JP2023504216A - 細胞を培養する方法、細胞からの加水分解物の調製、及びそれらの用途 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、生体外細胞培養によって細胞加水分解物を生成する方法を提供する。【解決手段】本発明は、生体外細胞培養によって細胞加水分解物を生成する方法であって、(i)音波処理を用いて細胞を溶解し、その細胞中のタンパク質を放出させ、(ii)プロテアーゼを用いてそのタンパク質を消化し、500ダルトン(Da)より分子サイズの小さい短いペプチドを生産し、(iii)プロテアーゼを所定時間、所定温度に加熱するか、プロテアーゼを所定濃度に希釈するかして、消化ステップを終結させ、そして(iv)消化終結ステップから得られる混合液を薄膜フィルターで無菌濾過するステップを含む方法である。【選択図】図７

Description

本発明は、、細胞を培養する方法、及び細胞からの加水分解物の調製、培養した細胞からの加水分解物の用途に関する。

動物の肉は、タンパク質が豊富で、身体機能のサポートに用いられるタンパク質を作るために必要なすべてのアミノ酸の供給源となる。消費される食肉は、伝統的には、養殖場で飼われる動物や魚から得られる。しかしながら、動物の肉を生産する畜産業や水生動物養殖業では、大量のエネルギーと資源が必要であり、カーボンフットプリントも高くなる。畜産業や水生動物養殖業で生産された食肉は、生産プロセスにおいて、病気や汚染源や毒素に露呈されるかもしれないので、そのような食肉では、人々の健康が危険にさらされかねない。人口増加、食肉需要の高まり、環境問題、陸地や水域の限りある資源、生物多様性の損失及び動物の屠殺に関しての否定的な見方と言った多くの懸念があって、科学者が、代替のプロセスで食肉を生産する技法を開発する運びとなった。

生体外食肉生産は、細胞培養技法を用いて、実験室で、動物の筋肉組織又は臓器組織を成長させて食肉及び食肉製品を製造するプロセスである。ここで用いられている通り、生体外食肉及び食肉製品には、可溶な形態や固形であったりする動物タンパク製品ならびに非食肉製品が含まれる。まだ開発の初期段階ではあるが、生体外食肉及び食肉製品には、健康及び環境上の利点及び動物の繁栄にとっての利益と言った、伝統的な食肉製品に無い数多くの利点がある。それは、細胞畜産業又は細胞培養での畜産製品の生産と言う、より広い分野の一部として運用される次世代の新興の技術である。

生体外食肉の生産のための細胞は、動物バイオプシーから取られる細胞（例えば、筋肉細胞、体細胞、幹細胞など）であり、そして、それは、バイオリアクター又はその他の種類の無菌環境における培養基で、動物から分離されて育てられる。その細胞は、バイオリアクターに置かれる三次元の可食の骨組に付着することで、動物臓器を模した半固形又は固形へと成長する。出発細胞は、動物組織又は連続細胞株から直接得られる一次細胞である。適切な培養基において正しい条件で育てられたら、一次細胞は、成長して増殖するが、細胞のDNAの端におけるテロメア長に関連する有限の回数だけである。他方、連続細胞株は、生体外で、長期間培養できる。細胞生物学の研究によって、一次細胞を如何にして不死の連続細胞株に変えるのかについて手順が確立されている。ウイルス性癌遺伝子、化学処理、又は、テロメアが縮むのを防ぐためのテロメラーゼ逆転写酵素の過剰発現を用いて、一次細胞は、連続細胞株へと形質転換される。

培養基は、アミノ酸、塩、ビタミン、成長因子、及びpHを制御するための緩衝システムといった細胞の増殖に必要な成分を含む。牛胎児血清(FBS)によって、生体巨大分子、成長因子、及び免疫分子が供給されるので、現在の方法では、FBSを、使用に先立って培養基に加える。しかしながら、FBSは、胎内の仔牛から得られるので、動物製品は使わないと言う目的と折りが合わない。動物成分を含まない培養基で細胞を育てると言うのが、生体外食肉生産の研究に従事する科学者が考える重要な要素である。成長因子には、ヒトを供給源として得られるものもある。

現在の生体外食肉生産は、細胞ベースのビーフ、ポーク及び家禽肉といった商品肉は、大抵の種類をカバーしている。しかしながら、これらの種類の食肉は、現在の生物医学技術の技法を用いて生産するのが困難であって費用もかさむ複数の細胞腫を含む複雑な組織の有機体を有する。細胞培養技法で生産される食肉においてタンパク質レベルとバイオマス産出高を上げるための非GM（非遺伝子組み換え）方法もまた欠如している。更には、上述の通り、現在の細胞培養技術は、栄養源としての動物成分（例えば、FBS）並びに高価な非食品グレードの成長因子に依存している。

ヒトの消費に加え、食肉は、しばしば、スキンケア、化粧品、及び傷手当て製品のための動物由来の原料を生産するのに用いられる。例えば、スキンケア、化粧品、及び傷手当て製品は、しばしば、皮膚組織の回復や再生を刺激する、成長因子、サイトカイン、及び細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を包含している。それらは、皮膚に潤いを与え、皺を減らすヒアルロン酸誘導剤；加齢に関係する酸化ストレスに対する保護のための抗酸化剤を含み得る。活性成分は、ほとんどが野生の動物や野生の植物から得られている。しかしながら、野生の動物や野生の植物に由来する派生原料を作るには、以下の欠点が伴う。

第一に、動物源及び植物源からの不断の供給が必要である。動物製品の需要の増加によって、より多くの動物が、養殖場や屠殺所で、苦しみ、殺されることとなる。保有する家畜を増やすと、環境やエコシステムに更なる負荷を加えてしまうことにもなる。更には、動物の虐待や、動物の厚生の問題をも提起するものでもある。

第二に、ターゲットとするタンパク質しか抽出されず、野生の動物や野生の植物において生産されたその他の機能的なタンパク質の残りは、浪費されてしまう。通常、野生の動物や野生の植物から、ある、ターゲット/対象とするタンパク質を抽出して、派生原料とする。その他の残りのタンパク質や栄養素は、抽出プロセスでは捕獲されない。しかしながら、これらの微量の機能性タンパク質を派生原料に含めておくことも望ましく、それと言うのも、そのような機能性タンパク質は、ある目的について成果を高め得るものであるからである。例えば、オレンジの栄養は、トータルでの方が、オレンジから抽出されたビタミンCだけと比べて、ある目的について、ヒトに対してより有益である。更には、何らかの有用な部分を得るためだけに動物を飼育するか植物を育てるかして、派生原料とするのは、極めて非効率である。

第三に、有害な薬品の使用と関わってしまう。例えば、魚の皮からコラーゲンを抽出することは、魚の皮をアルカリ性や酸性の溶液と混ぜるステップを含む一連のステップに関わることである。これによって、環境やエコシステムには追加の負担がかかってしまう。又、それは、潜在的には、業務上の危険に寄与するものでもある。派生原料にもまた、有害な薬品が含まれているかも知れない。

第四に、環境汚染物（重金属、抗生物質、マイクロプラスチック、除草剤、防カビ剤、殺虫剤）、外来性感染性因子（バクテリア、ウイルス、菌類、伝達性海綿状脳症感染性因子）、及び野生動物及び野生植物におけるアレルゲンの存在による安全への懸念がある。

第五に、分子プロフィールを制御して、動物由来（例えば、動物血清）の、及び植物由来（例えば、植物エキス、植物加水分解物）の原料の濃度を測定するのは困難である。動物由来の、及び植物由来の原料の各バッチは、動物、及び植物の異なるバッチからできており、温度、収穫時期、動物の飼料や肥料の種類、有害生物や寄生生物の存在などの違いによって、大きく偏向し得る。特定のバッチにおける分子によっては、ある個人においてアレルギー反応を引き起こすかも知れないものもある。

更には、第六に、動物由来の、及び植物由来の原料が、野生の動物、及び野生の植物から得られるならば、その起源をたどるのは非常に困難である。

代わりに、組換え有機体を用いて派生原料を作っても良い。しかしながら、この方法は、遺伝子組換え有機体の使用と関係しており、そのような有機体が偶然放出されると、環境に有害であり得る。更には、生産ラインごとに一つの（１）タンパク質しか生産されない。この方法は、原料に由来する複数のタンパク質について非効率である。加えて、組換え有機体によって生産されるタンパク質は、更に分離されて精製されなければならない。分離と精製は、典型的には、複数のステップを含んでおり、生産費の上昇をもたらす。更には、この方法によって生産されるタンパク質には折り重なりの変種がある。変種の中には、いくつかの機能が失われているものもある。

代わりに、使用した培地も、機能タンパク質源であって良い。しかしながら、上記の方法と同じように、いくつかの欠点がある。第一に、動物源及び植物源を不断に供給することが必要である。それが不利な点は、上記で説明しているので、ここでは繰り返さない。第二に、環境汚染物（重金属、抗生物質、マイクロプラスチック、除草剤、防カビ剤、殺虫剤）、外来性感染性因子（バクテリア、ウイルス、菌類、伝達性海綿状脳症感染性因子）、及び野生動物源及び野生植物源におけるアレルゲンの存在による汚染の懸念がある。第三に、使用した培地の、望まない代謝産物や廃棄物が、最終製品の純度に影響を及ぼすかも知れない。精製ステップを追加すれば、生産費の上昇をもたらしてしまう。

本開示の例は、前記課題を解決する、ヒトが消費する生体外食肉の生産方法に適用される。

本発明の目的は、制御されたプロセスのもと、動物由来の原料、及び/又は植物由来の原料を得る代替の方法を提供することである。本発明による派生原料は、環境汚染物、外来性感染性因子、及びアレルゲンが含まれていない。又、動物由来の材料の生産に関係する動物の苦痛や犠牲を制限するのにも役立っている。

細胞加水分解物は、しばしば、派生原料から抽出され、スキンケア、傷手当て製品、化粧品、又は食品における活性成分として適用される。細胞加水分解物には、ヒアルロン酸が含まれる。ただし、それに限定される訳では無い。前述の通り、本発明の更なる目的は、スキンケア、傷手当て製品、化粧品、食品、サプリメント、薬品、及びその他の医薬用品を含むが、それらに限定されるものではない種々の製品を作る上で、より効率的かつ環境にやさしいプロセスを提供することである。それによってまた、そのような製品についての、バッチからバッチへの一貫性、及び製品の追跡可能性が向上する。

また、本発明の目的は、スキンケア、傷手当て製品、化粧品、食品、サプリメント、薬品、及びその他の医薬用品を含むが、それらに限定されるものではない種々の生産業/製品において、消費者又は製造業者にとっての更なる価値を創り出すことであり、と言うのも、それは同時に、従来の、派生原料を作る方法（すなわち、野生の動植物、組換えDNA有機体、及び使用済み培地からの抽出）が遭遇する全ての欠点を解決するからである。本発明により以下の利点が得られる。
(1) 動物源、及び/又は植物源に依存しない；
(2) 遺伝子組換え有機体に依存しない；
(3) 対象とする細胞が自然に生産する全ての機能性タンパク質を捕獲する；
(4) 純度（製品における浪費がない）；
(5) 有害な薬品を使用しない；
(6) 単純な下流プロセスで、それによって費用が下げられる；
(7) 単一の使用/機能/作用ではなく、多機能である。

本発明の利点によって、消費者のニーズに合致する新しい価値が作り出される。それによって、種々の製品の活性成分、又は製品そのもの（スキンケア、傷手当て製品、化粧品、食品、サプリメント、薬品、及びその他の医薬用品を含むが、それらに限定されるものではない）に以下の特性が備わる。
(1) 派生原料が、高純度であって、無駄な物や有害な薬品が存在していないことによる、すっきりしたラベル；
(2) 動物源、及び/又は植物源に、ほとんど依存しないか、低度にしか依存しないことによる持続可能性；
(3) 生体材料を用いることによって化学合成がないこと；
(4) 対象とする細胞が自然に生産する機能タンパク質を備える完全分子プロフィールのために多機能である；
(5) 科学的な原理や試験の結果に支持されている。

本発明の開示の例によると、生体外細胞培養による食肉生産の方法には、動物又は植物を供給源として組織を分離し、細胞から細胞懸濁液を作るステップが含まれる。その方法には更に、培養基における食品グレードの骨組上で細胞を育てて、細胞を、動物の臓器を模した固体又は半個体の構造物へと成長させるステップが含まれる。
加えて、その方法には更に、タンパク質の発現を規制する一つ以上のマイクロRNAのレベルを変えることによって、成長している細胞におけるタンパク質の発現を増やすステップも含まれる。

本発明の開示の他の一例によると、生体外細胞培養による食肉生産の方法には、植物又は動物を供給源として組織を分離し、細胞から細胞懸濁液を作り、かつ培養基における食品グレードの骨組上で細胞を育てて、細胞を、動物の臓器を模した固体又は半個体の構造物へと成長させるステップが含まれる。その方法には更に、前記細胞を、栄養素、成長因子、及び細胞の成長をサポートするサイトカインを分泌する生体工学的に作り出された細胞と同時培養するステップが含まれる。

本発明の開示の他の一例によると、生体外細胞培養によって細胞加水分解物を生成する方法には、(i)音波処理を用いて細胞を溶解し、その細胞中のタンパク質を放出させ、(ii)プロテアーゼを用いてそのタンパク質を消化し、500ダルトン(Da)より分子サイズの小さい短いペプチドを生産し、(iii)プロテアーゼを15分間、摂氏95度に加熱するか、PBSを用いてプロテアーゼを100倍に希釈するかして、消化ステップを終結させ、そして(iv)消化終結ステップから得られる混合液を薄膜フィルターで無菌濾過するステップが含まれる。

図面の簡単な説明を以下に記載する。

添付した図面を関連させて考慮すると、本開示は、詳細な説明を参照することで、よりよく理解される。図面中の構成要素は、必ずしも一定の尺度に応じておらず、むしろ、開示の本質を例証することに重点が置かれている。

図１は、本開示の一例による、生体外細胞培養による食肉生産の方法のフローチャートである。

図２は、本開示の一例による、タンパク質発現の転写後増強の方法を概略的に描写する図である。

図３は、本開示の一例による、コラーゲン、タイプ１、アルファ１(COL1A1) 発現の転写後増強の方法を概略的に描写する図である。

図４は、本開示の一例による、コラーゲン、タイプ１、アルファ２(COL1A2) 発現の転写後増強の方法を概略的に描写する図である。

図５は、本開示の一例による、固相サポートを有する生体外食肉生産に用いられるバイオリアクターの概略的又は概念上の断面図である。

図６は、本開示の一例による、図５に類似するが第二の固相を有するバイオリアクターの概略的又は概念上の断面図である。

図７は、本開示の一例による、生体外細胞培養から細胞加水分解物を生成する方法のフローチャートである。

図８は、本開示の一例による、細胞加水分解物のヒト皮膚細胞への効果を評価する方法のフローチャートである。

図９は、加水分解物への露呈に際しての皮膚細胞ラミニン発現を描写するチャートである。

発明の詳細な説明
生体外食肉生産

次に図面を参照し、とりわけ、図１を参照すると、生体外食肉生産の方法10が示されている。ここで用いられている通り、「生体外食肉生産」とは、細胞培養技法を用いて動物及び/又は植物の組織を実験室で育て、食肉及び食肉製品を製造する、細胞ベースの食肉生産プロセス又は細胞ベースの畜産プロセスのことを指して言うものである。ブロック12で、動物又は植物から組織が分離される。一例において、その組織は、ハタ、スズキ、又はニベと言った海水魚を含む硬骨魚綱の硬骨魚から得られる。他の例においては、牛組織のような他の種類の動物組織が分離される。例によっては、ブロック12には、魚から浮き袋のような臓器組織を収集して細胞懸濁液を作ることが含まれる。以下の説明では、魚を供給源として得られる組織が主に記述されているが、この概念を、他の種類の動物及び/又は植物を供給源として得られる組織に適用して、他の種類の生体外食肉及び/又は動物タンパク質製品、及び菜食主義者用食肉及び/又はタンパク質製品が提供されるようにしても良いことは理解されるものである。

分離される細胞の多くは成体細胞で、医療研究において確立された種々の方法を継続的に用いて増殖させることが可能である（ブロック14）。例えば、山中因子のような特定の遺伝子を用いて、成体細胞を人工多能性幹細胞（iPS細胞）のような幹細胞へとプログラムし直してもよい。代わりに、分離された成体細胞を、テロメラーゼ逆転写酵素過剰発現によって連続株細胞へと変換しても良い。他の例においては、他の種類の細胞が、成体幹細胞や胚性幹細胞のように分離されても良い。この点について、本開示の方法には、あらゆる株細胞が供給源として含まれる。

次のブロック16では、バイオリアクターのような無菌室又は無菌容器において、食品グレードの生体適合骨組に付着/固着することによって、細胞が、魚臓器のような動物臓器を模した固体又は半固体構造体へと成長する。無菌室又は無菌容器は、温度制御され、化学薬品、栄養素、及び細胞のような物質を導入して取り除くための導入口と排出口を有していて良い。食品グレードの生体適合骨組は、最終可食製品の一部となり、アガロース、アルジネート、キトサン、菌糸体、及びコンニャクグルコマンナンと言った植物ベース又は菌類ベースの材料で作られる。ただし、材料が、それらに限定される訳では無い。アルジネートは、褐藻から自然に得られるバイオポリマーであって、生体適合性がある。加えて、菌類から得られる植物ベースのキトサンは、抗菌性を有する。例によっては、無菌容器において、抗生剤や抗菌化合物の無いままブロック16が行われる。ブロック18は、細胞の生存と成長をサポートするための、培養基のバイオリアクターへの供給に関する。培養基は、無機塩（例えば、塩化カルシウム(CaCl₂)、塩化カリウム(KCl)、塩化ナトリウム(NaCl)、重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)、リン酸二水素ナトリウム(NaH₂PO₄)、硫酸マグネシウム(MgSO₄)、等々）、アミノ酸、ビタミン（例えば、チアミン、リボフラビン、葉酸、等々）と言った成分、及びグルコース、β-メルカプトエタノール、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)及びピルビン酸ナトリウムと言ったその他の成分を含む緩衝溶液であって良い。ただし、成分が、それらに限定される訳では無い。限定されない成長培地には、例として、ライボビッツL-15培地、イーグル最小必須培地(MEM)、培地199、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、ハムF12培地、ハムF10培地、マッコイ5A培地、グラスゴー改変イーグル培地(GMEM)、イスコヴ改変ダルベッコ培地、及びRPMI 1640が含まれるが、それらに限定される訳ではない。

植物組織/細胞を用いるならば、培養基は、アミノ酸、塩、ビタミン、成長因子、炭水化物、硝酸肥料、及びpHを制御するための緩衝システムなど、植物細胞の増殖に必要な成分を含んで良い。培養基は、ムラシゲ＆スクーグ(MS)培地、リンスマイヤー＆スクーグ(LS)培地、ガンボーグ(B5)培地、ニッチ＆ニッチ(NN)培地、及びホワイトの培地であって良い。

ブロック20によると、食品グレードの成長因子及びサイトカインが、バイオリアクターの培養基に導入されて、細胞の成長と増殖をサポートする。成長因子及びサイトカインには、インシュリン成長因子1(IGF-1)、インシュリン、インターロイキン6(IL-6)、インターロイキン6受容体(IL-6R)、インターロイキン11(IL-11)、線維芽細胞成長因子(FGF)、表皮成長因子(EGF)、及びトランスフェリンが含まれるが、それらに限定される訳ではない。ブロック20は、牛胎児血清(FBS)無しでの、生体工学的に作り出された細胞の、分離された細胞との同時培養に関する。生体工学的に作り出された細胞は、前記成長因子とサイトカインを分泌するように作り出されており、これらの生体分子を、分離された細胞に、成長と増殖に必要なだけ供給する。ここで用いられている通り、「生体工学的に作り出された」細胞は、遺伝子組換え細胞と同等ではない。生体工学的に作り出された細胞は、一つ以上の特定のタンパク質を過剰発現する特定の遺伝子を有する。生体工学的に作り出された細胞は、魚の細胞又は、牛の細胞と言った、他の種類の動物の細胞であって良い。生体工学的に作り出された細胞は、最終食肉製品には含まれない。限定のない例として、生体工学的に作り出された魚の細胞が、分離された魚の細胞と同時培養されても良く、あるいは、生体工学的に作り出された牛の細胞が、分離された牛の細胞と同時培養されても良い。本発明の開示の同時培養方法によると、培養基において、動物由来である牛胎児血清(FBS)が必要で無くなる。更には、その同時培養方法によって、食品グレードの、特定の成長因子とサイトカインが、成長する細胞に本来の位置で継続的に供給され、製造プロセスが簡素化され、その費用が低減される。しかしながら、他の例においては、ブロック16では、細胞の成長をサポートするために、FBS、又はその他の血清を用いて、成長因子、サイトカイン、及びその他の栄養素を供給しても良い。

加えて、ブロック22によると、細胞中のタンパク質発現が増大して、結果として得られる食肉製品のバイオマス産出高が増大する。ここで用いられている通り、「バイオマス産出高」は、結果として得られる食肉製品において、消費の際にエネルギーの産出に利用可能な消化できる材料（例えば、タンパク質）の量のことを言う。更に具体的には、ブロック22は、培養に先立って細胞の操作を行うことで、細胞におけるマイクロRNAレベルを変えてタンパク質発現を増大させることに関する。マイクロRNAは、転写後遺伝子発現の規制に関係する、内因性の、短い、非符号化単一撚線RNAシーケンスである。ブロック22は、メッセンジャーRNA(mRNA)翻訳を促進することによってタンパク質発現を増大させるマイクロRNAの上方制御の量を増やすこと、及び/又はmRNA翻訳を抑制することによってタンパク質発現を低減するマイクロRNAの下方制御の量を減らすことに関する。マイクロRNAレベルは、マイクロRNA、マイクロRNAミミック、又はマイクロRNAインヒビターを細胞に導入することによって、増やされたり減らされたりする。マイクロRNAミミックは、マイクロRNAと同じ機能を有するが、タンパク質発現を変える上で、より安定していてより効率的である。例によっては、エレクトロポレーションを用いて、特定のマイクロRNAを発現する命令を伝える細胞にエピソーマルベクターを導入する。代わりに、あるいはこれと組み合わせて、特定のマイクロRNAを発現するエピソーマル命令を伝える媒体としてアデノ随伴ウイルスを用いる。ターゲットとしたマイクロRNAの下方制御の量の低減は、ターゲットとしたマイクロRNAのインヒビターをトランスフェクションで細胞に導入することによって達成される。ここで、本開示による、タンパク質発現/バイオマス産出量を増大する方法は、細胞のゲノムを変えずに実施されることに注意する。

図２には、細胞株のタンパク質発現を転写後に高める方法が、概略的に描写されている。一つ以上の上方制御マイクロRNA(miRNA)を増大させて、mRNA翻訳と選択されたタンパク質のタンパク質生産を増やす。代わりに、又はこれと組み合わせて、一つ以上の下方制御miRNAをインヒビター(anti-miRNA)でブロックしてmRNA翻訳と選択されたタンパク質のタンパク質生産を増やしても良い。

魚の浮き袋は、主には、線維芽細胞とコラーゲンタンパク質を含んでいる。コラーゲンタイプ1（コラーゲンI）が、魚の浮き袋において主要なタンパク質であり、培養された魚の浮き袋細胞においてコラーゲンIの発現を増大させると、バイオマス産出量が増える。魚の浮き袋細胞におけるコラーゲンIには、コラーゲン、タイプ１、アルファ１（COL1A1）とコラーゲン、タイプ１、アルファ２（COL1A2）とが含まれている。miR-21のレベルが増大すると魚の浮き袋細胞におけるCOL1A1とCOL1A2の生産が増えると言うように、COL1A1とCOL1A2の発現は、上方制御マイクロRNA 21 (miR-21) によって増やされる。加えて、miR-29aのレベルを低下させるかmiR-29aの作用をブロックするかすると、魚の浮き袋細胞におけるCOL1A1とCOL1A2の生産が増えると言うように、COL1A1とCOL1A2の発現は、下方制御マイクロRNA 29a (miR-29a) によって減らされる。図３及び図４には、miR-21のレベルを上げることによる、及び、インヒビター(anti-miR 29a)を用いてmiR-29aの作用をブロックすることによる、COL1A1（図３）とCOL1A2（図４）の生産の増加が示されている。COL1A1とCOL1A2の生産が増えた結果、結果として得られる食肉製品におけるバイオマス産出高が増える。同様の戦略を適用して、他の種類の動物細胞においても関係するタンパク質のレベルが上げられる。

図５には、分離した細胞の培養に用いるのに適例のバイオリアクター30が示されている。バイオリアクター30における無菌室36に保持されている食品グレードの骨組34に備えられる固相サポート32に、細胞が付着して成長する。骨組34は、食肉製品の形を規定する。食品グレードの骨組34は、アガロース、アルジネート、キトサン、菌糸体、及びコンニャクグルコマンナンと言った植物ベース又は菌類ベースの材料で作られる。ただし、材料が、それらに限定される訳では無い。細胞が、固相サポート32の内側表面に付着して成長するように、サポート32は多孔質である。細胞に栄養素を供給する培養基が、導入口38からバイオリアクター30へと導入され、排出口40からバイオリアクター30の外に取り出される。

図６には、図５のバイオリアクター30に類似するが、細かいメッシュ54で固相サポート32から分離される第二の固相52を更に含むバイオリアクター50が示されている。第二の固相52は、本来の位置である固相サポート32上で成長する細胞に、栄養素、成長因子、及びサイトカインを分泌する、生体工学的に作り出された細胞を包含するかサポートし、固相サポート32上の細胞から生体工学的に作り出された細胞を物理的に分離している。第二の固相52は、固相サポート32に類似する植物ベースの材料から作られる。メッシュ54は、栄養素、成長因子、及びサイトカインを透過させるが、細胞は透過させない。図６のバイオリアクター50は、生体工学的に作り出された細胞の、成長する細胞との同時培養を可能にする。例によっては、図５及び図６のバイオリアクター30及び50を縦に並べているものもある。他の例においては、プロセスの規模を拡大するために、バイオリアクター30が数台、バイオリアクター50が数台、又は、バイオリアクター30及び50が混合して、直列に並べられている。バイオリアクター30は、主に、バイオマス生産に用いられ、一方、バイオリアクター50は、成長する細胞に、栄養素、成長因子、及びサイトカインを提供するのに用いられる。

本発明の開示の生体外食肉生産方法によると、細胞が一種類の単純組織有機体を備える食肉製品が提供される。細胞が一種類の食肉製品は、複数種類の細胞を有する他の培養食肉に比べて、製造し、開発し、商品化するのが容易である。本発明の開示の他の例では、複数種類の細胞を有する食肉製品が提供される。更には、出願人は、成長している細胞におけるマイクロRNAレベル又は活性を変えることによって、バイオマス/タンパク質生産を増やす戦略を発見している。一つの例においては、魚の浮き袋の細胞に見られる主要なタンパク質（コラーゲンI）のレベルを高めるために、鍵となる二つのマイクロRNA（miR-21及びmiR-29a）をターゲットとしている。出願人が知る限りでは、培養食肉製品のタンパク質/バイオマス産出高の増大を達成するために、マイクロRNAレベル又は活性を変えることは、培養食肉開発の分野において他の人が使ったことのないものである。タンパク質の生産を増大させるためにマイクロRNAをターゲットとすることによって、既知のノックイン又はノックアウト方法よりも細胞へのストレスが引き起こされなくなる。生体工学的に作り出された細胞は、成長する動物細胞と同時培養され、成長する魚細胞に、本来の位置（in situ）での細胞成長と増殖のための食品グレードの成長因子とサイトカインを供給し、培養基における動物由来のFBSの必要性を低減又は削除する。同時培養技法によって、生産プロセスが簡素化され、生産費用が低減される。

更には、培養された食肉製品の栄養素をカスタマイズして、より健康的な食料製品を生成しても良い。例えば、培養された食肉製品を、栄養士からのダイエット勧告又は当人のゲノム試験に従ってカスタマイズしても良い。食肉製品における、高密度コレステロール、多価不飽和脂肪酸、及び一不飽和脂肪酸と言った健康的な栄養素を、細胞を特定の条件で培養することによって濃縮しても良い。代わりに、又はこれとの組み合わせにおいて、低密度コレステロールや飽和脂肪酸と言った健康を損なうことが知られている栄養素を、細胞を特定の条件で培養することによって低減しても良い。ビタミンやミネラルと言った微量栄養素もまた、強化されても良い。培養された食肉製品の栄養素のカスタマイズは、1) 細胞培養の間に成長する細胞に与えられる栄養素を調整する、及び/又は、2) 積層する骨組の、異なる細胞との比率を制御すると言った様々なやり方で達成される。ただし、そのやり方が、それらに限定されるものではない。

培養食料製品は、清潔、無菌かつ高度に制御されたプロセスの元で生産される。そうして、食料製品における栄養素の、細菌や菌類と言った微生物による望ましくない劣化を最小限のものとする。微生物が栄養素を分解することによる望ましくない風味や臭いもまた最小限のものとされる。この特性によって、培養食品の、料理での新しい使い方が可能となり、新しいレシピを作り出すのに役立つ。培養食品を、そのように適用した一例が、魚の浮き袋から得られる魚の培養食道である。伝統的な魚の食道には、生産プロセスにおいて細菌がアミンを分解するために、望ましくない魚臭い風味と匂いがある。この望ましくない特性のために、食品の材料としては、熱いか温かいまま出されて風味のある料理に限定される。細胞培養技法で生産される魚の培養食道は、望ましくない魚臭さや匂いがない。熱くて風味のある料理に加え、魚の培養食道は、デザートとして、あるいは、冷やして又は環境温度で直ぐに食べられる形で出される甘い料理にも用いることができる。

生体外培養による細胞加水分解物の生成

本発明の生体外食肉生産によって生産された製品は、動物由来の原料、又は植物由来の原料を生産するのに用いられる。そのような派生原料のヒトによる消費の他に、これらを、スキンケア、傷手当て製品、化粧品、食品、サプリメント、薬品、及びその他の医薬用品を含むが、それらに限定されるものではない種々の製品において用いることもできる。本発明の生体外食肉生産によって生成される製品の、動物由来の、及び/又は植物由来の原料は、野生の動物又は植物から作られるものと比べて、多くの利点を有する。

第一に、細胞は、汚染や病気を含まない条件のもとで育てられるので、培養基は、環境汚染物（重金属、抗生物質、マイクロプラスチック、除草剤、防カビ剤、殺虫剤）、又は外来性感染性因子（バクテリア、ウイルス、菌類、伝達性海綿状脳症感染性因子）を含まない。その結果、生成された動物由来の原料、又は植物由来の原料もまた、汚染や病気を含まない。

第二に、動物成分を含まず、化学的に定義される培地を用いることで、ユーザーがアレルギー反応を引き起こしてしまう機会が低減する。これが成し遂げられるのは、培地における動物の血清と、動物由来の成長因子（例えば、牛インシュリン）を遺伝子組換え成長因子で置き換えることによってである。化学的に定義される培地においては、植物エキス/加水分解物は必要とされない。

第三に、動物由来の原料、又は植物由来の原料のバッチからバッチへの一貫性が大きく向上する。これは、基礎培地の栄養プロフィール（炭水化物、アミノ酸、ビタミン、ミネラル）が既知であって一貫しており、化学的に定義される培地を、すなわち、全ての栄養素と成長因子の濃度が既知の培地を用いることで、更に精製されるからである。

第四に、追跡可能性が向上する。全ての培養基成分についてサプライチェーンが既知であるので、全てのものを簡単に起源までさかのぼることが出来る。

第五に、動物の苦痛や犠牲を低減する。生産プロセスを動かすのに、野生動物の動物組織を継続的に供給する必要がない。最初は、動物組織の小片から、スターター細胞を精製して、細胞株に発育させるが、それは、培養基において低温保存するか無期限に増殖させられる。これにより、動物の苦痛や犠牲が制限される。

第六に、無駄を減らし、効率を高める。培地の栄養素は、細胞の成長のために直接細胞に供給される。培養する細胞を全て溶解して、細胞加水分解物を生産する。動物/植物の使用されない部分の成長や、動物の交尾や運動といった生命の変遷のために、エネルギーや栄養素を浪費しない。

更には、本発明は、スキンケア、傷手当て製品、化粧品、食品、サプリメント、薬品、及びその他の医薬用品を含むが、それらに限定されるものではない種々の生産業/製品において、消費者又は製造業者にとっての価値を創り出し、と言うのも、背景技術の項で記述した通り、従来の方法において遭遇する全ての欠点に対処するからである。本発明により以下の利点が得られる。

第一に、動物源の継続的な飼育に依存しない。例えば、通常の方法を介してコラーゲンをベースとするクリームをより多く生産するには、動物の身体部分がより多く必要であって、それは、結果として、更なる動物の苦痛や犠牲になり得る。本発明においては、スターター細胞（幹細胞、筋肉細胞、線維芽細胞、脂肪細胞に限らない）を、動物組織の小片から精製して細胞株へと確立する。細胞株は、低温保存して液体窒素中に蓄積できる。必要な時に、細胞株を解凍して、細胞培養条件のもと無期限に増殖して、活性成分（例えば、成長因子、ECM分子）を生産できる。従って、全プロセスが、自立して持続可能であって、動物の苦痛/犠牲をほとんど引き起こさない。

第二に、動物源に依存しない。本発明においては、スターター細胞（幹細胞、筋肉細胞、線維芽細胞、脂肪細胞に限らない）を、動物組織の小片から精製して細胞株へと確立する。細胞株は、遺伝的に改変されない。

第三に、本発明の派生原料は、多機能であり、と言うのも、それは、主要なターゲットのタンパク質に加えて、多くの機能性タンパク質を痕跡量だけ含むからである。そのような痕跡量の機能性タンパク質は、多くの細胞機能にとって不可欠である。抽出された野生の動物/植物の一部により近い機能性タンパク質プロフィールをもつ派生原料から作られる製品は、一般に、より未完成の機能性タンパク質プロフィールをもつ派生原料から作られる製品よりも優れた性能を有する。外から補充して機能性タンパク質を派生原料に加えることもできるが、多数の機能性タンパク質を補充するのは困難である。また、補充の数とともに費用が増大する。

第四に、本発明により作られる機能性タンパク質には、無用なものが含まれておらず、と言うのも、成長培地の成分が十分に制御されているからである。

第五に、本発明により作られる派生原料には、有害な化学薬品が含まれておらず、と言うのも、機能性タンパク質を、有害な化学薬品を用いて抽出するのではないからである。成長培地の成分は十分に制御されている。

第六に、本発明により作られる機能性タンパク質には、無用なものや有害な化学薬品が含まれておらず、従って、さらに分離したり精製したりする必要がない。それゆえ、生産費用を下げることができる。

本発明の利点によって、消費者のニーズに合致する新しい価値の創造が可能となる。それによって、種々の製品の活性成分、又は製品そのもの（スキンケア、傷手当て製品、化粧品、食品、サプリメント、薬品、及びその他の医薬用品を含むが、それらに限定されるものではない）に以下の特性が備わる。
(1) 派生原料（derived law materials）が、高純度であって、無駄な物や有害な薬品が存在していないことによる、すっきりしたラベル；
(2) 動物源、及び/又は植物源に、ほとんど依存しないか、低度にしか依存しないことによる持続可能性；
(3) 生体材料を用いることによって化学合成がないこと；
(4) 対象とする細胞が自然に生産する機能タンパク質を備える完全分子プロフィールのために多機能である；
(5) 科学的な原理や試験の結果に支持されている。

ここで図面を参照し、生体外細胞培地から細胞加水分解物を生産する方法について、特に図７を参照する。細胞成長ステップ100において、細胞は、部分的に定義されるか（すなわち、FBS/植物加水分解物/ヒト血小板溶解物が補充された定義される基礎培地）、又は動植物成分を欠いている化学的に定義される培地（すなわち、全ての栄養素と成長因子の濃度が定まっている培地）である培養基を用いて制御された条件のもとで最初に育てられる。例によっては、成長培地（DMEM/F12+10%FBS）に、細胞を、4×10⁴個/cm²で接種して、加湿された培養器（34℃; CO₂ 5%、空気 95%）の中に保つものもある。また例によっては、本発明の生体外食肉生産方法10を用いて、細胞を育てるものもある。更に、例によっては、細胞成長ステップ100において、少なくとも一つの細胞株を用いても良い。また例によっては、細胞株には、幹細胞、筋肉細胞、線維芽細胞、及び脂肪細胞が含まれるものもある。なお、特定の一例においては、細胞成長ステップ100において、培養された魚の浮き袋細胞を用いる。

細胞のコンフルーエンスが少なくとも90%に達すると、分離ステップ102が始まる。分離ステップ102においては、細胞が付着している表面から、トリプシン/EDTA又はその他の遺伝子組換えプロテアーゼ（例えば、遺伝子組換えコラゲナーゼIV、TrypLE Express (試薬、登録商標)）を用いて、細胞を分離する。例によっては、コンフルーエンスが90%に達すると、成長培地を取り除く。細胞を、一旦PBSで洗い、CO₂培養器中においてトリプシン/EDTAでの処理によって分離する。細胞が取り除かれると、成長培地を加えることでトリプシンの活性を止める。細胞懸濁液を50 ml管に収集する。

そして、分離ステップ102から得られた混合物を、遠心分離ステップ104において、400×gで5分間、遠心分離機にかける。上澄みを取り除く。細胞の小球を基礎培地（例えば、DMEM/F12）において再懸濁する。残りの細胞懸濁液を、前もって重さを計っておいた50 ml管に移す。細胞を、400×gで5分間、遠心分離機にかける。そして、上澄みを取り除く。再度、管の重さを計る。細胞の数と細胞の小球の質量を記録する。更に例によっては、Countess II Automated Cell Counterを用いて細胞の濃度を測定し、細胞加水分解物の次のバッチを作るために細胞の一部を接種する。

遠心分離で、細胞の小球を得るが、これを-80℃で蓄積しても良い。

再懸濁ステップ106において、細胞の小球はPBSに懸濁される。例によっては、細胞の小球が1 mlのPBSに懸濁されるものもある。

溶解ステップ108において、ステップ106からの細胞を、音波処理によって溶解する。例によっては、Branson Digital Sonifier S450D（振幅=25%; 15秒オン15秒オフ、合計=10サイクル）を用いて、細胞懸濁液を音波処理することによって細胞を溶解するものもある。管を氷で冷やす（すなわち、音波処理は、およそ摂氏ゼロ度である）。

音波処理による細胞の溶解に続けて、可溶部を細胞の残屑から分離する。可溶部中のタンパク質は、消化ステップ110で、酵素によって短い機能性ペプチドに消化される。選択される望ましいプロテアーゼを、37℃で1-2時間、可溶部に加える。例によっては、プロテアーゼは、プロテイナーゼKである。短いペプチドが好まれる（すなわち、分子サイズが500ダルトン(Da)より小さい）が、それは、分子サイズが500ダルトン(Da)より大きな分子は、最も外側の表皮を効果的に通り抜けて、下に横たわる皮膚層に吸収されないからである。例によっては、プロテアーゼの適量を細胞懸濁液に加えて、細胞タンパク質をより小さなペプチドへと分解する。消化を1-2時間行って、管を37℃の水の中に浸けておく。10分毎に管を振って混ぜる。

消化ステップ110の後、続いて、第二の遠心分離ステップ112において、消化ステップ110からの混合物を20000×gで30分間、遠心分離機にかける。例によっては、中身を1.5 mlマイクロ遠心分離管に移す。マイクロ遠心分離管からの上澄みを50 ml管に組み合わせる。マイクロ遠心分離管の小球をかき乱さないようにする。

停止ステップ114において、続いて、上澄みを95℃に15分間加熱して、酵素の消化活動を停止させる。あるいは、上澄みにPBSを加えて、希釈によって酵素の消化活動を停止させる。例によっては、希釈は、100倍でなければならない。

濾過ステップ116において、停止ステップ114からの混合物における加水分解物は、0.2μm PVDF薄膜フィルターで無菌濾過される。

最終ステップ118において、濾過ステップ116から得られる加水分解物を、局所的な試薬として、スキンケア、化粧品、及び傷手当て製品に適用しても良い。加水分解物はまた、スキンケア、傷手当て製品、化粧品、食品、サプリメント、薬品、及びその他の医薬用品を含むが、それらに限定されるものではない様々な製品において、活性成分として用いても良い。加水分解物を直ちに用いないのであれば、例によっては、それを摂氏-20度で蓄積しても良い。

培養した細胞からの加水分解物は、栄養素が豊富であって、皮膚細胞の修復や再生を刺激する複数のタンパク質因子を含み、かつ分子サイズが500ドルトン(Da)より小さい。本発明の加水分解物は、皮膚の深層（真皮、下皮）に到達して効果を発揮でき、と言うのも、本発明の加水分解物は、角質層を通り抜けるのに十分なだけ小さく、又、成長因子やサイトカインの機能上の活性を引き出すための、それらの、主要なタンパク質ドメインを維持しているからである。

加水分解物の効能を、ヒトの皮膚細胞で更にテストする。

ここで図面を参照し、ヒトの皮膚細胞への細胞加水分解物の作用を評価する方法については、特に図８を参照する。

接種ステップ200において、完全成長培地にヒトの細胞を接種する。例によっては、ヒトのケラチン生成細胞の細胞株(HaCaT細胞)、又は、ヒト包皮線維芽細胞(BJ細胞)をこの目的で使うこともできる。完全培地（例えば、DMEM/F12 + 10% FBS）において、24ウェル/96ウェルプレートに細胞を接種し、次の日にそれらが80 - 90%コンフルーエンスに到達するようにする。

接種ステップ200の後、少なくとも一日経って、加水分解物添加ステップ202において、ヒト細胞に細胞加水分解物を加える。このステップ202を行うのは、ヒト細胞が、少なくとも80%コンフルーエンスに到達するときである。好ましくは、このステップ202を行うのは、ヒト細胞が、少なくとも90%コンフルーエンスに到達するときである。例によっては、完全培地、又は血清を含まない培地（例えば、DMEM/F12）を用いて、細胞加水分解物を、0.1%から10%までの望ましい濃度範囲に、好ましくは1%に、希釈する。更なる例によっては、ウェル中の古い培地を、対照培地（すなわち、基材対照）、又は希釈した細胞加水分解物を含む培地と置き換える。

ステップ202の後、培養ステップにおいて、細胞を、加湿した培養器に戻して、6 - 24時間置く。例によっては、細胞を、加湿した培養器（37℃; CO₂ 5%、空気 95%）に戻して、6 - 24時間、好ましくは18時間置く。

そして、RT-PCRを用いてターゲットの遺伝子発現を研究するために、細胞から全RNAを収穫する。あるいは、加水分解物で処理をした後の細胞増殖は、CyQUANT細胞増殖アッセイ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で研究できる。

ターゲットの遺伝子発現の査定

以下のステップを行なって、皮膚細胞からのターゲットの遺伝子発現を査定する。

全RNA抽出ステップ206において、以下のサブステップを行う。
1. 形質移入後6-24時間で、製造業者の指示に従って、PureLink RNA ミニキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使い、細胞単一層から全てのRNAを抽出する。
2. ウェルから培地を取り除く。細胞を一旦PBSで洗って、PBSを取り除く。
3. 2-メルカプトエタノールを1%含む溶解緩衝液を300μlウェルに加える。ピペットでの吸い取りと吐き出しを10回繰り返して、細胞を溶解する。
4. 溶解物を、清潔な1.5 mlのマイクロ遠心分離管に移す。最高速度で１分間、管を旋回させる。
5. 2600×gで5分間、管を遠心分離機にかける。上澄みを収集して、清潔な1.5 mlのマイクロ遠心分離管に移す。
6. 70%のエタノールを一分量、細胞溶解物の各分量に加える。混合物を旋回させて、それをスピンカートリッジ（収集管を備える）に移す。
7. 室温、12,000×gで15秒間、遠心分離機にかける。フロースルーは、廃棄する。スピンカートリッジを同じ収集管に再挿入する。
8. Wash Buffer Iを350μl、スピンカートリッジに加える。室温、12,000×gで15秒間、遠心分離機にかける。フロースルーと収集管は、廃棄する。スピンカートリッジは、新しい収集管に入れる。
9. Purelink DNaseを用いるカラムでのDNase処理によって、ゲノムのDNA汚染物を取り除く。以下の表１に示されるようにDNase混合物を調製する。DNase混合物80μlをカラム薄膜に加えて、室温で15分間、培養する。

10. Wash Buffer Iを350μl、スピンカートリッジに加える。室温、12,000×gで15秒間、遠心分離機にかける。フロースルーと収集管は、廃棄する。スピンカートリッジは、新しい収集管に入れる。
11. Wash Buffer IIの15 ml当たり、分子生物学グレード100%のエタノール60 mlを加えることによってWash Buffer IIを前もって調製する。エタノールを含むWash Buffer IIを500μl、スピンカートリッジに加える。
12. 室温、12,000×gで15秒間、遠心分離機にかける。フロースルーは、廃棄する。スピンカートリッジを同じ収集管に再挿入する。
13. サブステップ9-10を一度繰り返す。
14. 室温、12,000×gで2分間、遠心分離機にかけて、RNAが付着した薄膜を乾燥させる。収集管を廃棄して、スピンカートリッジを、回復管に入れる。
15. RNaseを含まない水30μlを、スピンカートリッジ薄膜の中央に加える。2分間待つ。室温、12,000×gで2分間、遠心分離機にかけて、RNA溶出液を収集する。
16. Nanodrop 2000でRNAの濃度を定量化する。精製したRNAが良品質であるなら、A260/A280及びA260/A230の比が >1.8 であるべきである。更には、Agilent 2100バイオアナライザー(Agilent)で分析するとき、RNA完全性番号(RIN)は、>=7（完全なRNAについてRIN=10）であるべきである。
17. 第一撚線cDNA合成へと進行するまで、氷でRNAを冷やしておく。

ステップ206が完了すると、第一撚線cDNA合成ステップ208が行われ、それには、以下のサブステップが含まれる。
1. 製造業者のプロトコールに記述されているのと同様に、MMLVRT(RNase H-)酵素(Excell Bio)を用いて全RNAから第一撚線cDNAを合成する。
2. 逆転写反応の各々について、表２に示されるように、全RNA、オリゴ(dT)20プライマー、及びRNaseを含まない水を、氷で冷やしているPCR管の中で混ぜる。

3. （任意）サンプルの一つの余分な反応を非RT対照となるように設定する。これを用いて、実時間定量PCRの後、ゲノムのDNA汚染物についての試験を行える。
4. 反応混合物を70℃で10分間加熱する。一方、表３に示されるように、RTマスター混合物と非RT対照混合物を設定する。ピペットによる過失を埋め合わせるために、少なくとも一つの余分な反応分のRTマスター混合物を忘れずに調製すること。

5. 10分間加熱した後、サンプル反応管を２分間氷で冷やす。卓上遠心分離機を用いて素早く回転させ、管の中身を管の底に寄せ集める。
6. RTマスター混合物を10μl、各サンプルに加え、非RT対照混合物を10μl、非RT対照に加える。
7. 反応管を50℃で1時間培養して逆転写させる。反応管を70℃で15分間培養し、続いて反応管を氷で冷やすことによって、MMLVRT(RNase H-)酵素を不活性化する。
8. 加圧滅菌したMQ水180μlを加えてcDNAサンプルを希釈する（10×希釈）。希釈したcDNAサンプルを-20℃で保管する。

最後に、RT-PCRステップ210を行う。それには、以下のサブステップが含まれる。
１．Roche LightCycler 480 System (ロシュ・ダイアグノスティックス)を用いる実時間定量PCR (qPCR)によって、ターゲットのサンプル間で比較遺伝子発現を定量化する。PowerUp SYBr Green Mastermix（サーモフィッシャーサイエンティフィック）の試薬と、対象とする遺伝子に特有のプライマーとでPCR反応マスター混合物を設定する。混合物の成分を表４に示す。

表５に、試験する遺伝子の例を示す。

2. 加圧滅菌したMQ水20μlにcDNAを5μl加えることによって、参照cDNAサンプルの5倍希釈を連続して行う（5¹から5⁵までの連続希釈）。qPCRランにおいて標準曲線を測定するための標準液が６通り（5⁰, 5¹, 5², 5³, 5⁴, 5⁵-倍の希釈液）できる。参照cDNAサンプルは、希釈されていないcDNAサンプル20μlとなる。
3. qPCRプレートの各ウェルに何を加えたかを実験記録シートに書き留める。
4. LightCycler マルチウェルプレート96（ロシュ）の各ウェルに、PCR反応マスター混合物を12μl加える。泡を立てないようにする。
5. 実験記録シートに従って、各ウェルに、希釈したcDNAサンプル、標準液、又はMQ水（PCR陰性対照）を8μl加える。泡を立てないようにする。
6. LightCycler マルチウェルプレート96パック（ロシュ）に備わる封止箔で、qPCRプレートを覆う。qPCRの間、蒸発が起こらないよう、全てのウェルが、封止箔で密接に封止されていることを確認する。
7. ベックマン・コールターAllegra 25R遠心分離機（ベックマン・コールター ライフサイエンス）の中において、200×gで遠心分離機にかけ、ウェルの中身をウェルの底に寄せ集める。
8. qPCRプレートをロシュLightCycler 480に入れる。PCRの条件を以下の通り設定する。
(i) UDG活性化
50℃で２分間（傾斜率4.4℃/秒）
1サイクル
(ii) 最初の変性
95℃で２分間（傾斜率4.4℃/秒）
1サイクル
(iii) PCR
分析モード：定量化
95℃で15秒間（傾斜率4.4℃/秒）
55℃で15秒間（傾斜率2.2℃/秒）
72℃で30秒間（傾斜率4.4℃/秒、取得モード：シングル）
40サイクル
(iv) 融解曲線分析
分析モード：融解曲線
95℃で20秒間（傾斜率4.4℃/秒）
55℃で1分間（傾斜率2.2℃/秒）
95℃（傾斜率0.11℃/秒、取得モード：連続、取得：1 ℃当たり５回）
1サイクル
(v) 冷却
4℃∞（傾斜率2.2℃/秒）
1サイクル
9. qPCRランを開始する。
10. qPCRランが完了した後、qPCRプレートを取り出す。以下の基準でqPCRランの有効性を確かめる。
(i) 増幅効率が90 - 105%である。
(ii) 標準曲線の決定係数(R²)は、> 0.99である。
(iii) 融解曲線分析において、単一のピークがある。
(iv) PCR製品が、ゲル電気泳動の後、適正なアンプリコンのサイズの単一のバンドを生じる。
11. 増幅効率を記録する。ターゲットの比較遺伝子発現が、比較ハウスキーピング遺伝子発現（すなわち、Gapdh）に正規化されて、以下に例示されるように、Pfaffl法で計算できる。

ここで、
Ct(A) = サンプルAにおけるターゲット遺伝子のCt値
Ct(B) = サンプルBにおけるターゲット遺伝子のCt値
Ct(a) = サンプルAにおけるGapdhのCt値
Ct(b) = サンプルBにおけるGapdhのCt値

CyQUANT細胞増殖アッセイによる細胞増殖査定

CyQUANT細胞増殖アッセイによる加水分解物で処理した後、細胞増殖を査定するために以下のステップを行う。

取り除きステップ212において、以下のサブステップを行う。
1. CyQUANT細胞増殖アッセイ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）は、間接的に核酸含有量を測定することによって、細胞の成長を測定するのに用いられる。細胞は、96ウェルプレートに接種される。16-24時間の細胞処理の後、培養基をできる限り取り除く。
2. プレートを-70℃で凍結させる。プレートは、-70℃で四週間まで保管できる。

ステップ212が完了すると、CyQUANTステップ214を行い、それには、以下のサブステップが含まれる。
1. アッセイキット成分を室温で解凍する。表６に示されるようなCyQUANT GR希釈標準溶液を調製する。ピペットで移してそれを混ぜる。

2. プレートを室温で解凍する。
3. CyQUANT GR希釈標準溶液200μlを各サンプルウェルに加え、200μlを空のウェル（細胞対照無し）に加える。５分間培養する。
4. 蛍光プレート読み取り器（例えば、モレキュラーデバイスのSpectraMax iD5）でプレートを読み取る。励起フィルターを480 nmに、発光フィルターを520 nmに、設定する。
5. 全てのサンプルの蛍光読み取り値は、細胞対照無しの読み取り値だけ引かれる。結果を表にする。

図９を参照すると、細胞加水分解物で処理されている皮膚細胞と、細胞加水分解物で処理されていない皮膚細胞との間の、皮膚細胞ラミニン発現の違いがチャートに示されている。細胞加水分解物で処理されている皮膚細胞のラミニン発現がおよそ140%であり、細胞加水分解物で処理されていない皮膚細胞のラミニン発現がおよそ100%である。

上記の記載は、例示的なものであって、制限的なものではない。開示を基礎として、例に対する多くの変形が可能であることが、当業者には明らかとなる。従って、例の範囲は、上記の記述を参照して決められるべきではなく、それらの全範囲又はそれと同等なものの他に特許請求の範囲を参照して決められるべきである。

いずれかの例の一つ以上の特徴を、その他の例の一つ以上の特徴と組み合わせても本発明の範囲から逸脱するものではない。冠詞については、特に反対のことを指していなければ、「一つ以上の」ものを意味するよう意図されている。「及び/又は」は、特に反対のことを指していなければ、用語の最も包括的な意味を表すよう意図されている。

本発明の開示は、多くの異なる形で実施されて良いが、本発明の開示は、一つ以上の発明の原理の例証であって、いずれか一つの例を、例示された例に限定することを意図するものではないとの理解の上で、図面と説明が呈示されている。

従って、開示は、その最も広い観点において、特定の細部、代表的なシステム及び方法、及び上に示されて記述されている説明的な例に限定されるものではない。本発明の開示の範囲や精神から逸脱することなく、上記明細事項に種々の修正や変更を加えても良く、本開示は、そのような修正や変更が、特許請求の範囲やそれと同等なものの範囲内に収まるならば、それら全てをカバーすることが意図されている。

代表的なプロトコール
A. 魚の浮き袋の細胞株の発育
1. 地元の魚市場で、健康なニベ、スズキ又は同じ部類の魚を得る。
2. 細胞を分離するまでその魚を氷で冷やしておく。
3. その魚を10％の漂白剤に浸す。
4. 防腐処置を施した状態でその魚から浮き袋を取り出す。
5. その臓器を次亜塩素酸で一回以上洗浄する。
6. その臓器を抗生物質培地（ペニシリン400 IU/ml、ストレプトマイシン400 pg/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で一回以上洗浄する。
7. 洗浄後、臓器を小さな片(2-3 mm³)に切る。
8. 切った臓器を、PBS中に0.25%トリプシンEDTAを含む遠心分離管に移す。
9. 1時間継続的に揺動させて室温で培養する。
10. 100 pmメッシュで上澄みを濾過して未消化の組織を取り除く。
11. 濾液を200 g、5分間、遠心分離機にかける。
12. 細胞ペレットを完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10% を含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で再懸濁する。
13. 細胞をT25フラスコ中に接種する。
14. 24-28℃で培養する。
15. 翌日、組織培養フラスコに付着していない細胞を取り除く。
16. 2-3日おきに培地の半分を新鮮な培地と取り替える。
17. 完全な単層が形成されると細胞が定着したと考えられ、定着した細胞は、二次培養の準備ができている。

B. 組織外植による魚の浮き袋の細胞株の発育
1. 地元の魚市場で、健康なニベ、スズキ又は同じ部類の魚を得る。
2. 細胞を分離するまでその魚を氷で冷やしておく。
3. その魚を10％の漂白剤に浸す。
4. 防腐処置を施した状態でその魚から浮き袋を取り出す。
5. その臓器を次亜塩素酸で一回以上洗浄する。
6. その臓器を抗生物質培地（ペニシリン400 IU/ml、ストレプトマイシン400 pg/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で一回以上洗浄する。
7. 洗浄後、臓器を小さな片(1-2 mm³)に切る。
8. 個々に、完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10% を含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）が入っている24ウェルプレートに、臓器片を載せる。
9. 24-28℃で培養する。
10. 組織外植をかき乱さずに、2-3日おきに培地の半分を新鮮な培地と取り替える。
11. 付着した細胞が観察されるまで組織外植を培養する。
12. 組織外植を取り出す。
13. 完全な単層が形成されると細胞が定着したと考えられ、定着した細胞は、二次培養の準備ができている。

C. 魚の筋肉細胞株の発育
1. 地元の魚市場で、健康なハタ、タラ、シタビラメ、オヒョウ、カレイ又は同じ部類の魚を得る。
2. 細胞を分離するまでその魚を氷で冷やしておく。
3. その魚を10％の漂白剤に浸す。
4. 防腐処置を施した状態でその魚から筋肉を取り出す。
5. その組織を次亜塩素酸で一回以上洗浄する。
6. その組織を抗生物質培地（ペニシリン400 IU/ml、ストレプトマイシン400 pg/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で一回以上洗浄する。
7. 洗浄後、組織を小さな片(2-3 mm³)に切る。
8. 切った組織を、PBS中にコラゲナーゼとディスパーゼを含む遠心分離管に移す。
9. 1時間継続的に揺動させて室温で培養する。
10. 100 pmメッシュで上澄みを濾過して未消化の組織を取り除く。
11. 濾液を200 g、5分間、遠心分離機にかける。
12. 細胞ペレットを完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10% を含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で再懸濁する。
13. 細胞をT25フラスコ中に接種する。
14. 24-28℃で培養する。
15. 翌日、組織培養フラスコに付着していない細胞を取り除く。
16. 2-3日おきに培地の半分を新鮮な培地と取り替える。
17. 完全な単層が形成されると細胞が定着したと考えられ、定着した細胞は、二次培養の準備ができている。

D. 組織外植からの魚の筋肉細胞株の発育
1. 地元の魚市場で、健康なハタ、タラ、シタビラメ、オヒョウ、カレイ又は同じ部類の魚を得る。
2. 細胞を分離するまでその魚を氷で冷やしておく。
3. その魚を10％の漂白剤に浸す。
4. 防腐処置を施した状態でその魚から筋肉を取り出す。
5. その組織を次亜塩素酸で一回以上洗浄する。
6. その組織を抗生物質培地（ペニシリン400 IU/ml、ストレプトマイシン400 pg/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で一回以上洗浄する。
7. 洗浄後、筋肉を小さな片(1-2 mm³)に切る。
8. 個々に、完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10% を含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）が入っている24ウェルプレートに、筋肉片を載せる。
9. 24-28℃で培養する。
10. 組織外植をかき乱さずに、2-3日おきに培地の半分を新鮮な培地と取り替える。
11. 付着した細胞が観察されるまで組織外植を培養する。
12. 組織外植を取り出す。
13. 完全な単層が形成されると細胞が定着したと考えられ、定着した細胞は、二次培養の準備ができている。

E. 成体幹細胞の分離と培養
1. 地元の魚市場で、健康なハタ、タラ、シタビラメ、オヒョウ、カレイ又は６ヶ月かそれより若い同じ部類の魚を得る。
2. 細胞を分離するまでその魚を氷で冷やしておく。
3. その魚を10％の漂白剤に浸す。
4. 防腐処置を施した状態でその魚から筋肉を取り出す。
5. その組織を次亜塩素酸で一回以上洗浄する。
6. その組織を抗生物質培地（ペニシリン400 IU/ml、ストレプトマイシン400 pg/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で一回以上洗浄する。
7. 洗浄後、組織を小さな片(2-3 mm³)に切る。
8. 切った組織を、PBS中にコラゲナーゼとディスパーゼを含む遠心分離管に移す。
9. 1時間継続的に揺動させて室温で培養する。
10. 100 pmメッシュで上澄みを濾過して未消化の組織を取り除く。
11. 濾液を200 g、5分間、遠心分離機にかける。
12. 細胞ペレットを完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10%、塩基性線維芽細胞成長因子100 ng/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で再懸濁する。
13. 細胞を、被覆のない平板上で1時間、24-28℃で培養する。
14. 上澄みを採取して、ラミニン、ゼラチン、マトリゲル又は類似する素地で被覆された平板上に載せる。
15. 24-28℃で培養する。
16. 24時間後に、しっかりと付着していない細胞を洗い落とす。
17. 培地を毎日、完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10%、塩基性線維芽細胞成長因子100 ng/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）と取り替える。

F. iPSCの生成と培養
1. トランスフェクションの2-4日前、組織培養フラスコ中の完全培地（10%FBSを含むL15）で細胞を培養する。トランスフェクションの当日（デイ0）、細胞は、およそ75-90%コンフルエントである。
2. ゼラチンで被覆された6ウェルプレートから培地を吸い出して、ウェル毎に2mLの新鮮な完全培地と置き換える。被覆されたプレートを使う用意が整うまで37℃に置く。
3. Epi5（登録商標）ベクターを37℃で解凍し、使う用意が整うまでそれらを濡れた氷上に置く。使用前、解凍したベクターを軽く遠心分離機にかけて、それらを管の底に集める。
4. PBSで細胞を洗う。
5. 細胞が入っている培養フラスコに0.05%のトリプシン/EDTAを3 mL加える。
6. 室温で3分間フラスコを培養する。
7. 各フラスコに完全培地を5-8 mL加える。細胞を、空で無菌の15 mL 円錐管に注意深く移す。
8. トリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
9. 細胞を200g、2分間、遠心分離機にかける。
10. 上澄みの大半を注意深く吸い出して、完全培地で再懸濁する。
11. 細胞を、ゼラチンで被覆された深皿プレート上に接種して、2 mL完全培地において30-60%コンフルエンスで６ウェルプレートにウェル当たり50,000から100,000細胞とし、24-28℃で一晩培養する。
12. Opti-MEM/Reduced-Serum Mediumを予め室温まで温めて、以下に記述する通り管A及び管Bを準備する。
13. 二つのEpi5（登録商標）Reprogramming Vector mixを各々1.2μL（合計2.4μL）、管Aとラベルを貼られた1.5 mLマイクロ遠心分離管の中のOpti-MEM培地118μLに加える。P3000（登録商標）試薬を4.8μL加えて良く混ぜる。
14. Lipofectamine 3000試薬3.6μLを、管Bとラベルを貼られた1.5 mLマイクロ遠心分離管の中の予め温められたOpti-MEM培地121μLで希釈する。
15. トランスフェクションマスターミックスを準備するために、管Aの中身を管Bに加えて良く混ぜる。
16. トランスフェクションマスターミックスを室温で５分間培養する。
17. もう一度混ぜて、トランスフェクションマスターミックス250μL全部を各ウェルに加える。
18. 24-28℃で一晩培養する。
19. トランスフェクションの24時間後に、培地をプレートから吸い出す。N2B27培地（IX N-2サプリメント、IX B27サプリメント、bFGF 100 ng/mLを含むL15）2 mLを各ウェルに加える。
20. 使用済みの培地をN2B27培地2 mLと交換して、合計14日間毎日N2B27培地を変える。
21. デイ14に、使用済みのN2B27培地を吸い出して、それを完全培地と交換する。ウェル毎に2 mL、毎日の培地交換を再開する。
22. 細胞が変形したことを示す、細胞塊の出現について、顕微鏡で１日おきにプレートを観察する。トランスフェクション後15日から21日以内に、iPSCコロニーは、移植に適切なサイズまで成長する。
23. デイ21までにコロニーがはっきりして、更なる培養及び増殖のために摘み取ることができる。

G. 細胞を二次培養する方法
1. 培養基を取り除いて廃棄する。
2. 細胞をPBSでゆすいでトリプシンインヒビターを含む血清の形跡を全て取り除く。
3. 0.25%トリプシンEDTA溶液を2-3 mLフラスコに加える。
4. 室温で1分間培養する。
5. 完全成長培地を5-8 mL加える。
6. 細胞をピペットで丁寧に吸い出す。
7. 適当な分量の細胞懸濁液を1 : 2から1 : 3という二次培養比で新しい培養フラスコに加える。
8. 24-28℃で培養する。

H. 懸濁培養液への適応
1. トリプシン処理によって問題の細胞にとって適切な頻度で単一層培地を継代培養する。
2. 継代培養を行う毎に、細胞単一層をPBSで洗い、0.25%トリプシンを上塗りする。
3. 室温で5分間培養する。
4. 完全培地で酵素を不活性化する。
5. 細胞懸濁液を採取して、トリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
6. 細胞懸濁液を別の培地フラスコに接種する。
7. 懸濁した細胞の生存率が90%以上になるまで継代培養を繰り返す。
8. 撹拌又は振動フラスコにおいて50 mL完全培地で細胞密度が10万-50万/mlの懸濁培養液を定着させる。
9. 単一層培養にとって最適な温度、湿度及び雰囲気が同じ条件のもとCO₂培養器において撹拌又は振動フラスコの懸濁培養液を培養する。
10. 2-3日毎に新鮮な培地で、細胞密度を10万-50万/mlに調整する。
11. トリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
12. 健全な細胞の成長を促進する細胞密度で、複数の培養を並行して定着させる。
13. 培養の一部を用いて細胞密度を徐々に100万/mlまで高める。
14. 細胞密度を高めることで細胞が死滅してしまうなら、高密度の培養を破棄する。
15. ステップ12の細胞を用いて高密度適応を再開する。
16. 細胞が懸濁液において成長するよう適応するとき、3 Lのバイオリアクターへと規模を拡大する。

I. 血清を含まない培地（植物水解物）への適応
1. DMEM/F12完全培地（DMEM培地とハムF12培地の1 : 1混合物、2-4 mMグルタミン、10% FBS）において細胞を培養する。
2. 血清を含まない培地（DEMEM培地とハムF12培地の1 : 1混合物、2-4 mMグルタミン、20% 植物水解物、例えば、大豆、綿実、菜種、小麦、酵母又はそれらに相当する物）への適応
3. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地I（新鮮な完全培地40%、以前の継代培地からの条件培地40%、血清を含まない培地20%）と取り替える。
4. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
5. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ3を繰り返す。
6. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地II（新鮮な完全培地30%、ステップ1における細胞からの条件培地30%、血清を含まない培地40%）と取り替える。
7. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
8. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ6を繰り返す。
9. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地III（新鮮な完全培地20%、ステップ1における細胞からの条件培地20%、血清を含まない培地60%）と取り替える。
10. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
11. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ9を繰り返す。
12. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地IV（新鮮な完全培地10%、ステップ1における細胞からの条件培地10%、血清を含まない培地80%）と取り替える。
13. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
14. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ12を繰り返す。
15. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を、血清を含まない培地と取り替える。
16. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
17. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ15を繰り返す。
18. 血清を含まない培地の使用は、各ステップにおいて、より緩やかに増やすこと、すなわち、各ステップで20%以下の増加が可能である。

J. 血清を含まない培地（既知組成）への適応
1. DMEM/F12完全培地（DMEM培地とハムF12培地の1 : 1混合物、2-4 mMグルタミン、10% FBS）において細胞を培養する。
2. 血清を含まない培地（DMEM培地とハムF12培地の1 : 1混合物、2-4 mMグルタミン、アスコルビン酸2リン酸65-130μg/ml、NaHCO₃ 550-1100μg/ml、亜セレン酸ナトリウム14-28 ng/ml、インシュリン19-38μg/ml、トランスフェリン11-22μg/ml、FGF-2 100-200 ng/ml、TGF-beta 2-4 ng/ml）を調合する。
3. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地I（新鮮な完全培地40%、以前の継代培地からの条件培地40%、血清を含まない培地20%）と取り替える。
4. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
5. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ3を繰り返す。
6. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地II（新鮮な完全培地30%、ステップ1における細胞からの条件培地30%、血清を含まない培地40%）と取り替える。
7. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
8. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ6を繰り返す。
9. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地III（新鮮な完全培地20%、ステップ1における細胞からの条件培地20%、血清を含まない培地60%）と取り替える。
10. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
11. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ9を繰り返す。
12. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地IV（新鮮な完全培地10%、ステップ1における細胞からの条件培地10%、血清を含まない培地80%）と取り替える。
13. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
14. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ12を繰り返す。
15. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を、血清を含まない培地と取り替える。
16. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
17. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ15を繰り返す。
18. 血清を含まない培地の使用は、各ステップにおいて、より緩やかに増やせる。例えば、各ステップで20%以下の増加となる。

K. 転写後のタンパク質発現の増強
1. 完全培地（ライボビッツL-15、又はDMEM、又はペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10%を備えるEMEM）、又は血清を含まない培地（植物加水分解物、又は化学的に定義された成分を備えるDMEM/F12）において細胞を培養する。
2. 培養基を取り除いて廃棄する。
3. 細胞PBSを軽くゆすいで、トリプシンインヒビターを含む血清の痕跡を全て取り除く。
4. 0.25%トリプシン-EDTA溶液2-3 mLをフラスコに加える。
5. 室温で１分間培養する。
6. 細胞をゆっくりとピペットで吸引する。
7. 細胞を、200gで２分間、遠心分離機にかける。
8. 完全培地、又は血清を含まない培地に、細胞を再懸濁する。
9. ６ウェルプレートの各ウェルに、50万個の細胞を加える。
10. 24-28℃で一晩培養する。
11. ポリエチレンイミン、リポソーム、電気穿孔法、その他の方法を用いて、マイクロRNAオリゴヌクレオチド（miR-21、miR-29a、miR-21ミミック、miR-29aミミック、anti-miR-21、anti-miR-29a、又はそれらの等価物）を細胞に形質移入する。
12. 24-28℃で一晩培養する。
13. 温度、湿度、及び大気が最適の培地と同じ条件のもと、CO₂培養器中の、多層フラスコ、スピナーフラスコ、又は振とうフラスコに、細胞を移す。

L. 細胞培養のための骨組（コンニャク＋ゴム）
1. サフランを２、３片入れた水を薄黄色になるまで沸騰させる。
2. サフランを取り除いてぬるくなるまで溶液を放置する。
3. 全ての乾燥成分を調合する
a. コンニャク-1-3%
b. ふくらし粉-0.7%-1.4%
c. ローカストビーンガム-0.5%-1%
d. 完全キサンタンガム-0.5%-1%
4. サフラン溶液を100 ml計りとる。
5. ふくらし粉、ローカストビーンガム、キサンタンガムを連続して加える。各原料を加えた後、混合物をよく撹拌する。
6. コンニャクを溶液上に少しずつ振り撒いて加える。撹拌し続ける。溶液はお粥状になる。
7. コンニャクの混合物を型に入れておよそ1-15 mm の厚さに広げる。
8. 型を蓋で覆い、室温で30分を超えて放置する。
9. 型を4℃の冷蔵庫に4時間入れる。
10. 弱い熱で型を40分間蒸す。
11. 型を室温で2時間放置する。
12. 骨組を45-55℃で15分間脱水する。

M. 細胞培養のための骨組（アルギン酸塩＋もち米粉）
1. アルギン酸ナトリウムを1g(1%)計量する。
2. ブレンダーに水を100 ml加える。
3. ブレンダーにアルギン酸塩粉を加え、溶解するまで混合物を混ぜる。
4. 容器をプラスチックフィルムで覆い、アルギン酸溶液を一晩冷蔵庫に入れて気泡を除去する。
5. もち米粉を10%計量して型に入れる。
6. アルギン酸溶液を型に加え、およそ1-15 mmの厚さとする。
7. 粉末が全て溶けるまで混合物を撹拌する。
8. 形に固まるまで弱い熱で混合物を30分間蒸す。
9. 型を蓋で覆い、室温で30分間放置する。
10. 乳酸カルシウムを1%計量し、水中で撹拌して溶かす。
11. 骨組を、1%の乳酸カルシウム溶液に、少なくとも2.5時間浸し、骨組のまわりへの膜組織の形成を可能とする。

Claims (5)

1. 生体外細胞培養によって細胞加水分解物を生成する方法であって、
   (i)音波処理を用いて細胞を溶解し、その細胞中のタンパク質を放出させ、
   (ii)プロテアーゼを用いてそのタンパク質を消化し、500ダルトン(Da)より分子サイズの小さい短いペプチドを生産し、
   (iii)プロテアーゼを所定時間、所定温度に加熱するか、プロテアーゼを所定濃度に希釈するかして、消化ステップを終結させ、そして
   (iv)消化終結ステップから得られる混合液を薄膜フィルターで無菌濾過する
   ステップを含む方法。
2. 薄膜フィルターが、0.2μm PVDF薄膜フィルターである請求項１に記載の方法。
3. 消化終結ステップにおける所定温度、及び所定時間が、それぞれ、摂氏95度、及び15分間である請求項１に記載の方法。
4. 所定濃度が100倍であり、プロテアーゼがPBSで希釈される請求項１に記載の方法。
5. 請求項１に記載の方法によって生成される細胞加水分解物を備える局所製剤。
   
   

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