JP2000083656A - 前駆脂肪細胞株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 動物の単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞の
新たな樹立方法及び該方法により得られる前駆脂肪細胞
株を提供することを課題とする。 【解決手段】 動物由来の単胞性脂肪細胞を天井培養し
て得られる線維芽細胞様脂肪細胞を長期間継代培養して
も形質転換なしに、かつ、均一な増殖及び分化能を保持
する前駆脂肪細胞が得られることを見い出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は動物の単胞性脂肪細
胞由来の前駆脂肪細胞株の樹立方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】白色脂肪組織の大部分を占有する成熟脂
肪細胞は、生体が摂取した余剰エネルギーを中性脂肪に
変換して貯蔵するだけでなく、生体維持に必要なエネル
ギー収支の調節機能においても主要な役割を果たすこと
が明らかにされている。このため脂肪細胞では、脂質代
謝ならびに種々の生理活性物質の生成および分泌が活発
に行われている。成熟脂肪細胞の直径は、１０〜２００
μｍと多様であるが、細胞質内に一つの大きな脂肪滴と
周辺部に押しやられた核を有する典型的な形態から単胞
性脂肪細胞と呼ばれている。脂肪細胞の形成過程は、ま
ず多能性中胚葉細胞から前駆脂肪細胞となり、活発に増
殖する。ついで、前駆脂肪細胞はコミットメントされた
のち、増殖停止して脂肪細胞へと終末分化するとされて
いる。この一連の分化過程において脂肪細胞特異的な遺
伝子が整然と発現されることが知られている。最近、脂
肪細胞の分化に関与する転写因子（核内受容体）の研究
が急速に進展し、脂肪細胞特異的な遺伝子群の発現誘導
および抑制を調節するマスターレギュレーターとしてペ
ルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ（ＰＰＡＲγ）が
発見された。ＰＰＡＲγは脂肪細胞にのみ特異的に発現
し、栄養素である脂肪酸をリガンドとする核内受容体で
ある。また、ＰＰＡＲγはレチノイドＸ受容体と補因子
二量体を形成して標的遺伝子の応答配列（ＰＰＲＥ）に
結合して転写調節することも明らかにされた。

【０００３】これと並行して、ＰＰＡＲγはインスリン
非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に対する治療薬であるチ
アゾリジン誘導体の細胞内標的タンパク質であることが
示され、糖尿病、肥満、高脂血症などの成人病と、脂肪
細胞分化を支配する転写調節の研究との緊密な接点が明
らかにされつつある。成人病との関連性では、脂肪細胞
が種々の生理活性物質を生成および分泌する内分泌細胞
との側面が注目されている。インスリン抵抗性は、肥満
症および糖尿病において最も頻繁に認められる病態であ
る。肥満を伴う糖尿病におけるインスリン抵抗性は、脂
肪細胞から分泌されるＴＮＦαによって惹起されると考
えられている。実際、肥満のヒトあるいは動物では、内
臓脂肪からの脂肪細胞からＴＮＦα分泌が亢進されてお
り、インスリン抵抗性の指標と相関することが示されて
いる。また、ＰＡＩ−１（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａ
ｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １）は血液線
溶系における最も重要な物質であり、線溶性を低下させ
血栓形成を促進し、心筋梗塞などの原因となることが知
られている。肥満症およびＮＩＤＤＭ患者では血中ＰＡ
Ｉ−１が上昇するが、それらは主に内臓脂肪細胞由来で
あることも明らかにされている。さらに、肥満遺伝子の
産物であるレプチンは脂肪細胞で産生され、中枢に作用
して摂食抑制およびエネルギー消費を促進して体脂肪を
一定に調節する新しいホルモンであるが、これも肥満症
およびＮＩＤＤＭ患者において高く、またＴＮＦαによ
って産生が亢進されることも明らかにされている。肥満
症あるいはＮＩＤＤＭにおける血中のＴＮＦα、ＰＡＩ
−１およびレプチンの上昇は、チアゾリジン誘導体によ
って強く改善されることから、それら脂肪細胞由来の生
理活性物質の生成および分泌は脂肪細胞分化に直接関係
すると考えられる。しかし、疾患についての知見はヒト
において、また脂肪細胞分化の機構についてはマウス前
駆脂肪細胞株を用いた体外培養における知見がほとんど
であり、それらの疾患と脂肪細胞分化の関連性について
は未だ不明な点が多く残されている。

【０００４】一方、家畜あるいは家禽などの産業動物の
体脂肪蓄積の制御および脂肪交雑肉の作出は、これまで
飼料エネルギーあるいは栄養素の調節によっておこなわ
れきた。しかし、経済効果優先の育種目標として、増体
量の向上が優先されたことから飼料摂取量の多い個体が
必然的に選抜されてきた。それにより、飼料摂取量が多
い個体ではエネルギー過剰に陥りやすく、脂肪として蓄
積される傾向を有する個体が多い。これに反して、ヒト
では肥満症の増加から低脂肪の畜肉が嗜好され、生産さ
れる大部分の脂肪は食されることなく廃棄されているの
が現状である。同時に、家畜あるいは家禽においても体
脂肪の過剰蓄積に起因する代謝障害による疾病の増加も
問題になっている。これらの解決策として、従来の間接
的な方法によって高い生産性を維持しつつ、体脂肪の過
剰蓄積を抑制することはすでに限界に達していると思わ
れる。そこで、根本的なテーマとして、脂肪組織を構成
する脂肪細胞の増殖および分化機構を直接的に制御する
ことができれば、体脂肪蓄積のより効果的な制御を可能
にすると考えられる。しかし、家畜あるいは家禽の脂肪
組織を構成する脂肪細胞の増殖および分化に関する細胞
レベルでの知見の集積はほとんどなされていないのが現
状であり、またそれを調べるための優れた実験系も未だ
確立されていない。

【０００５】これまで脂肪細胞の増殖および分化に関す
る研究は、主に、Ｓｗｉｓｓ−３Ｔ３由来の前駆脂肪細
胞株（３Ｔ３−Ｌ１や３Ｔ３−Ｆ４４３Ａ）、或いは、
脂肪組織を酵素処理することによって得られる間質−血
管画分に含まれる前駆脂肪細胞（Ｓ−Ｖ細胞）の初代培
養系を用いて行われてきた。しかし、Ｓｗｉｓｓ−３Ｔ
３由来の前駆脂肪細胞株には、１）パターンが異なった
染色体をもつ変異細胞が混入している、２）妊娠１７〜
１９日の胚由来であるため、アダルト由来の前駆脂肪細
胞とは分化特性が異なる、３）血清添加培地で培養する
と自発的に分化誘導されるので、本質的に分化誘導する
物質を特定できない、等の解決すべき課題がある。一
方、Ｓ−Ｖ細胞は、１）前駆脂肪細胞以外の細胞、たと
えば、血管内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞などが混
入しているため、前駆脂肪細胞自体の分化特性を調べる
ことかできない（他の細胞群の影響を無視できない）、
２）脂肪組織中には、中胚葉性の多能性細胞から前駆脂
肪細胞へと分化したばかりの細胞から、既にコミットメ
ントされ脂肪細胞への分化途上の細胞に至る、種々の段
階の分化過程にある細胞が存在する、３）初代培養系で
あるため、同一材料を用いて複数回の実験ができない、
４）前記２）及び３）の理由から細胞を調製する個体間
の差が大きいため、再現性の高いデータが得られない、
等の解決すべき課題がある。

【０００６】これらの課題は、対象とする動物の前駆脂
肪細胞を限界希釈法などによってクローニングして、前
駆脂肪細胞株を樹立することにより解決できる可能性が
あるが、この様な操作は煩雑であり、且つ成功率が低
い。

【０００７】

【発明が解決しょうとする課題】そこで、本発明は、動
物の単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞の新たな樹立方
法及び該方法により得られる前駆脂肪細胞株を提供する
ことを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、すでに、終末分化
を遂げている、動物由来の単胞性脂肪細胞を天井培養
し、得られる線維芽細胞様脂肪細胞が、前駆脂肪細胞と
同様な増殖及び分化特性を有することを確認し、さら
に、該線維芽細胞様脂肪細胞を長期間継代培養しても形
質転換なしに、かつ、均一な増殖及び分化能を保持して
継代培養ができることを見出し、本発明を完成した。す
なわち、本発明は、１）動物の単胞性脂肪細胞を天井培
養して形成される線維芽細胞様脂肪細胞を継代培養し、
分化誘導することによって得られる該動物由来の前駆脂
肪細胞株、２）動物がヒトである１）に記載の前駆脂肪
細胞株、３）動物がブタである１）に記載の前駆脂肪細
胞株、４）動物がブタである１）に記載の前駆脂肪細胞
株、に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】動物の脂肪組織は、形成される部
位（腸間膜、腎臓周囲、皮下、精巣上体、筋肉組織内な
ど）ごとに異なる特性を有することが明らかにされつつ
ある。そこで、前駆脂肪細胞の樹立目的によって、動物
の年齢あるいは性別など、採取する脂肪組織を選択する
ことができる。例えば、家畜では、商品価値の高い畜肉
（例えば、霜降り肉）生産を目的として、筋肉組織内脂
肪細胞の形成機構解明のための筋肉組織由来の前駆脂肪
細胞株の樹立、肉用家畜あるいは家禽の枝肉率の向上を
目的として、腹腔内脂肪細胞の形成機構およびその特性
解明のための腹腔内脂肪由来の前駆脂肪細胞株の樹立、
乳脂肪と脂肪酸組成との関連の調査を目的とした乳腺組
織由来の前駆脂肪細胞株の樹立、或いはヒトにおいて、
特に肥満症あるいは成人病に深く関与する生理活性物質
（ＴＮＦα、レプチン、ＰＡＩ−１など）の生成および
分泌の調節機構解明のための内臓脂肪組織由来の前駆脂
肪細胞株の樹立、などが考えられる。

【００１０】１）単胞性脂肪細胞の分離 単胞性脂肪細胞の分離は、基本的には、Ｒｏｄｂｅｌの
方法（ＲｏｄｂｅｌＭ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２３９：１７３−１８１，１９６４）に準じて行うこと
ができる。外科手術中のヒト、或いは家畜・家禽から目
的とする脂肪組織をすばやく採取する。太めの血管およ
び結合組織を除去する。抗生物質を含む基礎培地（例え
ばダルベッコー変法イーグル培地）、或いはリン酸緩衝
生理食塩水に脂肪組織を入れ、緩やかに脂肪組織を洗浄
する。次いで、脂肪組織を、ウシ血清アルブミンおよび
コラゲナーゼ、トリプシン、プロナーゼ、ディスパー、
エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、などの酵素を含む培
地中に入れ、外科用ハサミで細胞が挫滅しないよう細切
した後、４５〜６０分間震盪して細胞を分散する。分散
操作後、細胞懸濁液をナイロンメッシュで濾過して未消
化組織を除去する。濾液を緩やかに遠心分離すると、単
胞性脂肪細胞は上層に浮遊して集まる。一方、間質血管
細胞（前駆脂肪細胞を含む）は、沈殿に集まる。単胞性
脂肪細胞をビペットで吸引採取する。採取した単胞性脂
肪細胞は、さらに培地（例えば血清あるいはＢＳＡを含
むダルベッコー変法イーグル培地）に移し、数回遠心洗
浄する。

【００１１】２）単胞性脂肪細胞の培養 単胞性脂肪細胞の培養は、杉原らの方法（Ｓｕｇｉｈａ
ｒａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉ
ｏｎ，３１：４２−４９，１９８６）に準じて行うこと
ができる。すなわち、単胞性脂肪細胞は、細胞質内に含
まれる中性脂肪によって培養液中で浮遊するが、この浮
遊性を逆に利用して、培地を１００％充満させたフラス
コの内側上面（天井面）に該細胞を接着させて培養する
方法（天井培養）である。この方法で、単胞性脂肪細胞
を数日間天井培養すると、大部分の細胞は細胞質の一部
を伸長あるいは拡張させ、フラスコ天井面にしっかりと
接着し、大型の脂肪滴の周辺に種々の大きさの脂肪滴を
有する多胞性脂肪細胞へと形態変化する。この時点で、
フラスコ内の培地を適量の培地に交換し、通常の培養法
に戻して培養を継続する。多胞性脂肪細胞に含まれる脂
肪滴はさらに分割され、小さくなるにつれて、多胞性脂
肪細胞は細胞質をさらに伸長させ、線維芽細胞様の形態
に変化する細胞が観察される。さらに培養を継続する
と、線維芽細胞様の形態を呈する多胞性脂肪細胞の周辺
部には、脂肪滴を僅かに、あるいはまったく持たない線
維芽細胞様脂肪細胞（ＦＡ）が多数観察されるようにな
る。ＦＡは活発に増殖する一方で、多胞性脂肪細胞は徐
々に観察されなくなる。その後、フラスコ内の細胞はＦ
Ａのみとなりコンフルエントに達する。ブタ、ニワト
リ、ラットあるいはヒトなど、いずれの種から採取した
単胞性脂肪細胞を天井培養した場合においても、上記に
示した形態変化したのち、活発に増殖するが、年齢、採
取した組織の部位（例えば、皮下あるいは内臓脂肪組
織）および性別などによって若干異なる。

【００１２】３）線維芽細胞様脂肪細胞（ＦＡ）の増殖
および分化 上記２）において形成されたＦＡの採取および継代培養
は以下に示す方法を用いて行う。天井培養後、フラスコ
内にＦＡが形成され、活発に増殖することが確認された
ら、フラスコ内の培地を除去し、フラスコ内の細胞をト
リプシン処理および遠心分離する。この操作により、脂
肪滴を有する多胞性脂肪細胞を上層画分に、脂肪滴をも
たないＦＡを沈殿画分に分離することができる。この単
胞性脂肪細胞由来のＦＡを継代培養すると、培養２４時
間後に、殆どの細胞は培養皿底面に接着し、線維芽細胞
様の形態を示しながら活発に増殖し、数日後には、ほぼ
コンフルエントに達する。この培養期間における増殖曲
線を作成することによって該動物あるいは組織由来のＦ
Ａの増殖特性を調べる。動物種（ヒトあるいはラット）
によっては、細胞質内に微小な脂肪滴が観察されるが、
この場合は脂肪細胞の脱分化誘導作用を有するＴＮＦａ
添加した培地を用いるなど適宜に行う。細胞質内の脂肪
滴の有無の確認は、オイルレッド０染色法を用いて行
う。なお、ブタあるいはニワトリのＦＡでは、脂肪滴は
観察されない。

【００１３】ＦＡの分化特性については、以下に示す方
法を用いて行う。ＦＡの培地を分化誘導剤を添加した培
地（動物種で若干異なる）に交換し、数日間培養培養し
て分化誘導を行う。分化誘導後、通常の培地に戻し、さ
らに培養を継続する。一般的に、ＦＡを分化誘導後数日
経過すると、ＦＡは星状あるいは敷石状に形態変化し、
細胞質内に小さな脂肪滴を有する細胞が観察されるよう
になる。さらに培養を継続すると、細胞質は拡張し、細
胞質内に種々の大きさの脂肪滴が観察されるようにな
る。分化誘導後におけるＦＡ細胞質内の脂肪滴蓄積の確
認は、オイルレッド０染色法を用いて行う。また、脂肪
細胞の分化の後期マーカーであるｇｌｙｃｅｒｏｌ−３
−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
（ＧＰＤＨ）活性を分化の指標として測定し、分化誘導
後の培養期間中における活性の変化を観察する。以上の
結果として、該動物あるいは組織のＦＡが活発な増殖お
よび分化能を有することが示されれば、ＦＡは単胞性脂
肪細胞由来の前駆脂肪細胞であることが示される。

【００１４】４）前駆脂肪細胞株の樹立 単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞の継代培養を行い、
各継代ごとの増殖および分化能を調べることによって前
駆脂肪細胞株の樹立を試みる。例えば、ブタおよびニワ
トリの単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞では、それぞ
れ３７および３３代目においても、継代初期と同様の均
一な増殖能力および分化能が維持されており、かつ、染
色体異常などの形質転換も観察されないことが確認され
ている。

【００１５】以上のように、本発明は４行程からなる。
本発明では、実施例として以下にブタ皮下脂肪組織およ
びニワトリ腹腔内脂肪組織由来の前駆脂肪細胞株の樹立
を示したが、その他の家畜、例えばウシやヒツジ、或い
は家禽のアヒル、ウズラ、さらにはヒトなどにも、本発
明で開示された技術を用いて、或いは当業者であるなら
ば、必要な変更を加えて、目的の動物および組織由来の
前駆脂肪細胞株を樹立することが可能である。例えば培
養条件における培地、血清濃度、分化誘導剤などの選択
は、当業者であるならば、簡単な試行錯誤の結果、適宜
に最適条件を設定することが可能である。例えば、１４
日齢ニワトリ腹腔脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞の場合で
は、血清添加添加濃度は１０％、分化誘導剤は脂肪酸を
用い、また、６〜７ヶ月齢ブタ皮下脂肪組織由来の前駆
脂肪細胞の場合では２０％血清添加で分化誘導剤にはイ
ンスリン、デキサメタゾンおよびイソブチルメチルキサ
ンチンの同時添加が適当である。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

【００１７】［実施例１］単胞性脂肪細胞の増殖特性 ブタ単胞性脂肪細胞の増殖特性を明らかにする目的で行
った。すなわち、天井培養法を用いて単胞性脂肪細胞を
培養し、増殖様式を観察した。ついで、単胞性脂肪細胞
から形成されるＦＡの増殖状況を調べることによって、
それらの効率的な採取が可能であるかについても検討し
た。

【００１８】１）材料および方法 （１）脂肪組織の採取 と畜場において、６〜７ヶ月齢の雄あるいは雌ブタの皮
下脂肪組織を採取し、約３７℃に調整しておいた保温瓶
に入れて１時間以内に実験室に持ち帰った。

【００１９】（２）単胞性脂肪細胞の単離および培養 単胞性脂肪細胞の単離および培養方法の概略を図１に示
す。０．０８ｍｇ／ｍｌカナマイシン−硫酸塩（ＳＩＧ
ＭＡ）および０．５ｍｇ／ｍｌポリビニールアルコール
（ＳＩＧＭＡ）添加のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ−ＰＶ
Ａ）に、０．１％（ｖ／ｖ）セチルトリメチルアンモニ
ウムブロミドを添加した溶液で脂肪組織を洗浄した。さ
らに、ＰＢＳ−ＰＶＡで組織を３回洗浄した。２５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、１．８ｍｇ／ｍｌ ＮａＨＣＯ_３および
０．０８ｍｇ／ｍｌカナマイシン−硫酸塩を添加したダ
ルベッコ変法イーグル培地（ＨＥＰＥＳ−ＤＭＥＭ；日
水製薬）に、さらに２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
および０．１％コラゲナーゼ（Ｔｙｐｅ ＩＩ；ＳＩＧ
ＭＡ）を添加した培地（ｐＨ７．４）中に約４ｇの脂肪
組織を移し、外科用ハサミを用いて細切した。ついで遠
沈管に移したのち、３９℃の培養装置内で６０分間震盪
培養した。コラゲナーゼ処理後、細胞懸濁液を口径２５
０および１５０μｍのナイロンメッシュ（共進理工）を
用いて濾過したのち、３％（ｖ／ｖ）ウシ胎子血清（Ｆ
ＣＳ；Ｆｉｌｔｒｏｎ）を添加したＨＥＰＥＳ−ＤＭＥ
Ｍでメッシュに付着した細胞を洗い流し、未消化組織と
細胞を分別した。細胞懸濁液を遠沈管に移し、３分間、
１０６Ｇで遠心分離するこによって、上層に単胞性脂肪
細胞からなる画分を得た。単胞性脂肪細胞画分をピペッ
トで吸引採取し、それを新鮮な３％ＦＣＳ添加ＨＥＰＥ
Ｓ−ＤＭＥＭ中に移した。さらに、１０６Ｇ、３分間の
遠心洗浄を３回繰り返したのち、血球計算盤を用いて細
胞数を測定した。

【００２０】単胞性脂肪細胞の培養は、Ｓｕｇｉｈａｒ
ａら（Ｓｕｇｉｈａｒａ，Ｈ．ｅｔａｌ．：Ｄｉｆｆｅ
ｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，３１：４２−４９，１９８６）
の方法に準じて行った。すなわち、３〜６×１０^５個の
単胞性脂肪細胞を組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ，３
１０７）に移し、２０％ＦＣＳ、１．８ｍｇ／ｍｌＮａ
ＨＣＯ_３および０．０８ｍｇ／ｍｌカナマイシン−硫酸
塩を添加したＤＭＥＭでフラスコ内を完全に満たした。
３７℃、５％ＣＯ_２、９５％空気の気相下の炭酸ガス培
養装置内に、フラスコ底面が上となるように静置して６
日間培養した。培養６日後、フラスコ内の培地を除去し
たのち、２０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭに交換し、細胞接着
面が底面となるようにして炭酸ガス培養装置内でさらに
１６日間培養を続けた。なお、天井培養後の培地交換は
４日毎に行った。単胞性脂肪細胞の増殖状況について
は、倒立顕微鏡下で毎日観察を行った。

【００２１】（３）ＦＡ数の測定 培養６、１０、１４、１８および２２日後に、単胞性脂
肪細胞から増殖したＦＡを以下に示す方法で測定した。
フラスコ内の培地を除去したのち、ＰＢＳ−ＰＶＡで４
回洗浄した。ついで、０．１％（ｗ／ｖ）トリプシン
（Ｄｉｆｃｏ）、０．１％（ｗ／ｖ）エチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ；ナカライテスク）を添加したＰＢＳ
（トリプシンＥＤＴＡ−ＰＢＳ）をフラスコ内に加えた
のち、炭酸ガス培養装置内に５分間静置した。培養後、
３％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭを加えたのち遠沈管に移し、さ
らに同培地でフラスコ内を２回洗浄して細胞を回収し
た。その後、１６５Ｇ、３分間遠心洗浄し、２０％ＦＣ
Ｓ添加ＤＭＥＭで細胞を再浮遊させたのち、血球計算盤
を用いて細胞数を計算した。

【００２２】（４）組織化学的検索 細胞質内における脂肪蓄積の組織化学的検索には、オイ
ルレッド０染色（Ｈａｕｓｍａｎ，Ｇ．Ｊ．：Ｓｔａｉ
ｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５６：１４９−１５４，１
９８１）を用いた。すなわち、１０％ホルマリン（ｖ／
ｖ）添加ＰＢＳ（ホルマリン−ＰＢＳ）をフラスコ内の
培地に加えて２０分間室温下で前固定した。さらに、フ
ラスコ内の培地を除去し、再び１０％ホルマリン−ＰＢ
Ｓを加えて１時間室温下で後固定した。その後、フラス
コ内のホルマリン−ＰＢＳを除去し、蒸留水で２〜３回
洗浄した。０．５％（ｗ／ｗ）オイルレッド０−イソプ
ロピルアルコール溶液と蒸留水を３：２で混合したの
ち、定性濾紙（Ｎｏ．２、Ａｄｖａｎｔｅｃ）で濾過し
て作成したオイルレッド０染色液をフラスコに入れ、１
時間室温下で染色した。染色後、蒸留水で２〜３回洗浄
し、風乾させたのち倒立顕微鏡下で単胞性、多胞性およ
びＦＡの脂肪蓄積状況を観察した。

【００２３】２）結 果 コラゲナーゼ処理後の遠心分離操作によって、単胞性脂
肪細胞からなる単一な細胞画分が得られた（図２−
ａ）。皮下脂肪組織から採取された単胞性脂肪細胞数
は、４ｇ当たり約３×１０^６個であった。

【００２４】フラスコ内に導入された全ての単胞性脂肪
細胞は、フラスコ天井面（底面）に浮き上がり、細胞質
に含まれる一つの大きな脂肪滴に押し出されて細胞の周
辺部に移動した核を有する典型的な形態を呈した。天井
培養２〜３日後、一部の単胞性脂肪細胞は不完全ではあ
るが、フラスコ天井面に接着した。培養４日後には、大
部分の細胞は細胞質の一部を伸長あるいは拡張させフラ
スコ天井面にしっかりと接着し、大型の脂肪滴の周辺に
種々の大きさの脂肪滴を有する多胞性脂肪細胞へと形態
変化した。多胞性脂肪細胞に含まれる脂肪滴はさらに分
割され、小さくなるにつれて、多胞性脂肪細胞は細胞質
をさらに伸長させ、線維芽細胞様の形態に変化する細胞
が観察された。培養６日後には、線維芽細胞様の形態を
呈する多胞性脂肪細胞の周辺部には、脂肪滴をまったく
持たないＦＡが多数観察された（図２−ａ）。その後、
脂肪滴を持たないＦＡは活発に増殖したが、多胞性脂肪
細胞は徐々に観察されなくなった（図２−ｂ）。培養１
４日後、フラスコ内の細胞はＦＡのみとなりコンフルエ
ントに達した（図２−ｃ）。

【００２５】天井培養終了後（培養６日後）には、フラ
スコ内の細胞をトリプシン処理および遠心分離すること
によって、脂肪滴を有する多胞性脂肪細胞を上層画分
に、脂肪滴をもないＦＡを沈殿画分に分離することかで
きた。天井培養後におけるＦＡの増殖曲線を図３に示し
た。培養６日後に採取されたＦＡは、約６×１０^４個／
２５ｃｍ_２であったが、その後、急速に増加しコンフル
エントに達した培養１８日後では、約１．４×１０^６個
／２５ｃｍ_２と約２３倍にまで増加した。以上の結果か
ら、ブタ単胞性脂肪細胞は多胞性脂肪細胞へ、さらには
ＦＡへと形態変化したのち、活発に増殖し、コンフルエ
ントにまで達することが示された。したがって、ブタ単
胞性脂肪細胞を天井培養すれば、前駆脂肪細胞株樹立の
ための有用な材料であるＦＡを簡便かつ効率的に採取で
きることが明らかとなった。

【００２６】［実施例２］ブタＦＡの増殖および分化特
性 ブタ単胞性脂肪細胞を天井培養すると細胞質に脂肪滴を
持たないＦＡの効率的な採取が可能であることを実施例
１で示した。もし、採取されたＦＡが継代培養後におい
ても活発な増殖能および脂肪細胞への再分化能を有する
とすれば、それらの細胞は、前駆脂肪細胞である。本実
施例では、単胞性脂肪細胞から得られたＦＡが前駆脂肪
細胞にまで脱分化するか、すなわち、ＦＡは前駆脂肪細
胞であるかを調べる目的で行った。まず、ＦＡ細胞が前
駆脂肪細胞と同様な増殖および分化特性を有するかを、
脂肪組織から採取したＳ−Ｖ細胞を対照区として比較検
討した。さらに、ＦＡの増殖および分化における至適条
件についても調べた。

【００２７】１）材料および方法 （１）ＦＡの増殖特性 ＦＡの採取は、実施例１の（１）と同様の方法で行っ
た。天井培養１４日後、フラスコ内の培地を除去したの
ち、ＰＢＳ−ＰＶＡで４回洗浄した。トリプシンＥＤＴ
Ａ−ＰＢＳをフラスコ内に加えたのち、炭酸ガス培養装
置内に５〜８分間静置した。培養後、３％ＦＣＳ添加Ｄ
ＭＥＭを加えたのち遠沈管に移し、さらに同培地でフラ
スコ内を２回洗浄して細胞を回収した。その後、１６５
Ｇ、３分間遠心洗浄し、２０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭで細
胞を再浮遊させたのち、血球計算盤を用いて細胞数を測
定した。

【００２８】一方、対照区であるＳ−Ｖ細胞の採取は、
細胞懸濁液を遠心後、上層画分をピペットで吸引除去
し、沈殿層のＳ−Ｖ画分を採取した以外は、実施例１の
（２）と同様に行った。

【００２９】１０％ＦＣＳおよび２０％ＦＣＳを添加し
たＤＭＥＭのそれぞれに対して、ＦＡおよびＳ−Ｖ細胞
を１０^４および１０^５個／ｍｌとなるように播種したの
ち、３５ｍｍの培養皿（ＦＡｌｃｏｎ，３００１Ｊ）に
播種した。５％ＣＯ_２炭酸ガス培養装置内に静置して、
培養１６日後まで４日毎にそれぞれの細胞数を測定し
た。また、ＦＡおよびＳ−Ｖ細胞の増殖状況の観察は、
倒立顕微鏡を用いて毎日行った。

【００３０】（２）ＦＡの分化特性 ＦＡあるいはＳ−Ｖ細胞を、最終濃度１×１０^４個／ｍ
ｌとなるように２０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭで調整して培
養皿に播種し、炭酸ガス培養装置内（３７℃、５％ＣＯ
_２、９５％空気）で１０日間培養した。培養後、コンフ
ルエント状態を確認したのち、ＦＣＳについては種々の
濃度で、またデキサメタゾン（ＤＥＸ；０〜２．５μ
Ｍ）、１−メチル−３−イソブチルキサンチン（ＩＢＭ
Ｘ；０〜５ｍＭ）、あるいはインスリン（ＩＮＳ；０〜
５０μ，ｇ／ｍｌ）などの分化誘導剤については、種々
の濃度あるいは組み合わせで添加した分化誘導培地に交
換して４日間培養した。培養後、再び２０％ＦＣＳ添加
ＤＭＥＭに交換し、さらに８日間培養した。分化状況
は、グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤ
Ｈ）比活性値およびオイルレッド０染色を指標として調
べた。

【００３１】Ｇ３ＰＤＨ活性測定に用いる細胞の調整
は、ＰａｉｒａｕｌｔとＧｒｅｅｎ（Ｐａｉｒａｕｌ
ｔ，Ｊ．ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，Ｈ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５１３８−５１
４２，１９７９）の方法に準じて行った。すなわち、培
養１２後まで４日毎、あるいは培養１２日後に培養皿の
培地を除去し、あらかじめ４℃に冷却しておいたＰＢＳ
で細胞を２回洗浄したのち、１ｍＭ ＥＤＴＡ添加した
２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加え、ラバ
ーポリスマンで細胞をかき集めた。細胞塊を含むＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌをマイクロチューブに移し、１５０Ｗ、１０
秒間の超音波破砕処理して細胞を破壊した。ついで、４
℃、１２８００Ｇで５分間遠心分離したのち、上清を超
遠心用チューブに移し、４℃、１０００００Ｇ、６０分
間遠心分離した。遠心後に得られた上清（粗酵素液）を
マイクロチューブに移し、Ｇ３ＰＤＨ活性測定の直前ま
で−８０℃で保存した。

【００３２】Ｇ３ＰＤＨ活性の測定は、ＫｏｚａｋとＪ
ｅｎｓｅｎ（Ｋｏｚａｋ，Ｌ．Ｐ．ａｎｄ Ｊｅｎｓｅ
ｎ，Ｊ．Ｔ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４９：７
７７５−７７８１，１９７４）の方法に従った。すなわ
ち、０．５Ｈトリエタノールアミン、１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａおよび１０ｍＭβ−メルカプトエタノールの混合溶液
５０μ１、５ｍＭジヒドロキシアセトンリン酸（ＳＩＧ
ＭＡ）および０．５ｍＭ ＮＡＤＨ（オリエンタル酵
母）を混合したものを反応液として用いた。融解直後の
粗酵素液を反応液に加えて、撹拌したのち、ただちに分
光光度計（２５℃、３４０ｎｍ）を用いて、単位時間あ
たりの吸光度の変化を測定した。

【００３３】粗酵素液中のタンパク質濃度はＬｏｗｒｙ
らの方法に従って測定した。すなわち、蒸留水で２５倍
希釈した粗酵素液に２％（ｗ／ｖ）Ｎａ_２ＣＯ_３と１％
（ｗ／ｖ）ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏおよび２％（ｗ／ｖ）
酒石酸カリナトリウムが５０：１になるように混合した
ものを加えて１０分間室温下に静置した。その後、ＩＮ
フェノール試薬を加えたのち、３０分間静置した。発色
反応後、分光光度計（７５０ｎｍ）を用いて吸光度を測
定した。以上の操作によって得られたＧ３ＰＤＨ活性値
およびタンパク質含有量からＧ３ＰＤＨ比活性値（ｕｎ
ｉｔｓ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ）を以下に示す数式を用い
て算出した。

【００３４】Ｇ３ＰＤＨ比活性値（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ）＝（１００×ｔ分間の吸光度変化量／
１．２５×ｔ分）／粗酵素液中のタンパク質濃度（ｍ
ｇ） ２）結 果 （１）ＦＡの増殖特性 継代培養したＦＡの増殖期における形態変化を調べた。
培養２４時間後、ＦＡおよびＳ−Ｖ細胞にかかわりな
く、播種されたほとんどの細胞は培養皿底面に接着し
た。その後、接着したＦＡおよびＳ−Ｖ細胞は伸長して
線維芽細胞様の形態を示し、活発に増殖した。培養１０
日後には、いずれの細胞も培養皿一面に広がりほぼコン
フルエントに達した。増殖期におけるＦＡおよびＳ−Ｖ
細胞の形態的な差異は観察されなかった。ＦＡおよびＳ
−Ｖ細胞の増殖曲線を図４に示した。ＦＡおよびＳ−Ｖ
細胞の１０^５個／ｍｌ播種区では、ＦＣＳ濃度にかかわ
りなく急速に増殖し、培養８日後にはコンフルエントに
達した。一方、１０^４個／ｍｌ播種区においてもＦＡお
よびＳ−Ｖ細胞は、ＦＣＳ濃度にかかわりなく急速に増
加し、培養１２日後にはほぼコンフルエントに達した。
しかし、ＦＡの２０％ＦＣＳ添加区では培養１２日後に
おいても細胞数の増加が認められ、培養１６日後には１
０^５個／ｍｌ播種区と同様の値を示した。

【００３５】（２）ＦＡの分化特性 ＦＡの分化にともなう形態変化を図５に示した。分化誘
導直前のＦＡはコンフルエントに達しても線維芽細胞様
の典型的な形態を示し、細胞質内に脂肪滴は観察されな
かった（図５−ａ、ｂ）。０．２５μＭ ＤＥＸ、５μ
ｇ／ｍｌ ＩＮＳ、０．５ｍＭ ＩＢＭＸおよび２０％
ＦＣＳを添加したＤＭＥＭを用いて分化誘導すると、分
化誘導４日後には、ＦＡは星状の形態を示し、細胞質内
に小さな脂肪滴を有するものも観察された（図５−
ｂ）。分化誘導１２日後には、細胞質は拡張し、細胞質
内に種々の大きさの脂肪滴が多数観察された（図５−
ｃ）。また、図には示さなかったが、分化誘導後のＳ−
Ｖ細胞においても一部が星状になったが、他のほとんど
の細胞は線維芽細胞様の形態を維持した。しかし、培養
１２日後にはＦＡと同様に細胞質は拡張し、細胞質内に
種々の大きさの脂肪滴を蓄積した細胞も観察された。

【００３６】分化誘導直前のコンフルエントに達したＦ
Ａをオイルレッド０染色しても、染色された細胞は全く
観察されなかった（図５−ｄ）。しかし、分化誘導１２
日後のＦＡをオイルレッド０染色すると、培養皿底面の
ほぼ全体がオイルレッド０染色され（図５−ｆ）、培養
したＦＡのほとんどが成熟脂肪細胞へと分化することが
示された。一方、Ｓ−Ｖ細胞では、コロニー状にオイル
レッド０染色された部分が観察されたが、染色の程度は
ＦＡに比べて少なかった（図５−ｇ）。また、分化誘導
しないＦＡは、線維芽細胞様の形態が培養期間の全てに
おいて維持され、培養１２日後においてもオイルレッド
０染色に陽性の細胞はほとんど観察されなかった（図５
−ｅ）。

【００３７】ＦＡおよびＳ−Ｖ細胞の分化誘導後におけ
るＧ３ＰＤＨ比活性値の変化を図６に示した。分化誘導
剤無添加区では、ＦＡおよびＳ−Ｖ細胞のいずれにおい
てもＧ３ＰＤＨ比活性値の上昇は培養１２日後まで認め
られなかった。この結果は、ＦＡが分化誘導剤によって
のみ分化誘導され、自発的な分化を起こさないことを示
している。一方、分化誘導剤添加区におけるＦＡおよび
Ｓ−Ｖ細胞のＧ３ＰＤＨ比活性値は、それぞれ分化誘導
４および８日後から急速に上昇し、各培養日数間におけ
るその差は有意であった。分化誘導１２日後におけるＦ
ＡおよびＳ−Ｖ細胞のＧ３ＰＤＨ比活性値は、それぞれ
１６０および５４ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎで
あり、ＦＡのＧ３ＰＤＨ比活性値はＳ−Ｖ細胞に比べて
約３倍高い値を示した。

【００３８】ＦＡの分化に及ぼす血清濃度の影響を調べ
た。０．２５μＭ ＤＥＸ、５μｇ／ｍｌ ＩＮＳおよ
び０．５ｍＭ ＩＢＭＸ添加したＤＭＥＭに５、１０、
２０あるいは４０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ添加した培地で分
化誘導し、１２日間培養した。その結果、Ｇ３ＰＤＨ比
活性値は、５〜２０％ＦＣＳ添加区の間で濃度依存的に
増加し、各区間に有意差が認められた。しかし、４０％
ＦＣＳ添加区では、Ｇ３ＰＤＨ比活性値は低下する傾向
が認められた。これらの結果から、ＦＡの分化誘導には
分化誘導培地への２０％ＦＣＳ添加が至適濃度であるこ
とが示された。

【００３９】培地に添加するＤＥＸ、ＩＢＭＸおよびＩ
ＮＳなどの分化誘導剤の組み合わせがＦＡの分化に及ぼ
す影響を調べた（図７）。３種の分化誘導剤をそれぞれ
単独あるいは組み合わせて添加し、培養１２日後のＧ３
ＰＤＨ比活性値を測定した。その結果、ＩＢＭＸおよび
ＤＥＸのＧ３ＰＤＨ比活性値は、ＩＮＳ添加区および対
照区に比べて有意に高い値を示した。２種の分化誘導剤
を組み合わせると、全ての区において対照区およびＩＮ
Ｓ区と比べて有意に高い値を示した。特に、ＤＥＸ＋Ｉ
ＢＭＸ区では相乗効果が認められ、ＩＮＳ＋ＩＢＭＸ区
および全ての単独添加区と比べて有意に高い値を示し
た。さらに、３種を組み合せたＤＥＸ＋ＩＢＭＸ＋ＩＮ
Ｓ区の比活性値は、１３２ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ｐｒｏｔ
ｅｉｎと著しい相乗効果を示し、対照区および全ての実
験区に比べて有意（ｐ＜０．００１）に高い値を示し
た。ついで、ＤＥＸ＋ＩＢＭＸ＋ＩＮＳ区に含まれる各
分化誘導剤の至適濃度を調べた。その結果、ＤＥＸ、Ｉ
ＢＭＸおよびＩＮＳのいずれにおいても、それぞれ０．
２５μＭ、０．５ｍＭおよび５μ／ｍｌまで濃度依存的
に培養１２日後におけるＧ３ＰＤＨ比活性値を上昇させ
たが、それ以上の濃度では変化が認められなかった。

【００４０】以上の結果から、単胞性脂肪細胞由来のＦ
Ａは、活発な増殖および分化能を有する前駆脂肪細胞で
あることが明らかとなった。

【００４１】［実施例３］ブタ前駆脂肪細胞の増殖およ
び分化に及ぼす継代回数の影響 実施例２において、単胞性脂肪細胞から形成されるＦＡ
は前駆脂肪細胞であることが明らかとなった。したがっ
て、この単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞（Ｐｏｒｃ
ｉｎｅ Ｐｅｒａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ
ｆｒｏｍ Ｍａｔｕｒｅｄ Ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ：
ＰＰＭＡ）が継代可能であり、また継代を繰り返しても
安定した増殖および分化能が維持されるなら、ＰＰＭＡ
はブタ前駆脂肪細胞株であることが明らかでる。本実施
例では、ブタ前駆脂肪細胞株の樹立を目的として、ＰＰ
ＨＡを長期間にわたって継代培養し、継代間における増
殖および分化能を比較検討した。

【００４２】１）材料および方法 （１）ブタ単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞の採取 と畜場において、６〜７ヶ月齢の雄あるいは雌ブタ型５
頭から皮下脂肪組織を採取し、約３７℃に調整しておい
た保温瓶に入れて１時間以内に実験室に持ち帰った。つ
いで、実施例１の方法で天井培養してＰＰＭＡを得た。

【００４３】（２）ブタ前駆脂肪細胞の継代培養および
分化誘導 ＰＰＭＡの継代培養法は前項に従って行われた。すなわ
ち、トリプシンＥＤＴＡ−ＰＢＳを用いてＰＰＭＡを培
養皿底面から剥がし、遠心洗浄したのち、細胞数を血球
計算盤を用いて算出した。ついで、最終濃度１×１０^４
個／ｍｌとなるように２０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭで再浮
遊させ、細胞懸濁液２ｍｌを培養皿に移し、３７℃、５
％ＣＯ_２、９５％空気の気相下の炭酸ガス培養装置内で
１０日間培養した。培地交換は４日毎に行い、以上の操
作を継代毎に繰り返した。また、増殖状況の観察につい
ては、倒立顕微鏡を用いて毎日観察した。

【００４４】分化誘導については、継代培養１０日後に
コンフルエントに達しているＰＰＭＡの培地を０．２５
μＭ ＤＥＸ、０．５ｍＭ ＩＢＭＸおよび５μｇ／ｍ
ｌＩＮＳを含む２０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭに交換し、４
日間分化誘導した。その後、２０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ
に培地交換し５、さらに６日間培養した。培養１０日
後、ＰＰＭＡをサンプリングし、前項２に示した方法に
したがってＧ３ＰＤＨ比活性値を測定した。また、分化
誘導後における細胞形態変化の観察は倒立顕微鏡を用い
て毎日行った。

【００４５】２）結 果 増殖期におけるＰＰＭＡは線維芽細胞様の形態を示し、
各継代間における形態的な違いは観察されなかった。Ｐ
ＰＭＡの増殖に及ぼす継代回数の影響を図８−ａに示し
た。５個体のうち４個体のＰＰＭＡでは、継代６〜７代
目において培養１０日後における細胞数の減少が認めら
れた。しかし、その後安定し、３個体由来のＰＰＭＡで
は、継代３７代目においても継代初期と同様の増殖能力
が維持された。

【００４６】図には示していないが、継代３５代目にお
けるＰＰＭＡの染色体数の算定を分裂中期像の分析によ
って行った。ＰＰＭＡの７４％は２倍体（３８染色体）
であり、１１％が３９染色体であった。さらに、８％が
３８染色体以下であり、６％は構造異常および１％が５
８染色体以上であった。これらの結果は、ＰＰＭＡが長
期継代培養後においても正常な表現型が維持されること
示している。

【００４７】ＰＰＭＡの分化誘導後に観察される形態変
化は、各継代間で違いは観察されなかった。また、３個
体由来のＰＰＭＡでは、３５代以上の継代を繰り返して
も細胞質内に種々の大きさの脂肪滴を蓄積し、継代初期
との形態的な違いは認められなかった。ＰＰＭＡの分化
に及ぼす継代回数の影響を図８−ｂに示した。３個体由
来のＰＰＭＡでは、継代３７代目までＧ３ＰＤＨ比活性
値は維持された。しかし、他の２個体由来のＰＰＭＡの
Ｇ３ＰＤＨ比活性値は、それぞれ継代３および１６代目
から急速に減少し、それぞれ継代１２および２２代目以
降のＧ３ＰＤＨ比活性値はいずれも分化誘導しない対照
区（２〜６ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と同様
の値まで低下した。以上の結果は、単胞性脂肪細胞由来
のＰＰＭＡが、長期継代を経ても均一な増殖および分化
特性を維持することを示しいる。したがって、ＰＰＭＡ
は長期継代培養が可能なブタ前駆脂肪細胞株であること
が明らかとなった。

【００４８】［実施例４］ニワトリＦＡの分化特性 本実施例では、ニワトリの腹腔脂肪組織から採取した単
胞性脂肪細胞を天井培養し、得られたＦＡが前駆脂肪細
胞にまで脱分化するかについて調べた。腹腔内脂肪組織
から採取したＳ−Ｖ細胞を対照区とした。

【００４９】１）材料および方法 １４日齢雄ニワトリを放血と殺した後、直ちに腹腔内脂
肪を摘出し、重量を測定した。単胞性脂肪細胞およびＦ
Ａの採取、ならびにそれらの培養法は、実施例１の
（１）とほぼ同様の方法で行った。一方、Ｓ−Ｖ細胞の
採取は、実施例２の（１）と同様の方法で行った。ニワ
トリの場合は、天井培養８日後に形成されるＦＡを継代
培養したものを用いた。ＦＡあるいはＳ−Ｖ細胞を、最
終濃度１×１０^５個／ｍｌとなるように１０％ＦＣＳ添
加ＤＭＥＭで調整して培養皿に播種し、炭酸ガス培養装
置内（３７℃、５％ＣＯ_２、９５％空気）に静置して８
日間培養した。培養後、コンフルエント状態を確認した
のち、１μｇ／ｍｌインスリン、１０μｇ／ｍｌトラン
スフェリンおよび１２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含むＤＭＥ
Ｍに、０．１％脂肪酸濃縮液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）無
添加あるいは添加した培地に交換して１２日間培養し
た。培地交換は、４日毎に行った。分化状況は、Ｇ３Ｐ
ＤＨ比活性値およびオイルレッド０染色を指標として調
べた。Ｇ３ＰＤＨ活性測定に用いる細胞の調整およびＧ
３ＰＤＨ比活性測定およびオイルレッド０染色の方法
は、実施例２の（２）に従った。

【００５０】２）結 果 ニワトリＦＡおよびＳ−Ｖ細胞の分化誘導後におけるＧ
３ＰＤＨ比活性値の変化を図９に示す。脂肪酸無添加区
では、ＦＡおよびＳ−Ｖ細胞のいずれにおいても培養４
日後のＧ３ＰＤＨ比活性値はやや上昇する傾向が認めら
れたが、その後、培養１２日後まで低下し、Ｇ３ＰＤＨ
比活性値の有意な上昇は認められなかった。また、脂肪
酸無添加区においては、培養期間のいずれにおいても細
胞質にオイルレッド０染色陽性の物質は観察されなかっ
た。一方、脂肪酸添加区における分化誘導４日後のＦＡ
およびＳ−Ｖ細胞のＧ３ＰＤＨ比活性値は、無添加区と
同様であり、有意な上昇は認められなかったが、分化誘
導８日後におけるＦＡおよびＳ−Ｖ細胞のＧ３ＰＤＨ比
活性値はいずれも急速に上昇し、ＦＡの比活性値はＳ−
Ｖ細胞に比べて有意に高い値を示した。さらに、分化誘
導１２日後におけるＧ３ＰＤＨ比活性値は、それぞれ７
９および６０ｕｎｉｔｓ／ｐｒｏｔｅｉｎといずれも最
高値を示した。これらの結果から、ニワトリＦＡは前駆
脂肪細胞であることが示された。また、それらは脂肪酸
によって分化誘導され、自発的な分化を起こさないこと
が示された。

【００５１】［実施例５］ニワトリ前駆脂肪細胞の増殖
および分化に及ぼす継代回数の影響 実施例４において、ニワトリ単胞性脂肪細胞から形成さ
れるＦＡが前駆脂肪細胞であることが明らかとなった。
この単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞（Ｃｈｉｃｋ
Ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｄｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ
ＭａｔｕｒｅｄＡｄｉｐｏｃｙｔｅｓ：ＣＰＭＡ）が継
代可能であり、また継代を繰り返しても安定した増殖お
よび分化能が維持されるとすれば、ＣＰＭＡはニワトリ
前駆脂肪細胞株であると考えられる。本実施例では、ニ
ワトリ前駆脂肪細胞株の樹立を目的として、ＣＰＭＡを
長期間にわたって継代培養し、継代間における増殖およ
び分化能を比較検討した。

【００５２】１）材料および方法 ＣＰＭＡの継代培養法は実施例３の（２）に従って行わ
れた。すなわち、トリプシンＥＤＴＡ−ＰＢＳを用いて
ＣＰＭＡを培養皿底面から剥がし、遠心洗浄したのち、
細胞数を血球計算盤を用いて算出した。最終濃度１×１
０^５個／ｍｌとなるように１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭで
再浮遊させ、細胞懸濁液２ｍｌを培養皿に移し、３７
℃、５％ＣＯ_２、９５％空気の気相下の炭酸ガス培養装
置内で８日間培養した。培地交換は４日毎に行い、以上
の操作を継代毎に繰り返した。増殖状況の観察について
は、倒立顕微鏡を用いて毎日観察した。分化誘導につい
ては、継代培養８日後にコンフルエントに達しているＣ
ＰＭＡの培地を、実施例４の（２）に示した分化誘導培
地に交換することによって行った。その後、さらに分化
誘導培地中で１２日間培養した。分化誘導１２日後、Ｃ
ＰＭＡをサンプリングし、実施例２の（２）に示した方
法に従ってＧ３ＰＤＨ比活性値を測定した。また、分化
誘導後における細胞形態変化の観察は倒立顕微鏡を用い
て毎日行った。

【００５３】２）結 果 増殖期におけるＣＰＭＡは実施例３のブタ前駆脂肪細胞
に比べるとやや平滑筋細胞様の形態を示したが、各継代
間における形態的な違いについては観察されなかった。
ＣＰＭＡの増殖に及ぼす継代回数の影響を図１０に示し
た。５例中２例のＣＰＭＡにおいてのみ、継代１０〜１
５代目の培養８日後における細胞数において減少が認め
られた。しかし、それ以外のＣＰＭＡでは、継代３３代
目においても継代初期と同様の増殖能力が維持された。

【００５４】分化誘導後に観察されるＣＰＭＡの形態変
化は、各継代間で違いは観察されなかった。また、５例
中２例のＣＰＭＡでは、３３代以上の継代を繰り返して
も、分化誘導後において細胞質内に種々の大きさの脂肪
滴を蓄積し、継代初期との形態的な違いは認められなか
った。ＣＰＭＡの分化に及ぼす継代回数の影響を図１１
に示した。５例中２例のＣＰＭＡでは、継代３３代目ま
でＧ３ＰＤＨ比活性値は維持された。しかし、他の３例
のＣＰＭＡにおけるＧ３ＰＤＨ比活性値は、それぞれ継
代６、８および２５代目から急速に減少し、それぞれ継
代８、９および２９代目以降のＧ３ＰＤＨ比活性値はい
ずれも分化誘導しない対照区と同様の値（６〜１８ｕｎ
ｉｔｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）まで低下した。以上の
結果は、単胞性脂肪細胞由来のＣＰＭＡが、長期継代を
経ても均一な増殖および分化特性を維持することを示し
いる。したがって、ＣＰＭＡは長期継代培養が可能なニ
ワトリ前駆脂肪細胞株であることが明らかとなった。

【００５５】

【発明の効果】本発明により得られる効果を列記すると
以下のようになる。

【００５６】１）終末分化を遂げた単胞性脂肪細胞は前
駆脂肪細胞にまで脱分化することが明らかにされた。こ
れは、脂肪細胞分化のモデルだけでなく、分化および脱
分化の遺伝子レベルでの機構解明のための実験系となり
得る。

【００５７】２）これらの前駆脂肪細胞は、形質転換
（染色体レベルでの異常など）なしに長期継代可能であ
る。すなわち、本発明により動物細胞由来の前駆脂肪細
胞株を簡便にかつ短期間で再現性よく樹立することが可
能となる。

【００５８】３）家畜あるいは家禽由来の前駆脂肪細胞
株を用いて、増殖および分化を抑制する物質をスクリー
ニングすることができれば、それを家畜あるいは家禽に
投与することによって、より効果的な体脂肪蓄積の制御
が可能となる。この方法により現在行われている飼料エ
ネルギーあるいは栄養素の調節による従来法の限界を解
決するだけでなく、飼料効率のさらなる向上や、廃棄さ
れる脂肪を減少させ食料資源の効率化に貢献する。

【００５９】４）脂肪組織は形成される部位（腸間膜、
腎臓周囲、皮下、精巣上体、筋肉組織など）ごとに異な
る特性を有することが明らかにされつつある。本発明に
より各部位由来の前駆脂肪細胞が各個体ごとに採取され
ることから、各部位ごとの脂肪細胞分化の特性を個体差
を含めて詳細に比較検討することが可能となる。

【００６０】５）筋肉組織内に交雑する脂肪（霜降り
肉）は、食肉の商品価値を高めるが、本発明によって筋
肉組織由来の前駆脂肪細胞株を樹立し、それらの特性を
解明すれば、商品価値の高い畜肉生産を可能とする。

【００６１】６）内臓由来の前駆脂肪細胞を用いて、該
細胞から生成および分泌される生理活性物質、特に肥満
症あるいは成人病に深く関与するＴＮＦα、レプチン、
ＰＡＩ−１などの生成機構を解明のための実験系とな
る。これによりインスリン抵抗性および肥満解消薬の開
発あるいは動脈硬化の指標作りなどが可能となる。

【００６２】７）本発明によって単一な前駆脂肪細胞が
得られることから、成熟脂肪細胞、血管上皮細胞あるい
は血管周囲細胞、さらには筋細胞などとの共培養が可能
となり、それらの細胞が脂肪細胞分化に及ぼす影響につ
いて調べることが可能となる。

【００６３】８）ダイオキシンあるいは合成樹脂などの
内分泌撹乱化学物質（環境ホルモン）は脂溶性であり、
脂肪組織に蓄積される。したがって、分化誘導した脂肪
細胞を用いて、それらの物質の取り込みと排出のメカニ
ズムを詳細に検討する実験系となる。

【００６４】９）脂肪細胞は分化過程において脂肪細胞
特異的な遺伝子が整然と発現されることから、分化過程
のどの位置にある細胞かを明確にとらえることが出来
る。したがって、増殖期、分化前期、中期および後期さ
らには終末分化に至る任意の細胞を用意することができ
る。本発明をもちいれば、胎児期から成体由来の前駆脂
肪細胞を容易に準備することが可能であり、また染色体
異常を起こすことなく維持されることから体細胞クロー
ン作成時のドナー細胞として使用できる。

【００６５】１０）本発明は、成熟脂肪細胞が採取可能
であれば前駆脂肪細胞を得ることができることを主に唾
乳類および鳥類を対象として示した。このことは、爬虫
類、両生類あるいは魚類、また、無脊椎動物例えば昆虫
類などにおける脂肪細胞の分化特性等を調べるための実
験系や物質生産系を構築することができる。

【００６６】

【図面の簡単な説明】

【図１】単胞性脂肪細胞の天井培養法を示す図である。
脂肪組織をコラゲナーゼ処理し、ろ過後に遠心分離して
単胞性脂肪細胞（成熟脂肪細胞）群と間質血管系細胞群
を分離した。培地を満たしたフラスコ内に単胞性脂肪細
胞を播種し、６日間培養した。その間に単胞性脂肪細胞
はフラスコ内において浮上し、天井面に接着する。培養
６日後、フラスコ内の培養液を適量にし、接着面を底面
に戻して培養を継続した。

【図２】ブタ単胞性脂肪細胞から形成された線維芽細胞
様脂肪細胞（ＦＡ）の増殖。 ａ；培養６日後、多胞性脂肪細胞と脂肪滴を持たないＦ
Ａが混在している。 ｂ；培養１０日後、多胞性脂肪細胞は減少し、ＦＡの活
発な増殖が観察される。 ｃ；培養１４日後、ＦＡはほぼコンフルエントに達す
る。多胞性脂肪細胞は全く観察されない。

【図３】単胞性脂肪細胞から形成されたブタ線維芽細胞
様脂肪細胞の増殖曲線（ｎ＝５）。 ・２０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ中で６日間天井培養した
後、フラスコ内の培養液を適量にし、接着面を底面に戻
してさらに１６日間培養した。ａ〜ｄ：ｐ＜０．０５。

【図４】ブタ線維芽細胞様脂肪細胞（ＦＡ）および間質
血管系（Ｓ−Ｖ）細胞の増殖曲線。 ・１０％（●）あるいは２０％（〇）ＦＣＳ添加したＤ
ＭＥＭで細胞濃度１０^４あるいは１０^５個／ｍｌで播種
し、培養１６日まで４日毎にＦＡおよびＳ−Ｖ細胞の細
胞数を測定した。ａ〜ｃ：ｐ＜０．０５。

【図５】ブタ線維芽細胞様脂肪細胞（ＦＡ）の分化に伴
う形態変化およびオイルレッド０染色像。 ａ；培養１０日後、コンフルエントに達したＦＡの細胞
質には脂肪滴はまったく観察されない。 ｂ；分化誘導４日後、ＦＡは星状の形態を示し、細胞質
内に小さな脂肪滴を有する細胞も観察される。 ｃ；分化誘導１２日後、ＦＡの細胞質は拡張し、細胞質
内に種々の大きさの脂肪滴が多数観察される。 ｄ；分化誘導直前のコンフルエントに達しているＦＡの
オイルレッド０染色像。培養皿に染色された部分は観察
されない。 ｅ；分化誘導しないＦＡは、培養１２日後においても培
養皿に染色された部分がほとんど観察されない。 ｆ；分化誘導１２日後におけるＦＡのオイルレッド０染
色像。オイルレッド０染色されたＦＡが培養皿の全面に
観察される。 ｇ；分化誘導１２日後におけるＳ−Ｖ細胞のオイルレッ
ド０染色像。培養皿の底面にコロニー状に染色された部
分が観察される。

【図６】分化誘導後におけるブタ線維芽細胞様脂肪細胞
（ＦＡ）および間質血管系（Ｓ−Ｖ）細胞のグリセロー
ル３リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）活性の変化
（ｎ＝４）。 ・０．２５μＭデキサメタゾン（ＤＥＸ）、０．５ｍＭ
イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）および５μｇ
／ｍｌインスリン（ＩＮＳ）を添加あるいは無添加した
２０％ＦＣＳ添加のＤＭＥＭで４日間分化誘導したの
ち、２０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭでさらに８日間培養し
た。分化誘導後、４日毎にＧ３ＰＤＨ比活性値を測定し
た。ａ〜ｃ：ｐ＜０．０５。

【図７】種々に分化誘導剤の組み合わせがブタ線維芽細
胞様脂肪細胞の分化に及ぼす影響（ｎ＝６）。 ・０．２５μＭデキサメタゾン（ＤＥＸ）、０．５ｍＭ
イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、５μｇ／ｍ
ｌインスリン（ＩＮＳ）を種々の組み合わせで添加した
２０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭを用いて４日間分化誘導した
のち、２０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭでさらに８日間培養し
た。ａ〜ｄ：ｐ＜０．０５。

【図８】ブタ線維芽細胞様脂肪細胞の増殖（ａ）および
分化（ｂ）に及ぼす継代回数の影響。 ａ）５個体由来のブタ前駆脂肪細胞を最終濃度１×１０
^４個／ｍｌとなるように２０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ中に
播種したのち、培養１０日後の細胞数を測定した。 ｂ）コンフルエントに達した５個体由来のブタ前駆脂肪
細胞の培地を、０．２５μＭデキサメタゾン、０．５ｍ
Ｍイソブチルメチルキサンチンおよび５μｇ／ｍｌイン
スリンを含む２０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭで４日間分化誘
導したのち、２０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭでさらに６日間
培養した。

【図９】分化誘導後におけるニワトリ線維芽細胞様脂肪
細胞および間質血管系（Ｓ−Ｖ）細胞のＧ３ＰＤＨ活性
の変化（ｎ＝５）。コンフルエントに達したニワトリ線
維芽細胞様脂肪細胞の培地を、１μｇ／ｍｌインスリ
ン、１０μｇ／ｍｌのトランスフェリンおよび１２ｍｇ
／ｍｌ ＢＳＡ添加ＤＭＥＭに０．１％（ｖ／ｖ）脂肪
酸濃縮液を添加、あるいは無添加の培地に交換し、１２
日間培養した。分化誘導後、４日毎にＧ３ＰＤＨ比活性
値を測定した。ａ〜ｃ：ｐ＜０．０５。

【図１０】ニワトリ単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞
の増殖に及ぼす継代回数の影響（ｎ＝５）。 ニワトリ
前駆脂肪細胞を最終濃度１×１０^５個／ｍｌとなるよう
に１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ中に播種したのち、培養８
日後の細胞数を測定した。

【図１１】ニワトリ単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞
の分化に及ぼす継代回数の影響（ｎ＝５）。コンフルエ
ントに達したニワトリ前駆脂肪細胞の培地を、０．１％
（ｖ／ｖ）脂肪酸濃縮液、１μｇ／ｍｌインスリン、１
０μｇ／ｍｌのトランスフェリンおよび１２ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ添加ＤＭＥＭに交換し、１２日間培養した。分
化誘導１２日後にＧ３ＰＤＨ比活性値を測定した。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１０年９月２９日（１９９８．９．２
９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正内容】

【書類名】 明細書

【発明の名称】 前駆脂肪細胞株

【特許請求の範囲】

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は動物の単胞性脂肪細
胞由来の前駆脂肪細胞株の樹立方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】白色脂肪組織の大部分を占有する成熟脂
肪細胞は、生体が摂取した余剰エネルギーを中性脂肪に
変換して貯蔵するだけでなく、生体維持に必要なエネル
ギー収支の調節機能においても主要な役割を果たすこと
が明らかにされている。このため脂肪細胞では、脂質代
謝ならびに種々の生理活性物質の生成および分泌が活発
に行われている。成熟脂肪細胞の直径は、10〜200μmと
多様であるが、細胞質内に一つの大きな脂肪滴と周辺部
に押しやられた核を有する典型的な形態から単胞性脂肪
細胞と呼ばれている。脂肪細胞の形成過程は、まず多能
性中胚葉細胞から前駆脂肪細胞となり、活発に増殖す
る。ついで、前駆脂肪細胞はコミットメントされたの
ち、増殖停止して脂肪細胞へと終末分化するとされてい
る。この一連の分化過程において脂肪細胞特異的な遺伝
子が整然と発現されることが知られている。最近、脂肪
細胞の分化に関与する転写因子（核内受容体）の研究が
急速に進展し、脂肪細胞特異的な遺伝子群の発現誘導お
よび抑制を調節するマスターレギュレーターとして、ペ
ルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ（PPARγ）が発見
された。PPARγは脂肪細胞にのみ特異的に発現し、栄養
素である脂肪酸をリガンドとする核内受容体である。ま
た、PPARγはレチノイドX受容体と補因子二量体を形成
して、標的遺伝子の応答配列（PPRE）に結合して転写調
節することも明らかにされた。

【０００３】これと並行して、PPARγはインスリン非依
存型糖尿病（NIDDM）に対する治療薬であるチアゾリジ
ン誘導体の細胞内標的タンパク質であることが示され、
肥満症、糖尿病、および、高脂血症などの成人病と、脂
肪細胞分化を支配する転写調節の研究との緊密な接点が
明らかにされつつある。成人病との関連性では、脂肪細
胞が種々の生理活性物質を生成および分泌する内分泌細
胞としての側面が注目されている。インスリン抵抗性
は、肥満症および糖尿病において最も頻繁に認められる
病態である。肥満を伴う糖尿病におけるインスリン抵抗
性は、脂肪細胞から分泌されるTNFαによって惹起され
ると考えられている。実際、肥満のヒトあるいは動物で
は、内臓に形成された脂肪細胞からTNFα分泌が亢進さ
れており、インスリン抵抗性の指標と相関することが示
されている。また、PAI-1（plasminogen activator inh
ibitor 1）は血液線溶系における最も重要な物質であ
り、線溶性を低下させ血栓形成を促進し、心筋梗塞など
の原因となることが知られている。肥満症およびNIDDM
患者では血中PAI-1が上昇するが、それらは主に内臓脂
肪細胞由来であることも明らかにされている。さらに、
肥満遺伝子の産物であるレプチンは脂肪細胞で産生さ
れ、中枢に作用して摂食抑制およびエネルギー消費を促
進して体脂肪を一定に調節する新しいホルモンである
が、これも肥満症およびNIDDM患者において高く、またT
NFαによって産生が亢進されることも明らかにされてい
る。肥満症あるいはNIDDMにおける血中のTNFα、PAI-1
およびレプチンの上昇は、チアゾリジン誘導体によって
強く改善されることから、それら脂肪細胞由来の生理活
性物質の生成および分泌は脂肪細胞分化に直接関係する
と考えられる。しかし、疾患についての知見はヒトにお
いて、また脂肪細胞分化の機構についてはマウス前駆脂
肪細胞株を用いた体外培養における知見がほとんどであ
り、それらの疾患と脂肪細胞分化の関連性については未
だ不明な点が多く残されている。

【０００４】一方、家畜あるいは家禽など産業動物の体
脂肪蓄積の制御および脂肪交雑肉の作出は、これまで飼
料エネルギーあるいは栄養素の調節によっておこなわれ
きた。しかし、経済効果優先の育種目標として、増体量
の向上が優先されたことから飼料摂取量の多い個体が必
然的に選抜されてきた。それにより、飼料摂取量が多い
個体ではエネルギー過剰に陥りやすく、脂肪として過剰
に蓄積する傾向を有する。これに反して、ヒトでは肥満
症の増加から低脂肪の畜肉が嗜好され、生産される大部
分の脂肪は食されることなく廃棄されているのが現状で
ある。同時に、家畜あるいは家禽においても体脂肪の過
剰蓄積に起因する代謝障害による疾病の増加も問題にな
っている。これらの解決策として、飼料成分の調整等に
よる従来の間接的な方法によって高い生産性を維持しつ
つ、体脂肪の過剰蓄積を抑制することはすでに限界に達
していると思われる。そこで、根本的なテーマとして、
脂肪組織を構成する脂肪細胞の増殖および分化機構を直
接的に制御することができれば、体脂肪蓄積のより効果
的な制御を可能にすると考えられる。しかし、家畜ある
いは家禽の脂肪組織を構成する脂肪細胞の増殖および分
化に関する細胞レベルでの知見の集積はほとんどなされ
ていないのが現状であり、またそれを調べるための優れ
た実験系も未だ確立されていない。

【０００５】これまで脂肪細胞の増殖および分化に関す
る研究は、主に、Swiss-3T3由来の前駆脂肪細胞株（3T3
-L1や3T3-F443A）、或いは、脂肪組織を酵素処理するこ
とによって得られる間質-血管画分に含まれる前駆脂肪
細胞（S-V細胞）の初代培養系を用いて行われてきた。
しかし、Swiss-3T3由来の前駆脂肪細胞株には、１）パ
ターンが異なった染色体をもつ変異細胞が混入してい
る、２）妊娠17〜19日の胚由来であるため、アダルト由
来の前駆脂肪細胞とは分化特性が異なる、３）血清添加
培地で培養すると自発的に分化誘導されるので、本質的
に分化誘導する物質を特定できない、等の解決すべき課
題がある。一方、S-V細胞は、１）前駆脂肪細胞以外の
細胞、たとえば、血管内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細
胞などが混入しているため、前駆脂肪細胞自体の分化特
性を調べることができない（他の細胞群の影響を無視で
きない）、２）脂肪組織中には、中胚葉性の多能性細胞
から前駆脂肪細胞へと分化したばかりの細胞から、既に
コミットメントされ脂肪細胞への分化途上の細胞に至
る、種々の段階の分化過程にある細胞が存在する、３）
初代培養系であるため、同一材料を用いて複数回の実験
ができない、４）前記２）及び３）の理由から細胞を調
製する個体間の差が大きいため、再現性の高いデータが
得られない、等の解決すべき課題がある。

【０００６】これらの課題は、対象とする動物の前駆脂
肪細胞を限界希釈法などによってクローニングして、前
駆脂肪細胞株を樹立することにより解決できる可能性が
あるが、この様な操作は煩雑であり、且つ成功率が低
い。

【０００７】

【発明が解決しょうとする課題】そこで、本発明は、動
物の単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞の新たな樹立方
法及び該方法により得られる前駆脂肪細胞株を提供する
ことを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、すでに、終末分化
を遂げている動物由来の単胞性脂肪細胞を天井培養し、
得られる線維芽細胞様脂肪細胞が、前駆脂肪細胞と同様
な増殖及び分化特性を有し、分化誘導により、形態学的
にも、分化特性においても脂肪細胞へ分化することを確
認し、さらに、該線維芽細胞様脂肪細胞を長期間継代培
養しても形質転換なしに、かつ、均一な増殖及び分化能
を保持して継代培養ができることを見出し、本発明を完
成した。すなわち、本発明は、１）動物の単胞性脂肪細
胞を天井培養して形成される線維芽細胞様脂肪細胞を継
代培養し、脱分化することによって得られる該動物由来
の前駆脂肪細胞株、２）動物がヒトである１）に記載の
前駆脂肪細胞株、３）動物がブタである１）に記載の前
駆脂肪細胞株、４）動物がニワトリである１）に記載の
前駆脂肪細胞株、に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】動物の脂肪組織は、形成される部
位（腸間膜、腎臓周囲、皮下、精巣上体、筋肉組織内な
ど）ごとに異なる特性を有することが明らかにされつつ
ある。そこで、前駆脂肪細胞の樹立目的によって、動物
の年齢あるいは性別など、採取する脂肪組織を選択する
ことができる。例えば、家畜では、商品価値の高い畜肉
（例えば、霜降り肉）生産を目的として、筋肉組織内脂
肪細胞の形成機構解明のための筋肉組織由来の前駆脂肪
細胞株の樹立、肉用家畜あるいは家禽の枝肉率の向上を
目的として、腹腔内脂肪細胞の形成機構およびその特性
解明のための腹腔内脂肪由来の前駆脂肪細胞株の樹立、
乳脂肪と脂肪酸組成との関連の調査を目的とした乳腺組
織由来の前駆脂肪細胞株の樹立、或いはヒトにおいて、
特に肥満症あるいは成人病に深く関与する生理活性物質
（TNFα、レプチン、PAI-1など）の生成および分泌の調
節機構解明のための内臓脂肪組織由来の前駆脂肪細胞株
の樹立、などが考えられる。

【００１０】１）単胞性脂肪細胞の分離 単胞性脂肪細胞の分離は、基本的には、Rodbelの方法
（Rodbel M.: J. Biol.Chem., 239: 173-181, 1964）に
準じて行うことができる。外科手術中のヒト、或いは家
畜・家禽から目的とする脂肪組織をすばやく採取する。
太めの血管および結合組織を除去する。抗生物質を含む
基礎培地（例えばダルベッコー変法イーグル培地）、或
いはリン酸緩衝生理食塩水に脂肪組織を入れ、緩やかに
脂肪組織を洗浄する。次いで、脂肪組織を、ウシ血清ア
ルブミンおよびコラゲナーゼ、トリプシン、プロナー
ゼ、ディスパーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、
などの酵素を含む培地中に入れ、外科用ハサミで細胞が
挫滅しないよう細切した後、45〜60分間震盪して細胞を
分散する。分散操作後、細胞懸濁液をナイロンメッシュ
で濾過して未消化組織を除去する。濾液を緩やかに遠心
分離すると、単胞性脂肪細胞は上層に浮遊して集まる。
一方、間質血管細胞（前駆脂肪細胞を含む）は、沈殿に
集まる。単胞性脂肪細胞をピペットで吸引採取する。採
取した単胞性脂肪細胞は、さらに培地（例えば血清ある
いはBSAを含むダルベッコー変法イーグル培地）に移
し、数回遠心洗浄する。

【００１１】２）単胞性脂肪細胞の培養 単胞性脂肪細胞の培養は、杉原らの方法（Sugihara, H.
et al.: Differentiation,31: 42-49, 1986）に準じて
行うことができる。すなわち、単胞性脂肪細胞は、細胞
質内に含まれる中性脂肪によって培養液中で浮遊する
が、この浮遊性を逆に利用して、培地を100％充満させ
たフラスコの内側上面（天井面）に該細胞を接着させて
培養する方法（天井培養）である。この方法で、単胞性
脂肪細胞を数日間天井培養すると、大部分の細胞は細胞
質の一部を伸長あるいは拡張させ、フラスコ天井面にし
っかりと接着し、大型の脂肪滴の周辺に種々の大きさの
脂肪滴を有する多胞性脂肪細胞へと形態変化する。この
時点で、フラスコ内の培地を適量の培地に交換し、通常
の培養法に戻して培養を継続する。多胞性脂肪細胞に含
まれる脂肪滴はさらに分割され、小さくなるにつれて、
多胞性脂肪細胞は細胞質をさらに伸長させ、線維芽細胞
様の形態に変化する細胞が観察される。さらに培養を継
続すると、線維芽細胞様の形態を呈する多胞性脂肪細胞
の周辺部には、脂肪滴を僅かに、あるいはまったく持た
ない線維芽細胞様脂肪細胞（FA）が多数観察されるよう
になる。 FAは活発に増殖する一方で、多胞性脂肪細胞
は徐々に観察されなくなる。その後、フラスコ内の細胞
はFAのみとなりコンフルエントに達する。ブタ、ニワト
リ、ラットあるいはヒトなど、いずれの種から採取した
単胞性脂肪細胞を天井培養した場合においても、上記に
示した形態変化したのち、活発に増殖するが、年齢、採
取した組織の部位（例えば、皮下あるいは内臓脂肪組
織）および性別などによって若干異なる。

【００１２】３）線維芽細胞様脂肪細胞（FA）の増殖お
よび分化 上記２）において形成されたFAの採取および継代培養は
以下に示す方法を用いて行う。天井培養後、フラスコ内
にFAが形成され、活発に増殖することが確認されたら、
フラスコ内の培地を除去し、フラスコ内の細胞をトリプ
シン処理および遠心分離する。この操作により、脂肪滴
を有する多胞性脂肪細胞を上層画分に、脂肪滴をもたな
いFAを沈殿画分に分離することができる。この単胞性脂
肪細胞由来のFAを継代培養すると、培養24時間後に、殆
どの細胞は培養皿底面に接着し、線維芽細胞様の形態を
示しながら活発に増殖し、数日後には、ほぼコンフルエ
ントに達する。この培養期間における増殖曲線を作成す
ることによって該動物あるいは組織由来のFAの増殖特性
を調べる。動物種（ヒトあるいはラット）によっては、
細胞質内に微小な脂肪滴が観察されるが、この場合は脂
肪細胞の脱分化誘導作用を有するTNFα添加した培地を
用いるなど適宜に行う。細胞質内の脂肪滴の有無の確認
は、オイルレッドO染色法を用いて行う。なお、ブタあ
るいはニワトリのFAでは、脂肪滴は観察されない。

【００１３】FAの分化特性については、以下に示す方法
を用いて行う。FAの培地を分化誘導剤を添加した培地
（動物種で若干異なる）に交換し、数日間培養培養して
分化誘導を行う。分化誘導後、通常の培地に戻し、さら
に培養を継続する。一般的に、FAを分化誘導後数日経過
すると、FAは星状あるいは敷石状に形態変化し、細胞質
内に小さな脂肪滴を有する細胞が観察されるようにな
る。さらに培養を継続すると、細胞質は拡張し、細胞質
内に種々の大きさの脂肪滴が観察されるようになる。分
化誘導後におけるFA細胞質内の脂肪滴蓄積の確認は、オ
イルレッドO染色法を用いて行う。また、脂肪細胞の分
化の後期マーカーであるglycerol-3-phosphate-dehydro
genase（GPDH）活性を分化の指標として測定し、分化誘
導後の培養期間中における活性の変化を観察する。以上
の結果として、該動物あるいは組織のFAが活発な増殖お
よび分化能を有することが示されれば、FAは単胞性脂肪
細胞由来の前駆脂肪細胞であることが示される。

【００１４】４）前駆脂肪細胞株の樹立 単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞の継代培養を行い、
各継代ごとの増殖および分化能を調べることによって前
駆脂肪細胞株の樹立を試みる。例えば、ブタおよびニワ
トリの単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞では、それぞ
れ37および33代目においても、継代初期と同様の均一な
増殖能力および分化能が維持されており、かつ、染色体
異常などの形質転換も観察されないことが確認されてい
る。

【００１５】以上のように、本発明は４行程からなる。
本発明では、実施例として以下にブタ皮下脂肪組織およ
びニワトリ腹腔内脂肪組織由来の前駆脂肪細胞株の樹立
を示したが、その他の家畜、例えばウシやヒツジ、或い
は家禽のアヒル、ウズラ、さらにはヒトなどにも、本発
明で開示された技術を用いて、或いは当業者であるなら
ば、必要な変更を加えて、目的の動物および組織由来の
前駆脂肪細胞株を樹立することが可能である。例えば培
養条件における培地、血清濃度、分化誘導剤などの選択
は、当業者であるならば、簡単な試行錯誤の結果、適宜
に最適条件を設定することが可能である。例えば、14日
齢ニワトリ腹腔脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞の場合で
は、血清添加添加濃度は10％、分化誘導剤は脂肪酸を用
い、また、6〜7ヶ月齢ブタ皮下脂肪組織由来の前駆脂肪
細胞の場合では20％血清添加で分化誘導剤にはインスリ
ン、デキサメタゾンおよびイソブチルメチルキサンチン
の同時添加が適当である。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

【００１７】［実施例１］単胞性脂肪細胞の増殖特性 ブタ単胞性脂肪細胞の増殖特性を明らかにする目的で行
った。すなわち、天井培養法を用いて単胞性脂肪細胞を
培養し、増殖様式を観察した。ついで、単胞性脂肪細胞
から形成されるFAの増殖状況を調べることによって、そ
れらの効率的な採取が可能であるかについても検討し
た。

【００１８】１）材料および方法 (1) 脂肪組織の採取 と畜場において、6〜7ヶ月齢の雄あるいは雌ブタの皮下
脂肪組織を採取し、約37℃に調整しておいた保温瓶に入
れて１時間以内に実験室に持ち帰った。

【００１９】(2) 単胞性脂肪細胞の単離および培養 単胞性脂肪細胞の単離および培養方法の概略を図１に示
す。0.08mg/mlカナマイシン一硫酸塩（SIGMA）および0.
5mg/mlポリビニールアルコール（SIGMA）添加のリン酸
緩衝食塩水（PBS-PVA）に、0.1％(v/v）セチルトリメチ
ルアンモニウムブロミドを添加した溶液で脂肪組織を洗
浄した。さらに、PBS-PVAで組織を３回洗浄した。25mM
HEPES、1.8mg/ml NaHCO₃および0.08mg/mlカナマイシン
一硫酸塩を添加したダルベッコ変法イーグル培地（HEPE
S-DMEM；日水製薬）に、さらに２％ウシ血清アルブミン
（BSA）および0.1％コラゲナーゼ（Type II; SIGMA）を
添加した培地（pH7.4）中に約４gの脂肪組織を移し、外
科用ハサミを用いて細切した。ついで遠沈管に移したの
ち、39℃の培養装置内で60分間震盪培養した。コラゲナ
ーゼ処理後、細胞懸濁液を口径250および150μmのナイ
ロンメッシュ（共進理工）を用いて濾過したのち、３％
(v/v）ウシ胎子血清（FCS; Filtron）を添加したHEPES-
DMEMでメッシュに付着した細胞を洗い流し、未消化組織
と細胞を分別した。細胞懸濁液を遠沈管に移し、３分
間、106Gで遠心分離するこによって、上層に単胞性脂肪
細胞からなる画分を得た。単胞性脂肪細胞画分をピペッ
トで吸引採取し、それを新鮮な３％FCS添加HEPES-DMEM
中に移した。さらに、106G、３分間の遠心洗浄を３回繰
り返したのち、血球計算盤を用いて細胞数を測定した。

【００２０】単胞性脂肪細胞の培養は、Sugiharaら（Su
gihara, H.et al.: Differentiation, 31: 42-49, 198
6）の方法に準じて行った。すなわち、３〜６×10⁵個の
単胞性脂肪細胞を組織培養フラスコ（FALCON, 3107）に
移し、20％FCS、1.8mg/ml NaHCO₃および0.08mg/mlカナ
マイシン一硫酸塩を添加したDMEMでフラスコ内を完全に
満たした。37℃、５％CO₂、95％空気の気相下の炭酸ガ
ス培養装置内に、フラスコ底面が上となるように静置し
て６日間培養した。培養６日後、フラスコ内の培地を除
去したのち、20％FCS添加DMEMに交換し、細胞接着面が
底面となるようにして炭酸ガス培養装置内でさらに16日
間培養を続けた。なお、天井培養後の培地交換は４日毎
に行った。単胞性脂肪細胞の増殖状況については、倒立
顕微鏡下で毎日観察を行った。

【００２１】（3）FA数の測定 培養６、10、14、18および22日後に、単胞性脂肪細胞か
ら増殖したFAを以下に示す方法で測定した。フラスコ内
の培地を除去したのち、PBS-PVAで４回洗浄した。つい
で、0.1％(w/v)トリプシン（Difco）、0.1％(w/v)エチ
レンジアミン四酢酸（EDTA; ナカライテスク）を添加し
たPBS（トリプシンEDTA-PBS）をフラスコ内に加えたの
ち、炭酸ガス培養装置内に５分間静置した。培養後、3
％FCS添加DMEMを加えたのち遠沈管に移し、さらに同培
地でフラスコ内を２回洗浄して細胞を回収した。その
後、165G、３分間遠心洗浄し、20％FCS添加DMEMで細胞
を再浮遊させたのち、血球計算盤を用いて細胞数を計算
した。

【００２２】(4) 組織化学的検索 細胞質内における脂肪蓄積の組織化学的検索には、オイ
ルレッドO染色（Hausman, G. J.: Stain Technology, 5
6: 149-154, 1981）を用いた。すなわち、10％ホルマリ
ン(v/v)添加PBS（ホルマリン-PBS）をフラスコ内の培地
に加えて20分間室温下で前固定した。さらに、フラスコ
内の培地を除去し、再び10％ホルマリン-PBSを加えて１
時間室温下で後固定した。その後、フラスコ内のホルマ
リン-PBSを除去し、蒸留水で２〜３回洗浄した。0.5％
(w/w)オイルレッドO-イソプロピルアルコール溶液と蒸
留水を３：２で混合したのち、定性濾紙（No. 2、Advan
tec）で濾過して作成したオイルレッドO染色液をフラス
コに入れ、１時間室温下で染色した。染色後、蒸留水で
２〜３回洗浄し、風乾させたのち倒立顕微鏡下で単胞
性、多胞性およびFAの脂肪蓄積状況を観察した。

【００２３】２）結 果 コラゲナーゼ処理後の遠心分離操作によって、単胞性脂
肪細胞からなる単一な細胞画分が得られた（図２-a）。
皮下脂肪組織から採取された単胞性脂肪細胞数は、４g
当たり約３×10⁶個であった。

【００２４】フラスコ内に導入された全ての単胞性脂肪
細胞は、フラスコ天井面（底面）に浮き上がり、細胞質
に含まれる一つの大きな脂肪滴に押し出されて細胞の周
辺部に移動した核を有する典型的な形態を呈した。天井
培養２〜３日後、一部の単胞性脂肪細胞は不完全ではあ
るが、フラスコ天井面に接着した。培養４日後には、大
部分の細胞は細胞質の一部を伸長あるいは拡張させフラ
スコ天井面にしっかりと接着し、大型の脂肪滴の周辺に
種々の大きさの脂肪滴を有する多胞性脂肪細胞へと形態
変化した。多胞性脂肪細胞に含まれる脂肪滴はさらに分
割され、小さくなるにつれて、多胞性脂肪細胞は細胞質
をさらに伸長させ、線維芽細胞様の形態に変化する細胞
が観察された。培養６日後には、線維芽細胞様の形態を
呈する多胞性脂肪細胞の周辺部には、脂肪滴をまったく
持たないFAが多数観察された（図２-a）。 その後、脂
肪滴を持たないFAは活発に増殖したが、多胞性脂肪細胞
は徐々に観察されなくなった（図２-b）。培養14日後、
フラスコ内の細胞はFAのみとなり外観上コンフルエント
に達した（図２-c）。

【００２５】天井培養終了後（培養６日後）には、フラ
スコ内の細胞をトリプシン処理および遠心分離すること
によって、脂肪滴を有する多胞性脂肪細胞を上層画分
に、脂肪滴をもないFAを沈殿画分に分離することができ
た。天井培養後におけるFAの増殖曲線を図３に示した。
培養６日後に採取されたFAは、約６×10⁴個/25cm₂であ
ったが、急速に増加しコンフルエントに達した。例え
ば、培養18日後では、約1.4×10⁶個/25cm₂と約23倍にま
で増加した。以上の結果から、ブタ単胞性脂肪細胞は多
胞性脂肪細胞へ、さらにはFAへと形態変化したのち、活
発に増殖し、コンフルエントにまで達することが示され
た。したがって、ブタ単胞性脂肪細胞を天井培養すれ
ば、前駆脂肪細胞株樹立のための有用な材料であるFAを
簡便かつ効率的に採取できることが明らかとなった。

【００２６】［実施例２］ブタFAの増殖および分化特性 ブタ単胞性脂肪細胞を天井培養すると細胞質に脂肪滴を
持たないFAの効率的な採取が可能であることを実施例１
で示した。もし、採取されたFAが継代培養後においても
活発な増殖能および脂肪細胞への再分化能を有するとす
れば、それらの細胞は、前駆脂肪細胞である。本実施例
では、単胞性脂肪細胞から得られたFAが前駆脂肪細胞に
まで脱分化するか、すなわち、FAは前駆脂肪細胞である
かを調べる目的で行った。まず、FA細胞が前駆脂肪細胞
と同様な増殖および分化特性を有するかを、脂肪組織か
ら採取したS-V細胞を対照区として比較検討した。さら
に、FAの増殖および分化における至適条件についても調
べた。

【００２７】１）材料および方法 (1) FAの増殖特性 FAの採取は、実施例１の(1)と同様の方法で行った。天
井培養14日後、フラスコ内の培地を除去したのち、PBS-
PVAで４回洗浄した。トリプシンEDTA-PBSをフラスコ内
に加えたのち、炭酸ガス培養装置内に５〜８分間静置し
た。培養後、3％FCS添加DMEMを加えたのち遠沈管に移
し、さらに同培地でフラスコ内を２回洗浄して細胞を回
収した。その後、165G、３分間遠心洗浄し、20％FCS添
加DMEMで細胞を再浮遊させたのち、血球計算盤を用いて
細胞数を測定した。

【００２８】一方、対照区であるS-V細胞の採取は、細
胞懸濁液を遠心後、上層画分をピペットで吸引除去し、
沈殿層のS-V画分を採取した以外は、実施例１の(2)と同
様に行った。

【００２９】10％FCSおよび20％FCSを添加したDMEMのそ
れぞれに対して、FAおよびS-V細胞を10⁴および10⁵ 個/m
lとなるように播種したのち、35mmの培養皿（FALCON、
3001J）に播種した。５％CO₂炭酸ガス培養装置内に静置
して、培養16日後まで４日毎にそれぞれの細胞数を測定
した。また、FAおよびS-V細胞の増殖状況の観察は、倒
立顕微鏡を用いて毎日行った。

【００３０】(2) FAの分化特性 FAあるいはS-V細胞を、最終濃度１×10⁴個/mlとなるよ
うに20%FCS添加DMEMで調整して培養皿に播種し、炭酸ガ
ス培養装置内（37℃、5％CO₂、95％空気）で10日間培養
した。培養後、コンフルエント状態を確認したのち、FC
Sについては種々の濃度で、またデキサメタゾン(DEX; 0
〜2.5μM)、1-メチル-3-イソブチルキサンチン (IBMX;
0〜5 mM）、あるいはインスリン (INS; 0〜50μg/ml）
などの分化誘導剤については、種々の濃度あるいは組み
合わせで添加した分化誘導培地に交換して４日間培養し
た。培養後、再び20％FCS添加DMEMに交換し、さらに８
日間培養した。分化状況は、グリセロール３リン酸デヒ
ドロゲナーゼ (G3PDH)比活性値およびオイルレッドO染
色を指標として調べた。

【００３１】G3PDH活性測定に用いる細胞の調整は、Pai
raultとGreen (Pairault, J. andGreen, H.: Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 76: 5138-5142 ,1979）の方法に
準じて行った。すなわち、培養12後まで４日毎、あるい
は培養12日後に培養皿の培地を除去し、あらかじめ４℃
に冷却しておいたPBSで細胞を２回洗浄したのち、1 mM
EDTA添加した25 mMTris-HCl (pH 7.5) を加え、ラバー
ポリスマンで細胞をかき集めた。細胞塊を含むTris-HCl
をマイクロチューブに移し、150W、10秒間の超音波破砕
処理して細胞を破壊した。ついで、４℃、12800 Gで５
分間遠心分離したのち、上清を超遠心用チューブに移
し、４℃、100000 G、60分間遠心分離した。遠心後に得
られた上清（粗酵素液）をマイクロチューブに移し、G3
PDH活性測定の直前まで-80℃で保存した。

【００３２】G3PDH活性の測定は、KozakとJensen (Koza
k, L. P. and Jensen, J. T.: J. Biol. Chem., 249:77
75-7781, 1974) の方法に従った。すなわち、0.5 Mトリ
エタノールアミン、10 mM EDTAおよび10 mMβ-メルカプ
トエタノールの混合溶液50μl、５mMジヒドロキシアセ
トンリン酸 (SIGMA) および0.5 mM NADH (オリエンタル
酵母) を混合したものを反応液として用いた。融解直後
の粗酵素液を反応液に加えて、攪拌したのち、ただちに
分光光度計（25℃、340nm）を用いて、単位時間あたり
の吸光度の変化を測定した。

【００３３】粗酵素液中のタンパク質濃度はLowryらの
方法に従って測定した。すなわち、蒸留水で25倍希釈し
た粗酵素液に2％(w/v) Na₂CO₃と１%(w/v) CuSO₄・5H₂O
および2%(w/v)酒石酸カリナトリウムが50：１になるよ
うに混合したものを加えて10分間室温下に静置した。そ
の後、１Nフェノール試薬を加えたのち、30分間静置し
た。発色反応後、分光光度計(750nm)を用いて吸光度を
測定した。以上の操作によって得られたG3PDH活性値お
よびタンパク質含有量からG3PDH比活性値(units/mg pro
tein) を以下に示す数式を用いて算出した。 G3PDH比活性値 (units/mg protein) ＝（100×ｔ分間の
吸光度変化量/1.25×ｔ分）/粗酵素液中のタンパク質濃
度(mg)

【００３４】２）結 果 (1) FAの増殖特性 継代培養したFAの増殖期における形態変化を調べた。培
養24時間後、FAおよびS-V細胞にかかわりなく、播種さ
れたほとんどの細胞は培養皿底面に接着した。その後、
接着したFAおよびS-V細胞は伸長して線維芽細胞様の形
態を示し、活発に増殖した。培養10日後には、いずれの
細胞も培養皿一面に広がりほぼコンフルエントに達し
た。増殖期におけるFAおよびS-V細胞の形態的な差異は
観察されなかった。FAおよびS-V細胞の増殖曲線を図４
に示した。FAおよびS-V細胞の10⁵個/ml播種区では、FCS
濃度にかかわりなく急速に増殖し、培養８日後にはコン
フルエントに達した。一方、10⁴個/ml播種区においても
FAおよびS-V細胞は、FCS濃度にかかわりなく急速に増加
し、培養12日後にはほぼコンフルエントに達した。しか
し、FAの20％FCS添加区では培養12日後においても細胞
数の増加が認められ、培養16日後には10⁵個/ml播種区と
同様の値を示した。

【００３５】(2) FAの分化特性 FAの分化にともなう形態変化を図５に示した。分化誘導
直前のFAはコンフルエントに達しても線維芽細胞様の典
型的な形態を示し、細胞質内に脂肪滴は観察されなかっ
た（図５-a、 b）。0.25μM DEX、５μg/ml INS、0.5 m
M IBMXおよび20％FCSを添加したDMEMを用いて分化誘導
すると、分化誘導４日後には、FAは星状の形態を示し、
細胞質内に小さな脂肪滴を有するものも観察された（図
５-b）。分化誘導12日後には、細胞質は拡張し、細胞質
内に種々の大きさの脂肪滴が多数観察された(図５-c)。
また、図には示さなかったが、分化誘導後のS-V細胞に
おいても一部が星状になったが、他のほとんどの細胞は
線維芽細胞様の形態を維持した。しかし、培養12日後に
はFAと同様に細胞質は拡張し、細胞質内に種々の大きさ
の脂肪滴を蓄積した細胞も観察された。

【００３６】分化誘導直前のコンフルエントに達したFA
をオイルレッドO染色しても、染色された細胞は全く観
察されなかった（図５-d）。しかし、分化誘導12日後の
FAをオイルレッドO染色すると、培養皿底面のほぼ全体
がオイルレッドO染色され（図５-f）、培養したFAのほ
とんどが成熟脂肪細胞へと分化することが示された。一
方、S-V細胞では、コロニー状にオイルレッドO染色され
た部分が観察されたが、染色の程度はFAに比べて少なか
った（図５-g）。また、分化誘導しないFAは、線維芽細
胞様の形態が培養期間の全てにおいて維持され、培養12
日後においてもオイルレッドO染色に陽性の細胞はほと
んど観察されなかった（図５-e）。

【００３７】FAおよびS-V細胞の分化誘導後におけるG3P
DH比活性値の変化を図６に示した。分化誘導剤無添加区
では、FAおよびS-V細胞のいずれにおいてもG3PDH比活性
値の上昇は培養12日後まで認められなかった。この結果
は、FAが分化誘導剤によってのみ分化誘導され、自発的
な分化を起こさないことを示している。一方、分化誘導
剤添加区におけるFAおよびS-V細胞のG3PDH比活性値は、
それぞれ分化誘導４および８日後から急速に上昇し、各
培養日数間におけるその差は有意であった。分化誘導12
日後におけるFAおよびS-V細胞のG3PDH比活性値は、それ
ぞれ160および54 units/mg proteinであり、FAのG3PDH
比活性値はS-V細胞に比べて約３倍高い値を示した。

【００３８】FAの分化に及ぼす血清濃度の影響を調べ
た。0.25μM DEX、５μg/ml INSおよび0.5 mM IBMX添加
したDMEMに５、10、20あるいは40% (v/v) FCS添加した
培地で分化誘導し、12日間培養した。その結果、G3PDH
比活性値は、５〜20％FCS添加区の間で濃度依存的に増
加し、各区間に有意差が認められた。しかし、40%FCS添
加区では、G3PDH比活性値は低下する傾向が認められ
た。これらの結果から、FAの分化誘導には分化誘導培地
への20％FCS添加が至適濃度であることが示された。

【００３９】培地に添加するDEX、IBMXおよびINSなどの
分化誘導剤の組み合わせがFAの分化に及ぼす影響を調べ
た（図７）。３種の分化誘導剤をそれぞれ単独あるいは
組み合わせて添加し、培養12日後のG3PDH比活性値を測
定した。その結果、IBMXおよびDEXのG3PDH比活性値は、
INS添加区および対照区に比べて有意に高い値を示し
た。２種の分化誘導剤を組み合わせると、全ての区にお
いて対照区およびINS区と比べて有意に高い値を示し
た。特に、DEX+IBMX区では相乗効果が認められ、INS+IB
MX区および全ての単独添加区と比べて有意に高い値を示
した。さらに、３種を組み合せたDEX+IBMX+INS区の比活
性値は、132 units/mg proteinと著しい相乗効果を示
し、対照区および全ての実験区に比べて有意（p<0.00
1）に高い値を示した。ついで、DEX+IBMX+INS区に含ま
れる各分化誘導剤の至適濃度を調べた。その結果、DE
X、IBMXおよびINSのいずれにおいても、それぞれ0.25μ
M、0.5 mMおよび5μ/mlまで濃度依存的に培養12日後に
おけるG3PDH比活性値を上昇させたが、それ以上の濃度
では変化が認められなかった。

【００４０】以上の結果から、単胞性脂肪細胞由来のFA
は、活発な増殖および分化能を有する前駆脂肪細胞であ
ることが明らかとなった。

【００４１】［実施例３］ブタ前駆脂肪細胞の増殖およ
び分化に及ぼす継代回数の影響 実施例２において、単胞性脂肪細胞から形成されるFAは
前駆脂肪細胞であることが明らかとなった。したがっ
て、この単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞（Porcine
Peradipocytes derived from Matured Adipocytes : PP
MA）が継代可能であり、また継代を繰り返しても安定し
た増殖および分化能が維持されるなら、PPMAはブタ前駆
脂肪細胞株であることが明らかでる。本実施例では、ブ
タ前駆脂肪細胞株の樹立を目的として、PPMAを長期間に
わたって継代培養し、継代間における増殖および分化能
を比較検討した。

【００４２】１）材料および方法 (1) ブタ単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞の採取 と畜場において、6〜7ヶ月齢の雄あるいは雌ブタ型５頭
から皮下脂肪組織を採取し、約37℃に調整しておいた保
温瓶に入れて1時間以内に実験室に持ち帰った。つい
で、実施例１の方法で天井培養してPPMAを得た。

【００４３】(2) ブタ前駆脂肪細胞の継代培養および分
化誘導 PPMAの継代培養法は前項に従って行われた。すなわち、
トリプシンEDTA-PBSを用いてPPMAを培養皿底面から剥が
し、遠心洗浄したのち、細胞数を血球計算盤を用いて算
出した。ついで、最終濃度1×10⁴個/mlとなるように20
％FCS添加DMEMで再浮遊させ、細胞懸濁液２mlを培養皿
に移し、37℃、5％CO₂、95％空気の気相下の炭酸ガス培
養装置内で10日間培養した。培地交換は４日毎に行い、
以上の操作を継代毎に繰り返した。また、増殖状況の観
察については、倒立顕微鏡を用いて毎日観察した。

【００４４】分化誘導については、継代培養10日後にコ
ンフルエントに達しているPPMAの培地を0.25μM DEX、
0.5mM IBMXおよび5μg/ml INSを含む20％FCS添加DMEMに
交換し、４日間分化誘導した。その後、20％FCS添加DME
Mに培地交換し5、さらに6日間培養した。培養10日後、P
PMAをサンプリングし、前項２に示した方法にしたがっ
てG3PDH比活性値を測定した。また、分化誘導後におけ
る細胞形態変化の観察は倒立顕微鏡を用いて毎日行っ
た。

【００４５】２）結 果 増殖期におけるPPMAは線維芽細胞様の形態を示し、各継
代間における形態的な違いは観察されなかった。PPMAの
増殖に及ぼす継代回数の影響を図８−ａに示した。５個
体のうち４個体のPPMAでは、継代６〜７代目において培
養10日後における細胞数の減少が認められた。しかし、
その後安定し、３個体由来のPPMAでは、継代37代目にお
いても継代初期と同様の増殖能力が維持された。

【００４６】継代35代目におけるPPMAの染色体数の算定
を分裂中期像の分析によって行った。PPMAの74％は２倍
体（38染色体）であり、11％が39染色体であった。さら
に、8％が38染色体以下であり、６％は構造異常および1
％が58染色体以上であった。これらの結果は、PPMAが長
期継代培養後においても正常な表現型が維持されること
示している。

【００４７】PPMAの分化誘導後に観察される形態変化
は、各継代間で違いは観察されなかった。また、３個体
由来のPPMAでは、35代以上の継代を繰り返しても細胞質
内に種々の大きさの脂肪滴を蓄積し、継代初期との形態
的な違いは認められなかった。PPMAの分化に及ぼす継代
回数の影響を図８−ｂに示した。３個体由来のPPMAで
は、継代37代目までG3PDH比活性値は維持された。しか
し、他の２個体由来のPPMAのG3PDH比活性値は、それぞ
れ継代３および16代目から急速に減少し、それぞれ継代
12および22代目以降のG3PDH比活性値はいずれも分化誘
導しない対照区（２〜６units/mg protein）と同様の値
まで低下した。以上の結果は、単胞性脂肪細胞由来のPP
MAが、長期継代を経ても均一な増殖および分化特性を維
持することを示しいる。したがって、PPMAは長期継代培
養が可能なブタ前駆脂肪細胞株であることが明らかとな
った。

【００４８】［実施例４］ニワトリFAの分化特性 本実施例では、ニワトリの腹腔脂肪組織から採取した単
胞性脂肪細胞を天井培養し、得られたFAが前駆脂肪細胞
にまで脱分化するかについて調べた。腹腔内脂肪組織か
ら採取したS-V細胞を対照区とした。

【００４９】１）材料および方法 14日齢雄ニワトリを放血と殺した後、直ちに腹腔内脂肪
を摘出し、重量を測定した。単胞性脂肪細胞およびFAの
採取、ならびにそれらの培養法は、実施例１の（１）と
ほぼ同様の方法で行った。一方、S-V細胞の採取は、実
施例２の（１）と同様の方法で行った。ニワトリの場合
は、天井培養８日後に形成されるFAを継代培養したもの
を用いた。FAあるいはS-V細胞を、最終濃度１×10⁵個/m
lとなるように10％FCS添加DMEMで調整して培養皿に播種
し、炭酸ガス培養装置内（37℃、5％CO₂、95％空気）に
静置して８日間培養した。培養後、コンフルエント状態
を確認したのち、１μg/mlインスリン、10μg/mlトラン
スフェリンおよび12mg/ml BSAを含むDMEMに、0.1%脂肪
酸濃縮液（GIBCO BRL）無添加あるいは添加した培地に
交換して12日間培養した。培地交換は、４日毎に行っ
た。分化状況は、G3PDH比活性値およびオイルレッドO染
色を指標として調べた。G3PDH活性測定に用いる細胞の
調整およびG3PDH比活性測定およびオイルレッドO染色の
方法は、実施例２の（２）に従った。

【００５０】２）結果 ニワトリFAおよびS-V細胞の分化誘導後におけるG3PDH比
活性値の変化を図９に示す。脂肪酸無添加区では、FAお
よびS-V細胞のいずれにおいても培養４日後のG3PDH比活
性値はやや上昇する傾向が認められたが、その後、培養
12日後まで低下し、G3PDH比活性値の有意な上昇は認め
られなかった。また、脂肪酸無添加区においては、培養
期間のいずれにおいても細胞質にオイルレッドO染色陽
性の物質は観察されなかった。一方、脂肪酸添加区にお
ける分化誘導4日後のFAおよびS-V細胞のG3PDH比活性値
は、無添加区と同様であり、有意な上昇は認められなか
ったが、分化誘導８日後におけるFAおよびS-V細胞のG3P
DH比活性値はいずれも急速に上昇し、FAの比活性値はS-
V細胞に比べて有意に高い値を示した。さらに、分化誘
導12日後におけるG3PDH比活性値は、それぞれ79および6
0 units/proteinといずれも最高値を示した。これらの
結果から、ニワトリFAは前駆脂肪細胞であることが示さ
れた。また、それらは脂肪酸によって分化誘導され、自
発的な分化を起こさないことが示された。

【００５１】［実施例５］ニワトリ前駆脂肪細胞の増殖
および分化に及ぼす継代回数の影響 実施例４において、ニワトリ単胞性脂肪細胞から形成さ
れるFAが前駆脂肪細胞であることが明らかとなった。こ
の単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞（ChickPreadipoc
yte drived from Matured Adipocytes：CPMA）が継代可
能であり、また継代を繰り返しても安定した増殖および
分化能が維持されるとすれば、CPMAはニワトリ前駆脂肪
細胞株であると考えられる。本実施例では、ニワトリ前
駆脂肪細胞株の樹立を目的として、CPMAを長期間にわた
って継代培養し、継代間における増殖および分化能を比
較検討した。

【００５２】１）材料および方法 CPMAの継代培養法は実施例３の（２）に従って行われ
た。すなわち、トリプシンEDTA-PBSを用いてCPMAを培養
皿底面から剥がし、遠心洗浄したのち、細胞数を血球計
算盤を用いて算出した。最終濃度1×10⁵個/mlとなるよ
うに10％FCS添加DMEMで再浮遊させ、細胞懸濁液２mlを
培養皿に移し、37℃、5％CO₂、95％空気の気相下の炭酸
ガス培養装置内で８日間培養した。培地交換は４日毎に
行い、以上の操作を継代毎に繰り返した。増殖状況の観
察については、倒立顕微鏡を用いて毎日観察した。分化
誘導については、継代培養８日後にコンフルエントに達
しているCPMAの培地を、実施例４の（２）に示した分化
誘導培地に交換することによって行った。その後、さら
に分化誘導培地中で12日間培養した。分化誘導12日後、
CPMAをサンプリングし、実施例２の（２）に示した方法
に従ってG3PDH比活性値を測定した。また、分化誘導後
における細胞形態変化の観察は倒立顕微鏡を用いて毎日
行った。

【００５３】２）結果 増殖期におけるCPMAは実施例３のブタ前駆脂肪細胞に比
べるとやや平滑筋細胞様の形態を示したが、各継代間に
おける形態的な違いについては観察されなかった。CPMA
の増殖に及ぼす継代回数の影響を図１０に示した。５例
中２例のCPMAにおいてのみ、継代10〜15代目の培養８日
後における細胞数において減少が認められた。しかし、
それ以外のCPMAでは、継代33代目においても継代初期と
同様の増殖能力が維持された。

【００５４】分化誘導後に観察されるCPMAの形態変化
は、各継代間で違いは観察されなかった。また、5例中2
例のCPMAでは、33代以上の継代を繰り返しても、分化誘
導後において細胞質内に種々の大きさの脂肪滴を蓄積
し、継代初期との形態的な違いは認められなかった。CP
MAの分化に及ぼす継代回数の影響を図１１に示した。5
例中2例のCPMAでは、継代33代目までG3PDH比活性値は維
持された。しかし、他の3例のCPMAにおけるG3PDH比活性
値は、それぞれ継代６、８および25代目から急速に減少
し、それぞれ継代８、９および29代目以降のG3PDH比活
性値はいずれも分化誘導しない対照区と同様の値（6〜1
8 units/mg protein）まで低下した。以上の結果は、単
胞性脂肪細胞由来のCPMAが、長期継代を経ても均一な増
殖および分化特性を維持することを示しいる。したがっ
て、CPMAは長期継代培養が可能なニワトリ前駆脂肪細胞
株であることが明らかとなった。

【００５５】

【発明の効果】本発明により得られる効果を列記すると
以下のようになる。

【００５６】１）終末分化を遂げた単胞性脂肪細胞は前
駆脂肪細胞にまで脱分化することが明らかにされた。こ
れは、脂肪細胞分化のモデルだけでなく、分化および脱
分化の遺伝子レベルでの機構解明のための実験系となり
得る。

【００５７】２）これらの前駆脂肪細胞は、形質転換
（染色体レベルでの異常など）なしに長期継代可能であ
る。すなわち、本発明により動物細胞由来の前駆脂肪細
胞株を簡便にかつ短期間で再現性よく樹立することが可
能となる。

【００５８】３）家畜あるいは家禽由来の前駆脂肪細胞
株を用いて、増殖および分化を抑制する物質をスクリー
ニングすることができれば、それを家畜あるいは家禽に
投与することによって、より効果的な体脂肪蓄積の制御
が可能となる。この方法により現在行われている飼料エ
ネルギーあるいは栄養素の調節による従来法の限界を解
決するだけでなく、飼料効率のさらなる向上や、廃棄さ
れる脂肪を減少させ食料資源の効率化に貢献する。

【００５９】４）脂肪組織は形成される部位（腸間膜、
腎臓周囲、皮下、精巣上体、筋肉組織など）ごとに異な
る特性を有することが明らかにされつつある。本発明に
より各部位由来の前駆脂肪細胞が各個体ごとに採取され
ることから、各部位ごとの脂肪細胞分化の特性を個体差
を含めて詳細に比較検討することが可能となる。

【００６０】５）筋肉組織内に交雑する脂肪（霜降り
肉）は、食肉の商品価値を高めるが、本発明によって筋
肉組織由来の前駆脂肪細胞株を樹立し、それらの特性を
解明すれば、商品価値の高い畜肉生産を可能とする。

【００６１】６）内臓由来の前駆脂肪細胞を用いて、該
細胞から生成および分泌される生理活性物質、特に肥満
症あるいは成人病に深く関与するTNFα、レプチン、PAI
-1などの生成機構を解明のための実験系となる。これに
よりインスリン抵抗性および肥満解消薬の開発あるいは
動脈硬化の指標作りなどが可能となる。

【００６２】７）本発明によって単一な前駆脂肪細胞が
得られることから、成熟脂肪細胞、血管上皮細胞あるい
は血管周囲細胞、さらには筋細胞などとの共培養が可能
となり、それらの細胞が脂肪細胞分化に及ぼす影響につ
いて調べることが可能となる。

【００６３】８）ダイオキシンあるいは合成樹脂などの
内分泌攪乱化学物質（環境ホルモン）は脂溶性であり、
脂肪組織に蓄積される。したがって、分化誘導した脂肪
細胞を用いて、それらの物質の取り込みと排出のメカニ
ズムを詳細に検討する実験系となる。

【００６４】９）脂肪細胞は分化過程において脂肪細胞
特異的な遺伝子が整然と発現されることから、分化過程
のどの位置にある細胞かを明確にとらえることが出来
る。したがって、増殖期、分化前期、中期および後期さ
らには終末分化に至る任意の細胞を用意することができ
る。本発明をもちいれば、胎児期から成体由来の前駆脂
肪細胞を容易に準備することが可能であり、また染色体
異常を起こすことなく維持されることから体細胞クロー
ン作成時のドナー細胞として使用できる。

【００６５】10）本発明は、成熟脂肪細胞が採取可能で
あれば前駆脂肪細胞を得られることを主に哺乳類および
鳥類を対象として示した。このことは、爬虫類、両生類
あるいは魚類、また、無脊椎動物例えば昆虫類などにお
ける脂肪細胞の分化特性等を調べるための実験系や物質
生産系を構築することができる。

【００６６】

【図面の簡単な説明】

【図１】単胞性脂肪細胞の天井培養法を示す図である。
脂肪組織をコラゲナーゼ処理し、ろ過後に遠心分離して
単胞性脂肪細胞（成熟脂肪細胞）群と間質血管系細胞群
を分離した。培地を満たしたフラスコ内に単胞性脂肪細
胞を播種し、６日間培養した。その間に単胞性脂肪細胞
はフラスコ内において浮上し、天井面に接着する。培養
６日後、フラスコ内の培養液を適量にし、接着面を底面
に戻して培養を継続した。

【図２】ブタ単胞性脂肪細胞から形成された線維芽細胞
様脂肪細胞(FA)の増殖。 a；培養６日後、多胞性脂肪細胞と脂肪滴を持たないFA
が混在している。 b；培養10日後、多胞性脂肪細胞は減少し、FAの活発な
増殖が観察される。 c；培養14日後、FAはほぼコンフルエントに達する。多
胞性脂肪細胞は全く観察されない。

【図３】単胞性脂肪細胞から形成されたブタ線維芽細胞
様脂肪細胞の増殖曲線（n＝５）。 ・20%FCS添加DMEM中で６日間天井培養した後、フラスコ
内の培養液を適量にし、接着面を底面に戻してさらに１
６日間培養した。a〜d：p＜0.05。

【図４】ブタ線維芽細胞様脂肪細胞(FA)および間質血管
系(S-V)細胞の増殖曲線。 ・10%(●)あるいは20%(○)FCS添加したDMEMで細胞濃度1
0⁴あるいは10⁵個/mlで播種し、培養１６日まで４日毎に
FAおよびS-V細胞の細胞数を測定した。a〜c：p＜0.05。

【図５】ブタ線維芽細胞様脂肪細胞（FA）の分化に伴う
形態変化およびオイルレッドO染色像。 a；培養10日後、コンフルエントに達したFAの細胞質に
は脂肪滴はまったく観察されない。 b；分化誘導４日後、FAは星状の形態を示し、細胞質内
に小さな脂肪滴を有する細胞も観察される。 c；分化誘導12日後、FAの細胞質は拡張し、細胞質内に
種々の大きさの脂肪滴が多数観察される。 d；分化誘導直前のコンフルエントに達しているFAのオ
イルレッドO染色像。培養皿に染色された部分は観察さ
れない。 e；分化誘導しないFAは、培養12日後においても培養皿
に染色された部分がほとんど観察されない。 f；分化誘導12日後におけるFAのオイルレッドO染色像。
オイルレッドO染色されたFAが培養皿の全面に観察され
る。 g；分化誘導12日後におけるS-V細胞のオイルレッドO染
色像。培養皿の底面にコロニー状に染色された部分が観
察される。

【図６】分化誘導後におけるブタ線維芽細胞様脂肪細胞
(FA)および間質血管系(S-V)細胞のグリセロール３リン
酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)活性の変化（n＝４）。 ・0.25μMデキサメタゾン(DEX)、0.5mMイソブチルメチ
ルキサンチン(IBMX)および5μg/mlインスリン(INS)を添
加あるいは無添加した20%FCS添加のDMEMで４日間分化誘
導したのち、20％FCS添加DMEMでさらに８日間培養し
た。分化誘導後、４日毎にG3PDH比活性値を測定した。a
〜c：p＜0.05。

【図７】種々に分化誘導剤の組み合わせがブタ線維芽細
胞様脂肪細胞の分化に及ぼす影響（n＝６）。 ・0.25μMデキサメタゾン(DEX)、0.5mMイソブチルメチ
ルキサンチン(IBMX)、5μg/mlインスリン(INS)を種々の
組み合わせで添加した20%FCS添加DMEMを用いて４日間分
化誘導したのち、20%FCS添加DMEMでさらに８日間培養し
た。a〜d：p＜0.05。

【図８】ブタ線維芽細胞様脂肪細胞の増殖（ａ）および
分化（ｂ）に及ぼす継代回数の影響。 ａ）５個体由来のブタ前駆脂肪細胞を最終濃度１×10⁴
個/mlとなるように20％FCS添加DMEM中に播種したのち、
培養１０日後の細胞数を測定した。 ｂ）コンフルエントに達した５個体由来のブタ前駆脂肪
細胞の培地を、0.25μMデキサメタゾン、0.5mMイソブチ
ルメチルキサンチンおよび5μg/mlインスリンを含む20%
FCS添加DMEMで４日間分化誘導したのち、20%FCS添加DME
Mでさらに６日間培養した。

【図９】分化誘導後におけるニワトリ線維芽細胞様脂肪
細胞および間質血管系(S-V)細胞のG3PDH活性の変化（n
＝５）。コンフルエントに達したニワトリ線維芽細胞様
脂肪細胞の培地を、１μg/mlインスリン、10μg/mlのト
ランスフェリンおよび12mg/ml BSA添加DMEMに0.1％(v/
v)脂肪酸濃縮液を添加、あるいは無添加の培地に交換
し、12日間培養した。分化誘導後、４日毎にG3PDH比活
性値を測定した。a〜c：p＜0.05。

【図１０】ニワトリ単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞
の増殖に及ぼす継代回数の影響（n＝５）。 ニワトリ
前駆脂肪細胞を最終濃度１×10⁵個/mlとなるように10％
FCS添加DMEM中に播種したのち、培養８日後の細胞数を
測定した。

【図１１】ニワトリ単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞
の分化に及ぼす継代回数の影響（n＝５）。コンフルエ
ントに達したニワトリ前駆脂肪細胞の培地を、0.1％(v/
v)脂肪酸濃縮液、１μg/mlインスリン、10μg/mlのトラ
ンスフェリンおよび12mg/ml BSA添加DMEMに交換し、12
日間培養した。分化誘導12日後にG3PDH比活性値を測定
した。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】動物の単胞性脂肪細胞を天井培養して形成
   される線維芽細胞様脂肪細胞を継代培養し分化誘導する
   ことによって得られる該動物由来の前駆脂肪細胞株。
2. 【請求項２】動物がヒトである請求項１記載の前駆脂肪
   細胞株。
3. 【請求項３】動物がブタである請求項１記載の前駆脂肪
   細胞株。
4. 【請求項４】動物がニワトリである請求項１記載の前駆
   脂肪細胞株。