JP2024524626A - 操作された寡能性幹細胞から分化した細胞を含む食料品 - Google Patents

Abstract

本発明は、食品バイオテクノロジーの分野に属する。より詳細には、本発明は、いわゆる実験室培養肉に関する。本発明は、食料品を生産する方法であって、インビトロ分化非ヒト動物細胞を加工するステップを含み、前記インビトロ分化非ヒト動物細胞が少なくとも１種の寡能性幹細胞（ＯＳＣ）に由来し、前記少なくとも１種のＯＳＣが、少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている、方法に関する。本発明はまた、前記食料品、及び前記食料品を生産するのに有用なＯＳＣに関する。【選択図】図１０

Description

本発明は、食品生産の分野に関し、より特には、インビトロで培養した非ヒト動物細胞に基づく、改良された食料品を生産する方法に関する。本発明はまた、少なくとも１種の系列指定因子（specifier）遺伝子又はそれらの組合せが安定的に不活性化されている特定の寡能性幹細胞（Oligopotent Stem Cells）（ＯＳＣ）に関する。

世界人口は、主に中低所得国の人口増加により、２０５０年には９７億人に達すると予想されている（国連、２０１９）。この増加は、消費者のライフスタイルの変化及び生活水準の向上とともに、地球レベルでの家畜管理に世界的な圧迫を与えている。２０１０年～２０５０年に、肉製品の消費量は、発展途上国では２倍超になり、世界全体では７３％超になると予測されている（ＦＡＯ、２０１１）。かかる増加による環境的（汚染と天然資源の管理の観点から）及び地政学的影響に対処するには、代替的な環境上持続可能な肉生産様式が急務となっている。集約型畜産は、これらの目標を達成するものではなく、また、食品の品質及び動物福祉の両方の問題が引き起こされ、多くの社会で懸念の的となってきている。インビトロで生産された肉は、持続可能な消費を望む人及び／又は動物福祉に懸念を持つ人にとって、屠殺された動物からの肉に代わる現実的な選択肢となる。
いわゆるインビトロ肉又は実験室培養肉（lab-grown meat）を生産するための１つの戦略は、動物からの組織サンプルから得られる筋肉幹細胞を培養して筋肉線維を生産することである。この戦略では、筋肉幹細胞のインビトロ増殖能力の制限及び系列の限定のため、適切な生産量に達する可能性は低く、また、筋肉から派生する食品製品しか得ることができないであろう。更に、天然の肉は、脂肪細胞、筋肉、神経、内皮細胞がほんの数例として含まれる様々な細胞型で構成され、単なる骨格筋細胞の塊では、細胞内含有量、構造及び質感を再現するのにはほど遠い。

別の戦略は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から開始することである。これらの細胞は、食料品生産に有益な２つの基本的な特性を保持している。第１の特性は自己複製能力であり、これにより、細胞はインビトロで無限に拡大し、そのため、生産の規模を拡大できる。第２の特性は多能性であり、これは、あらゆる成熟細胞型（皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃腸管及び尿生殖路、腎臓、骨、筋肉、心臓、血管）へ分化する能力を指す。したがって、ＰＳＣの使用は、生理学的対応物の細胞組成を大部分模倣する肉ベース又は加工肉の食品製品の工学に有用なあらゆる細胞型を得る可能性を提供する。ＷＯ２０２０／１０４６５０は、血清及び増殖因子の必要性が低いか又は全くない鳥類の胚性幹細胞を大量に生成するための方法、並びにこれらの細胞の食料品生産への使用を開示しているが、いかなる分化ステップも含まれていない。特定のシグナル伝達の合図がない場合、これらの細胞の３Ｄ培養では、いわゆる胚様体が形成され、該胚様体は３種の胚性胚葉の派生細胞を呈する分化細胞の不均一な塊からできている細胞凝集体であり、これらのそれぞれの量又は質（すなわち、分化レベル及び細胞多様性）を制御する手段は存在しない。したがって、このアプローチは、特定の分化細胞型又はその混合物の大量生産には適していない。ＷＯ２０２１／０４８３２５は、食品製品の原料としての鳥類の幹細胞の使用を開示しているが、幹細胞又は寡能性幹細胞のインビトロ分化によって得た細胞の使用は記載していない。

系列コミットメントは、系列特異的な転写因子（系列指定因子）のセットによって、遺伝子レベルで組織化されるが、該セットは、下流の標的遺伝子の大規模なセットを直接的又は間接的に活性化及び／又は抑制して、特定の器官の特定の細胞型への特定の発生プログラムを実行するのに関与する。いくつかの例では、培養条件（支持体、せん断応力・・・）が、分化過程に寄与し得る。多能性細胞から出発して、ＰＳＣの特定の分化細胞型への分化を駆動するために、２つの主要な戦略が当技術分野で考えられている。第１の戦略は、「指向性分化」として知られ、多能性細胞を特定の外部シグナル伝達の合図に供することを含む、多ステップの培養プロトコールに存し、該シグナル伝達の合図は、所望の最終的な細胞型に応じて規定の時点で培養培地に添加又は除去される分子などであり、細胞が自然の分化過程で供される一連のシグナルによるものである。有利なことに、これは細胞の遺伝子改変を必要としないが、しかし、この戦略の主な欠点は、やや面倒なプロセスと、異なる時点で特定の発生経路を活性化又は阻害するのに使用される高価な組換え増殖因子、サイトカイン、ホルモン、又は他の小分子化合物の使用とである。第２の戦略は（すなわち「強制分化」）、多能性細胞を、これらの細胞が所望の転写因子を構成的に、又は特定の誘導シグナルによって発現又は過剰発現するように遺伝子改変することに存する。しかしながら、この方法は、外来遺伝物質（導入遺伝子）を細胞のゲノムに挿入することを意味し、この導入遺伝子は、細胞の数世代にわたって所望の分化特性を維持するために、細胞の数世代にわたって安定的に発現するか、又は誘導可能であり続ける必要がある。安定性及び遺伝子再配列の問題に加えて、導入遺伝子の誘導又は細胞のゲノム内でのそれらの維持では、細胞は、食品の生産、特にヒトの消費のための食品の生産を考えると望ましくない抗生物質及び／若しくは化学物質、又はいずれかの他の選択手段若しくは誘導手段に曝露されることを意味する可能性がある。培養肉のこれらの戦略と現在の課題は、Ｐｏｓｔら（２０２０）によって最近概説されている。ＷＯ２０１５／０６６３７７は、誘導可能な筋原性転写因子の導入遺伝子を発現するように改変されている、家畜から派生する細胞系から骨格筋細胞を生産することに関する。いくつかの例では、細胞はまた、骨格筋細胞への分化の誘導に切り替える前に細胞を大量生産するための多能性遺伝子の誘導発現を可能にする追加の導入遺伝子を用いて遺伝子改変される。ＷＯ２０１８／２２７０１６は、細胞培養食品製品を生産することを目的としたシステム及び方法に関する。ＷＯ２０１５／０６６３７７と同様に、ＷＯ２０１８／２２７０１６はまた、多能性因子及び分化因子の導入遺伝子の一過性及び逐次的発現のために遺伝子操作された細胞を記載している。しかしながら、これらの細胞の遺伝的安定性に関連する上述の欠点に加えて、遺伝子組換え物質を用いた食料品が更に直面しなければならないのは、遺伝子操作された物質、特に外来遺伝物質を含む遺伝子操作された物質に消費者が消極的であることである。

将来における世界の食糧供給という課題と、動物福祉への関心の高まりとを直視すると、依然として、インビトロ（培養）肉は貴重な解決策である。それにもかかわらず、インビトロ分化非ヒト動物細胞型に基づいた費用対効果の高い（例えば、より少ない組換え増殖因子、サイトカインホルモン、小化合物、又は抗生物質を使用）、従来の肉製品の構造特性及び官能特性に近づく、肉食料品を生産する方法が依然として必要とされている。

本発明者らは、実験室培養肉を生産するのに有用な非ヒト寡能性幹細胞（ＯＳＣ）をセットアップできた。ＯＳＣは、制限された数の細胞系列へ分化する能力を保持する自己複製幹細胞である。これらの細胞は、食料品生産に見合うだけの収量で増殖させることができる。細胞は、組換え分子を用いないで又は当技術分野の方法よりも安価な組換え分子を用いて分化され、このことは、特に有利な点である。次に、ＯＳＣは、食料品に変換するか又は組み込まれ、これらのＯＳＣは、少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。
したがって、本発明は、食料品を生産する方法であって、インビトロ分化非ヒト動物細胞を加工するステップを含み、前記インビトロ分化非ヒト動物細胞が少なくとも１種のＯＳＣに由来し、前記少なくとも１種のＯＳＣが少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている、方法に関する。

前記方法は、インビトロ分化非ヒト動物細胞を加工するステップの前に、前記インビトロ分化非ヒト動物細胞を生産するステップであって、
－ 少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている少なくとも１種のＯＳＣを増幅させるステップ、
－ 任意に、前記増幅されたＯＳＣを胚様体として培養するステップ、又は
－ 任意に、前記ＯＳＣを分化させるステップ
を含むステップを更に含み得る。

これにより、目的の細胞を食料品生産に十分な速度で得、それによって、前記実験室培養ベースの食料品の費用を更に下げることができる。前記方法の特定の実施形態では、少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている少なくとも１種のＯＳＣを増幅させるステップの前に、少なくとも１種の挿入及び／又は欠失を遺伝子編集システムを用いて生成させることにより、ＰＳＣ又は複能性若しくは全能性細胞において少なくとも１種の系列指定因子遺伝子を安定して不活性化することによって、前記少なくとも１種のＯＳＣを得るステップ。これにより、外因性遺伝物質が挿入されていない細胞を生成し、それによって、例えば消費者から脅威とみなされることもある外来遺伝物質を組み込んだ従来の遺伝子改変生物（ＧＭＯ）と比較してより安全でより安定したアプローチを提供することができる。

有利なことに、前記ＯＳＣは、多くの生物から入手可能な多種多様なＰＳＣから生成できる。したがって、本方法の特定の実施形態では、前記ＰＳＣは、非ヒト動物からの人工ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、核移植ＥＳＣ（ｎｔＥＳＣ）から選択される。これらはまた、非ヒト動物由来の複能性又は全能性細胞から生成できる。また、前記ＰＳＣ又は複能性若しくは全能性細胞は、非ヒト脊椎動物、例えば、家畜、魚類、鳥類；昆虫；甲殻類、例えば、小エビ、エビ、カニ、ザリガニ、及び／又はロブスター；軟体動物、例えば、タコ、イカ、コウイカ、ホタテガイ、カタツムリに由来し、それによって、多種多様な実験室培養食料品の生産への道が開かれ得る。

驚くべきことに、強制分化の制御は、細胞を１種又は複数の系列指定因子遺伝子の過剰発現によって分化経路に強制的に関与させる代わりに、特定の系列指定因子遺伝子の不活性化による他の分化経路の欠損の促進を介しても可能であることを本発明者らは発見した。したがって、本方法の特定の実施形態では、少なくとも１種のＯＳＣは、少なくとも１種の神経外胚葉（ＮＥ）、中内胚葉（ＭＥＤ）、中胚葉（ＭＤ）、若しくは内胚葉（ＥＤ）系列指定因子遺伝子又はそれらの組合せの発現が不活性化されている。特定の実施形態では、前記少なくとも１種のＮＥ、ＭＥＤ、ＭＤ、又はＥＤ系列指定因子遺伝子は、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＺＮＦ５２１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＺＩＣ１、ＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１、ＫＬＦ６、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ４Ａ、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＥＯＭＥＳ又はそれらの組合せから選択される。遺伝子の不活性化の更なる特定の組合せにより、ＯＳＣは分化能力がより更に限定されて、特定の細胞系列の費用対効果の高い生産が可能となる。また、より特定の実施形態では、ＯＳＣは、少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の発現及び少なくとも１種のＭＤ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されており、それによって、ＥＤ限定ＯＳＣが提供される。本方法の別の特定の実施形態では、前記ＯＳＣは、肝臓特異的であり、少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の発現、少なくとも１種のＭＤ系列指定因子遺伝子の発現、及びＥＤ細胞の非肝臓前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。本方法の別の特定の実施形態では、前記ＯＳＣは、少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の発現及び少なくとも１種のＥＤ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。本方法の更なる特定の実施形態では、前記ＯＳＣは、骨格筋特異的であり、少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の発現、少なくとも１種のＥＤ系列指定因子遺伝子の発現、及びＭＤ細胞の非骨格筋前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。本方法の別の特定の実施形態では、前記ＯＳＣは、心臓特異的であり、少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の発現、少なくとも１種のＥＤ系列指定因子遺伝子の発現、及びＭＤ細胞の非心臓前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。本方法の別の特定の実施形態では、前記ＯＳＣは、脂肪細胞特異的であり、少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の発現、少なくとも１種のＥＤ系列指定因子遺伝子の発現、及びＭＤ細胞の非脂肪細胞の前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子が不活性化されている。本方法の別の特定の実施形態では、前記ＯＳＣは、皮膚（ケラチノサイト）特異的であり、少なくとも１種のＭＥＤ系列指定因子遺伝子の発現（若しくは少なくとも１種のＭＤ系列指定因子及び少なくとも１種のＥＤ系列指定因子）、並びに／又はＮＥ細胞の非皮膚前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。

更に、食料品を生産する方法では、少なくとも１種のＯＳＣは、骨格筋、心臓、肝細胞、線維芽細胞、赤血球、ケラチノサイト、若しくは脂肪細胞特異的ＯＳＣ、又はそれらの組合せであり、これにより、家畜からの肉（派生）製品の組成及び官能特性を模倣する複雑な食料品を再現することが可能となる。
本発明の別の目的は、ＮＥ、ＭＤ、ＥＤ又はＭＥＤ系列指定因子遺伝子の群から選択される少なくとも２種の系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている非ヒトＯＳＣに関する。

本発明の更なる目的は、少なくとも１種の非ヒト動物細胞を含む食料品であって、ＮＥ、ＭＥＤ、ＭＤ、又はＥＤ系列指定因子遺伝子の群から選択される少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現が少なくとも１種の挿入及び／又は欠失を遺伝子編集システムを用いて生成させることにより不活性化されている、食料品に関する。この食料品は、世界の食糧供給への高まる懸念に対して価値ある持続可能な解決策を提供すると同時に、現在の実験室培養肉の欠点を示さない（例えば、高い費用、低収量、又はＧＭＯに対しては、遺伝的不安定性、外来ＤＮＡの伝播リスク）。

脊椎動物における神経外胚葉（ＮＥ）、中内胚葉（ＭＥＤ）、中胚葉（ＭＤ）及び内胚葉（ＥＤ）系列又は細胞型へのＰＳＣの分化経路の図である。１：ＮＥ系列への分化を支配する遺伝子のセット；２：ＭＥＤ系列への分化を支配する遺伝子のセット；３：ＭＥＤ系列細胞からＥＤ系列細胞への分化を支配する遺伝子のセット；４：ＭＥＤ系列細胞からＭＤ系列細胞への分化を支配する遺伝子のセット；５、６、７：それぞれ後期ＮＥ、ＥＤ及びＭＤ系列細胞への分化を支配する遺伝子のセット。 初期系列（ＮＥ、ＭＤ、ＥＤ）限定寡能性幹細胞（ＯＳＣ）を得るための遺伝子編集戦略の図である。ＯＳＣは、いくつかの分化経路が系列指定因子遺伝子の特異的不活性化、又はそれらの組合せによって妨げられる自己複製幹細胞である。Ａ）ＭＤ限定ＯＳＣを得るための本発明による遺伝子編集戦略の例：少なくとも１種のＮＥ及び少なくとも１種のＥＤ系列指定因子遺伝子が不活性化されている。Ｂ）ＮＥ限定ＯＳＣを得るための本発明による遺伝子編集戦略の例：少なくとも１種のＥＤ ｌ及び少なくとも１種のＭＤ系列指定因子遺伝子の遺伝子が不活性化されている。Ｃ）ＮＥ限定ＯＳＣを得るための本発明による代替の遺伝子編集戦略の例：少なくとも１種のＭＥＤ系列指定因子遺伝子が不活性化されている。Ｄ）ＥＤ限定ＯＳＣを得るための本発明による遺伝子編集戦略の例：少なくとも１種のＭＤ及び少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の遺伝子が不活性化されている。系列指定因子ノックアウト（ｋｏ）の生成順序は、単に示しただけにすぎないものである。図１及び３）中の進入禁止標識は、ＯＳＣにおける系列指定因子ｋｏによって妨げられる分化経路を示す。ＥＤＭＤ ＯＳＣ：分化能力が、ＥＤ、ＭＤ系列及びその派生細胞に限定されるＯＳＣ。ＮＥＭＤ ＯＳＣ：分化能力が、ＮＥ、ＭＤ系列及びその派生細胞に限定されるＯＳＣ。ＮＥＥＤ ＯＳＣ：分化能力が、ＮＥ、ＥＤ系列及びその派生細胞に限定されるＯＳＣ。ＮＥ ＯＳＣ：分化能力が、ＮＥ系列及びその派生細胞に限定されるＯＳＣ。ＭＤ ＯＳＣ：分化能力が、ＭＤ系列及びその派生細胞に限定されるＯＳＣ。ＥＤ ＯＳＣ：分化能力が、ＥＤ系列及びその派生細胞に限定されるＯＳＣ。 後期系列限定ＯＳＣを得るための遺伝子編集戦略の例の図であり、例えば、例は以下のようである：Ａ）皮膚ＯＳＣ：いくつかのＮＥ非皮膚遺伝子指定因子がＮＥ ＯＳＣにおけるノックアウト（ｋｏ）によって不活性化される；Ｂ）肝臓ＯＳＣ：いくつかのＥＤ非肝臓組織遺伝子の指定因子がＥＤ ＯＳＣにおけるｋｏによって不活性化される；又はＣ）心臓ＯＳＣ：いくつかのＭＤ非心臓組織遺伝子指定因子がＭＤ ＯＳＣにおけるｋｏによって不活性化される。進入禁止標識は、ＯＳＣにおいて妨げられる又は妨害される分化経路を示す。ｋｏの生成順序は、単に示しただけにすぎないものである。 オルソロガス系列指定因子遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ編集された挿入及び欠失（インデル）の％の図であり、これらインデルは、編集されたＯＳＣクローン系を生成するのに使用するヒトｉＰＳＣ（Ａ）及びアヒルＥＳＣ（Ｂ）プールにおいて検出される。ｓｇＲＮＡ（Ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）。 野生型ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）の多系列胚様体（ＥＢ）分化の図である。Ａ）哺乳類ＷＴＣ－１１ ｉＰＳＣから得られたＥＢの画像。白色バー：２００μｍ。Ｂ）ＥＢ分化の７日目（Ｄ７）でのＥＢの寸法。Ｃ）分化の０日目（Ｄ０）及びＤ７の時点での、逆転写後のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって得られた多能性（ＰＬ）、ＮＥ、ＥＤ、ＭＤ及びＭＥＤ系列特異的転写産物を定量することによって得られた、系列分布の円グラフ。 単一の系列指定因子遺伝子の遺伝子不活性化からもたらされる系列分化バイアスを示す編集されたＮＥＭＤ、ＮＥ、ＥＤＭＤ及びＮＥＥＤヒトＯＳＣ（ｈＯＳＣ）と比較した野生型ｈｉＰＳＣの１４日目のＥＢ分化能力の図である。 単一の系列指定因子遺伝子の遺伝子不活性化からもたらされるケラチノサイト分化バイアスを示すＮＥ及びＥＤＭＤ ｈＯＳＣと比較した野生型ｈｉＰＳＣの１１日目のケラチノサイト指向性分化能力の図である。柱は、０日目の時点での、野生型対照遺伝子の発現と比較した、ケラチノサイト分化の１１日目の時点での、ｑＲＴ－ＰＣＲによって得られた２種のＰＬ遺伝子（ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４）、１種のＮＥ遺伝子（ＰＡＸ６）、及び２種のケラチノサイト（Ｋ）遺伝子（ＴＰ６３、ＫＲＴ１４）の転写産物を定量することによって得られた、発現倍率変化を表す。 単一のオルソロガス系列指定因子遺伝子の遺伝子不活性化からもたらされる系列分化バイアスを示す編集されたＮＥＭＤ、ＥＤＭＤ及びＮＥＥＤアヒルＯＳＣ（ｄＯＳＣ）と比較した野生型ｄＥＳＣの１２日目のＥＢ分化能力の図である。分化の１２日目の時点での、ｑＲＴ－ＰＣＲによって得られたアヒルＰＬ、ＮＥ、ＥＤ、及びＭＤ系列特異的転写産物を定量することによって得られた、系列分布の円グラフ。 ２種のオルソロガス系列指定因子遺伝子：Ｐａｘ６（ＮＥ）及びＧｓｃ（ＭＥＤ）の同時遺伝子不活性化からもたらされる皮膚分化バイアスを示すケラチノサイトｄＯＳＣと比較した野生型ｄＥＳＣの１６日目のケラチノサイト指向性分化能力の図である。柱は、０日目の時点での、野生型対照遺伝子の発現と比較した、２種のＰＬ遺伝子（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４）、２種のＮＥ遺伝子（Ｅｎ１、Ｏｔｘ２）、及び２種のＫ遺伝子（Ｔｐ６３、Ｋｒｔ１４）のｑＲＴ－ＰＣＲ定量によって得られた、発現倍率変化を表す。 ＯＳＣを使用した食料品を生産する方法の一実施形態の例の図である。

本発明は、とりわけ、少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されているＯＳＣに由来したインビトロ分化非ヒト動物細胞を含む食料品を生産する方法に関する。実際、本発明者らは、初期及び／又は後期分化ステップでＰＳＣ、複能性細胞又は全能性細胞の分化能を限定することによって食料品関連細胞型への分化バイアスを導入することで、未改変ＰＳＣよりもより効率的でより均質に分化し、外因性因子の必要量が少ないＯＳＣを得られることを見出した。これは、前記ＰＳＣにおける初期及び／又は後期関連系列指定因子遺伝子の安定的な不活性化によって得られる。更に、前記ＯＳＣは、外因性遺伝物質を含まず、系列指定因子遺伝子の強制異所性発現のために操作された遺伝子組換えＰＳＣ系よりも安定な細胞系を構成する。

定義
本明細書で使用する場合、「多能性幹細胞」（ＰＳＣ）は、分裂による自己複製する能力、並びに３種の一次生殖細胞層（すなわち、ＥＤ、ＮＥ、及びＭＤ）及びそれらの派生細胞へ発達する能力を有する細胞に関する。脊椎動物では、出生時にその動物を構成するほぼ全ての細胞型は、哺乳類の胚盤胞段階着床前胚の場合は内部細胞塊（ＩＣＭ）又は卵生脊椎動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類）の場合は胚盤葉（ＢＤＭ）と呼ばれる一過性の多能性細胞のサブセットに由来する。哺乳類ＩＣＭ細胞の単離及び培養は、自己複製及び多能性能力を示す胚性幹細胞（ＥＳＣ）系を生成することを可能とする（Ｅｖａｎｓ及びＫａｕｆｍａｎ、１９８１、Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８）。同様に、ＢＤＭ細胞はまた、初期卵生脊椎動物胚から容易に単離して、多能性ＥＳＣ系を作製できる。ＰＳＣの代替的な供給源は、体細胞における多能性関連転写因子の異所性発現（いわゆる人工ＰＳＣ若しくはｉＰＳＣの生成、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ及びＹａｍａｎａｋａ、２００６参照）又は体細胞核の除核卵母細胞への注入で得られたクローン胚からのｎｔＥＳＣ生成（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９６）のいずれかによるリプログラミング過程を経た動物体細胞組織である。近年、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ及びｎｔＥＳＣ系は、食料品生産に関連する広範囲の脊椎動物の種から派生することに成功している。また、本明細書で使用する場合、多能性幹細胞（ＰＳＣ）という用語は、食品生産に関連するあらゆる脊椎動物からのあらゆるＥＳＣ、ｎｔＥＳＣ、ｉＰＳＣ、若しくはＩＣＭから単離された割球、又はそれらの組合せであって、３種の胚性胚葉の派生細胞を形成する能力を保持しているものを指す。したがって、本発明に適したＰＳＣは、非ヒト動物細胞である。

適切なＰＳＣは、ヒト又は動物の栄養摂取において一般的に消費されるあらゆる動物種に由来するＰＳＣを包含する。いくつかの例では、いずれにしても本発明により前記動物を犠牲にすることが避けられるため、適切なＰＳＣはまた、例えば、経済的な懸念、文化的習慣又は種の希少性のために別の方法ではヒト又は動物の栄養摂取のための肉の供給源としてはみなされないであろうあらゆる動物種を含むことができる。また、前記種は、あらゆる非ヒト脊椎動物、昆虫、甲殻類又は軟体動物、特に、ヒト又は動物の栄養摂取で一般的に消費されるものを含む。「軟体動物」は、より特には、タコ、イカ、コウイカ、ホタテガイ又はカタツムリを指すが、これらに限定されない。「昆虫」は、より特には、カブトムシ（又は甲虫目の他の昆虫）、チョウ又はガ（又は鱗翅目の他の昆虫）、アリ、スズメバチ又はミツバチ（又は膜翅目の他の昆虫）、バッタ、イナゴ又はコオロギ（又は直翅目の他の昆虫）、セミ、ヨコバイ又はウンカ（又は半翅目の他の昆虫）を指すが、これらに限定されない。「甲殻類」は、より特には、小エビ、エビ、カニ、ザリガニ、又はロブスターを指すが、これらに限定されない。「非ヒト脊椎動物」は、あらゆる非ヒト哺乳類、魚類、両生類、爬虫類又は鳥類、より特には、ヒト又は動物の栄養摂取で一般的に消費されるものを含む。また、特に好ましい鳥類は、肉又は卵が消費されるものであり；更により特には、前記鳥類は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウ、ハト、ウズラ、ひなバト又は更にはキジ、エミュー、ハクチョウ、ダチョウ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、及びヒクイドリから選択されるが、これらに限定されない家禽である。特に好ましい哺乳類は、その肉のために飼育された家畜、例えば、バイソン、シカ、カンガルー、ウマ、ロバ、畜牛、コブウシ、ヤク、バッファロー、ヒツジ、ヤギ、トナカイ、ブタ、イノシシ、ウサギ、モルモット、ラマである。非常に特定の実施形態では、ＰＳＣは、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒトコブラクダ、ヤギ、ウマ、ブタ、ニワトリ、アヒル、ゴウシュウマダイ、ヨーロピアンシーバス、大西洋タラ及びターボットから選択される脊椎動物のいずれかに由来する。

「寡能性幹細胞」（ＯＳＣ）は、ＰＳＣのように無限に自己複製する能力を保持する、少数の細胞型へ分化するように方向付けられた前駆細胞として定義される。本発明による食料品を生産するために使用されるＯＳＣは、分化能力が特定の胚性胚葉、器官前駆細胞及び／又は特定の組織に限定されている、上で定義されるＰＳＣから派生する。したがって、ＭＤ特異的ＯＳＣは、分化能力がＭＤ系列の細胞に限定される、又は少なくともそれへのバイアスが強くかかっているＯＳＣであり、該細胞は、前記ＭＤ特異的ＯＳＣの分化によって得られる細胞のより大きな部分、又は更には大部分を構成する。換言すれば、前記細胞は、ＰＳＣと比較して、ＮＥ及び／又はＥＤ系列の細胞へと分化する能力を失っているか、又はそれへ分化する傾向が低い。また、ＥＤ特異的ＯＳＣは、分化能力がＥＤ系列の細胞に限定される、又は少なくともそれへのバイアスが強くかかっているＯＳＣであり、該細胞は、前記ＥＤ特異的ＯＳＣの分化によって得られる細胞のより大きな部分、又は更には大部分を構成する。換言すれば、前記細胞は、ＰＳＣと比較して、ＮＥ及び／又はＭＤ系列の細胞へと分化する能力を失っているか、又はそれへ分化する傾向が低い。また、ＮＥ特異的ＯＳＣは、分化能力がＮＥ系列の細胞に限定される、又は少なくともそれへのバイアスが強くかかっているＯＳＣであり、該細胞は、前記ＮＥ特異的ＯＳＣの分化によって得られる細胞のより大きな部分、又は更には大部分を構成する。換言すれば、前記ＯＳＣは、ＰＳＣと比較して、ＭＤ及び／又はＥＤ系列から選択される細胞系列へと分化する能力を失っているか、又はそれへ分化する傾向が低い。上述したように、ＯＳＣは初期系列細胞型への分化に限定され得；ＯＳＣはまた、特定の器官の細胞へ優先的に分化するように分化能力が限定され得：例えば、肝臓特異的ＯＳＣ（又は肝臓ＯＳＣ）は、分化能力が肝臓細胞又はその前駆細胞に限定されるＯＳＣであり；骨格筋特異的ＯＳＣ（又は骨格筋ＯＳＣ）は、分化能力が骨格筋細胞又はその前駆細胞に限定されるＯＳＣであり；心臓特異的ＯＳＣ（又は心臓ＯＳＣ）は、分化能力が心臓細胞又はその前駆細胞に限定されるＯＳＣであり；皮膚特異的ＯＳＣ（又は皮膚ＯＳＣ）は、分化能力がケラチノサイト又はその前駆細胞に限定されるＯＳＣであり；脂肪細胞特異的ＯＳＣ（又は脂肪ＯＳＣ）は、分化能力が脂肪細胞の細胞又はその前駆細胞に限定されるＯＳＣである。当然の帰結として、単一又は少数の系列に限定される本発明のＯＳＣは、同じ分化プロトコールに供した非改変幹細胞と比較して、いずれかの分化プロトコール（例えば、ＥＢ又は指向性分化）に供した場合に、前記系列の細胞が少なくとも有意に富む細胞集団へ分化するＯＳＣを指す。好ましい実施形態では、前記集団は、同じ分化プロトコールに供した非改変幹細胞と比較して、前記系列の細胞が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、又は更には少なくとも５０％増加する。前記系列は、当技術分野で知られているいずれかの方法によって、例えば、転写（ｑＲＴ－ＰＣＲ若しくはいずれかのＲＮＡ定量方法）又は翻訳レベル（いずれかのタンパク質定量方法若しくは細胞選別方法）で分化系列に対するマーカー遺伝子の発現を定量することによって決めることができる。

ＭＤ、ＥＤ及び外胚葉は、初期胚の３種の一次胚葉である。ＭＥＤは、ＭＤ又はＥＤ細胞へ分化する組織層の細胞を指す。ＭＤ系列の細胞は、心臓及び骨格筋細胞、平滑筋細胞、非上皮血液細胞並びに腎臓細胞を含む。また、ＭＤ特異的ＯＳＣは、心臓及び／若しくは骨格筋細胞、平滑筋細胞、非上皮血液細胞並びに／又は腎臓細胞への分化へのバイアスがかかっている。ＥＤは、分化して、内部の裏打ち、消化腺及び上皮を形成する（例えば、胃腸管及び気道、肝臓、膵臓など）。また、ＥＤ特異的ＯＳＣは、例えば、消化管又は気道、及び肝臓などの上皮細胞へのバイアスがかかっている。外胚葉は分化して、上皮（表皮）組織（例えば、皮膚、口の裏打ち、肛門、鼻孔、汗腺、髪及び爪、並びに歯のエナメル質）と、神経組織（中枢神経系及び末梢神経）とを形成する。外胚葉はＮＥから派生し、これは、上で述べたように神経系及び上皮／表皮組織の発生における第１のステップである。また、表皮特異的ＯＳＣは、皮膚細胞又は鱗屑細胞へのバイアスがかかっており、より好ましくは、皮膚細胞及び神経外胚葉特異的ＯＳＣは、神経細胞及び上皮／表皮細胞である外胚葉系列へのバイアスがかかっている。

本明細書で使用する場合、用語「系列指定因子遺伝子」は、特定の発生プログラムを実行するいくつかの下流の標的遺伝子のセットを直接的又は間接的に活性化又は抑制するのに関与する転写因子をコードする遺伝子を指す。胚発生の様々な段階への進行は、組織間、細胞間相互作用及び周辺の組織／細胞から分泌される可溶性シグナル分子（例えば、増殖因子）の活性によって引き起こされるこれらの発生マスター遺伝子の組織化された活性化に依存している。注目すべきことに、胚発生を支配する遺伝経路及び形態形成機構が高レベルに保存されていることが魚類からヒトの脊椎動物で観察されている。実際、脊椎動物の体制の一般的な構成、器官、細胞型は非常に類似している。また、脊椎動物、軟体動物、昆虫及び甲殻類の種は全て、三胚葉性であり、このことは、これらの種は全て外胚葉、ＭＤ及びＥＤを含み、これらの種でＯＳＣを生成することが可能であることを意味することに留意されたい。したがって、系列指定因子遺伝子に対するオルソログは、食料品関連種に存在し、例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌ（＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＞）のようなゲノムデータベースで容易に検索できる。また、表１～４又はこの文献全体に列挙されている系列指定因子遺伝子は、Ｈ．サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）における名前に従って示しているが、あらゆる食料品関連種におけるいずれかのオルソログ遺伝子を指すと意図される。特定の実施形態では、「系列指定因子遺伝子」に対するオルソログは、Ｈ．サピエンスでの対応するタンパク質とそのアミノ酸配列において、配列が少なくとも３０％、好ましくは３０％超、好ましくは３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、又は更に３９％の相同性を共有するタンパク質をコードし、好ましくは、前記配列は、少なくとも４０％、好ましくは４０％超、好ましくは４１％、より好ましくは４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、更により好ましくは４９％の相同性を共有し、好ましくは、前記配列は、少なくとも５０％、好ましくは５０％超、好ましくは５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、更により好ましくは５９％の相同性を共有し、好ましくは、前記配列は、少なくとも６０％、好ましくは６０％超、好ましくは６１％、６２％、より好ましくは６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、更により好ましくは６９％の相同性を共有し、好ましくは、前記配列は、少なくとも７０％、好ましくは７０％超、好ましくは７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、更により好ましくは７９％の相同性を共有し、好ましくは、前記配列は、少なくとも８０％、好ましくは８０％超、好ましくは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、更により好ましくは８９％の相同性を共有し、好ましくは、前記配列は、少なくとも９０％、好ましくは９０％超、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、更により好ましくは９９％超の相同性を共有する。別の特定の実施形態では、「系列指定因子遺伝子」に対するオルソログは、Ｈ．サピエンスでの対応するタンパク質の機能性ドメインとそのアミノ酸配列において、配列が少なくとも５０％、好ましくは５０％超、好ましくは５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、更により好ましくは５９％の相同性を共有するタンパク質をコードし、好ましくは、前記配列は、少なくとも６０％、好ましくは６０％超、好ましくは６１％、６２％、より好ましくは６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、更により好ましくは６９％の相同性を共有し、好ましくは、前記配列は、少なくとも７０％、少なくとも７０％の相同性、好ましくは７０％超、好ましくは７１％、より好ましくは７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７７％、７９％、更により好ましくは８０％超、好ましくは８１％、より好ましくは８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、更により好ましくは１００％の相同性を共有する。

「に限定される」又は「へのバイアスがかかっている」という用語は、ＯＳＣに関連する場合、互換的に使用され、前記ＯＳＣは、より効率的に、均一に、主に及び／又は自発的に、特定の系列又は分化段階へ分化することを意味する。
「インビトロ肉」、「実験室培養肉」、「合成肉」という用語は、本明細書では互換的に使用され、再構成されたか又はされていない、本明細書に記載のＯＳＣの培養、分化及び／又は加工から得られる細胞、細胞塊、組織を指す。

「食料品」は、細かく刻むこと、乾燥、調理、仕上げ、水で戻すこと、漬込み又は燻しに適合した、分化ＯＳＣの加工から得られるあらゆる生鮮製品、乾燥製品、凍結製品、粉末、ペースト、押出し成形品、液状製品又は固形製品を包含する。「食料品」はまた、例えば、スープ、ソース、シチュー、トッピング、調味料、ソーセージ、挽き肉、肉だんご、ナゲット、スプレッド、パテ、ピューレ、飲料又はシェーク、すり身、バー、ビスケット、乾燥顆粒、錠剤、カプセル、粉末として定義される食品製品も包含する。特定の実施形態では、食料品はまた、例えば、食品サプリメントとして使用されるシェーク、粉末、バーも含む。

寡能性幹細胞
本発明者らは、少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されているＰＳＣ、複能性又は全能性細胞が、未改変ＰＳＣ、複能性又は全能性細胞に対してインビトロでより効率的に、より均質に及び／又はより少ない外因性因子の必要性で分化する寡能性幹細胞（ＯＳＣ）をもたらし、それによってインビトロ分化非ヒト動物細胞を含む食料品を生産するために有利なツールを構成することを発見した。
系列指定因子遺伝子の差次的な活性化は、一次胚葉、次に特定の分化細胞型への特定の発生プログラムを実行する下流の標的遺伝子の大規模なセットを直接的又は間接的に活性化／抑制するのに関与する。系列指定因子遺伝子は、転写因子の系列指定因子遺伝子セット１の発現がＮＥを指定するのに対して系列指定因子遺伝子セット２がＭＥＤ（すなわちＭＤ及びＥＤ）を指定するなどの器官形成が完了するまでの遺伝的スイッチを構成する（図１）。

したがって、本発明の一目的は、初期胚性胚葉（ＥＤ、ＭＤ、ＭＥＤ及びＮＥ）のうちの１種の細胞を指定及び分化するのに必要な少なくとも１種の初期系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されているＯＳＣに関する。より特には、前記目的は、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＺＮＦ５２１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＺＩＣ１、ＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１、ＫＬＦ６、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ４Ａ、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＥＯＭＥＳ又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されているＯＳＣに関する。更に特には、前記目的は、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＥＯＭＥＳ又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されているＯＳＣに関する。本発明のより特定の目的は、ＥＤ、ＭＤ、ＭＥＤ又はＮＥ系列指定因子遺伝子の群から選択される少なくとも２種の系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されているＯＳＣである。その点において、前記目的は、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＺＮＦ５２１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＺＩＣ１、ＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１、ＫＬＦ６、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ４Ａ、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＥＯＭＥＳから選択される少なくとも２種の遺伝子の発現が不活性化されているＯＳＣに関する。

一実施形態では、前記ＯＳＣは、少なくとも１種の初期ＮＥ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。特定の実施形態では、前記少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子は、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＺＮＦ５２１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３及びＺＩＣ１、又はそれらの組合せから選択される。得られたＯＳＣは、有利なことに、ＭＤ及び／又はＥＤ系列の細胞への分化に限定される。
別の実施形態では、前記ＯＳＣは、少なくとも１種の初期ＭＤ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。特定の実施形態では、前記少なくとも１種のＭＤ系列指定因子遺伝子は、ＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１及びＫＬＦ６、又はそれらの組合せから選択される。得られたＯＳＣは、有利なことに、ＮＥ及び／又はＥＤ系列の細胞への分化に限定される。
別の実施形態では、前記ＯＳＣは、少なくとも１種の初期ＥＤ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。更により特定の実施形態では、前記少なくとも１種のＥＤ系列指定因子遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７、及びＨＮＦ４Ａ、又はそれらの組合せから選択される。得られたＯＳＣは、有利なことに、ＮＥ及び／又はＭＤ系列の細胞への分化に限定される。
更なる実施形態では、前記ＯＳＣは、少なくとも１種のＭＥＤ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。更により特定の実施形態では、前記少なくとも１種のＭＥＤ系列指定因子遺伝子は、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１若しくはＥＯＭＥＳ、又はそれらの組合せから選択される。得られたＯＳＣは、有利なことに、ＮＥ系列の細胞への分化に限定される。

ＮＥ系列に限定される又はそれへのバイアスがかかっているＯＳＣ：
特定の実施形態では、前記ＯＳＣは、少なくとも１種のＭＥＤ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。更により特定の実施形態では、前記少なくとも１種のＭＥＤ系列指定因子遺伝子は、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＥＯＭＥＳ、又はそれらの組合せから選択される。より特定の実施形態では、前記ＯＳＣは、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＥＯＭＥＳの発現が不活性化されている。少なくとも１種のＭＥＤ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されているこれらのＯＳＣは、有利なことに、ＮＥ系列の細胞への分化に限定される。より特定の実施形態では、ＯＳＣは、少なくとも１種のＭＥＤ系列指定因子遺伝子及び少なくとも１種の後期神経系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。前記ＯＳＣは、有利なことに、表皮（皮膚）系列に限定される、又はそれへのバイアスがかかっている。より特定の実施形態では、表皮系列に限定される前記ＯＳＣにおいて、発現が不活性化されている少なくとも１種のＭＥＤ系列指定因子遺伝子は、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＥＯＭＥＳ、又はそれらの組合せから選択される。非常に特定の実施形態では、表皮系列に限定される前記ＯＳＣは、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＥＯＭＥＳの発現が不活性化されている。別の特定の実施形態では、表皮（皮膚）系列に限定される前記ＯＳＣにおいて、発現が不活性化されている少なくとも１種の神経系列指定因子遺伝子は、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＯＸ１０、ＰＡＸ３及びＰＡＸ６、又はそれらの組合せから選択される。したがって、特定の実施形態では、表皮系列ＯＳＣに限定される前記ＯＳＣは、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＥＯＭＥＳから選択される少なくとも１種の遺伝子並びにＮＥＵＲＯＤ２、ＳＯＸ１０、ＰＡＸ３及びＰＡＸ６から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。非常に特定の実施形態では、表皮系列に限定される前記ＯＳＣは、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＯＸ１０、ＰＡＸ３及びＰＡＸ６の発現が不活性化されている。更なる特定の実施形態では、表皮（皮膚）系列に限定される前記ＯＳＣは、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＯＸ１０、ＰＡＸ３及びＰＡＸ６の発現が不活性化されている。

別の特定の実施形態では、前記ＯＳＣは、少なくとも１種の初期ＭＤ系列指定因子遺伝子及び少なくとも１種の初期ＥＤ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。次いで、前記ＯＳＣはまた、ＮＥ系列に限定される、又はそれへのバイアスがかかっている。少なくとも１種の後期神経系列の発現が更に不活性化され、それによって、前記ＯＳＣは、有利なことに、表皮（皮膚）系列に限定され得る、又はそれへのバイアスがかかり得る。より特定の実施形態では、表皮系列に限定される前記ＯＳＣにおいて、発現が不活性化されている少なくとも１種の初期ＭＤ系列指定因子遺伝子は、ＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１及びＫＬＦ６、又はそれらの組合せから選択される。更なる特定の実施形態では、表皮系列に限定される前記ＯＳＣは、ＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１及びＫＬＦ６の発現が不活性化されている。別の特定の実施形態では、表皮系列に限定される前記ＯＳＣにおいて、発現が不活性化されている少なくとも１種の初期ＥＤ系列指定因子遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７、及びＨＮＦ４Ａ、又はそれらの組合せから選択される。更なる特定の実施形態では、表皮系列に限定される前記ＯＳＣは、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７、及びＨＮＦ４Ａの発現が不活性化されている。別の特定の実施形態では、表皮（皮膚）系列に限定される前記ＯＳＣにおいて、発現が不活性化されている少なくとも１種の神経系列指定因子遺伝子は、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＯＸ１０、ＰＡＸ３及びＰＡＸ６、又はそれらの組合せから選択される。非常に特定の実施形態では、表皮系列に限定される前記ＯＳＣは、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＯＸ１０及びＰＡＸ３の発現が不活性化されている。更なる特定の実施形態では、表皮系列に限定される前記ＯＳＣは、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＯＸ１０、ＰＡＸ６及びＰＡＸ３の発現が不活性化されている。更により特定の実施形態では、表皮（皮膚）系列に限定される前記ＯＳＣは、ＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１、ＫＬＦ６、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ４Ａ、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＯＸ１０及びＰＡＸ３の発現が不活性化されている。別の特定の実施形態では、表皮（皮膚）系列に限定される前記ＯＳＣは、ＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１、ＫＬＦ６、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ４Ａ、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＯＸ１０、ＰＡＸ６及びＰＡＸ３の発現が不活性化されている。

別の特定の実施形態では、表皮（皮膚）系列に限定されるＯＳＣは、少なくとも１種の神経系列指定因子が不活性化されているＯＳＣであり得る。より特定の実施形態では、前記神経系列指定因子は、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＯＸ１０、ＰＡＸ６及びＰＡＸ３、又はそれらの組合せから選択される。

実際、ＮＥ系列又は表皮系列に限定される又はそれへのバイアスがかかっている前記ＯＳＣは、自然にＮＥ又は表皮系列細胞へ分化する傾向があり、したがって、ＮＥ又は表皮系列の細胞への細胞分化を促進するための特定の因子の必要性が少ない（通常のインビトロ分化プロトコールにおけるよりも）又は必要性がなく、このことは、これらの細胞を使用して食料品を生産することを考えたとき特に有利である。一実施形態では、前記ＮＥ系列若しくは表皮系列に限定される又はそれへのバイアスがかかっているＯＳＣは、ＮＥ又は表皮系列の細胞へ分化するための外因性因子の必要量が１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０、１／１００、１／１０００減少するか、又は必要ですらない。

ＥＤ系列に限定される又はそれへのバイアスがかかっているＯＳＣ：
特定の実施形態では、前記ＯＳＣは、少なくとも１種の初期ＮＥ系列指定因子遺伝子の発現及び少なくとも１種のＭＤ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。前記ＯＳＣは、有利なことに、ＥＤ系列に限定される、又はそれへのバイアスがかかっている。より特定の実施形態では、ＥＤ系列に限定される前記ＯＳＣにおいて、発現が不活性化されている少なくとも１種の初期ＮＥ系列指定因子遺伝子は、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＺＮＦ５２１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３及びＺＩＣ１、又はそれらの組合せから選択される。更により特定の実施形態では、ＥＤ系列に限定される前記ＯＳＣは、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＺＮＦ５２１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３及びＺＩＣ１の発現が不活性化されている。別の特定の実施形態では、ＥＤ系列に限定される前記ＯＳＣにおいて、発現が不活性化されている少なくとも１種のＭＤ系列指定因子は、ＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１及びＫＬＦ６、又はそれらの組合せから選択される。更により特定の実施形態では、ＥＤ系列に限定される前記ＯＳＣは、ＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１及びＫＬＦ６の発現が不活性化されている。更なる特定の実施形態では、ＥＤ系列に限定される前記ＯＳＣは、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＺＮＦ５２１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３及びＺＩＣ１、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の初期ＮＥ系列指定因子遺伝子の発現、並びにＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１及びＫＬＦ６、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種のＭＤ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。非常に特定の実施形態では、ＥＤ系列に限定される前記ＯＳＣは、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＺＮＦ５２１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＺＩＣ１、ＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１及びＫＬＦ６の発現が不活性化されている。ＥＤ系列に限定される好ましいＯＳＣは、少なくともＰＡＸ６の発現、並びにＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１及びＫＬＦ６、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。ＥＤ系列に限定される別の好ましいＯＳＣは、少なくともＳＯＸ１の発現、並びにＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１及びＫＬＦ６、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。ＥＤ系列に限定される別の好ましいＯＳＣは、少なくともＺＮＦ５２１の発現、並びにＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１及びＫＬＦ６、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。ＥＤ系列に限定される別の好ましいＯＳＣは、少なくともＳＯＸ２の発現、並びにＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１及びＫＬＦ６から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。ＥＤ系列に限定される別の好ましいＯＳＣは、少なくともＳＯＸ３の発現、並びにＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１及びＫＬＦ６、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。ＥＤ系列に限定される別の好ましいＯＳＣは、少なくともＺＩＣ１の発現、並びにＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１及びＫＬＦ６、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。

ＥＤ系列に限定される前記ＯＳＣは、ＥＤ細胞への分化に、ＥＤ特異的因子の必要性が少ない（通常のインビトロ分化プロトコールにおけるよりも）又は必要性がなく、このことは、これらの細胞を使用して食料品を生産することを考えたとき特に有利である。特に、ＥＤ系列に限定される前記ＯＳＣは、特定の分化細胞、例えば、初期胚体外ＥＤ、心臓誘導ＥＤ、肝臓、膵臓、中腸及び後腸、幽門、十二指腸、膵臓、前方前腸ＥＤ、肺、甲状腺、胸腺、中／後腸、腸上皮細胞、又は原則としていずれかの他のＥＤ派生系列への分化へのバイアスがかかっている。

特定の実施形態では、上記のようなＥＤ系列に限定されるＯＳＣは、ＳＯＸ７、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ５、ＧＡＴＡ６、ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．１、ＦＯＸＮ１及びＣＤＸ２、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が更に不活性化されている。

非常に特定の実施形態では、段落００３３～００３４（paragraphs [0045-0046]）のいずれかに記載されるＥＤ系列に限定されるＯＳＣは、ＥＤ細胞の非肝臓系列細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子の発現が更に不活性化されている。更により特定の実施形態では、前記少なくとも１種の遺伝子は、ＳＯＸ７、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ５、ＧＡＴＡ６、ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．１、ＦＯＸＮ１及びＣＤＸ２又はそれらの組合せから選択される。更なる特定の実施形態では、ＥＤ系列に限定される前記ＯＳＣは、ＳＯＸ７の発現と、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ５及びＧＡＴＡ６又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現とが不活性化されており、それによって、肝細胞への分化に限定されるＯＳＣが提供される。更なる特定の実施形態では、ＥＤ系列に限定される前記ＯＳＣは、少なくともＳＯＸ７の発現と、ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．１、ＦＯＸＮ１及びＣＤＸ２、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現とが不活性化されており、それによって、肝細胞への分化に限定されるＯＳＣが提供される。更なる特定の実施形態では、ＥＤ系列に限定される前記ＯＳＣは、ＳＯＸ７、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ５、ＧＡＴＡ６、ＦＯＸＡ３、ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．１、ＦＯＸＮ１及びＣＤＸ２の発現が不活性化されており、それによって、肝細胞への分化に限定されるＯＳＣが提供される。

別の特定の実施形態では、肝細胞への分化に限定されるＯＳＣは、ＥＤ細胞の非肝臓系列細胞の神経系列指定因子への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子が不活性化されているＯＳＣであり得る。より特定の実施形態では、前記少なくとも１種の遺伝子は、ＳＯＸ７、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ５、ＧＡＴＡ６、ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．１、ＦＯＸＮ１及びＣＤＸ２又はそれらの組合せから選択される。

ＭＤ系列に限定される又はそれへのバイアスがかかっているＯＳＣ：
別の特定の実施形態では、前記ＯＳＣは、少なくとも１種の初期ＮＥ系列指定因子遺伝子の発現及び少なくとも１種のＥＤ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。前記ＯＳＣは、有利なことに、ＭＤ系列に限定される、又はそれへのバイアスがかかっている。より特定の実施形態では、前記ＭＤ系列に限定されるＯＳＣにおいて、発現が不活性化されている少なくとも１種の初期ＮＥ系列指定因子遺伝子は、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＺＮＦ５２１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３及びＺＩＣ１、又はそれらの組合せから選択される。更により特定の実施形態では、ＭＤ系列に限定される前記ＯＳＣは、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＺＮＦ５２１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３及びＺＩＣ１の発現が不活性化されている。別の特定の実施形態では、ＭＤ系列に限定される前記ＯＳＣにおいて、発現が不活性化されている少なくとも１種のＥＤ系列指定因子遺伝子は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７、及びＨＮＦ４Ａ、又はそれらの組合せから選択される。更により特定の実施形態では、ＭＤ系列に限定される前記ＯＳＣは、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７、及びＨＮＦ４Ａの発現が不活性化されている。別の特定の実施形態では、ＭＤ系列に限定される前記ＯＳＣは、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＺＮＦ５２１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３及びＺＩＣ１、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の初期ＮＥ系列指定因子遺伝子の発現、並びにＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７、及びＨＮＦ４Ａ、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種のＥＤ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。ＭＤ系列に限定される好ましいＯＳＣは、少なくともＰＡＸ６の発現、並びにＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７及びＨＮＦ４Ａ、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。ＭＤ系列に限定される別の好ましいＯＳＣは、少なくともＳＯＸ１の発現、並びにＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７及びＨＮＦ４Ａ、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。ＭＤ系列に限定される別の好ましいＯＳＣは、少なくともＺＮＦ５２１の発現、並びにＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７及びＨＮＦ４Ａ、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。ＭＤ系列に限定される別の好ましいＯＳＣは、少なくともＳＯＸ２の発現、並びにＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７及びＨＮＦ４Ａ、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。ＭＤ系列に限定される別の好ましいＯＳＣは、少なくともＳＯＸ３の発現、並びにＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７及びＨＮＦ４Ａ、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。ＭＤ系列に限定される別の好ましいＯＳＣは、少なくともＺＩＣ１の発現、並びにＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７及びＨＮＦ４Ａ、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている。

前記ＭＤ系列に限定されるＯＳＣは、ＭＤ細胞への分化に、ＭＤ特異的因子の必要性が少ない（通常のインビトロ分化プロトコールにおけるよりも）又は必要性がなく、このことは、これらの細胞を使用して食料品を生産することを考えたとき特に有利である。特に、ＭＤ系列に限定される前記ＯＳＣは、特定の分化細胞、例えば、内皮系列、腎臓系列、造血系列（例えば、赤血球として）、骨格筋系列（骨格筋細胞として）、心臓系列（心筋細胞として）、骨系列、軟骨系列、脂肪系列（脂肪細胞として）、線維芽細胞系列の細胞への分化へのバイアスがかかっている。
特定の実施形態では、上記のようなＭＤ系列に限定されるＯＳＣは、ＳＯＸ１８、ＯＳＲ１、ＥＹＡ１、ＲＵＮＸ１、ＴＡＬ１、ＭＥＳＰ１、ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１、ＰＡＸ７、ＭＹＯＤ１、ＭＹＦ５、ＲＵＮＸ２、ＫＬＦ２、ＭＳＸ２、ＰＡＸ９、ＮＫＸ３．２、ＳＯＸ８、ＳＯＸ９、ＰＰＡＲＧ、及びＣＥＢＰＡ、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が更に不活性化されている。

別の特定の実施形態では、段落００３８～００３９（paragraphs [0049-0050]）に記載されるＭＤ系列に限定される前記ＯＳＣが、ＭＤ細胞の非心臓前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されていることによって、心筋細胞への分化に限定される又はそれへの分化へのバイアスがかかっている心臓特異的ＯＳＣが提供される。更により特定の実施形態では、前記心臓特異的ＯＳＣが、ＳＯＸ１８、ＯＳＲ１、ＥＹＡ１、ＲＵＮＸ１、ＴＡＬ１、ＰＡＸ７、ＭＹＯＤ１、ＭＹＦ５、ＲＵＮＸ２、ＫＬＦ２、ＭＳＸ２、ＰＡＸ９、ＮＫＸ３．２、ＳＯＸ８、ＳＯＸ９、ＰＰＡＲＧ、及びＣＥＢＰＡ、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されていることによって、心筋細胞への分化に限定される又はそれへの分化へのバイアスがかかっているＯＳＣが提供される。更なる特定の実施形態では、ＭＤ系列に限定される前記ＯＳＣが、ＳＯＸ１８、ＯＳＲ１、ＥＹＡ１、ＲＵＮＸ１、ＴＡＬ１、ＰＡＸ７、ＭＹＯＤ１、ＭＹＦ５、ＲＵＮＸ２、ＫＬＦ２、ＭＳＸ２、ＰＡＸ９、ＮＫＸ３．２、ＳＯＸ８、ＳＯＸ９、ＰＰＡＲＧ、及びＣＥＢＰＡの発現が不活性化されている心臓特異的ＯＳＣであることによって、心筋細胞への分化に限定される又はそれへの分化へのバイアスがかかっているＯＳＣが提供される。

別の特定の実施形態では、心筋細胞への分化に限定されるＯＳＣは、ＳＯＸ１８、ＯＳＲ１、ＥＹＡ１、ＲＵＮＸ１、ＴＡＬ１、ＰＡＸ７、ＭＹＯＤ１、ＭＹＦ５、ＲＵＮＸ２、ＫＬＦ２、ＭＳＸ２、ＰＡＸ９、ＮＫＸ３．２、ＳＯＸ８、ＳＯＸ９、ＰＰＡＲＧ、及びＣＥＢＰＡから選択される少なくとも１種の遺伝子が不活性化されているＯＳＣであり得る。
別の特定の実施形態では、段落［００４９～００５０］に記載されるＭＤ系列に限定される前記ＯＳＣが、ＭＤ細胞の非骨格筋前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されていることによって、骨格筋細胞又はその前駆細胞への分化に限定される又はそれへの分化へのバイアスがかかっている骨格筋特異的ＯＳＣが提供される。より特定の実施形態では、ＭＤ系列に限定される前記ＯＳＣが、ＳＯＸ１８、ＯＳＲ１、ＥＹＡ１、ＲＵＮＸ１、ＴＡＬ１、ＭＥＳＰ１、ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１、ＲＵＮＸ２、ＫＬＦ２、ＭＳＸ２、ＰＡＸ９、ＮＫＸ３．２、ＳＯＸ８、ＳＯＸ９、ＰＰＡＲＧ、及びＣＥＢＰＡ、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されていることによって、骨格筋細胞又はその前駆細胞への分化に限定される又はそれへの分化へのバイアスがかかっているＯＳＣが提供される。更により特定の実施形態では、ＭＤ系列に限定される前記ＯＳＣが、ＳＯＸ１８、ＯＳＲ１、ＥＹＡ１、ＲＵＮＸ１、ＴＡＬ１、ＭＥＳＰ１、ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１、ＲＵＮＸ２、ＫＬＦ２、ＭＳＸ２、ＰＡＸ９、ＮＫＸ３．２、ＳＯＸ８、ＳＯＸ９、ＰＰＡＲＧ、及びＣＥＢＰＡの発現が不活性化されていることによって、骨格筋細胞又はその前駆細胞への分化に限定される又はそれへの分化へのバイアスがかかっているＯＳＣが提供される。

別の特定の実施形態では、骨格筋細胞への分化に限定されるＯＳＣは、ＳＯＸ１８、ＯＳＲ１、ＥＹＡ１、ＲＵＮＸ１、ＴＡＬ１、ＭＥＳＰ１、ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１、ＲＵＮＸ２、ＫＬＦ２、ＭＳＸ２、ＰＡＸ９、ＮＫＸ３．２、ＳＯＸ８、ＳＯＸ９、ＰＰＡＲＧ、及びＣＥＢＰＡから選択される少なくとも１種の遺伝子が不活性化されているＯＳＣであり得る。
別の特定の実施形態では、段落［００４９～００５０］に記載されるＭＤ系列に限定される前記ＯＳＣが、ＭＤ細胞の非脂肪細胞の前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されていることによって、脂肪細胞への分化に限定される又はそれへの分化へのバイアスがかかっている脂肪細胞特異的ＯＳＣが提供される。より特定の実施形態では、ＭＤ系列に限定される又はそれへのバイアスがかかっている前記ＯＳＣが、ＳＯＸ１８、ＯＳＲ１、ＥＹＡ１、ＲＵＮＸ１、ＴＡＬ１、ＭＥＳＰ１、ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１、ＰＡＸ７、ＭＹＯＤ１、ＭＹＦ５、ＲＵＮＸ２、ＫＬＦ２、ＭＳＸ２、ＰＡＸ９、ＮＫＸ３．２、ＳＯＸ８、及びＳＯＸ９、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されていることによって、脂肪細胞への分化に限定される又はそれへの分化へのバイアスがかかっているＯＳＣが提供される。更により特定の実施形態では、ＥＤ系列に限定される前記ＯＳＣが、ＳＯＸ１８、ＯＳＲ１、ＥＹＡ１、ＲＵＮＸ１、ＴＡＬ１、ＭＥＳＰ１、ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１、ＰＡＸ７、ＭＹＯＤ１、ＭＹＦ５、ＲＵＮＸ２、ＫＬＦ２、ＭＳＸ２、ＰＡＸ９、ＮＫＸ３．２、ＳＯＸ８、及びＳＯＸ９の発現が不活性化されていることによって、脂肪細胞への分化に限定される又はそれへの分化へのバイアスがかかっているＯＳＣが提供される。

別の特定の実施形態では、脂肪細胞への分化に限定されるＯＳＣは、ＳＯＸ１８、ＯＳＲ１、ＥＹＡ１、ＲＵＮＸ１、ＴＡＬ１、ＭＥＳＰ１、ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１、ＰＡＸ７、ＭＹＯＤ１、ＭＹＦ５、ＲＵＮＸ２、ＫＬＦ２、ＭＳＸ２、ＰＡＸ９、ＮＫＸ３．２、ＳＯＸ８、及びＳＯＸ９から選択される少なくとも１種の遺伝子が不活性化されているＯＳＣであり得る。

別の特定の実施形態では、段落［００４９～００５０］に記載されるＭＤ系列に限定される前記ＯＳＣが、ＭＤ細胞の非造血前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されていることによって、造血細胞への分化に限定される又はそれへの分化へのバイアスがかかっている造血細胞特異的ＯＳＣが提供される。より特定の実施形態では、ＭＤ系列に限定される前記ＯＳＣが、ＳＯＸ１８、ＯＳＲ１、ＥＹＡ１、ＭＥＳＰ１、ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１、ＰＡＸ７、ＭＹＯＤ１、ＭＹＦ５、ＲＵＮＸ２、ＫＬＦ２、ＭＳＸ２、ＰＡＸ９、ＮＫＸ３．２、ＳＯＸ８、ＳＯＸ９、ＰＰＡＲＧ、及びＣＥＢＰＡ、又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されていることによって、造血細胞への分化に限定される又はそれへの分化へのバイアスがかかっているＯＳＣが提供される。更により特定の実施形態では、ＭＤ系列に限定される前記ＯＳＣは、ＳＯＸ１８、ＯＳＲ１、ＥＹＡ１、ＭＥＳＰ１、ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１、ＰＡＸ７、ＭＹＯＤ１、ＭＹＦ５、ＲＵＮＸ２、ＫＬＦ２、ＭＳＸ２、ＰＡＸ９、ＮＫＸ３．２、ＳＯＸ８、ＳＯＸ９、ＰＰＡＲＧ、及びＣＥＢＰＡの発現が不活性化されており、それによって、造血細胞への分化に限定されるＯＳＣが提供される。

別の特定の実施形態では、造血細胞への分化に限定されるＯＳＣは、ＳＯＸ１８、ＯＳＲ１、ＥＹＡ１、ＭＥＳＰ１、ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１、ＰＡＸ７、ＭＹＯＤ１、ＭＹＦ５、ＲＵＮＸ２、ＫＬＦ２、ＭＳＸ２、ＰＡＸ９、ＮＫＸ３．２、ＳＯＸ８、ＳＯＸ９、ＰＰＡＲＧ、及びＣＥＢＰＡから選択される少なくとも１種の遺伝子が不活性化されているＯＳＣであり得る。
別の特定の実施形態では、本発明によるＯＳＣは、ＳＯＸ１８、ＯＳＲ１、ＥＹＡ１、ＲＵＮＸ１、ＴＡＬ１、ＭＥＳＰ１、ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１、ＰＡＸ７、ＭＹＯＤ、ＭＹＦ５、ＲＵＮＸ２、ＫＬＦ２、ＭＳＸ２、ＰＡＸ９、ＮＫＸ３．２、ＳＯＸ８、ＳＯＸ９、ＰＰＡＲＧ（ＰＰＡＲγ）、ＣＥＢＰＡ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ５、ＧＡＴＡ６、ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．１、ＦＯＸＮ１、ＣＤＸ２、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＯＸ１０、ＰＡＸ３及びＰＡＸ６から選択される少なくとも１種の遺伝子、好ましくは２種の遺伝子の発現が不活性化されている。

食料品を生産する方法
幹細胞は、移植治療、再生医療、及び組織工学の分野で有益なツールと考えられている。幹細胞をインビトロでの肉の生産に使用することは、持続可能性だけでなく動物福祉の観点からも、動物に由来する肉に代わるものと考えられている。いずれにしても、この技術はいまだその揺籃期にあり、高価な組換え分化因子及び多数の増殖培地を可能な限り使用せずに、量を十分に増やした後に所望の細胞型又はその前駆細胞に満足のいく収量で分化することができる安定な細胞の使用が必要とされている。本発明者らは、上記のようなＯＳＣは、インビトロ肉の生産及びそれから派生する食料品に特に適していることを発見した。
したがって、本発明の１つの目的は、少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている少なくとも１種のＯＳＣに由来したインビトロ分化非ヒト動物細胞を加工するステップを含む食料品を生産する方法に関する。
実際、当技術分野で開発された戦略のほとんどは、系列指定因子遺伝子を発現する誘導可能な導入遺伝子を幹細胞に組み込んで、強制発現させ、前記導入遺伝子に支配される系列への分化を引き起こすことに存する。かかる戦略により、導入遺伝子を持つ遺伝子改変された細胞が得られるが、該導入遺伝子は、制御された発現が時間の経過とともに失われる可能性があり（主に進行性のエピジェネティックなサイレンシングによって引き起こされる）、ヒトの健康に有害な可能性がある世界中のいくつかの食糧庁によって禁止されている抗生物質及び化学物質のような誘導物質の使用を必要とする。以下に説明するように、本発明のＯＳＣは導入遺伝子の挿入を全く含まず、これは、遺伝的安定性及び食品産業での使用の安全性の点で特に有利である。

少なくとも１種のＯＳＣに由来するインビトロ分化非ヒト動物細胞を加工するステップは、前記細胞を収集すること、任意に、細胞を洗浄する（又はすすぐ）こと、前記細胞を他の食品原料と混合すること、及び／又は通常の消費形態で食料品を提供することを含み得る。収集することは、例えば、細胞培養の容量及び条件、細胞の特徴、収集した細胞の想定される用途に応じて、例えば、遠心分離、ろ過若しくは沈殿（すなわち、凝集、沈降若しくはデカンテーション）、又はそれらの組合せといった細胞培養懸濁液から細胞を回収する当技術分野で知られているいずれかの方法によって行うことができる。例えば、細胞の沈殿は、細胞懸濁液にカルシウム塩を添加することによって実施できる。カルシウム塩は、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、グルコノ乳酸カルシウム、リン酸カルシウムからなる群から選択され得るが、これらに限定されない。好ましくは、塩化カルシウムが使用される。塩化カルシウムの最終濃度は、１０～５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５０～３００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌの範囲である。別の例では、培養容量が適合する限り、細胞培養物は、例えば、生細胞が次の加工するステップを必要とするか否か、又は後で加工する細胞の所望の圧縮性に合わせた好都合な速度で遠心分離できる。任意に、収集した細胞は、例えば、新鮮な培地や生理食塩水を用いて洗浄又はすすいだ後に再遠心分離することができる。残余の培養培地配合物を減少又は除去するのに適した他のあらゆる手段を代替的又は追加的に使用できる（例えば、ろ過、透析、沈殿・・・）。

好ましくは、前記通常の消費形態は、従来の肉又は肉ベース製品（すなわち、飼育された動物からの肉を含み、培養細胞からの肉を含まない）の外見及び／又は更には官能特性を模倣する。その点において、前記食料品は、飼われた動物からの特定の組織を模倣する相対比である、本明細書に記載のいくつかのＯＳＣの混合物又はこれらのＯＳＣからの分化細胞の混合物に基づくことができる。例えば、前記食料品は、脂肪細胞、骨格筋細胞、皮膚細胞（ケラチノサイト）、神経細胞及び／又は軟骨細胞の特定の混合物を、例えば、牛肉又は鳥肉の特定のカットのものに対応する相対比で含み得る。したがって、好ましくは、本発明による食料品は、ＯＳＣ若しくはこれらのＯＳＣからの分化細胞及び／又はその抽出物を含むが、換言すれば、細胞は、無傷の未分化及び／若しくは分化ＯＳＣ；並びに／又は破壊された未分化及び／若しくは分化ＯＳＣであり得る。

加工するステップは、食料品の総質量に対して少なくとも１質量％の、培養ＯＳＣ、若しくはこれらのＯＳＣからの分化細胞及び／又はその細胞抽出物を、混ぜることを含み得る。好ましくは、食料品の総質量に対して少なくとも２質量％の、培養ＯＳＣ、若しくはこれらのＯＳＣからの分化細胞及び／又はその細胞抽出物を、他の原料に混合する。より好ましくは、食料品の総質量に対して少なくとも５％の、培養ＯＳＣ、若しくはこれらのＯＳＣからの分化細胞及び／又はその細胞抽出物を、他の原料に混合する。更により好ましくは、食料品の総質量に対して少なくとも１０質量％の、培養ＯＳＣ、若しくはこれらのＯＳＣからの分化細胞及び／又はその細胞抽出物を、他の原料に混合する。前記質量は、好ましくは湿食料品質量である。
好ましくは、加工するステップの間に、食料品の総質量に対して９９質量％以下の、培養ＯＳＣ、若しくはこれらのＯＳＣからの分化細胞及び／又はその細胞抽出物を、他の原料に混合する。より好ましくは、加工するステップの間に、食料品の総質量に対して９５質量％以下の、ＯＳＣ、若しくはこれらのＯＳＣからの分化細胞及び／又はその細胞抽出物を、他の原料に混合する。更により好ましくは、加工するステップの間に、８０質量％以下の、ＯＳＣ、若しくはこれらのＯＳＣからの分化細胞及び／又はその細胞抽出物を、他の原料に混合する。質量は、好ましくは湿食料品質量である。

例えば、食料品は、食料品の総湿質量に対して、培養ＯＳＣ、若しくは分化ＯＳＣ及び／又はその細胞抽出物を、１質量％～１００質量％、好ましくは１質量％～９９質量％、更には２質量％～９５質量％、５質量％～９０質量％、好ましくは１０質量％～８０質量％、より好ましくは２０質量％～７０質量％、又は更により好ましくは３０質量％～６０質量％含む。
好ましくは、食料品に組み込まれる細胞は、本発明のＯＳＣの分化からもたらされる；前記細胞は、いずれかの分化段階、すなわち、中間分化段階又は後期分化段階であり得る。中間分化段階にある細胞は、少なくとも１種の更なる分化ステップが可能な細胞である。図１に図示されるような中間分化段階にある細胞は、例えば、ＭＤ、ＥＤ、外胚葉型の細胞、外胚葉神経板、神経堤、神経管若しくは表皮の細胞、前腸、中腸、後腸、尿生殖路前駆体細胞、間葉型細胞、中皮型細胞、非上皮血液細胞、体腔細胞、中間ＭＤ型細胞、脊索型細胞、沿軸ＭＤ型細胞、又は側板ＭＤ型細胞のようなＥＤ系列の前駆体細胞に対応し得る。後期分化段階にある細胞は、図１に列挙されているいずれかの型の細胞であり得る。
特定の実施形態では、加工するステップは、食料品の総湿質量に対して、肝細胞を少なくとも１質量％、好ましくは肝細胞を少なくとも２質量％、より好ましくは肝細胞を少なくとも５質量％、更により好ましくは肝細胞を少なくとも１０質量％混ぜることを含み得、前記肝細胞は、上で述べたようにＯＳＣに由来する。好ましくは、加工するステップは、食料品の総湿質量に対して、肝細胞を９９質量％以下、より好ましくは肝細胞を９５質量％以下、更により好ましくは肝細胞を９０質量％以下混ぜることを含み得、前記肝細胞は、上で述べたようにＯＳＣに由来する。前記加工するステップは、食品原料を混ぜて調理するステップを含み得、その結果、実施例の項に記載されるフォアグラのようなアヒルレバーパテがもたらされる。

特定の実施形態では、加工するステップは、食料品の総湿質量に対して、上記のような少なくとも１種のＯＳＣの分化からもたらされる、筋細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞）を少なくとも１質量％混ぜること、好ましくは筋細胞を少なくとも２質量％、より好ましくは筋細胞を少なくとも５質量％、更により好ましくは筋細胞を少なくとも１０質量％混ぜることを含み得る。好ましくは、得られた食料品は、食料品の総湿質量に対して、筋細胞を９９質量％以下、より好ましくは筋細胞を９５質量％以下、更により好ましくは筋細胞を９０質量％以下含む。例えば、食料品は、食料品の総湿質量に対して、筋細胞を１質量％～１００質量％、好ましくは筋細胞を１質量％～９９質量％、より好ましくは筋細胞を２質量％～９５質量％、更により好ましくは筋細胞を５質量％～９０質量％含む。

別の特定の実施形態では、加工するステップは、食料品の総湿質量に対して、上記のような少なくとも１種のＯＳＣの分化から生じる、ケラチノサイトを少なくとも１質量％混ぜること、好ましくはケラチノサイトを少なくとも２質量％、より好ましくはケラチノサイトを少なくとも５質量％、更により好ましくはケラチノサイトを少なくとも１０質量％混ぜることを含み得る。好ましくは、得られた食料品は、食料品の総湿質量に対して、ケラチノサイトを９９質量％以下、より好ましくはケラチノサイトを９５質量％以下、更により好ましくはケラチノサイトを９０質量％以下含む。例えば、食料品は、食料品の総湿質量に対して、ケラチノサイトを１質量％～１００質量％、好ましくはケラチノサイトを１質量％～９９質量％、より好ましくはケラチノサイトを２質量％～９５質量％、更により好ましくはケラチノサイトを５質量％～９０質量％含む。

動物由来の細胞は、屠殺された動物から得られる従来の肉製品の官能特性に近づけるのに最も適切な配合物である。実際、植物又は真菌由来の細胞又はタンパク質は、屠殺された動物から得られる従来の肉製品（特にその風味）を模倣するのに、はるかに多くの変換ステップ及び添加物成分を必要とする肉の代替品であり、動物性の従来の食品を食べる消費者の味覚経験を満足に再現できないことが多い。本発明によるＯＳＣは、動物由来であり、それ故に屠殺された動物からの動物組織の最も近い対応物であり、従来の肉製品と比較してより低い環境フットプリントで使用でき、競争力のある収量を提供し、外来ＤＮＡを呈さないため、この需要を満たす。この実施形態に限定されるものではないが、上述したように、加工するステップは、屠殺された動物に由来する原料を組み込んだ食料品のような細胞組成の食料品を得るために、様々な分化系列の細胞を混ぜることを含み、それによって、消費者に改善された官能体験をもたらし得る。例えば、１片の牛肉の外見、質感、及び／又は風味に可能な限り近づけるために、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、造血細胞、脂肪細胞は、動物に由来する１片の肉に関して当技術分野で知られている割合と類似の割合で一緒に混ぜることができる。また、異なる分化系列の細胞を、食料品中で結合している様々な特定の層又は部分の下に配置すること（例えば、ケラチノサイト及び／又は脂肪細胞の層が上にある肉の層として）も、一緒に混合して均質混合物とすることもできる。
ＯＳＣ、若しくはこれらのＯＳＣからの分化細胞及び／又はそれらの抽出物と混合する他の食品原料としては、調味料、風味剤、質感付与剤（texturizer）、着色料、保存料、若しくはあらゆる他の食品原料（植物材料、食用植物脂肪など・・・）又はそれらの組合せを少なくとも挙げることができる。

調味料は、例えば、塩；コショウ；ニンニク又はワケギ；ローズマリー、セージ、ミント、オレガノ、パセリ、タイム、ゲッケイジュの葉、クローブ、バジル、チャイブ、マヨラナ、ナツメグ、カルダモン、チリ、シナモン、ウイキョウ、コロハ、ショウガ、サフラン、バニラ及びコリアンダーを含む、香りの良いハーブ及び／若しくは香辛料；ワイン、強酒精（spirituous）、コニャック、アルマニャック、ポートワイン、ピノー・デ・シャラント、ラム、ウイスキー、カルヴァ、ポモー・ド・ノルマンディー、ジュランソン、ソーテルヌ、パシュランを含む、アルコール飲料；又はあらゆるそれらの組合せから選択することができる。
食用植物脂肪は、調理のために一般的に使用されている植物油、例えば、キャノーラ油、ヒマシ油、ヤシ油、アマニ油、アランブラキア油、オリーブ油、ヒマワリ油、ダイズ油、ラッカセイ油、イリッペ油、綿実油、シア油、パーム油、アボカド油、ベニバナ油、ゴマ油、レモン油、ブドウ種油、マカダミア油、アーモンド油、サル油、コカム油、又はマンゴー油、又はそれらの組合せから選択することができる。
風味剤は、例えば、風味増強剤、甘味料又はあらゆるそれらの組合せから選択することができる。
質感付与剤は、例えば、増量剤若しくは増粘剤、乾燥剤、硬化剤又はあらゆるそれらの組合せから選択することができる。
保存料は、例えば、抗菌剤、ｐＨ調整剤、又はあらゆるそれらの組合せから選択することができる。

着色料は、食品に使用するのに適したものである必要があり；例えば、天然の着色料、例えば、カロテン、トマト、ビート、又はその混合物から選択することができる。
加工するステップは、当業者によく知られているいずれかの手段によって行うことができる。かかる加工ステップの非限定的例は、前記分化細胞及び／又はこれらの分化細胞から抽出した成分（例えば、タンパク質）を対象とした、固めること、加圧、加熱、乾燥、凍結乾燥、凍結、煮ること、調理、燻し、照射、均質化、加圧下調理、成形、投与、缶詰化、低温殺菌、押出し及び／又は包装である。
加工するステップはまた以下の質感付与手法の使用も含むことができる：例えば、分化細胞又はそのあらゆる派生細胞若しくは抽出物（タンパク質分画、脂肪分画など）のいずれかに適用される湿式スピニング、３Ｄ印刷、エレクトロスピニング、押出し、浸漬、液体噴霧、乾式噴霧、噴霧乾燥、インクジェット適用など。
したがって、これらを使用して、所望の稠性、質感及び外見を呈する最終製品を生産することができる。有利なことに、前記質感付与手法は、食料品において、屠殺された動物に由来する１片の肉の外見をより正確に再現するために３次元に組織化された（層の下、挿入）又は単に一緒に混合した様々な型の細胞を含む複雑な食料品を提供するのに使用できる。例えば、使用する際には、様々なインクを用いることができ、各インクは、様々な型の分化ＯＳＣ（例えば、内皮細胞、脂肪細胞、骨格筋及び／又はケラチノサイト）を含み、前記ＯＳＣは、例えば、上で説明したように他の食品原料と混合されて肉製品を再現する。

いくつかの例では、分化細胞はまた、特定の成分に富む培地で特定の条件下で更に培養して、ヒトの健康又は動物の食事に有益な改善された食料品を提供することもできる。かかる成分は、例えば、必須微量元素、ミネラル、コビタミン、必須脂肪酸、必須アミノ酸、酵素、抗酸化剤など・・・であり得るが、これらに限定されない。他の例では、分化細胞は、特定の食品製品又は高級食品製品を生産するために、特定の条件下で培養できる。この点において、飽和パルミチン酸及び／又は一価不飽和オレイン酸のような脂肪酸に富む培地中で肝細胞を培養することで、用量依存的に脂肪症が誘導されることが当技術分野で知られている（Ｍｏｒａｖｃｏｖａら、２０１５）。脂肪症は、肝細胞におけるトリグリセリド及び脂肪酸の蓄積であり、フォアグラ高級食品で観察される。また、特定の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１種のＯＳＣに由来する肝細胞からのフォアグラの生産方法に関し、前記肝細胞を、トリグリセリド及び／又は脂肪酸が前記肝細胞に蓄積するように、脂肪症を促進する条件下、例えば、脂肪酸に富む培地中で培養する。

好ましくは、細胞は、以下を得るために加工される：生鮮製品、乾燥製品、凍結製品、粉末、ペースト、押出し成形品、固体又は液体からなる群から選択される形態の食料品、任意に、細かく刻むこと、調理、仕上げ、水で戻すこと、漬込み又は燻しを行った又はそれに適合した製品。食料品製品は、加工食品製品として、例えば、スープ、ソース、トッピング、調味料、シチュー、ソーセージ、挽き肉、肉だんご、ナゲット、スプレッド、パテ、ピューレ、飲料、又はシェーク、すり身、ビスケット、乾燥顆粒、錠剤、カプセル、粉末として、定義されるように加工できる。
特定の実施形態では、前記方法は、インビトロ分化非ヒト動物細胞を加工するステップの前に、前記インビトロ分化非ヒト動物細胞を生産するステップであって、
－ 少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている少なくとも１種のＯＳＣを増幅させるステップ、
－ 任意に、前記増幅されたＯＳＣを胚様体として培養するステップ、又は
－ 任意に、前記ＯＳＣを特定の細胞型へ分化させるステップ
を含むステップを含む。

ＯＳＣは、無限に分裂する能力を保持している改変ＰＳＣであり、この能力は、高収量の細胞を必要とする合成肉製品の分野において、特に興味を持たれており、増殖する能力を失っている又はそれが限定されている分化細胞では得ることができないことを理解されたい。ＯＳＣは、自己複製することができ、所望の細胞密度が得られる場合、適切なシグナル伝達に曝露されると分化できる。
少なくとも１種のＯＳＣを増幅させるステップは、当業者からよく知られたいずれかの方法を用いて未分化ＯＳＣを培養することで行うことができる。哺乳類及び他の脊椎動物細胞に対して、培養培地は市販されており、当業者からよく知られている。甲殻類細胞の増殖のための更なる例示の培地は、ＷＯ２０２０／１４９７９１に見出される。また、昆虫細胞のための培養培地もＲｏｓｅｌｌｏら（２０１３）に見出される。例えば、未分化ＯＳＣの拡大は、マトリックス依存性の表面付着二次元（２Ｄ）培養において、従来の皿又はフラスコを使用して、培養皿を増やすか、又は多層フラスコの使用によって達成できる。或いは、ＯＳＣは、三次元（３Ｄ）マトリックス依存性の培養における増殖、又は計装撹拌槽バイオリアクター（instrumented stirred tank bioreactors）における「自由浮遊」懸濁培養としての増殖又は足場依存性ＯＳＣに利用可能な表面積を拡大する「浮遊表面」を提供するマイクロキャリアを使用しての増殖に適合させることができる（Ｓｅｒｒａら、２０１２；Ｋｒｏｐｐら、２０１７）。

或いは、増幅ステップは、当業者からよく知られているいずれかの方法を使用して、少なくとも１種のＯＳＣが制限される細胞系列及び所望の分化細胞型に応じて実行できる。例えば、現在、Ｃｈｅｎｇら（２０１２）に記載されているように、自己複製するＥＤにコミットされた幹細胞系を樹立することが可能である。このアプローチはまた、ＥＤ限定ＯＳＣに適用可能であり、複数の培養皿若しくは多層フラスコを使用して２Ｄで、又はマトリックス依存性培養若しくは計装撹拌槽バイオリアクターを使用して３Ｄでスケーラブルである。ＥＤ限定又は、例えば、肝臓限定ＯＳＣに適用可能な別のアプローチが、Ａｋｂａｒｉら（２０１９）に記載されており、これにより、ＰＳＣ派生肝臓オルガノイドの長期の拡大（最大１年）が可能となる。Ａｋｂａｒｉらのアプローチはまた、ＭＤにコミットされたＯＳＣに適用できる。かかるＭＤ前駆細胞培養物はまた、２Ｄ又は３Ｄ培養条件で更に増幅できる。或いは、ＭＤ限定又は心臓限定ＯＳＣは、Ｃｈｅｎら（２０１４）、Ｋｅｍｐｆら（２０１６）又はＶａｈｄａｔら（２０１９）によって教示されているように懸濁３Ｄ培養で増幅できる。同様に、ヒトｉＰＳＣ派生骨格筋細胞の大規模な拡大が、記述されており（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌら、２０１８）、ＭＤ限定又は骨格筋限定ＯＳＣに適用することに成功できている。これらの方法は、あらゆる食料品関連細胞型（例えば、線維芽細胞、赤血球、又は脂肪細胞）を増幅させるのに容易に適応可能である。

前記増幅されたＯＳＣから胚様体を生成させる任意のステップは、細胞が増殖している支持体から細胞を剥離すること、及び細胞を３Ｄ懸濁培養で増殖させることを含む。細胞凝集体は、増殖用培地中で多能性を維持するシグナル伝達分子を除去すると、３種の胚性胚葉の子孫へ自発的に分化する。野生型ＰＳＣから生成させた胚様体の細胞組成及び遺伝子発現シグネチャーは、３種の胚性胚葉への分化能力を定量するためのアッセイとして一般的に使用されている。上記のようなＯＳＣは、非改変ＰＳＣから派生する胚様体と比較するとＥＢ分化培養条件下、より均質な培養分化細胞の塊（すなわち、特定の系列の細胞に富む）を得られると期待されるため、ＥＢを生成させるのに特に有利である。更に、ＥＢ培養は、バイオリアクターで効率的にスケールアップできる。特定の実施形態では、上記のようなＯＳＣからできているＥＢから得られる分化細胞の塊は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、更により好ましくは少なくとも５０％、前記ＯＳＣに関連する型の特定の細胞系列に富む。一例として、ＭＤ系列に限定されるＯＳＣからできているＥＢからの培養分化細胞の塊は、その分化能にバイアスがかかっていないＰＳＣからできているＥＢから得られる分化細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、更により好ましくは少なくとも５０％、ＭＤ系列の細胞に富む。また、別の例では、ＥＤ系列に限定されるＯＳＣからできているＥＢからの培養分化細胞の塊は、その分化能にバイアスがかかっていないＰＳＣからできているＥＢから得られる分化細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、更により好ましくは少なくとも５０％、ＥＤ系列の細胞に富み；更に別の例では、ＮＥ系列に限定されるＯＳＣからできているＥＢからの培養分化細胞の塊は、その分化能にバイアスがかかっていないＰＳＣからできているＥＢから得られる分化細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、更により好ましくは少なくとも５０％、ＮＥ系列の細胞に富む。

いくつかの例では、本発明によるＯＳＣのより効率的な分化又は更なる分化ステップを引き起こす又は行うことによって、細胞塊を組織／器官特異的細胞で富む状態にするために、更なる細胞分化ステップを特定の培養条件、パターン付き足場及び／又は分化因子とのインキュベーションによって適用できる。これらのステップは当業者によく知られており、所望の細胞型に応じて変わる。他の例では、初期系列に限定されるＯＳＣは、そのまま加工して食料品を生産できる。

特定の実施形態では、本発明の方法は、ＰＳＣにおける少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の安定的な不活性化によって前記少なくとも１種のＯＳＣを得る先行ステップを含む。あらゆる自己複製全能性幹細胞（ＴＳＣ）、ＰＳＣ、又は複能性幹細胞（ＭＳＣ）を、本発明によるＯＳＣを生産するのに使用できる。例示的な非限定的例は、始原生殖細胞（ＰＧＣ）、雌生殖系幹細胞（ＦＧＳＣ）、精原幹細胞（ＳＳＣ）、胚性生殖細胞（ＥＧＣ）、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、ｎｔＥＳＣ及び複能性幹細胞である。ＥＳＣは、リプログラミングによるいずれの外因性の転写操作も必要としないため、脊椎動物由来のＯＳＣを得るのに特に好ましい。卵生脊椎動物からのＥＳＣは、ＢＤＭ細胞として初期胚から容易に単離して多能性ＥＳＣ系を作製できるため、より特に好ましい。ＯＳＣのいずれか、次いで、それから派生する食料品を生産するために、鳥類のＥＳＣが特に好ましく、アヒルＥＳＣ系が更により特に好ましい。
より特定の実施形態では、前記少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現の安定的な不活性化は、
－ 前記遺伝子のコード配列のリーディングフレームを破壊すること、及び／又は
－ 前記遺伝子の発現に必要なシス調節エレメントを不活性化すること、
－ 前記遺伝子の発現に必要なトランス調節エレメントを不活性化することによって得られる。

少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の機能の不活性化は、典型的には、前記遺伝子のコード配列のリーディングフレームを破壊することによる前記遺伝子のノックアウトによって達成される。或いは、少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現の不活性化は、典型的には、前記遺伝子の発現に必要なプロモーター及び／又はエンハンサー配列の一部又は全体を欠失させることによって達成される。本発明の食料品生産方法では、少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の不活性化は、細胞の増幅ステップの間、安定に保たれることが重要である。したがって、遺伝子のコード配列（ＣＤＳ）を破壊する小さな挿入又は欠失（インデル）を、又はいくつかの例では、前記遺伝子又は前記遺伝子の発現を制御するプロモーター及び／若しくはエンハンサー配列の大部分又は全体を除去する大きな欠失を、外来遺伝物質の導入なしに、更に、選択手段なしに生成させることが特に適切である。また、系列指定因子遺伝子にインデルを生成させるのが、遺伝子が下流の必須過程に関与若しくはそれを制御しているために望ましくない、又は標的遺伝子の構造的若しくは他の特徴のために可能ですらない場合、シス調節エレメント（エンハンサー、サイレンサー、組織特異的調節エレメント）又は標的遺伝子の発現を調節するトランス調節エレメント（転写因子、マイクロＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ）を安定的に不活性化することが特に有利である。

本発明の方法に使用されるＯＳＣを生成するのに、上で述べたようなインデルノックアウトを可能にするあらゆるゲノム編集技術が適している。かかるゲノム編集技術は当業者によく知られている（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔら、２０２０で概説されている）。いわゆるプログラム可能なヌクレアーゼに基づく技術は、現在広く使用されており、本発明の方法で使用されるＯＳＣを生成するのに特に適しており、該ヌクレアーゼとしては、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）又はクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ ９のような）が挙げられるが、これらに限定されない。更に、その結果、ＯＳＣは、例えば、選択マーカー又は統合ベクターのような外来ＤＮＡを含まず、培養中に選択手段を必要とせず、より安全なＧＭＯと考えられる（外来ＤＮＡの伝播リスクがない）。また、本発明の方法の特定の実施形態では、少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の安定的な不活性化は、遺伝子編集システムを用いて少なくとも１種のインデルを前記遺伝子に生成させることを含み、該遺伝子編集システムは、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、例えば、ＭＡＤ７、及び／又はメガヌクレアーゼのような操作されたヌクレアーゼ、更により好ましくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９から選択されるプログラム可能なヌクレアーゼから選択される。

本発明の方法の一実施形態では、少なくとも１種のＯＳＣは、少なくとも１種のＮＥ（例えば、表１の遺伝子を参照）、ＭＥＤ（例えば、表３の遺伝子を参照）、ＭＤ（例えば、表４の遺伝子を参照）若しくはＥＤ（例えば、表２の遺伝子を参照）系列指定因子遺伝子又はそれらの組合せの発現が不活性化されている。適切なＯＳＣは、前の項に記載されている。

本発明の方法の特定の実施形態では、前記ＯＳＣは、少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の発現及び少なくとも１種のＭＤ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。実際、これらのＯＳＣは、ＥＤ系列の細胞への分化に限定され、したがって、食料品配合物として貴重なＥＤ系列のインビトロ分化細胞を提供する。本発明者らは、これらのＯＳＣは、単一の食料品関連細胞型を産生するために、器官指定因子ノックアウトを更に導入して特定の細胞型への分化能力を更に限定することによってその分化能力を更に特化させることができることを見出した（上記の「寡能性幹細胞」部分及び例えば、表２の遺伝子参照）。したがって、本発明の方法のより特定の実施形態では、前記ＯＳＣは、肝臓特異的であり、ＮＥ系列指定因子遺伝子の少なくとも１種の遺伝子の発現、ＭＤ系列指定因子遺伝子の少なくとも１種の遺伝子の発現、及びＥＤ細胞の非肝臓前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子（上記の「寡能性幹細胞」部分、及び例えば、表２の非肝細胞関連遺伝子を参照）の発現が不活性化されている。

本発明の方法の別の特定の実施形態では、前記ＯＳＣは、少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の発現及び少なくとも１種のＥＤ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。これらのＯＳＣは、ＭＤ系列の細胞への分化に限定され、したがって、食料品配合物として貴重なＭＤ系列のインビトロ分化細胞を提供する。前記ＯＳＣは、単一の食料品関連細胞型を産生するために、器官指定因子ノックアウトを更に導入して特定の細胞型へのその分化能力を更に限定することによってその分化能力を更に特化させることができる。例えば、非常に特定の実施形態では、ＭＤ系列に制限される前記ＯＳＣは、ＭＤ細胞の非心臓前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子の発現が更に不活性化されており（上記の「寡能性幹細胞」の部分及び例えば、表４を参照）、したがって、前記ＯＳＣは心臓特異的である。別の非常に特定の実施形態では、前記ＯＳＣは、骨格筋特異的であり、したがって、少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の発現、ＥＤ系列指定因子遺伝子の少なくとも１種の遺伝子の発現、及びＭＤ細胞の非骨格筋前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子（上記の「寡能性幹細胞」部分、及び例えば、表４の非骨格筋関連遺伝子を参照）の発現が不活性化されている。更なる特定の実施形態では、前記ＯＳＣは、脂肪細胞特異的であり、したがって、少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の発現、ＥＤ系列指定因子遺伝子の少なくとも１種の遺伝子の発現、及びＭＤ細胞の非脂肪細胞の前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子（上記の「寡能性幹細胞」部分、及び例えば、表４の非脂肪細胞関連遺伝子を参照）の発現が不活性化されている。
本発明の方法の特定の実施形態では、前記少なくとも１種のＯＳＣは、ＯＳＣに関して前の項で記載されているもののうちのいずれかである。特に好ましい実施形態では、前記少なくとも１種のＯＳＣは、アヒルＥＳＣから派生する。

したがって、本発明の食料品生産方法の別の実施形態では、少なくとも１種のＯＳＣは、骨格筋、心臓、肝細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、赤血球、若しくは脂肪細胞特異的ＯＳＣ、又はそれらの組合せから選択される。より特定の実施形態では、前記少なくとも１種のＯＳＣは、組合せである。実際、本発明の方法の増幅させる、培養する及び／又は分化させるステップのいずれかで異なるＯＳＣを混ぜることは、生きた動物に由来する器官の細胞組成により近い、密接に入り組んだ異なる細胞型からできている分化細胞の塊を得ることを可能とし、したがって、従来の食料品とのその類似性に関して食料品を改善し、したがって、消費者の官能体験を改善する。もちろん、本発明による食料品を生産する方法において、分化細胞はまた、加工するステップの間に混ぜることもできる。また、本発明の方法の一実施形態では、インビトロ分化非ヒト動物細胞は、筋細胞、皮膚細胞、血液細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、若しくは肝細胞、又はそれらの混合から選択される。
食料品
本発明の方法の実行により生産される食料品は、生きた動物から得られる肉製品の消費に代わるものである。これらの食料品は、世界人口の増加、生活水準の上昇、天然資源の不足、及びまた農業、より特には集約農業に関連する環境問題を解決する持続可能な方法となる。更に、西洋社会の人々の間では、動物福祉及び集約農業の欠点に対する関心が高まっている。

それにもかかわらず、インビトロ肉の生産は、依然として拡張性要件及び高い生産費用に直面している。本発明の方法は、当技術分野のインビトロ肉よりも安い費用及び／又は安全な方法で分化細胞の拡張可能な生産を可能とする。したがって、本発明の一目的は、本発明の方法によりその実施形態のいずれかにおいて上で述べたように得ることができる食料品に関する。
したがって、本発明の一目的は、少なくとも１種の非ヒト動物細胞を含む食料品に関し、前記少なくとも１種の非ヒト動物細胞は、ＮＥ（例えば、表１に列挙した遺伝子のオルソログ）、ＭＤ（例えば、表４に列挙した遺伝子のオルソログ）、ＥＤ（例えば、表２に列挙した遺伝子のオルソログ）若しくはＭＥＤ（例えば、表３に列挙した遺伝子のオルソログ）系列指定因子遺伝子、又はこれらの混合の群から選択される少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。
本発明の特定の目的は、少なくとも１種の非ヒト動物細胞を含む食料品に関し、前記少なくとも１種の非ヒト動物細胞は、少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている。特定の実施形態では、前記食料品は、
－ 少なくとも１種のＭＤ系列指定因子遺伝子、又は
－ 少なくとも１種のＥＤ系列指定因子遺伝子
の発現が不活性化されている少なくとも１種の非ヒト動物細胞を含む。

当業者は、前記食料品に対して、従来の肉組織（筋肉若しくは屑肉）又は肉ベース製品の外見及び／又はまた官能特性を模倣する通常の消費形態を付与する方法を知っているであろう。食料品製品は、加工食品製品、特に、スープ、シチュー、ソーセージ、挽き肉、コールドカット、スプレッド、パテ、ピューレ、すり身、ビスケット、乾燥顆粒、錠剤、カプセル、粉末、パスタ、ピザ、サンドイッチ又はナゲットに組み込むように加工できる。
しかし、従来通りに飼育された動物から得られる肉ベース製品を模倣することを目的とする場合、同じ動物に由来するＯＳＣを使用することが考えられ得る。例えば、フォアグラを生産することを目的とする場合、ガチョウ又はアヒルに由来するＯＳＣが好ましいと推測できる。別の実施形態では、牛ヒレ肉を生産することを目的とする場合、ウシに由来するＯＳＣが好ましいと推測できる。いずれにしても、異なる種、科、目又は綱に由来する細胞の使用が考えられ得る。
本発明は以下の非限定的な実施例で更に説明する。

以下の略称を使用している：
－ ｑＲＴ－ＰＣＲ：定量的逆転写－ポリメラーゼ連鎖反応
－ ＰＬ：多能性の
－ ＮＥ：神経外胚葉
－ ＭＥＤ：中内胚葉
－ ＭＤ：中胚葉
－ ＥＤ：内胚葉
－ インデル：挿入又は欠失
－ ｆｓ：フレームシフト
－ ｉｆ：インフレーム
－ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９：化膿連鎖球菌のＩＩ型のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連システム
－ ｇＲＮＡ：２種のＲＮＡ分子：ＤＮＡ標的配列（プロトスペーサー）に対する２０ヌクレオチドの相同性によりＣａｓ９ヌクレアーゼに標的特異性を与えるｃｒＲＮＡ、及びＣａｓ９結合足場として機能するｔｒａｃｒＲＮＡで構成されるガイドＲＮＡ
－ ｓｇＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの機能を保持した単一のＲＮＡ分子で構成される合成ｇＲＮＡ
－ ＲＮＰ：リボ核タンパク質
－ ＲＯＣＫｉ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤
－ ＥＢｄ：胚様体分化
－ Ｄｄ：指向性分化
－ ｄＥＳＣ：アヒル胚性幹細胞
－ ｎｔＥＳＣ：核移植ＥＳＣ
－ ＯＳＣ：寡能性幹細胞。分化能力が限定された自己複製幹細胞
－ ＥＤＭＤ ＯＳＣ：分化能力が、ＥＤ、ＭＤ系列及びその派生細胞に限定される自己複製ＯＳＣ
－ ＮＥＭＤ ＯＳＣ：分化能力が、ＮＥ、ＭＤ系列及びその派生細胞に限定される自己複製ＯＳＣ
－ ＮＥＥＤ ＯＳＣ：分化能力が、ＮＥ、ＥＤ系列及びその派生細胞に限定される自己複製ＯＳＣ
－ ＮＥ ＯＳＣ：分化能力が、ＮＥ系列及びその派生細胞に限定される自己複製ＯＳＣ
－ ＭＤ ＯＳＣ：分化能力が、ＭＤ系列及びその派生細胞に限定される自己複製ＯＳＣ
－ ＥＤ ＯＳＣ：分化能力が、ＥＤ系列及びその派生細胞に限定される自己複製ＯＳＣ
－ ケラチノサイトＯＳＣ：分化能力が、表皮系列に限定される自己複製ＮＥ ＯＳＣ
－ 肝臓ＯＳＣ：分化能力が、肝臓系列に限定される自己複製ＥＤ ＯＳＣ
－ 内皮ＯＳＣ：分化能力が、内皮系列に限定される自己複製ＭＤ ＯＳＣ
－ 血液ＯＳＣ：分化能力が、血液系列に限定される自己複製ＭＤ ＯＳＣ
－ 心臓ＯＳＣ：分化能力が、心臓系列に限定される自己複製ＭＤ ＯＳＣ
－ 筋肉ＯＳＣ：分化能力が、骨格筋系列に限定される自己複製ＭＤ ＯＳＣ
－ 骨ＯＳＣ：分化能力が、骨系列に限定される自己複製ＭＤ ＯＳＣ
－ 軟骨ＯＳＣ：分化能力が、軟骨系列に限定される自己複製ＭＤ ＯＳＣ
－ 脂肪ＯＳＣ：分化能力が、脂肪系列に限定される自己複製ＭＤ ＯＳＣ
－ ＲＴ°：室温
－ ＷＴ：野生型

（実施例Ｉ）
哺乳類ＯＳＣの生成－ＰＳＣにおける標的系列指定因子遺伝子の不活性化
Ｉ． ｈｉＰＳＣにおける初期ＮＥ、ＭＥＤ、ＭＤ及びＥＮ系列指定因子の候補遺伝子の不活性化によるＥＤＭＤ、ＮＥＭＤ、ＮＥＥＤ、ＮＥ、ＥＤ、ＭＤ ＯＳＣの生成
ＷＴＣ－１１ヒトｉＰＳＣ（Ｃｏｒｉｅｌｌ ＧＭ２５２５６）は、エピソーマルベクターを使用して健常男性皮膚線維芽細胞の非統合的リプログラミングによって生成される商業的に十分に特徴付けられたｉＰＳＣである。

Ａ． 細胞品質アッセイ
遺伝子編集の前に、未分化及び分化（ＥＢ）ＷＴＣ－１１ ｉＰＳＣは、表５に列挙した遺伝子に特異的なプライマーを使用して、ＰＬ、ＮＥ、ＭＥＤ、ＭＤ、ＥＤ特異的遺伝子の発現プロファイル及び転写因子マーカーの発現プロファイルの制御を行った。
Ｂ． ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ９ヌクレアーゼキット及びｇＲＮＡスクリーニング
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、標的遺伝子のコード配列にｆｓインデルを導入し、それによって標的遺伝子をノックアウトするために現在最も広く使用されているプログラム可能なヌクレアーゼである。これは、インビボと、脊椎動物、無脊椎動物及び植物を含む複数の種の培養細胞との両方で機能することが証明されている（Ｋｉｍ及びＫｉｍ、２０１４）。多数の市販の既製のＣＲＩＳＰＲＣａｓ９キットが入手可能である。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の構成要素の標的細胞への送達は、通常、Ａｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（Ｌｏｎｚａ）、エレクトロポレーション又はリポフェクションによって達成される。ＷＴＣ－１１ ｉＰＳＣの編集では、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）からのＡｌｔ－Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡｓ，ｔｒａｃｒＲＮＡ ａｎｄ Ｓ．ｐ． ＨｉＦｉ Ｃａｓ９ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ３を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）Ｃａｓ９ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔと複合体を形成させて使用した。

ｇＲＮＡの設計
系列指定因子遺伝子のゲノム及びコード配列は、ウェブベースのゲノムブラウザ（例えば、＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／＞、＜ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ＞）からダウンロードし、配列解析ソフトウェア（例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、ＳｎａｐＧｅｎｅ）に保存する。可能な限り、各転写因子のアイソフォーム、エクソン及び機能性ドメインが同定され、アノテーションされている。転写因子のＤＮＡ結合ドメインのすぐ上流のエクソン配列の２００～３００ヌクレオチドを、ｇＲＮＡ設計ツール（＜ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ＿Ｔｏｏｌｓ＞）でクエリ配列として使用する。遺伝子毎に、オンターゲット予測活性が最も高くかつオフターゲット予測活性が最も低い３種の最高ランクのｇＲＮＡを、ＷＴＣ－１１ ｉＰＳＣにおける更なる機能試験用に選択する。

ｇＲＮＡスクリーニング
各遺伝子を標的とする最も活性の高いｇＲＮＡを同定するため、全てのｇＲＮＡ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸプロトコールに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、ＷＴＣ－１１ ｉＰＳＣに別々にトランスフェクトする。トランスフェクションの４～５日後、細胞を各ウェルから回収し、ＤＮＡをＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製する。各標的では、座位ＴＩＤＥ／ＩＣＥオリゴペアは、ｇＲＮＡ標的部位に隣接する５００～７００のゲノム配列を増幅するように設計される。座位特異的ＰＣＲ増幅産物は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して精製する。各生成物は、内部ＴＩＤＥ／ＩＣＥシークエンシングオリゴを使用したサンガーシークエンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ）に送られる。サンガー配列ＡＢＩファイルは、次に、各ｇＲＮＡの切断部位で生じる小さなインデルを定量することができるＴＩＤＥ（＜ｈｔｔｐｓ：／／ｔｉｄｅ．ｎｋｉ．ｎｌ／＞）又はＩＣＥ ｓｙｎｔｈｅｇｏ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｙｎｔｈｅｇｏ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｃｒｉｓｐｒ－ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェアを使用して、解析する。

Ｃ． ＥＤＭＤ、ＮＥＭＤ、ＮＥＥＤ ＯＳＣクローン系の生成
ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体のトランスフェクション
ＷＴＣ－１１ ｈｉＰＳＣは、最も効果的なｇＲＮＡでトランスフェクトする。ＷＴＣ－１１細胞は、単一細胞であり、これは、ＴｒｉｐｌｅＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して解離し、１０μＭのＲＯＣＫｉ（Ｙ－２７６３２、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＥ８培養培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に再懸濁し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で計数する。１５×１０⁵細胞の１０プールは、ビトロネクチン（ＶＴＮ－Ｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）コート１２ウェル培養皿において、製造元のガイドラインに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＲＩＳＰＲＭＡＸを使用して対応するＲＮＰ複合体でトランスフェクトする。トランスフェクションの１２～２４時間後、培地はＲＯＣＫｉを含まないＥ８に交換する。次いで、培地は、細胞がトランスフェクションから完全に回復するまで（４～５日間）、毎日交換する。図４Ａに示すように、全ての試験した候補系列指定因子遺伝子においてインデルを生成させ得ることが見出される。

ＣＲＩＳＰＲ編集ｈＰＳＣのクローンの拡大
各々のトランスフェクトされたプールは、単一細胞であり、これは、ＴｒｉｐｌｅＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを使用して解離し、１０μＭのＲＯＣＫｉを添加したＥ８に再懸濁し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒで計数し、１０μＭのＲＯＣＫｉを添加したＥ８を含む１００ｍｍＶＴＮコート培養皿中で３つの異なる密度（５０、１００及び２５０細胞／ｃｍ２）で播種する。トランスフェクションの１２～２４時間後、培地はＲＯＣＫｉを含まないＥ８に交換する。次に、培地を明瞭なコロニーが出現するまで（７～１０日間）、２日おきに交換する。
各々のトランスフェクトされたｇＲＮＡでは、約５００μｍ超の直径を有する９６コロニーは、ＥＶＯＳ ＦＬ ｐｉｃｋｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）下でＰ２００ピペットチップを使用して手動で取り、Ｖ底９６ウェル皿の個々のウェルに移す。コロニーは、マルチチャンネルピペットを使用してＶ底皿で上下に１０回ピペッティングすることによって手動でばらばらにし、続いて、Ｅ８培地を含むＶＴＮコート９６ウェル培養皿に移す。培地を、明瞭なコロニーが出現するまで（約７日間）、２日おきに交換する。

この段階で、各プレートの２つの複製の生成を、ＥＤＴＡを使用してコロニーを穏やかに解離すること及び解離した各ウェルを２つのＶＴＮコート９６ウェル複製培養皿の対応するウェルに再プレーティングすることによって行う。９６ウェルの複製はＥ８中で６０～８０％コンフルエントになるまで培養し、この段階で、一方の複製は、ＥＤＴＡによる解離及びＰＳＣ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）での再懸濁後、－８０℃で凍結するが、もう一方の複製は、ＤＮｅａｓｙ ９６ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用したゲノムＤＮＡ抽出に用いる。

ＣＲＩＳＰＲ編集クローンの座位特異的ＭｉＳｅｑシークエンシング
座位特異的Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑオリゴを、各ｇＲＮＡ切断部位の周囲の１５０～２００のゲノム領域を増幅するために設計する。各座位特異的ＭｉＳｅｑオリゴペアを、対応座位を標的とするｇＲＮＡで編集したＤＮＡを含む９６ウェルプレートの、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いたＭｉＳｅｑ ＰＣＲ Ｉ増幅（１５サイクル）に使用する。ＰＣＲ Ｉ産物は、ヌクレアーゼ不含Ｈ２Ｏで１０倍に希釈し、１μｌを、各座位特異的ゲノム増幅産物に隣接する全長インデックス付き（１～９６）Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを生成させるオリゴを用いたＭｉＳｅｑ ＰＣＲ ＩＩ増幅（２０サイクル）に使用する。各編集では、９６のバーコード付きＰＣＲをプールし、２％ゲル上で短時間泳動してプライマー二量体を除去し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐカラムを使用して精製し、ヌクレアーゼ不含Ｈ２Ｏで溶出する。各ＰＣＲプールを、Ｑｕｂｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して定量し、等モル量の各ＰＣＲプールを１本のチューブに混合し、ヌクレアーゼ不含Ｈ２Ｏで希釈して１０ｎＭの最終プールライブラリーを生成する。ライブラリーの品質管理とＭｉＳｅｑの実行は、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３（６００サイクル）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＧｅｎｅｗｉｚ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｗｉｚ．ｃｏｍ）によって実施される。
ＭｉＳｅｑで配列決定されたＣＲＩＳＰＲ編集クローンのＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２分析
インデックス１～９６に対応するトリミングされたＭｉＳｅｑシークエンシングＦａｓｔＱファイルは、Ｇｅｎｅｗｉｚから取得し、各クローンの２つの対立遺伝子の配列は、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２アプリ（＜ｈｔｔｐｓ：／／ｈｕｂ．ｄｏｃｋｅｒ．ｃｏｍ／ｒ／ｐｉｎｅｌｌｏｌａｂ／ｃｒｉｓｐｒｅｓｓｏ２／＞）を使用して同定し、特徴付ける。野生型、ヘテロ接合体、トランスヘテロ接合体及びホモ接合体のｆｓインデル又はｆｉインデルを持つクローンは、更なる増幅及び保存のためにラベルされる。

ＣＲＩＳＰＲ編集クローンの増幅及び保存
凍結したクローンを含む９６ウェル複製プレートは、－８０℃から取り出し、すぐに３７℃で解凍し、３００ｇで３分間遠心分離する。凍結培地は、プレートをはじき、すぐに、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １ｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む１００μｌのＥ８培地を添加することによって除去する。再懸濁した細胞は、ＶＴＮコート９６ウェル培養皿に移し、一晩増殖させる。プレーティングの１２～２４時間後、培地はＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含まないＥ８に交換する。次いで、培地は、細胞が凍結から完全に回復するまで（７日間）、毎日交換する。可能な限り、３種の（ＷＴ／ＷＴ）野生型対照クローン、３種の（ＦＳ／ＷＴ）ヘテロ接合体クローン及び３種の（ＦＳ／ＦＳ）トランスヘテロ接合体クローン又はホモ接合体クローンは、２４ウェル皿中のＥ８で拡大し、次に、ＥＤＴＡを解離剤として使用して、６ウェル皿中で拡大する。ＩＦ／ＩＦ、ＩＦ／ＦＳ又はＩＦ／ＷＴクローンもまた、利用可能であれば拡大した。可能であれば、各系の３～６つのクライオバイアルをバンキング及び長期保存のために窒素中で凍結保存する。

Ｄ． ＮＥ、ＥＤ、ＭＤ ＯＳＣクローン系の生成
ＥＤＭＤ、ＮＥＭＤ、ＮＥＥＤ ＯＳＣクローン系の分化バイアスを野生型対照系と比較して定量した後（下記参照）、ＥＤＭＤへの最も高い分化バイアスを示すＥＤＭＤ ＯＳＣ系の１種、ＮＥＭＤへの最も高い分化バイアスを示すＮＥＭＤ ＯＳＣ系の１種、及びＮＥＥＤへの最も高い分化バイアスを示すＮＥＥＤ ＯＳＣ系の１種が選択される。
ＮＥ ＯＳＣの生成
分化能力がＮＥ系列及びその派生細胞に限定されるＯＳＣの生成は、上で述べたようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して実施する。
３種の代替アプローチを適用する：
１． ３種のＭＥＤ系列指定因子を標的とする９種のｇＲＮＡをＰＳＣにトランスフェクトすること、
２． 最良のＮＥＭＤ系を生成するのに使用される最良のＥＤ ｇＲＮＡを最良のＮＥＥＤ ＯＳＣ系にトランスフェクトすること、
３． 最良のＮＥＥＤ系を生成するのに使用される最良のＭＤ ｇＲＮＡを最良のＮＥＭＤ ＯＳＣ系にトランスフェクトすること。

ＥＤ ＯＳＣの生成
分化能力がＥＤ系列及びその派生細胞に限定されるＯＳＣの生成は、上で述べたようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して実施する。
２種の代替アプローチを適用する：
１． 最良のＥＤＭＤ系を生成するのに使用される最良のＮＥ ｇＲＮＡを最良のＮＥＥＤ ＯＳＣ系にトランスフェクトすること、
２． 最良のＮＥＥＤ系を生成するのに使用される最良のＭＤ ｇＲＮＡを最良のＥＤＭＤ ＯＳＣ系にトランスフェクトすること。
ＭＤ ＯＳＣの生成
分化能力がＭＤ系列及びその派生細胞に限定されるＯＳＣの生成は、上で述べたようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して実施する。
２種の代替アプローチを適用する：
１． 最良のＥＤＭＤ系を生成するのに使用される最良のＮＥ ｇＲＮＡを最良のＮＥＭＤ ＯＳＣ系にトランスフェクトすること、
２． 最良のＮＥＭＤ系を生成するのに使用される最良のＥＤ ｇＲＮＡを最良のＥＤＭＤ ＯＳＣ系にトランスフェクトすること。
同じ編集及び遺伝子型決定アプローチを、ＥＤＭＤ、ＮＥＭＤ、ＮＥＥＤ ＯＳＣクローン系（上記のパートＣ．参照）の生成に関して使用する。

ＩＩ． ＰＳＣ及び系列限定ＯＳＣの分化能力の評価
Ａ． 多能性アッセイ
このアッセイによって、未分化ＰＳＣ又はＥＤＭＤ、ＮＥＭＤ、ＮＥＥＤ、ＮＥ、ＥＤ、ＭＤ ＯＳＣの多能性状態を、未分化ＰＳＣ又はＯＳＣにおいて初期ＰＬ、ＮＥ、ＭＥＤ、ＭＤ、ＥＤ遺伝子の発現と、初期ＰＬ、ＮＥ、ＭＤ、ＥＤ細胞のパーセンテージとを定量することで調べることができる。
ＰＳＣ又はＯＳＣは、ＶＴＮコート６ウェル培養皿上でＥ８培地中で２継代増殖する。約７５％コンフルエントのウェルは、ＰＢＳで２回洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅで解離し、ＰＢＳに再懸濁する。細胞は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒで計数し、１×１０⁶細胞アリコートをペレット化する。ＰＢＳを除去し、細胞ペレットを、ＴａｑＭａｎ ｈＰＳＣ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ Ｐａｎｅｌ分析のために５００μｌのトリゾール試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に再懸濁するか（項ＩＶ参照）、又はフローサイトメトリー分析のために１ｍＬの氷冷ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の２％ＦＢＳ）に再懸濁する（項Ｅ参照）。

Ｂ． ＥＢ分化アッセイ
このアッセイによって、低ストリンジェンシーな分化アプローチを使用する場合のＰＳＣ又はＥＤＭＤ、ＮＥＭＤ、ＮＥＥＤ、ＮＥ、ＥＤ、ＭＤ ＯＳＣの分化能力を、ＥＢ分化ＰＳＣ又はＯＳＣにおいて初期ＰＬ、ＮＥ、ＭＥＤ、ＭＤ、ＥＤ遺伝子の発現と初期ＰＬ、ＮＥ、ＭＤ、ＥＤ細胞のパーセンテージとを定量することを通して調べることができる。

ＥＢ培養のための例示的なプロトコール１
ＰＳＣ又はＯＳＣは、ＶＴＮコート６０ｍｍ培養皿上でＥ８培地中で２継代増殖する。約８０～８５％コンフルエントの皿を、ＰＢＳで２回洗浄し、コラゲナーゼＩＶ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で５～１０分間処理する。次いで、コラゲナーゼを除去し、細胞を５ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で洗浄する。細胞に、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した３ｍｌのＥＢ培地（ＧｌｕｔａＭＡＸを添加したＤＭＥＭ Ｆ－１２；ＫｎｏｃｋＯｕｔ血清代替物、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、及び２－メルカプトエタノール）を添加する。コロニーは、注意深く剥離し、５ｍｌ血清用ピペットを使用して回収する。コロニー懸濁液は、１５ｍｌコニカルチューブに移し、５～７分間放置して沈降させる。上清を注意深く除去し、コロニーを、ｂＦＧＦを有するＥＢ培地３ｍｌに再懸濁する。この３ｍｌは、ｂＦＧＦを有するＥＢ培地２ｍｌを含む非ＴＣ処理６０ｍｍ皿に移す。皿をインキュベーターに一晩置く。翌日、皿の内容物は、１５ｍｌコニカルチューブに移し、５～１０分間放置して沈降させる。上清を除去し、ＥＢを、ｂＦＧＦを有さないＥＢ培地３ｍｌに再懸濁する（Ｄ０）。この３ｍｌのＥＢ懸濁液は、ｂＦＧＦを有さないＥＢ培地２ｍｌを含む新規の６０ｍｍ非ＴＣ処理皿に移す。７日間又は１４日間の培養後、ＥＢを分析のため収集する。ＰＢＳで２回洗浄後、ＥＢは、Ａｃｃｕｔａｓｅで解離し、ＰＢＳに再懸濁する。細胞は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒで計数し、１×１０⁶細胞アリコートをペレット化する。ＰＢＳを除去し、細胞ペレットを、ＴａｑＭａｎ ｈＰＳＣ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ Ｐａｎｅｌ分析のために５００μｌのトリゾール試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に再懸濁するか（項Ｄ参照）、又はフローサイトメトリー分析のために１ｍｌの氷冷ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の２％ＦＢＳ）に再懸濁する（項Ｅ参照）。

ＥＢ培養のための代替的な実験プロトコール
未分化ｈｉＰＳＣ（ＷＴＣ－１１）及びＯＳＣは、継代し、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｉ）Ｙ－２７６３２で２４ｈ処理する。培地を交換し、細胞をＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８完全培地（Ｇｉｂｃｏ）でもう１日置く。実験当日、細胞は、０．５ｍＭのＰＢＳ－ＥＤＴＡを使用して単一細胞に解離し、３７μｍのセルストレーナーでろ過し、計数する。２．５×１０⁶細胞を、２４ウェルＡｇｒｅｗｅｌｌ４００プレート（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の各ウェルに移し、１０μＭのＲｉを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地で２４ｈの間インキュベートする。翌日、ＥＢは、６ウェル超低付着性プレートに移し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６ ＥＢ培地（Ｇｉｂｃｏ）で１４日間インキュベートする。７日間又は１４日間の培養後、ＥＢを分析のため収集する。ＰＢＳで２回洗浄後、ＥＢは、Ａｃｃｕｔａｓｅで解離し、ＰＢＳに再懸濁する。細胞は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒで計数し、１×１０⁶細胞アリコートをペレット化する。ＰＢＳを除去し、細胞ペレットを、ＴａｑＭａｎ ｈＰＳＣ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ Ｐａｎｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）分析のために５００μｌのトリゾール試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に再懸濁するか（項Ｄ参照）、又はフローサイトメトリー分析のために１ｍｌの氷冷ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の２％ＦＢＳ）に再懸濁する（項Ｅ参照）。

Ｃ． 指向性分化アッセイ
このアッセイによって、高ストリンジェンシーな指向性分化アプローチを使用する場合のＰＳＣ又はＥＤＭＤ、ＮＥＭＤ、ＮＥＥＤ、ＮＥ、ＥＤ、ＭＤ ＯＳＣの後期系列分化能力を、指向性分化ＰＳＣ又はＯＳＣにおいて後期ＮＥ、ＭＤ、ＥＤ遺伝子の発現と後期ＮＥ、ＭＤ、ＥＤ細胞のパーセンテージとを定量することを通して調べることができる。
後期ＮＥ系列を生成するＮＥＥＤ、ＮＥＭＤ及びＮＥ ＯＳＣの能力をアッセイするために、ＴＰ６３⁺表皮前駆細胞への指向性分化用プロトコールが使用される（Ｚｈｏｎｇら、２０２０）。
ＰＳＣ又はＯＳＣは、ＶＴＮコート６ウェル培養皿上でＥ８培地中で継代する。約３０％コンフルエントになったときに（０日目＝ｄ０）、Ｅ８を分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸、セレニウム、トランスフェリン、インスリン、１×化学的に定義された脂質濃縮物）に切り替える。ｄ０～８日目（ｄ８）まで、細胞は、分化培地中で以下の処理：ｄ０～６（１０μＭのＳＢ４３１５４２）；ｄ１～６（５μＭのＣＨＩＲ９９０２１）；ｄ１～８（１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ））；ｄ４～８（５μＭのＤＡＰＴ（Ｔｏｃｒｉｓ ２６３４）で培養する。この段階（ｄ８）で、細胞は、ＰＢＳで２回洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔで解離し、ＰＢＳに再懸濁する。細胞は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒで計数し、１×１０⁶細胞アリコートをペレット化する。ＰＢＳを除去し、細胞ペレットを、フローサイトメトリー分析のために１ｍＬの氷冷ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の２％ＦＢＳ）に再懸濁する（下記の項Ｅ参照）。

ＮＥ ＯＳＣがケラチノサイトを生成する能力をアッセイするために、ＮＥ ＯＳＣは、２０００００細胞／ウェルで６ウェルプレートにプレーティングし、Ｅ８培地中で３日間培養し、次に分化培地（ＤＫＳＦＭ（Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ）、１μＭのレチノイン酸、２５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４）に４日間切り替える。４日目から１１日目まで、培地は、ＤＫＳＦＭと２～３日毎に交換する。１４日目から２５日目まで、培地は、ＣｎＴ－０７に切り替え、２～３日毎に交換した。データは、下記の項Ｄに説明するように２^-ΔΔCT法に従って分析した（図７にＤ１１段階の培養からのデータが示されている）。
後期ＥＤ系列を生成するＮＥＥＤ、ＥＤＭＤ及びＥＤ ＯＳＣの能力をアッセイするために、初期ＰＤＸ１⁺膵臓前駆細胞への指向性分化用プロトコールが使用される（Ｌｅｅら、２０１９）。

ＰＳＣ又はＯＳＣは、ＶＴＮコート６ウェル培養皿上でＥ８培地中で６５ｋ～１００ｋ細胞／ｃｍ²にて継代する。約８０～９０％コンフルエントになったときに、膵臓分化が開始される（ｄ０）。胚体内胚葉（ＤＥ）は、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、１２０－１４Ｅ）を用いた３日間の処理、５ｍＭのＧＳＫ－３阻害剤、ＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－０００４）を用いた１日目の処理、並びに０．５ｍＭのＣＨＩＲ－９９０２１を用いた２日目の処理によって誘導される。０．２５ｍＭのＬ－アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ４５４４）及び５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７（Ｒ＆Ｄ、２５１－ＫＧ）の２日間の処理の後、前腸（ＦＧ）段階が生じる。ＰＤＸ１⁺初期膵臓前駆細胞は、０．２５ｍＭのＬ－アスコルビン酸、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７、２５０ｎＭのヘッジホッグ阻害剤、ＳＡＮＴ－１（Ｓｉｇｍａ、Ｓ４５７２）、１ｍＭのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ、Ｒ２６２５）、１００ｎＭのＢＭＰ阻害剤、ＬＤＮ－１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－００１９）、及び２００ｎＭのＰＫＣ活性化剤であるＴＰＢ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、５６５７４０）を２日間添加することによって生成させる。この段階（ｄ７）で、細胞は、ＰＢＳで２回洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔで解離し、ＰＢＳに再懸濁する。細胞は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒで計数し、１×１０⁶細胞アリコートをペレット化する。ＰＢＳを除去し、細胞ペレットを、フローサイトメトリー分析のために１ｍｌの氷冷ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の２％ＦＢＳ）に再懸濁する（下記の項Ｅ参照）。

後期ＭＤ系列を生成するＮＥＭＤ、ＥＤＭＤ及びＭＤ ＯＳＣの能力をアッセイするために、ＩＳＬ１⁺心臓前駆細胞への指向性分化用プロトコールが使用された（Ｂａｌａｆａｎら、２０２０）。
ＰＳＣ又はＯＳＣは、ＶＴＮコート６ウェル培養皿上でＥ８培地中で継代する。約７５％コンフルエントになったときに、コロニーは、０．５ｍＭのＥＤＴＡを使用して解離した単一細胞とし、ＶＴＮコート６ウェル皿上で１０μＭのＲＯＣＫｉを添加したＥ８培地中で２．４×１０⁴細胞／ｃｍ２にて播種する。２４ｈ後、培地を、ＲＯＣＫｉを有さないＥ８に交換し、その後、毎日交換する。６０～７０％コンフルエントになったときに（２～３日間）、細胞は、インスリンを含まないＢ２７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の６μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で処理する（ｄ０）。２４ｈ後（ｄ１）、ＣＨＩＲ９９０２１を含む培地は、インスリンを含まないＲＰＭＩ－Ｂ２７のみと交換する。４８時間後（ｄ３）、細胞は、インスリンを含まないＲＰＭＩ－Ｂ２７で希釈した５μＭのＩＷＰ２（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で処理する。４８時間後（ｄ５）、培地は、新たに調製したインスリンを含まないＲＰＭＩ－Ｂ２７と交換する。４８時間後（ｄ７）、細胞は、ＰＢＳで２回洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔで解離し、ＰＢＳに再懸濁する。細胞は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒで計数し、１×１０⁶細胞アリコートをペレット化する。ＰＢＳを除去し、細胞ペレットを、フローサイトメトリー分析のために１ｍＬの氷冷ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の２％ＦＢＳ）に再懸濁する（項Ｅ参照）。

Ｄ． ＴａｑＭａｎ ｈＰＳＣ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ Ｐａｎｅｌを使用した初期ＰＬ、ＭＥＤ、ＮＥ、ＭＤ、ＥＤ遺伝子の発現のプロファイリング
各ＴａｑＭａｎ ｈＰＳＣ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ Ｐａｎｅｌアッセイでは、５００μｌのトリゾールに再懸濁した１×１０⁶未分化、ＥＢ分化、指向性分化ＰＳＣ又はＯＳＣ（上記の項Ａ～Ｃ参照）を使用する。

全ｍＲＮＡは、製造元のガイドラインに従って有機相分離によって精製する。ｃＤＮＡは、供給元のプロトコールに従ってＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して５００ｎｇのｍＲＮＡを逆転写して生成する。
次に、ＰＬ、ＮＥ、ＭＥＤ、ＭＤ、ＥＤ特異的遺伝子のｍＲＮＡレベルを、ＴａｑＭａｎ（商標）ｈＰＳＣ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ（商標）Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して定量する。この事前に設計されたＴａｑＭａｎパネルは、９種のＰＬ、６種のＭＥＤ、２６種のＥＤ、２２種のＭＤ及び２２種のＮＥ遺伝子を含む８５種の系列特異的遺伝子の発現を定量する（下記の表５参照。ヒト三系列ＴａｑＭａｎ ｈＰＳＣ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ Ｐａｎｅｌ）。これらの８５種の遺伝子の発現プロファイルに基づいて、各系に対して分化スコアがＴａｑｍａｎ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ Ｐａｎｅｌ（＜ｈｔｔｐｓ：／／ａｐｐｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｈＰＳＣｓｃｏｒｅｃａｒｄ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ＞）に関連するソフトウェアを使用して割り出される。このスコアは、未分化又は分化条件下での、系の３胚葉への分化能力を反映している。

ケラチノサイト指向性分化アッセイ（上記の項Ｃ）では、ｃＤＮＡは、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＰＡＸ６、ＴＰ６３及びＫＲＴ１４用のＴａｑＭａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ＴａｑＭａｎ（商標）ｈＰＳＣ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ（商標）Ｋｉｔ、ｒｅｆ Ａ１５８７２）を使用して分析する。ＧＡＰＤＨ又はＡＣＴＩＮは、内部標準として増幅される。データは２^-ΔΔCT法に従って分析する。

Ｅ． フローサイトメトリーによる初期及び後期ＰＬ、ＮＥ、ＭＤ及びＥＤ細胞集団の定量
１ｍｌの氷冷ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の２％のＦＢＳ）に再懸濁した１×１０⁶単一細胞アリコートは、死細胞を生きた細胞から識別するために、適切なＬＩＶＥＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＲＴ°で１０分間インキュベートする。細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄する。固定及び透過処理を、製造元のガイドラインに従ってＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施する。固定及び透過処理した細胞は、３００μｌのＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー中に回収し、以下のように混合した６本の別々のチューブに分注する：チューブ１（５０μｌのＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー）；チューブ２（５０μｌのＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー＋コンジュゲート抗体１のアイソタイプ対照）；チューブ３（５０μｌのＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー＋コンジュゲート抗体２のアイソタイプ対照）；チューブ４（５０μｌのＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー＋コンジュゲート抗体１）；チューブ５（５０μｌのＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー＋コンジュゲート抗体２）；チューブ６（５０μｌのＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー＋コンジュゲート抗体１＋コンジュゲート抗体２）。下記の表６（ヒト三系列フローサイトメトリーパネル）に、これらの実験に使用する抗体を列挙する。各サンプルは、ＲＴ°で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、サンプルは、１ｍＬのＦＡＣＳバッファーで３回洗浄し、３００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、４０μｍセルストレーナーを通し、フローサイトメトリー分析まで氷上で保存する。各サンプルでは、２０ｋのイベントを、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ｘフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で捕捉し、ＦｌｏｗＪｏ Ｘで分析する。生存率の制御は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ，ｆｏｒ ６３３ ｏｒ ６３５ ｎｍ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ（＃ Ｌ３４９７４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施する。

ＩＩＩ． ＰＳＣにおける後期ＮＥ、ＥＤ、ＭＤ系列指定因子の候補遺伝子の不活性化によるケラチノサイトＯＳＣの生成
ケラチノサイトＯＳＣは、ＷＴＣ－１１ ｈｉＰＳＣから操作されたＮＥ ＯＳＣにおける遺伝子編集によって生成する。
ＮＥ ＯＳＣのケラチノサイト（皮膚）系列への分化能力を限定するために、３種の後期神経系列指定因子遺伝子（ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＯＸ１０、ＰＡＸ３）を選択して不活性化する。
ｇＲＮＡの設計、スクリーニング、ＮＥ ＯＳＣでのトランスフェクション、及びクローン系の生成は、上記のパートＩに記載されるように実施する。
各標的遺伝子のケラチノサイト系列は、分化効率を、上記のパートＩＩに記載されるＴｐ６３⁺表皮前駆細胞への指向性分化を使用して未改変ＰＳＣ、ＮＥ ＯＳＣ（ＷＴ／ＷＴ；ＦＳ／ＷＴ；ＦＳ／ＦＳ；ＦＳ／ＩＦ）及びケラチノサイトＯＳＣ（ＷＴ／ＷＴ；ＦＳ／ＷＴ；ＦＳ／ＦＳ；ＦＳ／ＩＦ）の間で比較する。

ＩＶ． 結果
Ａ． ＷＴＣ－１１ ｈｉＰＳＣでのＥＢ分化アッセイ
ＷＴＣ－１１ ｈｉＰＳＣは、ＥＢ培養条件でＥＢを形成し、ｂＦＧＦなしでの培養の７日目（Ｄ７）に直径２０μｍに達することができる。予想されるように、０日目（Ｄ０）では、遺伝子の発現への寄与の約９８．８５％が多能性遺伝子によるものである（上で述べたＴａｑＭａｎ ｈＰＳＣ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ Ｐａｎｅｌを使用して決めた）。ＭＥＤ系列遺伝子からの寄与は非常に小さく（０．９８％）、ＥＤ、ＭＤ又はＮＥ遺伝子からの寄与は更に少ない（０．０１～０．０４％の範囲）（図５）。

培養のＤ７では、ｂＦＧＦなしでＥＢ培地中で、ｈｉＰＳＣ細胞はＥＤ、ＮＥ及びＭＤ系列へと効率的に分化する。遺伝子の発現への寄与の２．６６％のみが多能性マーカーによるものであるのに対して、ＥＤ、ＭＤ及びＮＥ遺伝子の遺伝子の発現への寄与はそれぞれ２４．９９％、２８．１２％及び３９．９１％に達する。この段階では、ＭＥＤ系列遺伝子は、遺伝子の発現の４．３１％しか寄与しない（図５及び表７に要約）。培養のＤ１４（図６）では、ＥＤ、ＭＤ及びＮＥ遺伝子の遺伝子の発現への寄与はそれぞれ、３８．００％、１４．００％及び３７．００％に達する。

Ｂ． ｈｉＰＳＣからの初期系列限定ＯＳＣ
ＭＤ限定ＯＳＣについての表８、ＮＥ限定ＯＳＣについての表９、又はＥＤ限定ＯＳＣについての表１０、又は図６に示すように、系列限定ＯＳＣから得られるＥＢは、他の型と比較してＭＤ、ＮＥ、及びＥＤ初期系列細胞に顕著に富む。結果は、下記の表８～１０にまとめられており、また、図６にも示されている。

したがって、ＷＴＣ－１１ ｈｉＰＳＣにおける系列指定因子遺伝子の少なくとも１種又は組合せの遺伝子編集によるｋｏによって、系列限定ＯＳＣの生成が可能となり、それによってかかるアプローチが哺乳類でも実行可能であることが示される。実際、図６に示すように、ＭＩＸＬ１、ＧＳＣ又はＥＯＭＥＳのいずれかの不活性化は、ＮＥ系列の細胞に顕著に富む（１．５～最大２．２倍の増加）ＯＳＣを発生する胚様体（ＥＢ）をもたらすが、一方、多能性細胞並びにＭＥ、ＥＤ及びＭＥＤ系列の細胞は、対照に比べて顕著に減少する。同様に、ＥＤ系列の遺伝子が不活性化されたとき、ＥＢの細胞系列組成における顕著なバイアスが観察される（例えば、ＳＯＸ１７、ＮＥ細胞の２．０倍の増加）。

初期ＮＥ系列の細胞への分化を支配する１種の遺伝子の不活性化（例えば、ＰＡＸ６）により、ＭＥＤ系列の細胞に富むようになる（６．３倍超の増加）が、一方、初期ＭＥＤへの分化を支配する１種の遺伝子の不活性化（例えば、ＴＢＸＴ）により、ＮＥ系列（最大１．８倍の増加）及びＥＤ系列（最大１．３倍の増加）の細胞に富む胚様体が生じる。
Ｃ． ケラチノサイトへの指向性分化
ＭＥＤ又は初期ＮＥ系列指定因子遺伝子が不活性化されているいくつかのクローンＯＳＣの指向性分化の結果（ＦＳ／ＷＴ；ＦＳ／ＩＦ；ＦＳ／ＦＳ、図７）は、ケラチノサイトのマーカー遺伝子として通常考えられるＴＰ６３及び／又はＫＲＴ１４遺伝子の発現が対照に対して野生型細胞と比較して大幅に増加することを示す。

（実施例ＩＩ）
アヒルＥＳＣからのＯＳＣの生成
分化能力が限定されたＯＳＣの操作が、食料品生産に関連する非哺乳類種に一般的に適用できるか示すために、アヒルＯＳＣは、アヒルＥＳＣ（ｄＥＳＣ）における遺伝子編集によって生成する。
ｄＥＳＣは、内部で産みたての卵から単離し、未分化及びｄＥＳＣ分化ＥＢにおけるＰＬ、ＮＥ、ＭＥＤ、ＭＤ、ＥＤ遺伝子の発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析によって品質管理した後に遺伝子編集を行った。

Ｉ． アヒルＥＳＣにおける系列指定因子の候補遺伝子の不活性化によるアヒルＯＳＣの生成
下記の表１２に、本研究で使用したヒト遺伝子に対するアヒルオルソログの一覧表を示す。

Ａ． 初期系列指定因子候補遺伝子の選択、及びゲノム操作プラットフォーム
予想されるように、３種のＭＥＤアヒルオルソログのタンパク質ドメイン並びにＦＯＸＡ２、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１及びＴＢＸ６は、ヒトの種と鳥類の種との間でよく保存されている。アヒル遺伝子のノックアウトを生成するために、実施例Ｉに記載のアプローチは、アヒルＥＳＣにおいて、候補遺伝子のオープンリーディングフレームにｆｓインデルをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集によって生成させることを目的として使用する。
ｇＲＮＡの設計
選択した系列指定因子遺伝子のゲノム及びコード配列は、ウェブベースのゲノムブラウザからダウンロードし、実施例Ｉに記載される配列解析ソフトウェアに保存する。転写因子のＤＮＡ結合ドメインのすぐ上流のエクソン配列の２００～３００ヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＯＲ ｇＲＮＡ設計ツール（＜ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｏｒ．ｔｅｆｏｒ．ｎｅｔ／＞）でクエリとして使用する。このｇＲＮＡ設計ツールは、アヒル（アナス・プラティリンコス（Ａｎａｓ ｐｌａｔｙｒｈｙｎｃｈｏｓ））を含む複数の無脊椎動物及び脊椎動物の種にわたるｇＲＮＡを設計及び分析する場合の選択肢となる。遺伝子毎に、オンターゲット予測活性が最も高くかつオフターゲット予測活性が最も低い３種の最高ランクのｇＲＮＡを、アヒルＥＳＣにおける更なる機能試験用に選択する。

ｇＲＮＡスクリーニング
各アヒル遺伝子を標的とする最も活性の高いｇＲＮＡを同定するため、９種のアヒルＭＥＤ ｇＲＮＡを実施例Ｉに記載されるようにトランスフェクトし、特定のｇＲＮＡでトランスフェクトした細胞のプールからのゲノムＤＮＡを分析する。各標的では、座位ＴＩＤＥ／ＩＣＥオリゴペアは、ｇＲＮＡ標的部位に隣接する５００～７００のゲノム配列を増幅するように設計される。座位特異的ＰＣＲ増幅産物は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して精製する。各生成物は、内部ＴＩＤＥ／ＩＣＥシークエンシングオリゴを使用したサンガーシークエンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ）に送られる。サンガー配列ＡＢＩファイルは、次に、各ｇＲＮＡの切断部位で生じる小さなインデルを定量することができるＴＩＤＥ（＜ｈｔｔｐｓ：／／ｔｉｄｅ．ｎｋｉ．ｎｌ／＞）又はＩＣＥ ｓｙｎｔｈｅｇｏ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｙｎｔｈｅｇｏ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｃｒｉｓｐｒ－ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェアを使用して、解析する。

アヒルＯＳＣクローン系の生成
ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体のトランスフェクション
アヒルＥＳＣは、ｄＥＳＣ培地（ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及びＬＩＦ（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））中で培養し、０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して継代する以外は、実施例Ｉと同じである。図４Ｂに示すように、全ての試験した遺伝子においてヒトＷＴＣ－１１細胞クローンよりも更に高い効率でインデルを生成させることが可能であった。
ＣＲＩＳＰＲ編集ｄＥＳＣのクローンの拡大
アヒルＥＳＣは、ｄＥＳＣ培地で培養し、０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡを用いて継代する以外は、実施例Ｉと同じである。
ＣＲＩＳＰＲ編集クローンの座位特異的ＭｉＳｅｑシークエンシング
座位特異的アヒルＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑオリゴを、各ｇＲＮＡ切断部位の周囲の１５０～２００のゲノム領域を増幅するために設計する。各座位特異的ＭｉＳｅｑオリゴペアを、対応座位を標的とするｇＲＮＡで編集したＤＮＡを含む９６ウェルプレートの、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いたＭｉＳｅｑ ＰＣＲ Ｉ増幅（１５サイクル）に使用する。アプローチは、それ以外は、実施例Ｉと同じである。

ＭｉＳｅｑで配列決定されたＣＲＩＳＰＲ編集クローンのＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２分析
ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２分析は、実施例Ｉで説明したように実施する。
ＣＲＩＳＰＲ編集クローンの増幅及び保存
このステップは、実施例Ｉと同様に実施する。
Ｂ． アヒルＰＳＣ及びＯＳＣの分化能力の評価
多能性アッセイ
このアッセイによって、未分化アヒルＥＳＣ又はＮＥ ＯＳＣの多能性状態を、初期ＰＬ、ＮＥ、ＭＥＤ、ＭＤ、ＥＤ遺伝子の発現を定量することで調べることができる。アヒルＥＳＣ又はＮＥ ＯＳＣは、ゼラチンコート６ウェル培養皿上でｄＥＳＣ培地中で２継代増殖する。約７５％コンフルエントのウェルは、ＰＢＳで２回洗浄し、０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡで解離し、ＰＢＳに再懸濁する。細胞をＣｏｕｎｔｅｓｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒで計数し、１×１０⁶細胞アリコートを収集する。ＰＢＳを除去し、細胞ペレットを、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析のために５００μｌのトリゾール試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に再懸濁する。約１５０ｂｐの増幅産物を増幅するプライマー、好ましくは選択した遺伝子マーカーのエクソン－エクソンジャンクションにおけるものは、当技術分野でよく知られているように設計する。Ｐｏｗｅｒｔｒａｃｋ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、リアルタイムＰＣＲ装置（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＰＣＲ関連シグナルを定量するのに使用する。

ＥＢ分化アッセイ
このアッセイによって、低ストリンジェンシーな分化アプローチを使用する場合のアヒルＥＳＣ又はアヒルＮＥ ＯＳＣの分化能力を、初期ＰＬ、ＮＥ、ＭＥＤ、ＭＤ、ＥＤ遺伝子の発現を定量することを通して調べることができる。プロトコールは、実施例Ｉとほぼ同じであり、簡潔に述べれば、未分化アヒルＥＳＣ及びＯＳＣを８０％コンフルエンシーになるまで培養した。細胞は、酵素で解離し、計数し、超低付着性（ＵＬＡ）において、ＥＳＣ培地（ＧｌｕｔａＭＡＸを含まないＤＭＥＭ／Ｆ－１２、１０％のＦＢＳ、１．４％のグルタミン、１．２％のピルビン酸、１．２％のＮＥＡＡ、０．２％の２－メルカプトエタノール、１０ｎｇ／μｌのｈＬＩＦ、１．１５ｎｇ／μｌのＩＬ６、１．１５ｎｇ／μｌのＩＬ６Ｒ、１．１５ｎｇ／μｌのｈＳＣＦ、５．７５ｎｇ／μｌのｉＧＦ１）中に５０００００細胞／ウェルでプレーティングし、インキュベーターに１日間戻した。翌日、凝集体を１５ｍＬファルコンチューブに移し、室温で５～１０分間重力により沈降させた。上清を除去し、細胞を６ｍＬのＥＢ培地（ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２、２０％のＫｎｏｃｋ－Ｏｕｔ血清代替物、１％のＭＥＭ非必須アミノ酸、０．１％の２－メルカプトエタノール）を使用して再懸濁し、超低付着性（ＵＬＡ）６ウェル皿に移した。培地は、２日毎に新鮮なＥＢ培地に１２日間交換した。

１２日間の培養後、ＥＢを分析のため収集する。ＰＢＳで２回洗浄後、ＥＢは、Ａｃｃｕｔａｓｅで解離し、ＰＢＳに再懸濁する。細胞は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒで計数し、１×１０⁶細胞アリコートをペレット化する。ＰＢＳを除去し、細胞ペレットを、ｑＲＴ－ＰＣＲによる分析のために５００μｌのトリゾール試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に再懸濁する。分化能力バイアスは、対照未改変ｄＥＳＣから派生する分化細胞とアヒルＮＥ ＯＳＣから派生する分化細胞との間のシグナル倍率変化を計算することによって決定する。

ＥＢ分化のための代替プロトコール
ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）４００ ２４ウェル培養プレート（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＡｎｔｉ－Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ Ｒｉｎｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で前処理し、マイクロウェル内に存在する気泡を遠心分離により除去する。接着培養において、細胞は、室温で５分間ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）消化して解離させ、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）４００培養プレートに播種する。６×１０⁵細胞の細胞懸濁液を各ウェルに播種する（５００細胞／マイクロウェル）。細胞は、これらの条件で、３７℃及び５％のＣＯ２にて２４時間インキュベートする。このインキュベーション後、小さな凝集体が形成される。この凝集体をＵＬＡプレートに移し（１ウェルの内容物を６ウェルプレートの１ウェルに移す）、培地をＥＢ培地（下記の組成）に変える。この時点から、細胞を３７℃、１２５ｒｐｍ及び５％ＣＯ２でインキュベートする。培地を２日毎に交換し、各時点でＱＣＲ分析のために１つのＰ６の内容物を回収する。

アヒルケラチノサイト指向性分化
未分化アヒルＥＳＣ及びＯＳＣは、６ウェルプレートにおいて、１０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、ＥＳＣ培地（ＧｌｕｔａＭＡＸを含まないＤＭＥＭ／Ｆ－１２、１０％のＦＢＳ、１．４％のグルタミン、１．２％のピルビン酸、１．２％のＮＥＡＡ、０．２％の２－メルカプトエタノール、１０ｎｇ／μｌのｈＬＩＦ、１．１５ｎｇ／μｌのＩＬ６、１．１５ｎｇ／μｌのＩＬ６Ｒ、１．１５ｎｇ／μｌのｈＳＣＦ、５．７５ｎｇ／μｌのｉＧＦ１）中で３日間培養し、次に、分化培地（ＤＫＳＦＭ（Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ）、５０μＭのレチノイン酸、２５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４）に１日間切り替える。１日目から１６日目まで、培地は、ＤＫＳＦＭ（Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ）と２～３日毎に交換する。
全ＲＮＡを０日目及び１６日目に生成した細胞ペレットから抽出する。逆転写のステップ後、ｃＤＮＡは、表１２に列挙されている遺伝子の典拠を用いることから設計を開始した各遺伝子マーカーのエクソン－エクソンジャンクションにまたがる特異的プライマーを使用してｑＲＴ－ＰＣＲによって分析する。ＳＹＢＲグリーンを、リアルタイムＰＣＲの間にＤＮＡ分子の定量を可能とするＤＮＡ結合蛍光色素として使用する。

ＩＩ． 結果
Ａ． ｄＯＳＣでのＥＢ分化アッセイ
ｈｉＰＳＣの場合と同様に、未改変ｄＥＳＣの場合、７日間又は１２日間の培養後、ＥＤ、ＮＥ、及びＭＤ細胞は、ＥＢの細胞の大部分を構成することが見出される。また、ＮＥ限定ＯＳＣ（ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１又はＥＯＭＥＳのアヒル遺伝子オルソログのいずれかが不活性化（示されていない））からできているＥＢにおいてＮＥ系列の細胞が顕著に富んでいることが見出される。図８に示すように、非不活性化系列経路細胞（non-inactivated lineage pathway cells）に顕著に富むアヒル胚様体が、アヒルＥＳＣにおける初期ＥＤ、初期ＮＥ又は初期ＭＤ遺伝子の不活性化によりもたらされる。例えば：
－ ＮＥＭＤ及びＮＥＥＤ ｄＯＳＣに由来するＥＢにおいて、ＮＥ細胞は、ＥＢ細胞集団の大部分を占め、非改変ｄＥＳＣから得られるＥＢと比較して最大１．４３倍富んでおり、
－ ＮＥＭＤ及びＥＤＭＤ ｄＯＳＣに由来するＥＢにおいて、ＭＤ細胞集団もまた、非改変ｄＥＳＣから得られるＥＢと比較して最大２．２６倍増加することが見出され、
－ ＥＤＭＤ ｄＯＳＣに由来するＥＢにおいて、ＥＤ細胞集団もまた、非改変ｄＥＳＣから得られるＥＢと比較して最大１．６５倍増加することが見出される。

逆に、不活性化系列経路に対応する細胞の集団の減少が、例えば、以下のように観察される：
－ ＮＥＥＤ ｄＯＳＣに由来するＥＢにおいて、ＥＤ又はＭＤ細胞集団は、非改変ｄＥＳＣから得られるＥＢと比較して最大１／３．６減少することが見出され、
－ ＥＤＭＤ ｄＯＳＣに由来するＥＢにおいて、ＮＥ細胞集団は、非改変ｄＥＳＣから得られるＥＢと比較して１／１．５５減少することが見出される。
Ｂ． ＮＥ ＯＳＣのケラチノサイトへの指向性分化
２種の異なる二重ｋｏ ＮＥ ＯＳＣクローン系（Ｐａｘ６（ＦＳ／ＷＴ）；Ｇｓｃ（ＦＳ／ＦＳ）及びＰａｘ６（ＦＳ／ＦＳ）；Ｇｓｃ（ＦＳ／ＦＳ））のケラチノサイトへの分化能力を、上で述べたように指向性分化を使用して試験する（図１０）。２種のクローンは、ケラチノサイトのマーカーとして当技術分野でみなされているＫｒｔ１４の発現が対照と比較して顕著に増加していることが示される。前記クローンは、逆に、ＮＥマーカー遺伝子及びＰＬ遺伝子の発現が減少していることが示される。

（実施例ＩＩＩ）
分化ＯＳＣの加工
アヒルパテ
アヒルパテの調製のために、ＯＳＣ派生筋細胞及びＯＳＣ派生脂肪細胞の細胞を、３００ｇでの遠心分離によって別々に収集する。細胞集団は、組み合わせ（６０％の筋細胞及び４０％の脂肪細胞）、適量のタマネギ、ニンニク、ワケギ、タイム、パセリ及びローレルとブレンドする。次に、この混合物を、ダイズレシチン、小麦粉、コニャック、塩及びコショウと混合する。調製物は、水を満たしたテリーヌ皿に置き、６０～２００℃、好ましくは１６０℃で５～９０分間、好ましくは４５分間焼く。
ＯＳＣ派生筋細胞及びＯＳＣ派生脂肪細胞は、上で述べたように得たＯＳＣから得られる。別々のバイオリアクターに播種し、５日間増幅させた後、前記ＯＳＣは、次に、分化誘導し、３００ｇでの遠心分離によって別々に収集する。

アヒルレバーパテ
アヒルレバーパテの生産のために、ＯＳＣ派生肝細胞は、ＥＤ系列へのバイアスがかかっているＯＳＣから得る。バイオリアクターに播種し、５％ＣＯ２を用いて３７℃で５日間増幅した後、前記ＯＳＣは、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４及び２０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦサイトカインを使用して、更に胚体ＥＤ細胞へと分化させ、更には成熟肝細胞へと分化させる。次いで、前記肝細胞は、脂質過負荷条件下で培養して、脂肪症を達成する（ＲＡ Ｍｏｒａｖｃｏｖａら、２０１５）。
次いで、得られた成熟脂肪肝細胞は、収集し、遠心分離によって処理して培養培地を除去し、任意に、少なくとも１回の洗浄／遠心分離のサイクルを細胞に適用して培養培地を除去する。上清を除去して細胞のペレットを残す。

次いで収集した脂肪肝細胞は、他の食品原料（表１３、アヒルレバーパテ組成物の例）と共に更に加工してアヒルレバーパテを生産する。

脂肪肝細胞は、業界基準の高せん断混合又は分散技術を使用して、植物脂肪及び残りの全ての食品原料と約１５℃の温度にて５０００ＲＰＭで１０分間混合する。

この調製物を、瓶に注ぎ、次に、７０℃（水浴）で５～１０分間調理し、冷却した後、４℃で保存する。これにより、フォアグラ様製品がもたらされる。
牛肉様製品
牛肉の胚性幹細胞は、上で述べたように遺伝子操作して、ＭＤ系列へのバイアスがかかっているＯＳＣを得る。前記ＯＳＣは、バイオリアクターにおいて牛肉ＯＳＣに適した基本培地中に播種し、５％ＣＯ２を用いて３７℃で５日間増幅した後、更にＤＥ細胞へと分化させ、更にはウシ骨格筋細胞へと分化させる。

次いで、細胞バイオマスは、収集し、１，５００ｇ（４℃）で１０分間遠心分離によって処理して、細胞残屑及び培養培地を除去し、任意に、少なくとも１回の洗浄／遠心分離のサイクルを適用する。得られた細胞は、業界基準の高せん断混合又は分散技術を用いて、様々な食品原料、例えば、塩、コショウ、砂糖、質感付与剤、着色料、香辛料と１５℃にて５０００ＲＰＭで約１０分間混合する。これらの食品原料は、中間細胞ベース調製物の総質量に対して０．１～５質量％という少量で細胞に添加する。
最終食品製品を後処理するために、中間細胞ベース調製物をベースにしたインク及び脱臭植物脂肪、例えば、精製ヤシ油をベースにしたインクの両方を使用して３Ｄ印刷の追加ステップを実施して、適切な外見、質感を更に提供し、従来のホールカットの１片の牛肉の口当たりを模倣する。次いで、印刷された食料品は冷却され、真空下でプラスチック袋に包装される。最終的に包装された食料品は、フライパンで焼くなどの更なる消費前のステップまで４℃で保存する。

参考文献

Claims (15)

1. 食料品を生産する方法であって、インビトロ分化非ヒト動物細胞を加工するステップを含み、前記インビトロ分化非ヒト動物細胞が少なくとも１種の寡能性幹細胞（ＯＳＣ）に由来し、前記少なくとも１種のＯＳＣは、少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている、方法。
2. インビトロ分化非ヒト動物細胞を加工するステップの前に、前記インビトロ分化非ヒト動物細胞を生産するステップであって、
   － 少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている少なくとも１種のＯＳＣを増幅させるステップ、
   － 任意に、前記増幅されたＯＳＣを胚様体として培養するステップ、又は
   － 任意に、前記ＯＳＣを分化させるステップ
   を含むステップを含む、請求項１に記載の方法。
3. 少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている少なくとも１種のＯＳＣを増幅させるステップの前に、遺伝子編集システムを用いて少なくとも１種の挿入及び／又は欠失を生成させることにより、多能性幹細胞（ＰＳＣ）又は複能性若しくは全能性細胞において少なくとも１種の系列指定因子遺伝子を安定して不活性化することによって、前記少なくとも１種のＯＳＣを得るステップを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記ＰＳＣ又は複能性若しくは全能性細胞は、非ヒト脊椎動物、例えば、家畜、魚類、鳥類；昆虫；甲殻類、例えば、小エビ、エビ、カニ、ザリガニ、及び／又はロブスター；軟体動物、例えば、タコ、イカ、コウイカ、ホタテガイ、カタツムリに由来する、請求項３に記載の方法。
5. 前記ＰＳＣが、非ヒト動物起源からの人工ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、核移植ＥＳＣ（ｎｔＥＳＣ）から選択される、請求項３に記載の方法。
6. 前記ＯＳＣは、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＺＮＦ５２１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＺＩＣ１、ＴＢＸＴ、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１、ＫＬＦ６、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ４Ａ、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＥＯＭＥＳ又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の神経外胚葉（ＮＥ）、中胚葉（ＭＤ）、内胚葉（ＥＤ）又は中内胚葉（ＭＥＤ）系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている、請求項１に記載の方法。
7. 前記ＯＳＣは、少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の発現及び少なくとも１種のＭＤ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている、請求項６に記載の方法。
8. 前記ＯＳＣは、肝臓特異的であり、ＮＥ系列指定因子遺伝子の少なくとも１種の遺伝子の発現、ＭＤ系列指定因子遺伝子の少なくとも１種の遺伝子の発現、及びＥＤ細胞の非肝臓前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている、請求項６に記載の方法。
9. 前記ＯＳＣは、少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の発現及び少なくとも１種のＥＤ系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されている、請求項６に記載の方法。
10. 前記ＯＳＣは、骨格筋特異的であり、少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の発現、ＥＤ系列指定因子遺伝子の少なくとも１種の遺伝子の発現、及びＭＤ細胞の非骨格筋前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている、請求項６に記載の方法。
11. 前記ＯＳＣは、心臓特異的であり、少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の発現、少なくとも１種のＥＤ系列指定因子遺伝子の発現、及びＭＤ細胞の非心臓前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子の発現が不活性化されている、請求項６に記載の方法。
12. 前記ＯＳＣは、脂肪細胞特異的であり、少なくとも１種のＮＥ系列指定因子遺伝子の発現、少なくとも１種のＥＤ系列指定因子遺伝子の発現、及びＭＤ細胞の非脂肪細胞の前駆細胞への分化を支配する少なくとも１種の遺伝子が不活性化されている、請求項６に記載の方法。
13. 少なくとも１種のＯＳＣが、骨格筋、心臓、肝細胞、線維芽細胞、赤血球、ケラチノサイト、若しくは脂肪細胞特異的ＯＳＣ、又はそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
14. ＮＥ、ＭＤ、ＥＤ又はＭＥＤ系列指定因子遺伝子の群から選択される少なくとも２種の系列指定因子遺伝子の発現が不活性化されていることを特徴とする、非ヒトＯＳＣ。
15. 少なくとも１種の非ヒト動物細胞を含む食料品であって、ＮＥ、ＭＤ、ＥＤ又はＭＥＤ系列指定因子遺伝子の群から選択される少なくとも１種の系列指定因子遺伝子の発現が、遺伝子編集システムを用いて少なくとも１種の挿入及び／又は欠失を生成させることにより不活性化されている、食料品。

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