CN117795059A - 从多能细胞分化的肌细胞、其产生方法和用途 - Google Patents

从多能细胞分化的肌细胞、其产生方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及产生包含骨骼肌细胞的生物工程化组织的领域，特别涉及用于从多能干细胞产生多于一个骨骼肌定向祖细胞和由其分化的骨骼肌细胞的组合物和方法。本发明还提供了大量骨骼肌定向祖细胞和/或大量骨骼肌细胞、包含它们的工程化组织及其用途。

Description

从多能细胞分化的肌细胞、其产生方法和用途
发明领域
本发明涉及产生包含骨骼肌细胞的生物工程化组织的领域，特别涉及用于从多能干细胞产生多于一个骨骼肌定向祖细胞和由其分化的骨骼肌细胞的组合物和方法。本发明还提供了大量(a mass of)骨骼肌定向祖细胞和/或大量骨骼肌细胞、包含骨骼肌定向祖细胞和骨骼肌细胞的工程化组织及其用途。
发明背景
动物肉是蛋白质的良好营养来源，含有人体生长和维持所需的适当比例的所有必需氨基酸。然而，现代饲养牲畜以获取食物的做法对空气和水质有有害影响，并且需要大面积的土地和能源投资。这也引发了道德问题，因为通常家畜生长在拥挤的栖息地，并且有时不适当的条件会使家畜受试者感到痛苦。出于这个原因，细胞人造肉产品也可能会被出于人道主义原因而戒除肉的人食用。
其中，产生人造肉产品的一个挑战是其质地和口感无法复制同等屠宰肉产品的质地和口感。仅含有培养的细胞的人造肉通常是绞肉的形式，这大大地限制了可以提供给消费者的食物的种类。虽然含有培养细胞和基于植物的蛋白的杂合产品形成了一种潜在的解决方案，但仍然需要获得模拟主要由肌肉组成的屠宰肉的基于细胞的部分。
体外肌肉分化的尝试主要在基础科学研究和治疗学开发的领域内进行。骨骼肌谱系来源于胚胎轴旁中胚层(PM)，它还产生中轴骨骼、真皮、棕色脂肪、脑膜和内皮细胞。最近报道了来自小鼠和人类多能干细胞(胚胎干细胞或诱导多能干细胞)的体外重演肌生成的实验策略，并且都依赖于外胚层阶段的Wnt信号传导剂(诸如CHIR)的早期活化。这导致神经中胚层祖细胞(NMP)的诱导，其随后可被诱导为PM命运和骨骼肌。这些方案可以有效地产生胎儿肌纤维(fetal muscle fiber)和未成熟卫星细胞。直到最近，允许合理的成熟肌细胞的分化的唯一有效方案依赖于转录因子诸如MyoD或Pax3/7的过表达，随后是诱导祖细胞的细胞分选(PourquiéO等人,2018.Curr Top Dev Biol.129:123-142.doi:10.1016/bs.ctdb.2018.03.003)。
先前的研究表明，活化素/Nodal/TGFβ、BMP、FGF和WNT从多能干细胞广泛诱导中胚层(Kyle M L等人,2016.Cell 166(2):451-467)。FGF和活化素被证明为心脏分化所必需的(Shen M等人,2021.Circulation Research 128:670-686；Sasano Y等人,2020.Journalof Bioscience and Bioengineering,129(6):749-755)，而活化素A被证明为肌肉量(muscle mass)的负调节因子(Latres E等人,2017.Nat Commun 8:15153,DOI:10.1038/ncomms15153)。研究表明，靶向(抑制)活化素A信号通路在微重力下防止肌肉损失和骨损失两方面具有显著的有益作用，这表明这种策略可能在预防或治疗肌肉损失和骨损失方面是有效的(Lee Se-Jin等人,2020.PNAS 117(38):23942-23951,doi.org/10.1073/pnas.2014716117)。TGFβ抑制剂SB431542，一种已知的体细胞中胚层样细胞诱导剂，被证明在PAX7诱导肌源性分化的背景下增强肌管的产生(Selvaraj S等人,2019.eLife 8:e47970,DOI:10.7554/eLife.47970)。
美国申请公布第2012/0164731号公开了一种使用多能干细胞，特别是诱导多能细胞产生骨骼肌祖细胞的方法，包括通过在活化素A存在时培养多能干细胞来获得PDGFRα阳性中胚层细胞，并且然后在无血清条件下和在存在Wnt信号诱导剂的情况下培养获得的中胚层细胞，以允许细胞分化为骨骼肌祖细胞。还公开了通过该方法获得的包含骨骼肌祖细胞的细胞群体，以及用于肌肉疾病诸如肌肉萎缩症的骨骼肌再生促进剂和治疗剂，该促进剂或治疗剂包含作为活性成分的骨骼肌祖细胞。
美国申请公布第2019/0010460号公开了用于从多能干细胞产生生物工程化心肌(BHM)的方法，大体上包括通过定向组织形成诱导中胚层分化、心脏分化和心脏成熟的步骤。
大多数目前用于从多能细胞分化肌细胞的方法需要使用大量组分，包括昂贵的生长因子和培养基，并且还需要长的培养期。
需要一种简单且经济的组合物和方法来获得可用于细胞培养产品(包括人造肉制品)工业的肌细胞。
发明概述
本发明满足了上述对可以形成工程化组织或人造肉制品的部分的大量骨骼肌细胞的需求，提供了用于产生可以容易地进一步分化为肌细胞的大量骨骼肌定向祖细胞的组合物和方法。
本发明部分地基于意外的发现，即在包含TGF-β(TGF-β)信号通路的活化剂(特别是活化素A)和糖原合酶激酶-3(GSK3)信号通路的抑制剂(特别是CHIR-99021)的组合的培养基中培养的多能干细胞(PSC)产生包含骨骼肌定向祖细胞的多于一个细胞。然后将所述肌肉定向祖细胞分化成肌细胞。有利的是，多于一个细胞还包含另外的谱系定向细胞，其也可以容易地分化为产生细胞外基质(ECM)的细胞和脂肪细胞。
此外，本发明的教导优于先前已知的从PSC产生骨骼肌定向祖细胞的方法，其优点在于：谱系定向分化过程仅需要补充有营养物质以及至少一种TGF-β活化剂和至少一种GSK3抑制剂的组合的培养基。此外，本发明的方法能够将从PSC产生肌细胞的时间缩短到几天的时间范围，并且在大约两周到大约四周内完成产生包含骨骼肌细胞的生物工程化组织的整个过程。此外，该方法易于扩展到几十升体积的反应器，这使得其能够以与该行业中那些传统工艺相当的成本用于食品工业。
根据某些方面，本发明提供了一种产生包含骨骼肌定向祖细胞的多于一个细胞的方法，该方法包括在包含以下的组合的培养基中培养多于一个多能干细胞(PSC)：(i)TGF-beta(TGF-β)信号通路的至少一种活化剂和(ii)GSK3信号通路的至少一种抑制剂，从而产生包含骨骼肌定向祖细胞的多于一个细胞。
根据某些实施方案，培养基是无血清培养基。
根据某些实施方案，培养在三维(3D)培养条件下进行。根据某些示例性实施方案，3D培养物是悬浮培养物。根据某些实施方案，悬浮培养物没有粘附材料和/或支撑基质。根据这些实施方案，细胞是自组装的，形成至少一个细胞聚集体。根据某些实施方案，细胞聚集体的形式是选自由团簇、球体、类器官等组成的组。
根据又一另外的或替代性实施方案，悬浮培养物包含至少一种粘附材料和/或支撑基质。根据某些示例性实施方案，3D培养在容器内进行。
根据某些替代性实施方案，培养在二维(2D)培养条件下进行。根据一些实施方案，2D培养物包含至少一种粘附材料和/或支撑基质。
根据本发明的教导，可以使用能够活化和支持细胞培养的，特别是PSC和从中分化的细胞的培养的本领域已知或将已知的任何粘附材料或支撑基质。根据某些实施方案，支撑基质是半固体基质。根据一些实施方案，支撑基质是固体。
根据某些实施方案，TGF-β信号通路的至少一种活化剂选自由以下组成的组：活化素A、TGF-β、BMP2、BMP7、GDF9、NODAL及其任何组合。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，GSK3信号通路的抑制剂选自由以下组成的组：CHIR-99021(C22H18Cl2N8)或其盐、SB 216763、LY2090314、TWS119、Tideglusib、GSK-3β抑制剂1、GSK-3β抑制剂2、GSK-3β抑制剂3、AR-A014418、TDZD-8、肯帕罗酮(kenpaullone)、GSK3抑制剂IX、色甘酸钠、CHIR-98014、AZD1080、SB 415286、IM-12、9-ING-41、靛玉红-3’-一肟、1-氮杂肯帕罗酮、BRD0705、AZD2858、CP21R7、BIO-丙酮肟、Bikinin、VP3.15、VP3.15二氢溴化物、GNF4877、KY19382、SAR502250、A1070722、(R)-BRD3731、BRD3731、BIP-135、5-碘代-靛玉红-3’-一肟、BRD5648、GSK3抑制剂1、GSK3/CDK5/CDK2-IN-1、靛玉红-3’-一肟-5-磺酸、GSK3β抑制性类黄酮、锂以及它们的任何组合。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，CHIR-99021盐选自由CHIR-99021一盐酸盐和CHIR-99021三盐酸盐组成的组。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，GSK3β抑制性类黄酮选自由木犀草素、芹黄素、槲皮素、杨梅素及其任何组合组成的组。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，除了活化TGF-β途径的生长因子之外，培养基不含其他生长因子。根据一些实施方案，培养基不含bFGF。
根据某些示例性实施方案，包含TGF-β信号通路的至少一种活化剂和GSK3信号通路的至少一种抑制剂的组合包含活化素A和CHIR-99021。根据某些实施方案，该组合由活化素A和CHIR-99021组成。
根据某些实施方案，在接种时，培养基还包含Rho相关蛋白激酶(Rock)的抑制剂。
根据某些实施方案，培养进行使得能够达到多于一个细胞的总数中约10％至约90％为骨骼肌定向祖细胞的时间段。
根据某些实施方案，在包含TGF-β信号通路的至少一种活化剂和GSK3信号通路的至少一种抑制剂的组合的培养基中连续进行多于一个PSC的培养。
根据某些另外的或替代性实施方案，以周期进行多于一个PSC的培养，其中包含TGF-β信号通路的至少一种活化剂和GSK3信号通路的至少一种抑制剂的组合的培养基在每个周期后被替换。在每个周期中的TGF-β信号通路的至少一种活化剂和GSK3信号通路的至少一种抑制剂的组合可以相同或不同。
根据某些实施方案，所产生的多于一个细胞还包含至少一个另外的谱系定向祖细胞。根据某些实施方案，至少一个另外的谱系定向祖细胞选自基质定向祖细胞、脂肪细胞定向祖细胞及其组合。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，多于一个PSC的来源选自由非人类动物和人类组成的组。根据某些实施方案，非人类动物选自由有蹄类动物、家禽、水生动物、无脊椎动物和爬行动物组成的组。根据某些实施方案，有蹄类动物选自由牛、绵羊、山羊、水牛、马科动物、猪、长颈鹿、骆驼、鹿、河马或犀牛组成的组。根据某些示例性实施方案，有蹄类动物是牛科动物。
根据某些实施方案，PSC选自由诱导PSC(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)和非胚胎干细胞组成的组。
根据某些实施方案，PSC不是遗传修饰的。根据某些实施方案，PSC是遗传修饰的。
根据另一方面，本发明提供了一种产生多于一个骨骼肌细胞的方法，该方法包括：
-将包含由如上所描述的本发明方法产生的骨骼肌定向祖细胞的多于一个细胞沉积在粘附材料和/或支撑基质上；并且
-在促进骨骼肌定向祖细胞向骨骼肌细胞分化的分化培养基中培养多于一个细胞，
从而产生包含骨骼肌细胞的多于一个分化的细胞。
本发明的方法可以使用多种类型的分化培养基。然而，本发明现在证明了，补充有营养物和任选的某些激素的无血清培养基足以获得由本发明的方法产生的肌肉定向祖细胞向骨骼肌细胞的分化。根据某些实施方案，分化培养基不含TGF-β信号通路的活化剂和GSK3信号通路的抑制剂。根据某些示例性实施方案，培养基不含活化素A和CHIR-99021。
根据某些实施方案，细胞在分化培养基中培养约3天至约30天的一段时间。根据某些实施方案，细胞在分化培养基中培养约3天至约10天。根据某些实施方案，细胞在分化培养基中培养约5天至约8天。根据某些实施方案，获得包含骨骼肌细胞的多于一个分化的细胞的整个周期为约6天至约30天。根据某些实施方案，获得包含骨骼肌细胞的多于一个分化的细胞的整个周期为约6天至约12天。
根据某些实施方案，多于一个分化的细胞包含占细胞总数的约10％至约90％的骨骼肌细胞。根据某些实施方案，骨骼肌细胞是存活的。
本发明还提供了包括通过本发明的方法产生的骨骼肌定向祖细胞的多于一个细胞。根据某些实施方案，多于一个骨骼肌定向祖细胞基本上没有PSC。如本文所用，关于PSC的术语“基本上没有”指的是通过本领域目前已知的标准方法无法检测到的许多PSC。
根据某些实施方案，骨骼肌定向祖细胞从非人类动物PSC产生。根据某些实施方案，骨骼肌定向祖细胞从牛PSC产生。
本发明还包括包含通过本文所描述的本发明的方法产生的分化的骨骼肌细胞的工程化组织。根据某些实施方案，分化的肌肉骨骼细胞从非人类动物PSC产生。根据某些实施方案，分化的肌细胞从牛PSC产生。
根据某些实施方案，多于一个分化的细胞包含占细胞总数的约10％至约90％的分化的骨骼肌细胞。根据某些实施方案，多于一个分化的细胞还包含分化的基质细胞、分化的脂肪细胞及其组合中的至少一种。根据某些实施方案，分化的基质细胞占细胞总数的约10％至约90％。根据某些实施方案，分化的脂肪细胞占细胞总数的约10％至约90％。根据某些实施方案，基质细胞是产生ECM的细胞。根据某些实施方案，多于一个分化的细胞不含心肌细胞。包含本发明骨骼肌细胞的多于一个分化的细胞和/或工程化组织可用于多种应用，主要取决于骨骼肌细胞从中分化的PSC的来源和类型。
根据某些示例性实施方案，包含本发明骨骼肌细胞的多于一个分化的细胞和/或工程化组织用于产生人造食品制品，特别是人造肉。
根据又一另外的某些方面，本发明提供了多于一个包含骨骼肌定向祖细胞的在体外生长的细胞，其中骨骼肌定向祖细胞的特征在于表达至少一种中胚层标志物和/或至少一种早期肌源性标志物。
根据某些实施方案，至少一种中胚层标志物选自由TBXT、TBX6、MSGN1、Pax3及其任何组合组成的组，并且至少一种早期肌源性标志物为Six1。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，骨骼肌定向祖细胞的特征在于表达MSGN1和Six1。
根据某些实施方案，多于一个在体外生长的细胞还包含至少一种选自由基质定向祖细胞、脂肪细胞定向祖细胞及其组合组成的组的另外的谱系定向细胞。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，多于一个在体外生长的细胞包含至少一种GSK3β抑制性类黄酮和/或其代谢物。
根据另外的某些方面，本发明提供了多于一个包含分化的骨骼肌细胞的在体外生长的细胞，其中骨骼肌细胞的特征在于表达至少一种肌源性标志物。
根据某些实施方案，至少一种肌源性标志物选自由Myf5、Pax7、MEF2C、SIX1、NYOD1、MYOG、MYH3、MYH7、NYH8、MB、MYMK及其任何组合组成的组。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，多于一个在体外生长的细胞还包含基质细胞、脂肪细胞或其组合中的至少一种。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，基质细胞是产生细胞外基质(ECM)的细胞。
根据某些实施方案，在多于一个在体外生长的细胞范围内的细胞是非人类动物细胞。
本发明还涵盖一种工程化组织，该工程化组织包含多于一个含有骨骼肌细胞的在体外生长的细胞。
根据某些实施方案，包含骨骼肌细胞的在体外生长的分化的细胞是非人类动物细胞。根据这些实施方案，多于一个细胞或包含多于一个细胞的工程化组织形成人造食品制品，特别是人造肉制品。
应当理解，本文公开的方面和实施方案中的每一个的任何组合被明确地涵盖在本发明的公开内容内。
本发明的可适用性的另外的实施方案和全部范围将从下文给出的详细描述变得明显。然而，应当理解，详细描述和具体实例，虽然指示本发明的示例性的实施方案，但仅通过说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改根据该详细描述对本领域技术人员将变得明显。
附图简述
图1示出了在无血清生长培养基中悬浮孵育4天后从牛多能干细胞获得的骨骼肌定向祖细胞的代表性明场图像，该无血清生长培养基包含活化素A和CHIR-99021的组合。放大倍数X4。
图2示出了从在包含活化素A和CHIR-99021的无血清生长培养基中孵育的牛PSC开始分化4天后标志物的代表性RT-PCR分析。
图3示出了从牛PSC开始分化总共11天后肌球蛋白重链的代表性免疫荧光染色(使用MF-20抗体)。将牛PSC在3D悬浮液中培养(图3A-图3C)或在支持物上的2D培养物中培养(图3D)，前4天在仅包含CHIR-99021的无血清生长培养基中(图3A)；包含CHIR-99021与活化素A组合的无血清生长培养基(图3B和图3D)中；或包含CHIR-99021与TGFβ组合的无血清生长培养基(图3C)中培养。4天后，将细胞/细胞聚集体沉积在2D支持物上，并在不含活化素A、CHIR-99021和TGFβ的无血清培养基中另外培养7天。灰色–DAPI/细胞核；白色-MyhC阳性细胞。放大倍数x10。
图4示出了肌源性标志物Myf5、Pax7、Mef2C、Six1、MyoD1、MyoG、MYH3、MYH7、MYH8、肌红蛋白(MB)和myomaker(MYMK)在从牛多能干细胞开始分化总共11天后的代表性RT-PCR分析，牛多能干细胞仅在定向阶段，即在前4天期间，在包含活化素A和CHIR-99021的无血清生长培养基中孵育。
发明详述
本发明提供了用于从多能干细胞(PSC)产生骨骼肌细胞的方法，其适于大规模、有成本效益的生产。本发明部分地基于意外的发现，即在存在活化素A—迄今为止已知的作为肌肉质量的负调节因子的TGF-β信号通路的活化剂和CHIR 99021—GSK3信号通路抑制剂的组合的情况下培养PSC，导致大量PSC转化为中胚层谱系细胞，中胚层谱系细胞继而可以分化为骨骼肌细胞。此外，在产生大量多于一个骨骼肌细胞和/或包含这些细胞的工程化组织的整个过程中所需的培养基易于生产，并且包含最少数量的生长因子和小分子；与迄今为止已知的方案相比，整个生长周期更短；即使当产品将被用于食品工业，也能以经济的成本进行大规模生产。
本发明还提供了通过本发明的方法产生的骨骼肌细胞，其可以以多于一个细胞或包含这些细胞的工程化组织的形式用于治疗应用。在某些实施方案中，本发明的骨骼肌细胞和包含这些骨骼肌细胞的工程化组织被定制用于食品工业，特别是用于人造肉的生产。
定义
除非上下文另外清楚指明，否则如本文使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多于一种化合物，包括其混合物。
术语“包含/包括(comprise)”、“包含/包括(comprising)”、“包括/包含(includes)”、“包括/包含(including)”、“具有(having)”和其同源词意指“包括但不限于”。
在整个本申请中，本发明的各种实施方案可以以范围形式来呈现。应当理解，以范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁并且不应当被解释为对本发明的范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单独的数值。例如，诸如从1至6的范围的描述应当被认为是已经具体地公开了子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及在该范围内的单独的数字例如1、2、3、4、5和6。不论范围的宽度如何，这都适用。
本文无论何时指示数值范围，其意在包括在该指示的范围内的任何引用的数值(分数或整数)。措辞“范围在(ranging/ranges between)”第一个指示数字和第二个指示数字“之间”以及“范围为从(ranging/ranges from)”第一个指示数字“到(to)”第二个指示数字在本文可互换地使用并且意在包括第一个指示数字和第二个指示数字及其之间的所有分数和整数。
如本文使用的术语“约”指的是数字符号(numberical designation)的+10％或-10％的数字符号的变化。此外，本文的所有数值范围应该理解为包括该范围内的每个整数。
如本文所使用的，术语“多于一个”，特别是提及PSC，指的是“至少两个”，特别是至少两个细胞、至少5个细胞、至少10个细胞或至少100个细胞、或至少1,000个细胞或至少10,000个细胞。
如本文所使用的，术语“多能干细胞(PSC)”指的是可以无限繁殖，以及产生身体中的所有其他细胞类型的细胞。该术语明确包括原始多能干细胞和始发(primed)多能干细胞两者。
如本文所使用的，术语“诱导多能干细胞(iPSC)”指的是可以直接从体细胞产生的多能干细胞类型。
如本文所使用的，术语“胚胎干细胞(ESC)”指的是来源于囊胚的多能干细胞类型。
如本文所使用的，本文所使用的术语“工程化组织”指的是X和Y平面中多于一个细胞厚、形成至少一层的细胞共生体(association of cells)。在一些实施方案中，工程化组织包括一层。在其他实施方案中，工程化组织包括多于一层。在一些实施方案中，层形成连续的、基本连续的或不连续的细胞片。在一些实施方案中，工程化组织或其层包括X、Y和Z轴上的多于一个细胞。根据本发明的教导的工程化组织可以包含或可以不包含细胞粘附材料和/或支撑基质。根据一些实施方案，细胞粘附材料和/或支撑基质形成纳米载体、微载体、大载体(macro-carrier)或其组合。根据一些实施方案，细胞粘附材料和/或支撑基质形成支架。
本文所使用的术语“人造肉”用来描述区别于屠宰动物肉的从体外非人类动物细胞培养物中长成的肉。可以在本领域中用于描述从体外动物细胞培养物中长成的肉的另外的术语包括细胞长成的肉(cell grown meat)、细胞培养肉(cell-cultured meat)、培殖肉(cultivated meat)、清洁肉(clean meat)、实验室长成的肉(lab-grown meat)、试管肉(test tube meat)、体外肉(in vitro meat)、试管肉排(tube steak)、合成肉(syntheticmeat)、组织工程化肉(tissue engineered meat)、工程化肉、人工肉(artificial meat)和人造肉(manmade meat)。
根据某些方面，本发明提供了一种生产包含肌肉定向祖细胞的多于一个细胞的方法，包括在包含以下组合的培养基中培养多于一个多能干细胞(PSC)：(i)TGF-beta(TGF-β)信号通路的至少一种活化剂和(ii)GSK3信号通路的至少一种抑制剂；从而产生多于一个肌肉定向祖细胞。
应明确理解，在整个孵育时间内，TGF-β信号通路的至少一种活化剂和GSK3信号通路的至少一种抑制剂两者都存在于培养基中，直到形成骨骼肌定向祖细胞。
TGF-β信号传导参与许多细胞功能，包括细胞生长、细胞命运和细胞凋亡。信号传导通常始于TGF-β超家族配体与II型受体的结合，其募集并磷酸化I型受体。然后，I型受体磷酸化转录因子的SMAD家族，该家族在细胞核中充当转录因子并调节靶基因表达。TGF-β超家族配体包括骨形态发生蛋白(BMP)、生长分化因子(GDF)、抗苗勒管激素(AMH)、活化素、Nodal和TGF-β。通常，Smad2和Smad3被TGF-β/活化素途径中的ALK4、ALK5和ALK7受体磷酸化。与之相比，Smad1、Smad5和Smad8作为骨形态发生蛋白(BMP)途径的一部分被磷酸化。尽管在途径之间存在一些交叉，但在本发明的上下文中，TGF-β信号通路的活化剂优选是通过Smad2和Smad3起作用的TGF-β通路的活化剂。
根据某些实施方案，TGF-β信号通路的活化剂选自由以下组成但不限于以下的组：活化素A、TGF-β、BMP2、BMP7、GDF9、NODAL及其任何组合。每种可能性代表本发明的单独实施方案。也可以应用适合于本发明方法的TGF-β信号通路的任何其它活化剂。
根据某些示例性实施方案，TGF-β信号通路的活化剂是活化素A。
糖原合酶激酶3(GSK3)从酵母到哺乳动物都是高度保守的。哺乳动物表达两种GSK3亚型，α(51kDa)和β(47kDa)，它们由不同的基因编码，并且在其催化结构域内具有97％的氨基酸序列同一性。然而，它们的序列在激酶结构域2之外有显著差异。这两种GSK3亚型表现为普遍表达，并且它们在一些信号通路中似乎是功能冗余的，包括Wnt-β-连环蛋白信号通路，但它们在其他通路中执行不同的功能。大量研究指出GSK3失调，特别是超活化，与多种病理状况有关，包括糖尿病、肥胖症、炎症、神经性紊乱和肿瘤发生。
根据某些实施方案，GSK3信号通路的抑制剂选自由以下组成但不限于以下的组：CHIR 99021(C22H18Cl2N8)或其盐、SB 216763、LY2090314、TWS119、Tideglusib、GSK-3β抑制剂1、GSK-3β抑制剂2、GSK-3β抑制剂3、AR-A014418、TDZD-8、肯帕罗酮、GSK 3抑制剂IX、色甘酸钠、CHIR-98014、AZD1080、SB 415286、IM-12、9-ING-41、靛玉红-3’-一肟、1-氮杂肯帕罗酮、BRD0705、AZD2858、CP21R7、BIO-丙酮肟、Bikinin、VP3.15、VP3.15二氢溴化物、GNF4877、KY19382、SAR502250、A 1070722、(R)-BRD3731、BRD3731、BIP-135、5-碘代-靛玉红-3’-一肟、BRD5648、GSK-3抑制剂1、GSK-3/CDK5/CDK2-IN-1、靛玉红-3’-一肟-5-磺酸、GSK3β抑制性类黄酮、锂和它们的任何组合。每种可能性代表本发明的单独实施方案。也可以应用适合本发明方法的任何其它GSK3-抑制剂。
根据某些实施方案，CHIR-99021盐选自由CHIR-99021一盐酸盐和CHIR-99021三盐酸盐组成的组。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些示例性实施方案，GSK3信号通路的抑制剂是CHIR-99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈，C22H18Cl2N8)。
发现黄酮类化合物对GSK3β具有抑制活性(例如，Johnson L J等人,2011.J MedFood14(4):325-333；Jung Y等人,2017.Appl Biol Chem 60(3):227–232)。根据某些实施方案，根据本发明的教导的GSK3信号通路的抑制剂是GSK3β抑制性类黄酮。根据一些实施方案，类黄酮选自由以下组成的组：木犀草素、芹菜素、槲皮素、杨梅素及其任何组合。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些示例性实施方案，用于形成多于一个骨骼肌定向祖细胞的培养基包含作为TGF-β信号通路活化剂的活化素A和作为GSK3信号通路抑制剂的CHIR-99021的组合。
本技术人员将理解，有效量的TGF-β信号通路活化剂和GSK3信号通路抑制剂的浓度将取决于所用药物的具体类型。通常，用于形成多于一个骨骼肌定向祖细胞的培养基除了活化TGF-β信号通路的生长因子和抑制GSK3信号通路的生长因子之外，没有其他生长因子。在替代性实施方案中，可以在细胞的某些生长阶段将这样的另外的生长因子添加到培养基中，持续有限的时间。
根据某些实施方案，培养基不含血清。如本文使用的，关于培养基的术语“无血清”指的是不具有动物血清的培养基。
根据某些实施方案，培养基无动物来源的组分。如本文使用的，关于培养基的术语“无动物来源的组分”指的是不包含任何动物来源的组分的培养基，特别是不包含哺乳动物来源的组分的培养基。
根据某些实施方案，在三维(3D)培养条件下进行培养。3D细胞培养物是一种人工创造的环境，其中生物细胞被允许生长或与其周围细胞相互作用。3D细胞培养允许在体外生长中形成自组装的细胞聚集体或细胞簇，模拟体内最早的发育步骤。根据某些示例性实施方案，3D培养物包括在液体悬浮液中生长的细胞，通常在容器内。
术语“容器”或“组织培养容器”在本文中可互换使用，并指细胞可以在其中悬浮生长的任何容器。容器可以具有各种尺寸，从毫升的范围(例如非黏附板或锥形烧瓶)至几千升的范围(例如生物反应器或培养袋)。
根据某些实施方案，悬浮培养物没有粘附材料和/或支撑基质，并且细胞和/或细胞簇自由悬浮/漂浮在液体中。根据这些实施方案，悬浮培养物保持在具有细胞不粘附的材料壁的容器中。
当细胞在没有任何粘附材料/支持基质的悬浮培养物中生长时，细胞倾向于与其他细胞聚集形成细胞聚集体。细胞聚集体可以是团簇、球状体、类器官等的形式。
根据某些实施方案，培养是在形成粘附单层的条件下进行的，本文也称为“二维(2D)培养”。根据本发明的教导，可以使用已知用于细胞培养的任何粘附基底/支持基质。实例包括涂有粘附物质(例如，灭活的饲养细胞、有机细胞外基质如Matrigel或玻连蛋白，或饲养细胞条件培养基)或水凝胶的生长板。
根据本发明的教导，可以使用来源于本领域已知或将要已知的任何来源的多能干细胞。根据某些实施方案，PSC来源于人类。根据另外的或替代性实施方案，PSC来源于非人类动物。根据某些实施方案，非人类动物选自由以下组成的组：有蹄类动物、家禽、水生动物、无脊椎动物和爬行动物。根据某些实施方案，有蹄类动物选自由以下组成的组：牛科动物、绵羊、山羊、马科动物、猪、长颈鹿、骆驼、鹿、河马或犀牛。每种可能性代表本发明的单独实施方案。根据某些示例性实施方案，有蹄类动物是牛科动物。
根据一些实施方案，PSC是胚胎干细胞(ESC)。
根据一些实施方案，PSC是非胚胎干细胞(ESC)。
根据某些实施方案，PSC是从体细胞重编程的诱导PSC(iPSC)。
根据某些实施方案，PSC是从不包括ESC的体细胞重编程的诱导PSC(iPSC)。
细胞的重编程以产生iPSC可以通过本领域已知的任何方法进行，包括例如Bessi等人,2021.Cells 10(6):1531；Kawaguchi等人,2015.PLoS One 10(8):e0135403；Zhao等人,2021.PNAS118(15):e2018505118；Poleganov等人,Hum.Gene Ther.2015；26:751-766中描述的方法。
根据某些实施方案，PSC(特别是牛PSC)的分离和/或培养，和/或细胞的重编程以产生iPSC，可以通过本发明申请人的国际(PCT)申请公布第WO 2020/230138号中描述的方法进行。
PSC的商业制品，例如，牛科动物来源的PSC的商业制品也是可获得的，包括囊胚来源的PSC。
根据某些实施方案，在接种时，培养基还包含Rho相关蛋白激酶(Rock)的抑制剂。根据本发明的教导，可以使用目前在本领域中已知的或在将来待开发的任何Rock抑制剂。根据某些实施方案，Rock抑制剂选自由以下组成的组：Thiazovivin、法舒地尔(Fasudil)、瑞舒地尔(Ripasudil)、奈舒地尔(Netarsudil)、RKI-1447、Y-27632、GSK429286A、Y30141。每种可能性代表本发明的单独实施方案。根据某些示例性实施方案，Rock抑制剂是Y-27632二盐酸盐(1R,4r)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)环己烷甲酰胺。
根据某些实施方案，多于一个PSC的培养在包含TGF-β信号通路的至少一种活化剂和GSK3信号通路的至少一种抑制剂的组合的培养基中连续进行。
根据某些另外的或替代性实施方案，多于一个PSC的培养以周期进行，其中在每个周期后替换包含TGF-β信号通路的至少一种活化剂和GSK3信号通路的至少一种抑制剂的组合的培养基。在每个周期中，TGF-β信号通路的至少一种活化剂和GSK3信号通路的至少一种抑制剂的组合可以相同或不同。
根据某些实施方案，培养进行使得能够达到多于一个细胞总数中的约10％至约90％为骨骼肌定向祖细胞的时间段。
根据某些实施方案，能够达到多于一个细胞总数中的约10％至约90％为骨骼肌定向祖细胞的时间段为约3天至约7天。根据某些实施方案，时间段为约3天至6天、3天至5天或3天至4天。每种可能性代表本发明的单独实施方案。根据某些实施方案，能够达到多于一个细胞总数中的约10％至约90％为骨骼肌定向祖细胞的时间段为4天。
这种培养的短时间框架，连同使用3D培养的选择，特别是在生物反应器中，是本发明方法相较于迄今已知的用于产生骨骼肌定向祖细胞的方法的显著优势，使得这些方法能够在大规模生产设施中使用，并且特别是它们在食品工业中用于生产人造肉制品，其中必须降低成本以能够替代屠宰肉。
根据某些实施方案，本发明提供了包含如上所述产生的骨骼肌定向祖细胞的多于一个细胞。
根据某些实施方案，多于一个细胞包含占细胞总数的约10％至约90％的骨骼肌定向祖细胞。根据一些实施方案，多于一个细胞包含占细胞总数的约15％至约90％、约25％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约45％至约90％或约50％至约90％的骨骼肌定向祖细胞。
根据又另外的某些实施方案，多于一个细胞还包含至少一个另外的谱系定向祖细胞。根据某些实施方案，谱系定向祖细胞选自由基质定向祖细胞、脂肪细胞定向祖细胞及其组合组成的组。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，多于一个细胞包含占细胞总数的约10％至约90％的基质定向祖细胞。根据某些实施方案，多于一个细胞包含占细胞总数的约10％至约90％的脂肪细胞定向祖细胞。
根据某些实施方案，通过本发明的方法产生的肌肉定向祖细胞包含选自由TBXT、TBX6、MSGN1、Pax3及其任何组合组成的组的至少一种中胚层标志物，并且至少一种早期肌源性标志物是Six1。每种可能性代表本发明的单独实施方案。根据某些实施方案，骨骼肌定向祖细胞的特征在于MSGN1和Six1的表达。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，包含骨骼肌定向祖细胞的多于一个细胞基本上不含PSC。根据一些实施方案，包含骨骼肌定向祖细胞的多于一个细胞不含PSC。
根据某些实施方案，包含骨骼肌定向祖细胞的多于一个细胞是非人类动物的。根据这些实施方案，多于一个细胞从非人类动物PSC产生。非人类动物如上文所描述的。根据某些示例性实施方案，非人类动物是牛科动物。
根据某些实施方案，包含骨骼肌定向祖细胞的多于一个细胞包含至少一种GSK3β抑制性类黄酮或其代谢物。根据某些实施方案，包含骨骼肌定向祖细胞的多于一个细胞包含选自由木犀草素、芹菜素、槲皮素、杨梅素、其代谢物及其任何组合组成的组的至少一种类黄酮。每种可能性代表本发明的单独实施方案。至少一种类黄酮或其代谢物的量可以变化，从一纳摩尔/升至几纳摩尔/升至数百微摩尔/升。根据一些实施方案，至少一种类黄酮或其代谢物的量为1nM至100μM、或1nM至10μM、或1nM至1μM。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些方面，本发明提供了一种产生包含骨骼肌细胞的多于一个分化的细胞的方法，该方法包括：
a)在包含以下组合的培养基中培养多于一个多能干细胞(PSC)：(i)TGF-beta(TGF-β)信号通路的至少一种活化剂和(ii)GSK3信号通路的至少一种抑制剂，从而形成包含骨骼肌定向祖细胞的多于一个细胞；
b)将包含步骤(a)中获得的骨骼肌定向祖细胞的多于一个细胞沉积在粘附材料和/或支撑基质上；并且
c)在促进骨骼肌定向祖细胞向骨骼肌细胞分化的分化培养基中培养所述多于一个细胞，
从而产生包含骨骼肌细胞的多于一个分化的细胞。
PSC、TGF-β信号通路的活化剂、GSK3信号通路的抑制剂和培养基；以及步骤(a)和(b)的过程如上所述。
根据某些实施方案，多于一个培养的PSC不是遗传修饰的。本发明的方法能够产生包含骨骼肌细胞的多于一个分化的细胞，而在整个过程中不进行任何遗传操作。根据这些实施方案，非遗传工程化骨骼肌细胞和包含非遗传工程化骨骼肌细胞的组织在制药和食品工业的某些应用中可以具有优势。
根据某些替代性实施方案，多于一个培养的PSC是遗传修饰的。采用遗传工程化方法可以促进例如从体细胞形成诱导PSC(iPSC)，具有不依赖胚胎干细胞的优点，特别是不需要胚胎哺乳动物干细胞。
如本领域已知或将已知的用于将包含骨骼肌定向祖细胞的多于一个细胞沉积在粘附材料和/或支撑基质上的任何方法都可以与本发明的教导一起使用。
根据某些实施方案，粘附材料选自由灭活的饲养细胞、有机细胞外基质如Matrigel或玻连蛋白或饲养细胞条件培养基组成的组。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，粘附材料或支撑基质的形式是选自由纳米载体、微载体、大载体、支架、组织培养板、组织培养容器等组成的组。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，支撑基质是选自半固体形式和固体形式的形式。
根据某些实施方案，使用如本领域已知的合适的打印机，通过生物打印来进行沉积。根据一些实施方案，生物打印按照国际(PCT)申请公布第WO 2022/162662号中所描述的进行。
根据本发明的教导，可以使用本领域已知或将已知的用于促进肌肉定向祖细胞向骨骼肌细胞的分化的任何分化培养基。有利地，本发明现在公开了，配备有包括例如维生素、无机盐、氨基酸、抗氧化剂、糖等营养物质和某些激素，例如胰岛素的无血清分化培养基足以进行分化，而不需要大量昂贵的生长因子。
根据某些示例性实施方案，分化培养基不含TGF-β信号通路的活化剂并且不含GSK3信号通路的抑制剂。根据另外的示例性实施方案，分化培养基不含活化素A和CHIR99021。
根据某些实施方案，细胞在分化培养基中培养约3天至约27天。根据一些实施方案，细胞在分化培养基中培养约3天至约26天、至约25天、至约24天、至约23天、至约22天、至约21天、至约20天、至约19天、至约18天、至约17天、至约16天、至约15天、至约14天、至约13天、至约12天、至约11天、至约10天、至约9天、至约8天、至约7天或至约6天。每种可能性代表本发明的单独实施方案。根据一些实施方案，细胞在分化培养基中培养约3天至约15天，或约5天至约10天或约6天至约9天。根据一些实施方案，细胞在分化培养基中培养约7天。
至于获得根据本发明的骨骼肌定向祖细胞所需的时间，与迄今为止已知的方法相比，将祖细胞分化为肌细胞的时间也减少了。根据某些实施方案，获得包含肌细胞的工程化组织的整个周期为约6天至约30天。根据某些实施方案，获得包含肌细胞的工程化组织的整个周期为约7天至约25天、约8天至约24天、约9天至约23天、约10天至约22天、约10天至约21天、约10天至约20天、约10天至约19天、约10天至约18天、约10天至约17天、约10天至约16天或约10天至约15天。
根据某些实施方案，获得包含肌细胞的工程化组织的整个周期为约11天至约14天。
在包含肌细胞的工程化组织的大规模产生中，这种最多约30天(通常为11-14天)的总体时间周期是非常有利的。
根据某些实施方案，沉积在粘附材料和/或支撑基质上的多于一个细胞还包含至少一种另外的谱系定向祖细胞。根据一些实施方案，谱系定向祖细胞选自基质定向祖细胞、脂肪细胞定向祖细胞及其组合。每种可能性代表本发明的单独实施方案。根据这些实施方案，形成的多于一个细胞还包含基质细胞和脂肪细胞中的至少一种。
根据一些实施方案，基质细胞是产生细胞外基质(ECM)的细胞。
根据某些实施方案，本发明的方法还包括从粘附材料和/或支撑基质中分离多于一个分化的细胞，该分化的细胞包含肌细胞和任选的基质细胞和脂肪细胞中的至少一种。
根据某些实施方案，本发明还提供了多于一个分化的细胞，包含通过本发明的方法产生的分化的骨骼肌细胞。
根据某些实施方案，通过本发明的方法产生的分化的骨骼肌细胞的特征在于表达至少一种选自由以下组成的组的肌源性标志物：Myf5、Pax7、MEF2C、SIX1、NYOD1、MYOG、MYH3、MYH7、NYH8、MB、MYMK及其任何组合。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，多于一个分化的细胞包含占细胞总数的约10％至约90％的骨骼肌细胞。根据一些实施方案，多于一个分化的细胞包含占细胞总数的约15％至约90％、约25％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约45％至约90％或约50％至约90％的骨骼肌细胞。根据某些实施方案，多于一个分化的细胞包含占细胞总数的约30％的骨骼肌细胞。
根据某些实施方案，骨骼肌细胞是存活的细胞。
根据某些实施方案，多于一个分化的细胞包含占细胞总数的约10％至约90％的基质细胞。根据一些实施方案，多于一个分化的细胞包含占细胞总数的约15％至约90％、约25％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约45％至约90％或约50％至约90％的基质细胞。根据某些实施方案，基质细胞是存活的细胞。
根据某些实施方案，多于一个分化的细胞包含占细胞总数的约10％至约90％的脂肪细胞。根据一些实施方案，多于一个分化的细胞包含占细胞总数的约15％至约90％、约25％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约45％至约90％或约50％至约90％的脂肪细胞。根据某些实施方案，脂肪细胞是存活的细胞。
根据某些实施方案，多于一个分化的细胞包含可检测量的至少一种如上所述的GSK3β抑制性类黄酮或其代谢物。
根据某些实施方案，包含肌细胞和任选的基质细胞和脂肪细胞中的至少一种的多于一个分化的细胞形成工程化组织。根据某些实施方案，工程化组织包含用于生产多于一个分化的细胞的粘附材料和/或支撑基质。根据某些另外的或替代性实施方案，工程化组织没有用于生产多于一个分化的细胞的粘附材料和/或支撑基质。
根据又一另外的某些方面，本发明提供了多于一个包含骨骼肌定向祖细胞的在体外生长的细胞，其中骨骼肌定向祖细胞的特征在于表达至少一种中胚层标志物和/或至少一种早期肌源性标志物。
根据某些实施方案，至少一种中胚层标志物选自由TBXT、TBX6、MSGN1、Pax3及其任何组合组成的组，并且至少一种早期肌源性标志物为Six1。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，骨骼肌定向祖细胞的特征在于表达MSGN1和Six1。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，包含骨骼肌定向祖细胞的多于一个在体外生长的细胞还包含选自由基质定向祖细胞、脂肪细胞定向祖细胞及其组合组成的组的至少一种另外的谱系定向细胞。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，包含骨骼肌定向祖细胞的多于一个在体外生长的细胞包含至少一种GSK3β抑制性类黄酮和/或其代谢物。类黄酮和量如上所述。
根据另外的某些方面，本发明提供了多于一个包含分化的骨骼肌细胞的在体外生长的分化的细胞，其中分化的骨骼肌细胞的特征在于表达至少一种肌源性标志物。
根据某些实施方案，至少一种肌源性标志物选自由Myf5、Pax7、MEF2C、SIX1、NYOD1、MYOG、MYH3、MYH7、NYH8、MB、MYMK及其任何组合组成的组。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，多于一个在体外生长的分化的细胞还包含基质细胞、脂肪细胞或其组合中的至少一种。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
根据某些实施方案，基质细胞是产生细胞外基质(ECM)的细胞。
根据某些实施方案，在多于一个在体外生长的分化的细胞范围内的细胞是非人类动物细胞。
本发明还涵盖一种工程化组织，该工程化组织包含含有骨骼肌细胞的多于一个在体外生长的分化的细胞。
通过本发明的方法生产的肌肉定向祖细胞、多于一个分化的细胞和包含这些细胞的工程化组织适合于多种用途，包括治疗应用和用作食物物质。
如上所述，要使用的培养基、用于获得包含骨骼肌细胞的多于一个分化的细胞所需的时间和总体功效使得本发明的方法非常适合用于食品工业，特别是在生产细胞培养肉的技术中。因此，本发明具体涵盖包含本发明的骨骼肌细胞和/或包含骨骼肌细胞的工程化组织的人造肉和人造肉制品。
根据这些实施方案，工程化组织或人造食品制品任选地还包含至少一种植物蛋白。根据某些实施方案，工程化组织和/或人造肉还包含至少一种另外的食品安全的补充剂。合适的另外的补充剂包括但不限于饱和脂肪酸和/或不饱和脂肪酸；脂质；调味剂；着色剂；调质剂(texturant)；可食用纤维；等等。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
以下实施例被呈现以更充分地说明本发明的一些实施方案。然而，其绝不应以任何方式被解释为限制本发明的宽范围。本领域技术人员可以容易地设想本文公开的原理的许多变化形式和修改，而不背离本发明的范围。
实施例
材料和方法
RNA提取和RT-PCR分析：
对于基因表达分析，使用RNA纯化试剂盒(Macherey-Nagel)从牛多能干细胞、牛定向细胞和骨骼肌细胞中提取RNA，并使用Nanodrop One C(ThermoFisher)确定RNA浓度。使用ReverseAid第一链cDNA合成试剂盒(ThermoFisher)，使用Thermal CyclerSimpliAmp装置(ThermoFisher)对纯化的RNA进行逆转录。使用TaqMan Fast AdvancedMaster Mix(ThermoFisher)和后续表1中列出的引物列表，使用QuantStudio 5实时PCR装置(ThermoFisher)对cDNA进行RT-PCR分析。
表1：用于多能性、定向性和肌源性标志物扩增的引物和探针
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免疫荧光
将2D培养物中的牛骨骼肌细胞经受如下免疫荧光分析：使用4％多聚甲醛(PFA；Santa Cruz Biotechnology)对细胞进行固定，使用0.5％ Triton X-100(Sigma)进行透化，并使用5％BSA(MP biomedicals)进行封闭。将细胞与第一抗体抗肌球蛋白MF-20(DSHB)1:75一起孵育，然后与第二山羊抗小鼠IgG(H&L Alexa594)抗体(Abcam ab150116)1:500一起孵育。使用0.5μg/mL的DAPI(Sigma)对细胞核进行染色。使用EVOS FL Auto 2荧光显微术(ThermoFisher)进行成像。
实施例1：多于一个骨骼肌定向细胞的产生
将牛多能干细胞(PSC)在2D或3D培养物中生长。将细胞收获、解离并重悬于无血清生长培养基中作为对照，或重悬于含有活化素A(20ng/ml)和CHIR-99021(10μM)的无血清生长培养基(骨骼肌前体培养基)中持续4天。在对照和测定两个条件下，在第一天的生长期间中加入Rock抑制剂(10μM)。图1示出了4天后从牛PSC中获得的骨骼肌定向祖细胞的代表性明场图像。
4天后，收获细胞，并如上所述进行RT-PCR分析，以检查中胚层标志物TBXT、TBX6、MSGN1和Pax3的表达；以及早期肌源性标志物Six1的表达。
如图2中所示，观察到多能标志物OCT4和Nanog的表达显著减少，并且中胚层标志物TBXT、TBX6、MSGN1和Pax3以及早期肌源性标志物Six1的表达显著增加(与PSC相比超过10倍)。在这个早期时间点，完全分化的肌肉卫星标志物Myf5和Pax7的上调并不显著。
这些结果清楚地表明，在补充有TGF-β活化剂(活化素A)和GSK3抑制剂(CHIR-99021)组合的基础无血清培养基中培养PSC，特别是培养牛PSC诱导了向骨骼肌细胞的分化过程。在大约4天的相对较短的时间后，细胞以将细胞鉴定为骨骼肌定向细胞的水平表达中胚层标志物和早期肌源性标志物。
实施例2：牛多能干细胞向骨骼肌细胞的分化
将牛多能干细胞(PSC)在2D和/或3D培养物中生长。将细胞解离，重悬于含有活化素A(20ng/ml)和CHIR99021(10μM)的无血清生长培养基(骨骼肌前体培养基)中；重悬于仅含CHIR99021(10μM)的相同的无血清生长培养基中；或重悬于含有TGFβ(2ng/ml)和CHIR-99021(10μM)的相同的无血清生长培养基中，并在悬浮培养条件下培养。向所有培养基类型中添加Rock抑制剂(RI，10μM)。
悬浮培养条件(“3D培养条件”)包括置于38.5℃、5％ CO2和湿度>75％的处于转动状态的超低粘附(ULA)6孔板(Corning)。使用骨骼肌前体培养基(不含RI)更新培养基，并允许形成的聚集体进行总共4天的分化。
收集包含骨骼肌定向细胞的聚集体，并接种在无血清生长培养基中的组织培养玻连蛋白(0.005mg/ml)预包被平板(“2D条件”)中。对于另外的7天(总共进行11天)，将平板置于38.5℃、5％ CO2和湿度>75％孵育；在第1天和第3天更换培养基(不含RI)。
肌球蛋白重链的代表性免疫荧光染色(使用如上所述的MF-20抗体)在总共11天的分化后表明了在经受含有活化素A和CHIR-99021组合的培养基的培养物中存在骨骼肌细胞(图3B)，并且在稍微较小程度上在经受含有TGFβ、TGF-beta(TGF-β)信号通路的另外的活化剂和CHIR-99021组合的培养基的培养物中存在骨骼肌细胞(图3C)。相反，在经受仅含有CHIR-99021的培养基中的培养物中没有观察到肌球蛋白阳性细胞(图3A)。
在总共11天的分化后，通过对肌源性标志物Myf5、Pax7、Mef2C、Six1、MyoD1、MyoG、MYH3、MYH7、MYH8、肌红蛋白(MB)和Myomaker(MYMK)的RT-PCR分析进一步支持了这些结果。所有标志物都上调，表明向骨骼肌分化(图4)。
在另外的实验中，将PSC重悬于含有活化素A(20ng/ml)和CHIR99021(10μM)的无血清生长培养基中，并在2D培养条件下，将组织培养板放置在38.5℃、5％ CO2和湿度>75％培养。使用骨骼肌前体培养基(不含RI)更新培养基，并允许形成的聚集体进行总共4天的分化。4天后，收集包含骨骼肌定向细胞的细胞，并接种在2D培养条件中，如对从上述3D培养条件中获得的聚集体所描述的。图3D示出了在定向诱导阶段，关于定向细胞向骨骼肌细胞的进一步分化，在2D或3D培养条件下培养PSC之间没有显著差异。
以上具体实施方案的描述将如此完全地揭示本发明的一般性质，使得其他人可以通过应用现有的知识，容易地为各种应用修改和/或调整这样的具体实施方案而不需要过度实验且不背离一般概念，且因此，这样的调整和修改应当并且预期被包含在所公开的实施方案的等效物的含义和范围内。应理解的是，本文使用的措辞或术语是为了描述而非限制的目的。用于进行多种所公开的功能的方法、材料和步骤可以采取多种替代形式而不背离本发明。

Claims (59)

1.一种产生包含骨骼肌定向祖细胞的多于一个细胞的方法，所述方法包括在包含以下组合的培养基中培养多于一个多能干细胞(PSC)：(i)TGF-beta(TGF-β)信号通路的至少一种活化剂和(ii)GSK3信号通路的至少一种抑制剂；从而产生包含骨骼肌定向祖细胞的多于一个细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基是无血清培养基。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中培养在三维(3D)培养条件下进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述3D培养是悬浮培养。
5.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述3D培养不含粘附材料和/或支撑基质。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞自组装以形成至少一个细胞聚集体。
7.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述3D培养包含至少一种粘附材料和/或支撑基质。
8.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中培养在包含至少一种粘附材料和/或支撑基质的二维(2D)培养条件下进行。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述TGF-β信号通路的至少一种活化剂选自由以下组成的组：活化素A、TGF-β、BMP2、BMP7、GDF9、NODAL及其任何组合。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述GSK3信号通路的至少一种抑制剂选自由以下组成的组：CHIR-99021(C22H18Cl2N8)或其盐、SB 216763、LY2090314、TWS119、Tideglusib、GSK-3β抑制剂1、GSK-3β抑制剂2、GSK-3β抑制剂3、AR-A014418、TDZD-8、肯帕罗酮、GSK3抑制剂IX、色甘酸钠、CHIR-98014、AZD1080、SB 415286、IM-12、9-ING-41、靛玉红-3’-一肟、1-氮杂肯帕罗酮、BRD0705、AZD2858、CP21R7、BIO-丙酮肟、Bikinin、VP3.15、VP3.15二氢溴化物、GNF4877、KY19382、SAR502250、A 1070722、(R)-BRD3731、BRD3731、BIP-135、5-碘代-靛玉红-3’-一肟、BRD5648、GSK-3抑制剂1、GSK-3/CDK5/CDK2-IN-1、靛玉红-3’-一肟-5-磺酸、GSK3β抑制性类黄酮、锂，以及它们的任何组合。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述CHIR-99021盐选自由CHIR-99021一盐酸盐、CHIR-99021三盐酸盐及其任何组合组成的组。
12.根据权利要求10-11中任一项所述的方法，其中所述GSK3β抑制性类黄酮选自由木犀草素、芹菜素、槲皮素、杨梅素及其任何组合组成的组。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述培养基除活化TGF-β途径的生长因子外，不含其他生长因子。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述培养基不含bFGF。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述组合包含活化素A和CHIR-99021。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述组合由活化素A和CHIR-99021组成。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中培养进行使得能够达到所述多于一个细胞的总数中约10％至约90％为骨骼肌定向祖细胞的时间段。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述多于一个PSC的培养在包含TGF-β信号通路的至少一种活化剂和GSK3信号通路的至少一种抑制剂的组合的所述培养基中连续进行。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述多于一个PSC的培养以周期进行，其中在每个周期后替换包含TGF-β信号通路的至少一种活化剂和GSK3信号通路的至少一种抑制剂的组合的所述培养基。
20.根据权利要求19所述的方法，其中在每个周期中，TGF-β信号通路的至少一种活化剂和GSK3信号通路的至少一种抑制剂的所述组合是相同的组合或不同的组合。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所产生的多于一个细胞还包含至少一个另外的谱系定向祖细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述另外的谱系定向祖细胞选自由基质定向祖细胞、脂肪细胞定向祖细胞及其组合组成的组。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述PSC选自由诱导PSC(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)和非胚胎干细胞(ESC)组成的组。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述PSC的来源选自由非人类动物和人类组成的组。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述非人类动物选自由有蹄类动物、家禽、水生动物、无脊椎动物和爬行动物组成的组。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述有蹄类动物选自由牛科动物、绵羊、山羊、水牛、马科动物、猪、长颈鹿、骆驼、鹿、河马或犀牛组成的组。
27.一种产生包含骨骼肌细胞的多于一个分化的细胞的方法，所述方法包括：
a.将包含通过权利要求1-26中任一项所述的方法产生的骨骼肌定向祖细胞的所述多于一个细胞沉积在粘附材料和/或支撑基质上；和
b.在促进所述骨骼肌定向祖细胞向骨骼肌细胞分化的分化培养基中培养所述多于一个细胞，
从而产生包含骨骼肌细胞的多于一个分化的细胞。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述分化培养基不含TGF-β信号通路的活化剂和GSK3信号通路的抑制剂。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述分化培养基不含活化素A和CHIR-99021。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中从PSC获得所述包含骨骼肌细胞的多于一个分化的细胞的整个周期为约6天至约30天。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述多于一个分化的细胞包含占细胞总数的约10％至约90％的骨骼肌细胞。
32.根据权利要求27-31中任一项所述的方法，其中所述多于一个分化的细胞还包含选自由基质细胞和脂肪细胞组成的组的至少一种另外的细胞类型。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述基质细胞是产生细胞外基质(ECM)的细胞。
34.根据权利要求27-33中任一项所述的方法，其中所述包含骨骼肌细胞的多于一个分化的细胞形成工程化组织。
35.多于一个细胞，包含通过权利要求1-26中任一项所述的方法产生的骨骼肌定向祖细胞。
36.根据权利要求35所述的多于一个细胞，其中所述多于一个细胞基本上不含PSC。
37.根据权利要求35-36中任一项所述的多于一个细胞，其中所述骨骼肌定向祖细胞的特征在于表达至少一种中胚层标志物和/或至少一种早期肌源性标志物。
38.根据权利要求35-37中任一项所述的多于一个细胞，其中所述骨骼肌定向祖细胞从非人类动物PSC产生。
39.根据权利要求38所述的多于一个细胞，其中所述骨骼肌定向祖细胞从牛PSC产生。
40.多于一个分化的细胞，包含通过权利要求27-33中任一项所述的方法产生的骨骼肌细胞。
41.根据权利要求40所述的多于一个分化的细胞，其中所述骨骼肌细胞从牛PSC分化而来。
42.根据权利要求40-41中任一项所述的多于一个分化的细胞，其中所述多于一个分化的细胞还包含选自由基质细胞、脂肪细胞及其组合组成的组的至少一种类型的细胞。
43.根据权利要求42所述的多于一个分化的细胞，其中所述基质细胞包含产生胶原的细胞。
44.一种工程化组织，包含根据权利要求40-43中任一项所述的多于一个细胞。
45.一种人造食品制品，包含根据权利要求41-43中任一项所述的多于一个分化的细胞和/或包含所述多于一个分化的细胞的工程化组织。
46.根据权利要求45所述的人造食品制品，其中所述人造食品制品是人造肉。
47.多于一个在体外生长的细胞，所述多于一个在体外生长的细胞包含骨骼肌定向祖细胞，其中所述骨骼肌定向祖细胞的特征在于表达至少一种中胚层标志物和/或至少一种早期肌源性标志物。
48.根据权利要求47所述的多于一个在体外生长的细胞，其中所述至少一种中胚层标志物选自由TBXT、TBX6、MSGN1、Pax3及其任何组合组成的组，并且所述至少一种早期肌源性标志物为Six1。
49.根据权利要求47-48中任一项所述的多于一个在体外生长的细胞，其中所述骨骼肌定向祖细胞的特征在于表达MSGN1和Six1。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的多于一个在体外生长的细胞，其中所述多于一个细胞还包含至少一种选自由基质定向祖细胞、脂肪细胞定向祖细胞及其组合组成的组的另外的谱系定向细胞。
51.根据权利要求47-50中任一项所述的多于一个在体外生长的细胞，其中所述多于一个细胞包含至少一种GSK3β抑制性类黄酮和/或其代谢物。
52.多于一个在体外生长的分化的细胞，所述多于一个在体外生长的分化的细胞包含骨骼肌细胞，其中所述骨骼肌细胞的特征在于表达至少一种肌源性标志物。
53.根据权利要求52所述的多于一个在体外生长的分化的细胞，其中所述至少一种肌源性标志物选自由Myf5、Pax7、MEF2C、SIX1、NYOD1、MYOG、MYH3、MYH7、NYH8、MB、MYMK及其任何组合组成的组。
54.根据权利要求52-53中任一项所述的多于一个在体外生长的分化的细胞，其中所述多于一个细胞还包含基质细胞、脂肪细胞或其组合中的至少一种。
55.根据权利要求54所述的多于一个在体外生长的分化的细胞，其中所述基质细胞是产生细胞外基质(ECM)的细胞。
56.根据权利要求52-55中任一项所述的多于一个在体外生长的分化的细胞，其中所述细胞是非人类动物细胞。
57.一种工程化组织，包含根据权利要求52-56中任一项所述的多于一个在体外生长的分化的细胞。
58.一种人造食品制品，包含根据权利要求56中所述的多于一个在体外生长的分化的细胞和/或包含所述多于一个在体外生长的分化的细胞的工程化组织。
59.根据权利要求58中所述的人造食品制品，其中所述人造食品制品是人造肉。
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