellulaire multipotente du stroma medullaire humain, et ses utilisations Download PDF

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stro
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Pierre Marie
Babatunde Oyajobi
Abderrahim Lomri
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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    • C12N2510/04—Immortalised cells

Definitions

  • the present invention relates to a new immortalized multipotent progenitor cell line, and to its uses.
  • Bone connective tissue consists of a mineralized extracellular matrix, and bone cells; among these, mention will be made in particular of cells of the osteoblastic line, which play an essential role in the formation and organization of bone tissue.
  • This remodeling involves a continuous renewal of the bone matrix, which mainly involves two types of bone cells: osteoclasts and osteoblasts. Osteoclasts are involved in the resorption of the old calcified matrix, and osteoblasts in the formation of new bone tissue.
  • osteoporosis a loss of bone mass (osteopenia), which can be accompanied by disorganization of the microarchitecture of the bone; this results in a decrease in the mechanical strength of the bone and an increased risk of fractures (osteoporosis).
  • This phenomenon is more important in the case of trabecular bone (cancellous bone) than in that of cortical bone (compact bone); there is also a gain in adipose volume in the bone marrow, coinciding with the decrease in the volume of the trabecular bone.
  • the mature osteoblasts which synthesize and organize the organic framework of the extracellular matrix, and participate in its mineralization, are formed by progressive differentiation from osteoprogenitor cells present, in adults, in the medullary stroma.
  • the spinal cord is a complex tissue, containing in particular cells of the osteoblastic, chondroblastic, adipocyte, fibroblastic, and myoblastic lines, as well as pluripotent progenitor stem cells.
  • the decrease in the number of active osteoblasts could result from one or more events in the differentiation process, such as an alteration in the recruitment of osteoprogenitor cells, and / or a decrease in the proliferation capacity of osteoblastic precursors.
  • an alteration in the recruitment of osteoprogenitor cells and / or a decrease in the proliferation capacity of osteoblastic precursors.
  • osteoprogismetrices it is desirable to have available cellular models, which would make it possible to study the effect of various factors on osteogenesis, and their mechanism of action, which would allow to influence the differentiation of the stromal stem cells towards osteoblastic route rather than towards the adipocyte route in the elderly osteopenic subject.
  • the systems currently available for studying the development of osteoblasts in the human medullary stroma consist of freshly isolated stromal cells. These are heterogeneous populations, made up of cells at different stages of differentiation, including cells already engaged in the path of osteogenesis (CHENG et al., Endocrinology vol 134, N ° l, 227-286 1994; FROMIGUE et al., Cytokine, vol 9, N ° 8, 613-623, 1997)
  • This poses several problems which are in particular the limited availability of sources of supply, the variability from one sample to another, according to the subjects from which they come, the limited growth potential, and the heterogeneity of the cells which makes the interpretation of the results difficult.
  • Homogeneous cell lines capable of differentiating towards the osteoblastic pathway, have so far been isolated only from clones of stromal rodent cells (BENAHAYU et al., J. Cell Physiol., 140, 1- 7, 1989; YAMAGUCHI et al., Calcif. Tissue Int., 49, 221-225, 1991; DORHEIM et al., J. Cell Physiol., 154, 317-328, 1993).
  • these lines do not constitute models usable for the study of Osteogenesis in humans.
  • the inventors set themselves the goal of obtaining immortalized and cloned stromal human cells capable of differentiating into mature osteoblastic cells, and usable as a model for the study of the differentiation mechanisms of osteoprogenitors of human bone marrow. They first succeeded in isolating, from human fetal medullary stroma, a population of stromal cells, based on their non-adhesion, and their affinity for a lectin. They then screened these stromal cells using the murine monoclonal antibody STRO-1 (SIMMONS et al., Blood, 78, 2848-2853, 1991), which recognizes an antigen of undetermined nature present on the surface.
  • STRO-1 murine monoclonal antibody
  • the selected cells were immortalized using the SV-40 virus T antigen (mutated vector, lacking the original sequence responsible for tumor formation) and were re-screened on the basis of their alkaline phosphatase activity ( ALP), which is an early marker of osteoblastic differentiation.
  • ALP alkaline phosphatase activity
  • the cells of clone F / STRO-1 + have a fibroblast morphology; they proliferate quickly but are not tumorigenic. Under basic culture conditions, they express both osteoblastic markers, chondrocytic markers, and adipocyte markers. When cultivated under appropriate conditions, they can differentiate towards the osteoblastic line (for example in the presence of glucocorticoids such as dexamethasone), towards the chondrocyte line (for example in the presence of indomethacin + insulin), or towards the line adipocyte (for example in the presence of rabbit serum). They therefore have the characteristics of multipotent progenitor cells of the spinal cord. In addition, they also express ⁇ and ⁇ receptors for estrogen.
  • This cell clone therefore represents an early stage in the development of stromal cells which is common to the differentiation pathways into osteoblasts, chondrocytes and adipocytes present in human bone marrow.
  • the present invention relates to cells from the clone F / STR0-1 +, as defined above.
  • the object of the present invention encompasses in particular, not only multipotent cells possessing the characteristics of the original F / STRO-1 + clone, and which can be obtained by cultivating it under conditions which do not induce its differentiation , but also more differentiated cells, which can be obtained by culture of the clone F / STRO-1 + under conditions inducing its differentiation towards the osteoblastic pathway, towards the chondrocytic pathway, or towards the adipocyte pathway.
  • the present invention also relates to the use of cells according to the invention for obtaining medicaments.
  • said cells can in particular be used for the screening of products active on the differentiation of cells of the human medullary stroma, in order to obtain drugs inducing their differentiation towards the osteoblastic pathway and / or towards the chondrocytic pathway, and / or inhibiting their differentiation towards the adipocyte pathway, and advantageously, for screening products capable of binding to the ⁇ or ⁇ receptors of estrogens and of exerting an activity, via these receptors on the differentiation of cells of the human medullary stroma.
  • These may in particular be estrogen agonists or antagonists, of which wishes to test the effects on osteogenesis, chondrogenesis and / or adipogenesis.
  • the present invention also relates to a method for testing the effect of a substance on the differentiation of cells of the human medullary stroma, characterized in that cells derived from the clone F / STR0-1 + are cultured, in the presence of the substance to be tested, and in that the specific markers of the osteoblastic line are detected and / or quantified, for example alkaline phosphatase and osteocalcin, and / or the specific markers of the chondrocytic line, by example, collagens II and X, and / or markers of the adipocyte line, for example, PPAR ⁇ (peroxisome proliferator activated receptor ⁇ ) and glycerol-3-phosphate dehydrogenesis (G3PDH) expressed by said cells.
  • PPAR ⁇ peroxisome proliferator activated receptor ⁇
  • G3PDH glycerol-3-phosphate dehydrogenesis
  • the F / STRO-1 + cells are cultured at 37 ° C. in a humid atmosphere, enriched with 5% C02, on base medium (17.13 g / 1 DMEM powder; 3.7 g / 1 NaHC03; 100 ⁇ l / ml penicillin; 100 ⁇ g / ml streptomycin; pH 7.2 to 7.4) enriched with 10% calf serum.
  • base medium 17.13 g / 1 DMEM powder; 3.7 g / 1 NaHC03; 100 ⁇ l / ml penicillin; 100 ⁇ g / ml streptomycin; pH 7.2 to 7.4
  • the medium is changed every two or three days.
  • the cells are trypsinized at confluence and reseeded, then cultured with medium changes every two or three days, without treatment, or in the presence of one of the following treatments:
  • the cells are seeded at high density (1.10 6/100 .mu.l) in petri dishes and allowing the aggregation of cells and the formation of three dimensional structures
  • the cells are grown either in a mineralization inducing medium (DMEM, 5% FCS, 50 .mu.g / ml of ascorbic acid, 3 mM phosphate) in a medium 'phosphate and ascorbic acid.
  • DMEM mineralization inducing medium
  • FCS 5% FCS
  • the culture media are removed, and the cells are rinsed with PBS, then fixed.
  • the alkaline phosphatase activity (marker of osteogenesis) is revealed by staining with naphthol AS-BI phosphate (SIGMA) in the presence of Fast Red Violet LB Sait (SIGMA).
  • SIGMA naphthol AS-BI phosphate
  • SIGMA Fast Red Violet LB Sait
  • the sulfated glycosaminoglycans (marker of chondrogenesis), are revealed by staining with Alcian Blue.
  • the intracellular lipids (marker of adipogenesis), are revealed by staining with Oil Red or Black Sudan.
  • the untreated F / STRO-1 + cells show a low alkaline phosphatase activity, and a slight staining with Alcian blue, signaling the presence of proteoglycans.
  • dexamethasone (10 -7 M) for 7 days
  • an increase in alkaline phosphatase activity which indicates differentiation towards the osteoblastic pathway.
  • insulin 10 ⁇ ⁇ M
  • an increase in the production of proteoglycans is observed; this increase is even more marked in the case of a joint treatment with indomethacin + insulin for 4 days, where a synergistic effect is observed on the production of proteoglycans.
  • the F / STRO-1 "1" cells cultivated in a monolayer in the presence of fetal calf serum (10%) have a fibroblastic morphology; staining with Oil Red or black Sudan only reveals a few rare lipid droplets. After treatment with rabbit serum (10%), numerous lipid droplets are observed, which indicates a differentiation towards the adipocyte pathway.
  • the cells were cultured in the presence of increasing concentrations of dexamethasone (Dex), in monolayer, for 7 days.
  • Dex dexamethasone
  • the alkaline phosphatase activity is measured using phenylphosphate as a substrate.
  • the reaction is blocked after 15 min. by addition of sodium arsenate and amino-4-antipyrine.
  • the phenol released is dosed by reaction with potassium ferricyanide.
  • the results are read in a spectrophotometer at 510 nm.
  • the results are illustrated in Figure 1, which shows that dexamethasone increases the alkaline phosphatase activity in a dose-dependent manner.
  • the cells were cultured in aggregates for 8 days, without treatment (c) or in the presence of increasing concentrations of indomethacin (ind), insulin (Ins) or indomethacin + insulin.
  • the cells rinsed with PBS are fixed at 4% PFA for 1 hour at 4 ° C.
  • the cells are stained with Alcian Blue 0.5% pH 1 for 24 hours at room temperature and rinsed with bi-distilled water; the coloration is extracted using 1 ml of a Guanidine-HCl 6M solution for 2 hours at room temperature.
  • Optical density is measured at 650 nm
  • the analysis was carried out by RT-PCR, from the total RNA extracted from the cells in culture, using primers specific for the gene whose transcription is sought to be detected; the amplification products are separated by electrophoresis on a 1% agarose gel, then transferred to a nylon membrane, and hybridized with an oligonucleotide internal to the amplified region, labeled with 32 P. Hybridization is revealed by autoradiography. Expression of estrogen receptors
  • FIG. 3 shows that the F / STRO-l + cells express estrogen receptors (ER) of the ⁇ and ⁇ type.
  • the human breast cancer line (MCF7) serves as a positive control. In both cases, the quantity of mRNA (evaluated by the amplification of the GAPDH control gene) is comparable.
  • MCF7 human breast cancer line
  • RNAs were extracted from cultured cells either in the absence or in the presence of a differentiation inducer. Expression of messenger RNAs encoding: alkaline phosphatase and osteocalcin (osteoblastic markers); collagen II and collagen X, (respectively early and late marker of chondrocytes); PPAR ⁇ and G3PDH (adipocyte markers), was evaluated, after 2 days, and 7 days, of culture.
  • alkaline phosphatase and osteocalcin osteoblastic markers
  • collagen II and collagen X (respectively early and late marker of chondrocytes)
  • PPAR ⁇ and G3PDH adipocyte markers
  • the differentiation inductors used are: dexamethasone (Dex); indomethanin + insulin (Indo / Ins) and rabbit serum.
  • FIG. 4 shows that in the absence of a differentiation inducer, the F / STRO-1 " cells express alkaline phosphatase (ALP) and osteocalcin (OC), as well as type II collagen and collagen of type X. Expression of alkaline phosphatase and osteocalcin is increased by dexamethasone, and expression of collagen type X is increased by indomethacin + insulin.
  • ALP alkaline phosphatase
  • osteocalcin OC
  • type II collagen and collagen of type X type II collagen and collagen of type X.
  • FIG. 5 shows that in the absence of a differentiation inducer, the F / STRO-1 " cells express the PPAR ⁇ and the G3PDH, adipocyte markers, and that the expression of the latter is increased when the fetal calf serum (FCS) is replaced with rabbit serum.
  • FCS fetal calf serum

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Abstract

L'invention concerne une lignée cellulaire multipotente du stroma médullaire humain, capable de se différencier vers la voie ostéoblastique, la voie chondrocytaire ou la voie adipocytaire.

Description

LIGNEE CELLULAIRE MULTIPOTENTE DU STROMA MEDULLAIRE HUMAIN, ET SES UTILISATIONS La présente invention est relative à une nouvelle lignée cellulaire progénitrice multipotente immortalisée, et à ses utilisations.
Le tissu conjonctif osseux est constitué d'une matrice extracellulaire minéralisée, et de cellules osseuses ; parmi celles-ci, on citera en particulier les cellules de la lignée ostéoblastique, qui jouent un rôle essentiel dans la formation et l'organisation du tissu osseux.
Durant la vie d'un individu intervient constamment un remodelage des os, accompagnant leur croissance et/ou permettant leur résistance aux contraintes mécaniques. Ce remodelage implique un continuel renouvellement de la matrice osseuse, qui fait principalement intervenir deux types de cellules osseuses : les ostéoclastes et les ostéoblastes . Les ostéoclastes interviennent dans la résorption de l'ancienne matrice calcifiée, et les ostéoblastes dans la formation du nouveau tissu osseux.
Lors du vieillissement de l'organisme on observe une perte de la masse osseuse (ostéopénie) , qui peut s'accompagner d'une désorganisation de la microarchitecture de l'os ; ceci se traduit par une diminution de la résistance mécanique de l'os et d'une augmentation du risque de fractures (ostéoporose) . Ce phénomène est plus important dans le cas de l'os trabéculaire (os spongieux) que dans celui de l'os cortical (os compact) ; on observe en outre un gain du volume adipeux dans la moelle osseuse, coïncidant avec la diminution du volume de l'os trabéculaire.
La perte de masse osseuse qui est accentuée par une carence oestrogénique, est plus marquée chez la femme après la ménopause que chez l'homme. Des récepteurs aux oestrogènes et à la progestérone ont été mis en évidence au niveau des ostéoblastes et des ostéoclastes humains. En revanche, le processus physiologique par lequel la carence oestrogénique induit ces modifications osseuses n'est pas encore complètement élucidé. Les études réalisées chez l'animal et chez l'homme afin de rechercher les causes de la perte de masse osseuse lors du vieillissement, ont mis en évidence un déséquilibre entre la résorption du tissu osseux et sa formation, au détriment de cette dernière. Ce déséquilibre serait principalement dû à la réduction du nombre d' ostéoblastes et à une diminution de leur activité .
Les ostéoblastes matures qui synthétisent et organisent la trame organique de la matrice extracellulaire, et participent à sa minéralisation, se forment par différenciation progressive à partir de cellules ostéoprogénitrices présentes, chez l'adulte, dans le stroma médullaire.
Le stroma médullaire est un tissu complexe, renfermant en particulier des cellules des lignées ostéoblastiques, chondroblastiques, adipocytaires, fibroblastiques, et myoblastiques, ainsi que des cellules souches progénitrices pluripotentes .
Par analogie avec le système hématopoïétique, on a émis l'hypothèse de l'existence d'un pool unique de cellules souches mésenchymateuses multipotentes, capables d'auto-renouvellement, et dont seraient issues les différentes lignées cellulaires du stroma médullaire (OWEN et al. J. Cell. Sci. Suppl. 10, 63-76, 1988 ; FRIEDENSTEIN, Transplantation, vol 6, 230-247, 1990 ), par l'intermédiaire de progéniteurs multipotents, à partir desquels s'effectuerait la spécialisation de chaque lignée. Ainsi, les ostéoblastes constitueraient l'aboutissement du développement progressif d'une population cellulaire s' engageant irréversiblement vers la lignée osteoblastique, à partir de quelques progéniteurs multipotents .
L'existence, dans le stroma médullaire, de progéniteurs capables de différenciation vers la lignée osteoblastique a été confirmée par des expérimentations qui ont montré que la transplantation de cellules de moelle osseuse non séparées, ou bien de cellules stromales à morphologie fibroblastique, chez des animaux immunodéficients entraînait une formation osseuse in vivo (HAYNESWORTH et al., Bone, vol 13, 81-88, 1992 ; GUNDLE et al., Bone, 16, 597-601, 1995)
Cependant, contrairement aux cellules hématopoïétiques dont les étapes de différenciation sont bien définies, on ne dispose que de peu d'informations sur les cellules souches stromales, et il n'a pas été possible d'établir clairement à quel moment, par rapport à l'engagement dans la différenciation, se détermine le recrutement des progéniteurs vers l'une ou l'autre des lignées cellulaires. Le vieillissement osseux s'accompagne de modifications dans la répartition des populations de cellules du stroma médullaire ; on observe une diminution des cellules hématopoïétiques et stromales, une augmentation du nombre d' adipocytes, le volume adipeux médullaire s' élevant de 15% à 50% entre 35 et 60 ans, et une réduction de la formation des ostéoblastes matures à partir de leur précurseurs immédiats, les préostéoblastes (ROHOLL et al., J. Bone Minerai Res. Vol 9, 355-366, 1994). Les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans ces effets n'ont pas été élucidés.
La diminution du nombre d' ostéoblastes actifs pourrait résulter d'un ou plusieurs événements au niveau du processus de différenciation, tels qu'une altération du recrutement des cellules ostéoprogénitrices, et/ou une diminution de la capacité de prolifération des précurseurs ostéoblastiques . Pour mettre au point des traitements adaptés, préventifs ou curatifs, de la perte osseuse liée au vieillissement, et des pathologies qui en résultent, il apparaît donc important de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le recrutement, la prolifération, et la différenciation des cellules souches ostéoprogénitrices . Dans ce but il est souhaitable de disposer de modèles cellulaires appropriés, qui permettraient d'étudier l'effet de différents facteurs sur l' ostéogenèse, et leur mécanisme d'action, ce qui permettrait d' influencer la différenciation des cellules souches stromales vers la voie osteoblastique plutôt que vers la voie adipocytaire chez le sujet âgé ostéopénique .
Les systèmes actuellement disponibles pour l'étude du développement des ostéoblastes dans le stroma médullaire humain sont constitués de cellules stromales fraîchement isolées. Il s'agit de populations hétérogènes, constituées de cellules à différents stades de différenciation, y compris des cellules déjà engagées dans la voie de l' ostéogenèse (CHENG et al., Endocrinology vol 134, N°l, 227-286 1994 ; FROMIGUE et al., Cytokine, vol 9, N°8, 613-623, 1997) Ceci pose plusieurs problèmes, qui sont en particulier la disponibilité limitée des sources d'approvisionnement, la variabilité d'un échantillon à l'autre, selon les sujets dont ils proviennent, le potentiel de croissance limité, et l'hétérogénéité des cellules qui rend l'interprétation des résultats difficiles.
Des lignées cellulaires homogènes, capables de se différencier vers la voie osteoblastique, n'ont jusqu'à présent été isolées qu'à partir de clones de cellules stromales de rongeurs (BENAHAYU et al., J. Cell Physiol., 140, 1-7, 1989 ; YAMAGUCHI et al., Calcif. Tissue Int., 49, 221-225, 1991 ; DORHEIM et al., J. Cell Physiol., 154, 317-328, 1993). Or, ces lignées ne constituent pas des modèles utilisables pour l'étude de 1' ostéogenèse chez l'homme. Il existe en effet, entre les cellules de la moelle osseuse de différentes espèces, des différences fondamentales aux niveaux morphologique, biochimique, et fonctionnel, qui se reflètent dans leur comportement au cours de l' ostéogenèse . Ainsi, des cultures primaires de cellules stromales de la moelle osseuse de rongeurs forment facilement des structures nodulaires calcifiées de type osseux [MANIATOPOULOS et al., Cell Tissue Res. vol 254, 317-330 (1988)], ce qui n'est pas le cas des cellules stromales de la moelle humaine [BERESFORD et al. J. Cell. Sci . Vol 102, 341-351
(1992) ; CHENG et al. Endocrinology, vol 134, N°l, 227-
286 (1994)]. Des différences entre les cellules de la moelle osseuse humaine et les cellules d'autres espèces ont été rapportées, aussi bien dans le cadre de leur croissance in vi tro que dans celui de la formation osseuse in vivo (KUTNETΞOV et al., Calcif. Tissue Int., 44, 265-270, 1996). En outre, la dexaméthasone, qui diminue significativement le potentiel ostéogénique des précurseurs du stroma médullaire chez la souris (FALLA et al., Blood, 82, 3580-3591, 1993), et n'a aucune activité sur la croissance des cellules stromales de moelle de rat (HEBERTSON et al., J. Bone Miner. Res. 10, 285-294, 1995), induit chez l'homme la différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse (BERESFORD et al. Arch. Oral Biol., 39, 941-947, 1994) ; CHENG et al., 1994, FROMIGUE et al., 1997, publications précitées), et stimule leur prolifération.
Les inventeurs se sont fixé pour but l'obtention de cellules humaines stromales immortalisées et clonées capables de se différencier en cellules ostéoblastiques matures, et utilisables comme modèle pour l'étude des mécanismes de différenciation des ostéoprogéniteurs de la moelle osseuse humaine. Ils sont parvenus dans un premier temps à isoler, à partir de stroma médullaire foetal humain, une population de cellules stromales, sur la base de leur non-adhérence, et de leur affinité pour une lectine. Ils ont ensuite criblé ces cellules stromales à l'aide de l'anticorps murin monoclonal STRO-1 (SIMMONS et al., Blood, 78, 2848-2853, 1991), qui reconnaît un antigène de nature non déterminée, présent à la surface de tous les précurseurs clonogéniques du stroma médulaire, y compris les ostéoprogéniteurs . Les cellules sélectionnées ont été immortalisées à l'aide de l'antigène T du virus SV-40 (vecteur muté, dépourvu de la séquence origine responsable de la formation tumorale) et ont subi un nouveau criblage sur la base de leur activité phosphatase alcaline (ALP) , qui est un marqueur précoce de la différenciation osteoblastique. Un clone présentant une activité ALP faible, pouvant correspondre à un stade précoce de différenciation, a été sélectionné.
Ce clone, dénommé F/STRO-1+, a été déposé le 16 septembre 1998 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes) tenue par l'Institut Pasteur, 26 rue du Docteur Roux à Paris, sous le numéro 1-2076.
Les cellules du clone F/STRO-1+ ont une morphologie fibroblastique ; elles prolifèrent rapidement mais ne sont pas tumorigenes. Dans les conditions basales de culture, elles expriment à la fois des marqueurs ostéoblastiques, des marqueurs chondrocytaires, et des marqueurs adipocytaires . Lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions appropriées elles peuvent se différencier vers la lignée osteoblastique (par exemple en présence de glucocorticoides comme la dexaméthasone) , vers la lignée chondrocytaire, (par exemple en présence d' indométhacine + insuline) , ou vers la lignée adipocytaire (par exemple en présence de sérum de lapin) . Elles présentent donc les caractéristiques de cellules progénitrices multipotentes du stroma médullaire. En outre, elles expriment également des récepteurs α et β des œstrogènes.
Ce clone cellulaire représente donc un stade précoce du développement des cellules stromales qui est commun aux voies de différenciation en ostéoblastes, chondrocytes et adipocytes présents dans la moelle osseuse humaine.
La présente invention a pour objet des cellules issues du clone F/STR0-1+, tel que défini ci- dessus.
L'objet de la présente invention englobe en particulier, non seulement des cellules multipotentes possédant les caractéristiques du clone F/STRO-1+ d'origine, et qui peuvent être obtenues en cultivant celui-ci dans des conditions n'induisant pas sa différenciation, mais également des cellules plus différenciées, qui peuvent être obtenues par culture du clone F/STRO-1+ dans des conditions induisant sa différenciation vers la voie osteoblastique, vers la voie chondrocytaire, ou vers la voie adipocytaire.
La présente invention a également pour objet l'utilisation de cellules conformes à l'invention pour l'obtention de médicaments.
Dans ce cadre, lesdites cellules peuvent notamment être utilisées pour le criblage de produits actifs sur la différenciation des cellules du stroma médullaire humain, afin d'obtenir des médicaments induisant leur différenciation vers la voie osteoblastique et/ou vers la voie chondrocytaire, et/ou inhibant leur différenciation vers la voie adipocytaire, et avantageusement, pour cribler des produits capables de se lier aux récepteurs α ou β des oestrogènes et d'exercer une activité, par l'intermédiaire desdits récepteurs sur la différenciation des cellules du stroma médullaire humain. Il peut s'agir en particulier d'agonistes ou d'antagonistes des oestrogènes, dont on souhaite tester les effets sur l' ostéogenèse, la chondrogénèse et/ou l' adipogénèse .
La présente invention a également pour objet un procédé pour tester l'effet d'une substance sur la différenciation des cellules du stroma médullaire humain, caractérisé en ce que l'on met en culture des cellules issues du clone F/STR0-1+, en présence de la substance à tester, et en ce que l'on détecte et/ou quantifie les marqueurs spécifiques de la lignée osteoblastique, par exemple la phosphatase alcaline et l' ostéocalcine, et/ou les marqueurs spécifiques de la lignée chondrocytaire, par exemple, les collagènes II et X, et/ou les marqueurs de la lignée adipocytaire, par exemple, le PPARγ (peroxisome proliferator activated receptor γ) et la glycérol-3-phosphate déshydrogénèse (G3PDH) exprimés par lesdites cellules.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs, illustrant les propriétés du clone F/STRO-1+.
EXEMPLE 1 : CULTURE ET CARACTERISTIQUES CYTOCHIMIQUES ET BIOCHIMIQUES DE LA LIGNEE CELLULAIRE F/STRO-1+
Les cellules F/STRO-1+ sont cultivées à 37 °C en atmosphère humide, enrichie par 5% de C02, sur milieu de base (17,13 g/1 DMEM en poudre; 3,7 g/1 NaHC03 ; 100 ϋl/ml pénicilline ; 100 μg/ml streptomycine ; pH 7,2 à 7,4) enrichi de 10% de sérum de veau. Le milieu est changé tous les deux ou trois jours.
Les cellules sont trypsinisées à confluence et réensemencées, puis cultivées avec des changements de milieux tous les deux ou trois jours, sans traitement, ou en présence de l'un des traitements suivants :
Dexaméthasone Indométhacine - Insuline
Indométhacine + Insuline Sérum de lapin Les études cytochimiques et biochimiques ont été réalisées sur les cellules en monocouche (en plaques multipuits FALCON) ou en agrégats. Pour les cultures en monocouche, les cellules sont réensemencées en plaque de 24 puits (FALCON) à la densité de 2.104 cellules/puits, dans du milieu DMEM contenant 10% de sérum de veau fœtal.
Pour la formation des agrégats, les cellules sont ensemencées à forte densité (1.106/100 μl) dans des boites de Pétri permettant ainsi l'agrégation des cellules et la formation de structures tridimentionnelles
(micromasses). Les cellules sont cultivées soit dans un milieu inducteur de minéralisation (DMEM, 5% SVF, 50 μg/ml d'acide ascorbique, 3 mM de phosphate) soit dans un milieu 'sans phosphate ni acide ascorbique.
Analyse cytochirαique
Pour l'analyse cytochimique, les milieux de culture sont retirés, et les cellules sont rincées au PBS, puis fixées.
L'activité phosphatase alcaline (marqueur de l' ostéogenèse) est révélée par coloration avec du naphtol AS-BI phosphate (SIGMA) en présence de Fast Red Violet LB Sait (SIGMA) . Les glycosaminoglycannes sulfatés (marqueur de la chondrogenèse) , sont révélés par coloration au Bleu Alcian.
Les lipides intracellulaires (marqueur de l' adipogenèse) , sont révélés par coloration à l'Oil Red ou au Noir Soudan.
Dans des cultures en 3 dimensions (agrégats), les cellules F/STRO-l+ non traitées montrent une faible activité phosphatase alcaline, et une légère coloration par le bleu Alcian, signalant la présence de protéoglycannes . Après traitement par la dexaméthasone (10-7 M) pendant 7 jours, on observe une augmentation de l'activité phosphatase alcaline, ce qui indique une différenciation vers la voie osteoblastique. Après traitement par l'insuline (10~^M) on observe une augmentation de la production de protéoglycannes ; cette augmentation est encore plus marquée dans le cas d'un traitement conjoint par indométhacine + insuline pendant 4 jours, où on observe un effet synergique sur la production de protéoglycannes .
Un traitement pendant 4 jours par 1 ' indométhacine et l'insuline, suivi par un traitement de 4 jours par la dexaméthasone induit à la fois une expression de l'activité phosphatase alcaline et des protéoglycannes indiquant la bi-potentialité de différenciation de ces cellules vers la voie cartilagineuse et osteoblastique.
Les cellules F/STRO-1"1" cultivées en monocouche en présence de sérum de veau fétal (10 %) présentent une morphologie fibroblastique ; la coloration par l'Oil Red ou le noir Soudan ne font apparaître que quelques rares gouttelettes lipidiques. Après traitement par le sérum de lapin (10 %), on observe de nombreuses gouttelettes lipidiques, ce qui indique une différenciation vers la voie adipocytaire. Analyse biochimique Activité phosphatase alcaline :
Les cellules ont été cultivées en présence de concentrations croissantes de dexaméthasone (Dex) , en monocouche, pendant 7 jours.
L'activité phosphatase alcaline est mesurée en utilisant le phenylphosphate comme substrat. La réaction est bloquée au bout de 15 min. par addition d' arséniate de sodium et d' amino-4-antipyrine. Le phénol libéré est dosé par réaction avec le ferricyanure de potassium. Les résultats sont lus au spectrophotomètre à 510 nm. Les résultats sont illustrés par la Figure 1, qui montre que la dexaméthasone augmente l'activité phosphatase alcaline de façon dose-dépendante.
Dosage des protéoglycannes sultatés Les cellules ont été cultivées en agrégats pendant 8 jours, sans traitement (c) ou en présence de concentrations croissantes d' indométhacine (ind) , d'insuline (Ins) ou d' indométhacine+insuline .
Les cellules rincées au PBS sont fixées au PFA 4% pendant 1 heure à 4°C. Les cellules sont colorées au Bleu Alcian 0,5% pH 1 pendant 24 heure à température ambiante et rincées à l'eau bi-distillée ; la coloration est extraite à l'aide de 1 ml d'une solution de Guanidine-HCl 6M pendant 2 heures à température ambiante. La densité optique est mesurée à 650 nm
Les résultats sont illustrés par la Figure 2, qui montre que l'insuline ou 1 ' indométhacine+insuline augmentent la production de protéoglycannes de façon dose-dépendante . EXEMPLE 2 : ANALYSE MOLECULAIRE DE GENES EXPRIMES PAR LA LIGNEE CELLULAIRE F/STRO-1+
L'analyse a été effectuée par RT-PCR, à partir des ARN totaux extraits des cellules en culture, à l'aide d'amorces spécifiques du gène dont on cherche à détecter la transcription ; les produits d'amplification sont séparés par électrophorèse sur gel d' agarose à 1%, puis transférés sur membrane de nylon, et hybrides avec un oligonucléotide interne à la région amplifiée, marqué au 32P. L'hybridation est révélée par autoradiographie. Expression des récepteurs aux oestrogènes
La figure 3 montre que les cellules F/STRO-l+ expriment des récepteurs aux œstrogènes (ER) de type α et β. La lignée cancéreuse de sein humain (MCF7) sert de contrôle positif. Dans les 2 cas, la quantité d'ARNm (évaluée par l'amplification du gène témoin GAPDH) est comparable. On voit que le récepteur ERα est peu exprimé dans les cellules F/STRO-1+, alors qu'il est fortement exprimé par les cellules MCF7 ; au contraire, le récepteur ERβ est plus fortement exprimé dans les cellules F/STRO-1+ que dans les cellules MCF7. Expression des marqueurs de différenciation :
Les ARN totaux ont été extraits à partir de cellules cultivées soit en l'absence, soit en présence d'inducteur de différenciation. L'expression des ARN messagers codant : la phosphatase alcaline et l' ostéocalcine (marqueurs ostéoblastiques) ; le collagene II et le collagene X, (respectivement marqueur précoce et tardif des chondrocytes) ; le PPARγ et la G3PDH (marqueurs adipocytaires) , a été évaluée, après 2 jours, et 7 jours, de culture .
Les résultats sont illustrés par les figures 4 et 5.
Les inducteurs de différenciation utilisés sont : la dexaméthasone (Dex) ; l' indométhanine + insuline (Indo/Ins) et le sérum de lapin.
La présence d'un inducteur est indiquée par le signe +.
La figure 4 montre qu'en l'absence d'inducteur de différenciation, les cellules F/STRO-1" expriment la phosphatase alcaline (ALP) et 1 ' ostéocalcine (OC), ainsi que le collagene de type II et le collagene de type X. L'expression de la phosphatase alcaline et de 1 ' ostéocalcine est augmentée par la dexaméthasone. L'expression du collagene de type X est augmentée par 1 ' indométhacine+insuline .
La figure 5 montre qu'en l'absence d'inducteur de différenciation, les cellules F/STRO-1" expriment le PPARγ et la G3PDH, marqueurs adipocytaires, et que l'expression de ce dernier est augmentée lorsque le sérum de veau fœtal (FCS) est remplacé par du sérum de lapin.

Claims

REVENDICATIONS
1) Cellule issue du clone F/STRO-1+ déposé le 16 septembre 1998 auprès de la CNCM, sous le numéro I- 2076.
2) Cellule selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue en cultivant le clone F/STR0-1+ dans des - conditions n'induisant pas sa différenciation. 3) Cellule selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue en cultivant le clone F/STRO-1+ dans des conditions induisant sa différenciation vers la voie osteoblastique.
4) Cellule selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue en cultivant le clone F/STRO-1+ dans des conditions induisant sa différenciation vers la voie chondrocytaire.
5) Cellule selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue en cultivant le clone F/STRO-1+ dans des conditions induisant sa différenciation vers la voie adipocytaire.
6) Utilisation d'au moins une cellule selon une quelconque des revendications 1 à 5, pour l'obtention d'un médicament. 7) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné à induire la différenciation de cellules du stroma médullaire humain vers la voie osteoblastique et/ou vers la voie chondrocytaire. 8) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné à inhiber la différenciation de cellules du stroma médullaire humain vers la voie adipocytaire.
9) Procédé pour tester l'effet d'une substance sur la différenciation des cellules du stroma médullaire humain, caractérisé en ce que l'on met en culture au moins une cellule selon une quelconque des revendications 1 à 5 en présence de la substance à tester, et en ce que l'on détecte et/ou quantifie les marqueurs spécifiques de la lignée osteoblastique, et/ou les marqueurs spécifiques de la lignée chondrocytaire, et/ou les marqueurs de la lignée adipocytaire, exprimés par ladite cellule.
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