CN116917463A - 用于培养肉工业的多能干细胞聚集体和从其获得的微组织 - Google Patents
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Abstract
始发态细胞、多能干细胞聚集体和由其生产的微组织，及其用于生产可食用产品的用途。
Description
相关申请
本申请要求于2021年1月20日提交的第63/139,374号美国临时专利申请、于2021年1月10日提交的第63/135,677号美国临时专利申请和于2021年10月18日提交的第63/256,679号美国临时专利申请的优先权，每份申请的全部内容通过引用并入。
本发明的领域和背景
本发明，在其一些实施方式中，涉及用于培养肉工业的多能干细胞聚集体和从其获得的微组织。
成功生产培养肉或通常称为清洁肉，需要面临三个主要考虑：i.细胞来源ii.培养条件和iii.可扩展性。
i.细胞来源：自发现以来，胚胎干细胞(ESC)由于其自我更新能力和几乎分化为任何类型细胞的能力，一直激励着科学家(6)。干细胞研究的重大进展使此类细胞在许多科学和医学应用中得以利用，并提供了关于必要培养条件的优化的有价值的数据(7)。ESC来源于早期胚胎(例如哺乳动物囊胚或禽X期胚胎)，只要阻止其自发分化，就可无限期培养(8)。由于满足市场需求所需的大量细胞，这一特性对培养的肉工业尤其具有吸引力。生长期后，可将ESC分化为特定谱系(9)，以概括最终产品中特定动物组织的所需味道和结构。虽然上述许多已被应用，主要用于学术和医学目的，但是培养肉工业仍在投入大量资源开发具有干细胞特征的新来源和类型的细胞系，如具有快速倍增时间的自我更新和分化潜能。用于清洁肉应用的另一类细胞是来自成人组织的原代细胞和祖细胞。虽然这些细胞仍保持一些自我更新能力，但是其效力在某种程度上限于特定谱系(10)。
ii.培养条件培养细胞通常在含有营养化合物(例如盐、脂肪酸、氨基酸、糖、生长因子)和动物来源血清的缓冲培养基中体外生长(13)。用于体外细胞培养的大多数可用的培养基最初针对小规模应用进行了优化(14)，因此忽略了其他变量，如财务成本、消费者对动物成分的敏感性以及培养基支持致密细胞群的能力。
iii.可扩展性大多数(如果不是所有)细胞都需要适应高密度、大容量培养。目前可接受的实现此类培养的方法是在监测的生物反应器中使用悬浮培养物，并不断搅拌，鼓励细胞象贴壁细胞在2D微载体上一样生长为聚集体(15)。然而，该过程中最具挑战性的部分将是放大细胞的分化或成熟(无论是否共培养)，以产生组织样结构。
培养鸡细胞的情况尤其具有吸引力，因为鸡肉被认为是高度营养的，蛋白质与肌肉/脂肪比率较高，并且鸡是地球上消耗最多的生物体(16)。出于这些原因，其生产的清洁可持续替代品是最理想的。如本文所用，“培养肉”可与“清洁肉”互换。
虽然是胚胎发育领域中胚胎发育研究的重要模型，但是与其他模型(例如小鼠/人ESC)相比，禽胚胎干细胞的情况似乎吸引了更少的关注。禽ESC可从X-XIII期胚盘获得(17)。这些囊胚层细胞表现出干细胞的所有特征，包括端粒酶活性和胚胎标记物(如碱性磷酸酶、SSEA1、Nanog、Oct4)的表达。然而，容易获得禽囊胚层细胞，以及它们在培养中自我更新的能力，导致它们在动物疫苗工业中的应用(20)。与培养肉工业相似，培养中的疫苗生产也需要在大密度群中培养细胞。最近几项研究证明了将来自鸭和鸡来源的禽类ESC细胞适应基于悬浮液的大体积培养条件的能力(21)。
发明概述
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种生产多能干细胞聚集体的方法，所述方法包括：
(a)提供在基质粘附条件下生长的非人多能干细胞；
(b)逐渐剥夺所述基质粘附的所述非人干细胞系，以获得包含所述非人多能干细胞的聚集体，所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出以未分化方式不超过12小时的倍增时间持续超过60次传代，能够在分化诱导后分化为肌肉、脂肪和结缔组织，表现出低于胚状体(EB)的细胞对细胞粘附，如通过选自由COL6A2、CD44、COL6A1、ANXA1、ANXA2和S100A11组成的组的粘附分子的减少的表达所确定的，其中步骤(a)和(b)在生长因子存在下进行。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种生产包含一种或多种细胞类型的微组织的方法，所述方法包括：
(a)在没有基质粘附的悬浮液中形成包含非人多能干细胞的聚集体，所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出以未分化方式不超过12小时的倍增时间持续超过60次传代，能够在分化诱导后分化为肌肉、脂肪和结缔组织，在存在生长因子的情况下生长，表现出低于胚状体(EB)的细胞对细胞粘附，如通过选自由COL6A2、CD44、COL6A1、ANXA1、ANXA2和S100A11组成的组的粘附分子的减少的表达所确定的；和
(b)将所述聚集体转移至生物反应器，在不存在生长因子的情况下，在没有基质粘附的悬浮液中生长，从而生产所述微组织。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种生产包含一种或多种感兴趣细胞类型的微组织的方法，所述方法包括：
(a)生产如本文所述的微组织；和
(b)使所述微组织经受悬浮液中的分化条件，从而生产所述包含一种或多种感兴趣细胞类型的微组织。
根据本发明的一些实施方式，所指示的数值是在作为所述非人多能干细胞的类型和发育阶段的细胞生长的最佳条件下提供的。
根据本发明的一些实施方式，非人干细胞为胚胎干细胞。
根据本发明的一些实施方式，胚胎干细胞属于胚胎干细胞系。
根据本发明的一些实施方式，非人多能干细胞为家畜多能干细胞。
根据本发明的一些实施方式，非人多能干细胞选自禽多能干细胞、牛多能干细胞、猪多能干细胞、山羊多能干细胞、绵羊多能干细胞、虾多能干细胞和鱼多能干细胞的组。
根据本发明的一些实施方式，禽多能干细胞选自鸡多能干细胞和鸭多能干细胞的组。
根据本发明的一些实施方式，禽多能干细胞为鸡多能干细胞。
根据本发明的一些实施方式，微组织的直径为30-500μm。
根据本发明的一些实施方式，微组织的直径为30-500μm。
根据本发明的一些实施方式，聚集体的非人多能干细胞表现出80-120μm的平均直径。
根据本发明的一些实施方式，聚集体的非人多能干细胞表现出碱性磷酸酶表达。
根据本发明的一些实施方式，聚集体的非人多能干细胞表现出端粒酶基因表达。
根据本发明的一些实施方式，聚集体的非人多能干细胞为SSEA4-、LIN28+、ENS-1+、NANOG+、OCT4,+和TRA-I-60+。
根据本发明的一些实施方式，聚集体或微组织表现出天然肉制品的感官特性。
根据本发明的一些实施方式，多种组织类型中的一种选自由肌肉细胞、脂肪细胞和结缔组织细胞组成的组。
根据本发明的一些实施方式，基质粘附选自饲养细胞和天然或合成基质分子。
根据本发明的一些实施方式，基质分子包含明胶。
根据本发明的一些实施方式，生长因子选自由IGF-1、IL6、sIL6 Rα、hLIF和干细胞因子(SCF)组成的组。
根据本发明的一些实施方式，生长因子包括IGF-1、IL6、sIL6 Rα、hLIF和干细胞因子(SCF)。
根据本发明的一些实施方式，该方法的每一步骤均不含除所述非人多能干细胞之外的动物组分。
根据本发明的一些实施方式，聚集体表现出与它们所源自的干细胞系的基因表达大致相同的基因表达，排除细胞运动和迁移相关基因的表达水平。
根据本发明的一些实施方式，微组织为NANOG-OCT4-LIN28-、SSEA3+。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了根据如本文所述方法可获得的微组织。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了根据如本文所述方法可获得的多能干细胞聚集体。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了包含一种或多种细胞类型的微组织，所述微组织的直径为30-500μm，其中所述微组织的细胞为NANOG-OCT4-LIN28-、SSEA3+。
根据本发明的一些实施方式，微组织表现出天然肉制品的感官特性。
根据本发明的一些实施方式，一种或多种细胞类型包括脂肪细胞和肌肉细胞。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种多能干细胞聚集体，其包含非人多能干细胞，所述聚集体的非人多能干细胞表现出以未分化方式不超过12小时的倍增时间持续超过60次传代，能够在分化诱导后分化为肌肉、脂肪和结缔组织，表现出低于胚状体(EB)的细胞对细胞粘附，如通过与所述EB相比选自由COL6A2、CD44、COL6A1、ANXA1、ANXA2和S100A11组成的组的粘附分子的减少的表达所确定的。
根据本发明的一些实施方式，多能干细胞聚集体表现出以下至少一种：
(i)平均直径80-120μm；
(ii)所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出碱性磷酸酶表达；
(iii)所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出端粒酶基因表达；
(iv)所述聚集体的所述非人多能干细胞为SSEA4-、LIN28+、ENS-1+、NANOG+、OCT4,+和TRA-I-60+；
(v)表现出天然肉制品的感官特性；
(vi)所述聚集体表现出与它们所源自的干细胞系大致相同的基因表达，排除细胞运动和迁移相关基因的表达水平。
根据本发明的一些实施方式，非人多能干细胞选自由禽多能干细胞、牛多能干细胞、猪多能干细胞、山羊多能干细胞、绵羊多能干细胞、虾多能干细胞和鱼多能干细胞组成的组。
根据本发明的一些实施方式，禽多能干细胞选自鸡多能干细胞和鸭多能干细胞的组。
根据本发明的一些实施方式，禽多能干细胞为鸡多能干细胞。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了包含本文所述微组织或聚集体的食品。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种生产食品的方法，该方法包括将本文所述的微组织或聚集体与供人类食用的可食用组合物组合。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种生产细胞的方法，该方法包括在浓度高于100μM的脂肪酸存在下培养具有脂肪细胞命运同时保持增殖表型的干细胞一段足以允许分化为脂肪细胞的时间。
根据本发明的一些实施方式，实现培养具有脂肪细胞命运的干细胞持续5-10天。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了根据如本文所述方法可获得的细胞。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了根据如本文所述方法可获得的微组织。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了根据如本文所述方法可获得的多能干细胞聚集体。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了包含如本文所述的细胞或如本文所述的微组织或聚集体的食品。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种生产食品的方法，所述方法包括将如本文所述的权利要求的细胞或微组织或聚集体与供人类食用的可食用组合物组合。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然可以在本发明的实施方式的实践或测试中使用与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料，但是下文描述示例性方法和/或材料。如果发生冲突，将以专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和示例仅为说明性，并非必须限制。
附图的几个视图的简要说明
图1A-E：cESC的分离。a.铺在饲养细胞层上的分离的cESC，产生细胞团块。b.与饲养细胞一起生长的典型建立的干细胞集落。c.在未添加饲养层的情况下铺的cESC形态。d.增殖细胞中的典型干细胞高核/细胞质比。e.无饲养细胞培养皿上cESC的增殖菌落。
图2A-F：cESC对悬浮液中生长的适应：a.移动到悬浮液的cESC集落的EB形态。b.适应悬浮液的cESC单细胞形态。c-e.悬浮液适应的cESC的早期分期聚集体。f.悬浮液适应的聚集体的成熟细胞聚集体。
图3：悬浮液中生长的聚集细胞的倍增时间。该图显示了聚集体悬浮生长的三个单独实验。计算75-120小时运行的平均倍增时间。计算的倍增时间范围为10-12小时，平均倍增时间为11.9小时/周期。
图4：聚集体细胞中干细胞标记物的表达。免疫荧光染色显示干细胞标记物Oct4、Nanog、in28、Tra-1-60和ENS-1(鸡干细胞标记物)的高表达和整体表达。SSEA3/4表面标记呈阴性。
图5A-C：聚集体的自我更新：a.聚集体对碱性磷酸酶染色阳性。
b.AP阳性聚集体的高倍放大c.三个聚集体群中端粒酶活性的代表性实例
图6：与鸡cES相比，聚集体样本中的代表性癌基因和肿瘤抑制因子基因表达水平。分析表明，与cES相比，聚集体保持了癌基因的表达水平。与鸡ES相比，肿瘤抑制因子无变化或升高。
图7A-B：聚集体细胞分化为脂肪积累细胞(A)a.未分化聚集体的初始培养。b.添添加分化培养基前培养3天的成熟聚集体。c.用脂肪分化培养基处理4天后，聚集体细胞的形态的改变。d.分化培养基处理后4天单个聚集体。证明在细胞细胞质内液滴的积累。(B)分化的聚集体中脂肪滴积累的验证。a.分化的聚集体染色为BODIPY染色阳性，证明脂肪积累。b.分化的脂肪积累细胞的高倍放大。
图8：聚集体分化为成纤维细胞。处理后，聚集体粘附在平板表面(左上)，随后聚集体崩解(右上)，导致采用单层上皮成纤维细胞。
图9：聚集体的节律性收缩经历肌肉分化。收缩在1.5-2秒内发生一次。
图10：无血清限定培养基中的微组织培养物。使细胞适应各种培养条件能力的代表性实例。呈现的克隆在补充有Ex-Cell(Merck)化学定义的水解产物的GRO-I(Merck)培养基中培养和繁殖。
图11显示微组织中干细胞和ECM标记物的表达。Oct4、Nanog和Lin28由于分化过程而丢失。然而，细胞获得了SSEA3的表达(上图)。此外，发现微组织中ECM和胶原家族成员的增强表达对Col2A1和Col9a2以及ECM标记物层粘连蛋白和HSPG的高存在呈阳性。
图12A-E：微组织限定区内的肌肉分化a.悬浮生长中的幼稚聚集体。b.将聚集体转移到分化条件中导致细胞突起以可重复的方式出现。c&d.肌肉分化开始(通过MyHC染色指示)e.微组织的几个位置中肌肉分化区的形成。
图13A-B：悬浮液中培养的禽干细胞微组织中肌肉祖细胞标记物的表达。
图14A-C：A.悬浮浮动聚集体培养物中微组织的形成。聚集体中出现突出物，MyHC(肌球蛋白重链)表达升高，表明限定的肌肉同一性。B.在贴壁条件中从微组织分化的肌肉纤维的成熟。C.B.的较高放大。
图15A-B：A.微组织分化为成熟的肌肉细胞。(a)-(c)：肌钙蛋白T的表达表明进入心肌细胞谱系。B：将细胞转移到粘附条件中促进肌肉纤维的成熟和伸长。
图16：暴露于高剂量油酸(上图)以及油酸和亚油酸联合处理(下图)后，分化微组织内脂肪滴大量积累到脂肪细胞中。
图17A-B：微组织分化为脂肪和肌肉细胞的互斥群。(a)肌钙蛋白-T染色强调在微组织外围分化为肌肉细胞，而bodipy染色则证明在微组织核心内形成脂肪积累细胞群。这两个群相互排斥。(b)图a中方形区域的放大。
图18A-E：微组织平行分化为不同的脂肪和肌肉细胞群：(a)微组织群内肌肉细胞骨架肌肉的典型排列(鬼笔环肽(Phalloidin)染色)。(b)肌纤维的核染色强调微组织细胞形成多核纤维。(c).脂肪积累细胞(脂肪细胞)微组织群的典型排列(鬼笔环肽染色)(d).脂质染色(BODIPY)生长强调分化微组织内的脂肪积累。(e).相同培养物内微组织细胞平行分化为脂肪和肌肉强调脂肪和肌肉细胞源自互斥群。
图19显示根据本发明的一些实施方式的方法的示意图。本发明的实施方式也指方法的部分，例如1-7、8b-9a、9b-a、8b、9b等。
本发明具体实施方式的描述
本发明，在其一些实施方式中，涉及生产用于培养肉工业的微组织的方法。
在详细说明本发明的至少一个实施方式之前，应理解，本发明在其应用中不一定限于以下描述中阐述的细节或由实施例举例说明的细节。本发明能够以其它实施方式或以各种方式实践或实施。
胚胎干细胞(ESC)尤其是鸡ESC的自我更新能力非常适用于培养肉工业。
为优化的肉生产设计了新平台。该平台提供了几个独特的特性，可以很好地作为肉和食品工业的强大工业制造工具，作为无穷无尽的非遗传修饰(GMO)生产来源。已显示细胞在100次传代以上自然不朽，保持稳定和一致的生长和特性。这减轻了补充动物细胞库的需要，使动物完全脱离生产工艺。该平台基于添加的无异种因子，使其完全不含除细胞本身以外的动物成分。该平台本质上是高度增殖的，支持连续生产工艺，从而实现成本效益和高产率制造工艺。
高效生产平台-聚集体和微组织线表现出快速的自我更新能力，并且能够达到快至8小时的倍增时间。这些培养物中的细胞密度超过10^8个细胞/ml。这些线保持高塑性，支持成熟过程，形成天然微组织结构，以可控的方式表达脂肪、肌肉和结缔组织细胞的异质组合物。工业标准试验显示，培养的和常规生产的鸡肉的营养成分和特性之间的高度相似。该平台生产原料或可用于合成具有与常规生产的肉类相当的感官特性的产品。行业标准测试以及多个品尝小组显示，在风味特征和消费者体验方面与传统生产的鸡肉高度相似。
因此，根据本发明的一个方面，提供了一种生产多能干细胞聚集体的方法，所述方法包括：
(a)提供在基质粘附条件下生长的非人多能干细胞的非人多能干细胞系；
(b)逐渐剥夺所述基质粘附的所述非人干细胞系，以获得包含所述非人多能干细胞的聚集体，所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出以未分化方式不超过12小时的倍增时间持续超过60次传代，能够在分化诱导后分化为肌肉、脂肪和结缔组织，表现出低于胚状体(EB)的细胞对细胞粘附，如通过与所述EB相比选自由COL6A2、CD44、COL6A1、ANXA1、ANXA2和S100A11组成的组的粘附分子的减少的表达所确定的，其中步骤(a)和(b)在生长因子存在下进行。
如本文所用，“多能干细胞”指非人细胞，其可分化为所有三个胚胎胚层，即外胚层、内胚层和中胚层或保持未分化状态。多能干细胞包括胚胎干细胞(ESC)和诱导的多能干细胞(iPS)。
短语“胚胎干细胞”是指胚胎细胞，其能够分化为所有三个胚胎胚层(即内胚层、外胚层和中胚层)的细胞，或保持未分化状态。短语“胚胎干细胞”可包括从胚胎植入前(即植入前胚泡)妊娠后形成的胚胎组织获得的细胞、从植入后/原肠胚形成前阶段胚泡中获得的延伸胚泡细胞(EBC)(参见WO2006/040763)、从妊娠期间任何时间胎儿的生殖组织获得的胚胎生殖(EG)细胞、和受孤雌生殖(孤雌生殖(parthenotes))刺激的源自未受精卵的细胞。
禽胚胎干细胞的主要来源是受精未孵化卵(第0天)。在此阶段，胚胎由60-100K多能细胞组成，处于停滞状态。为了使母鸡同步孵化在不同日期产下的几个蛋，停滞阶段至关重要。这些细胞的体外繁殖发生在39℃下温育时。(例如，Pokharel,N et al.PoultSci.2017Dec 1；96(12):4399-4408.doi:10.3382/ps/pex242.PMID:29053871)。
诱导的多能干细胞(iPS；胚胎样干细胞)，是通过成人体细胞去分化获得的细胞，其具有多能性(即，能够分化为三个胚胎生殖细胞层，即内胚层、外胚层和中胚层)。根据本发明的一些实施方式，此类细胞从分化组织(例如，体细胞组织诸如皮肤)获得且通过基因操作来经历去分化，所述基因操作重新编程细胞以获得胚胎干细胞特征。根据本发明的一些实施方式，通过在体细胞干细胞中诱导Oct-4、Sox2、Kfl4和c-Myc的表达来形成诱导的多能干细胞。
如本文所用，“聚集体”指经由粘附分子(例如ECM)的分泌彼此结合的一组增殖的、非分化的即多能细胞。尺寸可以在30-1000mm之间，例如，50-500um，例如，30-100um、100-500um、100-400um、200-500um、300-400um、100-200um、50-50um、500-1000um、700-1000um。值得注意的是，在整个文件中，尺寸指聚集体或微组织群中的平均尺寸。
标记物：Oct4+、Lin28+、SSEA1+、SSEA4-、ENS1+、Tra-1-60+.nanog+。根据具体实施方式，标记物为：Oct4+、Lin28+、SSEA4-、ENS1+、Tra-1-60+.Nanog+。
根据具体实施方式，聚集体在存在生长因子(例如，IGF1、SCF、IL6、IL6Rα、LIFhLIF其组合，或另外或替代地，IWR1、FGF2或其他)或信号传导抑制剂诸如Rho(例如，Y27632)MEK、GSK3、FGFR3、N2B27-3的抑制剂、或如下进一步举例说明的情况下生长。
根据具体实施方式，聚集体中约90-100％的细胞为多能干细胞。
如前所述，这些细胞是非人多能干细胞。
根据具体实施方式，非人多能干细胞属于家畜多能干细胞。
根据具体实施方式，非人多能干细胞选自禽多能干细胞、牛多能干细胞、猪多能干细胞、山羊多能干细胞、绵羊多能干细胞、虾多能干细胞和鱼多能干细胞的组。
如本文所用，术语“禽”是指分类学鸟纲的任何物种、亚种或生物体种，诸如但不限于，如鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦和包括鸵鸟、鸸鹋和食火鸡的平胸鸟的此类生物体。该术语包括原鸡(Gallus gallus)(鸡)的各种已知品种，例如，白来航鸡(Leghorn)、褐来航鸡、横斑洛克鸡(Barred-Rock)、苏塞克斯鸡、新汉夏鸡、洛岛鸡、澳洲黑鸡、考尼什鸡、米诺卡鸡、阿木鸡(Amrox)、加利福尼亚灰鸡、意大利山鹑色鸡(ItalianPartidge-coloured)以及火鸡、雉鸡、鹌鹑、鸭、未成熟的家养母鸡(game hen)、珍珠鸡、乳鸽、鸵鸟品种和其他通常以商业数量饲养的家禽。
在具体实施方式中，禽细胞为鸡细胞。
在一个实例中，细胞来自禽胚胎来源的干细胞系EB14(鸡)或EB66(鸭)(WO2005042728)。
根据一种实施方式，贯穿所述方法的细胞为非遗传修饰的。
在一个实施方式中，所述多能干细胞为干细胞系。
多能干细胞本质上是贴壁的，因此在细胞贴壁条件下生长，也称为二维培养(2D)。
根据具体实施方式，2D培养涉及在二维基质(无饲养层)上或饲养细胞上的生长。
因此，多能干细胞可以在存在培养基的情况下在固体表面诸如细胞外基质(例如明胶、纤维连接蛋白、人工基膜(MatrigelRTM)或层粘连蛋白)上生长(扩增)。
根据具体实施方式，表面为明胶。
根据具体实施方式，细胞在饲养层上生长。
根据具体实施方式，饲养细胞为小鼠胚胎成纤维细胞(MEFS)。
根据具体实施方式，细胞在因子和任选地血清(例如，胎牛血清、马血清和/或来自鳟鱼的鱼血清)或血清替代品(例如，酵母或植物水解产物例如大豆的存在下培养。此阶段可能包括其他因子，例如，丙酮酸钠、亚硒酸钠、氨基酸、2-巯基乙醇。允许细胞每24-72hr增殖和传代。
根据具体实施方式，生长因子选自由IGF-1、IL6、sIL6 Rα、hLIF和干细胞因子(SCF)组成的组。
根据具体实施方式，生长因子包括IGF-1、IL6、sIL6 Rα、hLIF和干细胞因子(SCF)。
根据本发明的一些实施方式，当细胞达到3-5次传代时，其逐渐被剥夺物质粘附(例如，饲养层)并生长持续几次传代以选择稳定的无饲养细胞克隆。根据一些实施方式，在此阶段仍存在因子。
值得注意的是，饲养层撤回阶段后，细胞倾向于形成由大有核细胞组成的不太紧密的干细胞集落，因为它们不受纤维细胞限制(图1c-e)。根据具体实施方式，在此阶段，细胞表现出每周期约24小时的预期倍增时间。这一阶段也被称为“逐渐剥夺基质粘附的非人干细胞系”。
如本文所用的“逐渐剥夺”是指基质粘附(而不是GF)的剥夺。
为此，细胞逐渐适应于悬浮生长，而不是作为贴壁细胞生长。
如本文所用，短语“悬浮培养”是指多能干细胞悬浮在培养基中而不是粘附在表面的培养。
因此，本发明的培养物“不含基质粘附”，其中多能干细胞能够在不粘附于外部底物(诸如细胞外基质的组分、玻璃微载体或珠粒)的情况下扩增。
根据一些实施方式，细胞从粘合表面(诸如包括粘合基质例如，明胶、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、聚-L-赖氨酸的那些)逐渐移出，并施加细微摇动(例如，50-100rpm)且任选地将聚集体机械解离。每次传代时，可能会逐渐增加摇动。根据具体实施方式，通过持续选择约2-3个月的时间，鼓励细胞下调不同的粘附分子同时表达其他的，允许随时间形成3D松散的覆盆子样聚集体，具有组成聚集体的每个细胞的明确定义，与胚状体的结构相反。在此阶段，细胞已变得非常稳定，并且倍增时间减少至每周期10-20，例如，18-20h、10-12h、12-14h、12-16h、10-16h、12-18h，诸如在禽胚胎干细胞的情况下。
根据具体实施方式，聚集体属于形成细胞系的聚集体。因此，在细胞适应悬浮液中的生长后，细胞适应以可重复的方式持续快速生长，诸如在搅拌的生物反应器环境中，以确保细胞适合工业放大的能力。为此，对克隆进行测试，以生成生长为聚集细胞的细胞系，具有高增殖率，任选地在搅拌生物反应器中高速搅拌(200-400rpm尖端速度)，同时保持聚集体的完整性和干细胞特征。根据本发明的一些实施方式，在该优化方法之后，生产具有所有有利特征的几种细胞系，这些细胞被命名为“SMCMC”。这些细胞表现出所需的形态、分化潜能和每周期10-12小时的倍增时间，一些生长条件显示每周期8小时。(图3)。
这种聚集体形成细胞系可储存在细胞库中。
根据本发明的一个方面，提供了多能干细胞聚集体。
根据具体实施方式，根据如本文所述的方法可获得聚集体。
根据具体实施方式，聚集体表现出80-120μm的平均直径。
根据具体实施方式，聚集体的非人多能干细胞表现出碱性磷酸酶表达。
根据具体实施方式，聚集体的非人多能干细胞表现出端粒酶基因表达。
根据具体实施方式，聚集体的非人多能干细胞为SSEA4-、LIN28+、ENS-1+、NANOG+、OCT4,+和TRA-I-60+，诸如在RNA水平所测定的。
根据具体实施方式，聚集体的非人多能干细胞不显示致癌转化。
根据本发明的一个方面，提供了一种多能干细胞聚集体，其包含非人多能干细胞，所述聚集体的非人多能干细胞表现出以未分化方式不超过12小时的倍增时间持续超过60次传代，能够在分化诱导后分化为肌肉、脂肪和结缔组织，表现出低于胚状体(EB)的细胞对细胞粘附，如通过与所述EB相比选自由COL6A2、CD44、COL6A1、ANXA1、ANXA2和S100A11组成的组的粘附分子的减少的表达所确定的。
根据具体实施方式，所述多能干细胞聚集体表现出以下中的至少一种：
(i)平均直径80-120μm；
(ii)所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出碱性磷酸酶表达；
(iii)所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出端粒酶基因表达；
(iv)所述聚集体的所述非人多能干细胞为SSEA4-、LIN28+、ENS-1+、NANOG+、OCT4,+和TRA-I-60+；
(v)表现出天然肉制品的感官特性；
(vi)所述聚集体表现出与它们源自的干细胞系大致相同的基因表达，排除细胞运动和迁移相关基因的表达水平。
根据具体实施方式，聚集体表现出i+ii.I+ii+iii、i-iv、i-v、i-vi、ii-iii、ii-iv、ii-v、ii-vi、iii-iv、iii-v、iii-vi、iv-v、iv-vi、v-vi的组合。
根据具体实施方式，非人多能干细胞选自禽多能干细胞、牛多能干细胞、猪多能干细胞、山羊多能干细胞、绵羊多能干细胞、虾多能干细胞和鱼多能干细胞的组。
根据具体实施方式，禽多能干细胞选自鸡多能干细胞和鸭多能干细胞的组。
根据具体实施方式，禽多能干细胞为鸡多能干细胞。
根据本发明的一些实施方式的示例性聚集体示于图4-6(禽类例如，鸡)中。
根据具体实施方式，聚集体表现出与它们所源自的干细胞系大致相同的基因表达，排除细胞运动和迁移相关基因的表达水平，诸如在RNA水平(参见实施例部分)或蛋白质水平(例如，免疫染色)所测定的。
根据具体实施方式，聚集体和微组织的细胞保持正常核型。
根据具体实施方式，以上涵盖图19的步骤1-7。根据具体实施方式，在存在血清的情况下执行这些步骤，尽管如所述血清可由血清替代品或其它替代品诸如酵母或植物水解产物替代。
培养肉生产特别强调用于培养细胞的培养基。组织培养基传统上设计用于其他目的(例如研究、制药、临床生产等)，因此从培养肉类生产的角度来看，需要注意几个问题。培养基的成本通常是培养肉类生产的最大经济负担。此外，大多数可用培养基含有胎牛(或其他动物来源)血清(FCS)。FCS的使用存在未定义的固有缺陷(就化学成分而言)，且批次之间差异很大。此外，在培养肉生产中使用此类材料很可能会因其生产方式有问题而疏远公众的接受。为了克服这些障碍，本发明人着手使聚集体和微组织(如下文进一步描述)适应在无血清培养基中生长，而不损害微组织的质量、安全性和独特特征。
图19显示了此类选项。
为了实现这一点，微组织(如下进一步描述)或后形成的聚集体(在振摇条件下)适应在无血清培养基中生长。
对无血清培养基的适应发生在通过使用无血清培养基在培养瓶中进行额外繁殖(图19 7b)，然后转移至搅拌的生物反应器(图19阶段8b)，或通过使用无血清培养基在生物反应器中直接播种(图19，阶段8b)，ES细胞在摇瓶种作为聚集体繁殖后(图19，阶段7b)。对无血清培养基的适应通过收集高度增殖的聚集体群并将其引入无血清培养基而进行(图19，7b)。逐渐适应通过随时间降低血清(例如，无血清培养基中的FBS)百分比而进行(例如，5％至2.5％至1％，直至完全撤回)。在大多数情况下，逐渐适应持续时间为2-4周。用于高规模生产的另一种生成无血清(SF)培养物的可能性是将聚集体直接转移至无血清培养基中。在该程序中，收集具有生存和快速适应变化环境能力的细胞。此过程的时间约为2周。根据本发明的一些实施方式，通过生成供将来使用的细胞库(图19步骤8a)来得出任一种可能性。
因此，如下所示，在无血清的情况下将细胞适应新培养基约14天，然后恢复最初的12小时倍增时间并保持高水平的细胞活力(图10)。以类似的方式，本发明人还能够使细胞适应在补充有酵母、植物蛋白胨和水解产物的基础培养基的其它组合中生长。在成功用于使细胞适应无血清培养基的混合中，本发明人可鉴别：补充有Ex-Cell裂解物的DMEM(高葡萄糖)、补充有Ex-Cell裂解物的DMEM/F12、补充有Ex-Cell裂解物的DMEM(低葡萄糖)、补充有KERRY集团生产的大豆和酵母裂解物组合的DMEM(高葡萄糖)。在该过程中成功测试的裂解物为这四种产品的全部或部分组合，如下：Hypep1510(ID:S-2048780,项目：U1-5X99023)、SHEFF-VAX PLUS ACF(ID S-2048778,U1-5X00484.K1G)、SHEFF-VAX PF ACF(ID:S-2048777,U1-5X01143.K1G)、SHEFF-VAX PLUS PF ACF VP(ID:S-2048776,U1-5X01090)。本发明人还成功地使微组织适应常规使用的基础培养基(DMEM HG/LG、DMEM/F12、RPMI1640)与FUJIFILM-IRVINE Scientific生产的大豆和酵母裂解物(超滤大豆水解产物#IR-96857E；超滤酵母水解产物#IR-96863E)的组合。此外，微组织也适应在补充有不同组合的DIFCO的精选大豆胨(#15ABP196)、Bacto的酵母提取物(#15ABP197)、BBL的植物蛋白胨(#15ABP195)、BBL的酵母提取物(#15ABP202)、Bacto麦芽提取物(15ABP201)和Bacto TC酵母酸盐(yeastolate)(#15ABP163)的基础培养基(DMEM HG/LG、DMEM/F12、RPMI 1640)中生长。为此，将酵母源裂解物与一种或几种植物源裂解物组合。在所有实验中，培养基还补充有乙醇胺(20ng/L)、胰岛素(100ug/L)、硒(50ng/L)和转铁蛋白(55ug/L)。培养基还补充有1XMEM NEAA(Biological industries，01-340-1B)、2mM L-丙氨酸/L-谷氨酰胺(Biologicalindustries-03-022-1B)和1mM丙酮酸钠(Biological industries)。本文呈现的结果强调了微组织适应多种组合的能力，这些组合基于补充有作为培养的培养基中血清替代品的大豆和植物水解产物的基础培养基。
应理解，并非所有步骤都是执行本发明实施方式所必需的。因此，例如，聚集体可从细胞库或商业供应商提供，并进一步用于食品工业，如下所述。
因此，无论生产如何，聚集体本身均可用于食品生产或进一步进行微组织产生的进一步开发工艺。
因此，根据本发明的一个方面，提供了一种生产包含一种或多种细胞类型的微组织的方法，所述方法包括：
(a)在没有基质粘附的悬浮液中形成包含非人多能干细胞的聚集体，所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出以未分化方式不超过12小时的倍增时间持续超过60次传代，能够在分化诱导后分化为肌肉、脂肪和结缔组织，在存在生长因子的情况下生长，表现出低于胚状体(EB)的细胞对细胞粘附，如通过与所述EB相比选自由COL6A2、CD44、COL6A1、ANXA1、ANXA2和S100A11组成的组的粘附分子的减少的表达所确定的；和
(b)将所述聚集体转移至生物反应器，在不存在生长因子的情况下，在没有基质粘附的悬浮液中生长，从而生产所述微组织。
根据替代方面，提供了一种生产包含一种或多种细胞类型的微组织的方法，所述方法包括：
(a)提供悬浮培养物，其包含聚集体，所述聚集体包含非人多能干细胞，所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出以未分化方式不超过12小时的倍增时间持续超过60次传代，能够在分化诱导后分化为肌肉、脂肪和结缔组织，在存在生长因子的情况下生长，表现出低于胚状体(EB)的细胞对细胞粘附，如通过与所述EB相比选自由COL6A2、CD44、COL6A1、ANXA1、ANXA2和S100A11组成的组的粘附分子的减少的表达所确定的；和
(b)将所述聚集体转移至生物反应器，在不存在生长因子的情况下，在没有基质粘附的悬浮液中生长，从而生产所述微组织。
在此阶段，将聚集体转移至不存在生长因子的生物反应器中，例如，如上所述。
如本文所用，生物反应器是指设计成在细胞培养背景下生长细胞、聚集体或组织的容器、装置或系统。此类生物反应器由Popovic等人BIOTECHNOLOGY-Bioreactoes andCultivation Systems for Cell and Tissue Culture-M.K.Popovic,Ralf Portner生命支持系统百科全书(Encyclopedia of Life Support Systems)(EOLSS)以及下文和之后的实施例部分描述。
根据规模选择生产用培养设备。大规模生产最好涉及使用专用设备。Furey(2000)Genetic Eng.News 20:10对连续细胞培养系统进行了综述。可根据本教导使用的合适的生物反应器包括但不限于，Sartorius Biostat STR、Sartorius Biostat BDCU、ThermoFisher HyPerforma DynaDrive S.U.B.、Eppendorf Bioflo 510。
当微组织用于食品工业时，此类系统也可用于微组织的生产。
如本文所用，术语“微组织”是指在没有生长因子或信号传递抑制剂的情况下生长的中胚层细胞非完全或最终分化。
如本文所用，“不存在生长因子”是指不包含添加的生长因子(除了血清中的生长因子之外，如果存在的话)的成熟培养基，其导致细胞失去关键的多能标记物，同时获得中胚层特性，包括特异性标记物，以及结缔组织蛋白的表达增加，如例如与图19的步骤7的细胞聚集体相比。由于微组织的早期分化阶段和生物反应器中的特定培养条件，这些微组织仍然能够快速且广泛地增殖并扩增至少150次群体倍增。
根据具体实施方式，生物反应器中的生长通过生物反应器运行参数的限定设定点来控制，例如，生物反应器内部搅拌和以0.25-1.70m/sec的尖端速度(最佳尖端速度为0.85m/sec)进行充气。这些参数反过来控制微组织的大小。微组织的大小对于在单个微组织中分化多种细胞类型的能力是重要的。
根据具体实施方式，如上文所述，微组织在无血清培养基中生长。
根据其它实施方式，微组织在血清存在下生长。
此成熟步骤(图19步骤8)可持续延长的时间，诸如150次传代以上。
如本文所用，“成熟”是指包括允许多能干细胞开始中胚层谱系定型的GF的撤回(即，不存在生长因子，也称为“无因子”)的步骤。
在下面的实施例部分中举例说明了可以采用的各种成熟方案。例如，在无因子培养基(DMEM(HG)/10-20％ FBS、10U/1U，青霉素/链霉素、2mM谷氨酰胺中在监测的搅拌生物反应器中的悬浮液中bESC的成熟；或在无因子培养基(DMEM(HG)/10-20％FBS、10U/1U，青霉素/链霉素、2mM谷氨酰胺中进行的搅拌生物反应器中的悬浮液中pESC的成熟。
不包括生长因子存在的步骤可持续7天至最长12个月，例如，在此期间细胞可被扩增收获、储存或进一步分化为特定目的细胞(例如，肌肉、脂肪或其组合)。
因此，提供了一种微组织。
因此，根据本发明的一个方面，提供了包含一种或多种细胞类型的微组织，微组织的直径为30-150μm，其中微组织的细胞(约90％)为NANOG-OCT4-LIN28-、SSEA3+。
根据本发明的一些实施方式，微组织表现出天然肉制品的感官特性
根据本发明的一些实施方式，一种或多种细胞类型包括脂肪细胞和肌肉细胞。
当不进行特定分化方案时，微组织为非多能的非完全分化的微组织。
如本文所用，“非完全分化的微组织”指包含中胚层谱系多潜能细胞(即，具有发育成不同类型中胚层组织的能力的细胞)的细胞的聚集体。微组织的大小可以在30-1000μm之间，例如50-300uM，标记物：Pax3+、Pax7+、MyoD+、SSEA4+、SSEA1-、oct4-，如在RNA水平所测定的(参见例如，实施例部分)。根据具体实施方式，步骤7的聚集体小于图19的步骤8b-9b的微组织。
此类微组织可整合到食品工业本身，或进一步进行分化过程。
因此，可以在此阶段收获非完全分化的微组织，该阶段由描述本发明实施方式的图19的步骤8b以非限制性方式覆盖。
或者，这些微组织可进一步进行分化。
因此，根据本发明的一个方面，提供了一种生产包含一种或多种感兴趣细胞类型的微组织的方法，所述方法包括：
(a)生产微组织(未完全分化)；和
(b)使微组织经受悬浮液中的分化条件，从而生产包含一种或多种感兴趣细胞类型的微组织。
用于分化的具体方案在随后的实施例部分以及通过引用以其全部并入的WO2018/189738中提供。
根据具体实施方式，分化的微组织为NANOG-OCT4-LIN28-、SSEA3+。
因此，“分化的微组织”是指由分化为成熟肌肉(肌钙蛋白T+、肌球蛋白+)、脂肪细胞(油红和Bodipy染色阳性)和胶原分泌细胞(COL9+COL1A+、COL2A+)的细胞组成的细胞聚集体。尺寸可在30-5000μm之间。参见例如，图16-18A-E作为示例性实施方式。
根据具体实施方式，微组织直径为30-500μm。
如上所述，成熟的微组织或聚集体可以使用本领域公知的分化方案进行分化。
或者，微组织或聚集体的分化方案可以是多步骤过程。
因此，根据本发明的一个方面，提供了一种向脂肪细胞命运的细胞引发(priming)的方法，该方法包括在浓度不超过100μM的脂肪酸存在下培养多能干细胞或多潜能干细胞一段足以获得肌肉细胞和具有脂肪细胞命运同时保持增殖表型的干细胞的时间。
如本文所用，“脂肪细胞命运”指“前脂肪细胞”指在其终末分化之前采取致力于脂肪生成命运的间充质干细胞。前脂肪细胞倾向于表达Sca-1、cd-90、cd29。前脂肪细胞也采用成纤维细胞形态，对BODIPY染色显示阳性反应，通常在细胞核周围。
如本文所用，“引发”指通过在低剂量(例如，低于100uM，例如，30-50uM、30-80uM、10-90uM)的FA(例如，油酸、棕榈酸)或其前体存在下培养以将细胞引导至脂肪细胞谱系来实现脂肪细胞命运。
在存在低水平脂肪酸的情况下，即低于100uM，例如，30-50uM、30-80uM、10-90uM，细胞将获得肌肉表型，如图9b所见。然而，增加水平，即，100uM或以上，将驱使细胞向脂肪细胞转变。
‘引发’步骤：引发步骤包括在低剂量的不同脂肪酸存在下调节(例如，禽)干细胞生长。在该方法中，本发明人以不超过低于100uM(例如，10-100uM或10-50uM)的最终浓度向细胞培养基中添加特定或若干脂肪酸。
分化步骤：引发细胞进行脂肪生成分化，然后是终末分化。分化细胞包括升高FA水平例如，100uM或100uM以上，例如，至500uM，例如，长达14天，例如，1-7天、1-10天、5-10天。
根据具体实施方式，多潜能干细胞为成体干细胞。
根据具体实施方式，成体干细胞为中胚层的。
根据具体实施方式，中胚层干细胞为间充质干细胞。
根据具体实施方式，引发和/或分化在悬浮液中实现。
根据具体实施方式，用于引发的培养持续2-5周的时间。
根据具体实施方式，如上所述，多潜能干细胞已通过多能干细胞的离体成熟而获得。
根据具体实施方式，离体成熟在不存在生长因子的悬浮液中实现。
根据具体实施方式，所述多能干细胞和/或多潜能干细胞任选处于30-500μm的聚集状态。
当细胞被引发时，它们可以经受终末分化。
因此，提供了一种细胞分化的方法，该方法包括在高于100μM的浓度的脂肪酸存在下培养具有脂肪细胞命运同时保持增殖表型的干细胞一段足以允许分化为脂肪细胞的时间。
组合时的引发和分化方案可导致形成包含脂肪细胞和肌肉细胞的微组织。根据每个步骤的长度，可以根据肌肉和脂肪细胞之间的相对比例来控制组成。如果该过程在引发步骤终止，则组合物将更像肌肉。
根据具体实施方式，任何聚集体或微组织表现出示天然肉制品的感官特性。
如本文所用，术语“感官特性”指消费者通过包括味道、质地、视觉、嗅觉或触觉在内的感官体验到的食物的方面。
例如，脂肪细胞可用于在烹饪或烤制时赋予非肉食物以肉味和/或质地(例如，牛肉或鸡肉)。
肌肉细胞或心肌细胞可用于赋予非肉食物以肉的质地以及肉的味道(例如，苦味/金属味)。
红细胞可以赋予非肉食物烤肉(例如，牛肉或鸡肉)味道以及肉色(例如，牛肉)。
肝细胞可以赋予非肉食物肉色(例如，牛肉)以及丰富肉的味道。
术语“肉”意在包括作为食品食用的任何动物肉(例如，牛肉、猪肉、家禽肉、鱼肉以及下文提供的其他实例)。
在这种情况下，感官特性是肉类的感官特性。例如，当提及味道时，感官特性可能是微味。
如本文所用，“营养特性”是指对饲喂其的受试者有价值的肉的成分。
例如，肌肉组织的蛋白质含量非常高，包含所有必需氨基酸，并且在大多数情况下是锌、维生素B12、硒、磷、烟酸、维生素B6、胆碱、核黄素和铁的良好来源。几种肉的维生素K含量也很高。肌肉组织的碳水化合物含量非常低，不含膳食纤维。蛋白质、维生素和矿物质几乎可以从任何肉类来源获得，并且通常是一致的。
根据动物的种类和品种、饲养动物的方式(包括饲喂内容)、身体的解剖学部位以及屠宰和烹饪方法，肉的脂肪含量可能会有很大差异。野生动物诸如鹿通常比农场动物瘦，导致那些关心脂肪含量的人选择野味诸如鹿肉。肉类中与肌肉纤维一起存在的脂肪沉积物在烹饪时会软化肉类，并通过热量引发的化学变化来改善风味，使蛋白质和脂肪分子相互作用。当和肉一起烹饪时，脂肪也会使肉变得更加多汁。然而，脂肪的营养贡献主要是卡路里，而不是蛋白质。随着脂肪含量的增加，肉对营养的贡献下降。此外，肉周围还存在与脂肪相关的胆固醇。胆固醇是一种与肉中发现的饱和脂肪相关的脂质。
下表A比较了几种肉的营养含量(每110gr)。虽然每种肉的蛋白质和碳水化合物含量大致相同，但是脂肪含量的范围很广。
表A
其他主要营养成分及其来源如下：
维生素B12，主要存在于鱼、肉、家禽和乳制品中。
维生素D，存在于油性鱼、蛋和乳制品中。
二十二碳六烯酸(DHA)，是在脂肪鱼中发现的一种必需Ω-3脂肪。
血红素铁，主要存在于肉类尤其红肉中。
锌，主要存在于动物蛋白质来源中，诸如牛肉、猪肉和羊肉。
因此，营养特性的改善/增强可以是蛋白质、卡路里、脂肪、维生素、矿物质中的任何一种，例如本文所列出的。
如本文所用的“增强”、“增加”、“增大”指与没有聚集体或微组织或其中一部分已被等量聚集体或微组织取代的相同食品相比，增加至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％(例如，按重量计或按评分计)的感官或营养特性。
因此，提供了包含如本文所述的微组织或聚集体的食品(也称为“食品(foodstuff)”)。食品可以包括肉和/或非肉部分。
另外或可选地，提供了一种生产食品的方法，该方法包括将如本文所述的微组织或聚集体与供人类食用的可食用组合物诸如肉和/或非肉部分组合。
根据具体实施方式，非肉类为植物来源的物质。
根据具体实施方式，非肉类为非植物来源物质(例如，矿物质、合成物质)。
根据具体实施方式，非肉类选自由植物来源的物质和非植物来源的物质组成的组。
根据具体实施方式，食品是素食食品。
根据具体实施方式，食品是纯素食品。
根据具体实施方式，食品包括肉替代品或通常作为肉替代品(基于植物的)食用。
根据具体实施方式，混合食品不含体液，例如，唾液、血清、血浆、粘液、尿液、粪便、泪液、乳汁等。
术语“食品”在下文中指任何具有食物价值的物质。该术语还指在加工之前、加工过程中和加工之后的食物原料、食品或其部分(例如，可食用物品诸如炸肉排的外皮)、副产品和最终产品(例如，香肠、碎肉、炸肉排等)。在本发明中，提供了三类食品：植物来源的食品及其物质、聚集体和微组织、和食品。
根据本发明的实施方式，食品是将由人类或非人类受试者消耗的最终制品(产品)，或在制备食品的过程中由食品工业消耗的聚集体和微组织。
肉类替代品的实例：根据本发明的一些实施方式预期的天然、传统和商业制造的：
Alpro和Provamel，通常以其植物奶系列而闻名，也提供不同的素食肉类替代品
Beanfeast
超越肉类(Beyond Meat)
博卡汉堡
油炸鹰嘴豆饼(Falafel)，一种传统的中东炸豆饼，被认为是古代科普特人在大斋期间创造的肉替代品
牛舌菌，常见的蘑菇，被称为牛排菌
Ganmodoki，类似于素食汉堡的传统日本豆腐料理
Gardein
乔治素食汉堡(Gardenburger)
格拉摩根素香肠(Glamorgan sausage)
戈申食品(Goshen Alimentos)
Green Slice vegetarian，有机和不含大豆的热狗和熟食切片
不可能食品(Impossible Foods)
菠萝蜜，一种水果，煮熟后的质地类似于手撕猪肉
冻豆腐(Koya-dofu)，冻干的豆腐，其风味和质地与经制备时的肉类相似，在佛教素食中很常见
硫色绚孔菌(Laetiporus)，一种蘑菇，也被称为树林鸡
叶蛋白浓缩物
LightLife
Linda McCartney Foods
Lyophyllum decastes(扁叶落叶松)，蘑菇，被称为炸鸡蘑菇
肉增量剂
Meatless
闷斋鸭(Mock duck)
Morningstar Farms
Muscolo di grano(小麦的肌肉)，根据意大利食谱制备的小麦面筋(seitan)
烤坚果
Oncom
坡尼尔(Paneer)，例如Paneer tikka素肉等菜肴
Quorn
大豆蛋白
豆渣，用于素食汉堡和炸丸子
丹贝(Tempeh)
植物组织蛋白
豆腐，其在亚洲传统上不被视为肉类替代品，但在西半球已广泛用于此目的
豆腐火鸡(Tofurkey)
豆腐火鸡(Tofurky)
Turtle Island Foods
素培根
素热狗
素汉堡
蔬菜鸡肉饼
素鸡肉饼，黏面包粉的(炸肉排)
素鸡法兰克福香肠(热狗)
Viana，是德国最大的纯素食食品制造商之一，提供各种素食汉堡、炸丸子、香肠、切碎的模拟肉，上至veganvegan gyros和三明治的熟食片(deli slices)
小麦面筋
以上任何实例都是独立的实施方式，不一定与特定的供应商相关联。
应当理解的是，食品是指食物或饲料(动物喂饲)。
生产食品的方法可以包括发酵胀起、揉、挤、模制、成形、烹饪、炖、煮、烤、烘焙、煎炸及其任何组合中的任一种。
还提供了向有需要的受试者提供营养的方法。该方法包括向受试者提供如本文所述的食品。
根据具体实施方式，受试者处于营养缺乏的风险中。
根据具体实施方式，受试者为健康受试者(例如，不患有与营养/吸收相关的疾病)。
应理解，根据具体实施方式，所指示的数值在作为非人多能干细胞的类型和发育阶段的细胞生长的最佳条件下提供。
如本文所用，术语“约”指±10％。
术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”及其词形变化意指“包括但不限于”。
术语“由……组成”是指“包括并限于”。
术语“基本上由……组成”是指所述组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但前提是所述另外的成分、步骤和/或部分不会实质性地改变所要求保护组合物、方法或结构的基础和新颖特征。
如本文所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数引用，除非上下文另有明确指示。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
在整个该申请中，可以以范围格式展示本发明的各种实施方式。应该理解，范围格式的描述仅出于方便和简洁，而不应该解释为为本发明的范围的不可变的限制。因此，范围的描述应该被认为具有具体公开的所有可能子范围以及所述范围内的各个数字值。例如，对范围诸如从1到6的描述应视为已明确公开了子范围诸如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等等，以及所述范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。这适用于任何宽度的范围。
每当在本文中指示数字范围时，其意图包括在指示范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语“第一指示数字与第二指示数字之间的范围”和“从第一指示数字至第二指示数字的范围”在本文中互换地使用，并且意在包括第一与第二指示数字以及其之间的所有分数和整数数字。
如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知或者容易地由从已知的方式、手段、技术和程序开发出的那些方式、手段、技术和步骤。
应当理解，为清楚起见，在多个分开的实施方式的上下文中所描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中经组合而提供。相反地，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中所描述的本发明的各种特征，也可以分开地或以任何合适的子组合或在本发明的任何其他所述的实施方式中被合适地提供。在各种实施方式的上下文中所描述的某些特征不应被认为是那些实施方式的必要特征，除非所述实施方式在没有那些要素的情况下不起作用。
如上文所描述的和以下权利要求书部分中所要求保护的本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中得到实验支持。
实施例
现在参考以下实施例，这些实施例与以上描述一起以非限制性方式示出了本发明的一些实施方式。
一般而言，本文所使用的命名和本发明所利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有详细的解释。参见，例如，"MolecularCloning:A laboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols inMolecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific AmericanBooks,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory ManualSeries",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所阐述的方法；"CellBiology:ALaboratory Handbook",Volumes I-IIICellis,J.E.,ed.(1994)；"Culture ofAnimal Cells-A Manual of Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-IIIColigan J.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Selected Methods inCellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；可用的免疫测定法在专利和科学文献中有广泛描述，参见，例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,andHiggins S.J.,eds.(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.,and HigginsS.J.,eds.(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"ImmobilizedCells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)和"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press；"PCRProtocols:AGuide To Methods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak et al.,"Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；所有这些内容均通过引用并入本文，如同在本文中充分阐述。本文件中提供了其他通用参考文献。其中的程序被认为是本领域公知的，并且是为了读者的方便而提供的。包含在其中的所有信息通过引用并入本文。
材料和方法
鸡胚胎干细胞(cESC)分离：
根据先前发表的方案，从新产鸡(原鸡)蛋中分离cESC(26)。简言之：将经过消毒的受精卵壳小心去除，以分离卵黄。将卵黄置于1500mm培养皿中，胚胎直接向上放置。将无菌3M纸的小穿孔环直接放在胚胎上，以便将其解剖出来。将采集的胚胎浸入冷的PBS中，注意垂直于液体表面进入环，以防止胚胎自身脱离。轻轻摇动胚胎，去除多余的卵黄。将清洁的胚胎置于含有ES培养基的新鲜培养皿中(见下文)。将采集的胚胎接种在6孔板的孔中，每孔涂有明胶和MEF-2胚胎。胚胎在39℃、10％ CO2下孵育。培养基每24小时更新一次。卵处于X阶段(第0天)。
ES培养基组成：DMEM/F-12、10％胎牛血清、1X MEM非必需氨基酸浓缩物、1mM丙酮酸钠、10U/1U青霉素/链霉素、2mM谷氨酰胺、15umβ-巯基乙醇、5ng/ml IGF1、1ng/ml SCF、1ng/ml IL6、1ng/ml sIL6 Rα、20ng/mL(1000U/ml)hLIF。
适应在悬浮液中生长和放大。
cESC对悬浮液中生长的适应包括在明胶包被板上接种的MEFS上或通过在明胶包被板上直接接种细胞进行干细胞增殖。在2-3次传代后，逐渐去除的饲养层(当存在时)。在建立cESC的无饲养细胞的群之后，将细胞转移至未处理的培养板中，并置于75RPM的轨道摇床上。数次传代后，聚集体(30-90次传代之间)细胞每天发生机械破坏，开始形成松散的聚集体，每个聚集体10-5000个细胞，大小在30-300微米之间。然后将聚集体转移至补充有50ml ES培养基的125ml烧瓶中。几次传代(3-5)后，将细胞转移至更大的烧瓶(上至2L)中，并使浓度达到2-6X106/ml。接下来，在搅拌生物反应器环境中检测几个克隆，以获得具有高增殖速率的细胞系，同时保持聚集体的完整性和干细胞特性。几次传代后，选定的克隆表现出所需的形态、分化潜能，并且达到每周期8-12小时的倍增时间。此时(图19的步骤7之后)，将细胞准备通过Sartorius、Eppendorf、Solaris、ThermoFisher、New Brunswickm、或Applikon接种到具有无因子培养基的搅拌生物反应器(AMBR 250和Biostat A/B/B-DCU(分别为2L、5L/10L)中，允许细胞形成微组织，并在灌注条件下在无因子培养基中达到约1亿-3亿个细胞/ml的群体密度。无因子培养基组成：DMEM 10％胎牛血清、10U/1U，青霉素/链霉素、2mM谷氨酰胺
牛ESC(bESC)分离、适应悬浮液和分化：
牛ESC分离(根据Bogliotti et al 2018)：
将受精牛胚胎置于12孔板中的饲养层(γ辐照的MEFS)上，并在补充有20ng/mlFGF2和2.5uM IWR1的CTFR-bESC培养基(定制mTESR*)中粘附和繁殖。使用TrypLE(12563011；Gibco)每48hr传代一次细胞，并在存在10uM rho-激酶抑制剂Y-27632的情况下重新铺在MEFS上。5次传代后，Y-27632的使用被耗尽。在此阶段，在MEF依赖的bESC的细胞库中冷冻保存细胞。对悬浮生长的适应如下进行：将MEF依赖的bESC转移至无MEF-6孔板中，培养基为补充有20ng/ml FGF2和2.5uM IWR1的CTFR-bESC或mTESR培养基，添加或不添加Y-27632。将细胞板置于摇床培养箱中，轻轻搅拌(75RPM)，37C/5％CO2。每24hr手动轻轻移液一次细胞，以抑制其粘附于孔表面。3-5次传代后，将细胞转移至摇床培养箱中的10mM平板中，轻轻搅拌(75RPM)，37C/5％CO2，持续14天。每48hr补充一次培养基。14天后，将细胞转移至125ml摇瓶中，总体积为30ml的mTESR，补充有20ng/ml FGF2和2.5uM IWR1。将适应这些条件的细胞在悬浮液适应的bESC的细胞库中冷冻保存。通过每48hr补充一次培养基进行聚集体选择，将30-500um聚集体留在烧瓶中。大量和分化群步骤的扩增如下进行：在长达14天的烧瓶体积逐渐增加(2L烧瓶中上至0.5L)后将细胞转移至生物反应器中成熟。在监测搅拌生物反应器中无因子培养基(DMEM(HG)/10-20％FBS、10U/1U，青霉素/链霉素、2mM谷氨酰胺中，在悬浮液中扩增bESC。肌肉分化：在添加5-50uM OA/LA——补充或不补充FGF2/50uM氢化可的松/5％马血清/Gsk抑制剂CHIR99021——的大型生物反应器中的细胞生长(参见brown et al.2014、Adhikari et al.,2019、lian et al 2013)持续7-21天，之后收获。脂肪分化：在添加200-400um OA/LA的大型生物反应器中的细胞生长持续4-7天，之后收获。
猪ESC分离(根据Burrell et al.,2019):
将受精猪胚胎置于12孔板中的饲养层(γ辐照的MEFS)上，并在N2B27-3i培养基(1:1比率的N2B27/F12/神经基础培养基(21103049；Gibco)、0.5X N2(17502048；ThermoFisher)、0.5XB27(17504044；Thermo Fisher)、1,000U/mL人白血病抑制因子(hLIF,L5283；Sigma)]、3i混合物[30mM CHIR99021(GSK3抑制)、40mM PD0325901(MEK抑制剂)、10mMPD173074(FGFR3抑制剂)]、0.5X GlutaMAX(35050-061；Gibco)补充有0.1mM b-巯基乙醇(M3148；Sigma)、1X MEM非必需氨基酸(MEM NEAA,11140050；Gibco)、0.01％牛血清白蛋白(BSA)(A7906；Sigma)中粘附和繁殖。使用TrypLE(12563011；Gibco)每48hr传代一次细胞，并在存在10uM rho-激酶抑制剂Y-27632的情况下重新铺在MEFS上，5次传代后Y-27632的使用被耗尽(其他因子包括在mTESR培养基中)。
在此阶段，在MEF依赖的fESC的细胞库中冷冻保存细胞。pESC对悬浮生长的适应如 下进行：。将MEF依赖的pESC转移至无MEF-6孔板中，培养基为mTESR培养基((85850；STEMCELL Technologies)，添加或不添加Y-27632。将板置于摇床培养箱中，轻轻搅拌(75RPM)，37C/5％CO2。每24hr手动轻轻移液一次细胞，以抑制其粘附于孔表面。3-5次传代后，将细胞转移至摇床培养箱中的10mM平板中，轻轻搅拌(75RPM)，37C/5％CO2，持续14天。每48hr补充一次培养基。14天后，将细胞转移至总体积为30ml的mTESR的125ml摇瓶中。将适应这些条件的细胞在悬浮液适应的bESC的细胞库中冷冻保存。通过每48hr补充一次培养基来对聚集体生长进行选择，将大聚集体留在烧瓶中。
大量pESC和分化群的扩增如下进行：长达14天的烧瓶体积逐渐增加(2L烧瓶中上至0.5L)后将细胞转移至生物反应器中成熟。在搅拌生物反应器中无因子培养基(DMEM(HG)/10-20％ FBS、10U/1U，青霉素/链霉素、2mM谷氨酰胺中，在悬浮液中扩增pESC。肌肉分化：在添加5-50uM OA/LA——补充或不补充FGF2/50uM氢化可的松/5％马血清——的大型生物反应器中的细胞生长(参见brown et al.2014、Adhikari et al.,2019)持续7-14天，之后收获。脂肪分化：在添加200-400um OA/LA的大型生物反应器中的细胞生长持续4-7天，之后收获。
鲨鱼、金枪鱼、鲑鱼、鲱鱼、沙丁鱼ESC分离(根据Hongetal.,1996)：在体外，在6-8hr后收集受精胚胎(囊胚)并胰蛋白酶化成单细胞悬浮液。将细胞悬液置于明胶包被的6孔培养皿中ESM培养基(DMEM(HG)，补充有20mg HEPES(pH 7.4)、10U/1U，青霉素/链霉素、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、2nM亚硒酸钠、1mM非必需氨基酸、50pM 2-巯基乙醇、10ng/mlbFGF、10ng/ml人重组LIF、15％胎牛血清和来自鳟鱼的鱼血清(FS，1％)中。允许细胞每48-72hr进行一次增殖和传代。在此阶段，细胞用于生成fESC的细胞库。对悬浮生长的适应如下 进行：将fESC转移至无包被的6孔板中ESM1培养基——添加或不添加Y-27632——中(mTESR已包括制造商报告的其他因子)。将细胞板置于摇床培养箱中，轻轻搅拌(75RPM)，37C/5％CO2。每24hr手动轻轻移液一次细胞，以抑制其粘附于孔表面。3-5次传代后，将细胞转移至摇床培养箱中的10mM平板中，轻轻搅拌(75RPM)，37C/5％CO2，持续14天。每48hr补充一次培养基。14天后，将细胞转移至总体积为30ml的mTESR的125ml摇瓶中。将适应悬浮生长的细胞在悬浮液适应的fESC的细胞库中冷冻保存。
通过每48hr补充一次培养基来对聚集体进行选择，将大聚集体留在烧瓶中，如上所述。大量和分化群的扩增如下进行：长达14天的烧瓶体积逐渐增加(2L烧瓶中上至0.5L)后将细胞在生物反应器中制备至成熟。fESC的扩增发生在搅拌生物反应器中，无因子(DMEM(HG)/10-20％ FBS、10U/1U，青霉素/链霉素、2mM谷氨酰胺。肌肉分化：在添加5-50uM OA/LA——补充或不补充FGF2/50uM氢化可的松/5％马血清——的大型生物反应器中的细胞生长(参见brown et al.2014、Adhikari et al.,2019)持续7-14天，之后收获。脂肪分化：在添加200-400um OA/LA的大型生物反应器中的细胞生长持续4-7天，之后收获。
标记物表达的检测
将聚集体收集至15ml小瓶中，并通过离心(800G/5min)沉淀。沉淀后，用PBS X1洗细胞两次。将细胞在4％ PFA中固定20min并在PBS X1中洗两次。固定后，细胞膜在PBSX1/0.01％ TritonX-100中渗透15min。通过在pbsX1/5％山羊血清中温育细胞1h进行表位阻断。将阻断抗体(Abs)加入细胞和样品中，在4C中温育o/n并缓慢摇动。将AB从细胞中洗两次，并添加二级荧光AB。将细胞与二级AB一起温育2hr并洗三次，之后进行显微镜观察。
使用中的AB：
端粒酶活性测定
根据制造商方案，使用端粒酶检测试剂盒(S7700Merck)在聚集体中检测端粒酶活性。简言之：将聚集体分离并悬浮在Chaps裂解缓冲液中。将裂解物添加至TS(端粒酶底物)主混合物中，并在37℃下温育30min。在下一步中，使用针对特定因子的试剂盒将样品进行PCR扩增。通过PCR产物的凝胶电泳检测端粒酶活性，其中加热的样品(95℃)用作阴性对照。试剂盒提供阳性对照样品(abcam#ab83369)。
碱性磷酸酶测定
根据制造商方案，使用碱性磷酸酶检测试剂盒(abcam#ab83369)进行聚集体中碱性磷酸酶的检测。通过HyLabs提取聚集体的RNA，并由魏兹曼研究所进行RNA测序。
RNA测序(RNA Seq.)
使用外包服务(Hylabs)，测序INCPM mRNA-seq，从细胞团块中提取RNA。简言之，将总RNA片段化，随后进行逆转录和第二链cDNA合成。对双链cDNA进行末端修复、碱基添加、接头连接和PCR扩增以创建文库。通过Qubit和TapeStation评估文库。用条形码构建了测序文库，以允许在Illumina NextSeq高输出75个周期的半泳道上多路复用12个样品，导致每个样品约2000万个单端82-bp读取。生物信息学：使用cutadapt从读取中修剪Poly-A/T拉伸和Illumina接头，结果丢弃小于30bp的读取。使用STAR将读取映射至G.gallus参考基因组GRCg6a，提供从Ensembl下载的基因注释(并将端到端选项和utFilterMismatchNoverLmax设置为0.04)。使用上述gtf，使用htseq-count定量每个基因的表达水平。使用DESeq2，betaPrior、cooksCutoff和independentFiltering参数设置为False来鉴别差异表达基因。使用Benjamini和Hochberg程序调整原始P值以进行多重检测。使用snakemake运行管道。
在无因子条件下的扩增(图19步骤8b的一般描述)
为了将多能聚集体扩增和成熟为具有肉类生产所需特性的微组织，将聚集体转移至搅拌生物反应器环境中的无因子培养基。在这些条件下，形成的微组织降低了多能标记物(OCT4、Nanog、Lin28)的表达，同时积累了胶原蛋白家族成员(Col9a2、Col9、Col2a)和ECM因子(HSPG、CSPG、层粘连蛋白)的表达。为了生产培养的鸡原料，收获细胞，离心并用PBS洗3次。然后将微组织储存在-20C直至使用。
微组织分化为脂肪积累细胞(图19步骤9a的一般描述)
为了通过诱导甘油三酯合成和脂滴积累实现脂肪细胞分化，对微组织细胞进行油酸处理。将油酸溶于70％乙醇或与无脂肪酸的BSA结合。将溶解或结合的油酸添加至无因子培养基中，使最终浓度高于100uM上至500μM(优选315μM)。收获前用血清培养微组织3-6天。
微组织分化为肌肉细胞(图19步骤9b的一般描述)
对于肌肉细胞分化，将微组织在20-50μM油酸/亚油酸(或两者的组合)存在下生长至少14天的时间。培养基每72-96hr更新一次。
微组织适应无血清培养基(图19步骤7-9的一般描述)。
微组织适应无血清培养基中的生长是通过两种并行方法进行的：
直接选择：将聚集的细胞直接置于无血清培养基中，浓度为500K-1M个细胞/ml。每72hr补充一次培养基。每次补充培养基时，从培养物中取出单细胞。
逐渐适应：将聚集的细胞置于含有补充10％ FCS的DMEM的培养基中，并将10％血清培养基与无血清培养基以1:1的比例(例如，250ml血清/250ml无血清培养基)与无血清培养基以1:1的比例混合。在接下来的几周内，含血清培养基在培养7天后减少50％，直至达到完全脱离无血清培养基。7天后，混合物中的血清培养基部分每周减少一半(例如，125ml血清/375ml无血清)，本发明人逐渐减少一半血清培养基，直至细胞完全适应无血清培养基。
对于使用GRO-I/EX-CELL系统的实验，根据制造商说明制备培养基。在所有其他实验中，将裂解物以1gr/L的浓度溶解在培养基中。在所有实验中，培养基还补充有乙醇胺(20ng/L)、胰岛素(100ug/L)、硒(50ng/L)和转铁蛋白(55ug/L)。培养基还补充有1XMEMNEAA(Biological industries，01-340-1B)。
2mM L-丙氨酸/L-谷氨酰胺(Biological industries-03-022-1B)和1mM丙酮酸钠(Biological industries)。
使用不同的酵母/大豆裂解物组合来替代血清。这些实验中使用的裂解物为：
KERRY’s：Hypep 1510(ID:S-2048780,Item:U1-5X99023)、SHEFF-VAX PLUS ACF(ID S-2048778,U1-5X00484.K1G)、SHEFF-VAX PF ACF(ID:S-2048777,U1-5X01143.K1G)、SHEFF-VAX PLUS PF ACF VP(ID:S-2048776,U1-5X01090)。
DIFCO：DIFCO的精选大豆胨(#15ABP196)、Bacto的酵母提取物(#15ABP197)、BBL的植物蛋白胨(#15ABP195)、BBL酵母提取物(#15ABP202)、Bacto麦芽提取物(15ABP201)和Bacto TC酵母酸盐(#15ABP163)DIFCO的精选大豆胨(#15ABP196)、Bacto的酵母提取物(#15ABP197)、BBL的植物蛋白胨(#15ABP195)、BBL酵母提取物(#15ABP202)、Bacto麦芽提取物(15ABP201)和Bacto TC酵母酸盐(#15ABP163)
IRVINE Scientific(超滤大豆水解产物#IR-96857E；超滤酵母水解产物#IR-96863E)
脂肪酸组成
使用外包服务(HUJI)分析细胞的脂肪酸组成。
VOC分析-使用外包服务(HUJI)进行挥发性有机化合物分析
使用外包服务(Bactochem)进行营养价值分析
实施例1
cESC检索和扩增
目的是建立干细胞来源的细胞系，能够在全悬浮液中长期复制和生长，同时保持分化为不同细胞类型的能力，这些细胞类型将具有良好的感官和营养特性，以及支持各种工程相关属性——其支持大规模生产。由于胚胎干细胞(ESC)具有不确定的复制能力和线性可塑性，因此目的是根据已发表的分离方案建立一个源自鸡胚胎干细胞(cESC)的细胞系，以获得进行进一步选择、适应和分化过程的初始cESC。
基于2013年Aubel&Pain的方案，并具有一些修改，进行了cESC的分离。通过从新产鸡卵的X期胚盘中分离囊胚层来获得原代培养物。然后将胚胎细胞接种在饲养细胞上，并在干细胞支持培养基中于39℃的5％ CO2培养箱中培养10天，直至易于看到集落(图1a)。
通过机械解离对集落传代至少10次。仅进一步使用了显示细胞同一性和形态稳定性的克隆(图1b)。
实施例2
饲养细胞去除
成功分离cESC之后，将细胞逐渐从饲养层移位并生长几代以选择稳定的无饲养细胞克隆。值得注意的是，在饲养层脱落阶段之后，细胞倾向于形成由大有核细胞组成的不太紧密的干细胞集落，因为它们不受纤维细胞限制(图1c-e)。在此阶段，细胞表现出每周期约24小时的预期倍增时间。
实施例3
适应悬浮和放大条件
为了能够以允许将过程放大至食品工业所需水平的方式生长大量细胞，有必要建立能够在完全悬浮液中生长同时保持自我更新和分化能力的细胞系，以发展有利于食品生产的新特性。为此，将细胞逐渐适应在悬浮液中生长，而不是作为贴壁细胞。当ESC被移动到悬浮状态时，它们自然地形成胚胎体(embryonic body)(EB)，胚胎体随着它们的生长而变得更紧密，从而阻断营养物和信号从表面到内细胞层的流动，产生从球体外部到中心的变化梯度条件。这反过来又引起细胞分化并失去其增殖潜能。因此，目的是选择在完全悬浮液中生长时不会形成紧密EB的细胞(参见图2a中的EB)，并且仍将保留作为工艺基础的所需干细胞特征。为此，细胞逐渐从粘附表面移位，并施加轻微的摇动。同样，通过持续选择约2-3个月的时间，鼓励细胞下调不同的粘附分子同事表达其他，允许随时间形成3D松散的覆盆子样聚集体，并明确定义组成聚集体的每个细胞(图2F)。在此阶段，细胞变得非常稳定，倍增时间缩短至每周期18-20小时。
在细胞适应悬浮液中的生长后，本发明人旨在规定并优化支持在搅拌生物反应器环境中以可再现方式持续快速生长所需的生长条件，以确保细胞适合工业放大的能力。为此，在高速搅拌(200-400rpm尖端速度)下，在搅拌生物反应器中测试了几个克隆，以生成以聚集的细胞生长的细胞系，具有高增殖速率，同时保持聚集细胞的完整性和干细胞特性。在此优化工艺后，生产了几种具有所有良好特性的细胞系，这些细胞被命名为“SMCMC”。这些细胞表现出所需的形态、分化潜能，并且达到每周期10-12小时的倍增时间，一些生长条件显示每周期8小时。(图3)。
实施例4
聚集体细胞的表征-永生
根据四项既定标准测试了聚集体的自我更新能力(图19阶段7)。
A.多能标记物表达。使用特异性免疫荧光抗体染色以及其他主要多能标记物(诸如SSEA4、LIN28和ENS-1)测定典型干细胞因子(诸如NANOG、OCT4和TRA-I-60)的表达。发现除SSEA4外，聚集体的所有多能标记物均为阳性，证实所有多能干细胞共有的基本自我更新因子的存在(图4)。
B.碱性磷酸酶活性。发现碱性磷酸酶染色在聚集体中呈阳性，表明其增殖性质(图5a-b)。
C.还测试了具有每次细胞传代/稀释之后达到完全汇合的能力的长期传代(>60)。聚集体连续生长持续至少180次传代，并显示生长稳定性和标记物表达。
D.端粒酶活性。干细胞独特表达端粒酶基因，使其能够维持染色体完整性，因此，检测端粒酶活性也被认为是自我更新能力的关键标准。使用TRAPeze端粒酶检测试剂盒，聚集体显示端粒酶活性(图5c)。
实施例5
聚集体细胞稳定性的表征
干细胞自然激活许多自我更新途径，如果缺乏适当的环境(通过阳性信号传导或阻断分化诱导刺激)，可能会无限期地生长。聚集细胞表现出多能细胞的关键特征，将其标记为具有自然不朽和自我更新能力的稳定干细胞系。然而，由于这些细胞被建立以提供用于食品生产的大量产量，本发明人试图验证这些细胞在建立过程中的某一点没有被转化。
为了解决这一问题，进行了RNA seq分析，以比较聚集体与早期贴壁的cESC系的转录谱，重点关注关键细胞周期和代谢基因。比较详细分析显示，与RNA合成和加工、蛋白质翻译、结合和活性相关的基因无变化，所有关键代谢和细胞周期过程均相对不变。此外，与早期干细胞系相比，未观察到端粒酶活性的差异，也未观察到DNA修复机制的差异。还分析了经典癌基因诸如MYC、AKT、EGFR、ELK、KRAS和CDX2的表达水平，显示表达水平无变化，有些甚至在聚集体中下调。还分析了肿瘤抑制基因的表达水平。基因诸如p53、APC、BRCA、MSH2和WT1在两个细胞组之间的表达水平相似(图6)。当观察侵袭行为时，观察到细胞运动和迁移相关基因表达水平降低。
总体而言，现有数据表明，通过激活干细胞调节的基因通路进行自我更新使聚集体自然永生化，并且没有明显的致癌转化证据。
实施例6
聚集体细胞系的分化能力
最后，为了确认聚集体保留了分化为不同细胞类型的能力，可能对食品工业具有价值，对几种旨在产生中胚层谱系细胞的分化方案进行了测试。
为了测试聚集体合成和储存脂肪的能力，给细胞补充脂肪细胞分化培养基长达4天。细胞形态的快速变化早在培养基组成变化后12小时检测到，因为细胞逐渐开始以增强的方式积累脂肪滴(图7A)。BODIPY染色也证实了分化聚集体内存在脂肪滴(图7B)。
还测试了形成成纤维细胞的聚集体能力，因为成纤维细胞能够分泌结缔组织的不同蛋白。使用具有成纤维细胞支持因子的分化培养基进行聚集体分化为成纤维细胞。给细胞补充成纤维细胞培养基72小时，然后添加基础生长培养基。在接下来的48小时内观察到典型的上皮形态(图8)。细胞可保持30次以上传代并保持其形态。也可以冷冻和解冻成纤维细胞，具有维持成纤维细胞表型的能力。
最后，还测试了聚集体分化为肌肉细胞的能力。将聚集体在肌肉分化培养基中生长72小时，然后将细胞转移至补充有基础生长培养基的非搅拌环境中。在接下来的3至8天内，观察到聚集体松散地粘附在板上，大小和节律收缩增加。肌肉分化和收缩也可在完全浮动的聚集体中实现(图9)，支持这些细胞对肉类生产可扩展过程的贡献。
实施例7
生产工艺
(参见图19作为示例但不限于禽干细胞)
在成功分离和建立了可大量扩增和生长并显示有利于食品生产的特性的鸡干细胞衍生系之后，本发明人创建了细胞库以提供生产工艺的第一阶段，明确的、未改变的种子培养。下一个挑战是使用聚集体平台在可扩展工艺中生产具有鸡肉风味的原料。
针对该任务，进行了仔细的培养基定制、机械工艺开发和常规的感官测试。
种子培养扩展阶段
生产工艺的第一步将包括从细胞库解冻新批次的聚集体。然后将这些细胞迅速扩增至适当的浓度，以供应生产的下游生物反应器，在那里，聚集体将转化为微组织，并继续增殖和改变其特性，以满足食品工业需要。
微组织形成阶段
为了达到所需的鸡肉风味，必须有几个属性。这些包括脂肪数量和组成、不同蛋白质的表达和特定糖的存在。通过操作经过仔细品尝和化学分析的成熟培养基，本发明人成功地开发了获得具有增强的味美的鸡肉风味的完全悬浮液中生长的微组织的方法。成熟培养基不含添加的生长因子，导致细胞失去关键的多能标记物，同时获得中胚层特性，包括特异性标记物和结缔组织蛋白表达增加。由于它们的早期同一性和在生物反应器中的特定培养条件，这些微组织仍然能够快速和广泛增殖，并至少扩增150个群体倍增。
通过生物反应器运行参数的规定设定值进行这些特性的控制，例如在生物反应器内搅拌，并以0.25-1.70m/sec的尖端速度0.85m/sec的最佳尖端速度进行充气。
实施例8
适应聚集体和微组织在无血清培养基中生长
微组织在无血清培养基中生长
培养肉生产中的关键挑战与用于培养细胞的培养基有关。组织培养基最初设计用于其他目的(例如研究、制药、临床生产等)，因此从培养肉生产的角度考虑，需要注意几个问题。培养基的成本通常是培养肉生产的最大经济负担。此外，大多数可用培养基含有胎牛(或其他动物来源)血清(FCS)。FCS的使用存在未定义的固有缺陷(就化学成分而言)，批次之间差异很大。此外，在培养肉生产中使用此类材料很可能会因其生产方式有问题而疏远公众的接受。为了克服这些障碍，本发明人着手使聚集体和微组织适应在无血清培养基中生长，而不损害微组织的质量、安全性和独特特征。为了实现这一点，微组织适应在无血清培养基中生长。作为初始阶段，本发明人使微组织适应SIGMA-Merck生产的市售无血清系统GRO-I/EX-CELL。该系统基于在基础培养基(GRO-I)中的细胞生长，补充化学定义的酵母/植物水解产物(EX-CELL)作为FCS的替代剂。适应过程通过从培养基中完全降低血清或通过血清浓度随时间逐渐耗尽(作为生物反应器(7b)中接种的初始阶段)或直接在搅拌生物反应器中接种细胞时进行(图19，阶段8B)。在这两种情况下，细胞(聚集体或微组织)均能够适应无血清培养基(在烧瓶和生物反应器中)中的生长。约14天，细胞适应新培养基，恢复最初的12小时倍增时间，并保持高水平的细胞活力(图10)。以类似的方式，本发明人还能够使细胞适应在补充有酵母、植物蛋白胨和水解产物的基础培养基的其它组合中生长。在成功用于使细胞适应无血清培养基的混合中，本发明人可鉴别：补充有Ex-Cell裂解物的DMEM(高葡萄糖)、补充有Ex-Cell裂解物的DMEM/F12、补充有Ex-Cell裂解物的DMEM(低葡萄糖)、补充有KERRY集团生产的大豆和酵母裂解物组合的DMEM(高葡萄糖)。在该过程中成功测试的裂解物为这四种产品的全部或部分组合：Hypep 1510(ID:S-2048780,项目：U1-5X99023)、SHEFF-VAX PLUS ACF(ID S-2048778,U1-5X00484.K1G)、SHEFF-VAX PF ACF(ID:S-2048777,U1-5X01143.K1G)、SHEFF-VAX PLUS PF ACF VP(ID:S-2048776,U1-5X01090)。本发明人还成功地使微组织适应常规使用的基础培养基(DMEM HG/LG、DMEM/F12、RPMI 1640)与FUJIFILM-IRVINE Scientific生产的大豆和酵母裂解物(超滤大豆水解产物#IR-96857E；超滤酵母水解产物#IR-96863E)的组合。此外，细胞也适应在补充有不同组合的DIFCO的精选大豆胨(#15ABP196)、Bacto的酵母提取物(#15ABP197)、BBL的植物蛋白胨(#15ABP195)、BBL的酵母提取物(#15ABP202)、Bacto麦芽提取物(15ABP201)和Bacto TC酵母酸盐(#15ABP163)的基础培养基(DMEM HG/LG、DMEM/F12、RPMI 1640)中生长。为了在后工艺目的，将酵母源裂解物与一种或几种植物源裂解物组合。在所有实验中，培养基还补充有乙醇胺(20ng/L)、胰岛素(100ug/L)、硒(50ng/L)和转铁蛋白(55ug/L)。培养基还补充有1XMEMNEAA(Biological industries，01-340-1B)、2mM L-丙氨酸/L-谷氨酰胺(Biologicalindustries-03-022-1B)和1mM丙酮酸钠(Biological industries)。本文呈现的结果强调了微组织适应多种组合的能力，这些组合基于补充有作为培养的培养基中血清替代品的大豆和植物水解产物的基础培养基。
实施例9
微组织的分子表征
在微组织形成阶段(图19的8b)，细胞失去了一些多能标记物，诸如NANOG、OCT4、LIN28，但不是SSEA3(图11)，并获得了一些中胚层特性诸如脂肪储存和细胞外基质蛋白(ECM)的分泌，这些蛋白围绕着每个聚集体并形成创建微组织一个特定的生态位。这些ECM蛋白还有助于微组织发展其增强的鸡肉风味和在一起烹饪时形成团块的能力。
源自微组织细胞的微组织表现出不同的中胚层特征。这些包括结构蛋白如纤维连接蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白，它们构成ECM并在组织发育期间组织细胞。此外，细胞表达SNAI1，这是胚胎中胚层形成和维持的主要调节因子。最后，细胞具有合成和储存甘油三酯的能力。分子功能分析和KEGG分析也显示微组织富集Wnt典型和非典型相关因子。如基因表达分析所表明的，Wnt信号传导与间充质细胞同一性的获得紧密相连。
细胞培养重建肉类消费体验的能力中的一个重要因素依赖于某些分子的表达，这些分子对这些细胞的质地和味道有显著贡献。对这些方面的主要贡献来自锚定在细胞膜上或由细胞分泌的ECM分子的存在。事实上，不同肌肉组织的纹理之间的大部分变化是其纤维中胶原蛋白含量的直接结果(32)。胶原蛋白超家族由28个成员组成，具有许多衍生物。胶原蛋白附着在原纤维上，并通过与其他ECM和功能因子的相互作用提供机械支持以及多种生物活性。值得注意的是，在RNA-seq分析中，确定了胶原蛋白家族成员和胶原相关蛋白诸如Col2A、Col8A2和Col9A2的上调。此外，RNA seq分析显示额外ECM和细胞粘附分子显著富集。这一发现具有特殊意义，因为胶原蛋白和蛋白多糖相互作用，诸如HSPG、CSPG和层粘连蛋白，所有这些都在微组织中上调，是细胞基质组织、结构和功能的基础。
为了证实关键ECM因子的表达，进行了ECM相关抗体特异性筛选。筛选结果证实了微组织中不同胶原蛋白和其他ECM分子的富集(图11举例说明图19的步骤8b)。
实施例10
微组织分化以增强脂肪和肌肉细胞
为了控制最终肉制品的精确参数，下一步是开发一种工艺，允许指导和调整分化为脂肪、肌肉或结缔组织的百分比。为此目的，开发了一种工艺，包括用不同浓度的不同脂肪酸组合培养几种细胞系。
处理包括用补充有20um-300um的油酸(OA)或亚油酸(LA)和两者的组合的分化培养基培养细胞。研究结果显示，脂肪酸(FA)浓度低于50uM时长时间生长可以使细胞增殖。在低浓度脂肪酸(FA)中培养微组织导致微组织在96小时内以高度可重复的方式形成可区分的突起(图12A-E)。进一步分析显示，肌肉分化的开始发生在早至将其导入FA后4-7天，在使用MyHC抗体通过免疫染色出现突起之前(图12A-E)。成熟之后，经历引发的细胞早至4-7天开始表达肌肉分化的早期标志物，然而，由于细胞仍在增殖，该阶段可延长至数周，例如，3周。图12A-E和13A-B取自阶段9b，显示从添加GF开始的肌肉分化开始。因此，当该阶段延长时，更多的肌肉细胞为证据(图14A-C)或添加更高浓度的FA用于增强脂肪积累。MyHC染色，图12A-E，显示肌肉分化。为了证实微组织突起顶部存在肌肉祖细胞，本发明人还使用针对肌肉祖细胞标记物Pax7和L4的AB对细胞进行染色。在这两种情况下，突起内的细胞均呈阳性染色(图13A-B)。在低剂量FA存在下培养的微组织的进一步染色能够证实微组织顶部同时仍处于悬浮生长条件下的肌肉成熟(MyHC染色，图14A-C)。值得注意的是，通过记录微组织的同步收缩(在存在FA的情况下生长14天)，证明微组织顶部存在成熟收缩肌肉(数据未显示)。此外，通过悬浮液和贴壁条件下的肌钙蛋白-T染色测定微组织内的肌肉祖细胞最终分化为成熟肌肉的能力(图15A-B)。
同时在微组织的不同位置出现肌肉祖细胞位点。50-200uM的FA浓度允许微组织内储存脂肪，不包括发生肌肉分化的区域。在较高量的FA(>200uM)中培养细胞将导致微组织整体和终末分化为脂肪积聚组织，并最终使培养物陷入增殖停滞。
本发明人发现，用低剂量的油酸或亚油酸或组合进行长期处理不仅会激发肌肉分化，还同时会驱动部分微组织细胞积累脂肪(图19的步骤9b)。用肌钙蛋白T AB和脂质染色(Bodipy)对微组织进行双重染色，并显示微组织内显著的互斥群体分化为脂肪或肌肉谱系(图16)。此外，将微组织转移至贴壁生长条件下导致成熟脂肪细胞和成熟延长肌纤维的分化(参见图17A-B)。基于细胞骨架组织，可以轻松区分这两个群体(图18A-E)。脂肪积累的进一步染色清楚显示微组织平行分化为脂肪和肌肉组织的能力(图18A-E)。这些特性使得微组织的分化过程对于培养肉生产非常优选，因为它们允许通过按需改变脂肪和蛋白质的百分比来控制原料的特性。
实施例11
微组织的感官和营养特性
在烹饪过程中，不同的食品组分之间会发生不同的化学反应。这些反应中最重要和最复杂的反应之一是美拉德反应，其中氨基酸与还原糖反应形成新的分子化合物，负责浓郁的肉味和香味。
另一个控制烹饪过程中风味传递和每种肉产生的独特香味的主要因素是脂肪含量和组成。
培养基组成(无因子的培养基和补充有FA的分化培养基)允许在微组织内形成所需组分，以产生相似的氨基酸和脂肪酸概况分布，用于鸡肉风味的开发，这从氨基酸组成分析以及通过气相色谱质谱分析获得的脂肪酸概况分析中可见。(表1-3)。
专家品尝师和厨师对产品进行了多次品尝，其报告了增强的、美味的鸡肉风味的品尝体验。为了以分析方式显示这一点，对熟制产品和熟制鸡胸肉进行了初步挥发性化合物(VOC)分析。结果显示VOC释放高度平行模式，表明两个样品之间产生相似的香味(图19)。
最后，本发明人希望验证产品的营养价值。分析了食品的所有主要组分，诸如水分、碳水化合物、蛋白质、脂肪和矿物质。所有数值均表明，微组织的总体营养成分与鸡肉相当(表3)。
| 氨基酸 | 鸡胸 | SM微组织 |
| 磺基丙氨酸 | 1.40 | 1.68 |
| 天冬氨酸 | 9.72 | 9.64 |
| 甲硫氨酸sulfon | 2.80 | 1.99 |
| 苏氨酸 | 4.40 | 4.72 |
| 丝氨酸 | 3.72 | 4.72 |
| 谷氨酸 | 15.47 | 14.26 |
| 脯氨酸 | 3.53 | 3.35 |
| 甘氨酸 | 5.27 | 5.45 |
| 丙氨酸 | 6.00 | 6.18 |
| 缬氨酸 | 5.51 | 5.87 |
| 异亮氨酸 | 4.98 | 4.40 |
| 亮氨酸 | 8.27 | 9.22 |
| 酪氨酸 | 3.58 | 3.98 |
| 苯丙氨酸 | 4.30 | 4.93 |
| 赖氨酸 | 9.33 | 8.91 |
| 组氨酸 | 4.06 | 2.73 |
| 精氨酸 | 7.64 | 7.97 |
表1：鸡胸肉样品的氨基酸概况分布与微组织概况分布之间的比较。分析显示样品之间相似的概况分布(图19的步骤8b)。
表2：微组织与鸡胸组织之间脂肪酸谱的比较(图19的步骤8b)。
表3：微组织与商业鸡胸肉样品的营养价值分析表明样品之间的高度可比的价值。(图19的步骤8b)。
虽然已结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是显然许多替代、修改和变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，它旨在包括落入所附权利要求书的精神和广泛范围内的所有此类替代、修改和变化。
申请人的意图是，将本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其全部并入本说明书，如同每个单独的出版物、专利或专利申请在提及时都被具体和单独地注明其将通过引用并入本文。此外，本申请中对任何参考文献的引用或识别不应解释为承认该参考文献可作为本发明的现有技术获得。就使用章节标题而言，它们不应被解释为必然限制。此外，本申请的任何优先权文件均通过引用以其全部并入本文。
Claims (55)
1.一种生产多能干细胞聚集体的方法，所述方法包括：
(a)提供在基质粘附条件下生长的非人多能干细胞的非人多能干细胞系；
(b)逐渐剥夺所述基质粘附的所述非人干细胞系，以获得包含所述非人多能干细胞的聚集体，所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出以未分化方式不超过12小时的倍增时间持续超过60次传代，能够在分化诱导后分化为肌肉、脂肪和结缔组织，表现出低于胚状体(EB)的细胞对细胞粘附，如通过与所述EB相比选自由COL6A2、CD44、COL6A1、ANXA1、ANXA2和S100A11组成的组的粘附分子的减少的表达所确定的，其中步骤(a)和(b)在生长因子存在下进行。
2.一种生产包含一种或多种细胞类型的微组织的方法，所述方法包括：
(a)在没有基质粘附的悬浮液中形成包含非人多能干细胞的聚集体，所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出以未分化方式不超过12小时的倍增时间持续超过60次传代，能够在分化诱导后分化为肌肉、脂肪和结缔组织，在存在生长因子的情况下生长，表现出低于胚状体(EB)的细胞对细胞粘附，如通过与所述EB相比选自由COL6A2、CD44、COL6A1、ANXA1、ANXA2和S100A11组成的组的粘附分子的减少的表达所确定的；和
(b)将所述聚集体转移至生物反应器，在不存在生长因子的情况下，在没有基质粘附的悬浮液中生长，从而生产所述微组织。
3.一种生产包含一种或多种细胞类型的微组织的方法，所述方法包括：
(a)提供悬浮培养物，其包含聚集体，所述聚集体包含非人多能干细胞，所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出以未分化方式不超过12小时的倍增时间持续超过60次传代，能够在分化诱导后分化为肌肉、脂肪和结缔组织，在存在生长因子的情况下生长，表现出低于胚状体(EB)的细胞对细胞粘附，如通过与所述EB相比选自由COL6A2、CD44、COL6A1、ANXA1、ANXA2和S100A11组成的组的粘附分子的减少的表达所确定的；和
(b)将所述聚集体转移至生物反应器，在不存在生长因子的情况下，在没有基质粘附的悬浮液中生长，从而生产所述微组织。
4.一种生产包含一种或多种感兴趣细胞类型的微组织的方法，所述方法包括：
(a)生产根据权利要求2所述的微组织；和
(b)使所述微组织经受悬浮液中的分化条件，从而生产所述包含一种或多种感兴趣细胞类型的微组织。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所指示的数值是在作为所述非人多能干细胞的类型和发育阶段的细胞生长的最佳条件下提供的。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述非人干细胞为胚胎干细胞。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述胚胎干细胞属于胚胎干细胞系。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述非人多能干细胞属于家畜多能干细胞。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述非人多能干细胞选自禽多能干细胞、牛多能干细胞、猪多能干细胞、山羊多能干细胞、绵羊多能干细胞、虾多能干细胞和鱼多能干细胞的组。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述禽多能干细胞选自鸡多能干细胞和鸭多能干细胞的组。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述禽多能干细胞为鸡多能干细胞。
12.根据权利要求2-11中任一项所述的方法，其中所述微组织的直径为30-500μm。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述聚集体表现出80-120μm的平均直径。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出碱性磷酸酶表达。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出端粒酶基因表达。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述聚集体的所述非人多能干细胞为SSEA4-、LIN28+、ENS-1+、NANOG+、OCT4,+和TRA-I-60+。
17.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述聚集体或微组织表现出天然肉制品的感官特性。
18.根据权利要求2-17中任一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞类型选自由肌肉细胞、脂肪细胞和结缔组织细胞组成的组。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种细胞类型包括脂肪细胞和肌肉细胞。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述基质粘附选自饲养细胞和天然或合成基质分子。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述基质分子包含明胶。
22.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述生长因子选自由IGF-1、IL6、sIL6 Rα、hLIF和干细胞因子(SCF)组成的组。
23.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述生长因子包括IGF-1、IL6、sIL6Rα、hLIF和干细胞因子(SCF)。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述方法的每一步骤均不含除所述非人多能干细胞之外的动物组分。
25.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述聚集体表现出与它们所源自的干细胞系的基因表达大致相同的基因表达，排除细胞运动和迁移相关基因的表达水平。
26.根据权利要求2-25中任一项所述的方法，其中所述微组织为NANOG-OCT4-LIN28-、SSEA3+。
27.一种通过向脂肪细胞命运引发来生产细胞的方法，所述方法包括在浓度不超过100μM的脂肪酸存在下培养多能干细胞或多潜能干细胞一段足以获得肌肉细胞和具有脂肪细胞命运同时保持增殖表型的干细胞的时间。
28.根据权利要求26所述的方法，其在悬浮液中实现。
29.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述培养持续2-5周的时期。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述多潜能干细胞为成体干细胞。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述成体干细胞为中胚层的。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述中胚层干细胞为间充质干细胞。
33.根据权利要求27所述的方法，其中所述多潜能干细胞已通过多能干细胞的离体成熟获得。
34.根据权利要求27-33中任一项所述的方法，其中所述离体成熟在不存在生长因子的悬浮液中实现。
35.根据权利要求27-34中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞和/或多潜能干细胞任选处于30-500μm的聚集状态。
36.根据权利要求27-35中任一项所述的方法，其中所述干细胞为非人的。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述非人干细胞属于家畜。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述非人干细胞选自由禽干细胞、牛干细胞、猪干细胞、山羊干细胞、绵羊干细胞、虾干细胞和鱼干细胞组成的组。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述禽干细胞选自鸡干细胞和鸭干细胞的组。
40.根据权利要求27-39中任一项所述的方法可获得的细胞。
41.一种生产细胞的方法，所述方法包括在浓度高于100μM的脂肪酸存在下培养权利要求40所述的细胞一段足以允许分化为脂肪细胞的时间。
42.根据权利要求41所述的方法，其中实现所述培养具有所述脂肪细胞命运的所述干细胞持续5-10天。
43.根据权利要求41-42中任一项所述的方法可获得的细胞。
44.根据权利要求2-42中任一项所述的方法可获得的微组织。
45.一种包含一种或多种细胞类型的微组织，所述微组织的直径为30-500μm，其中所述微组织的细胞为NANOG-OCT4-LIN28-、SSEA3+。
46.根据权利要求45所述的微组织，其表现出天然肉制品的感官特性。
47.根据权利要求45-46中任一项所述的微组织，其中所述一种或多种细胞类型包括脂肪细胞和肌肉细胞。
48.根据权利要求1-26中任一项所述的方法可获得的多能干细胞聚集体。
49.一种包含非人多能干细胞的多能干细胞聚集体，所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出以未分化方式不超过12小时的倍增时间持续超过60次传代，能够在分化诱导后分化为肌肉、脂肪和结缔组织，并表现出低于胚状体(EB)的细胞对细胞粘附，如通过与所述EB相比选自由COL6A2、CD44、COL6A1、ANXA1、ANXA2和S100A11组成的组的粘附分子的减少的表达所确定的。
50.根据权利要求49所述的多能干细胞聚集体，其进一步表现出以下至少之一：
(i)平均直径80-120μm；
(ii)所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出碱性磷酸酶表达；
(iii)所述聚集体的所述非人多能干细胞表现出端粒酶基因表达；
(iv)所述聚集体的所述非人多能干细胞为SSEA4-、LIN28+、ENS-1+、NANOG+、OCT4,+和TRA-I-60+；
(v)表现出天然肉制品的感官特性；
(vi)所述聚集体表现出与它们所源自的干细胞系大致相同的基因表达，排除细胞运动和迁移相关基因的表达水平。
51.根据权利要求49或50所述的多能干细胞聚集体，其中所述非人多能干细胞选自禽多能干细胞、牛多能干细胞、猪多能干细胞、山羊多能干细胞、绵羊多能干细胞、虾多能干细胞和鱼多能干细胞的组。
52.根据权利要求51所述的多能干细胞聚集体，其中所述禽多能干细胞选自鸡多能干细胞和鸭多能干细胞的组。
53.根据权利要求52所述的多能干细胞聚集体，其中所述禽多能干细胞为鸡多能干细胞。
54.一种食品，包含权利要求40或43所述的细胞或权利要求44至53所述的微组织或聚集体。
55.一种生产食品的方法，所述方法包括将权利要求40或43所述的细胞或权利要求44至53所述的微组织或聚集体与供人类食用的可食用组合物组合。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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