WO2020100788A1 - インスリン産生細胞の製造方法、及び組成物 - Google Patents

インスリン産生細胞の製造方法、及び組成物 Download PDF

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cells
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differentiation
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平 戴
行正 武田
義規 原田
松本　潤一
あゆみ 草鹿
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京都府公立大学法人
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Definitions

  • the present invention belongs to the technical field of regenerative medicine.
  • the present invention relates to a method for directly producing an insulin-producing cell from a somatic cell with a low-molecular compound, and a low-molecular compound-induced insulin-producing cell (ciIPCs: chemical compound-induced insulin-) produced by such a production method. This is related to producing cells).
  • the present invention further relates to an inducing medium composition that can be used for the method for producing the insulin-producing cells.
  • pancreatic ⁇ cells in addition to being reported to induce differentiation of iPS cells or ES cells into human pancreatic ⁇ cells, pancreatic ⁇ cells, pancreatic acinar cells, pancreatic duct gland cells, small intestinal crypt cells It has been reported that pancreatic ⁇ cells were directly induced from endoderm cells such as liver cells and cholangiocytes using Pdx1, Ngn3 and MafA which are pancreatic ⁇ cell-specific transcription factors (Non-patent Document 1). It has also been reported that mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or human dermal fibroblasts were directly induced into pancreatic ⁇ cells using factors such as Yamanaka 4 factor (Non-patent Documents 2 and 3).
  • Non-Patent Document 4 endodermal progenitor cells were prepared from mouse embryonic fibroblasts (MEFs) with a low molecular weight compound and the cells were differentiated into pancreatic endocrine cells.
  • Induction of differentiation from somatic cells to pancreatic ⁇ cells and the like as described above is always performed by culturing in a medium containing various other compounds and nutrients.
  • the medium include MEM (minimum essential medium), DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium), DMEM / F12, or a medium obtained by modifying these, which are common media, and these are commercially available. .. Then, usually, in consideration of cells to be induced, appropriate components (serum, protein, amino acid, saccharide, vitamins, fatty acids, antibiotics, etc.) are appropriately added to these media to induce cell differentiation. There is.
  • the main object of the present invention is to provide a new production method capable of efficiently performing direct conversion or induction from a somatic cell to an insulin-producing cell with a low molecular weight compound without artificially introducing a gene.
  • Examples of the present invention include the following.
  • [1] A method for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells, comprising the step of culturing somatic cells in a serum-free differentiation-inducing medium, the production of insulin-producing cells Method.
  • [2] A method for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells, which comprises the step of culturing somatic cells by containing 5 ⁇ g / mL or more of insulin in a differentiation-inducing medium. , A method for producing insulin-producing cells.
  • a method for producing an insulin-producing cell by directly inducing differentiation of somatic cells which comprises a serum-free differentiation-inducing medium, wherein the differentiation-inducing medium contains 5 ⁇ g / mL or more of insulin
  • a method for producing an insulin-producing cell comprising the step of culturing.
  • a composition for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells wherein the composition is serum-free and is used for inducing differentiation.
  • a composition for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells which comprises 5 ⁇ g / mL or more of insulin, and is a composition for differentiation induction.
  • a composition for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells which is serum-free and contains 5 ⁇ g / mL or more of insulin, the composition for differentiation induction. ..
  • the composition for inducing differentiation according to any one of [10] to [12] above, which comprises an RSK inhibitor.
  • composition for inducing differentiation according to [13] above which further contains a GSK3 inhibitor and / or a cAMP derivative.
  • RSK inhibitor is BRD7389 or BI-D1870.
  • GSK3 inhibitor is CHIR99021 or the cAMP inducer is forskolin.
  • the present invention direct conversion or induction from somatic cells to insulin-producing cells with high insulin-secreting ability can be efficiently carried out without artificial gene transfer.
  • the insulin-producing cells obtained by the present invention are useful in regenerative medicine and the like.
  • the vertical axis represents the insulin secretion amount ( ⁇ U / mg) per 1 mg of total protein in the cell.
  • the left column shows the result when fetal bovine serum (FBS) was contained, and the right column shows the result when no fetal bovine serum (FBS) was contained. It represents the amount of insulin secreted by insulin-producing cells containing 20 ⁇ g / mL or 120 ⁇ g / mL of insulin from human fibroblasts and directly induced to undergo differentiation.
  • the vertical axis represents the insulin secretion amount ( ⁇ U / mg) per 1 mg of total protein in the cell.
  • the left column shows the result when insulin was contained at 20 ⁇ g / mL, and the result when insulin was contained at 120 ⁇ g / mL, respectively. It represents the amount of insulin secreted by insulin-producing cells that are directly differentiated from human fibroblasts.
  • the vertical axis represents the insulin secretion amount ( ⁇ U / mg) per 1 mg of total protein in the cell. It represents the amount of insulin secreted by insulin-producing cells that are directly differentiated from human fibroblasts.
  • the vertical axis represents the insulin secretion amount ( ⁇ U / mg) per 1 mg of total protein in the cell.
  • AdMSC adipose tissue-derived mesenchymal stem cells
  • the method for producing insulin-producing cells according to the present invention is a method for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells. And a step of culturing somatic cells in a serum-free medium for inducing differentiation. Alternatively, it is a method for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells, which is characterized by including a step of culturing somatic cells containing 5 ⁇ g / mL or more of insulin in a differentiation-inducing medium.
  • one of the gist of the present invention is to produce somatic cells by culturing somatic cells in a serum-free differentiation-inducing medium substantially free of serum such as fetal bovine serum (FBS).
  • FBS fetal bovine serum
  • insulin-producing cells are produced by containing a relatively large amount of insulin at 5 ⁇ g / mL or more in a differentiation-inducing medium.
  • serum-free means that it does not substantially contain unadjusted or unpurified serum, and in the present invention, components derived from blood or components derived from animal tissue purified in a medium for differentiation induction are A serum-free medium for induction of differentiation is included unless it contains unadjusted or unpurified serum even if it is mixed.
  • the production method of the present invention is preferable, which comprises a step of culturing somatic cells in a serum-free medium for inducing differentiation and containing 5 ⁇ g / mL or more of insulin.
  • the above step is preferably a step of culturing somatic cells in the presence of an RSK inhibitor. More preferably, the step is a step of culturing somatic cells in the presence of a GSK3 inhibitor and / or a cAMP derivative in addition to the RSK inhibitor. In particular, the above step is preferably a step of culturing somatic cells in the presence of an RSK inhibitor and a GSK3 inhibitor or in the presence of an RSK inhibitor, a GSK3 inhibitor and a cAMP derivative. The above step may be a step of culturing somatic cells in the presence of other inhibitors, inducers, etc., if necessary, such as PI3K inhibitors.
  • Each of the above inhibitors and inducers may be used alone or in combination of two or more. Some of the specific inhibitors and the like may have two or more types of inhibitory effects, and in that case, one inhibitor can be regarded as having a plurality of inhibitors and the like.
  • Somatic cells Living cells can be classified into somatic cells and germ cells.
  • any somatic cell can be used as the starting material.
  • Somatic cells are not particularly limited, and may be either primary cells collected from a living body or established cells.
  • somatic cells at various stages of differentiation for example, terminally differentiated somatic cells (eg, fibroblasts, umbilical vein endothelial cells (HUVEC), hepatocytes (Hepatocytes), bile duct cells (Biliary cells), Pancreatic ⁇ cells, Pancreatic acinar cells, Acinar cells, Ductal cells of the pancreas, Intestinal crypt cells, and somatic cells in the process of terminal differentiation (eg, interstitial cells) Lobe stem cells, neural stem cells, endoderm progenitor cells, etc.) or somatic cells that have been initialized and have acquired pluripotency.
  • terminally differentiated somatic cells eg, fibroblasts, umbilical vein endothelial cells (HUVEC), he
  • the somatic cells that can be used in the method of the present invention include any somatic cells, for example, hematopoietic cells (various lymphocytes, macrophages, dendritic cells, bone marrow cells, etc.), organ-derived cells (hepatocytes, splenocytes, Pancreatic cells, kidney cells, lung cells, etc., muscle tissue cells (skeletal muscle cells, smooth muscle cells, myoblasts, cardiomyocytes, etc.), fibroblasts, nerve cells, osteoblasts, chondrocytes, endothelial cells , Stromal cells, adipocytes (white adipocytes, etc.), embryonic stem cells (ES cells) and the like.
  • the method of the present invention can be applied to progenitor cells of these cells and cancer cells.
  • fibroblasts or mesenchymal stem cells can be used.
  • the fibroblasts that can be used in the present invention are not particularly limited, and include, for example, dermal fibroblasts (Dermal Fibroblasts), aortic adventitia fibroblasts (Adventitial Fibroblasts), cardiac fibroblasts (Cardiac Fibroblasts), and lung fibroblasts.
  • Collagen fiber production is a major cellular component of connective tissue in various tissues and organs such as cells (Pulmonary Fibroblasts), uterine fibroblasts (Uterine Fibroblasts), and villous mesenchymal fibroblasts (Villous Mesenchymal Fibroblasts).
  • the cells to be performed can be mentioned.
  • the mesenchymal stem cells that can be used in the present invention are not particularly limited, and include, for example, adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (Bone marrow-derived mesenchymal stem cells).
  • Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells adipose tissue-derived mesenchymal stem cells
  • bone marrow-derived mesenchymal stem cells bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, dental pulp-derived mesenchymal stem cells cells), placenta-derived mesenchymal stem cells, amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells, endometrial-derived mesenchymal stem cells , Synovium-derived mesenchymal stem cells, dermal tissue-derived mesenchymal stem cells, and periodontal ligament-derived mesenchymal stem cells.
  • somatic cells examples include humans, mammals other than humans, and animals other than mammals (birds, reptiles, amphibians, fishes, etc.), but are not limited to these.
  • a source of somatic cells humans and mammals other than humans are preferable, and humans are particularly preferable.
  • somatic cells collected from a donor whose recipient and histocompatibility antigen types are the same or similar can be preferably used. Somatic cells collected from the recipient itself may be used for production of insulin-producing cells.
  • Somatic cell culture in the production method of the present invention should be carried out without containing serum such as fetal bovine serum (FBS) in the differentiation-inducing medium, and / or containing 5 ⁇ g / mL or more of insulin. Other than the above, it can be carried out by a conventional method. Then, the medium, temperature and other conditions depending on the type of somatic cells to be used can be selected and carried out in the presence of the above-mentioned various inhibitors (and optionally an inducer or activator). In the production method of the present invention, by culturing somatic cells in a differentiation-inducing medium containing the above-described various inhibitors and the like, insulin-producing cells can be produced from somatic cells by one-step culture.
  • FBS fetal bovine serum
  • somatic cell to be used that can be easily cultured, it is possible to increase the number of cells in advance and convert somatic cells that have reached a nearly confluent state into insulin-producing cells. Therefore, it is easy to produce a scaled-up insulin-producing cell.
  • the medium for inducing differentiation or the medium for subculturing somatic cells which is the basis for carrying out the present invention, can be selected from known media or commercially available media.
  • appropriate components serum, protein, amino acids, saccharides, vitamins, etc.
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • DMEM / F12 or a medium modified with these.
  • Fatty acids, antibiotics, etc. can be added for use.
  • the differentiation-inducing medium contains insulin in an amount of 5 ⁇ g / mL or more, preferably 20 ⁇ g / mL or more to 25 ⁇ g / mL or more, and more preferably in the range of 80 to 120 ⁇ g / mL. Is.
  • a certain known or commercially available medium for induction contains a certain amount of insulin in advance, it can be adjusted by adding insulin so that the above-mentioned amount of insulin is contained.
  • the culture conditions general cell culture conditions can be selected. Examples include conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . During the culture, it is preferable to change the medium at appropriate intervals (preferably once a day to 5 days, more preferably once every 2 days to 4 days).
  • the production method of the present invention is carried out using fibroblasts as the material, insulin-producing cells appear in 6 to 8 to 12 days under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the method of the present invention is carried out using mesenchymal stem cells as a material, insulin-producing cells appear from around one week under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • cell culture vessels such as plates, dishes, cell culture flasks, and cell culture bags can be used.
  • the cell culture bag one having gas permeability is suitable. Larger culture vessels may be used when large numbers of cells are required.
  • the culture can be performed in either an open system or a closed system, but it is preferable to perform the culture in a closed system for the purpose of administering the obtained insulin-producing cells to humans and the like.
  • RSK inhibitor RSK Rasosome S6 Protein Kinase
  • RSK Rassome S6 Protein Kinase
  • the molecular weight is divided into 70 kDa and 90 kDa subfamilies, and in particular, the 90 kDa RSK subfamily is activated by being phosphorylated by ERK belonging to the MAPK signaling pathway, and four genes are present in mammals.
  • Activated 90 kDa RSK phosphorylates various downstream proteins including Ribosomal protein S6, and variously controls cell survival, cell growth, differentiation and the like.
  • an RSK inhibitor means a culture condition capable of inhibiting RSK, and its means is not particularly limited, and a substance that inhibits the activity of RSK, for example, anti-RSK antibody or RSK An RSK signal inhibiting means such as an inhibitor can be used. Further, since RSK is activated when its specific site is phosphorylated, the above-mentioned means for inhibiting phosphorylation can also be used for inhibiting RSK signal.
  • the following compounds can be used as the RSK inhibitor, for example.
  • BRD7389 or BI-D1870 can be used.
  • SL 0101-1 (CAS No .: 77307-50-7) BI-D1870 (CAS No .: 501437-28-1) LJH685 (CAS No .: 1627710-50-2) LJI308 (CAS No .: 1627709-94-7) FMK (CAS No .: 821794-92-7) RMM46 (CAS No .: 1307896-46-3) CMK (CAS No .: 821794-90-5) Carnosol (CAS No .: 5957-80-2) Bix 02565 (CAS No .: 1311367-27-7)
  • the concentration of the RSK inhibitor varies depending on the somatic cells used and the like, but is not particularly limited and may be appropriately determined.
  • the range of 0.05 ⁇ mol / L to 50 ⁇ mol / L, preferably 0.1 ⁇ mol / L to 20 ⁇ mol / L Can be used in.
  • GSK3 GSK3 Inhibitor GSK3 (glycogen synthetase kinase-3, glycogen synthase kinase 3) was found as a protein kinase that phosphorylates and inactivates glycogen synthase. In mammals, GSK3 is classified into two isoforms, a 51 kDa ⁇ (GSK3 ⁇ ) and a 47 kDa ⁇ (GSK3 ⁇ ). GSK3 has an activity of phosphorylating various proteins, and is involved not only in glycogen metabolism but also in physiological phenomena such as cell division and cell proliferation.
  • the “in the presence of a GSK3 inhibitor” means a culture condition capable of inhibiting GSK3, and its means is not particularly limited, and a substance that inhibits the activity of GSK3, for example, an anti-GSK3 antibody or GSK3 is used.
  • GSK3 signal inhibiting means such as an inhibitor can be used.
  • the above-mentioned means for promoting phosphorylation can also be used for the inhibition of GSK3 signal.
  • the following compounds can be used as the GSK3 inhibitor, for example.
  • CHIR99021 can be used.
  • BIO ((2'Z, 3'E) -6-Broindirubin-3'-oxime) (CAS No .: 667463-62-9) Kenpaullone (CAS No .: 142273-20-9) A1070722 (CAS No .: 1384424-80-9) SB216763 (CAS No .: 280744-09-4) CHIR98014 (CAS No .: 556813-39-9) TWS119 (CAS No .: 601514-19-6) Tideglusib (CAS No .: 866854-05-3) SB415286 (CAS No .: 264218-23-7) Bikinin (CAS No .: 188011-69-0) IM-12 (CAS No .: 1129669-05-1) 1-Azakenpaullone (CAS No .: 676596-65-9) LY2090314 (CAS No .: 603288-22-8) AZD1080 (CAS No .: 61487-72-6) AZD2858
  • the concentration of the GSK3 inhibitor varies depending on the somatic cells used and the like, but is not particularly limited and may be appropriately determined.
  • the range of 0.05 ⁇ mol / L to 20 ⁇ mol / L, preferably 0.1 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L Can be used in.
  • cAMP cyclic adenosine monophosphate
  • ATP adenosine triphosphate
  • the “in the presence of a cAMP inducer” means a culture condition capable of inducing cAMP, and its means is not particularly limited, and for example, any means capable of increasing intracellular cAMP concentration. Can be used.
  • substances that can directly induce adenylate cyclase which is an enzyme involved in the production of cAMP
  • substances that can promote the expression of adenylate cyclase, substances that inhibit phosphodiesterase, which is an enzyme that decomposes cAMP, etc. Can be used as a means to increase intracellular cAMP concentration.
  • dibutyryl cAMP dibutyryl cAMP (dibutyryl cAMP), which is a structural analog of cAMP, which has the same action as cAMP in cells.
  • examples of the cAMP inducer include, forskolin (CAS No .: 66575-29-9), and forskolin derivative (for example, JP-A-2002-2002). 348243) and the following compounds.
  • forskolin can be used.
  • Isoproterenol (CAS No .: 7683-59-2) NKH477 (CAS No .: 138605-00-2) PACAP1-27 (CAS No .: 127317-03-7) PACAP1-38 (CAS No .: 137061-48-4)
  • the concentration of the cAMP inducer varies depending on the somatic cells to be used, etc., but is not particularly limited and may be appropriately determined. For example, it is used in the range of 1 ⁇ mol / L to 30 ⁇ mol / L. can do.
  • PI3K Phosphoinositide 3-kinase
  • PI3K is an enzyme that phosphorylates inositol phospholipids, and the phosphoinositides produced activate PDK1.
  • PDK1 further phosphorylates AKT and the PDK1 / AKT signaling pathway is activated.
  • LY294002 is a PI3K-selective inhibitor that inhibits the activation of the PDK1 / AKT signaling pathway by suppressing the production of phosphoinositides.
  • a PI3K inhibitor means a culture condition capable of inhibiting PI3K, and its means is not particularly limited, and any means capable of inhibiting PI3K can be used. it can.
  • substances that directly act on PI3K and inhibit its function for example, anti-PI3K antibody and other drugs
  • drugs that suppress the production of PI3K itself, and the like can be used.
  • PI3K can also be inhibited by inhibiting signal transduction involving PI3K at the upstream thereof.
  • PI3K inhibitors for example.
  • LY294002 can be used.
  • Buparlisib (CAS No .: 944396-07-0) TGR-1202 (CAS No .: 1532533-67-7) PI-103 (CAS No .: 371935-74-9) IC-87114 (CAS No .: 371242-69-2) Wortmannin (CAS No .: 19545-26-7) ZSTK474 (CAS No .: 475110-96-4) AS-605240 (CAS No .: 648450-29-7) PIK-90 (CAS No .: 677338-12-4) AZD6482 (CAS No .: 1173900-33-8) Duvelisib (CAS No .: 1201438-56-3) TG100-115 (CAS No .: 677297-51-7) CH5132799 (CAS No .: 1007207-67-1) CAY10505 (CAS No .: 12187777-13-9) PIK-293 (CAS No .: 900185-01-5) CZC24832 (CAS No .
  • the concentration of the PI3K inhibitor varies depending on the somatic cells to be used, etc., but is not particularly limited and may be appropriately determined, for example, in the range of 0.1 ⁇ mol / L to 20 ⁇ mol / L, preferably 0.5 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L Can be used in.
  • Insulin producing cells By the above-mentioned production method of the present invention, a cell population containing insulin producing cells can be obtained. Insulin-producing cells produced by the production method of the present invention are also within the scope of the present invention.
  • the insulin-producing cells produced by the method of the present invention may be terminally differentiated cells or progenitor cells destined to differentiate into insulin-producing cells.
  • Insulin-producing cells produced by the production method of the present invention are so-called low-molecular compound-induced insulin-producing cells (ciIPCs) that are directly induced to differentiate from somatic cells by a low-molecular compound, and are induced by gene transfer. Are distinguished.
  • the insulin-producing cells produced by the production method of the present invention are detected, confirmed and separated by utilizing, for example, morphological changes of cells, characteristic properties of insulin-producing cells and specific markers (eg, anti-insulin antibody). be able to.
  • the secretory ability of the produced insulin-producing cells can also be evaluated by quantifying the amount of secreted insulin by sandwich ELISA.
  • Quarantine method detection by antibody
  • detection may be carried out by quantifying the amount of mRNA of the protein molecule.
  • An antibody that recognizes a specific marker of insulin-producing cells is also useful for isolating and purifying the insulin-producing cells obtained by the method of the present invention.
  • the insulin-producing cells produced by the method of the present invention can be used, for example, for tissue repair or improvement of blood insulin concentration.
  • a pharmaceutical composition for tissue repair or the like can be produced.
  • pancreas transplantation or pancreatic islet transplantation is a radical treatment method in order to reduce the symptoms and cure it. Further, it is predicted that the number of patients with type 2 diabetes will further increase in the future both in Japan and overseas, which will cause a rise in medical costs, but transplantation of pancreatic ⁇ cells that secrete insulin can be an effective treatment method.
  • pancreatic diseases such as diabetes
  • a method for producing insulin-producing cells and a method for transplanting insulin-producing cells have been developed.
  • insulin-producing cells will be transplanted under the renal capsule or transplanted to the liver via the portal vein to be used for the treatment of severe pancreatic diseases (diabetes, etc.).
  • the insulin-producing cells produced by the method of the present invention are suitable for administration to an individual by mixing the insulin-producing cells with a pharmaceutically acceptable carrier by a conventional method.
  • a pharmaceutically acceptable carrier include physiological saline, glucose, and distilled water for injection made isotonic with the addition of auxiliary agents (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride).
  • auxiliary agents eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride.
  • buffers eg phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg benzalkonium chloride, procaine hydrochloride etc.
  • stabilizers eg human serum albumin, polyethylene glycol etc.
  • preservation Agents, antioxidants and the like may be added.
  • the insulin-producing cells produced by the production method of the present invention can be further used as a composition in which the cells are combined with other cells or components which are effective for exerting the functions of the insulin-producing cells and improving the engraf
  • the insulin-producing cells produced by the method of the present invention can also be used for screening drug candidate compounds that act on insulin-producing cells and for evaluating the safety of drug candidate compounds.
  • Insulin producing cells are an important tool for assessing the toxicity of drug candidate compounds. According to the production method of the present invention, a large number of insulin-producing cells can be obtained by a single operation, so that reproducible research results can be obtained without being affected by cell lot differences.
  • the inducing composition according to the present invention is a composition for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells, and is serum-free. Is characterized in that Alternatively, it is a composition for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells, which is characterized by containing 5 ⁇ g / mL or more of insulin.
  • a composition for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells does not substantially contain serum such as fetal bovine serum (FBS).
  • FBS fetal bovine serum
  • the gist of the present invention is that a composition for producing insulin-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells contains a relatively large amount of insulin of 5 ⁇ g / mL or more.
  • composition of the present invention which is serum-free and contains 5 ⁇ g / mL or more of insulin is preferable.
  • composition of the present invention containing an RSK inhibitor is preferable. More preferably, in addition to the RSK inhibitor, the composition of the present invention further contains a GSK3 inhibitor and / or a cAMP derivative. Particularly, the composition of the present invention containing an RSK inhibitor and a GSK3 inhibitor, or an RSK inhibitor, a GSK3 inhibitor, and a cAMP derivative is preferable. Furthermore, the composition of the present invention may optionally contain other inhibitors and inducers, such as PI3K inhibitors, if necessary.
  • inhibitors and inducers may be used alone or in combination of two or more. Some of the specific inhibitors and the like may have two or more types of inhibitory actions, etc., but in that case, one can be regarded as containing a plurality of inhibitors and the like. Specific examples and preferable examples of the above-mentioned inhibitors and inducers have the same meaning as above.
  • the composition of the present invention can be used as a medium for producing insulin-producing cells from somatic cells.
  • a basal medium produced by mixing components necessary for cell culture does not contain serum such as fetal bovine serum (FBS) and / or contains 5 ⁇ g / mL or more of insulin.
  • FBS fetal bovine serum
  • a medium containing an RSK inhibitor as an active ingredient in the medium and, if necessary, a GSK3 inhibitor and / or a cAMP derivative or a PI3K inhibitor can be exemplified.
  • the above-mentioned active ingredient may be contained at a concentration effective for producing insulin-producing cells, and the concentration can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the basal medium can be selected from known medium and commercially available medium.
  • a general medium such as MEM (minimum essential medium), DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium), DMEM / F12, RPMI1640, or a modified medium thereof can be used as the basal medium.
  • insulin is contained in an amount of 5 ⁇ g / mL or more, preferably 20 ⁇ g / mL or more to 25 ⁇ g / mL or more, and more preferably 80 to 120 ⁇ g / mL.
  • the composition of the present invention can be prepared by adding insulin so that the above-mentioned amount of insulin is contained. ..
  • the medium according to the composition of the present invention further includes known medium components described above in the present specification, such as serum, proteins (albumin, transferrin, growth factor, etc.), amino acids, sugars, vitamins, fatty acids, antibiotics. Etc. may be added.
  • the medium effective for the composition of the present invention may be further added with a substance effective for inducing differentiation into insulin-producing cells described above in the present specification.
  • Example 1 Production of insulin-producing cells-Direct induction from human fibroblasts to insulin-producing cells- (1) Human fibroblasts Human fibroblasts used as a material were purchased from DS Pharma Biomedical. Fibroblasts derived from 38-year-old human skin.
  • ITS-X (Cat #: 51500056, Gibco)
  • NEAA Non-essential amino
  • FBS fetal bovine serum
  • the cells were cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 while exchanging the medium with the same composition every 3 days.
  • human recombinant insulin Cat #: 093-06351; Wako
  • B means BRD7389
  • 3C-B shows the case where BRD7389 was not present in 3C, that is, the experimental result by two factors of CH and F.
  • 3C-B + BI-D1870 is the case where BRD7389 was not present in 3C, and instead RSK inhibitor BI-D1870 (Cat #: 15264, Cayman Chemical) was present at a final concentration of 5 ⁇ M or 10 ⁇ M. The experimental results are shown.
  • the higher the concentration of insulin in the differentiation-inducing medium is 100 ⁇ g / mL, the higher the amount of insulin secreted, and the insulin-producing cells having high secretory ability in a concentration-dependent manner are directly obtained from human fibroblasts. Was given.
  • Example 2 Production of insulin-producing cells-Direct induction from human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells- (1) Human mesenchymal stem cells Human mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue were purchased from Takara Bio Inc.
  • ITS-X (Cat #: 51500056, Gibco)
  • NEAA Non-essential amino
  • FBS fetal bovine serum
  • the cells were cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 while exchanging the medium with the same composition every 3 days.
  • human recombinant insulin Cat #: 093-06351; Wako

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Abstract

体細胞からインスリン産生細胞への直接転換ないし誘導を効率的に行うことができる新たな製造方法を提供することを主な課題とする。　本発明として、例えば、体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、無血清の分化誘導用培地で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、あるいは分化誘導用培地にインスリンを５μｇ／ｍＬ以上含有して体細胞を培養する工程を含むことを特徴とするインスリン産生細胞の製造方法を挙げることができる。　本発明によれば、インスリン分泌能の高いインスリン産生細胞を体細胞から直接効率的に製造することができる。本発明により得られたインスリン産生細胞は、再生医療などにおいて有用である。

Description

インスリン産生細胞の製造方法、及び組成物
（関連出願の相互参照）
　この出願は、２０１８年１１月１４日に日本国特許庁に出願された日本国出願番号第２０１８－２１３４４９号の利益を主張するものである。当該日本国出願は、その出願書類（明細書、特許請求の範囲、図面、要約書）の全体が本明細書に明示されているかのように全ての目的で参照により本明細書に援用される。
　本発明は、再生医療の技術分野に属する。本発明は、その技術分野において、低分子化合物により体細胞からインスリン産生細胞を直接製造する方法、及びかかる製造方法によって製造される低分子化合物誘導性インスリン産生細胞（ｃｉＩＰＣｓ：ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ）に関するものである。本発明はさらに、当該インスリン産生細胞を製造する方法のために使用することができる誘導用培地組成物に関するものである。
　近年、遺伝子導入を行うことなく、低分子化合物により線維芽細胞のような体細胞を直接他の細胞に転換する方法（ダイレクトリプログラミング：Ｄｉｒｅｃｔ　Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）が盛んに研究されている。例えば、特許文献１では、ＡＬＫ５阻害剤やＡＬＫ６阻害剤等のいくつかの低分子化合物を組み合わせ、その存在下において体細胞、特にヒト線維芽細胞を培養し、そこから褐色脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経系細胞、又は心筋細胞へと直接誘導されている。特許文献１の発明のように、ありふれた線維芽細胞から、入手が容易な低分子化合物により褐色脂肪細胞等の細胞へ直接誘導することができれば非常に有益である。例えば、自家の線維芽細胞から簡便に自家の他の細胞を作製しうるので、再生医療への応用が高まる。また、新しい医薬品開発のための実験材料としての細胞を容易に作製することができるようになる。
　インスリンを分泌する膵臓β細胞については、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞からヒト膵β細胞への分化誘導が報告されていることに加えて、膵α細胞、膵腺房細胞、膵管腺細胞、小腸腺窩細胞、肝細胞、胆管細胞といった内胚葉系細胞から膵β細胞特異的転写因子であるＰｄｘ１、Ｎｇｎ３、及びＭａｆＡを用いて膵β細胞へ直接誘導したことが報告されている（非特許文献１）。また、マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）やヒト皮膚線維芽細胞から山中４因子などを用いて膵β細胞へ直接誘導したことが報告されている（非特許文献２、３）。更にはマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）から低分子化合物により内胚葉前駆細胞を作製し、当該細胞から膵臓内分泌細胞へ分化させたことが報告されている（非特許文献４）。
　上記のような体細胞から膵β細胞等への分化誘導は、必ずその他様々な化合物や栄養素などを含んだ培地の下で培養することにより行われる。当該培地としては、例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はこれらを改変した培地を挙げることができ、これらは市販されている。そして、通常はこれら培地に、誘導する細胞を考慮して適当な成分（血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等）を適宜添加して細胞の分化誘導が行われている。
 
国際公開第２０１８／０６２２６９号
Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１６年，３巻，５７－６５頁 Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，２０１４年，１４巻，２２８－２３６頁 Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１６年，７巻，１００８０頁 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１７年，２９２巻，１９１２２－１９１３２頁
　細胞の分化誘導における問題の一つは、上手く所望の細胞へ分化誘導できたとしても、実用に耐えうるほどの十分な量の分化誘導を達成することが難しい点にある。この問題は、インスリン産生細胞を誘導する場合においても同様である。
　本発明は、人為的な遺伝子導入を行うことなく、低分子化合物により体細胞からインスリン産生細胞への直接転換ないし誘導を効率的に行うことができる新たな製造方法を提供することを主な課題とする。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、体細胞からインスリン産生細胞への直接誘導において、通常、培地に加えられるウシ胎児血清（ＦＢＳ）を除いて培養することにより、またはインスリンを通常よりも多量に添加して培養することにより上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成するに到った。
　本発明として、例えば、下記のものを挙げることができる。
［１］体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、無血清の分化誘導用培地で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
［２］体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、分化誘導用培地にインスリンを５μｇ／ｍＬ以上含有して体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
［３］体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、無血清の分化誘導用培地で、かつ分化誘導用培地にインスリンを５μｇ／ｍＬ以上含有して体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
［４］前記工程が、ＲＳＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
［５］前記工程が、さらにＧＳＫ３阻害剤、及び／又はｃＡＭＰ誘導体の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［４］に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
［６］ＲＳＫ阻害剤がＢＲＤ７３８９又はＢＩ－Ｄ１８７０である、上記［４］又は［５］に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
［７］ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、又はｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、上記［５］又は［６］に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
［８］前記体細胞が、線維芽細胞又は間葉系幹細胞である、上記［１］～［７］のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
［９］上記［１］～［８］のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法から製造される、インスリン産生細胞。
［１０］体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、無血清であることを特徴とする、分化誘導用組成物。
［１１］体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、インスリンを５μｇ／ｍＬ以上含有することを特徴とする、分化誘導用組成物。
［１２］体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、無血清で、かつインスリンを５μｇ／ｍＬ以上含有することを特徴とする、分化誘導用組成物。
［１３］ＲＳＫ阻害剤を含む、上記［１０］～［１２］のいずれか一項に記載の分化誘導用組成物。
［１４］さらにＧＳＫ３阻害剤、及び／又はｃＡＭＰ誘導体を含む、上記［１３］に記載の分化誘導用組成物。
［１５］ＲＳＫ阻害剤がＢＲＤ７３８９又はＢＩ－Ｄ１８７０である、上記［１３］又は［１４］に記載の分化誘導用組成物。
［１６］ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、又はｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、上記［１４］又は［１５］に記載の分化誘導用組成物。
［１７］前記体細胞が線維芽細胞又は間葉系幹細胞である、上記［１０］～［１６］のいずれか一項に記載の分化誘導用組成物。
 
　本発明によれば、人為的な遺伝子導入を行うことなく、体細胞からインスリン分泌能の高いインスリン産生細胞への直接転換ないし誘導を効率的に行うことができる。本発明により得られたインスリン産生細胞は、再生医療などにおいて有用である。
 
ヒト線維芽細胞からウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むあるいは除いて直接分化誘導されたインスリン産生細胞が分泌するインスリン量を表す。縦軸は細胞の総タンパク質１ｍｇあたりのインスリン分泌量（μＵ／ｍｇ）を示す。各実験結果において、左カラムはウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む場合の結果を、右カラムはウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含まない場合の結果を、それぞれ示す。 ヒト線維芽細胞からインスリンを２０μｇ／ｍＬあるいは１２０μｇ／ｍＬ含有して直接分化誘導されたインスリン産生細胞が分泌するインスリン量を表す。縦軸は細胞の総タンパク質１ｍｇあたりのインスリン分泌量（μＵ／ｍｇ）を示す。各実験結果において、左カラムはインスリンを２０μｇ／ｍＬ含有した場合の結果を、インスリンを１２０μｇ／ｍＬ含有した場合の結果を、それぞれ示す。 ヒト線維芽細胞から直接分化誘導されたインスリン産生細胞が分泌するインスリン量を表す。縦軸は細胞の総タンパク質１ｍｇあたりのインスリン分泌量（μＵ／ｍｇ）を示す。 ヒト線維芽細胞から直接分化誘導されたインスリン産生細胞が分泌するインスリン量を表す。縦軸は細胞の総タンパク質１ｍｇあたりのインスリン分泌量（μＵ／ｍｇ）を示す。 ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡｄＭＳＣ）から直接分化誘導されたインスリン産生細胞が分泌するインスリン量を表す。縦軸は細胞の総タンパク質１ｍｇあたりのインスリン分泌量（μＵ／ｍｇ）を示す。
　以下、本発明について詳細に説明する。
１　インスリン産生細胞の製造方法
　本発明に係る、インスリン産生細胞の製造方法（以下、「本発明製法」という。）は、体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、無血清の分化誘導用培地で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。あるいは体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、分化誘導用培地にインスリンを５μｇ／ｍＬ以上含有して体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。
　上記の通り、本発明の要旨の一つは、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のような血清を実質的に含まない無血清の分化誘導用培地にて体細胞を培養し、インスリン産生細胞を製造することにある。また、本発明の要旨としては、分化誘導用培地にインスリンを５μｇ／ｍＬ以上と比較的多く含有してインスリン産生細胞を製造することを挙げることができる。
　ここで「無血清」とは、無調整又は未精製の血清を実質的に含まないことをいい、本発明においては、分化誘導用培地に精製された血液由来の成分や動物組織由来の成分が混入していても、無調整又は未精製の血清を実質的に含まない限り、無血清の分化誘導用培地という。
　上記において、無血清の分化誘導用培地で、かつインスリンを５μｇ／ｍＬ以上含有して体細胞を培養する工程を含む本発明製法が好ましい。
　また、上記工程は、ＲＳＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程であることが好ましい。より好ましくは、上記工程が、ＲＳＫ阻害剤に加え、さらにＧＳＫ３阻害剤、及び／又はｃＡＭＰ誘導体の存在下で体細胞を培養する工程である。特に、上記工程が、ＲＳＫ阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤の存在下、又はＲＳＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導体の存在下で体細胞を培養する工程であることが好ましい。上記工程は、さらにＰＩ３Ｋ阻害剤など、必要に応じて、任意に他の阻害剤や誘導剤等の存在下で体細胞を培養する工程であってもよい。
　上記阻害剤や誘導剤は、それぞれにおいて、１種を用いても２種以上を併用してもよい。
　具体的な上記阻害剤等においては、２種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等が存在しているとみなすことができる。
１．１　体細胞について
　生物の細胞は、体細胞と生殖細胞とに分類できる。本発明製法には、その出発材料として任意の体細胞を使用することができる。体細胞には特に限定はなく、生体から採取された初代細胞、又は株化された細胞の何れでもよい。本発明製法では、分化の種々の段階にある体細胞、例えば、最終分化した体細胞（例、線維芽細胞、臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、肝細胞（Hepatocytes）、胆管細胞（Biliary cells）、膵α細胞（Pancreatic α cells）、膵腺房細胞（Acinar cells）、膵管腺細胞（Ductal cells）、小腸腺窩細胞（Intestinal crypt cells）など）、最終分化への途上にある体細胞（例、間葉系幹細胞、神経幹細胞、内胚葉前駆細胞など）、又は初期化され多能性を獲得した体細胞を使用することができる。本発明製法に使用できる体細胞としては、任意の体細胞、例えば、造血系の細胞（各種のリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、骨髄細胞等）、臓器由来の細胞（肝細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞等）、筋組織系の細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞等）、線維芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、間質細胞、脂肪細胞（白色脂肪細胞等）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等が挙げられる。また、これらの細胞の前駆細胞、癌細胞にも本発明製法を適用できる。好ましくは、線維芽細胞又は間葉系幹細胞を使用することができる。
　本発明で用いうる線維芽細胞としては、特に限定されず、例えば、皮膚線維芽細胞（Dermal Fibroblasts）、大動脈外膜線維芽細胞（Adventitial Fibroblasts）、心臓線維芽細胞（Cardiac Fibroblasts）、肺線維芽細胞（Pulmonary Fibroblasts）、子宮線維芽細胞（Uterine Fibroblasts）、絨毛間葉系線維芽細胞（Villous Mesenchymal Fibroblasts）などの種々の組織や器官で結合組織を構成する主要な細胞成分であり膠原線維生産を行う細胞を挙げることができる。
　本発明で用いうる間葉系幹細胞としては、特に限定されず、例えば、脂肪組織由来間葉系幹細胞（Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells）、骨髄由来間葉系幹細胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells）、臍帯由来間葉系幹細胞（Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells）、臍帯血由来間葉系幹細胞（Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells）、歯髄組織由来間葉系幹細胞（Dental pulp-derived mesenchymal stem cells）、胎盤由来間葉系幹細胞（Placenta-derived mesenchymal stem cells）、羊膜由来間葉系幹細胞（Amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells）、子宮内膜由来間葉系幹細胞（Endometrium-derived mesenchymal stem cells）、滑膜由来間葉系幹細胞（Synovium-derived mesenchymal stem cells）、真皮組織由来間葉系幹細胞、歯周靭帯由来間葉系幹細胞を挙げることができる。
　上記の体細胞の供給源としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、これらに限定されるものではない。体細胞の供給源としては、ヒト、及びヒト以外の哺乳動物が好ましく、ヒトが特に好ましい。ヒトへの投与を目的として本発明製法によりインスリン産生細胞を製造する場合、好ましくは、レシピエントと組織適合性抗原のタイプが一致又は類似したドナーより採取された体細胞を使用することができる。レシピエント自身より採取された体細胞をインスリン産生細胞の製造に供してもよい。
１．２　体細胞の培養
　本発明製法における体細胞の培養は、分化誘導用培地にウシ胎児血清（ＦＢＳ）のような血清を含有せずに行うこと、及び／又はインスリンを５μｇ／ｍＬ以上含有して行うこと以外は、常法により行うことができる。そして、使用する体細胞の種類に応じた培地、温度、その他の条件を選択し、上記の各種の阻害剤（及び、場合により誘導剤ないし活性化剤）の存在下において実施することができる。
　本発明製法においては、上記した各種の阻害剤等を含む分化誘導用培地において体細胞を培養することにより、一段階の培養によって体細胞からインスリン産生細胞を製造することができる。
　また、使用する体細胞として培養が容易なものを選択することにより、あらかじめ細胞数を増加させほぼコンフルエントの状態に達した体細胞をインスリン産生細胞に転換することも可能である。従って、スケールアップしたインスリン産生細胞の製造も容易である。
　本発明を実施する上で基礎となる分化誘導用培地あるいは体細胞を継代培養するための培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はこれらを改変した培地に、適切な成分（血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等）を添加して使用することができる。
　本発明製法の一態様において、分化誘導用培地にはインスリンが５μｇ／ｍＬ以上含有されるが、好ましくは２０μｇ／ｍＬ以上ないし２５μｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは８０～１２０μｇ／ｍＬの範囲内である。
　基礎となる公知の又は市販の誘導用培地に予め一定のインスリンが含まれている場合には、インスリンが上記の量含有されるようインスリンを添加して調整することができる。
　培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択することができる。３７℃、５％ＣＯ２の条件などが例示される。培養中は適切な間隔（好ましくは１日から５日に１回、より好ましくは２日から４日に１回）で培地を交換することが好ましい。線維芽細胞を材料として本発明製法を実施する場合、３７℃、５％ＣＯ２の条件では６ないし８日間から１２日間でインスリン産生細胞が出現する。間葉系幹細胞を材料として本発明製法を実施する場合、３７℃、５％ＣＯ２の条件では一週間前後からインスリン産生細胞が出現する。
　体細胞の培養には、プレート、ディッシュ、細胞培養用フラスコ、細胞培養用バッグ等の細胞培養容器を使用することができる。なお、細胞培養用バッグとしては、ガス透過性を有するものが好適である。大量の細胞を必要とする場合には、大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系又は閉鎖系のどちらでも実施することができるが、得られたインスリン産生細胞のヒトへの投与等を目的とする場合には、閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
１．３　本発明に用いうる阻害剤等について
１．３．１　ＲＳＫ阻害剤
　ＲＳＫ（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　Ｓ６　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ）は、広く細胞に発現しており、様々な成長因子に応答するセリン・スレオニンキナーゼの一つである。分子量が７０ｋＤａと９０ｋＤａのサブファミリーに分かれており、特に９０ｋＤａのＲＳＫサブファミリーは、ＭＡＰＫシグナル伝達経路に属するＥＲＫによってリン酸化されることで活性化し、哺乳類では４つの遺伝子が存在している。活性化した９０ｋＤａのＲＳＫは、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ６を含む下流の様々なタンパク質のリン酸化を行い、細胞の生存、細胞増殖、分化などを多様に制御している。
　「ＲＳＫ阻害剤の存在下」とは、ＲＳＫを阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＲＳＫの活性を阻害する物質、例えば、抗ＲＳＫ抗体やＲＳＫ阻害剤のようなＲＳＫシグナル阻害手段を利用することができる。また、ＲＳＫは自身の特定の部位がリン酸化されると活性化することから、上記のリン酸化を阻害する手段も、ＲＳＫシグナルの阻害に利用することができる。
　本発明では特に限定されないが、ＲＳＫ阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＢＲＤ７３８９又はＢＩ－Ｄ１８７０を使用することができる。
ＢＲＤ７３８９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３７６３８２－１１－５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
ＳＬ　０１０１－１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７７３０７－５０－７）
ＢＩ－Ｄ１８７０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：５０１４３７－２８－１）
ＬＪＨ６８５（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１６２７７１０-５０-２）
ＬＪＩ３０８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１６２７７０９-９４-７）
ＦＭＫ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８２１７９４-９２-７）
ＲＭＭ４６（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３０７８９６-４６-３）
ＣＭＫ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８２１７９４-９０-５）
Ｃａｒｎｏｓｏｌ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：５９５７-８０-２）
Ｂｉｘ　０２５６５（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３１１３６７-２７-７）
　ＲＳＫ阻害剤の濃度は、用いる体細胞等によって異なるが、特に限定されず適宜決定すればよく、例えば、０．０５μｍｏｌ／Ｌ～５０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ～２０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．３．２　ＧＳＫ３阻害剤
　ＧＳＫ３（ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ－３、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３）は、グリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活性化するプロテインキナーゼとして見いだされた。哺乳類では、ＧＳＫ３は５１ｋＤａのα（ＧＳＫ３α）と４７ｋＤａのβ（ＧＳＫ３β）の二つのアイソフォームに分類される。ＧＳＫ３は種々のタンパク質をリン酸化する活性を有しており、グリコーゲン代謝のみならず、細胞分裂、細胞増殖等の生理現象にも関わっている。
　「ＧＳＫ３阻害剤の存在下」とは、ＧＳＫ３を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＧＳＫ３の活性を阻害する物質、例えば、抗ＧＳＫ３抗体やＧＳＫ３阻害剤のようなＧＳＫ３シグナル阻害手段を利用することができる。また、ＧＳＫ３は自身の特定の部位がリン酸化されると活性を失うことから、上記のリン酸化を促進する手段も、ＧＳＫ３シグナルの阻害に利用することができる。
　本発明では特に限定されないが、ＧＳＫ３阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１を使用することができる。
ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２５２９１７－０６－９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ）（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６７４６３－６２－９）
Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１４２２７３－２０－９）
Ａ１０７０７２２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３８４４２４－８０－９）
ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２８０７４４－０９－４）
ＣＨＩＲ９８０１４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：５５６８１３－３９－９）
ＴＷＳ１１９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６０１５１４－１９－６）
Ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６５８５４－０５－３）
ＳＢ４１５２８６（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２６４２１８－２３－７）
Ｂｉｋｉｎｉｎ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１８８０１１－６９－０）
ＩＭ－１２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１２９６６９－０５－１）
１－Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６７６５９６－６５－９）
ＬＹ２０９０３１４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６０３２８８－２２－８）
ＡＺＤ１０８０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６１２４８７－７２－６）
ＡＺＤ２８５８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４８６４２４－２０－８）
ＡＲ－Ａ０１４４１８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４８７０２１－５２－３）
ＴＤＺＤ－８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３２７０３６－８９－５）
Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４７９－４１－４）
　ＧＳＫ３阻害剤の濃度は、用いる体細胞等によって異なるが、特に限定されず適宜決定すればよく、例えば、０．０５μｍｏｌ／Ｌ～２０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．３．３　ｃＡＭＰ誘導剤
　ｃＡＭＰ（環状アデノシン１リン酸）は、セカンドメッセンジャーとして種々の細胞内シグナル伝達に関わっている物質である。ｃＡＭＰは、細胞内ではアデニル酸シクラーゼ（ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ）によりアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）が環状化されることで生成する。
　「ｃＡＭＰ誘導剤の存在下」とは、ｃＡＭＰを誘導することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させることができる任意の手段を利用することができる。ｃＡＭＰの生成に関わる酵素であるアデニル酸シクラーゼに直接作用して誘導することができる物質、アデニル酸シクラーゼの発現を促進しうる物質の他、ｃＡＭＰを分解する酵素であるホスホジエステラーゼを阻害する物質等を、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる手段として使用することができる。細胞内でｃＡＭＰと同じ作用を持つ、ｃＡＭＰの構造類似体であるジブチリルｃＡＭＰ（ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ　ｃＡＭＰ）を使用することもできる。
　本発明では特に限定されないが、ｃＡＭＰ誘導剤（アデニル酸シクラーゼ活性化剤）としては、例えば、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ：ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６５７５－２９－９）、及びフォルスコリン誘導体（例えば特開２００２－３４８２４３号公報）や以下の化合物などが挙げられる。好ましくは、フォルスコリンを使用することができる。
フォルスコリン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６４２８－８９－５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
イソプロテレノール（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７６８３－５９－２）
ＮＫＨ４７７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３８６０５－００－２）
ＰＡＣＡＰ１－２７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２７３１７－０３－７）
ＰＡＣＡＰ１－３８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３７０６１－４８－４）
　ｃＡＭＰ誘導剤の濃度は、用いる体細胞等によって異なるが、特に限定されず適宜決定すればよく、例えば、０．２μｍｏｌ／Ｌ～５０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．３．４　ＰＩ３Ｋ阻害剤
　ＰＩ３Ｋ（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ　３－ｋｉｎａｓｅ）は、イノシトールリン脂質をリン酸化する酵素であり、産生されるホスホイノシチドはＰＤＫ１を活性化する。ＰＤＫ１はさらにＡＫＴをリン酸化し、ＰＤＫ１／ＡＫＴシグナル経路が活性化される。ＬＹ２９４００２は、ＰＩ３Ｋに選択的な阻害剤であり、ホスホイノシチドの産生を抑えることでＰＤＫ１／ＡＫＴシグナル経路の活性化を阻害する。
　「ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下」とは、ＰＩ３Ｋを阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＰＩ３Ｋを阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＰＩ３Ｋに直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＰＩ３Ｋ抗体、その他の薬剤）、ＰＩ３Ｋ自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＰＩ３Ｋが関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもＰＩ３Ｋを阻害することができる。
　本発明では特に限定されないが、ＰＩ３Ｋ阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＬＹ２９４００２を使用することができる。
ＬＹ２９４００２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１５４４４７－３６－６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Ｂｕｐａｒｌｉｓｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９４４３９６－０７－０）
ＴＧＲ－１２０２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１５３２５３３－６７－７）
ＰＩ－１０３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３７１９３５－７４－９）
ＩＣ－８７１１４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３７１２４２－６９－２）
Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１９５４５－２６－７）
ＺＳＴＫ４７４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４７５１１０－９６－４）
ＡＳ－６０５２４０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６４８４５０－２９－７）
ＰＩＫ－９０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６７７３３８－１２－４）
ＡＺＤ６４８２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１７３９００－３３－８）
Ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２０１４３８－５６－３）
ＴＧ１００－１１５（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６７７２９７－５１－７）
ＣＨ５１３２７９９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１００７２０７－６７－１）
ＣＡＹ１０５０５（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２１８７７７－１３－９）
ＰＩＫ－２９３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９００１８５－０１－５）
ＣＺＣ２４８３２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１５９８２４－６７－５）
Ｐｉｌａｒａｌｉｓｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９３４５２６－８９－３）
ＡＺＤ８８３５（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１６２０５７６－６４－８）
　ＰＩ３Ｋ阻害剤の濃度は、用いる体細胞等によって異なるが、特に限定されず適宜決定すればよく、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ～２０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
 
１．４　インスリン産生細胞
　上記した本発明製法により、インスリン産生細胞を含有する細胞集団を得ることができる。本発明製法により製造されるインスリン産生細胞も本発明の範囲内である。本発明製法で製造されるインスリン産生細胞は、最終分化した細胞の他、インスリン産生細胞に分化することが運命づけられた前駆細胞でもよい。
　本発明製法により製造されるインスリン産生細胞は、低分子化合物により体細胞から直接分化誘導される、いわゆる低分子化合物誘導性インスリン産生細胞（ｃｉＩＰＣｓ）であって、遺伝子導入により分化誘導されるものとは区別される。
　本発明製法で製造されるインスリン産生細胞は、例えば、細胞の形態的変化、インスリン産生細胞の特徴的性質や特異的マーカー（例、抗インスリン抗体）を利用して、検出、確認及び分離を行うことができる。また、分泌されるインスリンの量をサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量することによっても、製造されたインスリン産生細胞の分泌能を評価することができる。
　特異的マーカーの検出には、検疫的方法（抗体による検出）を利用できるが、タンパク質分子に関してはそのｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。インスリン産生細胞の特異的マーカーを認識する抗体は、本発明製法により得られたインスリン産生細胞を単離及び精製する上でも有用である。
　本発明製法で製造されるインスリン産生細胞は、例えば、組織修復や血中インスリン濃度の改善等のために使用することができる。本発明製法で製造されるインスリン産生細胞を移植することにより、組織修復等のための医薬用組成物を製造することができる。先天的にインシュリンがほとんど分泌できない１型糖尿病の患者では、その症状の軽減および根治のためには、膵臓移植あるいは膵島の移植が抜本的な治療法となっている。また、２型糖尿病の患者は国内外で今後さらに増加し、医療費高騰の原因となることが予測されているが、インシュリンを分泌する膵β細胞の移植は有効な治療法となり得る。このような糖尿病等の膵臓疾患の治療手段として、インスリン産生細胞の製造方法、及びインスリン産生細胞の移植方法の開発が行なわれている。例えば、インスリン産生細胞を腎皮膜下へ移植を行ったり、門脈を介して肝臓へ移植することで、重度の膵臓疾患（糖尿病等）の治療への利用が期待されている。
　本発明製法で製造されるインスリン産生細胞を医薬用組成物とする場合には、常法により、インスリン産生細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。
　本発明製法で製造されるインスリン産生細胞は、さらに、インスリン産生細胞の機能発揮や生着性向上に有効な他の細胞や成分と組み合わせた組成物とすることもできる。
　さらに、本発明製法で製造されるインスリン産生細胞は、インスリン産生細胞に作用する医薬候補化合物のスクリーニングや医薬候補化合物の安全性評価のために使用することもできる。インスリン産生細胞は、医薬候補化合物の毒性を評価するための重要なツールである。本発明製法によれば、一度の操作で多くのインスリン産生細胞を取得することができることから、細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能になる。
 
２　組成物
　本発明に係る誘導用組成物（以下、「本発明組成物」という。）は、体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、無血清であることを特徴とする。あるいは体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、インスリンを５μｇ／ｍＬ以上含有することを特徴とする。
　上記の通り、本発明の要旨の一つは、体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物において、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のような血清を実質的に含まないことにある。また、本発明の要旨としては、体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物において、インスリンを５μｇ／ｍＬ以上と比較的多く含有することを挙げることができる。
　上記において、無血清で、かつインスリンを５μｇ／ｍＬ以上含有する本発明組成物が好ましい。
　また、ＲＳＫ阻害剤を含む本発明組成物が好ましい。より好ましくは、ＲＳＫ阻害剤に加え、さらにＧＳＫ３阻害剤、及び／又はｃＡＭＰ誘導体を含む本発明組成物である。特に、ＲＳＫ阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤、又はＲＳＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導体を含む本発明組成物が好ましい。さらにＰＩ３Ｋ阻害剤など、必要に応じて、任意に他の阻害剤や誘導剤等を含む本発明組成物であってもよい。
　上記阻害剤や誘導剤等は、それぞれにおいて、１種であっても２種以上の併用であってもよい。
　具体的な上記阻害剤等においては、２種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等を含んでいるとみなすことができる。
　上記した阻害剤や誘導剤等の具体例や好ましい例などは、前記と同義である。
　本発明組成物は、体細胞からインスリン産生細胞を製造するための培地として使用することができる。
　本発明組成物としては、細胞の培養に必要な成分を混合して製造した基礎培地に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のような血清を含有しない、及び／又はインスリンを５μｇ／ｍＬ以上含有する培地を例示することができる。さらに当該培地に、有効成分として、ＲＳＫ阻害剤を含み、さらに必要に応じてＧＳＫ３阻害剤、及び／又はｃＡＭＰ誘導体やＰＩ３Ｋ阻害剤を含む培地を例示することができる。上記の有効成分は、インスリン産生細胞の製造に有効な濃度で含まれていればよく、濃度は当業者が適宜決定することができる。基礎培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、又はこれらを改変した培地を、基礎培地として使用することができる。
　本発明組成物の一態様において、インスリンが５μｇ／ｍＬ以上含有されるが、好ましくは２０μｇ／ｍＬ以上ないし２５μｇ／ｍＬ以上含有され、より好ましくは８０～１２０μｇ／ｍＬの範囲内で含有される。
　基礎となる公知の又は市販の分化誘導用培地に予め一定のインスリンが含まれている場合には、インスリンが上記の量含有されるようインスリンを添加して本発明組成物を作製することができる。
　本発明組成物に係る培地にはさらに、本明細書中で上記した公知の培地成分、例えば、血清、タンパク質（アルブミン、トランスフェリン、成長因子等）、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等を添加してもよい。
　本発明組成物に係る培地にはさらに、本明細書中で上記した、インスリン産生細胞への分化の誘導に有効な物質を添加してもよい。
 
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
実施例１　インスリン産生細胞の製造
～ヒト線維芽細胞からインスリン産生細胞への直接誘導～
（１）ヒト線維芽細胞
　材料としたヒト線維芽細胞はＤＳファーマバイオメディカル株式会社から購入した。３８才のヒト皮膚に由来する線維芽細胞である。
（２）ヒト線維芽細胞からのインスリン産生細胞への直接誘導
　ヒト線維芽細胞を、ゼラチン（Ｃａｔ＃：１９０－１５８０５，和光純薬工業社製）でコーティングされた３５ｍｍディッシュに５×１０４個ずつ播種し、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で、３７℃、５％ＣＯ２条件下でコンフルエントになるまで培養した。なおＤＭＥＭは、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）を示す。
　上記のヒト線維芽細胞のディッシュの培地を、下記の分化誘導用培地に交換した。
・分化誘導用培地：１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を添加又は添加せずに、ＩＴＳ-Ｘ（Ｃａｔ＃：５１５０００５６、Ｇｉｂｃｏ社製）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ：Ｎｏｎ-ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ；Ｃａｔ＃：１１１４００５０、Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ社製；終濃度２ｍｍｏｌ／Ｌ）、ニコチンアミド（Ｃａｔ＃：７２３４０－１００Ｇ、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ社製；終濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｅｘｅｎｄｉｎ-４（Ｃａｔ＃：ａｖ１２０２１４、Ａｂｃａｍ社製；終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、インスリン、及び下記の低分子化合物を添加したＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ-１２（Ｃａｔ＃：１２６３４０１０；Ｇｉｂｃｏ社製）。
　その後、３日毎に同組成の培地へ培地交換を行いながら、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で培養した。
　なお、分化誘導用培地には、インスリンが２０～１２０μｇ／ｍＬ含まれるよう、必要に応じてヒト組換え体インスリン（Ｃａｔ＃：０９３-０６３５１；　Ｗａｋｏ）を添加し調整した。
＜低分子化合物＞
３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｃａｔ＃：１３１２２，Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）
７．５μＭ　フォルスコリン（Ｃａｔ＃：０６３－０２１９３，Ｗａｋｏ）
１．５μＭ　ＢＲＤ７３８９（Ｃａｔ＃：ａｂ１４６１６１，Ａｂｃａｍ）
５μＭ　ＬＹ２９４００２（Ｃａｔ＃：７０９２０，Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）
（３）結果
　上記（２）に従って１４日間培養した結果を図１～４に示す。
　図中、「４Ｃ」は上記４つの低分子化合物を意味し、「３Ｃ」は上記４つの低分子化合物の中、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＲＤ７３８９、及びフォルスコリンの３種を意味する。「＋ＦＢＳ」は培地中にＦＢＳを存在させたことを示し、「－ＦＢＳ」は培地中にＦＢＳを存在させなかったことを示す。また、「ＮｏＣ」ないし「Ｎｏ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ」は上記４つの低分子化合物（４Ｃ）ないし３Ｃを培地中に存在させなかったことを示す。従って、例えば「Ｎｏ　Ｃ．－ＦＢＳ」は、４Ｃを存在させず、かつＦＢＳも存在させなかった場合の実験結果を、「４Ｃ－ＦＢＳ」は、４Ｃを存在させ、かつＦＢＳを存在させなかった場合の実験結果を、それぞれ表す。
　図４において、「Ｂ」はＢＲＤ７３８９を意味し、「３Ｃ－Ｂ」は、３Ｃの中、ＢＲＤ７３８９を存在させなかった場合、即ちＣＨとＦの２因子による実験結果を表す。「３Ｃ－Ｂ＋ＢＩ－Ｄ１８７０」は、３Ｃの中、ＢＲＤ７３８９を存在させず、代わりにＲＳＫ阻害剤であるＢＩ－Ｄ１８７０（Ｃａｔ＃：１５２６４，Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を終濃度５μＭ又は１０μＭで存在させた場合の実験結果を表す。
　図１に示す通り、分化誘導用培地にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含まず誘導することで、インスリン分泌量が約２０～５０倍増加し、より分泌能の高いインスリン産生細胞がヒト線維芽細胞から直接効率的に誘導された。
　図２に示す通り、分化誘導用培地中に高濃度のインスリン（１２０μｇ／ｍＬ）を含有して誘導することで、インスリン分泌量が約３倍増加し、より分泌能の高いインスリン産生細胞がヒト線維芽細胞から直接効率的に誘導された。
　上記から、インスリン分泌増加におけるＦＢＳと高濃度インスリンの効果は、それぞれ独立していると考えられる。
　図３に示す通り、分化誘導用培地中のインスリンの濃度が１００μｇ／ｍＬまでは濃度が高いほどインスリン分泌量が多く、濃度依存的に分泌能の高いインスリン産生細胞がヒト線維芽細胞から直接得られた。
　図４の結果から、ＬＹ２９４００２を除き、ＲＳＫ阻害剤（ＢＲＤ７３８９）、ＧＳＫ阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）、及びｃＡＭＰ誘導剤（フォルスコリン）の３因子から更にＲＳＫ阻害剤（ＢＲＤ７３８９）を除いた２因子では、インスリンの分泌量が少なく、インスリン産生細胞への誘導にはＲＳＫ阻害剤の存在が重要であることが示唆された。一方、ＢＲＤ７３８９の代わりに別のＲＳＫ阻害剤であるＢＩ－Ｄ１８７０を存在させた３因子でも分泌能の高いインスリン産生細胞が得られた。
実施例２　インスリン産生細胞の製造
～ヒト間葉系幹細胞からインスリン産生細胞への直接誘導～
（１）ヒト間葉系幹細胞
　脂肪組織から単離されたヒト間葉系幹細胞はタカラバイオ株式会社から購入した。
（２）ヒト間葉系幹細胞からのインスリン産生細胞への直接誘導
　ヒト間葉系幹細胞を、ゼラチン（Ｃａｔ＃：１９０－１５８０５，和光純薬工業社製）でコーティングされた３５ｍｍディッシュに５×１０４個ずつ播種し、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２（Ｃａｔ＃：Ｃ-２８００９；タカラバイオ社製）で、３７℃、５％ＣＯ２条件下でほぼコンフルエントになるまで培養した。
　上記のヒト間葉系幹細胞のディッシュの培地を、下記の分化誘導用培地に交換した。
・分化誘導用培地：１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を添加又は添加せずに、ＩＴＳ-Ｘ（Ｃａｔ＃：５１５０００５６、Ｇｉｂｃｏ社製）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ：Ｎｏｎ-ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ；Ｃａｔ＃：１１１４００５０、Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ社製；終濃度２ｍｍｏｌ／Ｌ）、ニコチンアミド（Ｃａｔ＃：７２３４０－１００Ｇ、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ社製；終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｅｘｅｎｄｉｎ-４（Ｃａｔ＃：ａｖ１２０２１４、Ａｂｃａｍ社製；終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び下記の低分子化合物を添加したＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｃａｔ＃：１２６３４０１０；Ｇｉｂｃｏ社製）。
　その後、３日毎に同組成の培地へ培地交換を行いながら、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で培養した。
　なお、誘導用培地にインスリンを１２０μｇ／ｍＬ含む実験においては、インスリンが１２０μｇ／ｍＬ含まれるようヒト組換え体インスリン（Ｃａｔ＃：０９３-０６３５１；　Ｗａｋｏ）を添加し調整した。
＜低分子化合物＞
０．５μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｃａｔ＃：１３１２２，Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）
３．７５μＭ　フォルスコリン（Ｃａｔ＃：０６３－０２１９３，Ｗａｋｏ）
０．２μＭ　ＢＲＤ７３８９（Ｃａｔ＃：ａｂ１４６１６１，Ａｂｃａｍ）
２．５μＭ　ＬＹ２９４００２（Ｃａｔ＃：７０９２０，Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）
（３）結果
　上記（２）に従って１４日間培養した結果を図５に示す。
　図中、「４Ｃ」は上記４つの低分子化合物を意味する。「＋ＦＢＳ」は培地中にＦＢＳを存在させたことを示し、「－ＦＢＳ」は培地中にＦＢＳを存在させなかったことを示す。また、「Ｎｏ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ」は上記４つの低分子化合物を培地中に存在させなかったことを示す。従って、例えば「Ｎｏ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ－ＦＢＳ」は、４Ｃを存在させず、かつＦＢＳも存在させなかった場合の実験結果を、「４Ｃ－ＦＢＳ」は、４Ｃを存在させ、ＦＢＳを存在させなかった場合の実験結果を、それぞれ表す。
　図５に示す通り、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡｄＭＳＣ）からの直接分化誘導においても、分化誘導用培地にウシ胎児血清（ＦＢＳ）が含まれなくてもインスリンの分泌が十分に確認された。また、高濃度（１２０μｇ／ｍＬ）のインスリンを分化誘導用培地に含有して誘導すると、インスリン分泌量が顕著に増加し、より分泌能の高いインスリン産生細胞がヒト間葉系幹細胞から直接効率的に誘導された。
 

 

Claims (17)

  1. 体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、無血清の分化誘導用培地で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
  2. 体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、分化誘導用培地にインスリンを５μｇ／ｍＬ以上含有して体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
  3. 体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造する方法であって、無血清の分化誘導用培地で、かつ分化誘導用培地にインスリンを５μｇ／ｍＬ以上含有して体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞の製造方法。
  4. 前記工程が、ＲＳＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項１～３のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
  5. 前記工程が、さらにＧＳＫ３阻害剤、及び／又はｃＡＭＰ誘導体の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項４に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
  6. ＲＳＫ阻害剤がＢＲＤ７３８９又はＢＩ－Ｄ１８７０である、請求項４又は５に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
  7. ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、又はｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、請求項５又は６に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
  8. 前記体細胞が、線維芽細胞又は間葉系幹細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞の製造方法から製造される、インスリン産生細胞。
  10. 体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、無血清であることを特徴とする、分化誘導用組成物。
  11. 体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、インスリンを５μｇ／ｍＬ以上含有することを特徴とする、分化誘導用組成物。
  12. 体細胞から直接分化誘導することによりインスリン産生細胞を製造するための組成物であって、無血清で、かつインスリンを５μｇ／ｍＬ以上含有することを特徴とする、分化誘導用組成物。
  13. ＲＳＫ阻害剤を含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の分化誘導用組成物。
  14. さらにＧＳＫ３阻害剤、及び／又はｃＡＭＰ誘導体を含む、請求項１３に記載の分化誘導用組成物。
  15. ＲＳＫ阻害剤がＢＲＤ７３８９又はＢＩ－Ｄ１８７０である、請求項１３又は１４に記載の分化誘導用組成物。
  16. ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、又はｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、請求項１４又は１５に記載の分化誘導用組成物。
  17. 前記体細胞が線維芽細胞又は間葉系幹細胞である、請求項１０～１６のいずれか一項に記載の分化誘導用組成物。
     
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