KR20220110541A - 세포로부터 배양된 고기, 조직 및 연관 생성물을 제조하기 위한 시스템 - Google Patents

세포로부터 배양된 고기, 조직 및 연관 생성물을 제조하기 위한 시스템 Download PDF

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KR20220110541A
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포 산 마리오 친
카이 이 캐리 찬
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아반트 미츠 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 세포 생성을 강화하고 세포 배양물을 성장시키는 비용을 감소시키는 세포 배양 시스템에 관한 것이다. 상기 시스템은 배양 배지 중에서 영양소의 수준을 안정화하는 것 및/또는 성장 억제인자의 최소 수준을 유지하는 것에 의해 최적의 배양 조건을 유지한다. 상기 시스템은 적어도 1종 유형의 세포를 유지하도록 구성되는 세포 배양 장치; 세포 배양 장치로 제1 유체를 공급 및 수용하도록 구성되는 신규 배지 장치; 신규 배지 장치로부터 제2 유체를 공급 및 수용하도록 구성되는 폐기물 제거 장치; 및 제1 유체로부터 제2 유체로 폐기물을 추출하고 제2 유체로부터 제1 유체로 영양소를 공급하도록 구성되는 투석 장치를 포함한다.

Description

세포로부터 배양된 고기, 조직 및 연관 생성물을 제조하기 위한 시스템
본원에서 논의되는 실시양태들은 일반적으로 세포 배양물을 성장시키기 위한 개선된 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본원에서 논의되는 실시양태들은 또한 일반적으로 고기 제조 및 조직 구성/조작(tissue constructions/engineering)을 위한 개선된 시스템 및 방법에 관한 것이다.
동물의 고기는 단백질이 많아서, 신체 기능을 지원하는 데에 사용되는 단백질을 구성하는 데에 필요한 모든 아미노산을 공급한다. 소비용 고기는 통상적으로 농장에서 사육되는 동물 또는 어류로부터 수득된다. 그러나, 동물 고기를 제조하기 위한 축산 및 양식은 다량의 에너지 및 자원을 필요로 하며, 고도의 탄소 발자국(carbon footprint)을 나타낸다. 축산 또는 양식에 의해 제조되는 고기는 공공의 건강상 위험성을 야기할 수 있는데, 제조 과정이 고기를 질환, 오염 및 독소에 노출시킬 수 있기 때문이다. 인구 증가, 고기 수요의 증가, 환경적 우려, 제한된 토지 및 수 자원, 생물다양성 상실, 및 동물 도축과 연관된 부정적인 인식과 같은 수많은 우려사항들이 대안적인 과정에 의해 고기를 제조하는 기술을 개발하도록 과학자들을 이끌었다.
시험관내 고기 제조는 고기 및 고기 생성물을 제조하는 세포 배양 기술을 사용하여 실험실에서 동물 유래의 근육 조직 또는 기관 조직이 성장되는 과정이다. 본원에서 사용될 때, 시험관내 고기 및 고기 생성물에는 가용성 형태 및 고체 형태를 포함한 동물 단백질 생성물은 물론 비-고기 생성물이 포함된다. 아직 개발 초기 단계 있기는 하지만, 시험관내 고기 및 고기 생성물은 건강 및 환경상의 장점과 같은 통상적인 고기 생성물에 대비한 수많은 장점들을 제공할 수 있으며, 동물 복지에 유익할 수 있다. 이는 더 넓은 세포 축산 분야 또는 세포 배양물로부터의 축산 생성물 제조의 일부로서 운용되는 차-세대의 신흥 기술이다.
시험관내 고기의 제조를 위한 세포는 동물 생검물로부터 채취된 다음 생물반응기 또는 기타 유형의 멸균 환경의 배양 배지 중에서 동물과 별개로 성장되었을 수 있는 세포 (예컨대 근육 세포, 체세포, 줄기 세포 등)일 수 있다. 세포는 생물반응기에 배치되는 식용가능한 3-차원 스캐폴드에 부착시키는 것에 의해 동물 기관을 모방한 반-고체 또는 고체 형태로 성장할 수 있다. 개시자 세포는 동물의 조직 또는 연속 세포주로부터 바로 수득된 초대 세포일 수 있다. 적절한 배양 배지 중에서 올바른 조건하에 성장될 경우, 초대 세포는 세포 DNA 말단의 텔로미어 길이와 관련된 한정된 회수로만 성장 및 증식하게 된다. 반면, 연속 세포주는 장기간의 기간 동안 시험관내에서 배양될 수 있다. 세포 생물학 연구는 초대 세포를 불멸의 연속 세포주로 전환하는 방법 절차를 확립하고 있다. 초대 세포는 바이러스 종양유전자, 화학물질 처리, 또는 텔로미어의 단축을 방지하기 위한 텔로머라제 리버스 트랜스크립타제의 과발현을 사용하여 연속 세포주로 형질전환될 수 있다.
배양 배지는 아미노산, 염, 비타민, 성장 인자, 및 pH를 조절하기 위한 완충 시스템과 같은 세포 증식에 필요한 성분들을 함유할 수 있다. 현행 방법들은 사용 전에 배지에 소 태아 혈청 (FBS)을 첨가하는데, 그것이 필수적인 거대분자, 성장 인자 및 면역 분자들을 제공하기 때문이다. 그러나, FBS는 태어나지 않은 송아지로부터 유래하며, 그에 따라 동물 생성물이 없다는 목적에 부합하지 않는다. 무-동물 성분 배지에서의 세포의 성장은 시험관내 고기 제조 연구와 연관되어 있는 과학자들에 의해 고려되는 중요한 인자이다. 일부 성장 인자는 인간 공급원으로부터 유래할 수 있다.
현행 시험관내 고기 제조는 세포-기재 쇠고기, 돼지고기 및 가금류 고기와 같은 대부분의 시중 고기 유형들을 포괄한다. 그러나, 이들 유형의 고기는 현행 생물의학 과학기술의 기술들을 사용하여 제조하기가 어렵고 비용이 드는 다수의 세포 유형을 포함하는 복잡한 조직 구성을 가진다. 또한, 세포 배양 기술에 의해 제조되는 고기에서 단백질 수준 및 바이오매스(biomass) 수율을 증가시키는 비-GM 방법의 결핍이 존재한다. 또한, 상기에서 설명된 바와 같이, 현행 세포 배양 기술은 영양소 공급원으로서의 동물 성분 (예컨대 FBS)은 물론 고가의 비-식품 등급 성장 인자에 의존할 수 있다.
배양된 고기의 제조 또는 재생 의학/조직 조작/조직 구성의 임상 적용분야에서는, 충분한 세포 수를 수확하는 것이 중요하다. 배양된 고기 제조 적용분야에서, 1 kg의 단백질은 대략 8x1012개의 근육 세포를 함유한다. 재생 의학 적용분야에서는, 대부분의 적용시 치료 당 대략 1010 내지 1012개의 세포를 필요로 한다. 예를 들어, 성인에서 손상된 심장 조직을 대체하는 데에는, 1x109 내지 2x109개의 심근세포가 필요하게 된다. 간 부전을 치료하는 것은 1010개 간세포의 세포 수를 필요로 하게 된다.
현행 세포 배양 접근법은 배양 배지의 존재하에서 배양 용기의 2D 배양 표면상에 세포를 시딩하는 것이다. 일반적으로, 배양 배지는 글루코스, 비타민, 무기 염, 아미노산 및 기타 영양소들을 함유한다. 세포가 성장하면서, 영양소는 점차적으로 고갈되며, 대사 폐기물은 축적된다. 따라서, 배양 배지는 영양소를 보충하고 폐기물을 제거하기 위하여 2 내지 3일마다 교체된다. 이와 같은 세포 배양 접근법에는 몇 가지 문제점이 존재한다. 첫 번째로, 배지 교체 사이에는 세포가 최적이하 조건에서 성장한다. 특히 세포가 고도로 증식성이며 높은 대사율을 가지는 경우, 세포는 짧은 시간 안에 글루코스와 같은 영양소를 소비하고 락테이트 및 암모니아와 같은 폐기물을 축적한다. 상승된 대사 폐기물 또는 성장 억제인자 수준은 세포 성장을 억제할 수 있다. 이는 다음 배지 교체 라운드 전에 세포가 최적의 속도로 성장하는 것을 방해한다. 두 번째로, 배양 배지를 교체하는 것은 영양소 및 성장 인자를 낭비함으로써; 제조 비용을 증가시킨다. 그것이 교체될 때, 폐 배양 배지에는 여전히 영양소가 존재한다. 특히, 혈청 보충물 또는 세포로부터 분비되는 것 중 어느 하나로부터 유래하는 폐 배양 배지 중 성장 인자는 배지 교체 동안 제거된다. 이는 배지 비용 및 제조 비용 중 상당 부분에 기여하는 혈청 보충물의 사용을 증가시킨다. 세 번째로, 배지는 수동으로 교체될 필요가 있는데, 이는 대-규모 제조시 제조 비용 및 오염 가능성을 증가시킨다.
[발명의 개요]
본 개시내용의 실시양태들은 상기 과제들에 대한 해결책을 제공하는 인간 소비용 시험관내 고기 제조 방법에 관한 것이다.
세포 제조를 규모 증대하기 위한 대안적인 시스템 및 방법을 제공함으로써, 배양된 고기의 제조 및 조직 조작/재생 의학/조직 구성 적용분야의 비용을 낮추고 규모를 증대하는 것이 본 발명의 목적이다. 세포 제조를 위한 최적의 배양 조건, 안정한 영양소 수준 및/또는 최소한의 성장 억제인자 수준을 유지하는 시스템을 제공하는 것 또한 본 발명의 목적이다. 본 발명의 또 다른 목적은 자동으로 영양소를 보충하고 세포에 의해 생성된 성장 억제인자를 제거할 수 있으면서도 사용되지 않은 성장 인자를 유지하여 제조를 강화하고 비용을 감소시키는 대-규모 세포 배양 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포 배양 시스템을 사용한 고기 생성물의 제조 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 그와 같은 배양 시스템을 사용한 조직 조작/구성 방법을 제공하는 것이다. 마지막으로, 본 발명의 목적은 재생 의학 적용분야에 임상적으로 적격인 수로의 세포의 증식 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 하기의 장점들을 제공한다: (1) 최적의 세포 생존력 및 세포 성장을 위하여 배양 배지 중에서 글루코스와 같은 영양소를 최적 수준으로, 그리고 암모니아 및 락테이트와 같은 폐기물을 낮은 수준으로 유지하는 것, 및 (2) 세포에 의해 분비된 성장 인자를 잔류시키고, 배양 배지에서의 동물-유래 혈청의 사용을 감소시키는 것. 성장 인자는 고가이며, 그에 따라 본 발명은 폐기물은 제거하면서도 성장 인자는 배양 배지 중에 잔류시키는 것에 의해 비용을 낮추고 배지 사용을 최적화하는 것을 돕는다.
하기에서 더 상세하게 논의될 바와 같이, 본 발명은 통상적인 기술에 비해 (1) 세포 배양 시스템으로부터 방출되는 폐기물을 급격하게 감소시키고, (2) 세포 물질 생성을 급격하게 증가시킨다.
본 개시내용의 일 실시양태에 따라, 세포 배양 시스템은 적어도 1종 유형의 세포를 유지하도록 구성되는 세포 배양 장치; 세포 배양 장치로 제1 유체를 공급 및 수용하도록 구성되는 신규 배지 장치; 신규 배지 장치로부터 제2 유체를 공급 및 수용하도록 구성되는 폐기물 제거 장치; 제1 유체를 순환시키도록 구성되는, 세포 배양 장치와 신규 배지 장치 사이에 연결되는 제1 펌프; 제2 유체를 순환시키도록 구성되는, 신규 배지 방치와 폐기물 제거 장치 사이에 연결되는 제2 펌프를 포함하며, 여기서 세포 배양 장치, 신규 배지 장치 및 폐기물 제거 장치는 교차 오염을 방지하기 위하여 서로 분리된다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에 따라, 본 발명의 세포 배양 시스템을 사용한 세포 배양물의 성장 방법은 적어도 1종 유형의 세포를 세포 배양 장치에 위치시키는 단계; 세포 배양 장치와 신규 배지 장치 사이에 제1 유체를 순환시키는 단계; 신규 배지 장치와 폐기물 제거 장치 사이에 제2 유체를 순환시키는 단계; 신규 배지 장치에서 제1 유체로부터 제2 유체로 폐기물을 추출하는 단계; 및 신규 배지 장치에서 제2 유체로부터 제1 유체로 영양소를 보충하는 단계를 포함한다.
본원에서 개시되는 실시양태들은 상기 과제들에 대한 해결책을 제공하는, 인간 소비용 시험관내 고기 제조 및/또는 조직 조작/조직 구성/재생 의학 적용분야를 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.
첨부 도면과 연계되어 고려되었을 때의 상세한 설명을 참조하면 본 개시내용이 더 잘 이해될 수 있다. 도면의 구성요소들이 반드시 축적에 맞는 것은 아니며, 대신 본 개시내용의 원리를 예시하기 위하여 강조가 이루어진다.
도 1은 본 개시내용의 일 실시양태에 따른, 시험관내 세포 배양에 의한 고기 제조 방법의 흐름도이다.
도 2는 본 개시내용의 일 실시양태에 따른, 단백질 발현 전사-후 강화 방법의 개략적 표시이다.
도 3은 본 개시내용의 일 실시양태에 따른, 콜라겐 유형 1 알파 1 (COL1A1) 발현 전사-후 강화 방법의 개략적 표시이다.
도 4는 본 개시내용의 일 실시양태에 따른, 콜라겐 유형 1 알파 2 (COL1A2) 발현 전사-후 강화 방법의 개략적 표시이다.
도 5는 본 개시내용의 일 실시양태에 따른, 고체 상 지지체를 포함하는 시험관내 고기 제조에 사용되는 생물반응기의 개략적 단면도 또는 개념 단면도이다.
도 6은 본 개시내용의 일 실시양태에 따른, 도 5와 유사하나 제2 고체 상을 포함하는 생물반응기의 개략적 단면도 또는 개념 단면도이다.
도 7은 본 개시내용의 일 실시양태에 따른 세포 배양 시스템의 개략도이다.
도 8은 본 개시내용의 일 실시양태에 따른 신규 배지 장치의 개략도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시양태에 따른 폐기물 제거 장치의 개략도이다.
도 10a는 0일차의 콜라겐-기재 스캐폴드에서 배양된 HEK293 세포의 명시야 이미지 및 생존/사멸 염색 이미지를 나타낸다. 도 10b는 4일차의 콜라겐-기재 스캐폴드에서 배양된 HEK293 세포의 명시야 이미지 및 생존/사멸 염색 이미지를 나타낸다. 도 10c는 11일차의 콜라겐-기재 스캐폴드에서 배양된 HEK293 세포의 명시야 이미지 및 생존/사멸 염색 이미지를 나타낸다.
도 11은 도 7 세포 배양 시스템에서의 배양 11일 후 생성된 추출된 세포 물질의 이미지를 나타내는데, 상기 세포 물질은 트립신 처리 및 원심분리에 의해 콜라겐-기재 스캐폴드로부터 추출된 것이었다. 세포 배양 시스템에서 성장된 세포는 성장하여 대조군의 것에 비해 훨씬 더 큰 부피의 미세조직을 형성하였다. 세포 배양 시스템에서는 미세조직의 덩어리가 관찰되었으나, 대조군에서는 그렇지 않았다. 생물반응기, 작동 세포 배양 시스템 프로토타입에서 배양된 세포. 대조군, 6-웰 플레이트에서 배양된 세포.
도 12는 세포 배양 시스템 및 6-웰 플레이트에서의 세포 배양 11일에 걸친 배양 배지 중 글루코스 농도의 변화 그래프이다.
지금부터 도면, 특히 도 1을 참조하여 시험관내 고기 제조 방법 (10)을 나타낸다. 본원에서 사용될 때, "시험관내 고기 제조"는 동물 및/또는 식물 유래의 조직이 고기 및 고기 생성물을 제조하기 위한 세포 배양 기술을 사용하여 실험실에서 성장되는 세포-기재 고기 제조 과정 또는 세포-기재 축산 과정을 지칭한다. 블록 (12)에서는, 동물 또는 식물 유래의 조직이 단리된다. 일 실시양태에서, 상기 조직은 그루퍼(grouper), 농어 또는 옐로 코커(yellow cocker)와 같은 염수 어류를 포함한 오스테이크타이에스(Osteichthyes) 강의 경골 어류로부터 유래한다. 다른 실시양태에서는, 소 조직과 같은 다른 유형의 동물 조직이 단리될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 블록 (12)는 어류로부터의 부레와 같은 기관 조직을 수집하는 것, 및 세포 현탁액을 제조하는 것을 포함할 수 있다. 하기 상세한 설명이 주로 어류 공급원으로부터 유래하는 조직에 대해 기술하기는 하지만, 다른 유형의 시험관내 고기 및/또는 동물 단백질 생성물, 그리고 채식주의 고기 및/또는 단백질 생성물을 제공하기 위하여 다른 유형의 동물 공급원 및/또는 식물 공급원으로부터 유래하는 조직에도 상기 개념이 적용될 수 있다는 것은 이해될 것이다.
많은 단리되는 세포는 성체 세포로서, 의학 연구에서 확립된 다양한 방법들을 사용하여 연속 증식하도록 구성될 수 있다 (블록 (14)). 예를 들면, 야마나카 인자(Yamanaka factor)와 같은 특정 유전자가 성체 세포를 유도 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell) (iPSC)와 같은 줄기 세포로 재프로그래밍하는 데에 사용될 수 있다. 대안적으로, 단리된 성체 세포는 텔로메라제 리버스 트랜스크립타제 과발현에 의해 연속 세포주로 형질전환될 수 있다. 다른 실시양태에서는, 성체 줄기 세포 및 배아 줄기 세포와 같은 다른 유형의 세포들이 단리될 수 있다. 이러한 점에서, 본 개시내용의 방법이 모든 세포주 공급원을 포함한다는 것이 이해될 것이다.
다음의 블록 (16)에서는, 생물반응기와 같은 멸균 챔버 또는 용기 내의 식품-등급 생체적합성 스캐폴드에 부착시키는 것/유착시키는 것에 의해, 세포가 어류 기관과 같은 동물 기관을 모방한 고체 또는 반-고체 구조로 성장된다. 상기 멸균 챔버 또는 용기는 온도가 조절될 수 있으며, 화학물질, 영양소 및 세포와 같은 물질을 도입하고 제거하기 위한 유입구 및 유출구를 가질 수 있다. 상기 식품-등급 생체적합성 스캐폴드는 최종 식용 생성물의 일부가 되며, 비제한적으로 아가로스, 알기네이트, 키토산, 균사체 및 곤약 글루코만난과 같은 식물-기재 또는 진균-기재 재료로 구성된다. 알기네이트는 갈조류로부터 자연적으로 유래하는 생체중합체로서, 생체적합성이다. 또한, 진균 유래의 식물-기재 키토산은 항세균 특성을 가지고 있다. 일부 실시양태에서, 블록 (16)은 멸균 용기에서 항생제 또는 항미생물 화합물의 부재하에 수행된다. 블록 (18)은 세포 생존 및 성장을 지원하기 위하여 생물반응기에 배양 배지를 공급하는 것을 포함한다. 배양 배지는 비제한적으로 무기 염 (예컨대 칼슘 클로라이드 (CaCl2), 칼륨 클로라이드 (KCl), 소듐 클로라이드 (NaCl), 소듐 비카르보네이트 (NaHCO3), 소듐 2수소 포스페이트 (NaH2PO4), 마그네슘 술페이트 (MgSO4) 등), 아미노산, 비타민 (예컨대 티아민, 리보플라빈, 엽산 등), 그리고 기타 성분들 예컨대 글루코스, β-메르캅토에탄올, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 및 소듐 피루베이트와 같은 성분들을 함유하는 완충된 용액일 수 있다. 성장 배지의 비-제한적인 예로는 레이보비츠(Leibovitz's) L-15 배지, 이글 최소 필수 배지 (MEM), 배지 199, 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 햄(Ham's) F12 영양소 혼합물, 햄 F10 영양소 혼합물, 맥코이(MacCoy's) 5A 배지, 글래스고우 변형 이글 배지 (GMEM), 이스코브(Iscove's) 변형 둘베코 배지, 및 RPMI 1640이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
블록 (20)에 따르면, 세포 성장 및 증식을 지원하기 위하여 식품-등급 성장 인자 및 시토카인이 생물반응기의 배양 배지로 도입된다. 성장 인자 및 시토카인에는 인슐린 성장 인자 1 (IGF-1), 인슐린, 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 6 수용체 (IL-6R), 인터류킨 11 (IL-11), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 표피 성장 인자 (EGF) 및 트랜스페린이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 블록 (20)은 소 태아 혈청 (FBS)의 부재하에 생물조작된 세포를 단리된 세포와 공동-배양하는 것을 포함할 수 있다. 상기 생물조작된 세포는 상기 성장 인자 및 시토카인들을 분비하고 성장 및 증식에 필요할 때 단리된 세포에 이들 생체분자를 공급하도록 조작되어 있다.
본원에서 사용될 때, "생물조작된" 세포가 유전자-변형된 세포와 동의어는 아니다. 생물조작된 세포는 1종 이상의 특정 단백질을 과발현하는 특정 유전자를 가지고 있다. 상기 생물조작된 세포는 어류 세포, 또는 다른 유형의 동물 세포 예컨대 소 세포일 수 있다. 생물조작된 세포는 최종 고기 생성물에는 존재하지 않는다. 비-제한적인 예로서, 생물조작된 어류 세포가 단리된 어류 세포와 공동-배양될 수 있거나, 또는 생물조작된 소 세포가 단리된 소 세포와 공동-배양될 수 있다. 본 개시내용의 공동-배양 방법은 배양 배지에서의 동물-유래 소 태아 혈청 (FBS)에 대한 필요성을 차단한다. 또한, 상기 공동-배양 방법은 제자리에서의 성장하는 단리된 세포에 대한 식품-등급 특정 성장 인자 및 시토카인의 연속 공급을 제공하며, 제조 과정의 비용을 단순화하고 감소시킨다. 그러나, 다른 실시양태에서는, 블록 (16) 동안의 세포 성장을 지원하기 위하여 FBS 또는 다른 혈청이 성장 인자, 시토카인 및 기타 영양소들을 공급하는 데에 사용될 수 있다.
더하여, 블록 (22)에 따르면, 생성되는 고기 생성물에서의 바이오매스 수율을 증가시키기 위하여, 세포에서의 단백질 발현이 증가된다. 본원에서 사용될 때, "바이오매스 수율"은 소비시 에너지 생성에 가용한 최종 고기 생성물 중 소화가능한 재료 (예컨대 단백질)의 양을 지칭한다. 더 구체적으로, 블록 (22)는 배양 전에 수행되는 세포의 조작을 사용하여 세포에서의 마이크로 RNA 수준을 변경하는 것에 의해 단백질 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 마이크로 RNA는 전사-후 유전자 발현을 조절하는 것과 연관되어 있는 내인성의 짧은 비-코딩 단일-가닥 RNA 서열이다. 블록 (22)는 전령 RNA (mRNA) 번역을 촉진하는 것에 의해 단백질 발현을 증가시키는 상향-조절 마이크로 RNA의 양을 증가시키는 것, 및/또는 mRNA 번역을 억제하는 것에 의해 단백질 발현을 감소시키는 하향-조절 마이크로 RNA의 양을 감소시키는 것을 포함한다. 마이크로 RNA 수준은 마이크로 RNA, 마이크로 RNA 모방체 또는 마이크로 RNA 억제제를 세포에 도입하는 것에 의해 증가되거나 감소될 수 있다. 마이크로 RNA 모방체는 마이크로 RNA와 동일한 기능을 가지고 있으나, 단백질 발현을 조절하는 데에 있어서 더 안정하고 효율적일 수 있다. 일부 실시양태에서는, 특정 마이크로 RNA를 발현하도록 하는 명령을 보유하는 에피솜 벡터를 세포에 도입하는 데에 전기천공이 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 그와의 조합으로서, 아데노-연관 바이러스가 특정 마이크로 RNA를 발현하도록 하는 에피솜 명령을 보유하는 비히클로 사용될 수도 있다. 표적으로 하는 하향-조절 마이크로 RNA의 양을 감소시키는 것은 표적으로 하는 마이크로 RNA의 억제제를 형질감염에 의해 세포에 도입하는 것에 의해 달성될 수 있다. 여기에서 주목할 것은 본 개시내용에 따른 단백질 발현/바이오매스 수율의 증가 방법이 세포의 게놈을 변형시키지 않으면서 수행된다는 것이다.
도 2를 참조하면, 세포주에서의 단백질 발현의 전사-후 강화를 위한 방법이 개략적으로 도시되어 있다. 선택되는 단백질의 mRNA 번역 및 단백질 생성을 증가시키기 위하여, 1종 이상의 상향-조절 마이크로 RNA (miRNA)가 증가될 수 있다. 대안적으로 또는 그와의 조합으로는, 선택되는 단백질의 mRNA 번역 및 단백질 생성을 증가시키기 위하여, 1종 이상의 하향-조절 miRNA가 억제제 (항-miRNA)를 사용하여 차단될 수 있다.
어류의 부레는 주로 섬유모세포 및 콜라겐 단백질을 포함한다. 콜라겐 유형 1 (콜라겐 I)은 어류 부레의 지배적인 단백질로서, 배양되는 어류 부레 세포에서의 콜라겐 I의 발현 증가는 바이오매스 수율을 증가시킬 수 있다. 어류 부레 세포의 콜라겐 I은 콜라겐 유형 1 알파 1 (COL1A1) 및 콜라겐 유형 1 알파 2 (COL1A2)를 포함한다. COL1A1 및 COL1A2 발현은 miR-21의 수준 증가가 어류 부레 세포에서의 COL1A1 및 COL1A2 생성을 증가시키도록 하는 상향-조절 마이크로RNA21 (miR-21)에 의해 증가된다. 또한, COL1A1 및 COL1A2 발현은 miR-29a의 수준 감소 또는 miR-29a 작용의 차단이 어류 부레 세포에서의 COL1A1 및 COL1A2 생성을 증가시키도록 하는 하향-조절 마이크로RNA 29a (miR-29a)에 의해 감소된다. 도 3-4는 miR-21 수준을 증가시키는 것 및 억제제 (항-miR 29a)를 사용하여 miR-29a의 작용을 차단하는 것에 의해 COL1A1 (도 3) 및 COL1A2 (도 4) 생성을 증가시키는 것을 나타낸다. 증가된 COL1A1 및 COL1A2 생성은 최종 고기 생성물에서의 증가된 바이오매스 수율로 이어진다. 유사한 전략이 다른 유형의 동물 세포에서 관련 단백질 수준을 증가시키는 데에 적용될 수 있다.
도 5를 참조하면, 단리된 세포를 배양하는 데에 사용되는 예시적인 생물반응기 (30)이 나타나 있다. 세포는 생물반응기 (30)의 멸균 챔버 (36) 내에서 유지되는 식품-등급 스캐폴드 (34)에 의해 제공되는 고체 상 지지체 (32)에 부착되어 거기에서 성장한다. 스캐폴드 (34)는 고기 생성물의 형상을 좌우할 수 있다. 식품-등급 스캐폴드 (34)는 비제한적으로 아가로스, 알기네이트, 키토산, 균사체 및 곤약 글루코만난과 같은 식물-기재 또는 진균-기재 재료로 구성된다. 고체 상 지지체 (32)는 다공성일 수 있으며, 그에 따라 세포는 지지체 (32)의 내부 표면에 부착되어 거기에서 성장할 수 있다. 세포에 영양소를 공급하는 배양 배지는 유입구 (38)을 통하여 생물반응기 (30)으로 도입되며, 유출구 (40)을 통하여 생물반응기 (30)으로부터 방출된다.
도 6은 도 5의 생물반응기 (30)과 유사하나 미세 메시 (54)에 의해 고체 상 지지체 (32)로부터 분리된 제2 고체 상 (52)를 추가적으로 포함하는 생물반응기 (50)을 나타낸다. 상기 제2 고체 상 (52)는 제자리에서 고체 상 지지체 (32)에 세포 성장을 위한 영양소, 성장 인자 및 시토카인을 분비하는 생물조작된 세포를 함유하거나 지지할 수 있으며, 고체 상 지지체 (32)상의 세포로부터 생물조작된 세포를 물리적으로 분리할 수 있다. 제2 고체 상 (52)는 고체 상 지지체 (32)와 유사한 식물-기재 재료로 구성된다. 메시 (54)는 영양소, 성장 인자 및 시토카인에 대해서는 투과성이나, 세포에 대해서는 비투과성이다. 도 6의 생물반응기 (50)은 성장하는 세포와의 생물조작된 세포의 공동-배양을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서는, 도 5 및 6의 생물반응기 (30) 및 (50)이 일렬로 배열될 수 있다. 다른 실시양태에서는, 과정의 규모 증대를 위하여 몇 개의 생물반응기 (30), 몇 개의 생물반응기 (50) 또는 생물반응기 (30)과 (50)의 혼합체가 직렬로 배열될 수 있다. 생물반응기 (30)은 주로 바이오매스 생성에 사용될 수 있는 반면, 생물반응기 (50)은 성장하는 세포에 영양소, 성장 인자 및 시토카인을 제공하는 데에 사용될 수 있다.
도 7을 참조하면, 예시적인 세포 배양 시스템 (100)은 세포 배양 장치 (102), 신규 배지 장치 (104) 및 폐기물 제거 장치 (106)을 포함한다. 상기 세포 배양 장치 (102)는 펌프 (108a)를 통하면 세포 배양 장치 (102)로부터 신규 배지 장치 (104)로 제1 유체가 유동할 수 있고 펌프 (108b)를 통하면 신규 배지 장치 (104)로부터 세포 배양 장치 (102)로 제1 유체가 유동할 수 있도록 펌프 (108a) 및 (108b)를 통하여 신규 배지 장치 (104)에 연결된다. 이에 의해, 제1 유체는 세포 배양 장치 (102)와 신규 배지 장치 (104) 사이를 순환한다.
신규 배지 장치 (104)는 추가적으로 펌프 (108c)를 통하면 신규 배지 장치 (104)로부터 폐기물 제거 장치 (106)으로 제2 유체가 유동할 수 있고 펌프 (108d)를 통하면 폐기물 제거 장치 (106)으로부터 신규 배지 장치 (104)로 제2 유체가 유동할 수 있도록 펌프 (108c) 및 (108d)를 통하여 폐기물 제거 장치 (106)에 연결된다. 이에 의해, 제2 유체는 신규 배지 장치 (104)와 폐기물 제거 장치 (106) 사이를 순환한다. 상기 제1 유체는 FBS, 성장 인자 또는 시토카인이 보충된 기본 배지를 포함할 수 있는 세포 배양 배지일 수 있다. 성장 인자 또는 시토카인에는 인슐린 성장 인자 1 (IGF-1), 인슐린, 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 6 수용체 (IL-6R), 인터류킨 11 (IL-11), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 표피 성장 인자 (EGF) 및 트랜스페린이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제2 유체는 비제한적으로 무기 염 (예컨대 칼슘 클로라이드 (CaCl2), 칼륨 클로라이드 (KCl), 소듐 클로라이드 (NaCl), 소듐 비카르보네이트 (NaHCO3), 소듐 2수소 포스페이트 (NaH2PO4), 마그네슘 술페이트 (MgSO4) 등), 아미노산, 비타민 (예컨대 티아민, 리보플라빈, 엽산 등), 그리고 기타 성분들 예컨대 글루코스, 베타-메르캅토에탄올, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 및 소듐 피루베이트와 같은 성분들을 함유하는 완충된 용액을 포함할 수 있는 신규 기본 배지일 수 있다. 성장 배지의 비-제한적인 예로는 레이보비츠 L-15 배지, 이글 최소 필수 배지 (MEM), 배지 199, 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 햄 F12 영양소 혼합물, 햄 F10 영양소 혼합물, 맥코이 5A 배지, 글래스고우 변형 이글 배지 (GMEM), 이스코브 변형 둘베코 배지, 및 RPMI 1640이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
펌프들 (108)은 연동 펌프 또는 임의의 다른 유사한 적합한 펌프일 수 있다.
세포 배양 시스템 (100)은 1종 이상의 용기를 포함한다. 각 세포 배양 장치 (102), 신규 배지 장치 (104) 및 폐기물 제거 장치 (106)이 용기일 수도 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 시스템 (100)은 1개를 초과하는 세포 배양 장치 (102), 신규 배지 장치 (104) 및 폐기물 제거 장치 (106)을 포함할 수 있다. 다수의 세포 배양 장치 (102)가 병렬 또는 직렬로 연결되어 서로 근접 배치될 수 있다. 다수의 신규 배지 장치 (104)가 병렬 또는 직렬로 연결되어 서로 근접 배치될 수 있다. 다수의 폐기물 제거 장치 (106)이 병렬 또는 직렬로 연결되어 서로 근접 배치될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 세포 배양 시스템 (100)은 추가적으로 세포 배양 장치 (102)의 세포에 기체를 공급하도록 구성되는 기체 공급원을 포함할 수 있다. 상기 기체 공급원은 산소 또는 이산화 탄소일 수 있다.
세포 배양 장치 (102)는 세포가 고체 또는 반고체 구조로 성장할 수 있게 스캐폴드 및 배양 배지를 유지하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 세포는 식품-등급 생체적합성 스캐폴드를 세포 배양 장치 (102)의 내부에 부착/유착시키는 것에 의해, 어류 기관과 같은 동물 기관을 모방한 고체 또는 반-고체 구조로 성장된다. 세포 배양 장치 (102)는 적어도 1종 유형의 세포를 함유하도록 구성될 수 있다. 적합한 유형의 세포에는 골, 연골, 근육, 간, 피부, 심장, 폐 및 이들의 임의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 유형의 포유동물 세포 또는 어류 세포가 본 발명의 범위 내에서 사용될 수도 있다. 기타 식물 및 동물 종들 유래의 세포가 사용될 수 있다. 기타 개시자 세포로는 중간엽 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포 및 위성 세포와 같은 다양한 기원의 줄기 세포들이 있을 수 있다. 개시자 세포는 유전자 변형된 세포 또는 임의의 세포주일 수도 있다. 생물조작된 세포 역시 사용될 수 있다.
세포 배양 장치 (102)에서 증식될 여러 유형의 특수 세포들은 살아있는 동물 유래의 생검물에 의해 수득될 수 있다.
세포 배양 장치 (102)는 또한 펌프 (108b)를 통하여 신규 배지 장치 (104)로부터 제1 유체를 수용하도록 구성되는 유입구 및 펌프 (108a)를 통하여 신규 배지 장치 (104)로 제1 유체를 제거/방출하도록 구성되는 유출구를 포함할 수 있다. 세포 배양 장치 (102)는 또한 미리 결정된 온도로 세포 배양 장치 (102)의 내부를 가열하도록 구성되는 가열 장치 및 그와 같은 미리 결정된 온도로 세포 배양 장치 (102) 내의 온도를 유지하기 위한 온도 조절 장치를 포함할 수 있다. 상기 미리 결정된 온도는 대략적으로 25 ℃ 내지 45 ℃ 범위일 수 있다.
세포 배양물은 추가적으로 미리 결정된 속도로 세포 배양 장치 (102) 내의 제1 유체를 교반하도록 구성되는 적어도 1개의 교반기를 포함할 수 있다. 상기 예정은 대략적으로 분 당 10 회전 (rpm) 내지 300 rpm일 수 있다.
세포 배양 장치 (102)는 추가적으로 산소 또는 이산화 탄소일 수 있는 기체 공급원에 연결되는 기체 유출구 및 기체 유입구를 포함할 수 있다. 산소 또는 이산화 탄소는 세포 배양 조건을 최적화하기 위하여 기체 유입구를 통해 세포 배양 장치 (102)로 공급될 수 있다. 기체 유출구를 통해서는 폐기 기체가 방출될 수 있다. 기체의 유동은 밸브에 의해 조절될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 배양 장치 (102)는 도 5에 나타낸 바와 같은 생물반응기 (30)일 수 있다. 다른 일부 실시양태에서, 세포 배양 장치 (102)는 도 6에 나타낸 바와 같은 생물반응기 (50)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 장치 (102)는 용기이다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 장치 (102)는 임의 크기의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 장치 (102)의 부피는 0.1 L - 2000 L의 범위일 수 있다.
도 8을 참조하면, 신규 배지 장치 (104)는 각각 펌프 (108a) 및 펌프 (108b)에 연결되도록 구성되는 제1 유체 배지 유입구 (110) 및 제1 유체 유출구 (112)를 포함할 수 있다. 또한, 신규 배지 장치 (104)는 추가적으로 각각 펌프 (108d) 및 펌프 (108c)에 연결되도록 구성되는 제2 유체 유입구 (114) 및 제2 유체 유출구 (116)을 포함할 수 있다. 또한, 신규 배지 장치 (104)는 제1 투석 멤브레인 (123)에 의해 분리된 제1 유체 구획 (120) 및 제2 유체 구획 (122)를 갖는 적어도 1개의 제1 투석 장치 (118)를 포함할 수 있다. 상기 제1 유체 유입구 (110) 및 제1 유체 유출구 (112)는 상기 제1 유체 구획 (120)에 연결된다. 상기 제2 유체 유입구 (114) 및 제2 유체 유출구 (116)은 상기 제2 유체 구획 (122)에 연결된다. 셀룰로스 에스테르 (CE), 재생 셀룰로스 (RC) 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF)를 포함한 여러 유형의 투석 멤브레인 (123)이 사용될 수 있다. 바람직한 제1 유체 중 거대분자 (예컨대 배양 용기 중 세포에 의해 분비되는 성장 인자)를 잔류시키고 폐기물이 제1 투석 장치 (118)의 제1 유체로부터 제거되는 것을 가능하게 하기 위하여, 여러 분자량 컷-오프 (MWCO)의 투석 멤브레인 (123)이 사용될 수 있다. 예를 들면, 제1 유체 중 인슐린-유사 성장 인자 (IGF, 재조합체 형태의 경우 7.5 kDa) 및 전환 성장 인자-베타 (TGF 베타, 전구 TGF-베타의 경우 44 kDa)를 잔류시키고 락테이트 (89 Da) 및 암모니아 (17 Da)가 제1 유체로부터 제거되는 것을 가능하게 하기 위하여, 100 Da - 1,000,000 Da MWCO 멤브레인, 바람직하게는 500 Da MWCO 멤브레인이 사용될 수 있다. 이와 같은 멤브레인은 글루코스 (180 Da)와 같은 제2 유체 중 영양소가 보충을 위해 멤브레인을 횡단하여 제1 유체로 진입하는 것을 가능하게 하는 데에도 사용될 수 있다.
신규 배지 장치 (104)는 미리 결정된 속도로 투석 장치 내의 유체를 교반하도록 구성되는 적어도 1개의 교반기를 어느 하나 또는 두 구획에 포함할 수 있다. 상기 예정은 대략 10 rpm 내지 500 rpm일 수 있다.
신규 배지 장치 (104)는 추가적으로 어느 하나 또는 두 구획에 원하는 유체를 첨가하고, 보충하고, 제거하기 위하여 연결되는 별도의 유입구 및 유출구를 포함할 수 있다. 상기 원하는 유체는 세포 배양 배지, 신규 기본 배지 및/또는 분화 배지일 수 있다.
도 9를 참조하면, 폐기물 제거 장치 (106)은 각각 펌프 (108c) 및 펌프 (108d)에 연결되도록 구성되는 폐기물 유입구 (124) 및 재충전 유출구 (126)을 포함할 수 있다. 또한, 폐기물 제거 장치 (106)은 추가적으로 폐기물 제거 유입구 (128) 및 폐기물 제거 유출구 (130)을 포함할 수 있다. 또한, 폐기물 제거 장치 (106)은 제2 투석 멤브레인 (137)에 의해 분리된 폐기물 구획 (134) 및 폐기물 제거 구획 (136)을 포함하는 적어도 1개의 제2 투석 장치 (132)를 포함할 수 있다. 상기 폐기물 유입구 (124) 및 신규 배지 유출구 (116)은 상기 폐기물 구획 (134)에 연결된다. 상기 폐기물 제거 유입구 (128) 및 폐기물 유출구 (130)은 상기 폐기물 제거 구획 (136)에 연결된다. 폐기물 제거 장치 (106)은 제2 유체로부터 폐기물을 제거하기 위하여 다른 폐기물 제거 기술을 사용할 수 있다. 예를 들면, 폐기물 제거는 제2 유체를 흡착제로서의 제올라이트로 통과시키는 것에 의해 수행될 수 있다. 제올라이트는 미세다공성의 알루미노실리케이트 광물이다. 예로는 방비석, 능비석, 클리놉틸로라이트, 휘불석, 소다비석, 필립사이트 및 스틸바이트가 있다. 폐기물 제거 장치 (106)은 충진-상 제올라이트의 컬럼을 포함할 수 있다. 제2 유체는 일 단부로부터 폐기물 제거 장치 (106)으로 유동하여, 제올라이트를 통과한 후, 또 다른 단부에서 폐기물 제거 장치 (106)으로부터 유출된다. 제올라이트는 독성 화학물질, 또는 제2 유체 중 세포 성장을 억제하는 화학물질, 예컨대 암모니아 및 락테이트를 흡수한다.
폐기물 제거 장치 (106)은 제2 유체 중 암모니아 및 락테이트와 같은 대사 폐기물을 제거하고 폐기물 배지 중 최대량의 영양소 예컨대 글루코스의 잔류를 가능하게 하도록 구성된다. 글루코스는 제2 유체 중에 잔류하면서 암모니아 및 락테이트는 투석액으로 진입하는 것을 가능하게 하기 위하여, 100 Da - 1,000,000 Da MWCO, 바람직하게는 100 Da MWCO의 투석 멤브레인이 사용될 수 있다. 폐기물 제거 구획 (136)에 진입하는 투석액은 포스페이트-완충된 식염수 (PBS) 또는 임의의 다른 가능한 완충제일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 배양 장치 (102), 신규 배지 장치 (104) 및 폐기물 제거 장치 (106) 각각은 제거가능한 플러그-인(plug-in) 모듈일 수 있다. 전기한 장치들의 각 유입구 및 유출구는 세포 배양 시스템 (100)의 펌프들의 유입구 및 유출구와 연결되고/거나 연결해제될 수 있다. 예를 들면, 신규 배지 장치 (104) 또는 폐기물 제거 장치 (106)은 시스템으로부터 그것을 언플러깅하고 세포 배양 시스템 (100)에 새로운 장치를 플러깅하는 것에 의해 빠르게 대체될 수 있다. 장치 중 1개가 오동작하는 경우, 본 실시양태는 가동휴지시간을 감소시킬 수 있다. 또한, 각 장치가 세포 배양 시스템 (100)으로부터 언플러깅됨으로써, 개별적인 용도로 그 자체를 가동할 수 있다.
지금부터는, 세포 배양물을 성장시키기 위하여 세포 배양 시스템 (100)을 이용하는 방법을 참조한다. 본원에서 기술되는 방법은 배양된 고기를 제조하기 위하여 피부, 근육, 지방 및 골 세포와 같은 세포들을 배양하는 데에 사용될 수 있다. 상기 방법은 세포 배양 시스템 (100)을 제공하는 것, 대사 폐기물 또는 성장 억제인자를 포함하는 배양된 배지를 신규 배지 장치 (104)의 제1 투석 장치 (118)로 전달하는 것, 신규 배지 장치 (104)의 제1 투석 장치 (118)에서 영양소를 보충하고 성장 억제인자를 제거하는 것, 대사 폐기물 또는 성장 억제인자를 포함하는 기본 배지를 신규 배지 장치 (104)의 제1 투석 장치 (118)로부터 폐기물 제거 장치 (106)으로 전달하는 것, 및 폐기물 제거 장치 (106)에서 성장 억제인자를 제거하는 것을 포함한다.
적어도 1종 유형의 세포가 세포 배양 장치 (102)에 첨가된다. 적합한 유형의 세포로는 골, 연골, 근육, 간, 피부, 심장, 폐 및 이들의 임의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 유형의 포유동물 세포 또는 어류 세포가 본 발명의 범위 내에서 사용될 수도 있다. 기타 식물 및 동물 종들 유래의 세포가 사용될 수 있다.
배양 용기에서 증식될 여러 유형의 특수 세포들은 살아있는 동물 유래의 생검물에 의해 수득될 수 있다. 기타 개시자 세포로는 중간엽 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포 및 위성 세포와 같은 다양한 기원의 줄기 세포들이 있을 수 있다. 개시자 세포는 유전자 변형된 세포 또는 임의의 세포주일 수도 있다.
세포는 식품-등급 생체적합성 스캐폴드를 세포 배양 장치 (102)와 같은 멸균 챔버 또는 용기에 부착/유착시키는 것에 의해, 어류 기관과 같은 동물 기관을 모방한 고체 또는 반-고체 구조로 성장된다. 세포 배양 장치 (102)의 온도는 조절되며, 배양 배지는 그의 유입구에서 세포 배양 장치 (102)로 도입되고, 화학물질, 영양소 및 세포와 같은 물질을 제거하기 위하여 세포 배양 장치 (102) 유출구로부터 방출된다. 식품-등급 생체적합성 스캐폴드는 최종 식용 생성물의 일부가 된다.
세포 성장 및 증식을 지원하기 위하여, 소 태아 혈청 (FBS) 보충물 또는 재조합 공급원 유래의 성장 인자 및 시토카인이 생물반응기의 배양 배지에 도입된다. 성장 인자 및 시토카인에는 인슐린 성장 인자 1 (IGF-1), 인슐린, 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 6 수용체 (IL-6R), 인터류킨 11 (IL-11), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 표피 성장 인자 (EGF) 및 트랜스페린이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원은 FBS의 부재하에 생물조작된 세포를 세포 배양 장치 (102) 중 배양 세포와 공동-배양하는 것을 포함할 수 있다. 상기 생물조작된 세포는 상기 성장 인자 및 시토카인들을 분비하고, 성장 및 증식에 필요할 때 배양 세포에 이들 생체분자를 공급하도록 조작되어 있다. 본 개시내용의 공동-배양 방법은 배양 배지에서의 동물-유래 소 태아 혈청 (FBS)에 대한 필요성을 차단한다. 또한, 상기 공동-배양 방법은 제자리에서의 성장하는 단리된 세포에 대한 식품-등급 특정 성장 인자 및 시토카인의 연속 공급을 제공하며, 제조 과정의 비용을 단순화하고 감소시킨다. 그러나, 다른 실시양태에서는, 세포 성장을 지원하기 위하여 FBS, 다른 혈청, 또는 재조합 공급원 유래의 단백질이 성장 인자, 시토카인 및 기타 영양소들을 공급하는 데에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서는, 세포 배양 조건을 최적화하기 위하여, 기체가 도입될 수 있다. 산소 및 이산화 탄소가 사용될 수 있다. 세포 배양 장치 (102)는 0-10 %의 이산화 탄소를 함유할 수 있다. 세포 배양 장치 (102)는 15-30 %의 산소를 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서는, 세포 배양 조건을 최적화하기 위하여, 온도가 조절될 수 있다. 서로 다른 유형의 세포는 서로 다른 최적 배양 온도를 가질 수 있다. 상기 온도는 25-45 ℃의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 배양 장치 (102) 중 배양 배지는 교반된다. 배양 용기에서의 교반 속도는 세포의 증식을 강화하도록 최적화될 수 있는데, 세포들은 전단 응력에 대하여 서로 다르게 반응하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 교반 속도는 유입 배양 배지와 세포 배양 장치 (102) 내부 배양 배지의 혼합을 강화하도록 최적화될 수도 있다. 교반 속도는 10 rpm - 300 rpm의 범위일 수 있다.
펌프 (108a)는 배양 배지를 세포 배양 장치 (102)로부터 신규 배지 장치 (104)의 제1 투석 장치 (118)로 전달할 수 있다.
제1 투석 장치 (118)에서는, CE, RC 또는 PVDF를 포함한 여러 유형의 투석 멤브레인이 사용될 수 있다. 바람직한 배양 배지 중 거대분자 (예컨대 배양 용기 중 세포에 의해 분비되는 성장 인자)를 잔류시키고 폐기물이 제1 투석 장치 (118)의 배양 배지로부터 제거되는 것을 가능하게 하기 위하여, 여러 분자량 컷-오프 (MWCO)의 투석 멤브레인이 사용될 수 있다. 예를 들면, 배양 배지 중 인슐린-유사 성장 인자 (IGF, 재조합체 형태의 경우 7.5 kDa) 및 전환 성장 인자-베타 (TGF 베타, 전구 TGF-베타의 경우 44 kDa)를 잔류시키고 락테이트 (89 Da) 및 암모니아 (17 Da)가 배양 배지로부터 제거되는 것을 가능하게 하기 위하여, 100 Da - 1,000,000 Da MWCO 멤브레인, 바람직하게는 500 Da MWCO 멤브레인이 사용될 수 있다. 이와 같은 멤브레인은 글루코스 (180 Da)와 같은 신규 기본 배지 중 영양소가 보충을 위해 멤브레인을 횡단하여 배양 배지로 진입하는 것을 가능하게 하는 데에도 사용될 수 있다.
신규 기본 배지는 제2 유체 구획 (122)를 채우는 반면, 배양 배지는 투석을 수행하기 위하여 제1 유체 구획 (120)을 채운다. 예를 들어, 락테이트, 암모니아 및 기타 폐기물들은 제1 투석 멤브레인 (123)을 통하여 배양 배지로부터 신규 기본 배지로 전달되며, 글루코스 및 기타 성장-강화 화합물들은 제1 투석 멤브레인 (123)을 통하여 신규 기본 배지로부터 배양 배지로 전달된다. 투석의 속도는 신규 기본 배지의 부피, 투석 멤브레인 내에 함유되는 배양 배지의 부피, 멤브레인 표면적, 온도, 및 투석 장치에서의 교반에 의한 교반을 변화시키는 것에 의해 조절될 수 있다. 투석 장치에서의 배양 배지의 영양소 보충 및 폐기물 제거의 속도는 세포 배양 장치 (102)로부터 제1 투석 장치 (118) 중 제1 유체 구획 (120)으로의 유체 유입에 있어서 1 ml/분 - 10 L/분 범위인 펌핑 속도를 변화시키는 것에 의해 조절될 수도 있다.
대사 폐기물 또는 성장 억제인자는 배양 배지로부터 제1 투석 장치 (118) 내부의 신규 기본 배지로 이동한다. 성장 억제인자는 시간이 지나면서 신규 기본 배지에 축적된다. 축적된 성장 억제인자 (비제한적으로 락테이트, 암모니아 포함)를 포함하는 기본 배지는 본원에서 폐기물 배지로 지칭된다. 폐기물 배지는 펌프 (108c)에 의해 폐기물 제거 장치 (106)으로 전달될 수 있다. 폐기물 배지 중 암모니아 및 락테이트와 같은 대사 폐기물은 폐기물 제거 장치 (106)의 제2 투석 장치 (132)에서 투석 원리를 사용하여 제거될 수 있다. 폐기물 제거 방법은 폐기물 배지에서의 최대량의 영양소 예컨대 글루코스의 잔류를 가능하게 해야 한다. 글루코스는 폐기물 배지 중에 잔류하면서 암모니아 및 락테이트는 투석액으로 진입하는 것을 가능하게 하기 위하여, 100 Da - 1,000,000 Da MWCO 멤브레인, 바람직하게는 100 Da MWCO 멤브레인인 투석 멤브레인이 사용될 수 있다. 상기 투석액은 포스페이트-완충된 식염수 (PBS) 또는 임의의 다른 가능한 완충제일 수 있다. 투석의 속도는 투석액의 부피, 투석 멤브레인 (137) 내에 함유되는 폐기물 배지의 부피, 멤브레인 표면적, 온도, 및 투석 장치 (132)에서의 교반에 의한 교반을 변화시키는 것에 의해 조절될 수 있다. 교반 속도는 10 rpm - 500 rpm의 범위일 수 있다. 폐기물 제거 장치 (106)에서의 폐기물 제거의 속도는 신규 배지 장치 (104)의 제1 투석 장치 (118)로부터 폐기물 제거 장치 (106)으로의 유체 유입에 있어서의 펌핑 속도를 변화시키는 것에 의해 조절될 수도 있다. 투석에 의해 세척된 폐기물 배지는 다시 신규 배지 장치 (104)의 제1 투석 장치 (118)로 전달될 수 있다. 상기 펌핑 속도는 1 ml/분 - 10 L/분의 범위일 수 있다.
신규 기본 배지 장치 (104) 및 폐기물 배지 장치 (106)으로부터의 배양의 분리는 세포 배양 장치 (102)가 제조 내내 확실하게 폐쇄 유지되는 것을 가능하게 한다. 장치들 중 어느 것에서의 오염은 영향을 받은 장치로 제한되게 되며, 다른 장치에는 영향을 주지 않게 된다.
또한, 해당 폐기물을 제2 유체로부터 추출하는 것에 의해, 폐기물 제거 장치 (106)은 전체 세포 배양 시스템 (100)으로부터의 대사 폐기물을 집중화, 추출 및/또는 수집하는 것을 돕는다. 전체 세포 배양 시스템 (100)의 폐기물은 이후 용이하게 수집 및 방출될 수 있다. 이는 통상적인 세포 배양 기술에 비해 방출되는 폐기물 및 전체적인 세포 배양 전개 비용을 감소시킨다. 배경기술 부문에서 논의된 바와 같이, 통상적인 세포 배양 기술은 영양소 및 폐기물 모두를 함유하는 폐 배양 배지를 폐기하고, 새로운 배양 배지로 그것을 대체한다. 따라서, 통상적인 방법에서 생성되는 폐기물 (즉 폐 배양 배지)의 양/부피는 본 발명에서 생성되는 폐기물의 양/부피에 비해 더 많다.
또한, 신규 배지 장치 (104) 및 폐기물 제거 장치 (106)은 전개 비용을 낮추고 세포 배양물을 성장시키기 위한 배지 사용을 최적화하는 것을 돕는다. 세포 배양 배지는 일반적으로 기본 배지에 비해 더 고가인데, 세포 배양 배지가 고가의 FBS, 성장 인자 또는 시토카인을 함유하기 때문이다. 신규 배지 장치 (104)의 도움으로, 세포 배양 배지는 조기에 폐기될 필요가 없으며, 재충전될 수 있다 (즉 해당 폐기물을 제거하고, 기본 배지로부터 영양소를 수득함).
비제한적으로 피부, 골, 연골, 심장 및 간을 포함한 여러 유형의 세포들은 세포 배양 장치 (102)에서 조작된 조직을 형성하기 위해 적합한 스캐폴드에서 배양될 수 있다. 중간엽 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포 및 위성 세포와 같은 다양한 기원의 줄기 세포들이 조직 조작 적용분야용으로 적합한 스캐폴드에서 배양될 수도 있다. 스캐폴드에서의 줄기 세포의 증식 후 기능상 조작된 조직을 형성시키기 위한 이후의 분화를 위해서는, 제1 투석 장치 (118) 또는 제2 투석 장치 (132)의 기본 배지에 분화 배지 성분들이 첨가될 수 있다. 예를 들면, 덱사메타손, 아스코르브산 및 β-글리세로포스페이트와 같은 골유도 배지 성분들이 스캐폴드에서의 줄기 세포의 골형성 분화를 위하여 기본 배지에 첨가될 수 있다. 100 Da - 1,000,000 Da MWCO, 바람직하게는 500 Da MWCO의 범위일 수 있는 제1 투석 멤브레인 (123)은 골유도 배지의 성분들이 배양 배지로 진입하는 것을 가능하게 하도록 선택되어야 한다.
대안적으로는, 세포 배양 장치 (102)의 2D 배양 표면상에서 줄기 세포가 증식될 수 있다. 줄기 세포는 재생 의학 적용분야를 위한 고-밀도 세포 현탁액을 수득하기 위하여 증식 및 트립신처리될 수 있다. 예를 들면, 인간 중간엽 줄기 세포가 환자로부터 단리된 후, 세포 배양 장치 (102)의 배양 접시상에서 증식될 수 있다. 합류시, 고-밀도 세포 현탁액을 형성시키기 위하여 세포들은 트립신처리될 수 있다. 이후, 세포 현탁액은 치유를 위하여 환자의 손상 부위에 주사된다.
[ 실시예 ]
실시예 1
HEK293 세포의 배양물을 PBS 중에서 세척하고, 트립신처리함으로써, 2.5e6 세포/ml의 세포 밀도를 가지는 세포 현탁액을 형성시켰다. 2.5e6 세포/ml 현탁액으로부터의 세포 현탁액 200 μl를 사전-절단된 정사각형 콜라겐-기재 스캐폴드 (1 cm x 1 cm)상에 적재함으로써, 5e5개 세포의 총 세포 수를 가지는 조직 구성체를 제조하였다. 조직 구성체를 37 ℃ 및 5 % CO2에서 4시간 동안 인큐베이팅하였다. 800 μl의 배지를 각 웰의 측면을 따라 천천히 첨가하였다. 다음에, 조직 구성체를 세포 배양 장치 (102)인 생물반응기 및 대조군 6-웰 배양 플레이트로 옮겼다. 0, 4 및 11일차에, 명시야 현미경에 의해 스캐폴드 내부 세포의 이미지를 포착하였다. 0, 4 및 11일차에, 하기의 프로토콜에 따라 생존/사멸 염색을 수행하였다. 0, 4 및 11일차에, 글루코스의 측정을 위하여, 조직 배양 병, 대조군 및 투석 장치로부터의 배지를 수집하였다.
스캐폴드 중 세포의 생존/사멸 염색
1. 칼세인 AM 및 에티듐 단일이량체-1 (서모피셔(thermofisher) 사의 생존/사멸 키트)을 1:1000으로 DPBS에 첨가함으로써, 염색 시약을 수득하였다.
2. 샘플을 DPBS 중에서 1회 세척하였다.
3. 샘플을 200-250 μl의 염색 시약 중에서 30분 동안 염색하였다.
4. 샘플을 DPBS 중에서 1회 세척하고, 형광 현미경하에서 관찰하였다.
결과
생물반응기에서는 관찰가능한 미세조직이 형성되었으나, 대조군에서는 그렇지 않았다.
도 10a-c는 생물반응기 프로토타입 및 대조군에서의 조직 구성체의 성장 및 세포 생존력을 나타낸다. 생물반응기 행은 작동하는 세포 배양 시스템 프로토타입에서 배양된 세포를 나타낸다. 대조군 행은 6-웰 플레이트에서 배양된 세포를 나타낸다. 0일차에, 세포는 도 10a에 나타낸 바와 같이 세포 응집물로서 스캐폴드에 부착하였다. 4일차에는, 도 10b에 나타낸 바와 같이 생물반응기 중에서 세포 응집물이 더 큰 회전타원체로 성장하였다. 11일차에는, 도 10c에 나타낸 바와 같이 생물반응기에서는 회전타원체들이 서로 뭉쳐 미세조직을 형성한 반면, 대조군의 회전타원체들은 확실한 성장을 나타내지 않는 것으로 보였다. 생존/사멸 염색은 생물반응기 중 미세조직이 생존가능한 회전타원체들을 연결시키는 것에 의해 형성되며, 대조군의 것에 비해 그것이 훨씬 더 크다는 것을 보여주었다.
도 11은 11일차에 형성된 미세조직을 나타낸다. 생물반응기에서는 스캐폴드에서 관찰가능한 미세조직들의 덩어리가 형성되었으며, 대조군에서는 이러한 미세조직이 관찰되지 않았다. 스캐폴드를 분해하기 위한 트립신처리 후, 미세조직을 제거하였는데, 생물반응기 중 미세조직이 대조군에서의 것에 비해 훨씬 더 큰 부피를 가진다는 것이 두드러졌다.
도 12는 생물반응기인 세포 배양 장치 (102)의 배양 용기 중에서 글루코스 수준이 유지되었음을 보여준다.
0일차에, 본 발명 세포 배양 장치 (102) 배양 용기 중 글루코스 농도 = 18.8 mmol/L이었다. 대조군 배양 플레이트 중 글루코스 농도 = 18.7 mmol/L이었다. 제1 투석 장치 (118)에서의 글루코스 농도 = 20.9 mmol/L이었다.
4일차에, 본 발명 세포 배양 장치 (102) 배양 용기 중 글루코스 농도 = 19.1 mmol/L이었다. 대조군 배양 플레이트 중 글루코스 농도 = 4.9 mmol/L이었다. 제1 투석 장치 (118)에서의 글루코스 농도 = 20.0 mmol/L이었다.
11일차에, 본 발명 세포 배양 장치 (102) 배양 용기 중 글루코스 농도 = 10.4 mmol/L이었다. 대조군 배양 플레이트 중 글루코스 농도 = 검출가능하지 않음이었다. 제1 투석 장치 (118)에서의 글루코스 농도 = 12.5 mmol/L이었다.
상기에 나타난 바와 같이, 본 발명은 또한 최적의 세포 생존력 및 세포 성장을 위하여 글루코스와 같은 영양소를 최적 수준으로, 그리고 암모니아 및 락테이트와 같은 성장 억제인자를 낮은 수준으로 유지한다.
또한, 본 발명은 세포에 의해 분비되는 성장 인자를 잔류시키고 배양 배지에서의 동물-유래 혈청의 사용을 감소시키는 것에 의해, 세포 증식 과정을 강화하며, 배양 고기 산업 및 조직 조작의 제조 비용을 감소시킨다. 본 발명은 대-규모 고기 제조에 사용될 수 있다.
본 개시내용의 시험관내 고기 제조 방법은 한 가지 세포 유형의 단순한 조직 구성을 가지는 고기 생성물을 제공한다. 한 가지 세포 유형을 가지는 고기 생성물은 다수의 세포 유형을 가지는 다른 배양된 고기에 비해 제조, 개발 및 상용화하기가 더 용이하다. 본 개시내용의 대안적인 실시양태는 다수의 세포 유형을 가지는 고기 생성물을 제공한다. 또한, 본 출원인은 성장하는 세포에서 마이크로 RNA 수준 또는 활성을 변경하는 것에 의해 바이오매스/단백질 생성을 증가시키는 전략을 발견하였다. 일 예에서는, 어류 부레 세포에서 발견되는 지배적인 단백질 (콜라겐 I)의 수준을 증가시키기 위하여, 2종의 핵심 마이크로 RNA (miR-21 및 miR-29a)를 표적화한다. 본 출원인이 알고 있는 바로는, 배양 고기 생성물에서 단백질/바이오매스 수율 증가를 달성하기 위한 마이크로 RNA 수준 또는 활성의 변경이 배양 고기 개발 분야에서 다른 사람에 의해 사용된 바는 없다. 단백질 생성의 증가를 위하여 마이크로 RNA를 표적화하는 것은 공지의 녹-인(knock-in) 또는 녹-아웃(knock-out) 방법에 비해 세포에 대하여 더 적은 스트레스를 야기할 수 있다. 성장하는 어류 세포에 제자리에서의 세포 성장 및 증식을 위한 식품-등급 성장 인자 및 시토카인을 공급함으로써 배양 배지에서의 동물-유래 FBS에 대한 필요성을 감소시키거나 차단하기 위하여, 생물-조작된 세포가 성장하는 성장하는 동물 세포와 공동-배양된다. 공동-배양 기술은 제조 과정을 단순화하고 제조 비용을 감소시킨다.
또한, 더 건강한 식품 생성물을 생성시키기 위하여, 배양되는 고기 생성물의 영양소가 맞춤화될 수 있다. 예를 들면, 배양되는 고기 생성물은 개인 게놈 시험을 참조한 영양사의 식이 권장사항에 따라 맞춤화될 수 있다. 특정 조건에서 세포를 배양하는 것에 의해, 고기 생성물 중 고-밀도 콜레스테롤, 다중불포화 지방산 및 단일불포화 지방산과 같은 건강한 영양소가 보강될 수 있다. 대안적으로 또는 이와의 조합으로서, 특정 조건에서 세포를 배양하는 것에 의해, 건강에 손상을 주는 것으로 알려져 있는 영양소 예컨대 저-밀도 콜레스테롤 및 포화 지방산이 감소될 수도 있다. 비타민 및 무기질과 같은 미량영양소 역시 강화될 수 있다. 배양되는 고기 생성물의 영양소 맞춤화는 비제한적으로 1) 세포 배양 동안 성장하는 세포에 공급되는 영양소를 설계하는 것, 및/또는 2) 다른 세포와의 층을 이루는 스캐폴드의 비율을 조절하는 것과 같은 다양한 방식으로 달성될 수 있다.
배양된 식품 생성물의 제조는 청정한 멸균의 고도로 조절되는 과정하에 있다. 따라서, 식품 생성물 중 영양소의 세균 또는 진균과 같은 미생물에 의한 바람직하지 않은 분해는 최소화된다. 미생물에 의한 영양소 분해로부터 유래하는 바람직하지 않은 맛 및 냄새 역시 최소화된다. 배양된 식품의 이와 같은 특성은 조리시의 새로운 용도를 가능하게 하며, 신규한 레시피를 창출하는 것을 돕는다. 배양된 식품의 그와 같은 한 가지 적용분야는 어류 부레로부터 유래하는 배양된 피시 모우(fish maw)이다. 통상적인 피시 모우는 제조 과정에서의 세균에 의한 아민의 분해로 인하여 바람직하지 않은 어류의 맛 및 냄새를 가진다. 이와 같은 바람직하지 않은 특성은 상기 식품 성분을 고온 또는 승온으로 제공되는 세이버리(savory) 디시로 제한한다. 세포 배양 기술로부터 생성되는 배양된 피시 모우는 바람직하지 않은 어류의 맛 및 냄새를 가지지 않는다. 고온 및 세이버리 디시 이외에, 배양된 피시 모우는 냉각 온도 또는 주변 온도에서 제공되는 디저트 또는 즉석-섭취 체계로서 스윗 디시(sweet dish)에 사용될 수 있다.
예시적인 프로토콜
A. 어류 부레 세포주의 개발
1. 지역 어시장에서 건강한 옐로 크로커, 농어 또는 유사 범주의 어류를 입수한다.
2. 세포 단리시까지 얼음상에서 어류를 유지한다.
3. 10 % 표백제 중에 어류를 침지시킨다.
4. 무균 조건하에서 어류로부터 부레를 제거한다.
5. 차아염소산 중에서 1회 이상 상기 기관을 세척한다.
6. 항생제 배지 (400 lU/ml의 페니실린, 400 pg/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM) 중에서 1회 이상 기관을 세척한다.
7. 세척 후, 기관을 작은 조각 (2-3 mm3)으로 절단한다.
8. PBS 중 0.25 % 트립신-EDTA를 함유하는 원심분리기 튜브로 절단된 기관을 옮긴다.
9. 1시간 동안 연속 진탕하면서 실온으로 인큐베이팅한다.
10. 100 pm 메시를 사용하여 상청액을 여과함으로써, 분해되지 않은 조직을 제거한다.
11. 5분 동안 200g로 여과액을 원심분리한다.
12. 완전 배지 (200 lU/ml의 페니실린, 200 pg/ml의 스트렙토마이신, 10 % 소 태아 혈청을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM)를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁한다.
13. T25 플라스크에 세포를 시딩한다.
14. 24-28 ℃에서 인큐베이팅한다.
15. 다음날, 조직 배양 플라스크에 부착되지 않은 세포를 제거한다.
16. 2-3일마다 신규 배지를 사용하여 배지의 절반을 대체한다.
17. 완전한 단층이 형성되고 확립된 세포가 하위배양용으로 준비가 되면, 세포가 확립된 것으로 간주한다.
B. 조직 체외이식편에 의한 어류 부레 세포주의 개발
1. 지역 어시장에서 건강한 옐로 크로커, 농어 또는 유사 범주의 어류를 입수한다.
2. 세포 단리시까지 얼음상에서 어류를 유지한다.
3. 10 % 표백제 중에 어류를 침지시킨다.
4. 무균 조건하에서 어류로부터 부레를 제거한다.
5. 차아염소산 중에서 1회 이상 상기 기관을 세척한다.
6. 항생제 배지 (400 lU/ml의 페니실린, 400 pg/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM) 중에서 1회 이상 기관을 세척한다.
7. 세척 후, 기관을 작은 조각 (1-2 mm3)으로 절단한다.
8. 개별적으로 완전 배지 (200 lU/ml의 페니실린, 200 pg/ml의 스트렙토마이신, 10 % 소 태아 혈청을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM)를 함유하는 24 웰 플레이트에 기관 조각을 위치시킨다.
9. 24-28 ℃에서 인큐베이팅한다.
10. 조직 체외이식편을 교란하지 않으면서 2-3일마다 신규 배지를 사용하여 배지의 절반을 대체한다.
11. 유착 세포가 관찰될 때까지 조직 체외이식편을 인큐베이팅한다.
12. 조직 체외이식편을 제거한다.
13. 완전한 단층이 형성되고 확립된 세포가 하위배양용으로 준비가 되면, 세포가 확립된 것으로 간주한다.
C. 어류 근육 세포주의 개발
1. 지역 어시장에서 건강한 그루퍼, 대구, 서대기, 넙치류, 도다리 또는 유사 범주의 어류를 입수한다.
2. 세포 단리시까지 얼음상에서 어류를 유지한다.
3. 10 % 표백제 중에 어류를 침지시킨다.
4. 무균 조건하에서 어류로부터 근육을 제거한다.
5. 차아염소산 중에서 1회 이상 조직을 세척한다.
6. 항생제 배지 (400 lU/ml의 페니실린, 400 pg/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM) 중에서 1회 이상 조직을 세척한다.
7. 세척 후, 조직을 작은 조각 (2-3 mm3)으로 절단한다.
8. PBS 중 콜라게나제 및 디스파제를 함유하는 원심분리기 튜브로 절단된 조직을 옮긴다.
9. 1시간 동안 연속 진탕하면서 실온으로 인큐베이팅한다.
10. 100 pm 메시를 사용하여 상청액을 여과함으로써, 분해되지 않은 조직을 제거한다.
11. 5분 동안 200g로 여과액을 원심분리한다.
12. 완전 배지 (200 lU/ml의 페니실린, 200 pg/ml의 스트렙토마이신, 10 % 소 태아 혈청을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM)를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁한다.
13. T25 플라스크에 세포를 시딩한다.
14. 24-28 ℃에서 인큐베이팅한다.
15. 다음날, 조직 배양 플라스크에 부착되지 않은 세포를 제거한다.
16. 2-3일마다 신규 배지를 사용하여 배지의 절반을 대체한다.
17. 완전한 단층이 형성되고 확립된 세포가 하위배양용으로 준비가 되면, 세포가 확립된 것으로 간주한다.
D. 조직 체외이식편으로부터의 어류 근육 세포주의 개발
1. 지역 어시장에서 건강한 그루퍼, 대구, 서대기, 넙치류, 도다리 또는 유사 범주의 어류를 입수한다.
2. 세포 단리시까지 얼음상에서 어류를 유지한다.
3. 10 % 표백제 중에 어류를 침지시킨다.
4. 무균 조건하에서 어류로부터 근육을 제거한다.
5. 차아염소산 중에서 1회 이상 조직을 세척한다.
6. 항생제 배지 (400 lU/ml의 페니실린, 400 pg/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM) 중에서 1회 이상 조직을 세척한다.
7. 세척 후, 근육을 작은 조각 (1-2 mm3)으로 절단한다.
8. 개별적으로 완전 배지 (200 lU/ml의 페니실린, 200 pg/ml의 스트렙토마이신, 10 % 소 태아 혈청을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM)를 함유하는 24 웰 플레이트에 근육 조각을 위치시킨다.
9. 24-28 ℃에서 인큐베이팅한다.
10. 조직 체외이식편을 교란하지 않으면서 2-3일마다 신규 배지를 사용하여 배지의 절반을 대체한다.
11. 유착 세포가 관찰될 때까지 조직 체외이식편을 인큐베이팅한다.
12. 조직 체외이식편을 제거한다.
13. 완전한 단층이 형성되고 확립된 세포가 하위배양용으로 준비가 되면, 세포가 확립된 것으로 간주한다.
E. 성체 줄기 세포 단리 및 배양
1. 지역 어시장에서 건강한 그루퍼, 대구, 서대기, 넙치류, 도다리 또는 유사 범주의 6개월령 이하 어류를 입수한다.
2. 세포 단리시까지 얼음상에서 어류를 유지한다.
3. 10 % 표백제 중에 어류를 침지시킨다.
4. 무균 조건하에서 어류로부터 근육을 제거한다.
5. 차아염소산 중에서 1회 이상 조직을 세척한다.
6. 항생제 배지 (400 lU/ml의 페니실린, 400 pg/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM) 중에서 1회 이상 조직을 세척한다.
7. 세척 후, 조직을 작은 조각 (2-3 mm3)으로 절단한다.
8. PBS 중 콜라게나제 및 디스파제를 함유하는 원심분리기 튜브로 절단된 조직을 옮긴다.
9. 1시간 동안 연속 진탕하면서 실온으로 인큐베이팅한다.
10. 100 pm 메시를 사용하여 상청액을 여과함으로써, 분해되지 않은 조직을 제거한다.
11. 5분 동안 200g로 여과액을 원심분리한다.
12. 완전 배지 (200 lU/ml의 페니실린, 200 pg/ml의 스트렙토마이신, 10 % 소 태아 혈청, l00 ng/ml의 기본 섬유모세포 성장 인자를 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM)를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁한다.
13. 코팅되지 않은 플레이트상에서 24-28 ℃로 1시간 동안 세포를 플레이팅한다.
14. 상청액을 수확하고, 라미닌, 젤라틴, 마트리겔(Matrigel) 또는 유사 매트릭스로 코팅된 플레이트상에 그것을 위치시킨다.
15. 24-28 ℃에서 인큐베이팅한다.
16. 24시간 후, 임의의 느슨하게 부착된 비-유착 세포를 세척 제거한다.
17. 완전 배지 (200 lU/ml의 페니실린, 200 pg/ml의 스트렙토마이신, 10 % 소 태아 혈청, l00 ng/ml의 기본 섬유모세포 성장 인자를 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM)를 사용하여 매일 배지를 대체한다.
F. iPSC의 생성 및 배양
1. 형질감염 2-4일 전에, 조직 배양 플라스크 중 완전 배지 (10 % FBS를 포함하는 L15)에 세포를 플레이팅한다. 형질감염일 (0일차)에, 세포는 대략 75-90 % 합류되어야 한다.
2. 젤라틴-코팅된 6-웰 플레이트로부터 배지를 흡인하고, 웰 당 2 mL의 신규 완전 배지로 그것을 대체한다. 코팅된 플레이트를 사용 준비될 때까지 37 ℃에 위치시킨다.
3. 37 ℃에서 Epi5™ 벡터를 해동하고, 사용 준비시까지 그것을 습윤한 얼음상에 위치시킨다. 사용 전에, 해동된 벡터를 간단하게 원심분리하여 튜브의 저부에 그것을 수집한다.
4. PBS 중에서 세포를 세척한다.
5. 세포를 함유하는 배양 플라스크에 3 mL의 0.05 % 트립신/EDTA를 첨가한다.
6. 3분 동안 실온에서 플라스크를 인큐베이팅한다.
7. 5-8 mL의 완전 배지를 각 플라스크에 첨가한다. 세포를 조심스럽게 빈 멸균 15 mL 원추형 튜브로 옮긴다.
8. 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
9. 2분 동안 200g로 세포를 원심분리한다.
10. 상청액의 대부분을 조심스럽게 흡인하고, 완전 배지를 사용하여 재현탁한다.
11. 세포를 6-웰 플레이트의 젤라틴-코팅된 접시 플레이트상에 2 mL 완전 배지 중 30-60 % 합류에서 웰 당 50,000 내지 100,000개 세포로 시딩하고, 밤새 24-28 ℃로 인큐베이팅한다.
12. 옵티(Opti)-MEM/환원-혈청 배지를 실온으로 예비가온하고, 하기하는 바와 같이 튜브 A 및 튜브 B를 제조한다.
13. 각각 1.2 μL인 2개 Epi5™ 재프로그래밍 벡터 혼합물 (총 2.4 μL)을 튜브 A로 표지된 1.5 mL 미세원심분리기 튜브 중 118 μL의 옵티-MEM 배지에 첨가한다. 4.8 μL의 P3000™ 시약을 첨가하고, 충분히 혼합한다.
14. 3.6 μL의 리포펙타민 3000 시약을 튜브 B로 표지된 1.5 mL 미세원심분리기 튜브 중 121 μL의 예비가온된 옵티-MEM 배지에 희석한다.
15. 형질감염 모 혼합물을 제조하기 위하여, 튜브 A의 내용물을 튜브 B에 첨가하고, 충분히 혼합한다.
16. 실온에서 5분 동안 형질감염 모 혼합물을 인큐베이팅한다.
17. 1회 더 혼합하고, 전체 250 μL의 형질감염 모 혼합물을 각 웰에 첨가한다.
18. 24-28 ℃에서 밤새 인큐베이팅한다.
19. 형질감염 24시간 후, 플레이트로부터 배지를 흡인한다. 2 mL의 N2B27 배지 (IX N-2 보충물, IX B27 보충물, 100 ng/mL의 bFGF를 포함하는 L15)를 각 웰에 첨가한다.
20. 폐 배지를 2 mL의 N2B27 배지로 대체하는 것에 의해, 총 14일 동안 매일 N2B27 배지를 교체한다.
21. 14일차에, 폐 N2B27 배지를 흡인하고, 완전 배지를 사용하여 그것을 대체한다. 웰 당 2 mL로 매일 배지 교체를 재개한다.
22. 격일로 현미경하에서 형질전환된 세포를 표시하는 세포 덩어리의 출현에 대하여 플레이트를 관찰한다. 형질감염-후 15 내지 21일 이내에, iPSC 집락이 전달하기에 적절한 크기로 성장하게 된다.
23. 집락은 21일차까지 구별되며, 추가적인 배양 및 증식을 위하여 선발될 수 있다.
G. 세포의 하위배양 방법
1. 배양 배지를 제거하여, 폐기한다.
2. 세포를 PBS로 간단하게 세정함으로써, 트립신 억제제를 함유하는 혈청 중 모든 미량물질을 제거한다.
3. 2-3 mL의 0.25 % 트립신-EDTA 용액을 플라스크에 첨가한다.
4. 1분 동안 실온에서 인큐베이팅한다.
5. 5-8 mL의 완전 성장 배지를 첨가한다.
6. 약하게 피펫팅하는 것에 의해 세포를 흡인한다.
7. 1:2 내지 1:3의 하위배양 비로 새로운 배양 플라스크에 적절한 분취량의 세포 현탁액을 첨가한다.
8. 24-28 ℃에서 인큐베이팅한다.
H. 현탁 배양으로의 적합화
1. 트립신처리에 의해 문제 세포에 적절한 빈도로 단층 배양물을 계대시킨다.
2. 각 계대에서, PBS를 사용하여 세포 단층을 세척하고, 0.25 % 트립신을 피복한다.
3. 5분 동안 실온에서 인큐베이팅한다.
4. 완전 배지를 사용하여 효소를 불활성화한다.
5. 세포 현탁액을 수확하고, 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
6. 세포 현탁액을 또 다른 배양 플라스크에 시딩한다.
7. 현탁된 세포의 생존력이 90 % 이상이 될 때까지 반복 계대시킨다.
8. 0.1-0.5 백만개/ml의 세포 밀도로 스피너 또는 셰이커 플라스크에서 50 ml의 완전 배지를 사용하여 현탁 배양을 확립한다.
9. 단층 배양에 최적인 동일한 온도, 습도 및 대기 조건하에 CO2 인큐베이터에서 스피너 또는 셰이커 플라스크 현탁 배양물을 인큐베이팅한다.
10. 2-3일마다 신규 배지를 사용하여 0.1-0.5 백만개/ml의 세포 밀도로 조정한다.
11. 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
12. 건강한 세포 성장을 촉진하는 세포 밀도에서 다수의 병행 배양물들을 확립한다.
13. 배양물의 일부를 사용하여 세포 밀도를 점차적으로 1 백만개/ml로 증가시킨다.
14. 증가하는 세포 밀도가 세포 사멸로 이어지는 경우, 고-밀도 배양물을 폐기한다.
15. 세포 형성 단계 12를 사용하여 고-밀도 적합화를 재개한다.
16. 세포가 현탁액 중에서 성장하도록 적합화되는 경우, 3 L 생물반응기로 규모를 증대한다.
I. 무-혈청 배지 (식물 가수분해물 ) 로의 적합화
1. DMEM/F12 완전 배지 (DMEM 배지와 햄 F12 배지의 1:1 혼합물, 2-4 mM의 글루타민, 10 % FBS) 중에서 세포를 배양한다.
2. 무-혈청 배지 (DMEM 배지와 햄 F12 배지의 1:1 혼합물, 2-4 mM의 글루타민, 20 %의 식물 가수분해물 예컨대 콩, 면실, 평지씨, 밀, 효모 또는 등가물)를 제조한다.
3. 세포가 합류에 도달하면, 적합화 배지 I (40 %의 신규 완전 배지, 이전 계대로부터의 40 %의 컨디셔닝된 배지, 20 %의 무-혈청 배지)을 사용하여 배지를 대체한다.
4. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
5. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 3을 반복한다.
6. 세포가 합류에 도달하면, 적합화 배지 II (30 %의 신규 완전 배지, 단계 1 세포로부터의 30 %의 컨디셔닝된 배지, 40 %의 무-혈청 배지)을 사용하여 배지를 대체한다.
7. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
8. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 6을 반복한다.
9. 세포가 합류에 도달하면, 적합화 배지 III (20 %의 신규 완전 배지, 단계 1 세포로부터의 20 %의 컨디셔닝된 배지, 60 %의 무-혈청 배지)을 사용하여 배지를 대체한다.
10. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
11. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 9를 반복한다.
12. 세포가 합류에 도달하면, 적합화 배지 IV (10 %의 신규 완전 배지, 단계 1 세포로부터의 10 %의 컨디셔닝된 배지, 80 %의 무-혈청 배지)을 사용하여 배지를 대체한다.
13. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
14. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 12를 반복한다.
15. 세포가 합류에 도달하면, 무-혈청 배지를 사용하여 배지를 대체한다.
16. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
17. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 15를 반복한다.
18. 무-혈청 배지 사용은 매 단계에서 점차적으로 더 증가될 수 있는데, 다시 말하자면 매 단계에서의 20 % 이하의 증가이다.
J. 무-혈청 배지 (화학적으로 규정된 것)로의 적합화
1. DMEM/F12 완전 배지 (DMEM 배지와 햄 F12 배지의 1:1 혼합물, 2-4 mM의 글루타민, 10 % FBS) 중에서 세포를 배양한다.
2. 무-혈청 배지 (DMEM 배지와 햄 F12 배지의 1:1 혼합물, 2-4 mM의 글루타민, 아스코르브산 2-포스페이트 65-130 ug/ml, NaHCO3 550-1100 ug/ml, 소듐 셀레나이트 14-28 ng/ml, 인슐린 19-38 ug/ml, 트랜스페린 11-22 ug/ml, FGF-2 100-200 ng/ml, TGF-베타 2-4 ng/ml)를 제조한다.
3. 세포가 합류에 도달하면, 적합화 배지 I (40 %의 신규 완전 배지, 이전 계대로부터의 40 %의 컨디셔닝된 배지, 20 %의 무-혈청 배지)을 사용하여 배지를 대체한다.
4. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
5. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 3을 반복한다.
6. 세포가 합류에 도달하면, 적합화 배지 II (30 %의 신규 완전 배지, 단계 1 세포로부터의 30 %의 컨디셔닝된 배지, 40 %의 무-혈청 배지)를 사용하여 배지를 대체한다.
7. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
8. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 6을 반복한다.
9. 세포가 합류에 도달하면, 적합화 배지 III (20 %의 신규 완전 배지, 단계 1 세포로부터의 20 %의 컨디셔닝된 배지, 60 %의 무-혈청 배지)을 사용하여 배지를 대체한다.
10. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
11. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 9를 반복한다.
12. 세포가 합류에 도달하면, 적합화 배지 IV (10 %의 신규 완전 배지, 단계 1 세포로부터의 10 %의 컨디셔닝된 배지, 80 %의 무-혈청 배지)을 사용하여 배지를 대체한다.
13. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
14. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 12를 반복한다.
15. 세포가 합류에 도달하면, 무-혈청 배지를 사용하여 배지를 대체한다.
16. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
17. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 15를 반복한다.
18. 무-혈청 배지 사용은 매 단계에서 점차적으로 더 증가될 수 있다. 예를 들면, 매 단계에서 20 % 이하의 증가이다.
K. 단백질 발현의 전사-후 강화
1. 완전 배지 (200 lU/ml의 페니실린, 200 pg/ml의 스트렙토마이신, 10 % 소 태아 혈청을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM) 또는 무-혈청 배지 (식물 가수분해물 또는 화학적으로 규정된 화합물을 포함하는 DMEM/F12) 중에서 세포를 배양한다.
2. 배양 배지를 제거하여, 폐기한다.
3. 세포를 PBS로 간단하게 세정함으로써, 트립신 억제제를 함유하는 혈청 중 모든 미량물질을 제거한다.
4. 2-3 mL의 0.25 % 트립신-EDTA 용액을 플라스크에 첨가한다.
5. 1분 동안 실온에서 인큐베이팅한다.
6. 약하게 피펫팅하는 것에 의해 세포를 흡인한다.
7. 2분 동안 200g로 세포를 원심분리한다.
8. 완전 배지 또는 무-혈청 배지에 세포를 재현탁한다.
9. 6-웰 플레이트의 각 웰에 5십만개의 세포를 첨가한다.
10. 24-28 ℃에서 밤새 인큐베이팅한다.
11. 폴리에틸렌이민, 리포좀, 전기천공 또는 기타 방법을 사용하여 세포에 마이크로 RNA 올리고뉴클레오티드 (miR-21, miR-29a, miR-21 모방체, miR-29a 모방체, 항-miR-21, 항-miR-29a 또는 등가물)을 형질감염시킨다.
12. 24-28 ℃에서 밤새 인큐베이팅한다.
13. 최적 배양과 동일한 온도, 습도 및 대기 조건하의 CO2 인큐베이터 중 다-층 플라스크, 스피너 플라스크 또는 셰이커 플라스크로 세포를 옮긴다.
L. 세포 배양용 스캐폴딩 ( 곤약 + 검)
1. 색상이 옅은 황색이 될 때까지 사프란 몇 조각과 함께 물을 끓인다.
2. 사프란을 제거하고, 따뜻해질 때까지 용액을 방치한다.
3. 완전 건조 성분을 제조한다
a. 곤약 - 0.5-5 %, 바람직하게는 3 %
b. 베이킹 소다 - 0.3-3 %, 바람직하게는 2 %
c. 완성 크산탄 검(Perfected Xanthan Gum) - 0.2-2 %, 바람직하게는 1.5 %.
4. 100 ml의 사프란 용액을 칭량한다.
5. 베이킹 소다, 로커스트 콩 검, 크산탄 검을 순차적으로 첨가한다. 각 성분을 첨가한 후, 혼합물을 충분히 교반한다.
6. 용액의 상부에 조금씩 뿌리는 것에 의해 곤약을 첨가한다. 교반을 유지한다. 용액이 죽 모양이 되어야 한다.
7. 대략 1-15 mm의 두께로 몰드에 곤약 혼합물을 바른다.
8. 뚜껑으로 몰드를 덮고, 30분 초과 동안 실온하에 방치한다.
9. 몰드를 4 ℃ 냉장고에 4시간 동안 넣어둔다.
10. 40분 동안 적은 열로 몰드를 찐다.
11. 2시간 동안 실온하에 몰드를 방치한다.
12. 15분 동안 45-55 ℃에서 스캐폴드를 탈수한다.
M. 세포 배양용 스캐폴딩 ( 알기네이트 + 점착성 쌀 가루 )
1. 0.1-2 g (0.1-2 %), 바람직하게는 약 1 g (1 %)의 소듐 알기네이트를 칭량한다.
2. 100 ml의 물을 블렌더에 첨가한다.
3. 알기네이트 분말을 블렌더에 첨가하고, 용해될 때까지 혼합물을 블렌딩한다.
4. 플라스틱 필름으로 용기를 덮고, 밤새 냉장고에 알기네이트 용액을 넣어둠으로써, 기포를 제거한다.
5. 1-10 g (1-10 %), 바람직하게는 약 5 g (5 %)의 점착성 쌀 가루를 칭량하고, 몰드에 넣는다.
6. 대략 1-15 mm의 두께로 몰드에 알기네이트 용액을 첨가한다.
7. 모든 가루가 용해될 때까지 혼합물을 교반한다.
8. 형상이 고정될 때가지 30분 동안 적은 열로 혼합물을 찐다.
9. 뚜껑으로 몰드를 덮고, 30분 동안 실온하에 방치한다.
10. 1 % 칼슘 락테이트를 칭량하고 교반함으로써 수중에 용해시킨다.
11. 적어도 2.5시간 동안 1 % 칼슘 락테이트 용액으로 스캐폴드를 침지시킴으로써, 스캐폴드 주변으로의 멤브레인의 형성을 가능하게 한다.

Claims (17)

  1. 적어도 1종 유형의 세포를 유지하도록 구성되는 세포 배양 장치;
    세포 배양 장치로 제1 유체를 공급 및 수용하도록 구성되는 신규 배지 장치;
    신규 배지 장치로부터 제2 유체를 공급 및 수용하도록 구성되는 폐기물 제거 장치;
    제1 유체를 순환시키도록 구성되는, 세포 배양 장치와 신규 배지 장치 사이에 연결되는 제1 펌프;
    제2 유체를 순환시키도록 구성되는, 신규 배지 방치와 폐기물 제거 장치 사이에 연결되는 제2 펌프
    를 포함하며, 여기서 세포 배양 장치, 신규 배지 장치 및 폐기물 제거 장치는 교차 오염을 방지하기 위하여 서로 분리되는 것인 세포 배양 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 세포가 포유동물, 어류, 동물 또는 식물 유래의 피부, 근육, 지방, 골 또는 임의의 다른 조직으로부터 수득되는 것인 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 신규 배지 장치가 제1 유체로부터 제2 유체로 폐기물을 추출하고 제2 유체로부터 제1 유체로 영양소를 공급하도록 구성되는 제1 투석 장치를 추가적으로 포함하는 것인 시스템.
  4. 제3항에 있어서, 제1 투석 장치가 적어도 1개의 500 Da 분자량 컷-오프 (MWCO) 멤브레인을 추가적으로 포함하며, 상기 멤브레인이 셀룰로스 에스테르 (CE), 재생 셀룰로스 (RC) 및 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF)에서 선택되는 것인 시스템.
  5. 제1항에 있어서, 폐기물 제거 장치가 제2 유체로부터 폐기물을 추출하도록 구성되는 제2 투석 장치를 추가적으로 포함하는 것인 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 제2 투석 장치가 적어도 1개의 100 Da 분자량 컷-오프 (MWCO) 멤브레인을 추가적으로 포함하며, 상기 멤브레인이 셀룰로스 에스테르 (CE), 재생 셀룰로스 (RC) 및 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF)에서 선택되는 것인 시스템.
  7. 제1항에 따른 세포 배양 시스템을 제공하는 단계:
    적어도 1종 유형의 세포를 세포 배양 장치에 위치시키는 단계;
    세포 배양 장치와 신규 배지 장치 사이에 제1 유체를 순환시키는 단계;
    신규 배지 장치와 폐기물 제거 장치 사이에 제2 유체를 순환시키는 단계;
    신규 배지 장치에서 제1 유체로부터 제2 유체로 폐기물을 추출하는 단계; 및
    신규 배지 장치에서 제2 유체로부터 제1 유체로 영양소를 보충하는 단계
    를 포함하는 세포 배양물의 성장 방법.
  8. 제7항에 있어서, 세포가 포유동물, 어류, 동물 또는 식물 유래의 피부, 근육, 지방, 골 또는 임의의 다른 조직으로부터 수득되는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 폐기물 제거 장치에서 제2 유체로부터 폐기물을 추출하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 하기의 단계들을 추가적으로 포함하는 방법:
    배양을 위하여 미리 결정된 온도로 배양 용기를 가열하는 단계;
    세포 배양 장치에서 제1 유체를 교반하는 단계;
    미리 결정된 밀도로 세포 배양물을 성장시키는 단계; 및
    제1 유체로부터 세포 배양물을 단리하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 제1 유체가 배양 배지이며, 제2 유체가 신규 기본 배지인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 세포들을 고기로 형성시키는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 세포들을 조직 구성체로 형성시키는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
  14. 제7항에 있어서, 미세담체가 있거나 없이 세포가 성장되는 방법.
  15. 제7항에 있어서, 스캐폴드가 있거나 없이 세포가 성장되는 방법.
  16. 제7항에 있어서, 세포가 중간엽 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포 및 위성 세포와 같은 다양한 기원의 줄기 세포 또는 유전자 변형된 세포일 수 있는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 기능상 조작된 조직을 형성시키기 위하여, 줄기 세포의 증식 후 이어지는 분화를 위해 제1 투석 장치에서 제2 유체에 적어도 1종의 분화 배지 성분을 공급하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021111196A1 (en) * 2019-12-02 2021-06-10 Avant Meats Company Limited Methods of meat production by in vitro cell cultivation
CN114181888B (zh) * 2021-11-24 2023-12-08 汕头大学 一种浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系的建立方法及应用
WO2023233340A1 (en) * 2022-06-02 2023-12-07 Avant Meats Company Limited Genetically engineered yeast cells, recombinant proteins produced thereof and applications thereof
WO2024028439A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Novelty For Them Gmbh Complexed asthaxanthin undergoing a hypsochromic shift upon heating and application in food products
WO2024134658A1 (en) * 2022-12-22 2024-06-27 Sea2Cell Ltd. Compositions and methods for culturing cells of aquatic species

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3418208A (en) * 1966-02-28 1968-12-24 Mobil Oil Corp Growing increased yields of micro-organisms
FR2594847B1 (fr) * 1986-02-25 1989-06-02 Moet Hennessy Rech Procede de preparation de polypeptides biologiquement actifs, polypeptides obtenus et compositions les contenant
DE3641824A1 (de) * 1986-12-06 1988-06-16 Bayer Ag Verfahren und vorrichtung zur kultivierung immobilisierter oder adhaerierter saeugerzellen sowie dessen verwendung bei der herstellung von proteinen
ATE120485T1 (de) * 1988-05-23 1995-04-15 Univ Minnesota Bioreaktor.
ES2252893T3 (es) 1991-11-20 2006-05-16 Innogenetics N.V. Granulos derivados de queratinocitos para el uso como sustancias para la curacion de heridas.
WO1999031222A1 (en) * 1997-12-18 1999-06-24 Willem Frederik Van Eelen Industrial scale production of meat from in vitro cell cultures
US6887693B2 (en) * 1998-12-24 2005-05-03 Cepheid Device and method for lysing cells, spores, or microorganisms
US20070122904A1 (en) 2000-09-29 2007-05-31 Unisearch Limited Method and apparatus for culturing cells
AU2002361549A1 (en) * 2001-07-13 2003-04-14 Paul L. Deangelis Glycosaminoglycan polymers and methods of making and using same
BR0315414A (pt) * 2002-12-03 2005-08-16 Innogenetics Nv Composições farmacêuticas de lisado de células e processos para a produção e uso destas
WO2005121316A1 (en) * 2004-06-11 2005-12-22 Bernard O'brien Institute Of Microsurgery Tissue material and muscle derived matrix
AP2007003940A0 (en) * 2004-09-17 2007-04-30 Jon Vein Tissue engineered meat for consumption and a method for producing tissue engineered meat for consumption
ATE496987T1 (de) * 2006-05-22 2011-02-15 Biovest Int Inc Ausserkapilläres fluidzirkulationssystem und - verfahren
WO2008109880A1 (en) * 2007-03-08 2008-09-12 The Johns Hopkins University Bioreactor system for pharmacokinetic-pharmacodynamic analysis
US20080254167A1 (en) * 2007-04-10 2008-10-16 Solae, Llc Seafood Compositions Comprising Structured Protein Products
US20100197007A1 (en) * 2007-07-31 2010-08-05 Inserm(Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Method for Culturing Mammalian Stem Cells
CA2696339C (en) * 2007-08-22 2017-12-19 Probiogen Ag Culture system and method for immunogenicity and immunofunction testing in vitro
CN102361970B (zh) * 2008-11-04 2018-03-27 韦尔赛特公司 干细胞聚集体悬浮组合物及其分化方法
US20130323708A1 (en) * 2009-07-01 2013-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Isolated adult cells, artificial organs, rehabilitated organs, research tools, organ encasements, organ perfusion systems, and methods for preparing and utilizing the same
US20110091604A1 (en) * 2009-10-21 2011-04-21 Seth Adrian Miller Synthetic meat
EP2536820A2 (en) * 2010-02-17 2012-12-26 INQ Biosciences Corporation Culture systems, apparatus, and related methods and articles
GB201019932D0 (en) * 2010-11-24 2011-01-05 Imp Innovations Ltd Dimensional hollow fibre bioreactor systems for the maintenance, expansion, differentiation and harvesting of human stem cells and their progeny
WO2012103922A1 (en) * 2011-01-31 2012-08-09 Red Patent B.V. Installation and method for biomass conversion into methane
EP2885415B1 (en) * 2012-08-17 2022-08-03 Easel Biotechnologies LLC Two stage production of higher alcohols
ES2782380T5 (es) * 2013-10-30 2023-05-08 Univ Missouri Método de especificación y cultivo de linaje del músculo esquelético escalable
CN103992385B (zh) 2014-05-22 2017-05-10 浙江海洋学院 一种大黄鱼鱼鳔抗氧化胶原肽及其制备方法和用途
CN104109705B (zh) * 2014-06-19 2017-10-31 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法
CN104313098A (zh) 2014-10-28 2015-01-28 威海市桢昊生物技术有限公司 一种鱼鳔胶原蛋白粉的制取方法
MX2017010217A (es) * 2015-02-09 2017-11-10 Univercells Nv Sistema, aparato y metodo para la produccion de celulas y/o productos de celulas.
CN105219827B (zh) 2015-11-10 2020-09-01 浙江海洋学院 鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法
IL302693A (en) 2016-07-11 2023-07-01 Yissum Res Dev Co Of Hebrew Univ Jerusalem Ltd Methods and systems for growing cells in culture
JP2019523278A (ja) * 2016-07-28 2019-08-22 フォンテラ コ−オペレイティブ グループ リミティド 乳製品およびプロセス
CN106749634B (zh) * 2017-01-17 2020-09-15 北京鸿顺养源生物科技有限公司 一种具有抗氧化活性的猪血红蛋白糖肽及其制备方法与应用
CN106805252A (zh) * 2017-01-22 2017-06-09 福州大学 一种鱼短肽及其在营养强化剂中的应用
US20200140821A1 (en) * 2017-06-07 2020-05-07 Wild Type, Inc. Ex vivo meat production
CA3070048A1 (en) * 2017-07-15 2019-01-24 Aleph Farms Ltd. Cultured meat compositions
CN107400633B (zh) * 2017-08-17 2023-10-10 上海白泽医疗器械有限公司 中空纤维交换器及中空纤维交换式培养系统
US10669524B2 (en) * 2018-06-12 2020-06-02 Fork & Goode, Inc. Large scale cell culture system for making meat and associated products
CN108823072B (zh) * 2018-09-19 2023-08-15 青岛中科蓝智生物科技发展有限公司 一种微藻细胞的培养-采收一体化系统及方法
CN110117527A (zh) 2019-05-15 2019-08-13 刘宝全 一种干细胞代谢废物的强化排出方法
CN110257227B (zh) * 2019-06-20 2020-08-04 江南大学 一种用于动物细胞培养的生物反应器
CN110201000A (zh) * 2019-07-11 2019-09-06 广东海洋大学 一种具有促进创伤愈合作用的方格星虫酶解蛋白肽粉的制备方法及其应用
CN110317848B (zh) * 2019-08-08 2020-02-18 北京工商大学 一种胶原蛋白肽的制备方法
US11306342B2 (en) 2019-12-02 2022-04-19 Avant Meats Company Limited Cell hydrolysate composition from cultivated cells and applications thereof
WO2021111196A1 (en) * 2019-12-02 2021-06-10 Avant Meats Company Limited Methods of meat production by in vitro cell cultivation

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