JP6886195B2 - 体細胞を製造する方法、体細胞、及び組成物 - Google Patents

Description

本発明は、体細胞を製造する方法に関するものである。本発明はさらに、当該体細胞、及び当該体細胞を製造する方法のために使用することができる組成物に関するものである。
本発明に係る製造方法により製造される体細胞は、具体的には、褐色脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、又は心筋細胞である。

近年の細胞関連研究の発展、特に多能性細胞に関する研究の発展により、治療用細胞を個体への移植に利用可能な品質及び量において入手することが可能になりつつある。幾つかの疾患については、治療に有効な細胞を患者に移植する試みが開始されている。

間葉系の細胞は、筋肉、骨、軟骨、骨髄、脂肪及び結合組織等の生体の各種器官を形成しており、再生医療の材料として有望である。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）は、骨髄、脂肪組織、血液、胎盤及び臍帯等の組織に存在する未分化細胞である。間葉系に属す細胞への分化能を有しているため、間葉系幹細胞は、それらの細胞を製造する際の出発材料として注目されている。また、間葉系幹細胞自体を骨、軟骨、心筋等の再構築に利用する再生医療も検討されている。

一方、線維芽細胞のような体細胞を直接他の細胞に転換する方法も報告されている。例えば、線維芽細胞を化学物質と共に培養することにより神経細胞を得ることが知られている（非特許文献１）。

Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１５年，５６巻，３号，１６６−１７０頁

非特許文献１に記載されている方法のように、遺伝子導入を行うことなく体細胞から所望の細胞への転換を行う方法は、治療用細胞を取得する手段として有効な選択肢となる場合がある。本発明は、人為的な遺伝子導入を行うことなく、体細胞から褐色脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、若しくは心筋細胞を製造する方法；褐色脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、若しくは心筋細胞；又は前記製造方法のために使用することができる、化学物質の組み合わせを含む組成物を提供することを解決することを主な課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、一定の阻害剤ないし活性化剤の存在下ないし非存在下で体細胞を培養することによって、体細胞を褐色脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、又は心筋細胞に転換できることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。

本発明として、例えば、下記のものを挙げることができる。
［１］ＡＬＫ５阻害剤の存在下、かつ、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程ａを含む、褐色脂肪細胞を製造する方法。
［２］上記工程ａが、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
［３］上記工程ａが、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの活性化剤及び／又は阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］又は［２］に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
［４］上記工程ａが、下記の何れかの存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］から［３］の何れか一項に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
（１）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（２）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤；
（３）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（４）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（５）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤；
（６）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤。
［５］ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養することが、ドルソモルフィンの存在下で体細胞を培養することである、上記［１］から［４］の何れか一項に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
［６］ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養することが、ＬＤＮ１９３１８９及び／又はドルソモルフィンの存在下で体細胞を培養することである、上記［３］又は［４］に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
［７］上記工程ａが、ｐ５３阻害剤の非存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］から［６］の何れか一項に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
［８］上記工程ａが、ヒストンに関与する成分の非存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］から［７］の何れか一項に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
［９］上記体細胞が線維芽細胞である、上記［１］から［８］の何れか一項に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
［１０］上記［１］から［９］の何れか一項に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法により製造される褐色脂肪細胞。

［１１］ＡＬＫ５阻害剤と、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤とを含む、組成物。
［１２］ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤を含む、上記［１１］に記載の組成物。
［１３］ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの活性化剤及び／又は阻害剤をさらに含む、上記［１１］又は［１２］に記載の組成物。
［１４］下記の何れかの組み合わせを含む、上記［１１］から［１３］の何れか一項に記載の組成物。
（１）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（２）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤；
（３）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（４）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（５）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤；
（６）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤。
［１５］ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤が、ドルソモルフィンである、上記［１１］から［１４］の何れか一項に記載の組成物。
［１６］ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤から選択される少なくとも一つの阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９及び／又はドルソモルフィンである、上記［１３］又は［１４］に記載の組成物。
［１７］体細胞から褐色脂肪細胞を製造するための組成物である、上記［１１］から［１６］の何れか一項に記載の組成物。

［１８］（１）Ｅｒｋ阻害剤、（２）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（３）ＡＬＫ５阻害剤、（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、並びに（５）ｃＡＭＰ活性化剤からなる５群から選択される少なくとも一つの存在下で体細胞を培養する工程ｂを含む、褐色脂肪細胞を製造する方法。
［１９］上記工程ｂが、（１）Ｅｒｋ阻害剤、（２）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（３）ＡＬＫ５阻害剤、（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、並びに（５）ｃＡＭＰ活性化剤からなる５群から選択される少なくとも二つの存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１８］に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
［２０］上記工程ｂが、下記の何れかの存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１８］又は［１９］に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
（ｉ）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤と、ｃＡＭＰ活性化剤；
（ｉｉ）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤と、Ｅｒｋ阻害剤；
（ｉｉｉ）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤と、ＡＬＫ５阻害剤；
（ｉｖ）ｃＡＭＰ活性化剤と、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤；
（ｖ）ｃＡＭＰ活性化剤と、Ｅｒｋ阻害剤；
（ｖｉ）ｃＡＭＰ活性化剤と、ＡＬＫ５阻害剤；
（ｖｉｉ）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤と、ＡＬＫ５阻害剤；並びに
（ｖｉｉｉ）Ｅｒｋ阻害剤と、ＡＬＫ５阻害剤。
［２１］上記工程ｂが、（１）Ｅｒｋ阻害剤、（２）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（３）ＡＬＫ５阻害剤、（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、並びに（５）ｃＡＭＰ活性化剤からなる５群から選択される少なくとも三つの存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１８］又は［１９］に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
［２２］上記工程ｂが、（１）Ｅｒｋ阻害剤、（２）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（３）ＡＬＫ５阻害剤、（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、並びに（５）ｃＡＭＰ活性化剤からなる５群から選択される少なくとも四つの存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１８］、［１９］及び［２１］の何れか一項に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
［２３］（１）Ｅｒｋ阻害剤、（２）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（３）ＡＬＫ５阻害剤、（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（５）ｃＡＭＰ活性化剤、並びに（６）ＧＳＫ３阻害剤からなる６群から選択される少なくとも五つの存在下で体細胞を培養する工程ｂを含む、褐色脂肪細胞を製造する方法。
［２４］ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤の存在下で体細胞を培養することが、ドルソモルフィンの存在下、又はドルソモルフィン及びＬＤＮ１９３１８９の存在下で体細胞を培養することである、上記［１８］から［２３］の何れか一項に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
［２５］上記工程ｂが、ｐ５３阻害剤の非存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１８］から［２４］の何れか一項に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
［２６］上記工程ｂが、ヒストンに関与する成分の非存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１８］から［２５］の何れか一項に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
［２７］上記体細胞が線維芽細胞である、上記［１８］から［２６］の何れか一項に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
［２８］上記［１８］から［２７］の何れか一項に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法により製造される褐色脂肪細胞。

［２９］（１）Ｅｒｋ阻害剤、（２）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（３）ＡＬＫ５阻害剤、（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、並びに（５）ｃＡＭＰ活性化剤からなる５群から選択される少なくとも一つを含む、体細胞から褐色脂肪細胞を製造するための組成物。
［３０］（１）Ｅｒｋ阻害剤、（２）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（３）ＡＬＫ５阻害剤、（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、並びに（５）ｃＡＭＰ活性化剤からなる５群から選択される少なくとも二つを含む、上記［２９］に記載の体細胞から褐色脂肪細胞を製造するための組成物。
［３１］下記の何れかを含む、上記［２９］又は［３０］に記載の体細胞から褐色脂肪細胞を製造するための組成物。
（ｉ）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤と、ｃＡＭＰ活性化剤；
（ｉｉ）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤と、Ｅｒｋ阻害剤；
（ｉｉｉ）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤と、ＡＬＫ５阻害剤；
（ｉｖ）ｃＡＭＰ活性化剤と、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤；
（ｖ）ｃＡＭＰ活性化剤と、Ｅｒｋ阻害剤；
（ｖｉ）ｃＡＭＰ活性化剤と、ＡＬＫ５阻害剤；
（ｖｉｉ）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤と、ＡＬＫ５阻害剤；並びに
（ｖｉｉｉ）Ｅｒｋ阻害剤と、ＡＬＫ５阻害剤。
［３２］（１）Ｅｒｋ阻害剤、（２）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（３）ＡＬＫ５阻害剤、（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、並びに（５）ｃＡＭＰ活性化剤からなる５群から選択される少なくとも三つを含む、上記［２９］又は［３０］に記載の体細胞から褐色脂肪細胞を製造するための組成物。
［３３］（１）Ｅｒｋ阻害剤、（２）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（３）ＡＬＫ５阻害剤、（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、並びに（５）ｃＡＭＰ活性化剤からなる５群から選択される少なくとも四つを含む、上記［２９］、［３０］及び［３２］の何れか一項に記載の褐色脂肪細胞を製造するための組成物。
［３４］（１）Ｅｒｋ阻害剤、（２）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（３）ＡＬＫ５阻害剤、（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（５）ｃＡＭＰ活性化剤、並びに（６）ＧＳＫ３阻害剤からなる６群から選択される少なくとも五つを含む、褐色脂肪細胞を製造するための組成物。
［３５］ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤が、ドルソモルフィンであるか、又はドルソモルフィン及びＬＤＮ１９３１８９である、上記［２９］から［３４］の何れか一項に記載の体細胞から褐色脂肪細胞を製造するための組成物。

［３６］ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下、ｃＡＭＰ活性化剤の存在下、かつＥｒｋ阻害剤の非存在下で体細胞を培養する工程ｃを含む骨芽細胞を製造する方法。
［３７］上記工程ｃが、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［３６］に記載の骨芽細胞を製造する方法。
［３８］上記工程ｃが、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤下で体細胞を培養する工程である、上記［３６］又は［３７］に記載の骨芽細胞を製造する方法。
［３９］上記工程ｃが、下記の何れかの存在下で体細胞を培養する工程である、上記［３６］から［３８］の何れか一項に記載の骨芽細胞を製造する方法。
（１）ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤及びｃＡＭＰ活性化剤の存在下、かつＥｒｋ阻害剤の非存在下；
（２）ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びｃＡＭＰ活性化剤の存在下、かつＥｒｋ阻害剤の非存在下。
［４０］ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤の存在下で体細胞を培養することが、ＬＤＮ１９３１８９及び／又はドルソモルフィンの存在下で体細胞を培養することである、上記［３７］又は［３９］に記載の骨芽細胞を製造する方法。
［４１］ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養することが、ドルソモルフィンの存在下で体細胞を培養することである、上記［３８］に記載の骨芽細胞を製造する方法。
［４２］上記工程ｃが、ｐ５３阻害剤の非存在下で体細胞を培養する工程である、上記［３６］から［４１］の何れか一項に記載の骨芽細胞を製造する方法。
［４３］上記工程ｃが、成長因子及び／又はサイトカインの非存在下で体細胞を培養する工程である、上記［３６］から［４２］の何れか一項に記載の骨芽細胞を製造する方法。
［４４］上記工程ｃが、ヒストンに関与する成分の非存在下で体細胞を培養する工程である、上記［３６］から［４３］の何れか一項に記載の骨芽細胞を製造する方法。
［４５］上記体細胞が線維芽細胞である、上記［３６］から［４４］の何れか一項に記載の骨芽細胞を製造する方法。
［４６］上記［３６］から［４５］の何れか一項に記載の骨芽細胞を製造する方法により製造される骨芽細胞。

［４７］ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤、及びｃＡＭＰ活性化剤を含む、組成物。
［４８］少なくともＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤を含む、上記［４７］に記載の組成物。
［４９］ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤をさらに含む、上記［４７］又は［４８］に記載の組成物。
［５０］下記の何れかの組み合わせを含む、上記［４７］又は［４８］に記載の組成物。
（１）ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤及びｃＡＭＰ活性化剤；
（２）ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びｃＡＭＰ活性化剤。
［５１］ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９及び／又はドルソモルフィンである、上記［４８］又は［５０］に記載の組成物。
［５２］ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤が、ドルソモルフィンである、上記［４９］に記載の組成物。
［５３］体細胞から骨芽細胞を製造するための組成物である、上記［４７］から［５２］の何れか一項に記載の組成物。

［５４］ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下、Ｅｒｋ阻害剤の非存在下、かつＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の非存在下で体細胞を培養する工程ｄを含む、軟骨細胞を製造する方法。
［５５］上記工程ｄが、少なくともＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［５４］に記載の軟骨細胞を製造する方法。
［５６］上記工程ｄが、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤の存在下、Ｅｒｋ阻害剤の非存在下、かつＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤の非存在下で体細胞を培養する工程である、上記［５４］又は［５５］に記載の軟骨細胞を製造する方法。
［５７］ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤の存在下で体細胞を培養することが、ＬＤＮ１９３１８９の存在下で体細胞を培養することである、上記［５５］又は［５６］に記載の軟骨細胞を製造する方法。
［５８］上記工程ｄが、ｐ５３阻害剤の非存在下で体細胞を培養する工程である、上記［５４］から［５７］の何れか一項に記載の軟骨細胞を製造する方法。
［５９］上記工程ｄが、ヒストンに関与する成分の非存在下で体細胞を培養する工程である、上記［５４］から［５８］の何れか一項に記載の軟骨細胞を製造する方法。
［６０］上記体細胞が線維芽細胞である、上記［５４］から［５９］の何れか一項に記載の軟骨細胞を製造する方法。
［６１］上記［５４］から［６０］の何れか一項に記載の軟骨細胞を製造する方法により製造される軟骨細胞。

［６２］ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤を含む、体細胞から軟骨細胞を製造するための組成物。
［６３］少なくともＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤を含む、上記［６２］に記載の組成物。
［６４］ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含む、組成物。
［６５］ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９である、上記［６３］又は［６４］に記載の組成物。
［６６］体細胞から軟骨細胞を製造するための組成物である、上記［６４］又は［６５］に記載の組成物。

［６７］ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程ｅを含む、神経系細胞を製造する方法。
［６８］上記工程ｅが、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［６７］に記載の神経系細胞を製造する方法。
［６９］上記工程ｅが、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの活性化剤及び／又は阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［６７］又は［６８］に記載の神経系細胞を製造する方法。
［７０］上記工程ｅが、下記の何れかの存在下で体細胞を培養する工程である、上記［６７］から［６９］の何れか一項に記載の神経系細胞を製造する方法。
（１）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（２）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（３）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、及びＥｒｋ阻害剤；
（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤。
［７１］ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養することが、ドルソモルフィンの存在下で体細胞を培養することである、上記［６７］から［７０］の何れか一項に記載の神経系細胞を製造する方法。
［７２］ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養することが、ＬＤＮ１９３１８９及び／又はドルソモルフィンの存在下で体細胞を培養することである、上記［６９］に記載の神経系細胞を製造する方法。
［７３］上記工程ｅが、ｐ５３阻害剤の非存在下で体細胞を培養する工程である、上記［６７］から［７２］の何れか一項に記載の神経系細胞を製造する方法。
［７４］上記工程ｅが、成長因子及び／又はサイトカインの非存在下で体細胞を培養する工程である、上記［６７］から［７３］の何れか一項に記載の神経系細胞を製造する方法。
［７５］上記工程ｅが、ヒストンに関与する成分の非存在下で体細胞を培養する工程である、上記［６７］から［７４］の何れか一項に記載の神経系細胞を製造する方法。
［７６］上記体細胞が線維芽細胞である、上記［６７］から［７５］の何れか一項に記載の神経系細胞を製造する方法。
［７７］上記［６７］から［７６］の何れか一項に記載の神経系細胞を製造する方法により製造される神経系細胞。

［７８］ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤を含む、体細胞から神経系細胞を製造するための組成物。
［７９］ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤を含む、体細胞から神経系細胞を製造するための組成物。
［８０］ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤、並びにｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの活性化剤及び／又は阻害剤を含む、組成物。
［８１］下記の何れかの組み合わせを含む、上記［８０］に記載の組成物。
（１）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（２）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（３）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、及びＥｒｋ阻害剤；
（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤。
［８２］ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤が、ドルソモルフィンである、上記［８１］に記載の組成物。
［８３］ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９及び／又はドルソモルフィンである、上記［８１］に記載の組成物。
［８４］体細胞から神経系細胞を製造するための組成物である、上記［８０］から［８３］の何れか一項に記載の組成物。

［８５］ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下、かつｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＥｒｋ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程ｆを含む、心筋細胞を製造する方法。
［８６］上記工程ｆが、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤の存在下、かつｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＥｒｋ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［８５］に記載の心筋細胞を製造する方法。
［８７］上記工程ｆが、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［８５］又は［８６］に記載の心筋細胞を製造する方法。
［８８］上記工程ｆが、ＧＳＫ３阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［８５］から［８７］の何れか一項に記載の心筋細胞を製造する方法。
［８９］上記工程ｆが、下記の何れかの存在下で体細胞を培養する工程である、上記［８５］から［８８］の何れか一項に記載の心筋細胞を製造する方法。
（１）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（２）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＥｒｋ阻害剤。
［９０］ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養することが、ドルソモルフィンの存在下で体細胞を培養することである、上記［８５］から［８９］の何れか一項に記載の心筋細胞を製造する方法。
［９１］上記工程ｆが、ＡＬＫ４阻害剤の非存在下で体細胞を培養する工程である、上記［８５］から［９０］の何れか一項に記載の心筋細胞を製造する方法。
［９２］上記工程ｆが、ｐ５３阻害剤の非存在下で体細胞を培養する工程である、上記［８５］から［９１］の何れか一項に記載の心筋細胞を製造する方法。
［９３］上記工程ｆが、ヒストンに関与する成分の非存在下で体細胞を培養する工程である、上記［８５］から［９２］の何れか一項に記載の心筋細胞を製造する方法。
［９４］上記体細胞が線維芽細胞である、上記［８５］から［９３］の何れか一項に記載の心筋細胞を製造する方法。
［９５］上記［８５］から［９４］の何れか一項に記載の心筋細胞を製造する方法により製造される心筋細胞。

［９６］ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤、並びにｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＥｒｋ阻害剤を含む、組成物。
［９７］ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＥｒｋ阻害剤を含む、上記［９６］に記載の組成物。
［９８］ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤をさらに含む、上記［９６］又は［９７］に記載の組成物。
［９９］ＧＳＫ３阻害剤をさらに含む、上記［９６］から［９８］の何れか一項に記載の組成物。
［１００］下記の何れかの組み合わせを含む、上記［９６］から［９８］の何れか一項に記載の組成物。
（１）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（２）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＥｒｋ阻害剤。
［１０１］ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤が、ドルソモルフィンである、上記［９７］から［１００］の何れか一項に記載の組成物。
［１０２］体細胞から心筋細胞を製造するための組成物である、上記［９６］から［１０１］の何れか一項に記載の組成物。

本発明の製造方法、又は本発明の組成物によれば、遺伝子導入を行うことなく体細胞から褐色脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、又は心筋細胞を製造することができる。本発明により得られた褐色脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、又は心筋細胞は、再生医療などにおいて有用である。

図１は、培養開始２１日後の細胞を固定した後に免疫染色を行った結果を示す。 図２は、各化合物の組み合わせで３週間処理した後の細胞の様子を示す。 図３は、各化合物の組み合わせで処理した場合のＦａｂｐ４（脂肪細胞特異的遺伝子）の定量の結果を示す。 図４は、３８歳の線維芽細胞におけるＵＣＰ１タンパク質（緑）及び核（青）を免疫染色した結果を示す。図４はモノクロであるため緑色と青色は表示されないが、図４のオリジナル写真では緑色と青色が表示される。 図５は、３８歳の線維芽細胞におけるＵＣＰ１タンパク質（緑）及び核（青）を免疫染色した結果を示す。図５はモノクロであるため緑色と青色は表示されないが、図５のオリジナル写真では緑色と青色が表示される。 図６は、３８歳の線維芽細胞におけるＵＣＰ１タンパク質（緑）及び核（青）を免疫染色した結果を示す。図６はモノクロであるため緑色と青色は表示されないが、図６のオリジナル写真では緑色と青色が表示される。 図７は、３８歳の線維芽細胞におけるＵＣＰ１タンパク質（緑）及び核（青）を免疫染色した結果を示す。図７はモノクロであるため緑色と青色は表示されないが、図７のオリジナル写真では緑色と青色が表示される。 図８は、３８歳の線維芽細胞におけるＵＣＰ１タンパク質（緑）及び核（青）を免疫染色した結果を示す。図８はモノクロであるため緑色と青色は表示されないが、図８のオリジナル写真では緑色と青色が表示される。 図９は、３８歳（Ａ）、４９歳（Ｂ）及び０歳（Ｃ）の３名由来の線維芽細胞におけるＵＣＰ１タンパク質（緑）及びミトコンドリア（赤）を免疫染色した結果を示す。図９はモノクロであるため緑色と赤色は表示されないが、図９のオリジナル写真では緑色と赤色が表示される。 図１０は、３８歳（Ａ）、４９歳（Ｂ）及び０歳（Ｃ）の３名由来の線維芽細胞を化合物カクテル（５ＣＯＲｏ−ＧＭ）で３週間培養した後に１週間Ｒｏのみで培養して成熟させた細胞の様子を示す。 図１１は、対照細胞（化合物による処理なし）、並びに０歳、３８歳及び４９歳の線維芽細胞由来の褐色脂肪細胞におけるＵｃｐ１遺伝子、Ｃｋｍｔ１遺伝子、Ｃｉｔｅｄ１遺伝子、Ｃｏｌｌａ２遺伝子、Ｆａｂｐ４遺伝子、ＡｄｉｐｏＱ遺伝子、及びＰｐａｒγ遺伝子の発現を定量した結果を示す。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。Studentｔ検定：＊ ｐ＜０．０５、＊＊ ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１ イソプロテレノール（０．１μＭ、１μＭ又は１０μＭ）又はフォルスコリン（０．１μＭ、１μＭ又は１０μＭ）で処理した後の褐色脂肪細胞におけるおＵｃｐ１、Ｃｋｍｔ１及びＣｉｔｅｄ１のｍＲＮＡを定量した結果を示す。未処理の褐色脂肪細胞の発現量を１として標準化した最初のレーンは対照細胞（化合物の添加なし）の発現量を示す。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。Studentｔ検定：＊ ｐ＜０．０５、＊＊ ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１ 図１３は、対照細胞（化合物の添加なし）、及び線維芽細胞（Ａ：３８歳、Ｂ：４９歳、及びＣ：０歳）由来の褐色脂肪細胞（各細胞についてｎ＝３）における酸素消費速度を、Ｆｌｕｘアナライザーを用いて測定した結果を示す。オリゴマイシン（Ｏ）、ＦＣＣＰ（Ｆ）及びアンチマイシンＡ／ロテノン（Ａ／Ｒ）を図示した時点で添加した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３−５）を示す。

図１４は、培養開始２１日後の細胞を染色した結果を示す。 図１５は、培養開始２１日後の細胞を染色した結果を示す。 図１６は、培養開始１４日後の細胞を固定した後に免疫染色を行った結果を示す。 図１７は、培養開始２１日後の細胞を固定した後に免疫染色を行った結果を示す。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

１ 体細胞について
生物の細胞は、体細胞と生殖細胞とに分類できる。本発明の方法には、その出発材料として任意の体細胞が使用できる。体細胞には特に限定はなく、生体から採取された初代細胞、又は株化された細胞の何れでもよい。本発明では、分化の種々の段階にある体細胞、例えば、最終分化した体細胞、最終分化への途上にある体細胞、又は初期化され多能性を獲得した体細胞を使用することができる。本発明に使用できる体細胞としては、特に本発明を限定するものではないが、任意の体細胞、例えば、造血系の細胞（各種のリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、骨髄細胞等）、臓器由来の細胞（肝細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞等）、筋組織系の細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞等）、線維芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、間質細胞、脂肪細胞（白色脂肪細胞等）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等が挙げられる。また、これらの細胞の前駆細胞、癌細胞にも本発明の方法を適用できる。体細胞としては、好ましくは、線維芽細胞を使用することができる。

上記の体細胞の供給源としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、これらに限定されるものではない。体細胞の供給源としては、ヒト、及びヒト以外の哺乳動物が好ましく、ヒトが特に好ましい。ヒトへの投与を目的として本発明の方法により褐色脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、又は心筋細胞を製造する場合、好ましくは、レシピエントと組織適合性抗原のタイプが一致又は類似したドナーより採取された体細胞を使用することができる。レシピエント自身より採取された体細胞を褐色脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、又は心筋細胞の製造に供してもよい。

２ ＡＬＫ５阻害剤について
ＡＬＫ５とは、ＴＧＦβＲ１（形質転換増殖因子β受容体１）とも称されるＴＧＦβ受容体サブファミリーメンバーである。ＡＬＫ５は、ＴＧＦβに結合した際にＩＩ型ＴＧＦβ受容体とヘテロ二量体複合体を形成するセリン／スレオニンキナーゼであり、ＴＧＦβシグナルを細胞表面から細胞質へと伝達する。

「ＡＬＫ５阻害剤の存在下」とは、ＡＬＫ５を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＡＬＫ５を阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＡＬＫ５に直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＡＬＫ５抗体やその他の薬剤）、ＡＬＫ５自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＡＬＫ５が関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもＡＬＫ５を阻害することができる。

本発明では特に限定されないが、ＡＬＫ５阻害剤としては、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＳＢ４３１５４２を使用することができる。

ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ａ８３−０１（和光純薬工業製）（ＣＡＳ Ｎｏ．：９０９９１０−４３−６）

ＡＬＫ５ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（和光純薬工業製）又はＲｅｐｓｏｘ（ａｂｃａｍ社製）（ＣＡＳ Ｎｏ．：４４６８５９−３３−２）

Ｄ４４７６（和光純薬工業製）（ＣＡＳ Ｎｏ．：３０１８３６−４３−１）

ＬＹ３６４９４７（和光純薬工業製）（ＣＡＳ Ｎｏ．：３９６１２９−５３−６）

ＳＢ４３１５４２（和光純薬工業製）（ＣＡＳ Ｎｏ．：３０１８３６−４１−９）

ＳＢ５２５３３４（和光純薬工業製）（ＣＡＳ Ｎｏ．：３５６５５９−２０−１）

ＳＤ２０８（和光純薬工業製）（ＣＡＳ Ｎｏ．：６２７５３６−０９−８）

ＡＬＫ５阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．２μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。

３ ＡＬＫ６阻害剤について
ＡＬＫ６は、ＢＭＰＲ１Ｂとしても知られ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体メンバーの膜貫通型セリン／スレオニンキナーゼメンバーであり、アクチビン受容体であるＡＣＶＲ１とＡＣＶＲ２に非常に類似している。ＡＬＫ６は主に軟骨内の骨形成と胚形成に関与する。

「ＡＬＫ６阻害剤の存在下」とは、ＡＬＫ６を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＡＬＫ６を阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＡＬＫ６に直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＡＬＫ６抗体やその他の薬剤）、ＡＬＫ６自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＡＬＫ６が関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもＡＬＫ６を阻害することができる。

本発明では特に限定されないが、ＡＬＫ６阻害剤としては、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ドルソモルフィンを使用することができる。

ドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ：和光純薬工業製）（ＣＡＳ Ｎｏ．：８６６４０５−６４−３）

Ｋ０２２８８（ＣＡＳ Ｎｏ．：１４３１９８５−９２−０）

ＡＬＫ６阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．２μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。

４ ＡＭＰＫ阻害剤について
ＡＭＰＫ（ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ：ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）は、セリン／スレオニンキナーゼの一種であり、細胞内のエネルギーのセンサーとしての役割を担っている。ＡＴＰがＡＭＰとリン酸に分解される過程でエネルギーが産生されるが、ＡＭＰＫはこのＡＭＰで活性化されるプロテインキナーゼである。また、ＡＭＰＫは細胞増殖の制御に関連する幾つかのタンパク質の活性に影響することが知られている。

「ＡＭＰＫ阻害剤の存在下」とは、ＡＭＰＫを阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＡＭＰＫを阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＡＭＰＫに直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＡＭＰＫ抗体やその他の薬剤）、ＡＭＰＫ自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＡＭＰＫが関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもＡＭＰＫを阻害することができる。

本発明では特に限定されないが、ＡＭＰＫ阻害剤としては、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ドルソモルフィンを使用することができる。

ドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ：和光純薬工業製）（ＡＭＰＫ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃとも称する）（ＣＡＳ Ｎｏ．：８６６４０５−６４−３）

Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ（和光純薬工業製）（ＣＡＳ Ｎｏ．：１６０８０７−４９−８）

Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ Ｎｏ．：１２１９１６８−１８−９）

Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ Ｎｏ．：２５３１６−４０−９）
ＳＴＯ−６０９ （ＣＡＳ Ｎｏ．：５２０２９−８６−４）

ＡＭＰＫ阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．２μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。

５ ｃＡＭＰ活性化剤について
ｃＡＭＰ（環状アデノシン１リン酸）は、セカンドメッセンジャーとして種々の細胞内シグナル伝達に関わっている物質である。ｃＡＭＰは、細胞内ではアデニル酸サイクラーゼ（ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ）によりアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）が環状化されることで生成する。

「ｃＡＭＰ活性化剤の存在下」とは、ｃＡＭＰを活性化することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させることができる任意の手段を利用することができる。ｃＡＭＰの生成に関わる酵素であるアデニル酸サイクラーゼに直接作用して活性化できる物質、アデニル酸サイクラーゼの発現を促進しうる物質の他、ｃＡＭＰを分解する酵素であるホスホジエステラーゼを阻害する物質等を、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる手段として使用することができる。細胞内でｃＡＭＰと同じ作用を持つ、ｃＡＭＰの構造類似体であるジブチリルｃＡＭＰ（ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ ｃＡＭＰ）を使用することもできる。

本発明で使用できるｃＡＭＰ活性化剤（アデニル酸サイクラーゼ活性化剤）としては、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ：ＣＡＳ Ｎｏ．：６６５７５−２９−９）、及びフォルスコリン誘導体（例えば特開２００２−３４８２４３号公報）などが挙げられる。好ましくは、フォルスコリンを使用することができる。

フォルスコリン（ＣＡＳ Ｎｏ．：６６４２８−８９−５）

イソプロテレノール（ＣＡＳ Ｎｏ．：７６８３−５９−２）
ＮＫＨ４７７（ＣＡＳ Ｎｏ．：１３８６０５−００−２）
ＰＡＣＡＰ１−２７（ＣＡＳ Ｎｏ．：１２７３１７−０３−７）
ＰＡＣＡＰ１−３８（ＣＡＳ Ｎｏ．：１３７０６１−４８−４）

ｃＡＭＰ活性化剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．５μｍｏｌ／Ｌ〜５０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ〜３０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。

６ ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤について
ＡＬＫ２は、ＡＬＫファミリーメンバーの受容体セリン／スレオニンキナーゼであり、ＳＭＡＤタンパク質、特にＳＭＡＤ１／５／８が関与するシグナル伝達経路の上流に位置する。ＡＬＫ２−Ｓｍａｄ１経路の活性化を通じてエンドグリンにより前立腺癌細胞の運動性が低下する。ＡＬＫ２遺伝子は、筋肉組織において進行性の異所性骨形成が特徴の珍しい常染色体性優性先天性疾患である進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）に関与する主要遺伝子である。

ＡＬＫ３は、膜貫通型セリンスレオニンキナーゼファミリーメンバーである。ＡＬＫ３遺伝子は、ＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｄｅｌｅｔｅｄ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １０）変異陰性カウデン病において微働感受性遺伝子として作用する。ＡＬＫ３輸送は、ＦＯＰの病変形成において重要な役割を担い、またヒトＴ細胞分化にも関与する。

「ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤の存在下」とは、ＡＬＫ２及びＡＬＫ３を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＡＬＫ２及びＡＬＫ３を阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＡＬＫ２又はＡＬＫ３に直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＡＬＫ２抗体、抗ＡＬＫ３抗体、その他の薬剤）、ＡＬＫ２自体又はＡＬＫ３自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＡＬＫ２及びＡＬＫ３が関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもＡＬＫ２及びＡＬＫ３を阻害することができる。

本発明では特に限定されないが、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤としては、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＡＬＫ２及びＡＬＫ３の両方を阻害するＬＤＮ１９３１８９を使用することができる。

ＤＭＨ１（ＡＬＫ２阻害剤）（ＣＡＳ Ｎｏ．：１２０６７１１−１６−１）

Ｋ０２２８８（ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤）（ＣＡＳ Ｎｏ．：１４３１９８５−９２−０）

ＬＤＮ２１２８５４（ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤）（ＣＡＳ Ｎｏ．：１４３２５９７−２６−６）

ＬＤＮ１９３１８９（ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤）（ＣＡＳ Ｎｏ．：１０６２３６８−２４−４）

ＬＤＮ１９３１８９ ＨＣｌ（ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤）（ＣＡＳ Ｎｏ．：１０６２３６８−６２−０）

ＭＬ３４７（ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤）（ＣＡＳ Ｎｏ．：１０６２３６８−４９−３）

ＬＤＮ２１４１１７（ＣＡＳ Ｎｏ．：１６２７５０３−６７−６）

ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．２μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。

７ ＧＳＫ３阻害剤について
グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ：ＧＳＫ）３は、グリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活性化するプロテインキナーゼとして見いだされた。哺乳類では、ＧＳＫ３は５１ｋＤａのα（ＧＳＫ３α）と４７ｋＤａのβ（ＧＳＫ３β）の二つのアイソフォームに分類される。ＧＳＫ３は種々のタンパク質をリン酸化する活性を有しており、グリコーゲン代謝のみならず、細胞分裂、細胞増殖等の生理現象にも関わっている。

「ＧＳＫ３阻害剤の存在下」とは、ＧＳＫ３を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＧＳＫ３の活性を阻害する物質、例えば、抗ＧＳＫ３抗体やＧＳＫ阻害剤のようなＧＳＫ３シグナル阻害手段を利用することができる。また、ＧＳＫ３は自身の特定の部位がリン酸化されると活性を失うことから、上記のリン酸化を促進する手段も、ＧＳＫ３シグナルの阻害に利用することができる。

本発明に使用できるＧＳＫ３阻害剤としては、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１を使用することができる。

ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ Ｎｏ．：２５２９１７−０６−９）

ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ）（ＣＡＳ Ｎｏ．：６６７４６３−６２−９）

Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳ Ｎｏ．：１４２２７３−２０−９）

Ａ１０７０７２２（ＣＡＳ Ｎｏ．：１３８４４２４−８０−９）

ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ Ｎｏ．：２８０７４４−０９−４）
ＣＨＩＲ９８０１４（ＣＡＳ Ｎｏ．：５５６８１３−３９−９）
ＴＷＳ１１９（ＣＡＳ Ｎｏ．：６０１５１４−１９−６）
Ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ（ＣＡＳ Ｎｏ．：８６５８５４−０５−３）
ＳＢ４１５２８６（ＣＡＳ Ｎｏ．：２６４２１８−２３−７）
Ｂｉｋｉｎｉｎ（ＣＡＳ Ｎｏ．：１８８０１１−６９−０）
ＩＭ−１２（ＣＡＳ Ｎｏ．：１１２９６６９−０５−１）
１−Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳ Ｎｏ．：６７６５９６−６５−９）
ＬＹ２０９０３１４（ＣＡＳ Ｎｏ．：６０３２８８−２２−８）
ＡＺＤ１０８０（ＣＡＳ Ｎｏ．：６１２４８７−７２−６）
ＡＺＤ２８５８（ＣＡＳ Ｎｏ．：４８６４２４−２０−８）
ＡＲ−Ａ０１４４１８（ＣＡＳ Ｎｏ．：４８７０２１−５２−３）
ＴＤＺＤ−８（ＣＡＳ Ｎｏ．：３２７０３６−８９−５）
Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ（ＣＡＳ Ｎｏ．：４７９−４１−４）

ＧＳＫ３阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．２μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。

８ Ｅｒｋ阻害剤について
ＥｒｋはＥＧＦ（上皮増殖因子）、血清刺激又は酸化ストレスなどによって活性化されるＭＡＰＫのサブファミリーで、Ｅｒｋはその関わるシグナル伝達経路の違いからＥＲＫ１／２、ＥＲＫ５、ＥＲＫ７、ＥＲＫ８に分けられる。上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）などのチロシンキナーゼ受容体にリガンドが結合することでシグナルが流れた結果、Ｅｒｋの活性化ループに存在するＴＥＹモチーフがリン酸化されて活性化する。

「Ｅｒｋ阻害剤の存在下」とは、Ｅｒｋを阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、Ｅｒｋの活性を阻害する物質、例えば、抗Ｅｒｋ抗体やＥｒｋ阻害剤のようなＥｒｋシグナル阻害手段を利用することができる。また、Ｅｒｋの活性化に関わる酵素、例えば、ＥｒｋキナーゼやＥｒｋキナーゼキナーゼ等を阻害する手段もＥｒｋ阻害に利用することができる。

本発明では特に限定されないが、Ｅｒｋ阻害剤としては、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＰＤ０３２５９０１を使用することができる。

ＰＤ０３２５９０１（ＣＡＳ Ｎｏ．：３９１２１０−１０−９）

Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ（ＣＡＳ Ｎｏ．：１０１６２２−５１−９）

Ａｍｉｎｏｐｕｒｖａｌａｎｏｌ Ａ（ＣＡＳ Ｎｏ．：２２０７９２−５７−４）

ＡＳ７０３０２６（ＣＡＳ Ｎｏ．：１２３６６９９−９２−５）
ＡＺＤ８３３０（ＣＡＳ Ｎｏ．：８６９３５７−６８−６）
ＢＩＸ０２１８８（ＣＡＳ Ｎｏ．：３３４９４９−５９−６）
ＢＩＸＯ２１８９（ＣＡＳ Ｎｏ．：１２６５９１６−４１−３）
ＣＩ−１０４０（ＣＡＳ Ｎｏ．：２１２６３１−７９−３）
Ｃｏｂｉｍｅｔｉｒｌｉｂ（ＣＡＳ Ｎｏ．：９３４６６０−９３−２）
ＧＤＣ−０６２３（ＣＡＳ Ｎｏ．：１１６８０９１−６８−６）
ＭＥｋ１６２（ＣＡＳ Ｎｏ．：６０６１４３−８９−９）
ＰＤ３１８０８８（ＣＡＳ Ｎｏ．：３９１２１０−００−７）
ＰＤ９８０５９（ＣＡＳ Ｎｏ．：１６７８６９−２１−８）
Ｒｅｆａｍｅｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ Ｎｏ．：９２３０３２−３７−５）
ＲＯ４９８７６５５（ＣＡＳ Ｎｏ．：８７４１０１−００−５）
ＳＣＨ７７２９８４（ＣＡＳ Ｎｏ．：９４２１８３−８０−４）
Ｓｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ Ｎｏ．：６０６１４３−５２−６）
ＳＬ３２７（ＣＡＳ Ｎｏ．：３０５３５０−８７−２）
Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ Ｎｏ．：８７１７００−１７−３）
ＡＲＲＹ−１４２８８６（ＣＡＳ Ｎｏ．：６０６１４３−５２−６）
ＸＬ５１８（ＣＡＳ Ｎｏ．：９３４６６０−９３−２）
ＲＤＥＡ１１９（ＣＡＳ Ｎｏ．：９２３０３２−３８−６）

Ｅｒｋ阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．２μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。

９ 好ましい培養条件
本発明においては特に限定されないが、工程ａ〜ｆにおいて、ｐ５３阻害剤の非存在下で体細胞を培養することが好ましい。ｐ５３阻害剤の非存在下とは、ｐ５３阻害剤が実質的に存在しないことを意味し、ｐ５３阻害剤が全く存在しない場合だけでなく、ｐ５３阻害剤が痕跡量で存在する場合を包含するものとする。ｐ５３タンパク質はがん抑制遺伝子として知られるｐ５３遺伝子の産物であり、細胞周期調節やアポトーシス制御に関わっている。ｐ５３の機能はＤＮＡとの特異的結合並びに遺伝子発現制御を通じて発揮されている。ｐ５３阻害剤としては、例えば、ピフィスリン−α（ＣＡＳ Ｎｏ．：６３２０８−８２−２）、ピフィスリン−β（ＣＡＳ Ｎｏ．：５１１２９６−８８−１）、ピフィスリン−μ（ＣＡＳ Ｎｏ．：６４９８４−３１−２）、ＮＳＣ６６８１１（ＣＡＳ Ｎｏ．：６９６４−６２−１）、Ｎｕｌｔｉｎ−３（ＣＡＳ Ｎｏ．：５４８４７２−６８−０）などが例示されるが、本発明においては上記したようなｐ５３阻害剤の非存在下で体細胞を培養することができる。

本発明においては特に限定されないが、工程ａ〜ｆにおいて、ヒストンに関与する成分の非存在下で体細胞を培養することが好ましい。ヒストンに関与する成分の非存在下とは、ヒストンに関与する成分が実質的に存在しないことを意味し、ヒストンに関与する成分が全く存在しない場合だけでなく、ヒストンに関与する成分が痕跡量で存在する場合を包含するものとする。ヒストンに関与する成分としては、例えば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤等を挙げることができる。核初期化因子によるリプログラミングを促進すると言われるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を使用しない場合には、意図しない分化を起こしかねない多能性細胞が誘導されるリスクはより低くなる。

１０ 体細胞の培養
本発明における体細胞の培養は、使用する体細胞の種類に応じた培地、温度、その他の条件を選択し、上記の各種の阻害剤（及び、場合により活性化剤）の存在下において実施すればよい。培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はこれらを改変した培地に、適切な成分（血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等）を添加して使用することができる。

培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。３７℃、５％ＣＯ_２の条件などが例示される。培養中は適切な間隔（好ましくは１日から７日に１回、より好ましくは３日から４日に１回）で培地を交換することが好ましい。線維芽細胞を材料として本発明の方法を実施する場合、３７℃、５％ＣＯ_２の条件では５ないし８日間から３週間で褐色脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、又は心筋細胞が出現する。使用する体細胞として培養が容易なものを選択することにより、あらかじめ細胞数を増加させた体細胞を褐色脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、又は心筋細胞に転換することも可能である。従って、スケールアップした褐色脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、又は心筋細胞の製造も容易である。

体細胞の培養には、プレート、ディッシュ、細胞培養用フラスコ、細胞培養用バッグ等の細胞培養容器を使用することができる。なお、細胞培養用バッグとしては、ガス透過性を有するものが好適である。大量の細胞を必要とする場合には、大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系又は閉鎖系のどちらでも実施することができるが、得られた褐色脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、又は心筋細胞のヒトへの投与等を目的とする場合には、閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
本発明の方法においては、上記した各種の阻害剤を含む培地において体細胞を培養することにより、一段階の培養によって体細胞から褐色脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、又は心筋細胞を製造することができる。

Ａ 褐色脂肪細胞に係る発明
［１］褐色脂肪細胞を製造する方法
本発明は、ＡＬＫ５阻害剤の存在下、かつ、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程ａを含む、褐色脂肪細胞を製造する方法に関する。
好ましくは、工程ａが、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である。
好ましくは、工程ａが、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの活性化剤及び／又は阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である。

工程ａは、特に好ましくは、下記の何れかの存在下で体細胞を培養する工程である。
（１）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（２）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤；
（３）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（４）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（５）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤；
（６）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤。

本発明はさらに、（１）Ｅｒｋ阻害剤、（２）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（３）ＡＬＫ５阻害剤、（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、並びに（５）ｃＡＭＰ活性化剤からなる５群から選択される少なくとも一つの存在下で体細胞を培養する工程ｂを含む褐色脂肪細胞を製造する方法に関する。

好ましくは、工程ｂが、（１）Ｅｒｋ阻害剤、（２）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（３）ＡＬＫ５阻害剤、（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、並びに（５）ｃＡＭＰ活性化剤からなる５群から選択される少なくとも二つの存在下で体細胞を培養する工程である。

好ましくは、工程ｂが、下記の何れかの存在下で体細胞を培養する工程である。
（ｉ）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤と、ｃＡＭＰ活性化剤；
（ｉｉ）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤と、Ｅｒｋ阻害剤；
（ｉｉｉ）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤と、ＡＬＫ５阻害剤；
（ｉｖ）ｃＡＭＰ活性化剤と、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤；
（ｖ）ｃＡＭＰ活性化剤と、Ｅｒｋ阻害剤；
（ｖｉ）ｃＡＭＰ活性化剤と、ＡＬＫ５阻害剤；
（ｖｉｉ）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤と、ＡＬＫ５阻害剤；並びに
（ｖｉｉｉ）Ｅｒｋ阻害剤と、ＡＬＫ５阻害剤。

好ましくは、工程ｂが、（１）Ｅｒｋ阻害剤、（２）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（３）ＡＬＫ５阻害剤、（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、並びに（５）ｃＡＭＰ活性化剤からなる５群から選択される少なくとも三つ（より好ましくは少なくとも四つ）の存在下で体細胞を培養する工程である。

本発明はさらに、（１）Ｅｒｋ阻害剤、（２）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（３）ＡＬＫ５阻害剤、（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（５）ｃＡＭＰ活性化剤、並びに（６）ＧＳＫ３阻害剤からなる６群から選択される少なくとも五つの存在下で体細胞を培養する工程ｂを含む褐色脂肪細胞を製造する方法に関する。

＜２種以上の阻害作用を有する阻害剤＞
上記した各種の阻害剤としては、２種類以上の阻害作用を有する阻害剤を使用してもよい。
例えば、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤としては、ＡＬＫ２及びＡＬＫ３の両方を阻害するＬＤＮ１９３１８９を使用することができ、あるいはＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６及びＡＭＰＫを阻害するドルソモルフィンを使用することもできる。即ち、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養することは、ＬＤＮ１９３１８９及び／又はドルソモルフィンの存在下で体細胞を培養することにより達成してもよい。

また、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤としては、ＡＬＫ６及びＡＭＰＫの両方を阻害するドルソモルフィンを使用することができる。即ち、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養することは、ドルソモルフィンの存在下で体細胞を培養することにより達成してもよい。
また、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤としては、ＡＬＫ６、ＡＭＰＫ、ＡＬＫ２及びＡＬＫ３を阻害するドルソモルフィンを使用することができる。即ち、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤の存在下で体細胞を培養することは、ドルソモルフィンの存在下で体細胞を培養することにより達成してもよい。

＜体細胞の培養において＞
本発明においては、体細胞から褐色脂肪細胞を製造する。デキサメタゾン、インスリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ロシグリタゾン、グルココルチコイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、トリヨードサイロニン（Ｔ３とも称する）等は、脂肪細胞への分化の誘導に有効な物質として知られている。褐色脂肪細胞への分化の誘導に有効な物質としては、例えば、分化誘導剤として市販されているものを使用することもできる。本発明においては、上記した物質の存在下において体細胞を培養することが好ましい。

好ましくは、デキサメタゾン、インスリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、及びロシグリタゾンから選択される１種以上、好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上、さらに好ましくは４種を使用することができる。
デキサメタゾンを使用する場合、デキサメタゾンの濃度は特に限定されないが、好ましくは、０．２μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。

インスリンを使用する場合、インスリンの濃度は特に限定されないが、好ましくは、１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは２μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの範囲で使用することができる。
３−イソブチル−１−メチルキサンチンを使用する場合、３−イソブチル−１−メチルキサンチンの濃度は特に限定されないが、好ましくは、０．０５μｍｏｌ／Ｌ〜５０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
ロシグリタゾンを使用する場合、ロシグリタゾンの濃度は特に限定されないが、好ましくは、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．２μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。

＜褐色脂肪細胞＞
上記した本発明の褐色脂肪細胞の製造方法により、褐色脂肪細胞を含有する細胞集団を得ることができる。本発明による褐色脂肪細胞を製造する方法により製造される褐色脂肪細胞も本発明の範囲内である。本発明の方法により製造される褐色脂肪細胞は、最終分化した細胞の他、褐色脂肪細胞に分化することが運命づけられた前駆細胞でもよい。また、本発明の方法により製造される褐色脂肪細胞は、褐色脂肪様細胞として知られる、ベージュ細胞又はブライト細胞でもよい。

本発明の方法により製造される褐色脂肪細胞は、例えば、細胞の形態的変化、褐色脂肪細胞の特徴的性質や特異的マーカーを利用して、検出、確認及び分離を行うことができる。
脂肪細胞は、細胞内に脂肪を蓄積する。従って、オイルレッドＯを用いた細胞内脂肪の染色によって脂肪細胞を検出することができる。
褐色脂肪細胞の特異的マーカーとしては、ＵＣＰ１、ＥＶＯＬ３（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｒｙ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ３）、ＰＧＣ１Ａ（ ＰＰＡＲ ｇａｍｍａ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ １−ａｌｐｈａ）、ＰＲＤＭ１６（ＰＲＤ１−ＢＦ１−ＲＩＺ１ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １６）、ＣＩＤＥＡ（Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ ＤＦＦＡ−Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ａ）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＵＣＰ１は、脱共役タンパク質（Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の一種である。

特異的マーカーの検出には、検疫的方法（抗体による検出）を利用できるが、タンパク質分子に関してはそのｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。褐色脂肪細胞の特異的マーカーを認識する抗体は、本発明の方法により得られた褐色脂肪細胞を単離及び精製する上でも有用である。

本発明の方法により製造される褐色脂肪細胞は、例えば、外科治療後の組織修復等のために使用することができる。本発明の方法により製造される褐色脂肪細胞を使用して、組織修復等のための医薬用組成物を製造することができる。また、褐色脂肪細胞の生体への移植や投与は、生体の代謝改善、肥満防止等への効果が期待されている。

褐色脂肪細胞を医薬用組成物とする場合には、常法により、褐色脂肪細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。
褐色脂肪細胞はさらに、褐色脂肪細胞の機能発揮や生着性向上に有効な他の細胞や成分と組み合わせた組成物とすることもできる。

さらに、本発明の方法により製造される褐色脂肪細胞は、褐色脂肪細胞に作用する医薬候補化合物のスクリーニングや医薬候補化合物の安全性評価のために使用することもできる。本発明によれば、一度の操作で多くの褐色脂肪細胞を取得することができることから、細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能になる。

［２］組成物
本発明はさらに、ＡＬＫ５阻害剤と、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤とを含む、組成物に関する。
本発明の組成物は、好ましくは、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤を含む。
本発明の組成物は、好ましくは、ＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの活性化剤及び／又は阻害剤をさらに含む。

本発明の組成物の具体例としては、下記の何れかの組み合わせを含む組成物を挙げることができる。
（１）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（２）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤；
（３）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（４）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（５）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤；
（６）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤。
上記した活性化剤及び阻害剤の具体例及び好ましい例は、本明細書中上記した通りである。

本発明はさらに、（１）Ｅｒｋ阻害剤、（２）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（３）ＡＬＫ５阻害剤、（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、及び（５）ｃＡＭＰ活性化剤からなる群から選択される少なくとも一つ（好ましくは少なくとも二つ、少なくとも三つ、又は少なくとも四つ）を含む、体細胞から褐色脂肪細胞を製造するための組成物に関する。

本発明の上記組成物の具体例としては、下記の何れかを含む組成物が挙げられる。
（ｉ）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤と、ｃＡＭＰ活性化剤；
（ｉｉ）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤と、Ｅｒｋ阻害剤；
（ｉｉｉ）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤と、ＡＬＫ５阻害剤；
（ｉｖ）ｃＡＭＰ活性化剤と、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤；
（ｖ）ｃＡＭＰ活性化剤と、Ｅｒｋ阻害剤；
（ｖｉ）ｃＡＭＰ活性化剤と、ＡＬＫ５阻害剤；
（ｖｉｉ）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤と、ＡＬＫ５阻害剤；並びに
（ｖｉｉｉ）Ｅｒｋ阻害剤と、ＡＬＫ５阻害剤。

さらに本発明は、（１）Ｅｒｋ阻害剤、（２）ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（３）ＡＬＫ５阻害剤、（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤、（５）ｃＡＭＰ活性化剤、及び（６）ＧＳＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも五つを含む、褐色脂肪細胞を製造するための組成物に関する。

本発明の組成物は、体細胞から褐色脂肪細胞を製造するための組成物として使用することができる。本発明の組成物はまた、体細胞から褐色脂肪細胞を製造するための培地として使用することもできる。

体細胞から褐色脂肪細胞の製造に使用される培地としては、細胞の培養に必要な成分を混合して製造した基礎培地に、有効成分として、ＡＬＫ５阻害剤と、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤とを含有させた培地を例示することができる。上記の有効成分は、褐色脂肪細胞の製造に有効な濃度で含まれていればよく、濃度は当業者が適宜決定することができる。基礎培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はこれらを改変した培地を、基礎培地として使用することができる。

培地にはさらに、本明細書中で上記した公知の培地成分、例えば、血清、タンパク質（アルブミン、トランスフェリン、成長因子等）、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等を添加してもよい。

培地にはさらに、本明細書中で上記した、デキサメタゾン、インスリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ロシグリタゾン、グルココルチコイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤等の脂肪細胞への分化の誘導に有効な物質を添加してもよい。

さらに本発明においては、ＡＬＫ５阻害剤と、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤とを生体に投与することによって、生体内において体細胞から褐色脂肪細胞を製造することもできる。即ち、本発明によれば、ＡＬＫ５阻害剤と、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤とを生体に投与することを含む、生体内において体細胞から褐色脂肪細胞を製造する方法が提供される。生体に投与する阻害剤の好ましい組み合わせは、本明細書中に記載した通りである。また、生体としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、ヒトが特に好ましい。ＡＬＫ５阻害剤と、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤を生体内の特定部位に投与することによって、上記特定部位において、体細胞から褐色脂肪細胞を製造することができる。

Ｂ 骨芽細胞に係る発明
［１］骨芽細胞を製造する方法
本発明は、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下、ｃＡＭＰ活性化剤の存在下、かつＥｒｋ阻害剤の非存在下で体細胞を培養する工程ｃを含む骨芽細胞を製造する方法に関する。
好ましくは、工程ｃが、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である。
好ましくは、工程ｃが、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤下で体細胞を培養する工程である。

工程ｃは、特に好ましくは、下記の何れかの存在下で体細胞を培養する工程である。
（１）ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤及びｃＡＭＰ活性化剤の存在下、かつＥｒｋ阻害剤の非存在下；
（２）ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びｃＡＭＰ活性化剤の存在下、かつＥｒｋ阻害剤の非存在下。

＜Ｅｒｋ阻害剤について＞
本発明においては、Ｅｒｋ阻害剤の非存在下で体細胞を培養する。Ｅｒｋ阻害剤の非存在下とは、Ｅｒｋ阻害剤が実質的に存在しないことを意味し、Ｅｒｋ阻害剤が全く存在しない場合だけでなく、Ｅｒｋ阻害剤が痕跡量で存在する場合を包含するものとする。即ち、Ｅｒｋの活性を阻害する物質、例えば、抗Ｅｒｋ抗体やＥｒｋ阻害剤のようなＥｒｋシグナル阻害手段の非存在下で体細胞を培養する。また、Ｅｒｋの活性化に関わる酵素、例えば、ＥｒｋキナーゼやＥｒｋキナーゼキナーゼ等を阻害する手段の非存在下で体細胞を培養する。

＜２種以上の阻害作用を有する阻害剤＞
上記した各種の阻害剤としては、２種類以上の阻害作用を有する阻害剤を使用してもよい。
例えば、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤としては、ＡＬＫ２及びＡＬＫ３の両方を阻害するＬＤＮ１９３１８９を使用することができ、あるいはＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６及びＡＭＰＫを阻害するドルソモルフィンを使用することもできる。即ち、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤の存在下で体細胞を培養することは、ＬＤＮ１９３１８９及び／又はドルソモルフィンの存在下で体細胞を培養することにより達成してもよい。

また、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤としては、ＡＬＫ６及びＡＭＰＫの両方を阻害するドルソモルフィンを使用することができる。即ち、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養することは、ドルソモルフィンの存在下で体細胞を培養することにより達成してもよい。

＜その他の好ましい条件＞
本発明においては特に限定されないが、工程ｃにおいて、成長因子及び／又はサイトカインの非存在下で体細胞を培養することが好ましい。成長因子及び／又はサイトカインの非存在下とは、成長因子及び／又はサイトカインが実質的に存在しないことを意味し、成長因子及び／又はサイトカインが全く存在しない場合だけでなく、成長因子及び／又はサイトカインが痕跡量で存在する場合を包含するものとする。成長因子及び／又はサイトカインの非存在下で体細胞を培養することの利点としては、安価に骨芽細胞を製造できることが挙げられる。
成長因子とは、生体内において特定の細胞の増殖や分化を促進する内因性タンパク質の総称である。サイトカインとは、免疫系細胞から分泌されるタンパク質で、標的細胞は特定されない情報伝達を担う。サイトカインとしては、免疫や炎症に関係したものが多く、細胞の増殖、分化、細胞死、又は創傷治癒に関係するものもある。なお、成長因子にはサイトカインに含まれるものもあり、互いに排他的な概念ではない。

成長因子としては、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、及び肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）等が挙げられる。

サイトカインとしては、インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ：ＩＬ）、インターフェロン（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ：ＩＦＮ）、及びレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）等が挙げられる。

＜体細胞の培養において＞
本発明においては、体細胞から骨芽細胞を製造する。デキサメタゾン、ハイドロコルチゾン、アスコルビン酸、β−グリセロリン酸等は、骨芽細胞への分化の誘導に有効な物質として知られている。骨芽細胞への分化の誘導に有効な物質としては、例えば、分化誘導剤として市販されているものを使用することもできる。本発明においては、上記した物質の存在下において体細胞を培養することが好ましい。

＜骨芽細胞＞
上記した本発明の骨芽細胞の製造方法により、骨芽細胞を含有する細胞集団を得ることができる。本発明による骨芽細胞を製造する方法により製造される骨芽細胞も本発明の範囲内である。本発明の方法で製造される骨芽細胞は、最終分化した細胞の他、骨芽細胞に分化することが運命づけられた前駆細胞でもよい。

本発明の方法で製造される骨芽細胞は、例えば、細胞の形態的変化、骨芽細胞の特徴的性質や特異的マーカーを利用して、検出、確認及び分離を行うことができる。
骨芽細胞の特異的マーカーとしては、骨型アルカリホスファターゼ及びオステオカルシンが知られており、これを指標として骨芽細胞を検出することができる。また、骨芽細胞は細胞外にカルシウムを沈着させる性質を持つので、ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色又はアリザリンレッド染色により細胞外のカルシウムを染色することによって骨芽細胞を検出することもできる。

特異的マーカーの検出には、検疫的方法（抗体による検出）を利用できるが、タンパク質分子に関してはそのｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。骨芽細胞の特異的マーカーを認識する抗体は、本発明の方法により得られた骨芽細胞を単離及び精製する上でも有用である。

本発明の方法で製造される骨芽細胞は、例えば、生体において数の減少もしくは機能の低下があった細胞を補充する再生医療に有用である。本発明の方法で製造される骨芽細胞を単独で、又は他の細胞や基材（生体高分子等）と組み合わせて形成させた組織を治療に使用することもできる。本発明の方法で製造される骨芽細胞を使用して、組織修復等のための医薬用組成物を製造することができる。

骨芽細胞を医薬用組成物とする場合には、常法により、骨芽細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。
骨芽細胞はさらに、骨芽細胞の機能発揮や生着性向上に有効な他の細胞や成分と組み合わせた組成物とすることもできる。

さらに、本発明の方法で製造される骨芽細胞は、骨芽細胞に作用する医薬候補化合物のスクリーニングや医薬候補化合物の安全性評価のために使用することもできる。本発明によれば、一度の操作で多くの骨芽細胞を取得することができることから、細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能になる。

［２］組成物
本発明はさらに、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤、及びｃＡＭＰ活性化剤を含む、組成物に関する。
本発明の組成物は、好ましくは、少なくともＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤を含む。
本発明の組成物は、好ましくは、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤をさらに含む。

本発明の組成物の具体例としては、下記の何れかの組み合わせを含む組成物を挙げることができる。
（１）ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤及びｃＡＭＰ活性化剤；
（２）ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びｃＡＭＰ活性化剤。
上記した活性化剤及び阻害剤の具体例及び好ましい例は、本明細書中上記した通りである。

本発明の組成物は、体細胞から骨芽細胞を製造するための組成物として使用することができる。本発明の組成物はまた、体細胞から骨芽細胞を製造するための培地として使用することもできる。

体細胞から骨芽細胞の製造に使用される培地としては、細胞の培養に必要な成分を混合して製造した基礎培地に、有効成分として、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤、及びｃＡＭＰ活性化剤を含有させた培地を例示することができる。上記の有効成分は、骨芽細胞の製造に有効な濃度で含まれていればよく、濃度は当業者が適宜決定することができる。基礎培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はこれらを改変した培地を、基礎培地として使用することができる。

培地にはさらに、本明細書中で上記した公知の培地成分、例えば、血清、タンパク質（アルブミン、トランスフェリン、成長因子等）、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等を添加してもよい。

培地にはさらに、本明細書中で上記した、デキサメタゾン、ハイドロコルチゾン、アスコルビン酸、β−グリセロリン酸等の骨芽細胞への分化の誘導に有効な物質を添加してもよい。

本発明の方法及び組成物としては、ＳＢ−４３１５２４（終濃度２μｍｏｌ／Ｌ）、ＬＤＮ−１９３１８９（終濃度１μｍｏｌ／Ｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（終濃度１μｍｏｌ／Ｌ）、ピフィスリン−α（終濃度５μｍｏｌ／Ｌ）並びにフォルスコリン（終濃度７．５μｍｏｌ／Ｌ）を含むＤ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）ｗｉｔｈＬ−Ｇｌｕｔａｍａｔｅ，Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ，Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（和光純薬工業社製）に、市販の骨芽細胞分化誘導剤（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ−Ｉｎｄｕｃｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ；タカラバイオ社製）を添加した培地（培地１００ｍＬあたりアスコルビン酸を１ｍＬ、ハイドロコルチゾンを２００μＬ、β−グリセロリン酸を２ｍＬ添加したもの）を使用する場合を除いたものでもよい。

本発明の方法及び組成物としては、ＳＢ−４３１５２４、ＬＤＮ−１９３１８９、ＣＨＩＲ９９０２１、ピフィスリン−α並びにフォルスコリンを含むＤ−ＭＥＭに、骨芽細胞分化誘導剤を添加した培地を使用する場合を除いたものでもよい。

本発明の方法及び組成物としては、ＳＢ−４３１５２４、ＬＤＮ−１９３１８９、ＣＨＩＲ９９０２１、ピフィスリン−α並びにフォルスコリンを含む培地に、骨芽細胞分化誘導剤を添加した培地を使用する場合を除いたものでもよい。

さらに本発明においては、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤、及びｃＡＭＰ活性化剤を生体に投与することによって、生体内において体細胞から骨芽細胞を製造することもできる。即ち、本発明によれば、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤、及びｃＡＭＰ活性化剤を生体に投与することを含む、生体内において体細胞から骨芽細胞を製造する方法が提供される。生体に投与する阻害剤の好ましい組み合わせは、本明細書中に記載した通りである。また、生体としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、ヒトが特に好ましい。ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤、及びｃＡＭＰ活性化剤を生体内の特定部位に投与することによって、上記特定部位において、体細胞から骨芽細胞を製造することができる。

Ｃ 軟骨細胞に係る発明
［１］軟骨細胞を製造する方法
本発明は、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下、Ｅｒｋ阻害剤の非存在下、かつＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の非存在下で体細胞を培養する工程ｄを含む軟骨細胞を製造する方法に関する。
好ましくは、工程ｄが、少なくともＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である。

好ましくは、工程ｄが、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤の存在下、Ｅｒｋ阻害剤の非存在下、かつＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤の非存在下で体細胞を培養する工程である。

＜ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤について＞
本発明においては、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の非存在下で体細胞を培養する。
ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の非存在下とは、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤が実質的に存在しないことを意味し、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤が全く存在しない場合だけでなく、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤が痕跡量で存在する場合を包含するものとする。

本発明の一例においては、上記したようなＡＬＫ６阻害剤ないしＡＭＰＫ阻害剤の非存在下で体細胞を培養することができる。

＜Ｅｒｋ阻害剤について＞
本発明においては、Ｅｒｋ阻害剤の非存在下で体細胞を培養する。Ｅｒｋ阻害剤の非存在下とは、Ｅｒｋ阻害剤が実質的に存在しないことを意味し、Ｅｒｋ阻害剤が全く存在しない場合だけでなく、Ｅｒｋ阻害剤が痕跡量で存在する場合を包含するものとする。即ち、Ｅｒｋの活性を阻害する物質、例えば、抗Ｅｒｋ抗体やＥｒｋ阻害剤のようなＥｒｋシグナル阻害手段の非存在下で体細胞を培養する。また、Ｅｒｋの活性化に関わる酵素、例えば、ＥｒｋキナーゼやＥｒｋキナーゼキナーゼ等を阻害する手段の非存在下で体細胞を培養する。

＜２種以上の阻害作用を有する阻害剤＞
上記した各種の阻害剤としては、２種類以上の阻害作用を有する阻害剤を使用してもよい。
例えば、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤としては、ＡＬＫ２及びＡＬＫ３の両方を阻害するＬＤＮ１９３１８９を使用することができる。

＜体細胞の培養において＞
本発明においては、体細胞から軟骨細胞を製造する。インスリン、アスコルビン酸、アスコルビン酸−２−リン酸、ハイドロコルチゾン、ＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β）、デキサメタゾン等は、軟骨細胞への分化の誘導に有効な物質として知られている。軟骨細胞への分化の誘導に有効な物質としては、例えば、分化誘導剤として市販されているものを使用することもできる。本発明においては、上記した物質の存在下において体細胞を培養することが好ましい。

＜軟骨細胞＞
上記した本発明の軟骨細胞の製造方法により、軟骨細胞を含有する細胞集団を得ることができる。本発明による軟骨細胞を製造する方法により製造される軟骨細胞も本発明の範囲内である。本発明の方法で製造される軟骨細胞は、最終分化した細胞の他、軟骨細胞に分化することが運命づけられた前駆細胞でもよい。

本発明の方法で製造される軟骨細胞は、例えば、細胞の形態的変化、軟骨細胞の特徴的性質や特異的マーカーを利用して、検出、確認及び分離を行うことができる。
軟骨細胞は、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸のような酸性ムコ多糖を含んでいることから、酸性ムコ多糖の染色に使用されるアルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ）で染色することにより、軟骨細胞を検出することができる。また、軟骨組織の染色法として知られるサフラニンＯ（Ｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ）染色によって軟骨細胞を検出することができる。さらに、軟骨細胞で高発現しているＩＩ型コラーゲン及びアグリカンも軟骨細胞の確認に有用な特異的マーカーである。

特異的マーカーの検出には、検疫的方法（抗体による検出）を利用できるが、タンパク質分子に関してはそのｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。軟骨細胞の特異的マーカーを認識する抗体は、本発明の方法により得られた軟骨細胞を単離及び精製する上でも有用である。

本発明の方法で製造される軟骨細胞は、例えば、生体において数の減少もしくは機能の低下があった細胞を補充する再生医療に有用である。本発明の方法で製造される軟骨細胞を単独で、又は他の細胞や基材（生体高分子等）と組み合わせて形成させた組織を治療に使用することもできる。例えば、軟骨細胞を足場物質（細胞外マトリックス成分など）と組み合わせて形成させた組織を、患者に移植することができる。本発明の方法で製造される軟骨細胞を使用して、組織修復等のための医薬用組成物を製造することができる。例えば、軟骨細胞は、外傷や老化に伴う関節損傷の治療や関節疾患の治療又は症状の軽減を目的として、患者へ投与してもよい。

軟骨細胞を医薬用組成物とする場合には、常法により、軟骨細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。
軟骨細胞はさらに、軟骨細胞の機能発揮や生着性向上に有効な他の細胞や成分と組み合わせた組成物とすることもできる。

さらに、本発明の方法で製造される軟骨細胞は、軟骨細胞に作用する医薬候補化合物のスクリーニングや医薬候補化合物の安全性評価のために使用することもできる。本発明によれば、一度の操作で多くの軟骨細胞を取得することができることから、細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能になる。

［２］組成物
本発明はさらに、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤を含む、体細胞から軟骨細胞を製造するための組成物に関する。本発明の上記組成物は、好ましくは少なくともＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤を含む。
本発明はさらに、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含む、組成物に関し、上記組成物は、好ましくは、体細胞から軟骨細胞を製造するための組成物である。
上記した活性化剤及び阻害剤の具体例及び好ましい例は、本明細書中上記した通りである。

本発明の組成物は、体細胞から軟骨細胞を製造するための組成物として使用することができる。本発明の組成物はまた、体細胞から軟骨細胞を製造するための培地として使用することもできる。

体細胞から軟骨細胞の製造に使用される培地としては、細胞の培養に必要な成分を混合して製造した基礎培地に、有効成分として、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤を含有させた培地を例示することができる。上記の有効成分は、軟骨細胞の製造に有効な濃度で含まれていればよく、濃度は当業者が適宜決定することができる。基礎培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はこれらを改変した培地を、基礎培地として使用することができる。

培地にはさらに、本明細書中で上記した公知の培地成分、例えば、血清、タンパク質（アルブミン、トランスフェリン、成長因子等）、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等を添加してもよい。

培地にはさらに、本明細書中で上記した、インスリン、アスコルビン酸、アスコルビン酸−２−リン酸、ハイドロコルチゾン、ＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β）、デキサメタゾン等の軟骨細胞への分化の誘導に有効な物質を添加してもよい。

本発明の方法及び組成物としては、ＳＢ−４３１５２４（終濃度２μｍｏｌ／Ｌ）、ＬＤＮ−１９３１８９（終濃度１μｍｏｌ／Ｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（終濃度１μｍｏｌ／Ｌ）、ピフィスリン−α（終濃度５μｍｏｌ／Ｌ）、フォルスコリン（終濃度７．５μｍｏｌ／Ｌ）、Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ（終濃度１％）、アスコルビン酸−２−リン酸（終濃度５０μｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）、ＴＧＦ−β３（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｌ−プロリン（終濃度４０μｇ／ｍｌ）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製；終濃度１×）を含むＤ−ＭＥＭ、Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用する場合を除いたものでもよい。

本発明の方法及び組成物としては、ＳＢ−４３１５２４、ＬＤＮ−１９３１８９、ＣＨＩＲ９９０２１、ピフィスリン−α、フォルスコリン、Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ、アスコルビン酸−２−リン酸、デキサメタゾン、ＴＧＦ−β３、Ｌ−プロリン、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むＤ−ＭＥＭを使用する場合を除いたものでもよい。

本発明の方法及び組成物としては、ＳＢ−４３１５２４、ＬＤＮ−１９３１８９、ＣＨＩＲ９９０２１、ピフィスリン−α、フォルスコリン、Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ、アスコルビン酸−２−リン酸、デキサメタゾン、ＴＧＦ−β３、Ｌ−プロリン、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含む培地を使用する場合を除いたものでもよい。

さらに本発明においては、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤を生体に投与することによって、生体内において体細胞から軟骨細胞を製造することもできる。即ち、本発明によれば、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤を生体に投与することを含む、生体内において体細胞から軟骨細胞を製造する方法が提供される。生体に投与する阻害剤の好ましい組み合わせは、本明細書中に記載した通りである。また、生体としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、ヒトが特に好ましい。ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤を生体内の特定部位に投与することによって、上記特定部位において、体細胞から軟骨細胞を製造することができる。

Ｄ 神経系細胞に係る発明
［１］神経系細胞を製造する方法
本発明は、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程ｅを含む、神経系細胞を製造する方法に関する。
好ましくは、工程ｅが、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である。
好ましくは、工程ｅが、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの活性化剤及び／又は阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である。

工程ｅは、特に好ましくは、下記の何れかの存在下で体細胞を培養する工程である。
（１）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（２）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（３）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、及びＥｒｋ阻害剤；
（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤。

＜２種以上の阻害作用を有する阻害剤＞
上記した各種の阻害剤としては、２種類以上の阻害作用を有する阻害剤を使用してもよい。
例えば、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤としては、ＡＬＫ２及びＡＬＫ３の両方を阻害するＬＤＮ１９３１８９を使用することができ、あるいはＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６及びＡＭＰＫを阻害するドルソモルフィンを使用することもできる。即ち、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養することは、ＬＤＮ１９３１８９及び／又はドルソモルフィンの存在下で体細胞を培養することにより達成してもよい。

また、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤としては、ＡＬＫ６及びＡＭＰＫの両方を阻害するドルソモルフィンを使用することができる。即ち、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養することは、ドルソモルフィンの存在下で体細胞を培養することにより達成してもよい。

＜その他の好ましい条件＞
本発明においては特に限定されないが、工程ｅにおいて、成長因子及び／又はサイトカインの非存在下で体細胞を培養することが好ましい。成長因子及び／又はサイトカインの非存在下とは、成長因子及び／又はサイトカインが実質的に存在しないことを意味し、成長因子及び／又はサイトカインが全く存在しない場合だけでなく、成長因子及び／又はサイトカインが痕跡量で存在する場合を包含するものとする。成長因子及び／又はサイトカインの非存在下で体細胞を培養することの利点としては、安価に神経系細胞を製造できることが挙げられる。
成長因子とは、生体内において特定の細胞の増殖や分化を促進する内因性タンパク質の総称である。サイトカインとは、免疫系細胞から分泌されるタンパク質で、標的細胞は特定されない情報伝達を担う。サイトカインとしては、免疫や炎症に関係したものが多く、細胞の増殖、分化、細胞死、又は創傷治癒に関係するものもある。なお、成長因子にはサイトカインに含まれるものもあり、互いに排他的な概念ではない。

成長因子としては、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、及び肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）等が挙げられる。

サイトカインとしては、インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ：ＩＬ）、インターフェロン（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ：ＩＦＮ）、及びレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）等が挙げられる。

＜体細胞の培養において＞
本発明においては、体細胞から神経系細胞を製造する。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；Ｂｒａｉｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ：Ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ）、ｃＡＭＰ、アスコルビン酸、アスコルビン酸−２−リン酸等は、神経系細胞への分化の誘導に有効な物質として知られている。神経系細胞への分化の誘導に有効な物質としては、例えば、分化誘導剤として市販されているものを使用することもできる。本発明においては、上記した物質の存在下において体細胞を培養してもよい。

＜神経系細胞＞
上記した本発明の神経系細胞の製造方法により、神経系細胞を含有する細胞集団を得ることができる。本発明による神経系細胞を製造する方法により製造される神経系細胞も本発明の範囲内である。本発明の方法で製造される神経系細胞としては、特に限定されないが、神経細胞（ニューロン）、グリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア）、シュワン細胞などが例示される。上記した最終分化した細胞の他、神経系細胞に分化することが運命づけられた前駆細胞でもよい。

本発明の方法で製造される神経系細胞は、例えば、細胞の形態的変化により確認することができる。神経系細胞は、細胞の種類によって特徴的な形態をとることから、培養前後の細胞の形態を比較することによって神経系細胞の存在を知ることができる。また、神経系細胞に特徴的な分子、例えば、酵素、レセプター又は低分子化合物等を検出して、神経系細胞を確認することもできる。神経系細胞に特徴的な分子としては、β３−チューブリン、シナプシンＩ、ベジクル型グルタミン酸トランスポーター（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：ｖＧＵＬＴ）、微小管関連タンパク質（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＡＰ）２、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、チロシン水酸化酵素等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

上記分子の検出には、検疫的方法（抗体による検出）を利用できるが、タンパク質分子に関してはそのｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。神経系細胞に特徴的な分子を認識する抗体は、本発明の方法により得られた神経系細胞を単離及び精製する上でも有用である。

本発明の方法で製造される神経系細胞は、例えば、神経系疾患の治療に有用である。神経系疾患としては、脊髄損傷、脳血管障害（脳梗塞等）、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の方法で製造される神経系細胞を使用して、神経系疾患の治療のための医薬用組成物を製造することができる。

神経系細胞を医薬用組成物とする場合には、常法により、神経系細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。
神経系細胞はさらに、神経系細胞の機能発揮や生着性向上に有効な他の細胞や成分と組み合わせた組成物とすることもできる。

さらに、本発明の方法で製造される神経系細胞は、神経系細胞に作用する医薬候補化合物のスクリーニングや医薬候補化合物の安全性評価のために使用することもできる。本発明によれば、一度の操作で多くの神経系細胞を取得することができることから、細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能になる。

［２］組成物
本発明はさらに、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤を含む、体細胞から神経系細胞を製造するための組成物に関する。上記組成物は、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤を含むものでもよい。

本発明はさらに、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤、並びにｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの活性化剤及び／又は阻害剤を含む、組成物に関する。

本発明の組成物の具体例としては、下記の何れかの組み合わせを含む組成物を挙げることができる。
（１）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（２）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（３）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、及びＥｒｋ阻害剤；
（４）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤。

上記した活性化剤及び阻害剤の具体例及び好ましい例は、本明細書中上記した通りである。

本発明の組成物は、体細胞から神経系細胞を製造するための組成物として使用することができる。本発明の組成物はまた、体細胞から神経系細胞を製造するための培地として使用することもできる。

体細胞から神経系細胞の製造に使用される培地としては、細胞の培養に必要な成分を混合して製造した基礎培地に、有効成分として、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤を含有させた培地を例示することができる。上記の有効成分は、神経系細胞の製造に有効な濃度で含まれていればよく、濃度は当業者が適宜決定することができる。基礎培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はこれらを改変した培地を、基礎培地として使用することができる。

培地にはさらに、本明細書中で上記した公知の培地成分、例えば、血清、タンパク質（アルブミン、トランスフェリン、成長因子等）、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等を添加してもよい。

培地にはさらに、本明細書中で上記した、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；Ｂｒａｉｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ：Ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ）、ｃＡＭＰ、アスコルビン酸、アスコルビン酸−２−リン酸等の神経系細胞への分化の誘導に有効な物質を添加してもよい。

さらに本発明においては、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤を生体に投与することによって、生体内において体細胞から神経系細胞を製造することもできる。即ち、本発明によれば、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤を生体に投与することを含む、生体内において体細胞から神経系細胞を製造する方法が提供される。生体に投与する阻害剤の好ましい組み合わせは、本明細書中に記載した通りである。また、生体としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、ヒトが特に好ましい。ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤を生体内の特定部位に投与することによって、上記特定部位において、体細胞から神経系細胞を製造することができる。

Ｅ 心筋細胞に係る発明
［１］心筋細胞を製造する方法
本発明は、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下、かつｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＥｒｋ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程ｆを含む、心筋細胞を製造する方法に関する。
好ましくは、工程ｆが、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤の存在下、かつｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＥｒｋ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である。
好ましくは、工程ｆが、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である。
好ましくは、工程ｆが、ＧＳＫ３阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である。

工程ｆは、特に好ましくは、下記の何れかの存在下で体細胞を培養する工程である。
（１）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（２）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＥｒｋ阻害剤。

＜２種以上の阻害作用を有する阻害剤＞
上記した各種の阻害剤としては、２種類以上の阻害作用を有する阻害剤を使用してもよい。
例えば、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤としては、ＡＬＫ２及びＡＬＫ３の両方を阻害するＬＤＮ１９３１８９を使用することができ、あるいはＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６及びＡＭＰＫを阻害するドルソモルフィンを使用することもできる。即ち、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養することは、ＬＤＮ１９３１８９及び／又はドルソモルフィンの存在下で体細胞を培養することにより達成してもよい。

また、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤としては、ＡＬＫ６及びＡＭＰＫの両方を阻害するドルソモルフィンを使用することができる。即ち、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で体細胞を培養することは、ドルソモルフィンの存在下で体細胞を培養することにより達成してもよい。

＜その他の好ましい条件＞
本発明においては特に限定されないが、工程ｆにおいて、ＡＬＫ４阻害剤の非存在下で体細胞を培養することが好ましい。ＡＬＫ４阻害剤の非存在下とは、ＡＬＫ４阻害剤が実質的に存在しないことを意味し、ＡＬＫ４阻害剤が全く存在しない場合だけでなく、ＡＬＫ４阻害剤が痕跡量で存在する場合を包含するものとする。ＡＬＫ４は受容体セリンスレオニンキナーゼのサブファミリーメンバーであり、アクチビンによるシグナル伝達を媒介する。ＡＬＫ４は、脊椎動物の発生段階においてＣｒｉｐｔｏ存在下でＮｏｄａｌシグナル伝達を媒介する。
本明細書でＡＬＫ５阻害剤の一つとして例示したＳＢ４３１５４２（和光純薬工業製）は、ＡＬＫ４阻害作用も有しているが、本発明においては、ＡＬＫ５阻害剤としては、ＡＬＫ４阻害作用を有さない化合物を使用する方が好ましい。

＜体細胞の培養において＞
本発明においては、体細胞から心筋細胞を製造する。５−アザシチジン、ＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β）、アンジオテンシンＩＩ、ＢＭＰ−２（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）等は、心筋細胞への分化の誘導に有効な物質として知られている。心筋細胞への分化の誘導に有効な物質としては、例えば、分化誘導剤として市販されているものを使用することもできる。本発明においては、上記した物質の存在下において体細胞を培養することが好ましい。

＜心筋細胞＞
上記した本発明の心筋細胞の製造方法により、心筋細胞を含有する細胞集団を得ることができる。本発明による心筋細胞を製造する方法により製造される心筋細胞も本発明の範囲内である。本発明の方法で製造される心筋細胞は、最終分化した細胞の他、心筋細胞に分化することが運命づけられた前駆細胞でもよい。

本発明の方法で製造される心筋細胞は、例えば、細胞の形態的変化、心筋細胞の特徴的性質や特異的マーカーを利用して、検出、確認及び分離を行うことができる。
心筋細胞は、自律的に拍動するという他の細胞にない特徴を有しており、顕微鏡下での観察により他の細胞と区別することができる。また、心筋細胞の特異的マーカーとしては、心筋トロポニンＣ（ｃＴｎＴ）、αミオシン重鎖、αアクチン等が挙げられるが、これに限定されるものではない。

特異的マーカーの検出には、検疫的方法（抗体による検出）を利用できるが、タンパク質分子に関してはそのｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。心筋細胞の特異的マーカーを認識する抗体は、本発明の方法により得られた心筋細胞を単離及び精製する上でも有用である。

本発明の方法で製造される心筋細胞は、例えば、組織修復等のために使用することができる。本発明の方法で製造される心筋細胞を使用して、組織修復等のための医薬用組成物を製造することができる。心不全又は心筋梗塞等の心疾患の治療手段として、心筋細胞の製造方法、及び心筋細胞の移植方法の開発が行なわれている。例えば、心筋細胞と内皮細胞等を積層化することにより形成された心筋シートは、優れた治療効果と生着性を示すことから、重度の心不全の治療への利用が期待されている。

心筋細胞を医薬用組成物とする場合には、常法により、心筋細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。
心筋細胞はさらに、心筋細胞の機能発揮や生着性向上に有効な他の細胞や成分と組み合わせた組成物とすることもできる。

さらに、本発明の方法で製造される心筋細胞は、心筋細胞に作用する医薬候補化合物のスクリーニングや医薬候補化合物の安全性評価のために使用することもできる。心筋細胞は、医薬候補化合物の心毒性を評価するための重要なツールである。本発明によれば、一度の操作で多くの心筋細胞を取得することができることから、細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能になる。

［２］組成物
本発明はさらに、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤、並びにｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＥｒｋ阻害剤を含む、組成物に関する。
本発明の組成物は、好ましくは、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＥｒｋ阻害剤を含む。
本発明の組成物は、好ましくは、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤をさらに含む。
本発明の組成物は、好ましくは、ＧＳＫ３阻害剤をさらに含む。

本発明の組成物の具体例としては、下記の何れかの組み合わせを含む組成物を挙げることができる。
（１）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
（２）ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＥｒｋ阻害剤。
上記した活性化剤及び阻害剤の具体例及び好ましい例は、本明細書中上記した通りである。

本発明の組成物は、体細胞から心筋細胞を製造するための組成物として使用することができる。本発明の組成物はまた、体細胞から心筋細胞を製造するための培地として使用することもできる。

体細胞から心筋細胞の製造に使用される培地としては、細胞の培養に必要な成分を混合して製造した基礎培地に、有効成分として、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤、並びにｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＥｒｋ阻害剤とを含有させた培地を例示することができる。上記の有効成分は、心筋細胞の製造に有効な濃度で含まれていればよく、濃度は当業者が適宜決定することができる。基礎培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はこれらを改変した培地を、基礎培地として使用することができる。

培地にはさらに、本明細書中で上記した公知の培地成分、例えば、血清、タンパク質（アルブミン、トランスフェリン、成長因子等）、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等を添加してもよい。

培地にはさらに、本明細書中で上記した、心筋細胞への分化の誘導に有効な物質を添加してもよい。

さらに本発明においては、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤、並びにｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＥｒｋ阻害剤を生体に投与することによって、生体内において体細胞から心筋細胞を製造することもできる。即ち、本発明によれば、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤、並びにｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＥｒｋ阻害剤を生体に投与することを含む、生体内において体細胞から心筋細胞を製造する方法が提供される。生体に投与する阻害剤の好ましい組み合わせは、本明細書中に記載した通りである。また、生体としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、ヒトが特に好ましい。ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤、並びにｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤及びＥｒｋ阻害剤を生体内の特定部位に投与することによって、上記特定部位において、体細胞から心筋細胞を製造することができる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。

実施例Ａ：褐色脂肪細胞の製造１
＜ヒト線維芽細胞からの褐色脂肪細胞の誘導＞
（１）ヒト線維芽細胞
材料としたヒト線維芽細胞はＤＳファーマバイオメディカル株式会社から購入した。３８才のヒト皮膚に由来する線維芽細胞である。

（２）ヒト線維芽細胞からの褐色脂肪細胞への直接誘導
ヒト線維芽細胞を３５ｍｍディッシュに８×１０^４個ずつ播種し、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地（和光純薬工業製）で、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２日間培養した。なおＤＭＥＭは、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）を示す。

上記のヒト線維芽細胞のディッシュの培地をインスリン（終濃度１０μｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（終濃度２．５μｍｏｌ／Ｌ）、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（終濃度０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、ロシグリタゾン（終濃度１μｍｏｌ／Ｌ）、及び表１に従って添加した低分子化合物を含むＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）ｗｉｔｈ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ，Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（和光純薬工業製）に培地を交換した。その後、３日毎に同組成の培地へ培地交換を行いながら、３７℃、５％ ＣＯ_２条件下で培養した。表１に記載の化合物の詳細は、本明細書中上記の通りである。

（３）褐色脂肪細胞の評価
上記の（２）に従って培養した結果、培養開始６日後から脂肪細胞様の細胞が出現した。培養開始２１日後に細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定した後、免疫染色を行った。染色には抗ＵＣＰ１抗体（ａｂ１０９８３、ａｂｃａｍ社製；４００倍希釈で使用）を使用した。結果を図１に示す。図中、上段は免疫染色の結果であり、青がＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）による核染色、緑がＵＣＰ−１の染色結果を示す。なお、図１はモノクロであるため青色と緑色は表示されないが、図１のオリジナル写真では青色と緑色が表示される。下段は同視野内の位相差顕微鏡像を示す。

図１に示されるとおり、複数の低分子化合物を添加して培養することで褐色脂肪細胞のマーカーであるＵＣＰ−１陽性の細胞が出現することがわかる。さらに褐色脂肪細胞への分化には、ＴＧＦ阻害剤であるＳＢ４３１５４２、及びＢＭＰ阻害剤のうち、ＡＬＫ６阻害能、及びＡＭＰＫ阻害能を有するドルソモルフィンが好ましいことが分かる。

実施例Ｂ：褐色脂肪細胞の製造２
化合物の略号は以下を示す。
Ｇ：ＣＨＩＲ９９０２１
Ｍ：ＰＤ０３２５９０１
Ｓ：ＳＢ４３１５４２
Ｌ：ＬＤＮ１９３１８９
Ｆ：フォルスコリン
Ｄ：ドルソモルフィン
Ｒｏ：ロシグリタゾン

なお、５Ｃとは、Ｇ、Ｍ、Ｓ、Ｌ及びＦの５種の組み合わせを意味する。
５ＣＤとは、５ＣにＤを追加したものを意味する、
５ＣＤＲｏとは、５ＣにＤとＲｏを追加したものを意味する。
５ＣＤＲｏ−Ｇとは、５ＣＤＲｏからＧを除外したものを意味する。他の表記も上記と同様の意味を有する。

＜方法＞
（細胞培養）
ヒト皮膚線維芽細胞は、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社から購入した。細胞情報は下記表に記載する。

約１．５ｘ１０^５個の細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｕｔａｈ，ＵＳＡ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ ＤＭＥＭ培地（１１９９５−０６５，Ｇｉｂｃｏ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含む３５ｍｍディッシュに播種した。

（ヒト線維芽細胞から褐色脂肪細胞への直接転換）
各ヒト線維芽細胞が８０−９０％コンフルエントに達した後に、培地を変更して褐色脂肪細胞への直接転換を開始した。使用した脂肪細胞培地は、ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ ＤＭＥＭ培地（０４３−３００８５，和光純薬工業株式会社）に、アスコルビン酸、ビオチン、パントテン酸、トリヨードチロニン、オクタン酸、インスリン、デキサメタゾン、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）、ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを含む添加試薬（ＭＫ４２５，タカラバイオ株式会社）を添加して調製した。低分子化合物は全て和光純薬工業株式会社から購入し、以下の最終濃度で脂肪細胞培地に添加した。ＣＨＩＲ９９０２１（１μＭ）、ＰＤ０３２５９０１（１μＭ）、ＳＢ４３１５４２（２μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（１μＭ）、フォルスコリン（７．５μＭ）、ピフィスリンα（ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α）（５μＭ）、ドルソモルフィン（１μＭ）、及びロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）（１μＭ）。ヒト線維芽細胞は、表示した各化合物を含む脂肪細胞培地中で３週間培養した。培地は３日毎に交換した。細胞は、ロシグリタゾン（１μＭ）のみを含む脂肪細胞培地中でさらに１週間培養して、化学的に誘導した褐色脂肪細胞様細胞を成熟させた。

（免疫染色）
免疫細胞化学は、既報の通り行った（Ｄａｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｕｔｒ．２０１５；５６（３）：１６６−７０）。先ず、細胞を２％パラホルムアルデヒド（ナカライテスク社）で固定した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄後、細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳで１０分間インキュベートした。次いで、細胞を、３％スキムミルクを含有するＰＢＳにより室温で１時間ブロッキングした。ＵＣＰ−１抗体（ａｂ１０９８３，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）をブロッキング溶液で１／５００に希釈した。細胞を抗体と一晩４℃でインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ａ−２１２０６，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と２時間室温でインキュベートした。細胞核をＤＡＰＩ溶液（同仁化学研究所）で染色した。画像は全て蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｖｅｒｔ．Ａ１， Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて取得した。ミトコンドリアは、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて染色した。

（ＲＮＡ単離及びＱＲＴ−ＰＣＲ）
遺伝子発現を定量するために、全ＲＮＡを、各化合物で処理した線維芽細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。対照として、線維芽細胞を、脂肪細胞培地を用いて並行して培養した。０．１μＭ、１μＭ及び１０μＭのイソプロテレノール又はフォルスコリンで３時間又は６時間処理した後に、化合物で誘導した褐色脂肪細胞及び対照細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（登録商標）ＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡）により逆転写した後に、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてリアルタイムＰＣＲ解析を行った。反応は以下の条件において、１水準につき３反応を実施した。９５℃で１０分の後に、９５℃で１５秒及び６０℃で６０秒を４０サイクル。結果は全て、Ｔｂｐ ｍＲＮＡの量で標準化した。ＱＲＴ−ＰＣＲで使用したプライマーは下記表に示す。

（酸素消費速度の測定）
ミトコンドリアによる酸素消費速度（ｏｘｙｇｅｎ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｒａｔｅ：ＯＣＲ）の測定のために、０歳、３８歳及び４９歳の３種の異なる線維芽細胞を、化合物の組み合わせ（５ＣＤＲｏ−ＧＭ；即ち、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ１９３１８９、フォルスコリン、ドルソモルフィン、ロシグリタゾン）により９６ウエルプレート上において３週間、直接転換した。対照として、線維芽細胞を脂肪細胞培地で並行して培養した。成熟させるために、これらの細胞は、ロシグリタゾンのみを含む脂肪細胞培地中でさらに１週間培養した。３７℃の非ＣＯ_２インキュベーター内で１時間インキュベートした後、化合物で誘導した褐色脂肪細胞を含む各ウエルの酸素消費速度を、ＸＦ９６ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｌｕｘ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて取扱説明書に従って分析した。分析中、オリゴマイシン、ＦＣＣＰ（カルボニルシアニド４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン）、及びアンチマイシンＡ／ロテノンを各ウエルに注入装置を介して最終濃度がそれぞれ２μＭ、０．２５μＭ及び０．５μＭになるように添加した。

＜結果＞
（ヒト線維芽細胞から脂肪細胞への直接転換用の化合物の同定）
図２に示す通り、５ＣＤＲｏの組み合わせにより、直接転換が促進された。５ＣＤＲｏ（ＣＨＩＲ９９０２１、ＰＤ０３２５９０１、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ１９３１８９、フォルスコリン、ドルソモルフィン、ロシグリタゾン）の組み合わせからＣＨＩＲ９９０２１及びＰＤ０３２５９０１を除くと、転換効率及び脂肪滴の形成が改善した（図２）。

脂肪細胞特異的遺伝子の発現を、化合物の組み合わせで処理した細胞中において定量した。Ｆａｂｐ４の発現は対照と比較して、化合物の組み合わせで処理した細胞中において上昇していた（図３）。

（化合物で誘導した脂肪細胞様細胞におけるＵｃｐ１発現及びミトコンドリア発生の増加）
各化合物の組み合わせで細胞を３週間インキュベートした後、ロシグリタゾン以外の化合物を脂肪細胞培地から除いて１週間インキュベートした。これにより、脂肪細胞様細胞の成熟が明らかに促進し、脂肪滴の量が増大した。
５ＣＤＲｏ−Ｇ（ＰＤ０３２５９０１，ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ１９３１８９、フォルスコリン、ドルソモルフィン、ロシグリタゾン）は、褐色脂肪細胞を効率的に生成した（図４及び下記表）。

ＣＨＩＲ９９０２１以外の化合物の一種を、５ＣＤＲｏ−Ｇから除外した結果を図５に示す。ＰＤ０３２５９０１又はＬＤＮ１９３１８９を除外すると、脂肪細胞様細胞の生成効率が最大になった。「フォルスコリン、ドルソモルフィン及びＳＢ４３１５４２」、「フォルスコリン、ＬＤＮ１９３１８９及びＳＢ４３１５４２」、「ドルソモルフィン、ＬＤＮ１９３１８９及びＳＢ４３１５４２」、及び「ドルソモルフィン、ＰＤ０３２５９０及びＳＢ４３１５４２」などの３種の化合物を含む組み合わせは、脂肪細胞様細胞への効率的な転換を示した（図６）。２種以下の化合物の場合においても、直接転換することが示された（図７及び図８）。

化合物の各種の組み合わせについての脂肪細胞様細胞への転換の効率を、図４〜図８に示す結果から評価した結果を下記表に示す。なお、図４〜図８は免疫染色の結果を位相差顕微鏡で観察した結果であるが、その細胞の状態から総合的に効率を判断した。＋のマークの数が多いほど、転換効率が高いことを示す。例えば＋＋＋＋は、ほぼすべて褐色脂肪細胞に転換したことを示す。−のマークは、褐色脂肪細胞に転換しなかったことを示す。

５ＣＤＲｏ−ＧＭ（ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ１９３１８９、フォルスコリン、ドルソモルフィン、ロシグリタゾン）の直接転換での有用性を確認するために、ヒト成人及び新生児（３８歳、４９歳及び０歳）由来の３種の線維芽細胞株を試験した。ロシグリタゾンによる最後の１週間の成熟後に、線維芽細胞は全て脂肪細胞様細胞を生成した（図９のＡ−Ｃ）。

免疫細胞化学分析も行って、タンパク質発現とＵＣＰ１の細胞局在を分析した。その結果、脂肪細胞様細胞の大部分はＵＣＰ−１陽性であることが判明し、褐色脂肪細胞の特徴を有していることが示された。さらに、ＵＣＰ−１染色は、ミトコンドリアシグナルの上昇と十分に重複していた。オイルレッド染色により、脂肪細胞様細胞が多量の脂肪滴を有することを確認した（図１０）。

（化合物で誘導した褐色脂肪細胞におけるヒト褐色脂肪細胞特異的遺伝子の発現誘導）
化合物で誘導した褐色脂肪細胞の遺伝子発現を特徴付けるために、ヒト褐色脂肪組織に特異的な複数のマーカー遺伝子を、ＱＲＴ−ＰＣＲにより定量した。０歳（新生児）、３８歳及び４９歳の３人のヒト由来の線維芽細胞を５ＣＤＲｏ−ＧＭと一緒に３週間培養した後に、ロシグリタゾンで１週間成熟化した。

Ｕｃｐ１ ｍＲＮＡは、化合物の添加なしの対照と比較して、全ての線維芽細胞において誘導されていた（図１１のＡ）。Ｃｋｍｔ１（ミトコンドリアクレアチンキナーゼ及びＣｉｔｅｄ１（ヒト褐色脂肪細胞マーカー）の発現は、全ての線維芽細胞で誘導されていた（図１１のＡ）。Ｃｏｌ１ａ２（線維芽細胞のマーカーの一つ）は約４０％〜８０％減少したので、細胞の運命が線維芽細胞から褐色脂肪細胞に変化したことが示された（図１１のＢ）。化合物で誘導した褐色脂肪細胞において、脂肪生成分化マーカーであるＦａｂｐ４， ＡｄｉｐｏＱ、及びＰｐａｒγの発現は、全ての線維芽細胞について増加していた（図１１のＣ）。なお、図１１中の５ＣＤとは５ＣＤＲｏを意味し、５ＣＤ−ＭＧは５ＣＤＲｏ−ＭＧと同義である。

（化合物で誘導した褐色脂肪細胞における熱産生のための機能的βアドレナリン受容体シグナル）
Ｕｃｐ１を介した熱産生は、褐色脂肪細胞においては交感神経系及びβアドレナリン受容体シグナル経路により調節される。化合物で誘導した褐色脂肪細胞における熱産生能を評価するために、異なる３種の濃度のイソプロテレノール（βアドレナリン受容体アゴニスト）で３時間又は６時間処理した後に、Ｕｃｐ１ ｍＲＮＡを定量した（図１２のＡ）。３時間の処理によりＵｃｐ１ ｍＲＮＡは僅かに増大し、６時間の処理により未処理の細胞と比較して約４〜５倍まで顕著に増大した。Ｕｃｐ１の誘導が細胞ｃＡＭＰ濃度の増大を介するものであることを確認するために、細胞を異なる３種の濃度のフォルスコリンで３時間又は６時間処理した（図１２のＢ）。未処理の細胞と比較して、３時間の処理より６時間の処理をした細胞の方がＵｃｐ１発現は増大していた。対照的に、他のヒト褐色脂肪細胞特異的遺伝子であるＣｋｍｔ１及びＣｉｔｅｄ１の発現については大きな変化は見られなかった。上記結果は、発現の上昇はＵｃｐ１などの熱発生遺伝子に特異的なものであることを示唆している（図１２のＣ及びＤ）。また上記結果は、熱発生遺伝子誘導に対してβアドレナリン受容体シグナル経路に応答できることを示している。

（化合物で誘導した褐色脂肪細胞における酸素消費速度（ＯＣＲ）の増加）
化合物で誘導した褐色脂肪細胞におけるミトコンドリアの増加が、酸素消費速度の増大と関連していることを実証するために、異なるヒト線維芽細胞由来の褐色脂肪細胞をＦｌｕｘアナライザーで分析した。ＯＣＲ値は、測定中に摂動試薬を添加することにより典型的変化し、３８歳の線維芽細胞由来の褐色脂肪細胞は対照と比較してより高いＯＣＲを示した（図１３のＡ）。他の線維芽細胞からの褐色脂肪細胞も、ＯＣＲの増大を示した（図１３のＢ及びＣ）。上記結果により、化合物で誘導した褐色脂肪細胞においてはミトコンドリアにおける酸化代謝が亢進し活性になっていることが示された。

実施例Ｃ：骨芽細胞の製造
＜ヒト線維芽細胞からの骨芽細胞の誘導＞
（１）ヒト線維芽細胞
材料としたヒト線維芽細胞はＤＳファーマバイオメディカル株式会社から購入した。３８才のヒト皮膚に由来する線維芽細胞である。

（２）ヒト線維芽細胞からの骨芽細胞への直接誘導
ヒト線維芽細胞を３５ｍｍディッシュに５×１０^４個ずつ播種し、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製）で、３７℃、５％ＣＯ_２条件下でコンフルエントになるまで培養した。なおＤＭＥＭは、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）を示す。

上記のヒト線維芽細胞のディッシュの培地を、骨芽細胞分化誘導剤（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ−Ｉｎｄｕｃｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ；タカラバイオ社製）、および表１に従って添加した低分子化合物を含むＲＰＭＩ１６４０ ｗｉｔｈ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ（和光純薬工業社製）に培地を交換した。その後、３日毎に同組成の培地へ培地交換を行いながら、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。表６に記載の化合物の詳細は、本明細書中上記の通りである。

（３）骨芽細胞の評価
上記（２）に従って培養した結果、培養開始７日後から骨芽細胞様の細胞が出現した。培養開始２１日後に常法に従ってｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色に供し、カルシウムの沈着有無を評価した。結果を図１４に示す。図中、上段はｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色の結果を示し、下段は同視野内の位相差顕微鏡像を示す。

図１４に示されるとおり、実施例１及び実施例２においてｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色によるカルシウムの沈着が認められる細胞が出現することがわかる。さらに骨芽細胞の分化にはｃＡＭＰ活性化剤であるフォルスコリン、ＴＧＦ阻害剤であるＳＢ４３１５４２、ＢＭＰ阻害剤のうち、ＡＬＫ２／３阻害能をもち、ＡＬＫ６阻害能とＡＭＰＫ阻害能を有さないＬＤＮ１９３１８９、およびＧＳＫ−３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１が重要であり、かつＥｒｋ阻害剤であるＰＤ３２５９０１は添加しないほうが好ましいことがわかる。

実施例Ｄ：軟骨細胞の製造
＜ヒト線維芽細胞からの軟骨細胞の誘導＞
（１）ヒト線維芽細胞
材料としたヒト線維芽細胞はＤＳファーマバイオメディカル株式会社から購入した。３８才のヒト皮膚に由来する線維芽細胞である。

（２）ヒト線維芽細胞からの軟骨細胞への直接誘導
ヒト線維芽細胞を３５ｍｍディッシュに５×１０^４個ずつ播種し、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で、３７℃、５％ＣＯ_２条件下でコンフルエントになるまで培養した。なおＤＭＥＭは、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）を示す。

上記のヒト線維芽細胞のディッシュの培地を、Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製；終濃度１％）、アスコルビン酸−２−リン酸（Ｗａｋｏ社製；終濃度５０μｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（Ｗａｋｏ社製；終濃度０．１μＭ）、ＴＧＦ−β３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ製；終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｌ−プロリン（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社製；終濃度４０μｇ／ｍｌ）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製；終濃度１×）、および表１に従って添加した低分子化合物を含むＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に培地を交換した。その後、３日毎に同組成の培地へ培地交換を行いながら、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。表７に記載の化合物の詳細は、本明細書中上記の通りである。

（３）軟骨細胞の評価
実施例（２）に従って培養した結果、培養開始７日後から軟骨細胞様の細胞が出現した。培養開始２１日後に常法に従ってアルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ）染色に供し、軟骨基質である酸性多糖の有無を評価した。結果を図１５に示す。図中、上段はＡｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ染色の結果を示し、下段は同視野内の位相差顕微鏡像を示す。

図１５に示されるとおり、実施例１においてＡｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ染色による酸性多糖の産生が認められる細胞が出現することがわかる。さらに軟骨細胞への分化にはｃＡＭＰ活性化剤であるフォルスコリン、ＴＧＦ阻害剤であるＳＢ４３１５４２、ＢＭＰ阻害剤のうち、ＡＬＫ２／３阻害能をもつＬＤＮ１９３１８９、ＧＳＫ−３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１の添加が重要であり、かつＢＭＰ阻害剤のうち、ＡＬＫ６阻害能、およびＡＭＰＫ阻害能をもつドルソモルフィン、Ｅｒｋ阻害剤であるＰＤ０３２５９０１を含まないことが望ましいことがわかる。

実施例Ｅ：神経系細胞の製造
＜ヒト線維芽細胞からの神経系細胞の誘導＞
（１）ヒト線維芽細胞
材料としたヒト線維芽細胞はＤＳファーマバイオメディカル株式会社から購入した。３８才のヒト皮膚に由来する線維芽細胞である。

（２）ヒト線維芽細胞からの神経系細胞への直接誘導
ヒト線維芽細胞を３５ｍｍディッシュに８×１０^４個ずつ播種し、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地（和光純薬工業製）で、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２日間培養した。なおＤＭＥＭは、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）を示す。

上記のヒト線維芽細胞のディッシュの培地を、０．５％ Ｎ−２サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、１％ Ｂ−２７サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、５０％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、５０％ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、および表１に従って添加した低分子化合物を含む培地に交換した。その後、３日毎に同組成の培地へ培地交換を行いながら、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。表８に記載の化合物の詳細は、本明細書中上記の通りである。

（３）神経系細胞の評価
上記（２）に従って培養した結果、培養開始５日後から神経様の突起構造が認められた。培養開始１４日後に細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定した後、免疫染色を行った。染色には抗βＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（ＭＭＳ−４３５Ｐ、Ｃｏｖａｎｃｅ社製；１０００倍希釈で使用）を使用した。結果を図１６に示す。図中、上段は免疫染色の結果であり、青がＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）による核染色、緑がβ３−チューブリン（βＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎ）の染色結果を示す。下段は同視野内の位相差顕微鏡像を示す。

図１６に示されるとおり、実施例１〜５においてβＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎ陽性細胞が出現することがわかる。さらに神経系細胞への分化にはＢＭＰ阻害剤のうち、ＡＬＫ６阻害能、ＡＭＰＫ阻害能をもつドルソモルフィンが重要であることがわかる。

実施例Ｆ：心筋細胞の製造
＜ヒト線維芽細胞からの心筋細胞の誘導＞
（１）ヒト線維芽細胞
材料としたヒト線維芽細胞はＤＳファーマバイオメディカル株式会社から購入した。３８才のヒト皮膚に由来する線維芽細胞である。

（２）ヒト線維芽細胞からの心筋細胞への直接誘導
ヒト線維芽細胞を３５ｍｍディッシュに８×１０^４個ずつ播種し、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２日間培養した。なおＤＭＥＭは、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）を示す。

上記のヒト線維芽細胞のディッシュの培地を、１０％ウシ胎児血清、１％ Ｎ−２サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、２％ Ｂ−２７サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および表１に従って添加した低分子化合物を含むＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）ｗｉｔｈ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ，Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（和光純薬工業製）に交換した。その後、３日毎に同組成の培地へ培地交換を行いながら、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。表９に記載の化合物の詳細は、本明細書中上記の通りである。

（３）心筋細胞の評価
上記の（２）に従って培養した結果、培養開始８日後から収縮、あるいは拍動する単体の細胞や小さな細胞塊が認められた。培養開始２１日以降には収縮、あるいは拍動する心筋細胞様の塊が多数散見されるようになった。培養開始２１日後に細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定した後、免疫染色を行った。染色には抗ｃＴｎＴ抗体（ａｂ１０２１４、ａｂｃａｍ社製；２００倍希釈で使用）を使用した。結果を図１７に示す。図中、上段は免疫染色の結果であり、青がＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）による核染色、緑がｃＴｎＴの染色結果を示す。下段は同視野内の位相差顕微鏡像を示す。

図１７に示されるとおり、実施例１〜４においてにおいてｃＴｎＴ陽性細胞が出現することがわかる。さらに心筋細胞への分化にはｃＡＭＰ活性化剤であるフォルスコリン、ＴＧＦ阻害剤であるＲｅｐｓｏｘ、ＢＭＰ阻害剤のうち、ＡＬＫ６阻害能、ＡＭＰＫ阻害能をもつドルソモルフィン、Ｅｒｋ阻害剤であるＰＤ０３２５９０１が重要であることがわかる。

Claims (8)

1. ＡＬＫ５阻害剤の存在下、並びにＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、及びＡＬＫ３阻害剤の存在下、かつｐ５３阻害剤の非存在下で線維芽細胞を出発材料として培養する工程ａを含む、褐色脂肪細胞を製造する方法。
2. 上記工程ａが、さらに、ｃＡＭＰ活性化剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの活性化剤及び／又は阻害剤の存在下で線維芽細胞を出発材料として培養する工程である、請求項１に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
3. 上記工程ａが、下記の何れかの存在下で線維芽細胞を出発材料として培養する工程である、請求項１又は２の褐色脂肪細胞を製造する方法。
   （１）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
   （２）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤；
   （３）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
   （４）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
   （５）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤。
4. ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、及びＡＬＫ３阻害剤の存在下で線維芽細胞を出発材料として培養することが、ドルソモルフィン又はドルソモルフィン及びＬＤＮ１９３１８９の存在下で線維芽細胞を出発材料として培養することである、請求項１から３の何れか一項に記載の褐色脂肪細胞を製造する方法。
5. ＡＬＫ５阻害剤と、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、及びＡＬＫ３阻害剤とを含む組成物であって、線維芽細胞を出発材料として培養し、かつ該線維芽細胞から褐色脂肪細胞を製造するための組成物（但し、ｐ５３阻害剤を含むものを除く。）。
6. ｃＡＭＰ活性化剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの活性化剤及び／又は阻害剤をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
7. 下記の何れかの組み合わせを含む、請求項５又は６に記載の組成物。
   （１）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
   （２）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤及びＡＬＫ３阻害剤；
   （３）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
   （４）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤；
   （５）ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤。
8. ＡＬＫ６阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、及びＡＬＫ３阻害剤が、ドルソモルフィン又はドルソモルフィン及びＬＤＮ１９３１８９である、請求項５から７の何れか一項に記載の組成物。
   
   

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