CN110592003B - 体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，所述方法包括：A、将人皮肤成纤维细胞于基础培养基中进行体外培养并传代，待细胞汇合度达80‑100％时，进行诱导分化；B、将步骤A的基础培养基换成诱导分化培养基①，培养6‑10天，每两天换液一次；然后，将诱导分化培养基①换成诱导分化培养基②，培养2‑4天；最后换成基础培养基，培养8‑14天，每两天换液一次。本发明成功解决了将人皮肤成纤维细胞诱导分化成脂肪细胞的难题；通过将皮肤成纤维细胞诱导分化成脂肪细胞，减小皮肤在创伤愈合时留下的疤痕，为临床上的创伤修复和疤痕修复等提供新思路、新疗法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法。
背景技术
目前，脂肪细胞体外诱导分化方法基本一致，都是将原代小鼠胚胎成纤维细胞诱导分化成脂肪细胞的方案。该方案是目前较为成熟的脂肪细胞诱导分化方案，被广泛应用于脂肪代谢及脂肪细胞诱导分化等研究中。该方案中的细胞来源是原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，取材相对繁琐，组织来源受限；另外，该方案不能将人皮肤成纤维细胞诱导分化成脂肪细胞，因此不能应用于临床上的皮肤创伤修复和疤痕修复等。
发明内容
本发明的目的是提供一种体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，包括以下步骤：
A、将人皮肤成纤维细胞于基础培养基中进行体外培养并传代，待细胞汇合度达80-100％时，进行诱导分化；
B、将步骤A的基础培养基换成诱导分化培养基①，培养6-10天，每两天换液一次；然后，将诱导分化培养基①换成诱导分化培养基②，培养2-4天；最后，将诱导分化培养基②换成基础培养基，培养8-14天，每两天换液一次；
其中，所述基础培养基为含10-20％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基；
所述诱导分化培养基①选自如下a～c中的任一种：
a.含0.5-1μM地塞米松、10-20μg/mL胰岛素、1-2μM罗格列酮和0.2-0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基；
b.含0.5-1μM地塞米松、10-20μg/mL胰岛素和1-2μM罗格列酮的基础培养基；
c.含0.5-1μM地塞米松、10-20μg/mL胰岛素和0.2-0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基；
所述诱导分化培养基②为含10-20μg/mL胰岛素的基础培养基。
优选地，所述诱导分化培养基①为含0.5-1μM地塞米松、10-20μg/mL胰岛素、1-2μM罗格列酮和0.2-0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基。
上述培养基最好现配现用，避免药物的有效成分降解。
在本发明的一个具体实施方式中，体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法包括：
1)将人皮肤成纤维细胞于基础培养基中进行体外培养并传至第6代，待细胞汇合度达95％时，进行诱导分化；
2)将步骤1)的基础培养基换成诱导分化培养基①，培养6天，每两天换液一次；然后，将诱导分化培养基①换成诱导分化培养基②，培养2天；最后，将诱导分化培养基②换成基础培养基，培养8天，每两天换液一次。
所述诱导分化培养基①为含1μM地塞米松、20μg/mL胰岛素、2μM罗格列酮和0.5mM1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基。所述诱导分化培养基②为含20μg/mL胰岛素的基础培养基。
优选地，步骤A中按1:2-3的比例(优选1:2或1:3)进行人皮肤成纤维细胞传代。
优选地，步骤A中用于诱导分化的人皮肤成纤维细胞的代数≤10代，优选2～6代。
前述的方法，细胞培养条件为：35℃～37℃，5％CO2，优选37℃，5％CO2。
第二方面，本发明提供按照上述方法制备的脂肪细胞。
第三方面，本发明提供所述脂肪细胞的以下任一应用：
(1)用于制备生物医用材料及组织修复材料；
(2)用于创伤修复和疤痕修复。
本发明中使用的细胞来源是原代人皮肤成纤维细胞(HDF)，取材及分离方便。细胞分离方法如下：首先，从志愿者皮肤上取下直径为1mm的皮肤组织，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗3次；然后，在超净工作台中用眼科剪去除多余的脂肪组织，并且剪碎剩下的组织，用PBS清洗3次；然后加入0.25％的胰酶浸没所有的组织块，放在含有5％CO2的细胞培养箱中，37℃消化10min；消化结束后，加入含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基终止消化。然后用移液枪轻轻反复吹吸，将细胞团吹散。最后，将细胞悬液分别转移到35mm培养皿中，加入4ml含有20％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基，放在细胞培养箱中，在5％CO2，37℃条件下培养4-6天。培养过程中，可以根据培养皿内培养基的量，适当补加培养基。最后，分离出的细胞就是原代人皮肤成纤维细胞。在整个细胞分离过程中，要保证无菌操作，并且要在培养基中加入双抗(青-链霉素)，避免污染。待细胞分离出来后，要进行支原体检测，确定没有支原体污染后，细胞才可以用于后续实验。我们通过多次诱导分化实验发现，用于诱导分化的HDF细胞代数不要太高，最好在10代以内；10代以上的HDF细胞诱导分化效率比较低，并且代数越高，诱导分化越难，分化效率越低。因此，为了便于以后的诱导分化实验，要尽可能多地冻存代数低的HDF细胞
诱导方案：整个HDF细胞诱导分化过程主要包括细胞周期阻滞、诱导分化两部分。首先，通过药物处理或者细胞接触抑制，将HDF细胞退出有丝分裂期；然后，通过一系列诱导处理，促进HDF细胞内的脂代谢，进而促进脂肪合成和脂肪累积。本发明采取细胞接触抑制的方法，使HDF细胞退出有丝分裂期；此外，通过增加诱导分化培养基中胰岛素的浓度，来减少诱导分化过程中的细胞凋亡。通过反复实验摸索出“6+2+8＝16天”的诱导分化模式，可以有效地将HDF细胞诱导分化成脂肪细胞。其具体步骤是：诱导分化培养基①处理6天，诱导分化培养基②处理2天，基础培养基处理8天。我们发现，诱导分化培养基①的处理时间至少为6天，否则细胞很很难被诱导分化。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明成功解决了将人皮肤成纤维细胞诱导分化成脂肪细胞的难题；以第6代人皮肤成纤维细胞为例，采用“6+2+8＝16天”诱导分化模式，成功将人皮肤成纤维细胞诱导分化成脂肪细胞；并且发现诱导分化培养基①的处理时间至少为6天，不然诱导分化效率低。油红染色结果显示，HDF细胞分化成脂肪细胞的效率为30％左右。
(二)本发明首次提出人皮肤成纤维细胞诱导分化成脂肪细胞的最佳代数，为10代以内。
(三)本发明首次发现添加3-isobutyl-1-methylxanthine(1-甲基-3-异丁基黄嘌呤)，可以有效促进皮肤成纤维细胞分化成脂肪细胞。
(四)通过将皮肤成纤维细胞诱导分化成脂肪细胞，减小皮肤在创伤愈合时留下的疤痕，为临床上的创伤修复和疤痕修复等提供新思路、新疗法。
附图说明
图1为本发明实施例1中人皮肤成纤维细胞诱导分化为脂肪细胞的油红染色结果。
图2为本发明实施例1中人皮肤成纤维细胞诱导分化为脂肪细胞的油红染色统计结果。
图3为本发明实施例1中诱导分化得到的脂肪细胞的标志基因检测结果。
图4为本发明实施例2中人皮肤成纤维细胞诱导分化为脂肪细胞的油红染色结果。
图5为本发明实施例2中人皮肤成纤维细胞诱导分化为脂肪细胞的油红染色统计结果。
图6为本发明实施例2中诱导分化得到的脂肪细胞的标志基因检测结果。
图7为本发明实施例3中人皮肤成纤维细胞诱导分化为脂肪细胞的油红染色结果。
图8为本发明实施例3中人皮肤成纤维细胞诱导分化为脂肪细胞的油红染色统计结果。
图9为本发明实施例3中诱导分化得到的脂肪细胞的标志基因检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的高糖DMEM培养基购自Gibco公司。
实施例1体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法
本实施例以分离的原代人皮肤成纤维细胞(第6代)为例，采用“6+2+8＝16天”诱导分化模式，将原代人皮肤成纤维细胞体外诱导分化为脂肪细胞。具体方法如下：
1、将约105个HDF细胞传代到35mm培养皿中，加入4ml基础培养基，放在培养箱培养2天。细胞培养条件为37℃，5％CO2，下同。
2、待细胞汇合度达95％时，将培养基更换成3ml诱导分化培养基①，每两天更换一次，诱导培养6天。
3、将诱导分化培养基①更换成3ml诱导分化培养基②，培养2天。
4、将诱导分化培养基②换成4ml基础培养基，每两天更换一次，培养8天。
整个诱导分化过程中涉及到3种培养基，分别是基础培养基，诱导分化培养基①和诱导分化培养基②。配方如下：
基础培养基：高糖DMEM培养基(高糖Dulbecco’s modified Eagle medium)+20％胎牛血清+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素；
诱导分化培养基①：在基础培养基中，加入Dexamethasone(地塞米松)，insulin(胰岛素)，Rosiglitazone(罗格列酮)，3-isobutyl-1-methylxanthine(1-甲基-3-异丁基黄嘌呤)，终浓度分别为1μM，20μg/mL，2μM，0.5mM；
诱导分化培养基②：在基础培养基中，加入终浓度为20μg/mL的胰岛素；
培养基最好现配现用，避免药物的有效成分降解。
具体步骤如下：
(1)将盖玻片在75％酒精中洗3次，然后在酒精灯上灼烧灭菌，铺在35mm的培养皿中，每个培养皿铺4个盖玻片；加入4ml基础培养基，用镊子将重叠的盖玻片铺开，以备后续细胞传代使用。
(2)待10cm培养皿里的原代HDF细胞长满后，进行细胞传代。首先，吸掉培养皿中的培养基，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗2次，每次2ml；然后吸掉PBS，加入1ml浓度为0.25％的胰酶，双手反复晃动培养皿，使胰酶均匀浸润培养皿底部；最后放在含有5％CO2的细胞培养箱中，37℃消化1-2min。
(3)取出消化的细胞，往培养皿中加入0.5ml基础培养基，终止消化；然后用移液器反复吹吸，将细胞吹匀，并切转移到1.5ml离心管中，1000rpm离心4分钟。
(4)吸掉上清，加入1ml基础培养基，轻轻反复吹吸，将细胞混匀；然后按1：4的传代比例，将细胞悬液平均分到4个之前铺有盖玻片的35mm培养皿中，双手反复晃动培养皿，使细胞混匀，然后放在细胞培养箱中培养。
(5)24h后，取出培养皿放在10倍显微镜下观察，可以看到细胞已经贴壁，并且呈上皮样细胞铺展开；72h后，细胞差不多可以长满。一定要等到细胞长满，发生接触抑制后才可以进行后续的诱导分化；否则，诱导分化效率会降低。
(6)吸掉基础培养基，加入3ml诱导分化培养基①，放回细胞培养箱中继续培养6天，每两天更换一次新鲜培养基；为了避免在添加培养基时将细胞吹起，要贴壁进行操作；在这步诱导分化过程中，会出现细胞凋亡；为了减轻这种情况，可以适当提高培养基中胰岛素的浓度。随着诱导分化的进行，在10倍显微镜下会发现细胞内逐渐出现圆形脂肪滴。
(7)诱导分化培养基①处理6天后，更换为诱导分化培养基②，继续培养2天。
(8)然后将培养基更换为基础培养基，继续培养8天，每两天更换一次新鲜培养基；在显微镜下观察发现含有脂肪滴的细胞越来越多，并且细胞内的脂肪滴越来越大。
(9)诱导分化结束后，取出培养皿中的盖玻片进行油红染色，检测诱导分化效果；另外，提取培养皿剩余细胞的RNA，进行荧光定量PCR，检测成熟脂肪细胞的标志基因Adiponectin，Fabp4和Leptin的表达，进一步验证诱导分化的结果。
I、油红染色
油红O是一种很强的脂溶剂和染脂剂，能够与甘油三酯结合，因此常被用于脂肪染色。我们对诱导分化后的细胞进行油红染色，来检测成熟脂肪细胞内的脂肪滴。
具体操作如下：
1)将盖玻片用PBS洗3次，然后用4％多聚甲醛(PFA)固定20min；
2)用PBS洗3次后，用60％异丙醇平衡5min；
3)用浓度为3g/L的油红O(溶解在60％异丙醇中)密闭染色10min；
4)用60％异丙醇洗3次；
5)用苏木精染色2min；
6)用PBS洗3次，晾干后封片进行成像。
II、成熟脂肪细胞标志基因检测
Adiponectin，Fabp4和Leptin是成熟脂肪细胞的标志基因，常被用来衡量脂肪细胞诱导分化的效果。采用Trizol法从诱导分化后的细胞中提取总RNA，然后反转录后进行荧光定量PCR，检测Adiponectin，Fabp4和Leptin这三个基因的表达水平。
所用PCR引物序列如下：
Adiponectin:5’-GATGGCAGAGATGGCAC-3’
5’-GCTGAGCGGTATACATAGG-3’
Fabp4:5’-ACGAGAGGATGATAAACTGGTGG-3’
5’-GCGAACTTCAGTCCAGGTCAAC-3’
Leptin:5’-CACCAAAACCCTCATCAAGACA-3’
5’-CTTTCTGTTTGGAGGAGACTGACT-3’
油红染色结果见图1，如图所示，着色部分是染色的脂肪(经油红染色后呈红色)，未诱导的HDF细胞没有脂肪累积；而诱导分化16天的HDF细胞有明显的脂肪累积。油红染色统计结果见图2，如图所示，未诱导的HDF细胞中油红染色呈阳性的细胞数为0；而诱导分化16天的HDF细胞中油红染色呈阳性的细胞数为325个/cm2(HDF细胞分化成脂肪细胞的效率约为30％)。
成熟脂肪细胞标志基因检测结果见图3，如图所示，通过定量PCR(quantitativePCR)，检测了Adiponectin，Fabp4，Leptin三个成熟脂肪细胞的标志基因。未诱导的HDF细胞中检测不到这三个基因的表达；而在诱导分化16天的HDF细胞中检测到了这三个基因的高水平表达。
本发明成功解决了将人皮肤成纤维细胞诱导分化成脂肪细胞的难题；通过将皮肤成纤维细胞诱导分化成脂肪细胞，减小皮肤在创伤愈合时留下的疤痕，为临床上的创伤修复和疤痕修复等提供新思路、新疗法。
实施例2诱导分化培养基①成分优化实验
本实施例具体实验步骤同实施例1，同样采用“6+2+8＝16天”诱导分化模式，对原代人皮肤成纤维细胞(第6代)进行诱导分化。所不同的是，对诱导分化培养基①成分做出以下调整：
对照组：诱导分化培养基①含有1μM地塞米松、20μg/mL胰岛素、2μM罗格列酮、0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤；
无地塞米松组：诱导分化培养基①含有20μg/mL胰岛素、2μM罗格列酮、0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤；
无胰岛素组：诱导分化培养基①含有1μM地塞米松、2μM罗格列酮、0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤；
无罗格列酮组：诱导分化培养基①含有1μM地塞米松、20μg/mL胰岛素、0.5mM1-甲基-3-异丁基黄嘌呤；
无黄嘌呤组：诱导分化培养基①含有1μM地塞米松、20μg/mL胰岛素、2μM罗格列酮。
油红染色结果见图4，如图所示，相对于对照组，诱导后的无黄嘌呤组和无罗格列酮组油红染色减少，而无胰岛素组和无地塞米松组观察不到油红染色。
油红染色统计结果见图5，如图所示，相对于对照组，诱导后的无黄嘌呤组和无罗格列酮组油红染色细胞数减少，而无胰岛素组和无地塞米松组油红染色细胞数为0。
成熟脂肪细胞标志基因检测结果见图6，如图所示，相对于对照组，诱导后的无黄嘌呤组和无罗格列酮组Adiponectin，Fabp4，Leptin三个成熟脂肪细胞的标志基因表达减少，而无胰岛素组和无地塞米松组检测不到这三个基因的表达。
以上实验结果表明，胰岛素和地塞米松是诱导分化必不可少的，缺少其中任一成分，无诱导效果；而罗格列酮和1-甲基-3-异丁基黄嘌呤对诱导分化具有促进作用，缺少其中一种，诱导效果将大大减弱。
实施例3人皮肤成纤维细胞的代数对诱导分化效果的影响
本实施例具体实验步骤同实施例1，同样采用“6+2+8＝16天”诱导分化模式，对不同代数的原代人皮肤成纤维细胞进行诱导分化。分别选取了第3代，第7代，第10代和第12代细胞进行实验。
油红染色结果见图7，如图所示，随着细胞代数的增加，油红染色逐渐减少，第12代细胞几乎检测不到油红染色。
油红染色统计结果见图8，如图所示，随着细胞代数的增加，油红染色细胞数逐渐减少，第12代细胞油红染色细胞数几乎为0。
成熟脂肪细胞标志基因检测结果见图9，如图所示，随着细胞代数的增加，Adiponectin，Fabp4，Leptin三个成熟脂肪细胞的标志基因表达逐渐减少，第12代细胞几乎检测不到这三个基因的表达。
以上实验结果表明，原代人皮肤成纤维细胞的代数对诱导分化的影响很大，代数低的细胞容易分化，而代数高的细胞很难分化，最终优选将10代以内的人皮肤成纤维细胞用于脂肪细胞的诱导分化。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.体外诱导人皮肤成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将原代人皮肤成纤维细胞于基础培养基中进行体外培养并传代，待细胞汇合度达80-100％时，进行诱导分化；
B、将步骤A的基础培养基换成诱导分化培养基①，培养6-10天，每两天换液一次；然后，将诱导分化培养基①换成诱导分化培养基②，培养2-4天；最后，将诱导分化培养基②换成基础培养基，培养8-14天，每两天换液一次；
其中，所述基础培养基为含10-20％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基；
所述诱导分化培养基①选自如下a～c中的任一种：
a.含0.5-1μM地塞米松、10-20μg/mL胰岛素、1-2μM罗格列酮和0.2-0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基；
b.含0.5-1μM地塞米松、10-20μg/mL胰岛素和1-2μM罗格列酮的基础培养基；
c.含0.5-1μM地塞米松、10-20μg/mL胰岛素和0.2-0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基；
所述诱导分化培养基②为含10-20μg/mL胰岛素的基础培养基；
步骤A中用于诱导分化的人皮肤成纤维细胞的代数≤10代。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导分化培养基①为含1μM地塞米松、20μg/mL胰岛素、2μM罗格列酮和0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中按1:2-3的比例进行人皮肤成纤维细胞传代。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将原代人皮肤成纤维细胞于基础培养基中进行体外培养并传至第6代，待细胞汇合度达95％时，进行诱导分化；
2)将步骤1)的基础培养基换成诱导分化培养基①，培养6天，每两天换液一次；然后，将诱导分化培养基①换成诱导分化培养基②，培养2天；最后，将诱导分化培养基②换成基础培养基，培养8天，每两天换液一次；
所述诱导分化培养基①为含1μM地塞米松、20μg/mL胰岛素、2μM罗格列酮和0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的基础培养基；
所述诱导分化培养基②为含20μg/mL胰岛素的基础培养基。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，细胞培养条件为：35℃～37℃，5％CO2。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，细胞培养条件为：37℃，5％CO2。
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