JP7369346B2 - インスリン産生細胞の製造方法、及び組成物 - Google Patents
インスリン産生細胞の製造方法、及び組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7369346B2 JP7369346B2 JP2020555670A JP2020555670A JP7369346B2 JP 7369346 B2 JP7369346 B2 JP 7369346B2 JP 2020555670 A JP2020555670 A JP 2020555670A JP 2020555670 A JP2020555670 A JP 2020555670A JP 7369346 B2 JP7369346 B2 JP 7369346B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- insulin
- cells
- producing
- fibroblasts
- producing cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/33—Insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/335—Glucagon; Glucagon-like peptide [GLP]; Exendin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
- C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/54—Collagen; Gelatin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
この出願は、2018年11月14日に日本国特許庁に出願された日本国出願番号第2018-213449号の利益を主張するものである。当該日本国出願は、その出願書類(明細書、特許請求の範囲、図面、要約書)の全体が本明細書に明示されているかのように全ての目的で参照により本明細書に援用される。
本発明は、人為的な遺伝子導入を行うことなく、低分子化合物により体細胞からインスリン産生細胞への直接転換ないし誘導を効率的に行うことができる新たな製造方法を提供することを主な課題とする。
[1]体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、無血清の分化誘導用培地で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
[2]体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、分化誘導用培地にインスリンを5μg/mL以上含有して体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
[3]体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、無血清の分化誘導用培地で、かつ分化誘導用培地にインスリンを5μg/mL以上含有して体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
[4]前記工程が、RSK阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記[1]~[3]のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
[5]前記工程が、さらにGSK3阻害剤、及び/又はcAMP誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記[4]に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
[6]RSK阻害剤がBRD7389又はBI-D1870である、上記[4]又は[5]に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
[7]GSK3阻害剤がCHIR99021、又はcAMP誘導剤がフォルスコリンである、上記[5]又は[6]に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
[8]前記体細胞が、線維芽細胞又は間葉系幹細胞である、上記[1]~[7]のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
[9]上記[1]~[8]のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法から製造される、インスリン産生細胞。
[11]体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、インスリンを5μg/mL以上含有することを特徴とする、分化誘導用組成物。
[12]体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、無血清で、かつインスリンを5μg/mL以上含有することを特徴とする、分化誘導用組成物。
[13]RSK阻害剤を含む、上記[10]~[12]のいずれか一項に記載の分化誘導用組成物。
[14]さらにGSK3阻害剤、及び/又はcAMP誘導剤を含む、上記[13]に記載の分化誘導用組成物。
[15]RSK阻害剤がBRD7389又はBI-D1870である、上記[13]又は[14]に記載の分化誘導用組成物。
[16]GSK3阻害剤がCHIR99021、又はcAMP誘導剤がフォルスコリンである、上記[14]又は[15]に記載の分化誘導用組成物。
[17]前記体細胞が線維芽細胞又は間葉系幹細胞である、上記[10]~[16]のいずれか一項に記載の分化誘導用組成物。
本発明に係る、インスリン産生細胞の製造方法(以下、「本発明製法」という。)は、体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、無血清の分化誘導用培地で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。あるいは体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、分化誘導用培地にインスリンを5μg/mL以上含有して体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。
上記の通り、本発明の要旨の一つは、ウシ胎児血清(FBS)のような血清を実質的に含まない無血清の分化誘導用培地にて体細胞を培養し、インスリン産生細胞を製造することにある。また、本発明の要旨としては、分化誘導用培地にインスリンを5μg/mL以上と比較的多く含有してインスリン産生細胞を製造することを挙げることができる。
ここで「無血清」とは、無調整又は未精製の血清を実質的に含まないことをいい、本発明においては、分化誘導用培地に精製された血液由来の成分や動物組織由来の成分が混入していても、無調整又は未精製の血清を実質的に含まない限り、無血清の分化誘導用培地という。
具体的な上記阻害剤等においては、2種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等が存在しているとみなすことができる。
生物の細胞は、体細胞と生殖細胞とに分類できる。本発明製法には、その出発材料として任意の体細胞を使用することができる。体細胞には特に限定はなく、生体から採取された初代細胞、又は株化された細胞の何れでもよい。本発明製法では、分化の種々の段階にある体細胞、例えば、最終分化した体細胞(例、線維芽細胞、臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、肝細胞(Hepatocytes)、胆管細胞(Biliary cells)、膵α細胞(Pancreatic α cells)、膵腺房細胞(Acinar cells)、膵管腺細胞(Ductal cells)、小腸腺窩細胞(Intestinal crypt cells)など)、最終分化への途上にある体細胞(例、間葉系幹細胞、神経幹細胞、内胚葉前駆細胞など)、又は初期化され多能性を獲得した体細胞を使用することができる。本発明製法に使用できる体細胞としては、任意の体細胞、例えば、造血系の細胞(各種のリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、骨髄細胞等)、臓器由来の細胞(肝細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞等)、筋組織系の細胞(骨格筋細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞等)、線維芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、間質細胞、脂肪細胞(白色脂肪細胞等)、胚性幹細胞(ES細胞)等が挙げられる。また、これらの細胞の前駆細胞、癌細胞にも本発明製法を適用できる。好ましくは、線維芽細胞又は間葉系幹細胞を使用することができる。
本発明製法における体細胞の培養は、分化誘導用培地にウシ胎児血清(FBS)のような血清を含有せずに行うこと、及び/又はインスリンを5μg/mL以上含有して行うこと以外は、常法により行うことができる。そして、使用する体細胞の種類に応じた培地、温度、その他の条件を選択し、上記の各種の阻害剤(及び、場合により誘導剤ないし活性化剤)の存在下において実施することができる。
本発明製法においては、上記した各種の阻害剤等を含む分化誘導用培地において体細胞を培養することにより、一段階の培養によって体細胞からインスリン産生細胞を製造することができる。
また、使用する体細胞として培養が容易なものを選択することにより、あらかじめ細胞数を増加させほぼコンフルエントの状態に達した体細胞をインスリン産生細胞に転換することも可能である。従って、スケールアップしたインスリン産生細胞の製造も容易である。
基礎となる公知の又は市販の誘導用培地に予め一定のインスリンが含まれている場合には、インスリンが上記の量含有されるようインスリンを添加して調整することができる。
1.3.1 RSK阻害剤
RSK(Ribosomal S6 Protein Kinase)は、広く細胞に発現しており、様々な成長因子に応答するセリン・スレオニンキナーゼの一つである。分子量が70kDaと90kDaのサブファミリーに分かれており、特に90kDaのRSKサブファミリーは、MAPKシグナル伝達経路に属するERKによってリン酸化されることで活性化し、哺乳類では4つの遺伝子が存在している。活性化した90kDaのRSKは、Ribosomal protein S6を含む下流の様々なタンパク質のリン酸化を行い、細胞の生存、細胞増殖、分化などを多様に制御している。
BI-D1870(CAS No.:501437-28-1)
LJH685(CAS No.:1627710-50-2)
LJI308(CAS No.:1627709-94-7)
FMK(CAS No.:821794-92-7)
RMM46(CAS No.:1307896-46-3)
CMK(CAS No.:821794-90-5)
Carnosol(CAS No.:5957-80-2)
Bix 02565(CAS No.:1311367-27-7)
GSK3(glycogen synthase kinase-3、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3)は、グリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活性化するプロテインキナーゼとして見いだされた。哺乳類では、GSK3は51kDaのα(GSK3α)と47kDaのβ(GSK3β)の二つのアイソフォームに分類される。GSK3は種々のタンパク質をリン酸化する活性を有しており、グリコーゲン代謝のみならず、細胞分裂、細胞増殖等の生理現象にも関わっている。
Kenpaullone(CAS No.:142273-20-9)
A1070722(CAS No.:1384424-80-9)
SB216763(CAS No.:280744-09-4)
CHIR98014(CAS No.:556813-39-9)
TWS119(CAS No.:601514-19-6)
Tideglusib(CAS No.:865854-05-3)
SB415286(CAS No.:264218-23-7)
Bikinin(CAS No.:188011-69-0)
IM-12(CAS No.:1129669-05-1)
1-Azakenpaullone(CAS No.:676596-65-9)
LY2090314(CAS No.:603288-22-8)
AZD1080(CAS No.:612487-72-6)
AZD2858(CAS No.:486424-20-8)
AR-A014418(CAS No.:487021-52-3)
TDZD-8(CAS No.:327036-89-5)
Indirubin(CAS No.:479-41-4)
cAMP(環状アデノシン1リン酸)は、セカンドメッセンジャーとして種々の細胞内シグナル伝達に関わっている物質である。cAMPは、細胞内ではアデニル酸シクラーゼ(adenylate cyclase)によりアデノシン3リン酸(ATP)が環状化されることで生成する。
NKH477(CAS No.:138605-00-2)
PACAP1-27(CAS No.:127317-03-7)
PACAP1-38(CAS No.:137061-48-4)
PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)は、イノシトールリン脂質をリン酸化する酵素であり、産生されるホスホイノシチドはPDK1を活性化する。PDK1はさらにAKTをリン酸化し、PDK1/AKTシグナル経路が活性化される。LY294002は、PI3Kに選択的な阻害剤であり、ホスホイノシチドの産生を抑えることでPDK1/AKTシグナル経路の活性化を阻害する。
TGR-1202(CAS No.:1532533-67-7)
PI-103(CAS No.:371935-74-9)
IC-87114(CAS No.:371242-69-2)
Wortmannin(CAS No.:19545-26-7)
ZSTK474(CAS No.:475110-96-4)
AS-605240(CAS No.:648450-29-7)
PIK-90(CAS No.:677338-12-4)
AZD6482(CAS No.:1173900-33-8)
Duvelisib(CAS No.:1201438-56-3)
TG100-115(CAS No.:677297-51-7)
CH5132799(CAS No.:1007207-67-1)
CAY10505(CAS No.:1218777-13-9)
PIK-293(CAS No.:900185-01-5)
CZC24832(CAS No.:1159824-67-5)
Pilaralisib(CAS No.:934526-89-3)
AZD8835(CAS No.:1620576-64-8)
上記した本発明製法により、インスリン産生細胞を含有する細胞集団を得ることができる。本発明製法により製造されるインスリン産生細胞も本発明の範囲内である。本発明製法で製造されるインスリン産生細胞は、最終分化した細胞の他、インスリン産生細胞に分化することが運命づけられた前駆細胞でもよい。
本発明製法により製造されるインスリン産生細胞は、低分子化合物により体細胞から直接分化誘導される、いわゆる低分子化合物誘導性インスリン産生細胞(ciIPCs)であって、遺伝子導入により分化誘導されるものとは区別される。
本発明製法で製造されるインスリン産生細胞は、さらに、インスリン産生細胞の機能発揮や生着性向上に有効な他の細胞や成分と組み合わせた組成物とすることもできる。
本発明に係る誘導用組成物(以下、「本発明組成物」という。)は、体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、無血清であることを特徴とする。あるいは体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、インスリンを5μg/mL以上含有することを特徴とする。
上記の通り、本発明の要旨の一つは、体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物において、ウシ胎児血清(FBS)のような血清を実質的に含まないことにある。また、本発明の要旨としては、体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物において、インスリンを5μg/mL以上と比較的多く含有することを挙げることができる。
具体的な上記阻害剤等においては、2種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等を含んでいるとみなすことができる。
上記した阻害剤や誘導剤等の具体例や好ましい例などは、前記と同義である。
本発明組成物としては、細胞の培養に必要な成分を混合して製造した基礎培地に、ウシ胎児血清(FBS)のような血清を含有しない、及び/又はインスリンを5μg/mL以上含有する培地を例示することができる。さらに当該培地に、有効成分として、RSK阻害剤を含み、さらに必要に応じてGSK3阻害剤、及び/又はcAMP誘導剤やPI3K阻害剤を含む培地を例示することができる。上記の有効成分は、インスリン産生細胞の製造に有効な濃度で含まれていればよく、濃度は当業者が適宜決定することができる。基礎培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるMEM(最少必須培地)、DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)、DMEM/F12、RPMI1640、又はこれらを改変した培地を、基礎培地として使用することができる。
基礎となる公知の又は市販の分化誘導用培地に予め一定のインスリンが含まれている場合には、インスリンが上記の量含有されるようインスリンを添加して本発明組成物を作製することができる。
~ヒト線維芽細胞からインスリン産生細胞への直接誘導~
(1)ヒト線維芽細胞
材料としたヒト線維芽細胞はDSファーマバイオメディカル株式会社から購入した。38才のヒト皮膚に由来する線維芽細胞である。
ヒト線維芽細胞を、ゼラチン(Cat#:190-15805,和光純薬工業社製)でコーティングされた35mmディッシュに5×104個ずつ播種し、10%ウシ胎児血清(Fetal bovine serum;FBS)、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを添加したDMEM培地(Gibco社製)で、37℃、5%CO2条件下でコンフルエントになるまで培養した。なおDMEMは、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)を示す。
・分化誘導用培地:10%ウシ胎児血清(FBS、Hyclone社製)を添加又は添加せずに、ITS-X(Cat#:51500056、Gibco社製)、非必須アミノ酸(NEAA:Non-essential amino acids;Cat#:11140050、Gibco社製)、Glutamine(Gibco社製;終濃度2mmol/L)、ニコチンアミド(Cat#:72340-100G、Sigma-Aldrich社製;終濃度10mmol/L)、Exendin-4(Cat#:av120214、Abcam社製;終濃度100ng/mL)、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、インスリン、及び下記の低分子化合物を添加したAdvanced DMEM/F-12(Cat#:12634010;Gibco社製)。
なお、分化誘導用培地には、インスリンが20~120μg/mL含まれるよう、必要に応じてヒト組換え体インスリン(Cat#:093-06351; Wako)を添加し調整した。
3μM CHIR99021(Cat#:13122,Cayman Chemical)
7.5μM フォルスコリン(Cat#:063-02193,Wako)
1.5μM BRD7389(Cat#:ab146161,Abcam)
5μM LY294002(Cat#:70920,Cayman Chemical)
上記(2)に従って14日間培養した結果を図1~4に示す。
図中、「4C」は上記4つの低分子化合物を意味し、「3C」は上記4つの低分子化合物の中、CHIR99021、BRD7389、及びフォルスコリンの3種を意味する。「+FBS」は培地中にFBSを存在させたことを示し、「-FBS」は培地中にFBSを存在させなかったことを示す。また、「NoC」ないし「No Compound」は上記4つの低分子化合物(4C)ないし3Cを培地中に存在させなかったことを示す。従って、例えば「No C.-FBS」は、4Cを存在させず、かつFBSも存在させなかった場合の実験結果を、「4C-FBS」は、4Cを存在させ、かつFBSを存在させなかった場合の実験結果を、それぞれ表す。
図2に示す通り、分化誘導用培地中に高濃度のインスリン(120μg/mL)を含有して誘導することで、インスリン分泌量が約3倍増加し、より分泌能の高いインスリン産生細胞がヒト線維芽細胞から直接効率的に誘導された。
上記から、インスリン分泌増加におけるFBSと高濃度インスリンの効果は、それぞれ独立していると考えられる。
~ヒト間葉系幹細胞からインスリン産生細胞への直接誘導~
(1)ヒト間葉系幹細胞
脂肪組織から単離されたヒト間葉系幹細胞はタカラバイオ株式会社から購入した。
ヒト間葉系幹細胞を、ゼラチン(Cat#:190-15805,和光純薬工業社製)でコーティングされた35mmディッシュに5×104個ずつ播種し、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを添加したMesenchymal Stem Cell Growth Medium 2(Cat#:C-28009;タカラバイオ社製)で、37℃、5%CO2条件下でほぼコンフルエントになるまで培養した。
・分化誘導用培地:10%ウシ胎児血清(FBS、Hyclone社製)を添加又は添加せずに、ITS-X(Cat#:51500056、Gibco社製)、非必須アミノ酸(NEAA:Non-essential amino acids;Cat#:11140050、Gibco社製)、Glutamine(Gibco社製;終濃度2mmol/L)、ニコチンアミド(Cat#:72340-100G、Sigma-Aldrich社製;終濃度5mmol/L)、Exendin-4(Cat#:av120214、Abcam社製;終濃度50ng/mL)、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、及び下記の低分子化合物を添加したAdvanced DMEM/F12(Cat#:12634010;Gibco社製)。
なお、誘導用培地にインスリンを120μg/mL含む実験においては、インスリンが120μg/mL含まれるようヒト組換え体インスリン(Cat#:093-06351; Wako)を添加し調整した。
0.5μM CHIR99021(Cat#:13122,Cayman Chemical)
3.75μM フォルスコリン(Cat#:063-02193,Wako)
0.2μM BRD7389(Cat#:ab146161,Abcam)
2.5μM LY294002(Cat#:70920,Cayman Chemical)
上記(2)に従って14日間培養した結果を図5に示す。
図中、「4C」は上記4つの低分子化合物を意味する。「+FBS」は培地中にFBSを存在させたことを示し、「-FBS」は培地中にFBSを存在させなかったことを示す。また、「No compound」は上記4つの低分子化合物を培地中に存在させなかったことを示す。従って、例えば「No Compound-FBS」は、4Cを存在させず、かつFBSも存在させなかった場合の実験結果を、「4C-FBS」は、4Cを存在させ、FBSを存在させなかった場合の実験結果を、それぞれ表す。
Claims (14)
- 線維芽細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、無血清で、かつインスリンを少なくとも20μg/mL含有する分化誘導用培地で、出発材料としての線維芽細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
- 線維芽細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、無血清で、かつインスリンを20~120μg/mLの範囲内で含有する分化誘導用培地で、出発材料としての線維芽細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
- 前記工程が、RSK阻害剤としてBRD7389又はBI-D1870の存在下で、出発材料としての線維芽細胞を培養する工程である、請求項1又は2に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
- 前記工程が、さらにGSK3阻害剤、及び/又はcAMP誘導剤の存在下で、出発材料としての線維芽細胞を培養する工程である、請求項3に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
- RSK阻害剤がBI-D1870である、請求項3又は4に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
- GSK3阻害剤がCHIR99021、又はcAMP誘導剤がフォルスコリンである、請求項4に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
- 前記線維芽細胞が、ヒト線維芽細胞又は皮膚線維芽細胞である、請求項1~6のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
- 線維芽細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、無血清で、インスリンを少なくとも20μg/mL含有することを特徴とする、分化誘導用組成物。
- 線維芽細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、無血清で、かつインスリンを20~120μg/mLの範囲内で含有することを特徴とする、分化誘導用組成物。
- RSK阻害剤としてBRD7389又はBI-D1870を含む、請求項8又は9に記載の分化誘導用組成物。
- さらにGSK3阻害剤、及び/又はcAMP誘導剤を含む、請求項10に記載の分化誘導用組成物。
- RSK阻害剤がBI-D1870である、請求項10又は11に記載の分化誘導用組成物。
- GSK3阻害剤がCHIR99021、又はcAMP誘導剤がフォルスコリンである、請求項11に記載の分化誘導用組成物。
- 前記線維芽細胞が、ヒト線維芽細胞又は皮膚線維芽細胞である、請求項8~13のいずれか一項に記載の分化誘導用組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018213449 | 2018-11-14 | ||
JP2018213449 | 2018-11-14 | ||
PCT/JP2019/044057 WO2020100788A1 (ja) | 2018-11-14 | 2019-11-11 | インスリン産生細胞の製造方法、及び組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2020100788A1 JPWO2020100788A1 (ja) | 2021-09-27 |
JP7369346B2 true JP7369346B2 (ja) | 2023-10-26 |
Family
ID=70730525
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020555670A Active JP7369346B2 (ja) | 2018-11-14 | 2019-11-11 | インスリン産生細胞の製造方法、及び組成物 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220025336A1 (ja) |
EP (1) | EP3882340A4 (ja) |
JP (1) | JP7369346B2 (ja) |
CN (1) | CN113039269A (ja) |
WO (1) | WO2020100788A1 (ja) |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4990446B2 (ja) | 2001-05-28 | 2012-08-01 | 電気化学工業株式会社 | 関節症治療用注入剤 |
JP5660572B2 (ja) * | 2008-11-11 | 2015-01-28 | 国立大学法人広島大学 | 分化誘導培地用添加剤およびその利用 |
US20150140661A1 (en) * | 2012-05-25 | 2015-05-21 | Saitama Medical University | Method for producing pancreatic hormone-producing cell, pancreatic hormone-producing cell, and differentiation/induction promoter |
GB201211606D0 (en) * | 2012-06-29 | 2012-08-15 | Cancer Res Technology | Method for reprogramming somatic cells to pancreatic beta-cells |
WO2015020113A1 (ja) * | 2013-08-07 | 2015-02-12 | 国立大学法人京都大学 | 膵ホルモン産生細胞の製造法 |
RU2694311C2 (ru) * | 2014-05-16 | 2019-07-11 | Янссен Байотек, Инк. | Применение малых молекул для увеличения экспрессии mafa в панкреатических эндокринных клетках |
US11459546B2 (en) | 2016-09-30 | 2022-10-04 | Kyoto Prefectural Public University Corporation | Method for producing somatic cell, somatic cell, and composition |
-
2019
- 2019-11-11 JP JP2020555670A patent/JP7369346B2/ja active Active
- 2019-11-11 US US17/288,636 patent/US20220025336A1/en active Pending
- 2019-11-11 WO PCT/JP2019/044057 patent/WO2020100788A1/ja unknown
- 2019-11-11 EP EP19885990.2A patent/EP3882340A4/en active Pending
- 2019-11-11 CN CN201980074984.9A patent/CN113039269A/zh active Pending
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
Cytotherapy,2013年,Vol.15,p.1228-1236 |
Islets,2010年,Vol.2,p.112-120 |
J. Cell. Physiol.,2018年02月,Vol.233,p.1627-1637 |
PNAS,2003年,Vol.100,p.7117-7122 |
PNAS,2010年,Vol.107,p.15099-15104 |
Stem Cells,2009年,Vol.27,p.1941-1953 |
日本薬理学雑誌,2014年,Vol.144,p.8-12 |
昭和大学薬学雑誌,2011年,Vol.2,p.127-138 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2020100788A1 (ja) | 2020-05-22 |
US20220025336A1 (en) | 2022-01-27 |
JPWO2020100788A1 (ja) | 2021-09-27 |
CN113039269A (zh) | 2021-06-25 |
EP3882340A1 (en) | 2021-09-22 |
EP3882340A4 (en) | 2022-08-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7236114B2 (ja) | 体細胞を製造する方法、体細胞、及び組成物 | |
US20220090008A1 (en) | Colony forming medium and use thereof | |
JP7406196B2 (ja) | 神経様細胞の製造方法 | |
JP6968347B2 (ja) | 肝細胞の製造方法 | |
JP2017104091A (ja) | 間葉系細胞の製造方法 | |
JP6383436B2 (ja) | 神経系細胞の製造方法 | |
JP7369347B2 (ja) | インスリン産生細胞の製造方法 | |
JP7369346B2 (ja) | インスリン産生細胞の製造方法、及び組成物 | |
EP2898065B1 (en) | Adipose tissue cells | |
JP7248986B2 (ja) | インスリン産生細胞の製造方法 | |
US11834679B2 (en) | Method for producing cardiomyocytes | |
WO2023167122A1 (ja) | 増殖因子産生細胞及びその製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220526 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230531 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230719 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230904 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230926 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7369346 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |