KR20240041372A - 세포로부터 재배된 육류, 조직 및 연관 제품을 생산하기 위한 시스템 - Google Patents

세포로부터 재배된 육류, 조직 및 연관 제품을 생산하기 위한 시스템 Download PDF

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KR20240041372A
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포 산 마리오 친
카이 이 캐리 찬
츄엔 웨이 리
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아반트 미츠 컴퍼니 리미티드
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Abstract

조직을 재배하기 위해 적어도 하나의 세포 유형을 고정하도록 구성된 적어도 하나의 생물반응기, 투석막을 포함하는 투석 유닛, 신선한 배지 유닛, 및 투석물로부터 대사 폐기물을 제거하도록 구성된 폐기물 제거 유닛을 포함하는 세포/조직 배양 시스템으로서, 여기서 대사 폐기물은 암모니아 및 젖산염을 포함하고, 폐기물 제거 유닛은 젖산염을 분해하고 세포 성장을 촉진하는 탄소원을 생성하도록 구성된 생체촉매 또는 효소를 포함한다.

Description

세포로부터 재배된 육류, 조직 및 연관 제품을 생산하기 위한 시스템
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 8월 5일자로 출원된 미국 정규 출원 일련 번호 제62/17/395,452호에 대한 우선권을 주장하며, 이 출원의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
본원에 논의된 실시양태는 일반적으로 세포 배양물을 성장시키기 위한 개선된 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본원에 논의된 실시양태는 또한 일반적으로 시험관내 육류 생산 및 조직 구축/공학을 위한 개선된 시스템 및 방법에 관한 것이다.
동물 육류는 단백질이 많고, 신체 기능을 지지하는 데 사용되는 단백질을 구축하는 데 필요한 모든 아미노산을 공급한다. 소비용 육류는 전통적으로 농장에서 사육되는 동물 또는 어류에서 수득된다. 그러나, 동물 육류를 생산하기 위한 농업 및 수경재배는 많은 양의 에너지와 자원을 필요로 하며, 탄소 발자국이 높다. 농업 또는 수경재배에 의해 생산된 육류는 생산 공정에서 육류가 질병, 오염 물질 및 독소에 노출될 수 있으므로 공중 보건에 위험을 초래할 수 있다. 인구 증가, 육류 수요 증가, 환경 문제, 제한된 토지 및 수자원, 생물다양성 손실, 및 동물 도살과 연관된 부정적인 인식과 같은 많은 우려로 인해 과학자들은 대체 공정으로 육류를 생산하는 기술을 개발하게 되었다.
시험관내 육류 생산은 동물의 근육 조직 또는 기관 조직을 세포 배양 기술을 사용하여 실험실에서 성장시켜 육류 및 육류 제품을 제조하는 공정이다. 본원에 사용된 바와 같이, 시험관내 육류 및 육류 제품은 동물 단백질 제품뿐만 아니라 가용성 형태 및 고체 형태를 포함하는 비-육류 제품을 포함한다. 아직 개발 초기 단계에 있지만 시험관내 육류 및 육류 제품은 건강 및 환경적 이점, 및 동물 복지 혜택과 같은 전통적인 육류 제품에 비해 많은 이점을 제공할 수 있다. 이는 세포 배양물로부터 농산물을 생산하거나 또는 세포 농업의 더 넓은 분야의 일부로서 작동하는 차세대 신흥 기술이다.
시험관내 육류 생산을 위한 세포는 동물 생검에서 채취한 세포(예를 들어, 근육 세포, 체세포, 줄기 세포 등)일 수 있으며, 이는 이후 생물반응기 또는 다른 유형의 멸균 제어 환경 내의 배양 배지에서 동물과 별도로 성장될 수 있다. 세포는 생물반응기에 배치된 식용 가능한 3차원 스캐폴드에 부착되어 동물 기관을 모방하는 반고체 또는 고체 형태로 성장할 수 있다. 스타터 세포는 동물의 조직에서 직접 수득한 일차 세포이거나, 또는 연속 세포주일 수 있다. 적절한 배양 배지의 올바른 조건 하에 성장하면 일차 세포는 성장하고 증식하지만, 세포 DNA 끝에 있는 텔로미어 길이와 관련된 한정된 횟수만큼이다. 반면, 연속 세포주는 장기간에 걸쳐 시험관내에서 배양될 수 있다. 세포 생물학 연구는 일차 세포를 불멸의 연속 세포주로 전환시키는 방법에 대한 절차를 확립했다. 일차 세포는 텔로미어가 단축되는 것을 방지하기 위한 텔로머라제 역전사 효소의 과잉발현, 바이러스 종양 유전자, 또는 화학적 처리를 사용하여 연속 세포주로 형질전환시킬 수 있다.
배양 배지는 아미노산, 염, 비타민, 성장 인자, 및 pH 제어를 위한 완충 시스템과 같은 세포 증식에 필요한 성분을 함유할 수 있다. 현재의 방법은 사용하기 전에 배지에 소 태아 혈청(FBS)을 첨가하는데, 그 이유는 이것이 필수 거대분자, 성장 인자 및 면역 분자를 제공하기 때문이다. 그러나, FBS는 태어나지 않은 송아지에서 유래되므로, 동물 제품이 없어야 하는 목적과 양립할 수 없다. 동물 성분이 없는 배지에서 세포의 성장은 시험관내 육류 생산 연구에 관여하는 과학자들이 고려하는 중요한 인자이다. 일부 성장 인자는 인간, 동물 또는 재조합 근원에서 유래될 수 있다.
상품 육류 유형인 소고기, 돼지고기 및 가금류 육류는 생산이 어렵고 비용이 많이 드는 다수의 세포 유형을 수반하는 복잡한 조직 구성을 가지고 있다. 현재 시험관내 육류의 세포는 일반적으로 식물 근원의 재료로 만든 식품 등급의 생체 적합성 스캐폴드에 부착/접착된다. 결과적으로, 재배된 육류 제품은 식용 가능한 스캐폴드와 동물 세포의 조합이다. 이러한 육류 제품은 식물 근원의 식용 가능한 형태-제공 충전재와 동물 세포를 혼합한 단순한 조합이기 때문에 통상적인 육류에 비해 구조가 균질하다. 현재 시험관내 육류 제품은 기존 육류의 맛과 질감을 모방하기 어렵기 때문에 소비자를 만족시킬 수 없다. 또한, 다수의 세포 유형을 수반하는 복잡한 조직 구성도 부족하다. 소비자의 요구를 충족하고 일반 대중의 장기적인 지지를 얻기 위해서는 시험관내 육류의 구조, 질감, 및 조직 구성을 기존 육류의 것처럼 개선시킬 필요가 있다.
또한, 시험관내 육류의 생산 또는 재생 의학/조직 공학/조직 구축의 임상 적용에 있어서는 충분한 세포 수를 수확하는 것이 중요하다. 시험관내 육류 생산 적용에 있어서, 단백질 1kg은 대략 8x1012 근육 세포를 함유한다. 재생 의학의 적용에 있어서, 대부분의 적용에는 치료당 약 1010 내지 1012개의 세포가 필요하다. 예를 들어, 성인의 손상된 심장 조직을 대체하는 데에는 1x109 내지 2x109개의 심근 세포가 필요할 것이다. 간부전을 치료하는 데에는 1010개 간세포의 세포 수가 필요할 것이다.
현재의 세포 배양 접근법은 배양 배지의 존재 하에 배양 용기의 2D 배양 표면에 세포를 파종한다. 일반적으로 배양 배지는 포도당, 비타민, 무기염, 아미노산 및 기타 영양소를 함유한다. 세포가 성장함에 따라 영양소는 점차 고갈되고 대사 폐기물은 축적된다. 따라서, 영양소 보충과 폐기물 제거를 위해 2 내지 3일마다 배양 배지가 교체된다. 이 세포 배양 접근법에는 몇 가지 문제가 있다. 첫째, 세포는 배지 교체 사이에 준최적 조건에서 성장한다. 특히 세포가 증식력이 높고 대사율이 높으면 세포는 단시간에 포도당과 같은 영양소를 소비하고 젖산염 및 암모니아와 같은 폐기물을 축적한다. 대사 폐기물 또는 성장 저해제의 상승된 수준은 세포 성장을 저해할 수 있다. 이는 다음 번 배지 교체 전에 세포가 최적의 속도로 성장하는 것을 방해한다. 둘째, 배양 배지를 바꾸면 영양소 및 성장 인자가 낭비되고; 그리고 생산 비용을 증가시킨다. 소모된 배양 배지를 교체해도 이 배지에는 여전히 영양소가 존재한다. 특히, 혈청 보충물 유래이거나 또는 세포에 의해 분비된, 소모된 배양 배지 중의 성장 인자는 배지 교체 중에 제거된다. 이로 인해 혈청 보충물의 사용이 증가하고, 이는 배지 비용 및 생산 비용의 유의한 부분에 기여한다. 셋째, 배지는 수동으로 교환될 필요가 있고, 이는 대규모 제조 시 생산 비용 및 오염 기회를 증가시킨다.
또한, 배양 배지 내 암모늄 또는 젖산염 축적은 세포 성장 및 세포 생산성을 저해할 수 있는 것으로 관찰된다. 배양물 중 암모니아 축적을 감소시키기 위해 다수의 접근법이 제안되었다. 이들은 포도당 및 글루타메이트 센서를 사용하여 최적 수준으로 포도당 또는 글루타민의 실시간 피드백 제어를 통해 포도당 및 글루타민을 대체 당 및 아미노산으로 교체하는 것을 포함하고, 인큐베이션 온도를 감소시킨다. 그러나, 이러한 방법 중 어느 것도 세포 성장에 부정적인 영향을 주지 않으면서 암모니아 생산을 감소시키는 데 있어 세포주 및 생물공정 전반에 걸쳐 보편적으로 효과적이지는 않다.
그러나, 배양물 내 젖산염 축적을 감소시키는 데에는 다수의 접근법이 제안되었다. 이들은 포도당 및 글루타메이트 센서를 사용하여 최적 수준으로 포도당 및 글루타민의 실시간 피드백 제어를 통해 포도당 및 글루타민을 대체 당 및 아미노산으로 교체하는 것, 배양물에 구리 이온을 보충하는 것, 인큐베이션 온도를 감소시키는 것 및 배양물의 pH를 감소시키는 것을 포함한다. 그러나, 이들 방법 중 어느 것도 세포 성장에 부정적인 영향을 주지 않으면서 젖산염 생산을 감소시키는 데 있어서 세포주 및 생물공정 전반에 걸쳐 보편적으로 효과적이지는 않다.
기존 생물반응기 중 어느 것도 앞서 언급한 문제를 해결하고 앞서 언급한 요구사항을 한 번에 달성할 수 있는 것은 없었다. 특히, 기존의 교반-현탁 생물반응기는 높은 세포 밀도의 세포 성장을 지지할 수 없기 때문에 다수의 세포 유형을 수반하는 복잡한 조직 구성을 가진 시험관내 육류 생산에 적합하지 않다. 이러한 교반-현탁 생물반응기의 세포는 현탁 상태이며, 이러한 생물반응기의 세포 밀도는 전단 응력으로 인해 제한된다. 가장 중요하게는, 이러한 생물반응기에는 세포가 세포외 매트릭스(ELM)에 침착하도록 하고/조직을 형성하도록 하는 성분이 없다는 것이다. 이러한 교반-현탁 생물반응기로부터의 생성물은 기존 육류의 것과 같은 구조, 질감 및 조직 구성을 제공할 수 없다.
칩 상의 기관(Organ-on-a-Chip)은 또 다른 세포 배양 기술이지만, 또한 대규모 생산에 사용될 수 없기 때문에 시험관내 육류 생산에는 적합하지 않다.
기존의 교반-현탁 생물반응기 및 칩 상의 기관을 사용하여 시험관내 육류를 생산하기 위한 생산 비용은 세포 성장 및 수동 공정 동안 특정 대사산물을 유지하고 성장 저해제를 폐기하는 것에 대한 실패로 인해 경제적이지 않다.
마지막으로 중요한 것은, 기존의 교반-현탁 생물반응기 또는 칩 상의 기관은 세포를 배양하기 위한 환경 친화적인 접근법이 아니다. 세포 배양으로부터 생산된 폐기물은 처리되지 않았다. 이는 대량 생산 하에 있는 경우 환경 문제를 생성할 수 있다.
요약하면, 기존의 생물반응기는 시험관내 육류 생산을 위해 상업적으로 실행 가능한 규모로 기존 육류와 유사한 구조, 질감 및 조직 구성을 갖는 시험관내 육류의 경제적인 생산을 전혀 허용하지 않는다.
본 개시내용의 실시양태는 상기 과제에 대한 해결책을 제공하는 인간 소비용 시험관내 육류 생산 방법을 적용한다.
전술한 배경에 비추어 볼 때, 한 측면에서, 본 발명의 목적은 (1) 기존 육류와 유사한 개선된 구조, 질감 및 조직 구성을 갖고, (2) 경제적이고, (3) 환경 친화적인 접근법(예를 들어, 폐기물 감소)인, 소비성 시험관내 육류를 생산하는 대체 생물반응기 시스템 및 방법, 및/또는 조직 공학/재생 의학/조직 구축 적용예를 제공하는 것이다. 본 발명의 생물반응기 시스템 및 방법은 하나의 단일 장비에서 전술한 배경기술에 언급된 바와 같은 모든 문제를 해결한다. 본 발명의 생물반응기 시스템 및 방법은 오염 위험, 노동 요구 사항 및 배양 배지의 사용을 최소화하면서 생물반응기에서 폐기물을 제거하고 영양소를 보충할 수 있는 유가식을 사용한다. 본 발명은 영양소를 지속적으로 보충하고 축적된 성장 저해제를 제거하며 세포에 작용하는 전단 응력을 감소시키기 때문에 회분식(batch) 공정 및 전통적인 관류 기술에 비해 높은 세포 밀도 성장을 지지한다. 본 발명의 생물반응기 시스템 및 방법은 기존 육류와 유사한 개선된 구조, 질감 및 조직 구성을 갖는 경제적으로 시험관내 육류 생산 세포에 매우 적합하다. 또한, 다수의 세포 유형을 수반하는 복잡한 조직 구성을 갖는 시험관내 육류 생산에도 적합하다. 또한, 본 발명의 목적은 시험관내 육류 생산을 위해 최적의 배양 조건, 안정적인 수준의 영양소 및/또는 최소 수준의 성장 저해제를 유지하는 시스템을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 자동으로 영양소를 보충하고 세포에 의해 생산된 성장 저해제를 제거하면서, 미사용 성장 인자를 보유하여 생산성을 향상시키고 비용을 절감할 수 있는 대규모 시험관내 육류 생산 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시험관내 육류 생산 시스템을 사용한 시험관내 육류 생산 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 이 시스템을 사용한 조직 공학/구축 방법을 제공하는 것이다. 마지막으로, 본 발명의 목적은 재생 의학 적용예를 위해 임상적으로 적절한 수로 세포를 확장하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 배양 배지로부터 대사 폐기물(예를 들어, 암모니아 및 젖산염)을 제거하여 시험관내 육류 생산의 비용을 낮추고 생산성을 증가시키기 위한 대안적인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 다음과 같은 이점을 제공한다: (1) 최적의 세포 생존력 및 세포 성장을 위해 배양 배지에서 포도당과 같은 영양소를 최적 수준으로 유지하고 암모니아 및 젖산염과 같은 폐기물을 최소 수준으로 유지함; (2) 세포에 의해 분비되는 성장 인자를 보유하고 배양 배지에서 동물 유래 혈청의 사용을 감소시킴; (3) 젖산염(대사 폐기물)을 세포가 사용할 수 있는 탄소원으로 전환시켜 세포 성장, 분화 및 세포외 매트릭스 침착을 촉진함; (4) 세포가 성장하기 위한 생체내 환경과 유사한 세포외 매트릭스 및 감소된 전단 응력 환경을 제공함; 및 (5) 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스를 고정하기 위한 신뢰할 수 있는 홀더를 제공함. 성장 인자는 고가이므로, 본 발명은 폐기물을 제거 및 전환시키는 동시에 배양 배지에 성장 인자를 보유함으로써 비용을 낮추고 배지 사용을 최적화하는 데 도움을 준다.
이하에 더 자세히 논의되는 바와 같이, 본 발명은 (1) 세포 배양 시스템에서 배출되는 폐기물을 극적으로 감소시키고, (2) 기존 기술에 비해 세포 대량 생산을 극적으로 증가시킨다.
본 개시내용의 한 실시양태에 따르면, 조직을 형성하기 위해 적어도 하나의 세포 유형을 수용하도록 구성된 생물반응기, 세포에 영양소를 보충하고 생물반응기로부터 투석물로 대사 폐기물을 제거하도록 구성된 투석막을 포함하는 투석 유닛, 및 투석 유닛에 연결되어 투석물을 투석 유닛에 공급하도록 구성된 신선한 배지 유닛, 및 신선한 배지 유닛에 연결되어 투석물로부터 대사 폐기물을 제거하도록 구성된 폐기물 제거 유닛을 포함하는 시험관내 육류 생산 시스템이 제공되고, 여기서 투석물은 세포를 위한 영양소를 포함하고, 대사 폐기물은 암모니아 및 젖산염을 포함하고, 폐기물 제거 유닛은 암모니아를 분해하도록 구성된 제1 생체촉매를 포함하고, 폐기물 제거 유닛은 젖산염을 분해하도록 구성된 제2 생체촉매를 포함하고, 생물 반응기, 투석 유닛, 신선한 배지 유닛 및 수분 제거 유닛은 시스템에 탈착 가능하게 연결된다.
생물반응기는 세포가 그 위에서 3차원적으로 성장할 수 있도록 하는 플랫폼, 및 적어도 하나의 플랫폼을 수용하고 고정하도록 구성된 홀더를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 플랫폼은 식용 가능한 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스이다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명의 시스템을 제공하는 단계, 적어도 하나의 세포 유형을 생물반응기에 넣고 생물반응기에서 조직을 생산하는 단계, 적어도 암모니아 및 젖산염을 투석 유닛을 통해 생물반응기로부터 투석물로 추출하는 단계; 폐기물 제거 유닛에서 세포 성장을 촉진하는 신선한 탄소원을 폐기물 제거 유닛에서 생성하는 단계; 및 이러한 신선한 탄소원을 투석물로부터 생물반응기로 전달하는 단계를 포함하는 시험관내 육류 생산 방법이 제공된다.
본원에 개시된 실시양태는 상기 과제에 대한 해결책을 제공하는 인간 소비용 시험관내 육류 생산 및/또는 조직 공학/조직 구축/재생 의학 적용예를 위한 시스템 및 방법을 적용한다.
본 개시내용은 첨부 도면과 관련하여 고려할 때 상세한 설명을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다. 도면의 구성요소는 반드시 일정한 비율로 구성되는 것은 아니며, 대신 본 개시내용의 원리를 예시하는 데 중점을 두고 있다.
도 1은 본 개시내용의 한 실시양태에 따른 시험관내 육류 생산 방법의 흐름도이다.
도 2는 본 개시내용의 한 실시양태에 따른 고체 상 지지체를 갖는 시험관내 육류 생산에 사용되는 생물반응기의 개략적 또는 개념적인 단면도이다.
도 3은 본 개시내용의 한 실시양태에 따라, 도 2와 유사하나, 제2 고체상을 갖는 생물반응기의 개략적 또는 개념적인 단면도이다.
도 4는 본 개시내용의 한 실시양태에 따른 세포 배양 시스템의 개략도이다.
도 5는 본 개시내용의 한 실시양태에 따른 신선한 배지 유닛의 개략도이다.
도 6은 본 발명의 한 실시양태에 따른 폐기물 제거 유닛의 개략도이다.
도 7a는 0일째 콜라겐 기반 스캐폴드에서 배양된 HEK293 세포의 명시야(Brightfield) 이미지 및 생존/사멸(LIVE/DEAD) 염색 이미지를 보여준다. 도 7b는 4일째 콜라겐 기반 스캐폴드에서 배양된 HEK293 세포의 명시야 이미지 및 생존/사멸 염색 이미지를 보여준다. 도 7c는 11일째 콜라겐 기반 스캐폴드에서 배양된 HEK293 세포의 명시야 이미지 및 생존/사멸 염색 이미지를 보여준다.
도 8은 도 4의 세포 배양 시스템에서 배양 11일 후, 세포 질량을 트립신처리 및 원심분리를 통해 콜라겐 기반 스캐폴드로부터 추출한, 대량 생산된 추출된 세포의 이미지이다. 세포 배양 시스템에서 성장한 세포는 대조군보다 훨씬 더 큰 부피의 미세조직을 형성하도록 성장되었다. 미세조직의 덩어리는 세포 배양 시스템에서 관찰되었으나 대조군에서는 관찰되지 않았다. 범례: 생물반응기, 작동 중인 세포 배양 시스템 프로토타입에서 배양된 세포. 대조군, 6웰 플레이트에서 배양된 세포.
도 9는 세포 배양 시스템 및 6웰 플레이트에서 세포 배양 11일 동안 배양 배지 내 포도당 농도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 개시내용의 또 다른 실시양태에 따른 세포 배양 시스템의 개략도이다.
본원에 사용된 바와 같이, "시험관내 육류 생산"은 동물 및/또는 식물의 조직을 육류 및 육류 제품을 제조하는 세포 배양 기술을 사용하여 실험실에서 성장시키는 세포 기반 육류 생산 공정 또는 세포 기반 농업 공정을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "생물반응기", "세포 배양 유닛" 및 "세포/조직 배양 유닛"은 상호교환적으로 사용되고 시험관내 육류 생산을 위한 생물반응기를 지칭한다. 이제 도면을 참조로 하고 특히 도 1을 참조하면, 시험관내 육류 생산을 위한 방법(10)이 제시된다.
블록(12)에서, 동물 또는 식물로부터의 조직이 단리된다. 한 실시양태에서, 조직은 노란색 코커, 또는 그루퍼, 농어와 같은 해수 어류를 포함하는 경골어강(Osteichthyes) 클래스의 경골 어류로부터 유래된다. 다른 실시양태에서, 소 조직과 같은 다른 유형의 동물 조직이 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 블록(12)은 어류로부터 부레와 같은 기관 조직을 수집하는 단계, 및 세포 현탁액을 제조하는 단계를 수반할 수 있다. 다음 설명은 주로 어류 공급원에서 유래한 조직을 설명하지만, 다른 유형의 시험관내 육류 및/또는 동물성 단백질 제품, 및 채식주의자 육류 및/또는 단백질 제품을 제공하기 위해 다른 유형의 동물 공급원 및/또는 식물 공급원에서 유래되는 조직에 개념이 적용될 수 있음이 이해될 것이다.
단리된 세포 중 다수는 성체 세포이며, 의학 연구에서 확립된 다양한 방법을 사용하여 지속적으로 증식하도록 할 수 있다(블록 14). 예를 들어, 야마나카(Yamanaka) 인자와 같은 특정 유전자는 성체 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)와 같은 줄기 세포로 재프로그램하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 단리된 성체 세포는 텔로머라제 역전사효소 과잉발현에 의해 연속 세포주로 형질전환될 수 있다. 다른 실시양태에서, 성체 줄기 세포 및 배아 줄기 세포와 같은 다른 유형의 세포가 단리될 수 있다. 이와 관련하여, 본 개시내용의 방법은 세포주의 모든 공급원을 포함한다는 것이 이해될 것이다.
다음 블록(16)에서, 세포는 생물반응기와 같은 멸균 챔버 또는 용기에서 식품 등급의 생체적합성 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스에 부착/접착하여 어류 기관과 같은 동물 기관을 모방한 고체 또는 반고체 구조로 성장한다. 멸균 챔버 또는 용기는 온도 제어될 수 있고, 화학물질, 영양소, 및 세포와 같은 물질을 도입 및 제거하기 위한 입구 및 출구를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 블록(16)은 멸균 용기에서 항생제 또는 항미생물 화합물의 부재 하에 수행된다. 블록(18)은 세포 생존 및 성장을 지지하기 위해 생물반응기에 배양 배지를 공급하는 것을 수반한다. 배양 배지는 비제한적으로 무기 염(예를 들어, 염화칼슘(CaCl2), 염화칼륨(KCl), 염화나트륨(NaCl), 중탄산나트륨(NaHCO3), 인산이수소나트륨(NaH2PO4), 황산마그네슘(MgSO4) 등), 아미노산, 비타민(예를 들어, 티아민, 리보플라빈, 엽산 등) 및 기타 성분, 예컨대 포도당, β-머캅토에탄올, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 및 피루브산 나트륨과 같은 성분을 함유하는 완충 용액일 수 있다. 성장 배지의 비제한적인 예로는 Leibovitz의 L-15 배지, Eagle의 최소 필수 배지(MEM), Medium 199, Dulbecco의 Modified Eagle 배지(DMEM), Ham의 F12 영양소 혼합물, Ham의 F10 영양소 혼합물, MacCoy의 5A 배지, Glasgow Modified Eagle 배지(GMEM), Iscove의 Modified Dulbecco 배지, 및 RPMI 1640을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
블록(20)에 따르면, 식품 등급의 성장 인자 및 사이토카인은 세포 성장 및 증식을 지지하기 위해 생물반응기의 배양 배지에 도입된다. 성장 인자 및 사이토카인은 인슐린 성장 인자 1(IGF-1), 인슐린, 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 인터루킨 11(IL-11), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 표피 성장 인자(EGF), 및 트랜스페린을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 블록 (20)은 소태아혈청(FBS) 없이 생체조작된 세포를 단리된 세포와 공동 배양하는 것을 수반할 수 있다. 생체조작된 세포는 상기 성장 인자 및 사이토카인을 분비하고, 성장 및 증식에 필요한 경우 단리된 세포에 이러한 생체분자를 공급하도록 조작된다.
본원에 사용된 바와 같이, "생체조작된" 세포는 유전자 변형된 세포와 동등한 것이 아니다. 생체조작된 세포는 하나 이상의 특정 단백질을 과잉발현하는 특정 유전자를 갖는다. 생체조작된 세포는 어류 세포일 수 있고, 또는 소 세포와 같은 동물 세포의 다른 유형일 수 있다. 생체조작된 세포는 최종 육류 제품에 존재하지 않는다. 비제한적인 예로서, 생체조작된 어류 세포는 단리된 어류 세포와 공동 배양될 수 있거나, 생체조작된 소 세포는 단리된 소 세포와 공동 배양될 수 있다. 본 개시내용의 공동배양 방법은 배양 배지에 동물 유래 소 태아 혈청(FBS)에 대한 필요성을 없애준다. 또한, 공동배양 방법은 동일계내에서 성장하는 단리된 세포에 식품 등급의 특정 성장 인자 및 사이토카인의 지속적인 공급을 제공하고, 생산 공정을 단순화하고 비용을 절감한다. 그러나, 다른 실시양태에서, FBS 또는 다른 혈청은 블록 (16) 동안 세포 성장을 지지하기 위해 성장 인자, 사이토카인 및 기타 영양소를 공급하는 데 사용될 수 있다.
도 2를 살펴보면, 단리된 세포의 배양 및/또는 시험관내 육류 생산에 사용되는 예시적인 생물반응기(30)가 도시된다. 세포는 생물반응기(30)의 멸균 챔버(36)에 고정된 식품 등급 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스(34)에 의해 제공되는 고체 상 스캐폴드(32)에 부착하여 성장한다. 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스(34)는 육류 제품의 모양을 결정할 수 있다. 식품 등급 스캐폴드는 비제한적으로 아가로스, 알기네이트, 키토산, 균사체 및 곤약 글루코만난과 같은 식물 기반 또는 진균 기반의 물질로 만들어질 수 있다. 고체 상 스캐폴드(32)는 세포가 스캐폴드(32)의 내부 표면에 부착하여 성장할 수 있도록 다공성일 수 있다. 세포에 영양소를 공급하는 배양 배지는 입구(38)를 통해 생물반응기(30)로 도입되고, 출구(40)를 통해 생물반응기(30)로부터 비워진다.
도 3은 도 2의 생물반응기(30)와 유사한 생물반응기(50)를 보여주지만, 미세 메쉬(54)에 의해 고체 상 스캐폴드(32)와 분리된 제2 고체 상(52)을 추가로 포함한다. 제2 고체 상(52)은 동일계내 고체 상 지지체(32) 상에서 성장하는 세포에 대한 영양소, 성장 인자, 및 사이토카인을 분비하는 생체조작된 세포를 함유하거나 지지할 수 있고, 생체조작된 세포를 고체 상 지지체(32) 상의 세포와 물리적으로 분리할 수 있다. 제2 고체 상(52)은 고체 상 지지체(32)와 유사하게 식물 기반 물질로 만들어진다. 메쉬(54)는 영양소, 성장 인자, 및 사이토카인에 대해 투과성이되, 세포에 대해서는 비투과성이다. 도 3의 생물반응기(50)는 성장 세포와 생체조작된 세포의 공동 배양을 허용한다. 일부 실시양태에서, 도 2 및 도 3의 생물반응기(30) 및 (50)은 직렬로 배열될 수 있다. 다른 실시양태에서, 여러 개의 생물반응기(30), 여러 개의 생물반응기(50), 또는 생물반응기(30) 및 (50)의 혼합물이 공정의 규모 확대를 위해 직렬로 배열될 수 있다. 생물반응기(30)는 주로 바이오매스 생산을 위해 사용될 수 있는 반면, 생물반응기(50)는 성장하는 세포에 영양소, 성장 인자 및 사이토카인을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
도 4를 살펴보면, 예시적인 세포/조직 배양 시스템(100)은 세포 배양 유닛(102), 신선한 배지 유닛(104) 및 폐기물 제거 유닛(106)을 포함한다. 세포 배양 유닛(102)은 펌프(108a 및 108b)를 통해 신선한 배지 유닛(104)에 연결되어 제1 유체는 펌프(108a)를 통해 생물반응기(102)로부터 신선한 배지 유닛(104)으로 흐를 수 있고, 제1 유체는 펌프(108b)를 통해 신선한 배지 유닛(104)으로부터 생물반응기(102)로 흐를 수 있다. 이에 따라 제1 유체는 생물반응기(102)와 신선한 배지 유닛(104) 사이를 순환한다. 제1 유체의 순환을 위한 튜브와 펌프(108a 및 108b) 중 적어도 하나는 생물반응기(102) 내부에 영양소를 고르게 분배하는 유체 흐름을 생성하도록 구성된다. 이러한 유체 흐름은 세포/조직 배양 시스템(100)에 교반기 또는 진탕기의 부재 하에 달성된다.
신선한 배지 유닛(104)은 펌프(108c) 및 (108d)를 통해 폐기물 제거 유닛(106)에 추가로 연결되어 제2 유체는 펌프(108c)를 통해 신선한 배지 유닛(104)으로부터 폐기물 제거 유닛(106)으로 흐를 수 있고, 제2 유체는 폐기물 제거 유닛(106)으로부터 펌프(108d)를 통해 신선한 배지 유닛(104)으로 흐를 수 있다. 이에 따라, 제2 유체는 신선한 배지 유닛(104)과 폐기물 제거 유닛(106) 사이를 순환한다. 제1 유체는 FBS, 성장 인자 또는 사이토카인이 보충된 기본 배지를 포함할 수 있는 세포 배양 배지일 수 있다. 성장 인자 또는 사이토카인은 인슐린 성장 인자 1(IGF-1), 인슐린, 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 인터루킨 11(IL-11), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 표피 성장 인자(EGF), 및 트랜스페린을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 제2 유체는 비제한적으로 무기염(예를 들어, 염화칼슘(CaCl2), 염화칼륨(KCl), 염화나트륨(NaCl), 중탄산나트륨(NaHCO3), 인산이수소나트륨(NaH2PO4), 황산마그네슘(MgSO4) 등), 아미노산, 비타민(예를 들어, 티아민, 리보플라빈, 엽산 등), 및 기타 성분, 예컨대 포도당, 베타-머캅토에탄올, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 피루브산 나트륨과 같은 성분을 함유하는 완충 용액을 포함할 수 있는 신선한 기본 배지(투석물)일 수 있다. 성장 배지의 비제한적 예로는 Leibovitz의 L-15 배지, Eagle의 최소 필수 배지(MEM), Medium 199, Dulbecco의 Modified Eagle 배지(DMEM), Ham의 F12 영양소 혼합물, Ham의 F10 영양소 혼합물, MacCoy의 5A 배지, Glasgow Modified Eagle 배지(GMEM), Iscove의 Modified Dulbecco 배지 및 RPMI 1640을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
펌프(108)는 연동식 펌프 또는 임의의 다른 유사한 적합한 펌프일 수 있다.
세포/조직 배양 시스템(100)은 하나 이상의 용기를 포함한다. 각각의 생물반응기(102), 신선한 배지 유닛(104) 및 폐기물 제거 유닛(106)은 용기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포/조직 배양 시스템(100)은 하나보다 많은 생물반응기(102), 신선한 배지 유닛(104) 및 폐기물 제거 유닛(106)을 포함할 수 있다. 복수의 생물반응기(102)는 병렬 또는 직렬로 연결되어 서로 근접하게 배치될 수 있다. 복수의 신선한 배지 유닛(104)은 병렬 또는 직렬로 연결되어 서로 근접하게 배치될 수 있다. 복수의 폐기물 제거 유닛(106)은 병렬 또는 직렬로 연결되어 서로 근접하게 배치될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포/조직 배양 시스템(100)은 단일 신선한 배지 유닛(104) 및 폐기물 제거 유닛(106)과 병렬로 연결된 하나보다 많은 생물반응기(102)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물반응기(102)의 크기 또는 부피는 다양할 수 있다. 이와 같이, 세포/조직 배양 시스템(100)의 생산은 쉽게 규모 확대 및 축소될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포/조직 배양 시스템(100)은 생물반응기(102)의 세포에 기체를 공급하도록 구성된 기체 공급원을 추가로 포함할 수 있다. 기체 공급원은 질소, 산소, 이산화탄소 또는 기체 혼합물일 수 있다.
생물반응기(102)는 세포가 고체 또는 반고체 구조의 조직으로 성장할 수 있도록 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스 및 배양 배지를 수용하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 세포는 생물반응기(102)의 내부로 식품 등급 생체적합성 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스에 부착/접착함으로써 어류 기관과 같은 동물 기관을 모방한 고체 또는 반고체 구조로 성장한다. 생물반응기(102)는 적어도 하나의 세포 유형을 함유하도록 구성될 수 있다. 적합한 세포 유형으로는 뼈, 연골, 근육, 간, 피부, 심장, 폐 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 유형의 포유동물 세포 또는 어류 세포가 본 발명 내에서 사용될 수 있다. 다른 식물 및 동물 종의 세포가 사용될 수 있다. 다른 스타터 세포는 중간엽 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 및 위성 세포와 같은 다양한 기원의 줄기 세포일 수 있다. 스타터 세포는 유전자 변형 세포 또는 임의의 세포주일 수도 있다. 생체조작된 세포도 사용될 수 있다.
생물반응기(102)에서 확장될 상이한 유형의 특수 세포는 살아있는 동물로부터 생검에 의해 수득될 수 있다.
생물반응기(102)는 펌프(108b)를 통해 신선한 배지 유닛(104)으로부터 제1 유체를 수용하도록 구성된 입구 및 펌프(108a)를 통해 신선한 배지 유닛(104)으로 제1 유체를 제거/방출하도록 구성된 출구를 추가로 포함할 수 있다. 생물반응기(102)는 생물반응기(102)의 내부를 소정의 온도로 가열하도록 구성된 가열 장치 및 생물반응기(102) 내의 온도를 그러한 소정의 온도로 유지하기 위한 온도 제어 유닛을 추가로 포함할 수 있다. 소정의 온도는 대략 25℃ 내지 45℃ 범위일 수 있다.
생물반응기(102)는 생물반응기(102) 내의 제1 유체를 소정의 속도로 교반하도록 구성된 적어도 하나의 교반기를 추가로 포함할 수 있다. 소정의 속도는 대략 분당 10회전(rpm)에서 300rpm까지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물반응기(102)에 연결된 펌프 및 튜브는 생물반응기(102) 내부에 영양소를 고르게 분배하는 유체 흐름을 생성하도록 구성된다. 이러한 유체 흐름은 세포/조직 배양 시스템(200)에서 교반기 또는 진탕기의 부재 하에 달성된다.
생물반응기(102)는 질소, 산소, 이산화탄소 또는 기체 혼합물일 수 있는, 기체 공급원에 연결된 기체 출구 및 기체 입구를 추가로 포함할 수 있다. 기체는 세포 배양 조건을 최적화하기 위해 기체 입구를 통해 생물반응기(102)에 공급될 수 있다. 폐기체(wasted gas)는 기체 출구를 통해 방출될 수 있다. 기체의 흐름은 밸브에 의해 제어될 수 있다.
일부 실시형태에서, 생물반응기(102)는 도 2에 도시된 바와 같은 생물반응기(30)일 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 생물반응기(102)는 도 3에 도시된 생물반응기(50)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물반응기(102)는 용기이다. 일부 실시양태에서, 생물반응기(102)는 임의의 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물반응기(102)의 부피는 0.1L 내지 2000L 범위일 수 있다.
도 5를 살펴보면, 신선한 배지 유닛(104)은 펌프(108a) 및 펌프(108b)에 각각 연결되도록 구성된 제1 유체 배지 입구(110) 및 제1 유체 출구(112)를 포함할 수 있다. 또한, 신선한 배지 유닛(104)은 각각 펌프(108d) 및 펌프(108c)에 연결되도록 구성된 제2 유체 입구(114) 및 제2 유체 출구(116)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 신선한 배지 유닛(104)은 제1 투석막(123)에 의해 분리된 제1 유체 구획(120) 및 제2 유체 구획(122)을 갖는 적어도 하나의 제1 투석 유닛(118)을 포함할 수 있다. 제1 유체 입구(110) 및 제1 유체 출구(112)는 제1 유체 구획(120)에 연결된다. 제2 유체 입구(114) 및 제2 유체 출구(116)는 제2 유체 구획(122)에 연결된다. 셀룰로스 에스테르(CE), 재생 셀룰로스(RC) 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF)를 포함하는 상이한 유형의 투석막(123)이 사용될 수 있다. 상이한 분자량 컷오프(MWCO)의 투석막(123)은 제1 유체(예를 들어, 배양 용기의 세포에 의해 분비된 성장 인자)에 원하는 거대분자를 보유하고 제1 투석 유닛(118)의 제1 유체로부터 폐기물이 제거되도록 하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 거대분자는 또한 제1 유체에 상이한 종류의 단백질 및 다른 거대분자(둘 다 적어도 100Da를 가짐), 예를 들어 인지질(레시틴, 세라마이드), 지질(DHA, AHA), 다당류(글리코겐), 프로테오글리칸(헤파린, 콘드로이틴), 핵산(DNA, RNA), 인슐린 유사 성장 인자(IGF, 재조합 형태의 경우 7.5kDa) 및 형질전환 성장 인자-베타(TGF 베타, 프로 TGF-베타의 경우 44kDa)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 100Da - 1,000,000Da MWCO 막, 바람직하게는 500 Da MWCO 막은 제1 유체에 인슐린 유사 성장 인자(IGF, 재조합 형태의 경우 7.5kDa) 및 형질전환 성장 인자-베타(TGF 베타, 프로 TGF-베타의 경우 44kDa)를 보유하고 젖산염(89 Da) 및 암모니아(17 Da)는 제1 유체로부터 제거되도록 하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 막은 또한 포도당(180 Da)과 같은 제2 유체의 영양소가 막을 따라 보충용 제1 유체 내로 들어갈 수 있도록 하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투석 유닛(118)은 반투과성 중공 섬유를 함유하는 중공 섬유 카트리지의 형태일 수 있다.
신선한 배지 유닛(104)은 투석 유닛 내의 유체를 소정의 속도로 교반하도록 구성된 구획 중 하나 또는 둘 다에 적어도 하나의 교반기를 포함할 수 있다. 소정의 속도는 대략 10rpm 내지 500rpm일 수 있다.
신선한 배지 유닛(104)은 원하는 유체를 첨가, 보충 및 제거하기 위해 구획 중 하나 또는 둘 다에 연결된 분리된 입구 및 출구를 추가로 포함할 수 있다. 원하는 유체는 세포 배양 배지, 신선한 기본 배지 및/또는 분화 배지(모두 생물반응기(102)의 세포를 위한 영양소를 함유함)일 수 있다.
도 6을 살펴보면, 폐기물 제거 유닛(106)은 펌프(108c) 및 펌프(108d)에 각각 연결되도록 구성된 폐기물 입구(124) 및 재생 출구(126)를 포함할 수 있다. 또한, 폐기물 제거 유닛(106)은 폐기물 제거 입구(128) 및 폐기물 제거 출구(130)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 폐기물 제거 유닛(106)은 제2 투석 막(137)에 의해 분리된 폐기물 구획(134) 및 폐기물 제거 구획(136)을 갖는 적어도 하나의 제2 투석 유닛(132)을 포함할 수 있다. 폐기물 입구(124)와 신선한 배지 출구(116)는 폐기물 구획(134)에 연결된다. 폐기물 제거 입구(128)와 폐기물 출구(130)는 폐기물 제거 구획(136)에 연결된다. 일부 실시양태에서, 투석 유닛(132)은 반투과성 중공 섬유를 함유하는 중공 섬유 카트리지의 형태일 수 있다. 폐기물 제거 유닛(106)은 제2 유체로부터 폐기물을 제거하기 위해 다른 폐기물 제거 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 제2 유체를 흡착제인 제올라이트에 통과시켜 폐기물 제거를 수행할 수 있다. 제올라이트는 미세다공성 알루미노실리케이트 광물이다. 예로는 아날심(analcime), 차바자이트(chabazite), 클리노프틸로라이트(clinoptilolite), 휴란다이트(heulandite), 나트롤라이트(natrolite), 필립사이트(phillipsite) 및 스틸바이트(stilbite)가 있다. 폐기물 제거 유닛(106)은 충전층 제올라이트의 컬럼을 포함할 수 있다. 제2 유체는 한쪽 끝에서 폐기물 제거 유닛(106)으로 흘러들어가고, 제올라이트를 통과하고, 다른 쪽 끝에서 폐기물 제거 유닛(106)을 빠져나간다. 제올라이트는 독성 화학물질 또는 제2 유체에서 세포 성장을 저해하는 화학물질, 예를 들어 암모니아 및 젖산염을 흡수한다.
폐기물 제거 유닛(106)은 제2 유체에서 암모니아 및 젖산염과 같은 대사성 폐기물을 제거하고 폐기물 배지에 포도당과 같은 영양소의 최대량을 보유하도록 구성된다. 100Da - 1,000,000Da MWCO, 바람직하게는 100Da MWCO의 투석막을 사용하여 암모니아 및 젖산염은 투석물로 들어가도록 하고, 포도당은 제2 유체에 보유되도록 할 수 있다. 폐기물 제거 구획(136)에 들어가는 투석물은 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 임의의 다른 가능한 완충액일 수 있다.
일부 실시양태에서, 생물반응기(102), 신선한 배지 유닛(104) 및 폐기물 제거 유닛(106) 각각은 제거 가능한 플러그인 모듈일 수 있다. 즉, 생물반응기(102), 신선한 배지 유닛(104) 및 폐기물 제거 유닛(106) 각각은 세포/조직 배양 시스템(100)에 탈착가능하게 연결된다. 전술한 유닛들의 각각의 입구 및 출구는 세포/조직 배양 시스템(100)의 펌프의 입구 및 출구와 연결 및/또는 분리될 수 있다. 예를 들어, 신선한 배지 유닛(104) 또는 폐기물 제거 유닛(106)은 시스템에서 플러그를 뽑고 새로운 유닛을 세포/조직 배양 시스템(100)에 꽂음으로써 신속하게 교체될 수 있다. 본 실시양태는 유닛 중 하나가 오작동하는 경우 비가동 시간을 줄일 수 있다. 또한, 각 유닛은 세포/조직 배양 시스템(100)에서 분리될 수 있고 독립적인 사용을 위해 자체적으로 작동할 수 있다.
이제, 세포/조직 배양 시스템(100)을 활용하여 세포 배양 및 조직을 성장시키는 방법을 살펴보자. 본원에 기술된 방법은 피부, 근육, 지방조직 및 뼈 세포와 같은 세포 및 조직을 배양하여 배양육을 생산하는 데 사용될 수 있다. 이 방법은 생물반응기(102)를 갖는 세포/조직 배양 시스템(100)을 제공하는 단계, 배양된 배지를 대사 폐기물 또는 성장 저해제와 함께 신선한 배지 유닛(104)의 제1 투석 유닛(118)으로 전달하는 단계, 배양된 배지에 영양소를 보충하고 신선한 배지 유닛(104)의 제1 투석 유닛(118)에서 배양된 배지로부터 성장 저해제를 제거하는 단계, 대사 폐기물 또는 성장 저해제가 있는 기본 배지를 신선한 배지 유닛(104)의 제1 투석 유닛(118)으로부터 폐기물 제거 유닛(106)으로 전달하는 단계, 및 폐기물 제거 유닛(106)의 기본 배지로부터 성장 저해제 및 대사 폐기물을 제거하는 단계를 포함한다. 이와 같이, 생물반응기(102) 내 대사 폐기물 및 성장 저해제는 제거되고, 영양소는 제1 투석 유닛(118)을 통해 생물반응기(102) 내 세포에 보충된다.
적어도 하나의 세포 유형은 생물반응기(102)에 첨가된다. 적합한 세포 유형으로는 뼈, 연골, 근육, 간, 피부, 심장, 폐 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 유형의 포유동물 세포 또는 어류 세포가 본 발명 내에서 사용될 수 있다. 다른 식물 및 동물 종의 세포가 사용될 수 있다.
배양 용기에서 확장될 상이한 유형의 특수 세포는 살아있는 동물로부터 생검에 의해 수득될 수 있다. 다른 스타터 세포는 중간엽 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 및 위성 세포와 같은 다양한 기원의 줄기 세포일 수 있다. 스타터 세포는 유전자 변형 세포 또는 임의의 세포주일 수도 있다.
세포는 멸균 챔버 또는 용기, 예컨대 생물반응기(102)에서 식품 등급의 생체적합성 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스에 부착/접착함으로써 어류 기관과 같은 동물 기관을 모방한 고체 또는 반고체 구조의 조직으로 성장한다. 일부 실시양태에서, 생물반응기(102)는 조직 배양 홀더를 포함하고, 이는 세포 성장을 수용하는 식품 등급 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스의 층을 고정하도록 구성될 수 있다. 성장하는 세포는 소정의 조건 하에서 세포외 매트릭스를 침착하도록 지시될 수 있다. 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스는 세포에게 3차원 구조를 제공하여 조직을 발달 및 형성하도록 한다. 세포 배양 홀더는 복수의 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스 홀더를 가질 수 있으며, 각 홀더는 적어도 하나의 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스를 수용하고 고정하도록 구성될 수 있다. 이는 또한 홀더에서 적층될 수 있는 상이한 두께로 복수의 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스를 수용하고 고정할 수도 있다. 조직 배양 홀더는 생물반응기(102)의 유체가 모든 측면에서 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스 상의 세포와 상호작용할 수 있도록 유체 투과성 구조를 추가로 포함할 수 있다. 조직 배양 홀더는 관련 기술분야에 알려진 일반적인 멸균 방법, 예를 들어 소독제, 자외선 및 오토클레이브에 의해 손상되지 않는 물질로 만들어질 수 있다. 이러한 물질은, 예를 들어 스테인레스 스틸, 유리 또는 고온 저항성 수지일 수 있다. 하나보다 많은 조직 배양 홀더는 생물반응기(102)의 멸균 챔버에 고정될 수 있어, 생산 요구에 따라 쉽게 규모 확대될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 배양 홀더는 지지 트레이 또는 다공성 플레이트일 수 있으며, 이러한 트레이 또는 플레이트는 배지 흐름을 허용하는 적어도 하나의 다공성을 포함한다.
조직 배양 홀더는 발달하는 조직이 직접 관류되지 않고 영양소는 확산에 의해 전달되기 때문에 세포에 작용하는 전단 응력을 감소시키기 위해 조직 배양 홀더에서 배양 배지의 흐름을 최소화하면서 세포와 배양 배지 간의 영양소 및 폐기물의 교환을 최적화하도록 구성된다. 과도한 전단 응력은 세포를 사멸시킬 수 있고, 이는 낮은 수율을 초래한다. 조직 배양 홀더는 추가로 조직 배양 홀더에서의 위치를 고착시키기 위해 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스를 고정하는 홀더를 추가로 포함한다. 조직 배양 홀더는 배양 배지가 흐를 때 진동이 최소화되도록 최적화된다. 이는 세포가 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스에 확고하게 부착되는 것을 도와, 수율을 향상시킨다.
또 다른 일부 실시양태에서, 생물반응기(102)는 배양 홀더, 식품 등급의 스캐폴드 및 세포외 매트릭스를 포함하지 않는다. 생물반응기(102)의 세포는 생물반응기(102)에서 현탁액으로 배양될 수 있다. 생물반응기(102)는 세포에 작용하는 전단 응력을 저하시키기 위해 생물반응기(102)에서 전단 응력을 제어하도록 추가로 구성될 수 있다. 또한, 생물반응기(102)는 세포가 이 위에서 증식할 수 있도록 하는 미세담체(microcarrier)를 포함할 수 있다.
생물반응기(102)의 온도는 제어되고, 배양 배지는 생물반응기(102) 내로 이의 입구에서 도입되고, 화학물질, 영양소, 성장 저해제 및 세포와 같은 물질을 제거하기 위해 생물반응기(102) 출구로부터 방출된다. 식품 등급의 생체적합성 스캐폴드는 최종 식용 가능한 제품의 일부가 된다.
소태아혈청(FBS) 보충물 또는 재조합 공급원으로부터의 성장 인자, 식물 가수분해물, 식물 추출물 및 사이토카인은 생물반응기의 배양 배지에 도입되어 세포 성장 및 증식을 지지한다. 성장 인자 및 사이토카인은 인슐린 성장 인자 1(IGF-1), 인슐린, 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 인터루킨 11(IL-11), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 표피 성장 인자(EGF), 및 트랜스페린을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 적용예는 FBS의 부재 하에 생물반응기(102)에서 배양된 세포와 생체조작된 세포를 공동 배양하는 것을 수반할 수 있다. 생체조작된 세포는 상기 성장 인자 및 사이토카인을 분비하도록 조작되고, 이들 생체분자를 성장 및 증식에 필요한 경우 배양된 세포에 공급한다. 본 개시내용의 공동 배양 방법은 배양 배지에서 동물-유래 소태아혈청(FBS)의 필요성을 없앤다. 더욱이, 공동 배양 방법은 동일계 내에서 성장하는 단리된 세포에 식품 등급의 특정 성장 인자 및 사이토카인의 연속적인 공급을 제공하고 생산 공정을 단순화하여 비용을 절감시킨다. 하지만, 다른 실시양태에서, 재조합 공급원으로부터의 FBS, 다른 혈청 또는 단백질이 사용되어 세포 성장을 지지하는 성장 인자, 사이토카인, 및 다른 영양소를 공급할 수 있다.
일부 실시양태에서, 기체는 세포 배양 조건을 최적화하기 위해 도입될 수 있다. 질소, 산소, 이산화탄소 또는 기체 혼합물이 사용될 수 있다. 생물반응기(102)는 0-10%의 이산화탄소를 함유할 수 있다. 생물반응기(102)는 15-30%의 산소를 함유할 수 있다. 생물반응기(102)는 60-85%의 질소를 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 온도는 세포 배양 조건을 최적화하도록 제어될 수 있다. 상이한 유형의 세포는 최적의 배양 온도가 상이할 수 있다. 온도는 25 내지 45℃ 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 생물반응기(102)의 배양 배지는 교반된다. 세포가 전단 응력에 다르게 반응하는 것으로 알려져 있으므로 배양 용기의 교반 속도는 세포의 확장을 향상시키도록 최적화될 수 있다. 교반 속도는 또한 생물반응기(102) 내부의 배양 배지와 유입 배양 배지의 혼합을 향상시키도록 최적화될 수 있다. 교반 속도는 10rpm - 300rpm 범위일 수 있다.
펌프(108a)는 배양 배지를 생물반응기(102)로부터 신선한 배지 유닛(104)의 제1 투석 유닛(118)으로 전달할 수 있다.
제1 투석 유닛(118)에는 CE, RC 또는 PVDF를 포함하는 상이한 유형의 투석막이 사용될 수 있다. 상이한 분자량 컷오프(MWCO)의 투석막을 사용하여 배양 배지(즉, 이 특정 실시양태에서는 제1 유체)(예를 들어, 배양 용기 내 세포에 의해 분비되는 성장 인자)에 원하는 거대분자를 보유하고 폐기물이 제1 투석 유닛(118)에서 배양 배지로부터 제거되도록 할 수 있다. 예를 들어, 100Da-1,000,000Da MWCO 막, 바람직하게는 500 Da MWCO 막은 인슐린 유사 성장 인자(IGF, 재조합 형태의 경우 7.5kDa) 및 형질전환 성장 인자-베타(TGF 베타, 프로 TGF-베타의 경우 44kDa)를 배양 배지에 보유하고 젖산염(89 Da)과 암모니아(17 Da)가 배양 배지로부터 제거되도록 하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 막은 또한 포도당(180Da)과 같은 신선한 기본 배지/투석물(즉, 이 특정 실시양태에서는 제2 유체)의 영양소가 보충을 위해 막을 통과하여 배양 배지로 들어갈 수 있도록 하는 데 사용될 수 있다.
제2 유체 구획(122)에는 신선한 기본 배지가 채워지는 반면, 제1 유체 구획(120)에는 배양 배지가 채워져 투석이 수행된다. 예를 들어, 젖산염, 암모니아 및 기타 폐기물은 배양 배지로부터 제1 투석막(123)을 통해 신선한 기본 배지로 전달되고, 포도당 및 기타 성장-향상 화합물은 신선한 기본 배지로부터 제1 투석 막(123)을 통해 배양 배지로 전달된다. 투석 속도는 신선한 기본 배지의 부피, 투석막 내에 함유된 배양 배지의 부피, 막 표면적, 온도 및 투석 유닛에서의 교반에 의한 진탕을 변화시켜 제어할 수 있다. 투석 유닛에서 배양 배지의 영양소 보충 및 폐기물 제거 속도는 생물반응기(102)로부터 제1 투석 유닛(118)의 제1 유체 구획(120)으로의 유체 유입을 위해 1 ml/분 - 10 L/분 범위의 펌핑 속도를 변화시킴으로써 제어될 수도 있다.
대사 폐기물 또는 성장 저해제는 배양 배지로부터 제1 투석 유닛(118) 내부의 신선한 기본 배지로 이동한다. 성장 저해제는 시간이 지남에 따라 신선한 기본 배지에 축적된다. 성장 저해제(젖산염, 암모니아를 포함하되 이에 제한되지 않음)가 축적된 기본 배지는 본원에서 폐배지라고 지칭된다. 폐배지는 펌프(108c)에 의해 폐기물 제거 유닛(106)으로 전달될 수 있다. 폐배지 내 암모니아 및 젖산염과 같은 대사 폐기물은 폐기물 제거 유닛(106)의 제2 투석 유닛(132)에서 투석 원리를 이용하여 제거할 수 있다. 폐기물 제거 방법은 폐배지에 포도당과 같은 영양소의 최대량이 보유되도록 해야 한다. 폐배지에 포도당이 보유된 투석물 내로 암모니아 및 젖산염이 들어갈 수 있도록 하기 위해 100Da - 1,000,000Da WMCO 막, 바람직하게는 100Da MWCO 막의 투석막이 사용될 수 있다. 투석물은 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 임의의 다른 가능한 완충액일 수 있다. 투석 속도는 투석물의 부피, 투석막(137) 내에 함유된 폐배지의 부피, 막 표면적, 온도 및 투석 유닛(132)에서 교반에 의한 진탕을 변화시켜 제어할 수 있다. 교반 속도는 10 rpm - 500 rpm 범위일 수 있다. 폐기물 제거 유닛(106)에서의 폐기물 제거 속도는 또한 신선한 배지 유닛(104)의 제1 투석 유닛(118)으로부터 폐기물 제거 유닛(106)으로의 유체 유입을 위한 펌핑 속도를 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 투석에 의해 깨끗해진 폐배지는 신선 배지 유닛(104)의 제1 투석 유닛(118)으로 다시 전달될 수 있다. 펌핑 속도는 1 ml/분 - 10 L/분 범위일 수 있다.
신선한 기본 배지 유닛(104) 및 폐배지 유닛(106)으로부터 세포/조직 배양물의 분리는 생물반응기(102)가 생산 전반에 걸쳐 안전하게 폐쇄된 상태로 유지될 수 있도록 한다. 임의의 유닛의 오염은 영향을 받은 유닛에만 국한될 것이며 다른 유닛에는 영향을 미치지 않을 것이다.
또한, 폐기물 제거 유닛(106)은 제2 유체로부터 이러한 폐기물을 추출함으로써 전체 세포/조직 배양 시스템(100)으로부터 대사 폐기물을 집중화, 추출 및/또는 수집하는 데 도움을 준다. 그러면, 전체 세포/조직 배양 시스템(100)의 폐기물은 쉽게 수집 및 배출될 수 있다. 이는 기존 세포 배양 기술에 비해 배출되는 폐기물 및 세포 배양의 전체 운영 비용을 감소시킨다. 배경기술 섹션에서 논의된 바와 같이, 기존의 세포 배양 기술은 영양소 및 폐기물을 모두 함유하는 소모된 배양 배지를 폐기하고 이를 새로운 배양 배지로 교체한다. 따라서, 기존 방법에서 생성된 폐기물(즉, 소모된 배양 배지)의 양/부피는 본 발명에서 생성된 폐기물의 양/부피보다 많다.
그러나, 신선한 배지 유닛(104) 및 폐기물 제거 유닛(106)은 운영 비용을 낮추고 성장하는 세포 배양물을 위한 배지 사용을 최적화하는 데 도움을 준다. 세포 배양 배지는 고가의 FBS, 성장 인자 또는 사이토카인을 함유하고 있으므로, 세포 배양 배지는 일반적으로 기본 배지보다 가격이 더 비싸다. 신선한 배지 유닛(104)의 도움으로, 세포 배양 배지는 조기에 폐기할 필요가 없고 재생될 수 있다(즉, 폐기물을 제거하고 기본 배지로부터 영양소를 수득함).
피부, 뼈, 연골, 심장 및 간을 포함하지만 이에 제한되지 않는 상이한 유형의 세포는 적합한 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스에서 배양되어 생물반응기(102)에서 조직을 형성할 수 있다. 중간엽 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 및 위성 세포와 같은 다양한 기원의 줄기 세포도 조직 공학 적용예에 적합한 스캐폴드에서 배양될 수 있다. 기능적으로 조작된 조직을 형성하기 위해 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스에서 줄기 세포를 확장한 후 후속 분화를 위해 제1 투석 유닛(118) 또는 제2 투석 유닛(132)의 기본 배지에 분화 배지의 성분을 첨가할 수 있다. 예를 들어, 덱사메타손, 아스코르브산 및 β-글리세로포스페이트와 같은 골유도 배지 성분은 스캐폴드 내 줄기 세포의 골형성 분화를 위한 기본 배지에 첨가될 수 있다. 100Da - 1,000,000Da MWCO, 바람직하게는 500Da MWCO일 수 있는 제1 투석막(123)은 골유도 배지의 성분이 배양 배지 내로 들어갈 수 있도록 선택되어야 한다.
대안적으로, 줄기 세포는 2D 배양 표면 또는 생물반응기(102)의 미세담체 상에서 확장될 수 있다. 줄기 세포는 재생 의학 적용예를 위한 고밀도 세포 현탁액을 수득하기 위해 확장되고 트립신 처리될 수 있다. 예를 들어, 인간 중간엽 줄기 세포는 환자로부터 단리되어 배양 접시 또는 생물반응기(102)의 미세담체에서 확장될 수 있다. 융합 시 세포는 고밀도 세포 현탁액을 형성하도록 트립신 처리된다. 그런 다음 세포 현탁액은 치유하기 위한 환자의 상처 부위에 주입된다.
실시예 1
HEK293 세포의 배양물을 PBS로 세척하고 트립신 처리하여 세포 밀도가 2.5e6 세포/ml인 세포 현탁액을 형성했다. 2.5e6 세포/ml 현탁액으로부터의 200 μl 세포 현탁액을 사전-절단된 사각형 콜라겐 기반 스캐폴드(1 cm x 1 cm)에 로딩하여 총 세포 수가 5e5 세포인 조직 구조물을 만들었다. 조직 구조물을 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션했다. 800 μl 배지를 각 웰의 측면을 따라 부드럽게 첨가했다. 그런 다음 조직 구조물을 세포 배양 유닛(102)의 생물반응기 및 대조용 6웰 배양 플레이트로 전달했다. 0일, 4일, 11일째, 스캐폴드 내부의 세포 이미지를 명시야 현미경으로 포착했다. 0, 4, 11일째, 생존/사멸 염색을 다음 프로토콜에 따라 수행했다. 0일, 4일, 11일째, 포도당 측정을 위해 조직 배양병, 대조군 및 투석 유닛으로부터의 배지를 수집했다.
스캐폴드 내 세포의 생존/사멸 염색
1. Calcein AM 및 Ethidium 동종이량체-1(Thermo Fisher의 생존/사멸 키트)을 DPBS에 1:1000으로 첨가하여 염색 시약을 수득했다.
2. 샘플을 DPBS로 1회 세척했다.
3. 샘플을 200-250μl 염색 시약에서 30분 동안 염색했다.
4. 샘플을 DPBS로 1회 세척하고 형광 현미경 하에 가시화했다.
결과
관찰 가능한 미세조직이 생물반응기에서는 형성되었으나 대조군에서는 형성되지 않았다.
도 7a-c는 생물반응기 프로토타입 및 대조군에서 조직 구조물의 성장 및 세포 생존력을 보여준다. 생물반응기 행은 작동하는 세포 배양 시스템 프로토타입에서 배양된 세포를 보여준다. 대조군 행은 6웰 플레이트에서 배양된 세포를 보여준다. 0일째, 도 7a에 도시된 바와 같이 세포는 세포 응집체로서 스캐폴드에 부착되었다. 4일째, 세포 응집체는 도 7b에 도시된 바와 같이 생물반응기에서 더 큰 회전타원체로 성장했다. 11일째, 생물반응기에서 회전타원체는 함께 뭉쳐져 미세조직을 형성한 반면, 대조군의 회전타원체는 도 7c에 도시된 바와 같이 뚜렷한 성장이 없는 것으로 보였다. 생존/사멸 염색은 생물반응기의 미세조직이 생존 가능한 회전타원체를 연결하여 형성됨을 보여주었고 이는 대조군에서보다 훨씬 더 컸다.
도 8은 11일째에 형성된 미세조직을 보여준다. 생물반응기에서, 관찰 가능한 미세조직 덩어리가 스캐폴드에 형성되었고, 이러한 미세조직은 대조군에서는 관찰되지 않았다. 스캐폴드를 분해하기 위한 트립신 처리 후, 미세조직은 방출되었으며, 놀랍게도 생물반응기의 미세 조직은 대조군의 미세조직보다 부피가 훨씬 더 컸다.
도 9는 생물반응기의 세포 배양 유닛(102)의 배양 용기 내에서 포도당 수준이 유지되었음을 보여준다.
0일째, 본 발명의 배양 용기 세포 배양 유닛(102) 내 포도당 농도 = 18.8 mmol/L이다. 대조용 배양 플레이트의 포도당 농도 = 18.7 mmol/L이다. 제1 투석 유닛(118)의 포도당 농도 = 20.9 mmol/L이다.
4일째, 본 발명의 배양용기 세포 배양 유닛(102) 내 포도당 농도 = 19.1 mmol/L이다. 대조용 배양 플레이트의 포도당 농도 = 4.9 mmol/L이다. 제1 투석 유닛(118)의 포도당 농도 = 20.0 mmol/L이다.
11일째, 본 발명의 배양용기 세포 배양 유닛(102) 내 포도당 농도 = 10.4 mmol/L이다. 대조용 배양 플레이트의 포도당 농도 = 검출할 수 없음. 제1 투석 유닛(118) 내 포도당 농도 = 12.5 mmol/L이다.
도 10을 살펴보면, 본 발명의 또 다른 실시양태에 따른 예시적인 세포/조직 배양 시스템(200)은 생물반응기(202), 신선한 배지 유닛(204), 폐기물 제거 유닛(206), 복수의 펌프(208) 및 투석 유닛(210)을 포함한다. 생물반응기(202) 및 신선한 배지 유닛(204)은 각각 배기 또는 샘플링 목적을 위해 무균 커넥터에 연결된 포트(212a/212b)를 추가로 포함할 수 있다. 적어도 하나의 세포 배양 유닛(214)은 생물반응기(202) 내에 추가로 배치될 수 있다. 세포 배양 시스템(200)은 제1 순환(216) 및 제2 순환(218)을 추가로 포함한다.
제1 유체 순환(216)은 생물반응기(202), 제1 펌프(208a) 및 투석 유닛(210)을 연결한다. 제1 순환(216)은 생물반응기(202)와 투석 유닛(210) 사이에 제1 유체를 순환시키도록 구성된다. 제1 순환(216)의 제1 펌프(208a) 및/또는 튜브는 생물반응기(202) 내부에 영양소를 균일하게 분배하는 유체 흐름을 생성하도록 구성된다. 이러한 유체 흐름은 생물반응기(202)에서 교반기 또는 진탕기의 부재 하에 달성된다. 제1 유체는 FBS, 식물 가수분해물, 식물 추출물, 성장 인자 또는 사이토카인이 보충된 기본 배지를 포함할 수 있는 세포 배양 배지일 수 있다. 성장 인자 또는 사이토카인은 인슐린 성장 인자 1(IGF-1), 인슐린, 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 인터루킨 11(IL-11), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 표피성장인자(EGF), 및 트랜스페린을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
제2 유체 순환(218)은 신선한 배지 유닛(204), 투석 유닛(210), 제2 펌프(208b) 및 폐기물 제거 유닛(206)을 연결한다. 제2 순환(218)은 신선한 배지 유닛(204), 투석 유닛(210) 및 폐기물 제거 유닛(206) 간에 제2 유체가 순환하도록 구성된다. 제2 유체는 투석물이며, 이는 비제한적으로 무기 염(예를 들어, 염화칼슘(CaCl2), 염화칼륨(KCl), 염화나트륨(NaCl), 중탄산나트륨(NaHCO3), 인산이수소나트륨(NaH2PO4), 황산마그네슘(MgSO4) 등), 아미노산, 비타민(예를 들어, 티아민, 리보플라빈, 엽산 등), 및 기타 성분, 예컨대 포도당, 베타-머캅토에탄올, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 피루브산나트륨과 같은 성분을 함유하는 완충 용액을 포함할 수 있는 신선한 기본 배지일 수 있다.
세포/조직 배양 시스템(200)은 신선한 배지 유닛(204)에 유체 연결되는 적어도 하나의 기체 및/또는 액체 입구(224)를 갖는 적어도 하나의 질량 제어기(222) 및 적어도 하나의 센서(220)를 추가로 포함할 수 있다. 기체 및/또는 액체 입구(224)는 신선한 배지 유닛(204)의 내부로부터 기체 및/또는 액체를 흡입하도록 구성된다. 센서(220)는 온도, 포도당 수준, 글루타민 수준, 이산화탄소 수준, 암모니아 수준, 피루브산염 수준, 젖산염 수준, pH를 수득할 수 있다. 센서(220) 및 질량 제어기(222)는 통신 네트워크를 통해 컴퓨터 시스템(226)에 추가로 연결될 수 있다. 컴퓨터 시스템(226)은 센서(220)와 데이터를 교환하고, 사용자가 제어 어플리케이션쪽으로 지시하는 매개변수 및 센서(220)로부터 수득되는 데이터에 따라 질량 제어기(222) 및 펌프(208)를 제어할 수 있다. 컴퓨터 시스템(226)은 센서(220)의 판독값을 보여주는 디스플레이 유닛(228)에 추가로 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 생물반응기(202), 신선한 배지 유닛(204), 폐기물 제거 유닛(206) 및 투석 유닛(210)은 각각 제거 가능한 플러그인 모듈일 수 있다. 환언하면, 생물반응기(202), 신선한 배지 유닛(204), 폐기물 제거 유닛(206) 및 투석 유닛(210)은 각각 무균 커넥터를 통해 세포/조직 배양 시스템(200)에 탈착 가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 세포/조직 배양 시스템(200)은 하나보다 많은 생물반응기(202)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포/조직 배양 시스템(200)은 신선한 배지 유닛(204)과 폐기물 제거 유닛(206)의 단일 세트를 갖는 하나보다 많은 생물반응기(202)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물반응기(202)의 크기 또는 부피는 다양할 수 있다. 이와 같이, 세포/조직 배양 시스템(200)의 생산은 쉽게 규모 확대 및 축소될 수 있다.
세포/조직 배양 시스템(200)의 성분의 구체적인 세부사항은 이하에 제시된다.
생물반응기(202)는 신선한 배지 유닛(204) 및 폐기물 제거 유닛(206)과 물리적으로 분리된, 단리된 독립형 유닛이다. 생물반응기(202)는 이 생물반응기(202)가 제1 유체 순환(216)에 탈착 가능하게 연결될 수 있도록 무균 커넥터를 통해 제1 유체 순환(216)에 연결될 수 있다.
조직 배양 홀더(214)는 소정의 조건 하에 성장된 줄기 세포에 의해 생산되는 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스 상의 세포 성장을 수용하는 식품 등급의 스캐폴드를 고정하도록 구성될 수 있다. 세포는 3차원 환경 하에 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스에서 성장할 수 있고 조직 구조를 형성할 수 있다. 조직 배양 홀더(214)는 복수의 스캐폴드 홀더 또는 세포외 매트릭스 홀더를 가질 수 있고, 각 홀더는 적어도 하나의 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스를 수용하고 고정하도록 구성될 수 있다. 또한, 홀더에 적층될 수 있는 상이한 두께의 복수의 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스를 수용하고 고정할 수도 있다. 조직 배양 홀더(214)는 생물반응기(202) 내의 유체가 최소의 전단 응력으로 모든 측면에서 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스 상의 세포와 상호작용할 수 있도록 유체 투과성 구조를 추가로 포함할 수 있다. 조직 배양 홀더(214)는 관련 기술분야에 공지된 일반 멸균 방법, 예를 들어 소독제, 자외선 및 오토클레이브에 의해 손상되지 않을 물질로 제조될 수 있다. 이러한 물질은 예를 들어 스테인리스 스틸, 유리 또는 고온 저항성 수지일 수 있다. 하나보다 많은 조직 배양 홀더(214)가 세포 배양 유닛(202)의 멸균 챔버에 고정될 수 있어, 생산 요구에 따라 쉽게 규모 확대될 수 있다. 일부 실시양태의 경우, 조직 배양 홀더(214)는 지지 트레이 또는 다공성 플레이트일 수 있으며, 여기서 이러한 트레이 또는 플레이트는 배지 흐름을 허용하는 적어도 하나의 다공성을 포함한다.
조직 배양 홀더(214)는 발달하는 조직이 직접 관류되지 않고 영양소는 확산에 의해서만 전달되기 때문에, 세포에 작용하는 전단 응력을 감소시키기 위해 조직 배양 홀더(214)에서 배양 배지의 흐름을 유지하면서 세포와 배양 배지 사이의 영양소와 폐기물의 교환을 최적화하도록 구성된다. 과도한 전단 응력은 세포를 사멸시켜 수율을 저하시킬 수 있다. 조직 배양 홀더(214)는 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스를 조직 배양 홀더(214)에서의 위치를 고착시키기 위해 고정하는 홀더를 추가로 포함할 수 있다. 조직 배양 홀더(214)는 배양 배지가 그 주위로 이동할 때 진동이 최소화되도록 최적화된다. 이는 세포가 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스에 단단히 부착되도록 도와주어 수율을 향상시킨다.
또한 일부 실시양태에서, 생물반응기(202)는 배양 홀더(214), 식품 등급의 스캐폴드 및 세포외 매트릭스를 포함하지 않는다. 생물반응기(202)에서 세포는 현탁 상태일 수 있다. 생물반응기(202)는 세포에 작용하는 전단 응력을 낮추기 위해 생물반응기(202)의 전단 응력을 제어하도록 추가로 구성될 수 있다. 그러나, 생물반응기(202)는 미세담체를 포함하여 세포가 그 위에서 배양될 수도 있다.
제1 유체 순환(216)은 내부 유체가 생물반응기(202) 및/또는 투석 유닛(210)을 선택적으로 우회하게 하는 우회로를 포함할 수 있다. 이와 같이 생물반응기(202) 내의 조직/세포는 오작동이 있는 경우에 제1 유체 순환의 유체로의 오염으로부터 보호될 수 있다.
신선한 배지 유닛(204) 및 폐기물 제거 유닛(206)은 각각 무균 커넥터를 통해 제2 유체 순환(216)과 연결되어, 신선한 배지 유닛(204) 및 폐기물 제거 유닛(206)은 각각 제2 유체 순환(218)에 탈착 가능하게 연결될 수 있다.
제2 유체 순환(218)은 내부 유체가 신선한 배지 유닛(204), 폐기물 제거 유닛(206) 및/또는 투석 유닛(210)을 선택적으로 우회하도록 하기 위해 우회로를 포함할 수 있다. 이와 같이 생물반응기(202)의 조직/세포는 오작동이 있는 경우 제1 유체 순환의 유체로의 오염으로부터 보호될 수 있다.
일부 실시양태에서, 투석 유닛(210)은 제1 유체 순환(216)에 원하는 거대분자를 보유하고, 포도당(180 Da), 피루브산염, 아미노산, 비타민 및 미네랄과 같은 제2 유체 순환(218) 중 제2 유체의 영양소가 막(210a)을 따라 생물반응기(202)의 세포에 영양소를 보충하기 위한 제1 유체로 들어가도록 구성된 투석 막(210a)을 포함한다. 이와 같이, 투석막(210a)은 생물반응기(202)에 원하는 거대분자를 보유하도록 구성된다. 원하는 거대분자는 또한 제1 유체에 상이한 종류의 단백질 및 기타 거대분자(둘 다 적어도 100Da를 가짐), 예를 들어 인지질(레시틴, 세라마이드), 지질(DHA, AHA), 다당류(글리코겐), 프로테오글리칸(헤파린, 콘드로이틴), 핵산(DNA, RNA), 인슐린 유사 성장 인자(IGF, 재조합 형태의 경우 7.5kDa) 및 형질전환 성장 인자-베타(TGF 베타, 프로 TGF-베타의 경우 44kDa)를 포함할 수 있다.
셀룰로오스 에스테르(CE), 재생 셀룰로오스(RC) 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF)를 포함하는 상이한 유형의 투석막이 사용될 수 있다. 제1 유체에 원하는 거대분자(예를 들어, 배양 용기의 세포에 의해 분비된 성장 인자)를 보유하고 투석 유닛(210)에서 제1 유체로부터 폐기물이 제거되도록 하기 위해 상이한 분자량 컷오프(MWCO)의 투석막(210a)이 사용될 수 있다. 폐기물은 암모늄 또는 젖산염을 포함하는 성장 저해제일 수 있다. 암모늄 또는 젖산염 축적은 세포 성장 및 세포 생산성을 저해할 수 있는 것으로 관찰되었다. 투석막(210a)의 경우, 예를 들어 100Da - 1,000,000Da MWCO 막, 바람직하게는 500Da MWCO 막은 제1 유체에 인슐린 유사 성장 인자(IGF, 재조합 형태의 경우 7.5kDa) 및 형질전환 성장 인자-베타(TGF 베타, 프로 TGF-베타의 경우 44kDa)를 보유하고 제1 유체로부터 젖산염(89 Da) 및 암모니아(17 Da)가 제거되도록 하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 막은 또한 세포 증식 및/또는 분화를 최적화하도록 보충하기 위해 포도당(180 Da), 피루브산염, 아미노산, 비타민 및 미네랄과 같은 제2 유체의 영양소가 막을 따라 제1 유체 내로 들어갈 수 있도록 하는 데 사용될 수 있다. 막이 또한 제2 유체에 제올라이트, 질화 박테리아 및 효소를 보유하도록 구성된다는 것이 이하에 자세히 논의될 것이다. 또한 일부 실시양태에서, 투석 유닛(210)은 반투과성 중공 섬유를 함유하는 중공 섬유 카트리지의 형태일 수 있다.
폐기물 제거 유닛(206)은 제2 유체에서 성장 저해제를 감소시키거나 제거하기 위한 생체촉매 또는 효소를 포함할 수 있다. 폐기물 제거 유닛(206)은 충전층 제올라이트 컬럼, 암모니아를 감소시키거나 제거하기 위한 질화 박테리아를 포함하는 생체촉매 및/또는 젖산염을 탄소원으로 전환시킴으로써 젖산염을 감소시키거나 제거하기 위한 효소를 포함하는 생체촉매를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 질화 박테리아는 현탁 배양물의 형태로 폐기물 제거 유닛(206)에 혼입될 수 있다. 또한 일부 실시양태에서, 질화 박테리아는 또한 미세입자 또는 기타 고정화 방법을 사용하여 막 위의 알기네이트, 아가로스 또는 젤라틴 비드에 고정될 수 있다. 미생물 세포의 고정화는 박테리아 생체촉매의 효율적인 사용을 가능하게 하며, 이는 박테리아 및 제2 유체의 분리를 간단하게 하고 생체촉매의 지속적인 사용을 가능하게 한다. 질화 박테리아는 다음 종 중 임의의 것일 수 있다: 니트로소모나스(Nitrosomonas), 니트로소코커스(Nitrosococcus), 니트로박터(Nitrobacter), 니트로스피나(Nitrospina), 니트로스피라(Nitrospira) 또는 니트로코커스(Nitrococcus) 속. 이들 박테리아는 암모늄 또는 암모니아를 아질산염 및 질산염으로 산화시킨다.
일부 실시양태에서, 효소는 대사 폐기물(예를 들어 젖산염)을 세포 성장, 분화 및 세포외 매트릭스 침착을 위해 세포에 의해 사용될 수 있는 탄소원으로 전환시키기 위한 생체촉매로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체촉매는 신선한 배지 유닛(204)에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소는 젖산염 탈수소효소이다.
일부 실시양태에서, 컴퓨터 시스템(222)은 원격 컴퓨터 시스템이다. 예를 들어, 원격 컴퓨터 시스템(222)은 센서(216)와 신호를 주고 받을 수 있는 소프트웨어 모듈을 갖춘 제어 장치를 포함할 수 있다. 원격 컴퓨터 시스템(222)은 마이크로프로세서(도시되지 않음) 및 소프트웨어 및 데이터를 저장하기 위해 마이크로프로세서에 연결된 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체 또는 메모리(도시되지 않음)를 포함할 수 있다.
이제, 세포 생산을 위해 세포/조직 배양 시스템(200)을 활용하는 방법을 살펴보자. 본원에 기술된 방법은 피부, 근육, 지방조직 및 뼈 세포와 같은 세포를 배양하여 시험관내 육류를 생산하는 데 사용될 수 있다. 이 방법은 생물반응기(202)를 갖는 세포/조직 배양 시스템(200)을 제공하는 것, 투석 유닛(210)에서 제1 유체로부터 제2 유체로 대사 폐기물 및 성장 저해제를 전달하는 것, 투석 유닛(210)에서 제2 유체로부터 제1 유체로 영양소를 보충하는 것, 및 폐기물 제거 유닛(206)에서 제2 유체로부터 성장 저해제 및 대사 폐기물을 제거하는 것을 포함한다. 이와 같이, 생물반응기(202) 내의 대사 폐기물 및 성장 저해제는 제거되고 영양소는 투석 유닛(210)을 통해 생물반응기(202) 내의 세포에 보충된다.
적어도 1가지 유형의 세포가 생물반응기(202)에 첨가된다. 적합한 유형의 세포에는 뼈, 연골, 근육, 간, 피부, 심장, 폐 및 이들의 임의의 조합이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 유형의 포유동물 세포 또는 어류 세포가 본 발명 내에서 사용될 수 있다. 다른 식물 및 동물 종의 세포가 사용될 수 있다.
생물반응기(202)에서 확장될 상이한 유형의 특수 세포는 살아있는 동물의 생검을 통해 수득될 수 있다. 다른 스타터 세포는 중간엽 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 및 위성 세포와 같은 다양한 기원의 줄기 세포일 수 있다. 스타터 세포는 유전자 변형 세포 또는 임의의 세포주일 수도 있다.
세포는 멸균 챔버 또는 용기, 예컨대 생물반응기(202)에서 식품 등급의 생체적합성 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스에 부착/접착시킴에 의해 어류 기관과 같은 동물 기관을 모방한 고체 또는 반고체 구조의 조직으로 성장한다. 식품 등급의 생체적합성 스캐폴드는 최종 식용 가능한 제품의 일부가 된다.
소태아혈청(FBS) 보충물 또는 재조합 공급원으로부터의 성장 인자 및 사이토카인은 생물반응기(202)의 배양 배지(예를 들어, 이 특정 실시양태에서 제1 유체)에 도입되어 세포 성장 및 증식을 지지한다. 성장 인자 및 사이토카인은 인슐린 성장 인자 1(IGF-1), 인슐린, 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 인터루킨 11(IL-11), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 표피 성장 인자(EGF), 및 트랜스페린을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 적용예는 FBS의 부재 하에 생물반응기(202)에서 배양된 세포와 생체조작된 세포를 공동 배양하는 것을 수반할 수 있다. 생체조작된 세포는 상기 성장 인자 및 사이토카인을 분비하도록 조작되고, 이들 생체분자를 성장 및 증식에 필요한 경우 배양된 세포에 공급한다. 본 개시내용의 공동 배양 방법은 배양 배지에서 동물-유래 소태아혈청(FBS)의 필요성을 없앤다. 더욱이, 공동 배양 방법은 동일계 내에서 성장하는 단리된 세포에 식품 등급의 특정 성장 인자 및 사이토카인의 연속적인 공급을 제공하고 생산 공정을 단순화하여 비용을 절감시킨다. 하지만, 다른 실시양태에서, 재조합 공급원으로부터의 FBS, 다른 혈청 또는 단백질이 세포 성장을 지지하는 성장 인자, 사이토카인, 및 다른 영양소를 공급하기 위해 사용될 수 있다. 또한 일부 실시양태에서, 생물반응기(202)는 도 2에 도시된 생물반응기(30) 또는 도 3에 도시된 생물반응기(50), 또는 도 4에 도시된 생물반응기(100)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 기체는 세포 배양 조건을 최적화하기 위해 도입될 수 있다. 질소, 산소, 이산화탄소 또는 기체 혼합물이 사용될 수 있다. 세포 배양 유닛(202)은 0-10%의 이산화탄소를 함유할 수 있다. 생물반응기(202)는 15-30%의 산소를 함유할 수 있다. 생물반응기(202)는 60-85%의 질소를 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 온도는 세포 배양 조건을 최적화하도록 제어될 수 있다. 상이한 유형의 세포는 최적의 배양 온도가 상이할 수 있다. 온도는 25 내지 45℃ 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 생물반응기(202)의 배양 배지는 교반된다. 세포가 전단 응력에 상이하게 반응하는 것으로 알려져 있으므로 배양 용기의 교반 속도는 세포의 확장을 향상시키도록 최적화될 수 있다. 교반 속도는 또한 세포 배양 유닛(202) 내부의 배양 배지와 유입 배양 배지의 혼합을 향상시키도록 최적화될 수 있다. 교반 속도는 10rpm - 300rpm 범위일 수 있다.
펌프(208a)는 배양 배지를 생물반응기(202)로부터 투석 유닛(210)으로, 그리고 다시 생물반응기(202)로 순환시켜, 생물반응기(202)로부터의 배양 배지를 투석 유닛(210)으로 전달할 수 있다.
생물반응기(202)의 세포를 위한 영양소를 함유하는 신선한 기본 배지/투석물(즉, 이 특정 실시양태에서의 제2 유체)은 신선한 배지 유닛(204) 또는 제2 순환(218)으로 도입된다. 펌프(208b)는 신선한 배지 유닛(204)으로부터의 신선한 기본 배지를 투석 유닛(210)으로, 그 다음 폐기물 제거 유닛(206)으로 순환시킬 수 있다. 폐기물 제거 유닛(206)을 통해 통과 시, 신선한 기본 배지/투석물은 신선한 배지 유닛(204)으로 되돌아간다.
투석은 투석 유닛(210)에서 수행된다. 예를 들어, 젖산염, 암모니아 및 기타 폐기물은 배양 배지로부터 투석 유닛(210)의 투석 막(210a)을 통해 신선한 기본 배지로 전달되고, 포도당 및 기타 성장-향상 화합물을 포함하는 영양소는 신선한 기본 배지로부터 투석 유닛(210)의 투석 막을 통해 배양 배지로 전달된다. 투석 유닛(210)의 투석 막(210a)은 또한 배양 배지에 원하는 거대분자를 보유할 수 있다. 투석 속도는 투석 유닛(210) 내로의 신선한 기본 배지의 유속, 투석 유닛(210) 내로의 배양 배지의 유속, 투석 막의 표면적, 온도, 및 투석 유닛(210)에서 교반에 의한 진탕을 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 또한, 투석 유닛(210)에서 배양 배지의 영양소 보충 및 폐기물 제거 속도는 생물반응기(202)로부터 투석 유닛(210)으로 유체 유입을 위해 1 ml/분 - 10 L/분 범위인 펌핑 속도를 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 이와 유사하게, 투석 유닛(210)에서 배양 배지의 영양소 보충 및 폐기물 제거 속도는 또한 신선한 배지 유닛(204)으로부터 투석 유닛(210)으로 유체 유입을 위해 1 ml/분 - 10 L/분 범위인 펌핑 속도를 변화시킴으로써 제어될 수 있다.
대사 폐기물 또는 성장 저해제는 배양 배지로부터 투석 유닛(210) 내부의 신선한 기본 배지/투석물로 이동한다. 성장 저해제는 시간이 지남에 따라 신선한 기본 배지/투석물에 축적된다. 성장 저해제(젖산염, 암모니아를 포함하되 이에 제한되지 않음)가 축적된 기본 배지는 그 다음 펌프(208b)에 의해 폐기물 제거 유닛(206)으로 전달된다. 폐배지 내 암모니아 및 젖산염과 같은 대사 폐기물은 흡착제로서 제올라이트를 사용함으로써 제거될 수 있다. 제올라이트는 미세다공성 알루미노실리케이트 광물이다. 예로는 아날심(analcime), 차바자이트(chabazite), 크리노프틸로라이트(clinoptilolite), 휴란다이트(heulandite), 나트롤라이트(natrolite), 필립사이트(phillipsite) 및 스틸바이트(stilbite)이다. 폐기물 제거 유닛(206)은 충전층 제올라이트의 컬럼을 포함할 수 있다. 제2 유체는 한쪽 끝에서 폐기물 제거 유닛(206)으로 유입되고, 제올라이트를 통과하고 다른 쪽 끝에서 폐기물 제거 유닛(206)으로 배출된다. 제올라이트는 독성 화학물질 또는 제2 유체에서 세포 성장을 저해하는 화학물질, 예를 들어 암모니아 및 젖산염을 흡수한다.
제올라이트에 추가로 또는 대안적으로, 질화 박테리아는 제2 유체에서 암모니아를 감소시키거나 제거하는 데 사용될 수 있다. 제2 유체 순환(218)은 제1 유체 순환(216)으로부터 분리되고, 선택된 분자만이 막을 통해 제1 유체와 제2 유체 사이에서 교환될 수 있으므로, 질화 박테리아는 암모니아를 제거하기 위해 세포 배양 시스템(200)에 사용될 수 있다. 제1 유체 순환(216)과 제2 유체 순환(218)의 분리는 생물반응기(202)에서 세포 배양물이 질화 박테리아로 오염될 위험성을 감소시킨다. 세포 배양물과 직접 접촉하는 배양 배지로부터 암모니아를 직접 제거하기 위해 질화 박테리아를 사용하면 세포 배양물이 오염될 수 있다.
제올라이트 및/또는 질화 박테리아에 추가로, 또는 대안적으로, 생체촉매는 세포 배양물에서 젖산염을 감소시키거나 제거하는 데 사용될 수 있다. 대사 폐기물(예를 들어, 젖산염)을 탄소원(예를 들어, 피루브산염)으로 전환시키는 데 사용될 수 있는 효소를 포함하는 생체촉매는 세포 성장, 분화 및 세포외 매트릭스 침착을 위한 세포에 의해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 효소는 젖산염을 피루브산염으로 전환시키는 젖산염 탈수소효소이다. 증식 동안 배양 배지(제1 유체)의 변화는 젖산염 축적으로 인한 pH 감소를 특징으로 한다. 본원에 기술된 바와 같은 생체촉매는 배양 배지로부터의 젖산염을 신선한 기본 배지/투석물로 이동시키고, 신선한 기본 배지/투석물에서 이를 신선한 탄소원(예를 들어, 피루브산염)으로 투석 유닛(210)에서 교환함으로써 pH 변화를 조절하는 것을 돕는다. 그런 다음 신선한 탄소원은 조직의 추가 지속 가능한 성장 및 발달을 위해 배양 배지로 전달될 수 있다.
젖산염을 제거하는 생체촉매를 사용하면 많은 이점을 제공한다. 포도당과 같은 탄소원의 첨가는 비용이 많이 들고 배양물에 침습적이고 인적 및 기계적 오류가 발생하기 쉬울 수 있다. 따라서, 대사 폐기물을 세포가 증식, 분화, 및 세포외 매트릭스 침착에 사용할 수 있는 탄소원으로 전환시킴으로써, 생산 비용을 절감할 수 있고 생산 효율성을 증가시킬 수 있다.
피루브산염 대사는 더 낮은 농도의 유해 암모니아 및 감소된 pCO2를 생성하는 것으로 입증되었다. 따라서, 투석 유닛(210)을 통해 배양물 내 젖산염 농도를 낮추면 피루브산염 대사가 촉진되어 암모니아 생산량 감소 및 더 낮은 pCO2가 초래된다.
본 실시양태 하에 질화 박테리아 및 생체촉매를 이용한 암모니아 및 젖산염의 제거는 세포/조직 배양 시스템(200)에 적용될 수 있다. 특히, 질화 박테리아 및 생체촉매도 폐기물 제거 유닛(206)에 혼입될 수 있다.
상기에 제시된 바와 같이, 본 발명은 최적의 세포 생존력 및 세포 성장을 위해 포도당과 같은 영양소를 최적 수준으로 유지하고 암모니아 및 젖산염과 같은 성장 저해제를 최소 수준으로 유지한다.
본 발명은 또한 대사 폐기물의 새로운 탄소원으로의 효소적 전환의 사용이 세포 성장, 분화 및 세포외 매트릭스 침착을 촉진할 수 있음을 보여준다. 이는 배양 배지 및 생산 공정의 비용을 절감한다.
또한, 본 발명은 세포에 의해 분비되는 성장인자를 보유하고, 배양 배지에 동물 유래 혈청의 사용을 감소시킴으로써 세포 확장 공정을 향상시키고 시험관내 육류 산업 및 조직 공학의 생산 비용을 감소시킨다. 본 발명은 대규모 육류 생산에 사용될 수 있다.
본 개시내용의 시험관내 육류 생산 방법은 1가지 세포 유형의 단순한 조직 구성을 갖는 육류 제품을 제공한다. 1종의 세포를 가진 육류 제품은 다수의 세포 유형을 가진 다른 배양육에 비해 제조, 발달 및 상업화 하기가 더 쉽다. 본 개시내용의 대안적 실시양태는 다수의 세포 유형의 조직 구성을 갖는 육류 제품을 제공한다. 생체조작된 세포는 성장하는 동물 세포와 공동 배양되어 성장하는 어류 세포에 동일계내 세포 성장 및 증식을 위한 식품 등급의 성장 인자 및 사이토카인을 공급하여 배양 배지에 동물 유래 FBS의 필요성을 감소시키거나 없앤다. 공동 배양 기술은 생산 공정을 단순화하고 생산 비용을 절감시킨다.
또한, 시험관내 육류 제품의 영양소는 더 건강한 식품을 생성하도록 맞춤화될 수 있다. 예를 들어, 시험관내 육류 제품은 영양사의 식이 권장 사항 또는 개인의 게놈 테스트에 따라 맞춤화될 수 있다. 특정 조건에서 세포를 배양하면 육류 제품 중 고밀도 콜레스테롤, 다중불포화 지방산, 및 단일불포화 지방산과 같은 건강한 영양소를 농축시킬 수 있다. 대안적으로, 또는 이와 조합으로, 저밀도 콜레스테롤 및 포화지방산과 같은 건강에 해로운 것으로 알려진 영양소는 특정 조건에서 세포를 배양함으로써 감소시킬 수 있다. 비타민, 및 미네랄과 같은 미량영양소도 향상될 수 있다. 시험관내 육류 제품의 영양소 맞춤화는 다양한 방식, 예컨대, 비제한적으로 1) 세포 배양 동안 성장하는 세포에 공급되는 영양소의 조정 및/또는 2) 상이한 세포를 이용한 층상 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스의 비율 제어를 통해 달성할 수 있다.
시험관내 식품의 생산은 깨끗하고 멸균되고 고도로 제어된 공정 하에서 이루어진다. 따라서, 박테리아 또는 진균과 같은 미생물에 의한 식품 내 영양소의 바람직하지 않은 분해가 최소화된다. 미생물에 의한 영양소 분해로 인한 불쾌한 맛과 냄새도 최소화된다. 이러한 재배 식품의 특성은 요리에 새로운 용도를 가능하게 하고 새로운 요리법을 만드는 데 도움이 된다. 시험관내 식품의 이러한 적용예 중 하나는 어류 부레에서 유래된 시험관내 부레이다. 기존의 부레에는 생산 공정 중 박테리아에 의한 아민 분해로 인한 바람직하지 않은 비린 맛과 냄새가 있다. 이러한 바람직하지 않은 특성은 식재료를 뜨겁거나 따뜻하게 제공하는 맛있는 요리에만 제한한다. 세포 배양 기술로부터 생산된 시험관내 부레에는 바람직하지 않은 비린 맛과 냄새가 없다. 뜨겁고 맛있는 요리 외에도 시험관내 부레는 달콤한 요리에, 디저트로서, 또는 냉장 또는 상온에서 바로 먹을 수 있는 형태로 사용될 수 있다.

Claims (18)

  1. 시험관내 육류 생산용 시스템으로서,
    조직을 형성하기 위해 적어도 하나의 세포 유형을 고정하도록 구성된 생물반응기;
    상기 세포에 영양소를 보충하고 대사 폐기물을 상기 생물반응기로부터 투석물로 제거하도록 구성된 투석막을 포함하는 투석 유닛;
    상기 투석 유닛과 연결되어, 상기 투석물을 상기 투석 유닛에 공급하도록 구성된 신선한 배지 유닛; 및
    상기 신선한 배지 유닛과 연결되어 상기 투석물로부터 상기 대사 폐기물을 제거하도록 구성된 폐기물 제거 유닛
    을 포함하며;
    여기서, 상기 투석물은 상기 세포를 위한 영양소를 포함하고,
    상기 대사 폐기물은 암모니아 및 젖산염을 포함하고,
    상기 폐기물 제거 유닛은 암모니아를 분해하도록 구성된 제1 생체촉매를 포함하고,
    상기 폐기물 제거 유닛은 젖산염을 분해하도록 구성된 제2 생체촉매를 포함하고,
    상기 생물반응기, 상기 투석 유닛, 상기 신선한 배지 유닛 및 상기 수분 제거 유닛은 각각 상기 시스템에 탈착 가능하게 연결되는, 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 생체촉매가 젖산염을 분해하도록 구성된 효소인, 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폐기물 제거 유닛은 상기 생물반응기에서 세포 성장을 촉진할 수 있는 신선한 탄소원을 생성하도록 추가로 구성되는, 시스템.
  4. 제3항에 있어서, 상기 신선한 탄소원이 피루브산염인, 시스템.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1 생체촉매가 질화 박테리아인, 시스템.
  6. 제1항에 있어서, 상기 투석 막은 적어도 하나의 500Da 분자량 컷오프(MWCO) 막이고, 상기 막은 셀룰로오스 에스테르(CE), 재생 셀룰로오스(RC) 및 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF)로부터 선택되는, 시스템.
  7. 제6항에 있어서, 상기 투석막은 상기 생물반응기에서 거대분자를 보유하도록 구성되고, 상기 거대분자는 적어도 100Da을 갖는 단백질, 인지질(레시틴, 세라마이드), 지질(DHA, AHA), 다당류(글리코겐), 프로테오글리칸(헤파린, 콘드로이틴), 핵산(DNA, RNA), 인슐린 유사 성장 인자 및/또는 형질전환 성장 인자-베타를 포함하는, 시스템.
  8. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 생물반응기를 추가로 포함하며, 여기서 적어도 하나의 추가적인 생물반응기와 상기 생물반응기는 병렬로 연결되는, 시스템.
  9. 제1항에 있어서, 상기 생물반응기가
    세포를 그 위에서 3차원적으로 성장시키기 위한 플랫폼; 및
    적어도 하나의 플랫폼을 수용하고 고정하도록 구성된 홀더
    를 추가로 포함하며,
    여기서 상기 플랫폼은 식용 가능한 스캐폴드 또는 세포외 매트릭스인, 시스템.
  10. 제1항에 있어서, 상기 생물반응기가 현탁액에서 또는 미세담체(microcarrier) 상에서 세포 성장을 지지하도록 구성되는, 시스템.
  11. 제1항에 있어서, 상기 생물반응기에 연결된 펌프 및 튜브를 추가로 포함하며, 여기서 상기 펌프는 상기 시스템에 교반기 또는 진탕기의 부재 하에 상기 생물반응기 내부의 유체에 영양소를 고르게 분배하는 유체 흐름을 생성하도록 구성되는, 시스템.
  12. 시험관내 육류를 생산하기 위한 방법으로서,
    제1항의 시스템을 제공하는 단계;
    적어도 하나의 세포 유형을 생물반응기에 넣고 상기 생물반응기에서 조직을 생산하는 단계;
    적어도 암모니아 및 젖산염을 투석 유닛을 통해 상기 생물반응기로부터 투석물로 추출하는 단계;
    폐기물 제거 유닛에서 세포 성장을 촉진하는 신선한 탄소원을 폐기물 제거 유닛에서 생성하는 단계; 및
    상기 신선한 탄소원을 상기 투석물로부터 상기 생물반응기로 전달하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 신선한 탄소원이 피루브산염인, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 암모니아 추출이 질화 박테리아를 제공하는 단계를 수반하는, 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 젖산염 추출 단계 및 신선한 탄소원 생성 단계가 젖산염 탈수소효소를 제공하는 단계를 수반하는, 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 세포는 중간엽 줄기세포, 유도 만능 줄기 세포, 및 위성 세포와 같은 다양한 기원의 줄기 세포 또는 유전자 변형 세포일 수 있는, 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 생물반응기에 거대분자를 보유하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 상기 거대분자는 적어도 100Da를 갖는 단백질, 인지질(레시틴, 세라마이드), 지질(DHA, AHA), 다당류(글리코겐), 프로테오글리칸(헤파린, 콘드로이틴), 핵산(DNA, RNA), 인슐린 유사 성장 인자 및 형질전환 성장 인자-베타를 포함하는, 방법.
  18. 제12항에 있어서, 상기 투석물로부터의 상기 영양소를 전달함으로써 상기 생물반응기 내의 상기 세포에 상기 영양소를 보충하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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