KR20220110798A - 시험관내 세포 배양에 의한 고기 제조 방법 - Google Patents

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KR20220110798A
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포 산 마리오 친
카이 이 캐리 찬
춘 헤이 푼
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아반트 미츠 컴퍼니 리미티드
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Abstract

시험관내 세포 배양에 의한 고기 제조 방법은 동물 또는 식물 공급원으로부터 조직을 단리하여 세포들의 세포 현탁액을 제조하는 것, 및 배양 배지 중 식품 등급 스캐폴드상에서 세포를 성장시키는 것에 의해 동물 기관을 모방한 고체 또는 반-고체 구조로 세포를 성장시키는 것을 포함한다. 성장하는 세포에서의 1종 이상의 단백질의 발현은 단백질의 발현을 조절하는 1종 이상의 마이크로 RNA의 수준을 변경하는 것에 의해 증가될 수 있다. 추가적으로, 성장하는 세포는 제자리에서 세포의 성장을 지원하는 성장 인자 및 시토카인을 분비하는 생물조작된 세포와 공동-배양될 수 있다. 상기 공동-배양 기술은 배양 배지에서의 동물-유래 소 태아 혈청에 대한 필요성을 감소시키거나 차단한다.

Description

시험관내 세포 배양에 의한 고기 제조 방법
본원에서 논의되는 실시양태들은 일반적으로 시험관내 세포 배양을 사용한 고기 제조를 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
동물의 고기는 단백질이 많아서, 신체 기능을 지원하는 데에 사용되는 단백질을 구성하는 데에 필요한 모든 아미노산을 공급한다. 소비용 고기는 통상적으로 농장에서 사육되는 동물 또는 어류로부터 수득된다. 그러나, 동물 고기를 제조하기 위한 축산 및 양식은 다량의 에너지 및 자원을 필요로 하며, 고도의 탄소 발자국(carbon footprint)을 나타낸다. 축산 또는 양식에 의해 제조되는 고기는 공공의 건강상 위험성을 야기할 수 있는데, 제조 과정이 고기를 질환, 오염 및 독소에 노출시킬 수 있기 때문이다. 인구 증가, 고기 수요의 증가, 환경적 우려, 제한된 토지 및 수 자원, 생물다양성 상실, 및 동물 도축과 연관된 부정적인 인식과 같은 수많은 우려사항들이 대안적인 과정에 의해 고기를 제조하는 기술을 개발하도록 과학자들을 이끌었다.
시험관내 고기 제조는 고기 및 고기 생성물을 제조하는 세포 배양 기술을 사용하여 실험실에서 동물 유래의 근육 조직 또는 기관 조직이 성장되는 과정이다. 본원에서 사용될 때, 시험관내 고기 및 고기 생성물에는 가용성 형태 및 고체 형태를 포함한 동물 단백질 생성물은 물론 비-고기 생성물이 포함된다. 아직 개발 초기 단계 있기는 하지만, 시험관내 고기 및 고기 생성물은 건강 및 환경상의 장점과 같은 통상적인 고기 제조에 대비한 수많은 장점들을 제공할 수 있으며, 동물 복지에 유익할 수 있다. 이는 더 넓은 세포 축산 분야 또는 세포 배양물로부터의 축산 생성물 제조의 일부로서 운용되는 차-세대의 신흥 기술이다.
시험관내 고기의 제조를 위한 세포는 동물 생검물로부터 채취된 다음 생물반응기 또는 기타 유형의 멸균 환경의 배양 배지 중에서 동물과 별개로 성장되었을 수 있는 세포 (예컨대 근육 세포, 체세포, 줄기 세포 등)일 수 있다. 세포는 생물반응기에 배치되는 식용가능한 3-차원 스캐폴드에 부착시키는 것에 의해 동물 기관을 모방한 반-고체 또는 고체 형태로 성장할 수 있다. 개시자 세포는 동물의 조직 또는 연속 세포주로부터 바로 수득된 초대 세포일 수 있다. 적절한 배양 배지 중에서 올바른 조건하에 성장될 경우, 초대 세포는 세포 DNA 말단의 텔로미어 길이와 관련된 한정된 회수로만 성장 및 증식하게 된다. 반면, 연속 세포주는 장기간의 기간 동안 시험관내에서 배양될 수 있다. 세포 생물학 연구는 초대 세포를 불멸의 연속 세포주로 전환하는 방법 절차를 확립하고 있다. 초대 세포는 바이러스 종양유전자, 화학물질 처리, 또는 텔로미어의 단축을 방지하기 위한 텔로머라제 리버스 트랜스크립타제의 과발현을 사용하여 연속 세포주로 형질전환될 수 있다.
배양 배지는 아미노산, 염, 비타민, 성장 인자, 및 pH를 조절하기 위한 완충 시스템과 같은 세포 증식에 필요한 성분들을 함유할 수 있다. 현행 방법들은 사용 전에 배지에 소 태아 혈청 (FBS)을 첨가하는데, 그것이 필수적인 거대분자, 성장 인자 및 면역 분자들을 제공하기 때문이다. 그러나, FBS는 태어나지 않은 송아지로부터 유래하며, 그에 따라 동물 생성물이 없다는 목적에 부합하지 않는다. 무-동물 성분 배지에서의 세포의 성장은 시험관내 고기 제조 연구와 연관되어 있는 과학자들에 의해 고려되는 중요한 인자이다. 일부 성장 인자는 인간 공급원으로부터 유래할 수 있다.
현행 시험관내 고기 제조는 세포-기재 쇠고기, 돼지고기 및 가금류 고기와 같은 대부분의 시중 고기 유형들을 포괄한다. 그러나, 이들 유형의 고기는 현행 생물의학 과학기술의 기술들을 사용하여 제조하기가 어렵고 비용이 드는 다수의 세포 유형을 포함하는 복잡한 조직 구성을 가진다. 또한, 세포 배양 기술에 의해 제조되는 고기에서 단백질 수준 및 바이오매스(biomass) 수율을 증가시키는 비-GM 방법의 결핍이 존재한다. 또한, 상기에서 설명된 바와 같이, 현행 세포 배양 기술은 영양소 공급원으로서의 동물 성분 (예컨대 FBS)은 물론 고가의 비-식품 등급 성장 인자에 의존할 수 있다.
본 개시내용의 실시양태들은 상기 과제들에 대한 해결책을 제공하는 인간 소비용 시험관내 고기 제조 방법에 관한 것이다.
[발명의 개요]
본 개시내용의 일 실시양태에 따라, 시험관내 세포 배양에 의한 고기 제조 방법은 동물 또는 식물 공급원으로부터 조직을 단리하여 세포들의 세포 현탁액을 제조하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 세포가 동물 기관을 모방한 고체 또는 반-고체 구조로 성장하도록 배양 배지 중 식품 등급 스캐폴드상에서 세포를 성장시키는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 추가적으로 단백질의 발현을 조절하는 1종 이상의 마이크로 RNA의 수준을 변경하는 것에 의해 성장하는 세포에서의 단백질의 발현을 증가시키는 것을 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에 따라, 시험관내 세포 배양에 의한 고기 제조 방법은 식물 또는 동물 공급원으로부터 조직을 단리하여 세포들의 세포 현탁액을 제조하는 것, 및 세포가 동물 기관을 모방한 고체 또는 반-고체 구조로 성장하도록 배양 배지 중 식품 등급 스캐폴드상에서 세포를 성장시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 상기 세포를 세포의 성장을 지원하는 영양소, 성장 인자 및 시토카인을 분비하는 생물조작된 세포와 공동-배양하는 것을 포함한다.
본원에서 개시되는 실시양태들은 상기 과제들에 대한 해결책을 제공하는, 인간 소비용 시험관내 고기 제조 방법에 관한 것이다.
첨부 도면과 연계되어 고려되었을 때의 상세한 설명을 참조하면 본 개시내용이 더 잘 이해될 수 있다. 도면의 구성요소들이 반드시 축적에 맞는 것은 아니며, 대신 본 개시내용의 원리를 예시하기 위하여 강조가 이루어진다.
도 1은 본 개시내용의 일 실시양태에 따른, 시험관내 세포 배양에 의한 고기 제조 방법의 흐름도이다.
도 2는 본 개시내용의 일 실시양태에 따른, 단백질 발현 전사-후 강화 방법의 개략적 표시이다.
도 3은 본 개시내용의 일 실시양태에 따른, 콜라겐 유형 1 알파 1 (COL1A1) 발현 전사-후 강화 방법의 개략적 표시이다.
도 4는 본 개시내용의 일 실시양태에 따른, 콜라겐 유형 1 알파 2 (COL1A2) 발현 전사-후 강화 방법의 개략적 표시이다.
도 5는 본 개시내용의 일 실시양태에 따른, 고체 상 지지체를 포함하는 시험관내 고기 제조에 사용되는 생물반응기의 개략적 단면도 또는 개념 단면도이다.
도 6은 본 개시내용의 일 실시양태에 따른, 도 5와 유사하나 제2 고체 상을 포함하는 생물반응기의 개략적 단면도 또는 개념 단면도이다.
도 7은 일 실시양태에 따른, 음성 대조군 miRNA, miRNA 132 억제제 (miR-132 억제제), miRNA 133 (miR-133 억제제) 및 miRNA 21 모방체 (miR-21 모방체)에 의한 형질감염 24시간 후의 YCB 세포에서의 COL1A1 mRNA 발현 관련 데이터의 그래프 표시이다.
도 8은 일 실시양태에 따른, 음성 대조군 miRNA, miR-132 억제제, miR-133 억제제 및 miR-21 모방체에 의한 형질감염 24시간 후의 YCB 세포에서의 COL1A2 mRNA 발현 관련 데이터의 그래프 표시이다.
도 9a는 miR-21 모방체에 의한 형질감염 72시간 후의 YCB 세포에서의 COL1A1 발현 크로마토그램이다. 도 9b는 일 실시양태에 따른, miR-21 모방체에 의한 형질감염 72시간 후의 YCB 세포에서의 COL1A1 발현 관련 데이터의 그래프 표시이다.
도 10a는 음성 대조군 miRNA, miR-21 모방체, miR-132 억제제 및 miR-133 억제제에 의한 형질감염 72시간 후의 YCB 세포에서의 CTGF 발현 크로마토그램이다. 도 10b는 일 실시양태에 따른, 음성 대조군 miRNA, miR-21 모방체, miR-132 억제제 및 miR-133 억제제에 의한 형질감염 72시간 후의 YCB 세포에서의 CTGF 발현 관련 데이터의 그래프 표시이다.
도 11은 음성 대조군 miRNA 및 miR-21 모방체에 의한 형질감염 24시간 후의 293 세포에서의 COL1A1 mRNA 발현의 그래프 표시이다. 일 실시양태에 따른 대조군 miRNA 대비 *p<0.05이다.
지금부터 도면, 특히 도 1을 참조하여 시험관내 고기 제조 방법 (10)을 나타낸다. 본원에서 사용될 때, "시험관내 고기 제조"는 동물 및/또는 식물 유래의 조직이 고기 및 고기 생성물을 제조하기 위한 세포 배양 기술을 사용하여 실험실에서 성장되는 세포-기재 고기 제조 과정 또는 세포-기재 축산 과정을 지칭한다. 블록 (12)에서는, 동물 또는 식물 유래의 조직이 단리된다. 일 실시양태에서, 상기 조직은 그루퍼(grouper), 농어 또는 옐로 코커(yellow cocker)와 같은 염수 어류를 포함한 오스테이크타이에스(Osteichthyes) 강의 경골 어류로부터 유래한다. 다른 실시양태에서는, 소 조직과 같은 다른 유형의 동물 조직이 단리될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 블록 (12)는 어류로부터의 부레와 같은 기관 조직을 수집하는 것, 및 세포 현탁액을 제조하는 것을 포함할 수 있다. 하기 상세한 설명이 주로 어류 공급원으로부터 유래하는 조직에 대해 기술하기는 하지만, 다른 유형의 시험관내 고기 및/또는 동물 단백질 생성물, 그리고 채식주의 고기 및/또는 단백질 생성물을 제공하기 위하여 다른 유형의 동물 공급원 및/또는 식물 공급원으로부터 유래하는 조직에도 상기 개념이 적용될 수 있다는 것은 이해될 것이다.
많은 단리되는 세포는 성체 세포로서, 의학 연구에서 확립된 다양한 방법들을 사용하여 연속 증식하도록 구성될 수 있다 (블록 (14)). 예를 들면, 야마나카 인자(Yamanaka factor)와 같은 특정 유전자가 성체 세포를 유도 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell) (iPSC)와 같은 줄기 세포로 재프로그래밍하는 데에 사용될 수 있다. 대안적으로, 단리된 성체 세포는 텔로메라제 리버스 트랜스크립타제 과발현에 의해 연속 세포주로 형질전환될 수 있다. 다른 실시양태에서는, 성체 줄기 세포 및 배아 줄기 세포와 같은 다른 유형의 세포들이 단리될 수 있다. 이러한 점에서, 본 개시내용의 방법이 모든 세포주 공급원을 포함한다는 것이 이해될 것이다.
다음의 블록 (16)에서는, 생물반응기와 같은 멸균 챔버 또는 용기 내의 식품 등급 생체적합성 스캐폴드에 부착시키는 것/유착시키는 것에 의해, 세포가 어류 기관과 같은 동물 기관을 모방한 고체 또는 반-고체 구조로 성장된다. 상기 멸균 챔버 또는 용기는 온도가 조절될 수 있으며, 화학물질, 영양소 및 세포와 같은 물질을 도입하고 제거하기 위한 유입구 및 유출구를 가질 수 있다. 상기 식품 등급 생체적합성 스캐폴드는 최종 식용 생성물의 일부가 되며, 비제한적으로 아가로스, 알기네이트, 키토산, 균사체 및 곤약 글루코만난과 같은 식물-기재 또는 진균-기재 재료로 구성된다. 알기네이트는 갈조류로부터 자연적으로 유래하는 생체중합체로서, 생체적합성이다. 또한, 진균 유래의 식물-기재 키토산은 항세균 특성을 가지고 있다. 일부 실시양태에서, 블록 (16)은 멸균 용기에서 항생제 또는 항미생물 화합물의 부재하에 수행된다. 블록 (18)은 세포 생존 및 성장을 지원하기 위하여 생물반응기에 배양 배지를 공급하는 것을 포함한다. 배양 배지는 비제한적으로 무기 염 (예컨대 칼슘 클로라이드 (CaCl2), 칼륨 클로라이드 (KCl), 소듐 클로라이드 (NaCl), 소듐 비카르보네이트 (NaHCO3), 소듐 2수소 포스페이트 (NaH2PO4), 마그네슘 술페이트 (MgSO4) 등), 아미노산, 비타민 (예컨대 티아민, 리보플라빈, 엽산 등), 그리고 기타 성분들 예컨대 글루코스, β-메르캅토에탄올, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 및 소듐 피루베이트와 같은 성분들을 함유하는 완충된 용액일 수 있다. 성장 배지의 비-제한적인 예로는 레이보비츠(Leibovitz's) L-15 배지, 이글 최소 필수 배지 (MEM), 배지 199, 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 햄(Ham's) F12 영양소 혼합물, 햄 F10 영양소 혼합물, 맥코이(MacCoy's) 5A 배지, 글래스고우 변형 이글 배지 (GMEM), 이스코브(Iscove's) 변형 둘베코 배지, 및 RPMI 1640이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
블록 (20)에 따르면, 세포 성장 및 증식을 지원하기 위하여 식품 등급 성장 인자 및 시토카인이 생물반응기의 배양 배지로 도입된다. 성장 인자 및 시토카인에는 인슐린 성장 인자 1 (IGF-1), 인슐린, 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 6 수용체 (IL-6R), 인터류킨 11 (IL-11), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 표피 성장 인자 (EGF) 및 트랜스페린이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 블록 (20)은 소 태아 혈청 (FBS)의 부재하에 생물조작된 세포를 단리된 세포와 공동-배양하는 것을 포함할 수 있다. 상기 생물조작된 세포는 상기 성장 인자 및 시토카인들을 분비하고 성장 및 증식에 필요할 때 단리된 세포에 이들 생체분자를 공급하도록 조작되어 있다. 본원에서 사용될 때, "생물조작된" 세포가 유전자-변형된 세포와 동의어는 아니다. 생물조작된 세포는 1종 이상의 특정 단백질을 과발현하는 특정 유전자를 가지고 있다. 상기 생물조작된 세포는 어류 세포, 또는 다른 유형의 동물 세포 예컨대 소 세포일 수 있다. 생물조작된 세포는 최종 고기 생성물에는 존재하지 않는다. 비-제한적인 예로서, 생물조작된 어류 세포가 단리된 어류 세포와 공동-배양될 수 있거나, 또는 생물조작된 소 세포가 단리된 소 세포와 공동-배양될 수 있다. 본 개시내용의 공동-배양 방법은 배양 배지에서의 동물-유래 소 태아 혈청 (FBS)에 대한 필요성을 차단한다. 또한, 상기 공동-배양 방법은 제자리에서의 성장하는 세포에 대한 식품 등급 특정 성장 인자 및 시토카인의 연속 공급을 제공하며, 제조 과정의 비용을 단순화하고 감소시킨다. 그러나, 다른 실시양태에서는, 블록 (16) 동안의 세포 성장을 지원하기 위하여 FBS, 다른 혈청, 또는 재조합 공급원 유래의 단백질이 성장 인자, 시토카인 및 기타 영양소들을 공급하는 데에 사용될 수 있다.
더하여, 블록 (22)에 따르면, 생성되는 고기 생성물에서의 바이오매스 수율을 증가시키기 위하여, 세포에서의 단백질 발현이 증가된다. 본원에서 사용될 때, "바이오매스 수율"은 소비시 에너지 생성에 가용한 최종 고기 생성물 중 소화가능한 재료 (예컨대 단백질)의 양을 지칭한다. 더 구체적으로, 블록 (22)는 배양 전에 수행되는 세포의 조작을 사용하여 세포에서의 마이크로 RNA 수준을 변경하는 것에 의해 단백질 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 마이크로 RNA는 전사-후 유전자 발현을 조절하는 것과 연관되어 있는 내인성의 짧은 비-코딩 단일-가닥 RNA 서열이다. 블록 (22)는 전령 RNA (mRNA) 번역을 촉진하는 것에 의해 단백질 발현을 증가시키는 상향-조절 마이크로 RNA의 양을 증가시키는 것, 및/또는 mRNA 번역을 억제하는 것에 의해 단백질 발현을 감소시키는 하향-조절 마이크로 RNA의 양을 감소시키는 것을 포함한다. 마이크로 RNA 수준은 마이크로 RNA, 마이크로 RNA 모방체 또는 마이크로 RNA 억제제를 세포에 도입하는 것에 의해 증가되거나 감소될 수 있다. 마이크로 RNA 모방체는 마이크로 RNA와 동일한 기능을 가지고 있으나, 단백질 발현을 조절하는 데에 있어서 더 안정하고 효율적일 수 있다. 일부 실시양태에서는, 특정 마이크로 RNA를 발현하도록 하는 명령을 보유하는 에피솜 벡터를 세포에 도입하는 데에 전기천공이 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 그와의 조합으로서, 아데노-연관 바이러스가 특정 마이크로 RNA를 발현하도록 하는 에피솜 명령을 보유하는 비히클로 사용될 수도 있다. 표적으로 하는 하향-조절 마이크로 RNA의 양을 감소시키는 것은 표적으로 하는 마이크로 RNA의 억제제를 형질감염에 의해 세포에 도입하는 것에 의해 달성될 수 있다. 여기에서 주목할 것은 본 개시내용에 따른 단백질 발현/바이오매스 수율의 증가 방법이 세포의 게놈을 변형시키지 않으면서 수행된다는 것이다.
도 2를 참조하면, 세포주에서의 단백질 발현의 전사-후 강화를 위한 방법이 개략적으로 도시되어 있다. 선택되는 단백질의 mRNA 번역 및 단백질 생성을 증가시키기 위하여, 1종 이상의 상향-조절 마이크로 RNA (miRNA)가 증가될 수 있다. 대안적으로 또는 그와의 조합으로는, 선택되는 단백질의 mRNA 번역 및 단백질 생성을 증가시키기 위하여, 1종 이상의 하향-조절 miRNA가 억제제 (항-miRNA)를 사용하여 차단될 수 있다.
어류의 부레는 주로 섬유모세포 및 콜라겐 단백질을 포함한다. 콜라겐 유형 1 (콜라겐 I)은 어류 부레의 지배적인 단백질로서, 배양되는 어류 부레 세포에서의 콜라겐 I의 발현 증가는 바이오매스 수율을 증가시킬 수 있다. 어류 부레 세포의 콜라겐 I은 콜라겐 유형 1 알파 1 (COL1A1) 및 콜라겐 유형 1 알파 2 (COL1A2)를 포함한다. COL1A1 및 COL1A2 발현은 miR-21의 수준 증가가 어류 부레 세포에서의 COL1A1 및 COL1A2 생성을 증가시키도록 하는 상향-조절 miRNA21 (miR-21)에 의해 증가된다. 또한, COL1A1 및 COL1A2 발현은 miR-133의 수준 감소 또는 miR-133 작용의 차단이 어류 부레 세포에서의 COL1A1 및 COL1A2 생성을 증가시키도록 하는 하향-조절 miRNA 133 (miR-133)에 의해 감소된다. 도 3-4는 miR-21 수준을 증가시키는 것 및 억제제 (항-miR 133)를 사용하여 miR-133의 작용을 차단하는 것에 의해 COL1A1 (도 3) 및 COL1A2 (도 4) 생성을 증가시키는 것을 나타낸다. 증가된 COL1A1 및 COL1A2 생성은 최종 고기 생성물에서의 증가된 바이오매스 수율로 이어진다. 유사한 전략이 다른 유형의 동물 세포에서 관련 단백질 수준을 증가시키는 데에 적용될 수 있다.
도 5를 참조하면, 단리된 세포를 배양하는 데에 사용되는 예시적인 생물반응기 (30)이 나타나 있다. 세포는 생물반응기 (30)의 멸균 챔버 (36) 내에서 유지되는 식품 등급 스캐폴드 (34)에 의해 제공되는 고체 상 지지체 (32)에 부착되어 거기에서 성장한다. 스캐폴드 (34)는 고기 생성물의 형상을 좌우할 수 있다. 식품 등급 스캐폴드 (34)는 비제한적으로 아가로스, 알기네이트, 키토산, 균사체 및 곤약 글루코만난과 같은 식물-기재 또는 진균-기재 재료로 구성된다. 고체 상 지지체 (32)는 다공성일 수 있으며, 그에 따라 세포는 지지체 (32)의 내부 표면에 부착되어 거기에서 성장할 수 있다. 세포에 영양소를 공급하는 배양 배지는 유입구 (38)을 통하여 생물반응기 (30)으로 도입되며, 유출구 (40)을 통하여 생물반응기 (30)으로부터 방출된다.
도 6은 도 5의 생물반응기 (30)과 유사하나 미세 메시 (54)에 의해 고체 상 지지체 (32)로부터 분리된 제2 고체 상 (52)를 추가적으로 포함하는 생물반응기 (50)을 나타낸다. 상기 제2 고체 상 (52)는 제자리에서 고체 상 지지체 (32)에 세포 성장을 위한 영양소, 성장 인자 및 시토카인을 분비하는 생물조작된 세포를 함유하거나 지지할 수 있으며, 고체 상 지지체 (32)상의 세포로부터 생물조작된 세포를 물리적으로 분리할 수 있다. 제2 고체 상 (52)는 고체 상 지지체 (32)와 유사한 식물-기재 재료로 구성된다. 메시 (54)는 영양소, 성장 인자 및 시토카인에 대해서는 투과성이나, 세포에 대해서는 비투과성이다. 도 6의 생물반응기 (50)은 성장하는 세포와의 생물조작된 세포의 공동-배양을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서는, 도 5 및 6의 생물반응기 (30) 및 (50)이 일렬로 배열될 수 있다. 다른 실시양태에서는, 과정의 규모 증대를 위하여 몇 개의 생물반응기 (30), 몇 개의 생물반응기 (50) 또는 생물반응기 (30)과 (50)의 혼합체가 직렬로 배열될 수 있다. 생물반응기 (30)은 주로 바이오매스 생성에 사용될 수 있는 반면, 생물반응기 (50)은 성장하는 세포에 영양소, 성장 인자 및 시토카인을 제공하는 데에 사용될 수 있다.
본 개시내용의 시험관내 고기 제조 방법은 한 가지 세포 유형의 단순한 조직 구성을 가지는 고기 생성물을 제공한다. 한 가지 세포 유형을 가지는 고기 생성물은 다수의 세포 유형을 가지는 다른 배양되는 고기에 비해 제조, 개발 및 상용화하기가 더 용이하다. 본 개시내용의 대안적인 실시양태는 다수의 세포 유형을 가지는 고기 생성물을 제공한다. 또한, 본 출원인은 성장하는 세포에서 마이크로 RNA 수준 또는 활성을 변경하는 것에 의해 바이오매스/단백질 생성을 증가시키는 전략을 발견하였다. 일 예에서는, 어류 부레 세포에서 발견되는 지배적인 단백질 (콜라겐 I)의 수준을 증가시키기 위하여, 2종의 핵심 마이크로 RNA (miR-21 및 miR-133)를 표적화한다. 본 출원인이 알고 있는 바로는, 배양 고기 생성물에서 단백질/바이오매스 수율 증가를 달성하기 위한 마이크로 RNA 수준 또는 활성의 변경이 배양 고기 개발 분야에서 다른 사람에 의해 사용된 바는 없다. 단백질 생성의 증가를 위하여 마이크로 RNA를 표적화하는 것은 공지의 녹-인(knock-in) 또는 녹-아웃(knock-out) 방법에 비해 세포에 대하여 더 적은 스트레스를 야기할 수 있다. 성장하는 어류 세포에 제자리에서의 세포 성장 및 증식을 위한 식품 등급 성장 인자 및 시토카인을 공급함으로써 배양 배지에서의 동물-유래 FBS에 대한 필요성을 감소시키거나 차단하기 위하여, 생물-조작된 세포가 성장하는 성장하는 동물 세포와 공동-배양된다. 공동-배양 기술은 제조 과정을 단순화하고 제조 비용을 감소시킨다.
또한, 더 건강한 식품 생성물을 생성시키기 위하여, 배양되는 고기 생성물의 영양소가 맞춤화될 수 있다. 예를 들면, 배양되는 고기 생성물은 개인 게놈 시험을 참조한 영양사의 식이 권장사항에 따라 맞춤화될 수 있다. 특정 조건에서 세포를 배양하는 것에 의해, 고기 생성물 중 고-밀도 콜레스테롤, 다중불포화 지방산 및 단일불포화 지방산과 같은 건강한 영양소가 보강될 수 있다. 대안적으로 또는 이와의 조합으로서, 특정 조건에서 세포를 배양하는 것에 의해, 건강에 손상을 주는 것으로 알려져 있는 영양소 예컨대 저밀도 콜레스테롤 및 포화 지방산이 감소될 수도 있다. 비타민 및 무기질과 같은 미량영양소 역시 강화될 수 있다. 배양되는 고기 생성물의 영양소 맞춤화는 비제한적으로 1) 세포 배양 동안 성장하는 세포에 공급되는 영양소를 설계하는 것, 및/또는 2) 다른 세포와의 층을 이루는 스캐폴드의 비율을 조절하는 것과 같은 다양한 방식으로 달성될 수 있다.
배양된 식품 생성물의 제조는 청정한 멸균의 고도로 조절되는 과정하에 있다. 따라서, 식품 생성물 중 영양소의 세균 또는 진균과 같은 미생물에 의한 바람직하지 않은 분해는 최소화된다. 미생물에 의한 영양소 분해로부터 유래하는 바람직하지 않은 맛 및 냄새 역시 최소화된다. 배양된 식품의 이와 같은 특성은 조리시의 새로운 용도를 가능하게 하며, 신규한 레시피를 창출하는 것을 돕는다. 배양된 식품의 그와 같은 한 가지 적용분야는 어류 부레로부터 유래하는 배양된 피시 모우(fish maw)이다. 통상적인 피시 모우는 제조 과정에서의 세균에 의한 아민의 분해로 인하여 바람직하지 않은 어류의 맛 및 냄새를 가진다. 이와 같은 바람직하지 않은 특성은 상기 식품 성분을 고온 또는 승온으로 제공되는 세이버리(savory) 디시로 제한한다. 세포 배양 기술로부터 생성되는 배양된 피시 모우는 바람직하지 않은 어류의 맛 및 냄새를 가지지 않는다. 고온 및 세이버리 디시 이외에, 배양된 피시 모우는 냉각 온도 또는 주변 온도에서 제공되는 디저트 또는 즉석-섭취 체계로서 스윗 디시(sweet dish)에 사용될 수 있다.
[ 실시예 ]
실시예 1
miRNA 모방체 및 억제제를 사용한 단백질 발현의 향상
일 실시양태에 따라, 실시예로서, miRNA 및 억제제를 사용하여 콜라겐 I αI (COL1A1) 및 콜라겐 I α2 (COL1A2)의 발현을 향상시키기 위한 전략을 제시할 수 있다.
본원에서 사용될 때, "억제제"라는 용어는 miRNA 억제제를 지칭할 수 있으며, 내인성 miRNA 분자에 특이적으로 결합하여 그것을 억제하고 miRNA 활성의 하향-조절에 의해 miRNA 기능 분석을 가능하게 하도록 설계되는 소형의 단일-가닥 RNA 분자이다.
재료 및 방법
시약
서모피셔 사이언티픽(Thermofisher Scientific) 사로부터 하기의 시약들을 구입하였다: 글루타맥스(Glutamax)™을 포함하는 DMEM/F12, 소 태아 혈청 (FBS), 트립신/EDTA, 리포펙타민(Lipofectamine)™ 3000, 음성 대조군 miRNA (mirVana™ miRNA 모방체, 음성 대조군 #1; 서모피셔 사이언티픽 사, 카탈로그 번호 #4464058), miRNA 21 모방체 (miRBase 수탁 번호: MI0033728; 서열식별번호(SEQ ID NO): 1; miR-21 모방체), miRNA 132 억제제 (miRBase 수탁 번호: MI0000449; 서열식별번호: 2; miR-132 억제제), miRNA 133 억제제 (miRBase 수탁 번호: MI0000822; 서열식별번호: 3; miR-133 억제제), RNAlater™ 용액, 퓨어링크(Purelink)™ RNA 미니키트, 퓨어링크™ DNase 세트, 및 파워업(PowerUp)™ SYBR™ 그린 마스터믹스(Green Mastermix). M-MuLVRT (RNase H-) cDNA 합성 키트는 엑셀 바이오(ExCell Bio) 사로부터 구매하였다.
본원에서 사용될 때, "miRNA 21 모방체"는 "miRNA 21"과 동일한 RNA 서열을 가진다.
세포
사내에서 옐로 크로커 부레 (YCB) 세포주를 개발하였다. 293 세포는 ATCC로부터 입수하였다. 두 세포주를 가습 인큐베이터 (약 2-10 % CO2, 바람직하게는 5 % CO2; 약 90-98 % 공기, 바람직하게는 95 % 공기; 약 24-37 ℃, 바람직하게는 34 ℃) 내부의 완전 배지 (DMEM/F12, 약 2-20 % FBS, 바람직하게는 10 % FBS) 중에서 유지하였다. 이들을 1:2 내지 1:10의 분할 비로 일상적으로 하위배양하였다. 상기 분할 비는 바람직하게는 1:4이다.
형질감염
리포펙타민™ 3000을 사용하여 제조자 (서모피셔 사이언티픽 사)의 프로토콜에 따라 세포를 음성 대조군 miRNA, miR-21 모방체, miR-132 억제제, miR-133 억제제로 형질감염시켰다. 트립신-EDTA에 의해 세포를 탈착시켰다 (세포 합류 ~80 %시). 이것을 약 0.2-1.0 ml, 바람직하게는 0.5 ml의 완전 배지에 약 1-10 x 105개/24 웰, 바람직하게는 약 5 x 105개/24 웰 (YCB 세포) 또는 약 1-10 x 105개/24 웰, 바람직하게는 약 6.5 x 105개/24 웰 (293 세포)로 시딩하였다. 직후에, 약 0.01-0.10 nmol, 바람직하게는 약 0.06 nmol의 miRNA를 약 50-300 μl, 바람직하게는 약 100 μl의 DMEM/F12 중 약 0.5-5 μl, 바람직하게는 약 1.5 μl의 리포펙타민™ 3000 시약과 혼합하였다. 복합체 형성을 위하여 혼합물을 약 5-30분, 바람직하게는 약 10분 동안 실온 (약 20 ℃ - 26 ℃, 바람직하게는 약 24 ℃)에서 인큐베이팅하고, 50-300 μM, 바람직하게는 100 μM의 최종 miRNA 농도를 달성하도록 웰의 서로 다른 영역에 적가하였다. 세포를 인큐베이터로 복귀시키고, 약 18-36시간 사이, 바람직하게는 약 24시간에 표적 유전자 발현에 대하여 분석하였다.
총 RNA 추출 및 역전사
형질감염-후 약 18-36시간, 바람직하게는 약 24시간에, 배지를 제거하고, RNAlater™ 용액을 웰에 첨가하여 RNA를 보존한 후, 플레이트를 약 4-10 ℃, 바람직하게는 약 4 ℃에서 저장하였다. 총 RNA를 추출하기 위하여, RNAlater™ 용액을 제거하고, 퓨어링크™ RNA 미니 키트에 의해 제조자 (서모피셔 사이언티픽 사)의 프로토콜을 기준으로 RNA를 정제하였다. 퓨어링크™ DNase 세트에 의해 컬럼-상 DNase 처리를 수행하였다. 나노드롭(Nanodrop)™ 2000c에 의해 샘플 중 RNA의 농도를 측정하였다. M-MuLVRT (RNase H-) cDNA 합성 키트 및 올리고 dT 프라이머를 사용하여 제조자 (엑셀 바이오 사)의 프로토콜에 따라 약 0.5-5 μg의 RNA, 바람직하게는 약 2 μg의 RNA (293 세포) 또는 약 0.5 μg의 RNA (YCB 세포)를 cDNA로 역전사하였다.
실-시간 PCR
로체(Roche) LC480 실-시간 PCR 시스템 (로체 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics) 사)에 의해 COL1A1 및 COL1A2의 발현을 분석하였다. cDNA 샘플을 약 0.1-0.8 μM, 바람직하게는 약 0.4 μM의 유전자 특이적 프라이머 (표 1) 및 파워업™ SYBR™ 그린 마스터믹스와 혼합하였다. 증폭 프로토콜은 하기와 같았다: (a) 약 45-55 ℃로 약 1-10분, 바람직하게는 약 50 ℃로 약 2분; (b) 약 90-98 ℃로 약 1-5분, 바람직하게는 약 95 ℃로 약 2분; (c) 약 35-45 주기, 바람직하게는 40 주기 (각 주기는 하기의 단계들을 포함할 수 있음: (i) 약 90-98 ℃로 약 10-30초, 바람직하게는 95 ℃로 15초; (ii) 약 50-60 ℃로 약 10-30초, 바람직하게는 55 ℃로 15초; 및 (iii) 약 66-74 ℃로 약 15-60초, 바람직하게는 72 ℃로 30초; (iv) 용융 곡선 분석 (하기의 단계들을 포함함: (1) 약 90-98 ℃로 약 10-30초, 바람직하게는 약 95 ℃로 약 15초; (2) 약 55-65 ℃로 약 0.5-3분, 바람직하게는 약 60 ℃로 약 1분; (3) 경사율: 약 90-98 ℃에 도달할 때까지 약 0.05-0.3 ℃/초, 바람직하게는 약 95 ℃에 도달할 때까지 약 0.15 ℃/초; 및 (4) 경사 동안 신호 포착)). (a) 용융 곡선 분석 후 앰플리콘이 단일 피크를 나타냄, (b) PCR 생성물이 겔 전기영동에 의해 분석되었을 때, 올바른 크기의 단일 밴드가 관찰됨, (c) 증폭 효율 = 약 90-110 %; 오차 < 약 0.01-0.1임에 의해 PCR의 타당성을 검증하였다. Pfaffl 방법에 의해 각 샘플에서의 표적 유전자 발현을 측정하고, 살림 유전자 EF1α의 발현에 의해 표준화하였다. 샘플 B에 대비한 샘플 A에서의 상대적 유전자 발현은 하기 방정식 (1)에 의해 좌우된다.
Figure pct00001
<표 1>
Figure pct00002
통계 분석
모든 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 통계 분석은 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 5.0에 의해 수행하였다. YCB 세포의 유전자 발현 데이터의 경우, 일-원 ANOVA 후 유의성이 있을 경우 이어지는 투키(Tukey) 사후 검정에 의해 데이터를 분석하였다. 293 세포에 대한 데이터의 경우, 스투던트 t-검정에 의해 데이터를 분석하였다. 결과는 p<0.05인 경우 통계적으로 서로 다른 것으로 간주하였다.
결과
본 실시예에서는, 음성 대조군 miRNA, miR-21 모방체, miR-132 억제제 또는 miR-133 억제제를 사용하여 YCB 세포를 형질감염시켰다. 이후, qPCR에 의해 형질감염 약 24시간 후에 2종의 서로 다른 유형의 콜라겐인 COL1A1 및 COL1A2 mRNA 발현을 정량하였다. 음성 대조군 miRNA에 의한 형질감염과 비교하였을 때, miR-21 모방체 또는 miR-133 억제제에 의한 형질감염은 COL1A1 (도 7) 및 COL1A2 (도 8) mRNA 발현을 증가시킨다는 것을 발견하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, miR-21 모방체 및 miR-133 억제제에 의한 형질감염 24시간 후, COL1A1의 mRNA 발현은 각각 대조군의 약 1.5배 및 대조군의 약 1.5배였다. COL1A1의 mRNA 발현은 음성 대조군 miRNA 및 miR-132 억제제에 의한 형질감염 약 24시간 후에는 각각 대조군의 약 1배 및 대조군의 1배였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, miR-21 모방체 및 miR-133 억제제에 의한 형질감염 24시간 후, COL1A2의 mRNA 발현은 각각 대조군의 약 1.4배 및 대조군의 약 1.4배였다. COL1A2의 mRNA 발현은 음성 대조군 miRNA 및 miR-132 억제제에 의한 형질감염 약 24시간 후에는 각각 대조군의 약 1배 및 대조군의 약 0.9배였다.
이에 따라, miR-21 모방체/miR-21 또는 miR-133 억제제의 형질감염은 YCB 세포에서 콜라겐 mRNA 발현을 증가시키는 것으로 나타났다.
이제 도 9a 및 9b를 참조하면, miR-21 모방체에 의한 형질감염 약 72시간 후, COL1A1의 단백질 발현은 증가되었는데, COL1A1의 단백질 발현은 약 1.2 상대적 발현이었다. COL1A1의 발현은 음성 대조군 miRNA에 의한 형질감염 약 72시간 후 약 1 상대적 발현이었다.
이제 도 10a 및 10b를 참조하면, miR-21 모방체 및 miR-132 억제제에 의한 형질감염 약 72시간 후, CTGF의 단백질 발현은 증가되었는데, COL1A1의 발현은 각각 약 1.4 및 약 1.6 상대적 발현이었다. CTGF의 발현은 음성 대조군 miRNA 및 miR-133 억제제에 의한 형질감염 약 72시간 후 약 1 상대적 발현 및 약 1 상대적 발현이었다.
본 실시예는 miRNA가 어류 부레 세포 (즉 YCB 세포)에서 콜라겐 발현을 조절할 수 있다는 것을 보여준다.
miR-21 모방체의 형질감염은 293 세포에서도 콜라겐 mRNA 발현을 증가시켰다. 본 발명자들은 miR-21 모방체를 인간 293 세포에 형질감염시키고, 형질감염 약 24시간 후에 콜라겐 mRNA 발현을 분석하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군 miRNA 군과 비교하였을 때, miR-21 모방체는 293 세포에서의 COL1A1 mRNA 발현을 증가시켰다.
도 11에 나타낸 바와 같이, miR-21에 의한 형질감염 약 24시간 후, COL1A1의 mRNA 발현은 대조군의 약 1.6-1.8배이다. COL1A1의 mRNA 발현은 음성 대조군 miRNA에 의한 형질감염 24시간 후, 대조군의 약 1배이다.
본 실시예는 콜라겐 발현에 대한 miRNA의 효과가 다른 세포 유형에서 재현될 수 있다는 것을 보여준다.
결론
본 실시예는 에피솜 수준에서 miRNA를 조절하는 것에 의해, 본 발명의 측면들이 여러 세포 유형에서 단백질 발현을 증가시킬 수 있다는 것을 보여준다. 특정 miRNA의 에피솜조절은 배양 고기 제조에서 세포의 생산성을 증가시키는 데에 사용될 수 있다.
상기한 상세한 설명은 예시적인 것으로서, 제한하는 것이 아니다. 개시내용을 검토하게 되면, 많은 실시양태의 변이들이 관련 기술분야 통상의 기술자에게 떠오르게 될 수 있다. 따라서, 실시양태의 영역은 상기한 상세한 설명을 참조하여 결정되어서는 아니 되며, 그 대신 해당하는 전체 영역 또는 등가물들과 함께 계류중인 청구범위를 참조하여 결정되어야 한다.
임의 실시양태의 1종 이상의 특징은 실시양태의 영역에서 벗어나지 않고도 임의의 다른 실시양태의 1종 이상의 특징과 조합될 수 있다. "하나"의 사용은 구체적으로 반대로 표시되지 않는 한 "하나 이상"을 의미하고자 하는 것이다. "및/또는"의 언급은 구체적으로 반대로 표시되지 않는 한 용어의 가장 포괄적인 의미를 나타내고자 하는 것이다.
본 개시내용이 많은 서로 다른 형태로 구현될 수 있기는 하지만, 본 개시내용이 1종 이상의 발명의 원리에 대한 예시로서 임의의 일 실시양태를 예시되는 실시양태로 제한하고자 하는 것은 아니라는 이해를 전제로 하여 도면 및 논의를 제시하는 바이다.
따라서, 해당하는 더 광의의 측면에서의 본 개시내용이 특정 세부사항, 대표적인 시스템 및 방법, 그리고 상기에서 나타내 기술한 예시적인 예들로 제한되는 것은 아니다. 본 개시내용의 영역 또는 기술사상에서 벗어나지 않고도 상기 명세서에 대하여 다양한 변형 및 변이들이 이루어질 수 있으므로, 하기 청구범위 및 그의 등가물의 영역 내에 그것이 해당된다는 전제하에 그와 같은 모든 변형 및 변이들을 본 개시내용으로 포괄하고자 한다.
예시적인 프로토콜
A. 어류 부레 세포주의 개발
1. 지역 어시장에서 건강한 옐로 크로커, 농어 또는 유사 범주의 어류를 입수한다.
2. 세포 단리시까지 얼음상에서 어류를 유지한다.
3. 10 % 표백제 중에 어류를 침지시킨다.
4. 무균 조건하에서 어류로부터 부레를 제거한다.
5. 차아염소산 중에서 1회 이상 상기 기관을 세척한다.
6. 항생제 배지 (400 lU/ml의 페니실린, 400 pg/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM) 중에서 1회 이상 기관을 세척한다.
7. 세척 후, 기관을 작은 조각 (2-3 mm3)으로 절단한다.
8. PBS 중 0.25 % 트립신-EDTA를 함유하는 원심분리기 튜브로 절단된 기관을 옮긴다.
9. 1시간 동안 연속 진탕하면서 실온으로 인큐베이팅한다.
10. 100 pm 메시를 사용하여 상청액을 여과함으로써, 분해되지 않은 조직을 제거한다.
11. 5분 동안 200g로 여과액을 원심분리한다.
12. 완전 배지 (200 lU/ml의 페니실린, 200 pg/ml의 스트렙토마이신, 10 % 소 태아 혈청을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM)를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁한다.
13. T25 플라스크에 세포를 시딩한다.
14. 24-28 ℃에서 인큐베이팅한다.
15. 다음날, 조직 배양 플라스크에 부착되지 않은 세포를 제거한다.
16. 2-3일마다 신규 배지를 사용하여 배지의 절반을 대체한다.
17. 완전한 단층이 형성되고 확립된 세포가 하위배양용으로 준비가 되면, 세포가 확립된 것으로 간주한다.
B. 조직 체외이식편에 의한 어류 부레 세포주의 개발
1. 지역 어시장에서 건강한 옐로 크로커, 농어 또는 유사 범주의 어류를 입수한다.
2. 세포 단리시까지 얼음상에서 어류를 유지한다.
3. 10 % 표백제 중에 어류를 침지시킨다.
4. 무균 조건하에서 어류로부터 부레를 제거한다.
5. 차아염소산 중에서 1회 이상 상기 기관을 세척한다.
6. 항생제 배지 (400 lU/ml의 페니실린, 400 pg/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM) 중에서 1회 이상 기관을 세척한다.
7. 세척 후, 기관을 작은 조각 (1-2 mm3)으로 절단한다.
8. 개별적으로 완전 배지 (200 lU/ml의 페니실린, 200 pg/ml의 스트렙토마이신, 10 % 소 태아 혈청을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM)를 함유하는 24 웰 플레이트에 기관 조각을 위치시킨다.
9. 24-28 ℃에서 인큐베이팅한다.
10. 조직 체외이식편을 교란하지 않으면서 2-3일마다 신규 배지를 사용하여 배지의 절반을 대체한다.
11. 유착 세포가 관찰될 때까지 조직 체외이식편을 인큐베이팅한다.
12. 조직 체외이식편을 제거한다.
13. 완전한 단층이 형성되고 확립된 세포가 하위배양용으로 준비가 되면, 세포가 확립된 것으로 간주한다.
C. 어류 근육 세포주의 개발
1. 지역 어시장에서 건강한 그루퍼, 대구, 서대기, 넙치류, 도다리 또는 유사 범주의 어류를 입수한다.
2. 세포 단리시까지 얼음상에서 어류를 유지한다.
3. 10 % 표백제 중에 어류를 침지시킨다.
4. 무균 조건하에서 어류로부터 근육을 제거한다.
5. 차아염소산 중에서 1회 이상 조직을 세척한다.
6. 항생제 배지 (400 lU/ml의 페니실린, 400 pg/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM) 중에서 1회 이상 조직을 세척한다.
7. 세척 후, 조직을 작은 조각 (2-3 mm3)으로 절단한다.
8. PBS 중 콜라게나제 및 디스파제를 함유하는 원심분리기 튜브로 절단된 조직을 옮긴다.
9. 1시간 동안 연속 진탕하면서 실온으로 인큐베이팅한다.
10. 100 pm 메시를 사용하여 상청액을 여과함으로써, 분해되지 않은 조직을 제거한다.
11. 5분 동안 200g로 여과액을 원심분리한다.
12. 완전 배지 (200 lU/ml의 페니실린, 200 pg/ml의 스트렙토마이신, 10 % 소 태아 혈청을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM)를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁한다.
13. T25 플라스크에 세포를 시딩한다.
14. 24-28 ℃에서 인큐베이팅한다.
15. 다음날, 조직 배양 플라스크에 부착되지 않은 세포를 제거한다.
16. 2-3일마다 신규 배지를 사용하여 배지의 절반을 대체한다.
17. 완전한 단층이 형성되고 확립된 세포가 하위배양용으로 준비가 되면, 세포가 확립된 것으로 간주한다.
D. 조직 체외이식편으로부터의 어류 근육 세포주의 개발
1. 지역 어시장에서 건강한 그루퍼, 대구, 서대기, 넙치류, 도다리 또는 유사 범주의 어류를 입수한다.
2. 세포 단리시까지 얼음상에서 어류를 유지한다.
3. 10 % 표백제 중에 어류를 침지시킨다.
4. 무균 조건하에서 어류로부터 근육을 제거한다.
5. 차아염소산 중에서 1회 이상 조직을 세척한다.
6. 항생제 배지 (400 lU/ml의 페니실린, 400 pg/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM) 중에서 1회 이상 조직을 세척한다.
7. 세척 후, 근육을 작은 조각 (1-2 mm3)으로 절단한다.
8. 개별적으로 완전 배지 (200 lU/ml의 페니실린, 200 pg/ml의 스트렙토마이신, 10 % 소 태아 혈청을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM)를 함유하는 24 웰 플레이트에 근육 조각을 위치시킨다.
9. 24-28 ℃에서 인큐베이팅한다.
10. 조직 체외이식편을 교란하지 않으면서 2-3일마다 신규 배지를 사용하여 배지의 절반을 대체한다.
11. 유착 세포가 관찰될 때까지 조직 체외이식편을 인큐베이팅한다.
12. 조직 체외이식편을 제거한다.
13. 완전한 단층이 형성되고 확립된 세포가 하위배양용으로 준비가 되면, 세포가 확립된 것으로 간주한다.
E. 성체 줄기 세포 단리 및 배양
1. 지역 어시장에서 건강한 그루퍼, 대구, 서대기, 넙치류, 도다리 또는 유사 범주의 6개월령 이하 어류를 입수한다.
2. 세포 단리시까지 얼음상에서 어류를 유지한다.
3. 10 % 표백제 중에 어류를 침지시킨다.
4. 무균 조건하에서 어류로부터 근육을 제거한다.
5. 차아염소산 중에서 1회 이상 조직을 세척한다.
6. 항생제 배지 (400 lU/ml의 페니실린, 400 pg/ml의 스트렙토마이신을 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM) 중에서 1회 이상 조직을 세척한다.
7. 세척 후, 조직을 작은 조각 (2-3 mm3)으로 절단한다.
8. PBS 중 콜라게나제 및 디스파제를 함유하는 원심분리기 튜브로 절단된 조직을 옮긴다.
9. 1시간 동안 연속 진탕하면서 실온으로 인큐베이팅한다.
10. 100 pm 메시를 사용하여 상청액을 여과함으로써, 분해되지 않은 조직을 제거한다.
11. 5분 동안 200g로 여과액을 원심분리한다.
12. 완전 배지 (200 lU/ml의 페니실린, 200 pg/ml의 스트렙토마이신, 10 % 소 태아 혈청, 100 ng/ml의 기본 섬유모세포 성장 인자를 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM)를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁한다.
13. 코팅되지 않은 플레이트상에서 24-28 ℃로 1시간 동안 세포를 플레이팅한다.
14. 상청액을 수확하고, 라미닌, 젤라틴, 마트리겔(Matrigel) 또는 유사 매트릭스로 코팅된 플레이트상에 위치시킨다.
15. 24-28 ℃에서 인큐베이팅한다.
16. 24시간 후, 임의의 느슨하게 부착된 비-유착 세포를 세척 제거한다.
17. 완전 배지 (200 lU/ml의 페니실린, 200 pg/ml의 스트렙토마이신, 10 % 소 태아 혈청, 100 ng/ml의 기본 섬유모세포 성장 인자를 포함하는 레이보비츠 L-15 또는 DMEM 또는 EMEM)를 사용하여 매일 배지를 대체한다.
F. iPSC의 생성 및 배양
1. 형질감염 2-4일 전에, 조직 배양 플라스크 중 완전 배지 (10 % FBS를 포함하는 L15)에 세포를 플레이팅한다. 형질감염일 (0일차)에, 세포는 대략 75-90 % 합류되어야 한다.
2. 젤라틴 코팅된 6-웰 플레이트로부터 배지를 흡인하고, 웰 당 2 mL의 신규 완전 배지로 대체한다. 코팅된 플레이트를 사용 준비될 때까지 37 ℃에 위치시킨다.
3. 37 ℃에서 Epi5™ 벡터를 해동하고, 사용 준비시까지 그것을 습윤한 얼음상에 위치시킨다. 사용 전에, 해동된 벡터를 간단하게 원심분리하여 튜브의 저부에 그것을 수집한다.
4. PBS 중에서 세포를 세척한다.
5. 세포를 함유하는 배양 플라스크에 3 mL의 0.05 % 트립신/EDTA를 첨가한다.
6. 3분 동안 실온에서 플라스크를 인큐베이팅한다.
7. 5-8 mL의 완전 배지를 각 플라스크에 첨가한다. 세포를 조심스럽게 빈 멸균 15 mL 원추형 튜브로 옮긴다.
8. 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
9. 2분 동안 200g로 세포를 원심분리한다.
10. 상청액의 대부분을 조심스럽게 흡인하고, 완전 배지를 사용하여 재현탁한다.
11. 세포를 6-웰 플레이트의 젤라틴 코팅된 접시 플레이트상에 2 mL 완전 배지 중 30-60 % 합류에서 웰 당 50,000 내지 100,000개 세포로 시딩하고, 밤새 24-28 ℃로 인큐베이팅한다.
12. 옵티(Opti)-MEM/환원-혈청 배지를 실온으로 예비가온하고, 하기하는 바와 같이 튜브 A 및 튜브 B를 제조한다.
13. 각각 1.2 μL인 2개 Epi5™ 재프로그래밍 벡터 혼합물 (총 2.4 μL)을 튜브 A로 표지된 1.5 mL 미세원심분리기 튜브 중 118 μL의 옵티-MEM 배지에 첨가한다. 4.8 μL의 P3000™ 시약을 첨가하고, 충분히 혼합한다.
14. 3.6 μL의 리포펙타민 3000 시약을 튜브 B로 표지된 1.5 mL 미세원심분리기 튜브 중 121 μL의 예비가온된 옵티-MEM 배지에 희석한다.
15. 형질감염 모 혼합물을 제조하기 위하여, 튜브 A의 내용물을 튜브 B에 첨가하고, 충분히 혼합한다.
16. 실온에서 5분 동안 형질감염 모 혼합물을 인큐베이팅한다.
17. 1회 더 혼합하고, 전체 250 μL의 형질감염 모 혼합물을 각 웰에 첨가한다.
18. 24-28 ℃에서 밤새 인큐베이팅한다.
19. 형질감염 24시간 후, 플레이트로부터 배지를 흡인한다. 2 mL의 N2B27 배지 (IX N-2 보충물, IX B27 보충물, 100 ng/mL의 bFGF를 포함하는 L15)를 각 웰에 첨가한다.
20. 폐 배지를 2 mL의 N2B27 배지로 대체하는 것에 의해, 총 14일 동안 매일 N2B27 배지를 교체한다.
21. 14일차에, 폐 N2B27 배지를 흡인하고, 완전 배지를 사용하여 그것을 대체한다. 웰 당 2 mL로 매일 배지 교체를 재개한다.
22. 격일로 현미경하에서 형질전환된 세포를 표시하는 세포 덩어리의 출현에 대하여 플레이트를 관찰한다. 형질감염 후 15 내지 21일 이내에, iPSC 집락이 전달하기에 적절한 크기로 성장하게 된다.
23. 집락은 21일차까지 구별되며, 추가적인 배양 및 증식을 위하여 선발될 수 있다.
G. 세포의 하위배양 방법
1. 배양 배지를 제거하여, 폐기한다.
2. 세포를 PBS로 간단하게 세정함으로써, 트립신 억제제를 함유하는 혈청 중 모든 미량물질을 제거한다.
3. 2-3 mL의 0.25 % 트립신-EDTA 용액을 플라스크에 첨가한다.
4. 1분 동안 실온에서 인큐베이팅한다.
5. 5-8 mL의 완전 성장 배지를 첨가한다.
6. 약하게 피펫팅하는 것에 의해 세포를 흡인한다.
7. 1:2 내지 1:3의 하위배양 비로 새로운 배양 플라스크에 적절한 분취량의 세포 현탁액을 첨가한다.
8. 24-28 ℃에서 인큐베이팅한다.
H. 현탁 배양으로의 적합화
1. 트립신처리에 의해 문제 세포에 적절한 빈도로 단층 배양물을 계대시킨다.
2. 각 계대에서, PBS를 사용하여 세포 단층을 세척하고, 0.25 % 트립신을 피복한다.
3. 5분 동안 실온에서 인큐베이팅한다.
4. 완전 배지를 사용하여 효소를 불활성화한다.
5. 세포 현탁액을 수확하고, 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
6. 세포 현탁액을 또 다른 배양 플라스크에 시딩한다.
7. 현탁된 세포의 생존력이 90 % 이상이 될 때까지 반복 계대시킨다.
8. 0.1-0.5 백만개/ml의 세포 밀도로 스피너 또는 셰이커 플라스크에서 50 ml의 완전 배지를 사용하여 현탁 배양을 확립한다.
9. 단층 배양에 최적인 동일한 온도, 습도 및 대기 조건하에 CO2 인큐베이터에서 스피너 또는 셰이커 플라스크 현탁 배양물을 인큐베이팅한다.
10. 2-3일마다 신규 배지를 사용하여 0.1-0.5 백만개/ml의 세포 밀도로 조정한다.
11. 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
12. 건강한 세포 성장을 촉진하는 세포 밀도에서 다수의 병행 배양물들을 확립한다.
13. 배양물의 일부를 사용하여 세포 밀도를 점차적으로 1 백만개/ml로 증가시킨다.
14. 증가하는 세포 밀도가 세포 사멸로 이어지는 경우, 고-밀도 배양물을 폐기한다.
15. 세포 형성 단계 12를 사용하여 고밀도 적합화를 재개한다.
16. 세포가 현탁액 중에서 성장하도록 적합화되는 경우, 3 L 생물반응기로 규모를 증대한다.
I. 무혈청 배지 (식물 가수분해물 ) 로의 적합화
1. DMEM/F12 완전 배지 (DMEM 배지와 햄 F12 배지의 1:1 혼합물, 2-4 mM의 글루타민, 10 % FBS) 중에서 세포를 배양한다.
2. 무혈청 배지 (DMEM 배지와 햄 F12 배지의 1:1 혼합물, 2-4 mM의 글루타민, 20 %의 식물 가수분해물 예컨대 콩, 면실, 평지씨, 밀, 효모 또는 등가물)를 제조한다.
3. 세포가 합류에 도달하면, 적합화 배지 I (40 %의 신규 완전 배지, 이전 계대로부터의 40 %의 컨디셔닝된 배지, 20 %의 무혈청 배지)을 사용하여 배지를 대체한다.
4. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
5. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 3을 반복한다.
6. 세포가 합류에 도달하면, 적합화 배지 II (30 %의 신규 완전 배지, 단계 1 세포로부터의 30 %의 컨디셔닝된 배지, 40 %의 무혈청 배지)를 사용하여 배지를 대체한다.
7. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
8. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 6을 반복한다.
9. 세포가 합류에 도달하면, 적합화 배지 III (20 %의 신규 완전 배지, 단계 1 세포로부터의 20 %의 컨디셔닝된 배지, 60 %의 무혈청 배지)을 사용하여 배지를 대체한다.
10. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
11. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 9를 반복한다.
12. 세포가 합류에 도달하면, 적합화 배지 IV (10 %의 신규 완전 배지, 단계 1 세포로부터의 10 %의 컨디셔닝된 배지, 80 %의 무혈청 배지)를 사용하여 배지를 대체한다.
13. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
14. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 12를 반복한다.
15. 세포가 합류에 도달하면, 무혈청 배지를 사용하여 배지를 대체한다.
16. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
17. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 15를 반복한다.
18. 무혈청 배지 사용은 매 단계에서 점차적으로 더 증가될 수 있는데, 다시 말하자면 매 단계에서의 20 % 이하의 증가이다.
J. 무혈청 배지 (화학적으로 규정된 것)로의 적합화
1. DMEM/F12 완전 배지 (DMEM 배지와 햄 F12 배지의 1:1 혼합물, 2-4 mM의 글루타민, 10 % FBS) 중에서 세포를 배양한다.
2. 무혈청 배지 (DMEM 배지와 햄 F12 배지의 1:1 혼합물, 2-4 mM의 글루타민, 아스코르브산 2-포스페이트 65-130 ug/ml, NaHCO3 550-1100 ug/ml, 소듐 셀레나이트 14-28 ng/ml, 인슐린 19-38 ug/ml, 트랜스페린 11-22 ug/ml, FGF-2 100-200 ng/ml, TGF-베타 2-4 ng/ml)를 제조한다.
3. 세포가 합류에 도달하면, 적합화 배지 I (40 %의 신규 완전 배지, 이전 계대로부터의 40 %의 컨디셔닝된 배지, 20 %의 무혈청 배지)을 사용하여 배지를 대체한다.
4. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
5. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 3을 반복한다.
6. 세포가 합류에 도달하면, 적합화 배지 II (30 %의 신규 완전 배지, 단계 1 세포로부터의 30 %의 컨디셔닝된 배지, 40 %의 무혈청 배지)를 사용하여 배지를 대체한다.
7. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
8. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 6을 반복한다.
9. 세포가 합류에 도달하면, 적합화 배지 III (20 %의 신규 완전 배지, 단계 1 세포로부터의 20 %의 컨디셔닝된 배지, 60 %의 무혈청 배지)을 사용하여 배지를 대체한다.
10. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
11. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 9를 반복한다.
12. 세포가 합류에 도달하면, 적합화 배지 IV (10 %의 신규 완전 배지, 단계 1 세포로부터의 10 %의 컨디셔닝된 배지, 80 %의 무혈청 배지)를 사용하여 배지를 대체한다.
13. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
14. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 12를 반복한다.
15. 세포가 합류에 도달하면, 무혈청 배지를 사용하여 배지를 대체한다.
16. 2-3일마다 트리판 블루 염료 배제 세포 생존력 검정에 의해 생존력을 점검한다.
17. 적합화가 세포 사멸로 이어지는 경우, 배양물을 폐기하고, 단계 15를 반복한다.
18. 무혈청 배지 사용은 매 단계에서 점차적으로 더 증가될 수 있다. 예를 들면, 매 단계에서 20 % 이하의 증가이다.
L. 세포 배양용 스캐폴딩 ( 곤약 + 검)
1. 색상이 옅은 황색이 될 때까지 사프란 몇 조각과 함께 물을 끓인다.
2. 사프란을 제거하고, 따뜻해질 때까지 용액을 방치한다.
3. 완전 건조 성분을 제조한다
a. 곤약 - 0.5-5 %, 바람직하게는 3 %
b. 베이킹 소다 - 0.3-3 %, 바람직하게는 2 %
c. 완성 크산탄 검(Perfected Xanthan Gum) - 0.2-2 %, 바람직하게는 1.5 %.
4. 100 ml의 사프란 용액을 칭량한다.
5. 베이킹 소다, 크산탄 검을 순차적으로 첨가한다. 각 성분을 첨가한 후, 혼합물을 충분히 교반한다.
6. 용액의 상부에 조금씩 뿌리는 것에 의해 곤약을 첨가한다. 교반을 유지한다. 용액이 죽 모양이 되어야 한다.
7. 대략 1-15 mm의 두께로 몰드에 곤약 혼합물을 바른다.
8. 뚜껑으로 몰드를 덮고, 30분 초과 동안 실온하에 방치한다.
9. 몰드를 4 ℃ 냉장고에 4시간 동안 넣어둔다.
10. 40분 동안 적은 열로 몰드를 찐다.
11. 2시간 동안 실온하에 몰드를 방치한다.
12. 15분 동안 45-55 ℃에서 스캐폴드를 탈수한다.
M. 세포 배양용 스캐폴딩 ( 알기네이트 + 곤약 )
1. 0.1-2 g (0.1-2 %), 바람직하게는 약 1 g (1 %)의 소듐 알기네이트를 칭량한다.
2. 100 ml의 물을 블렌더에 첨가한다.
3. 알기네이트 분말을 블렌더에 첨가하고, 용해될 때까지 혼합물을 블렌딩한다.
4. 플라스틱 필름으로 용기를 덮고, 밤새 냉장고에 알기네이트 용액을 넣어둠으로써, 기포를 제거한다.
5. 0.5-5 g, 바람직하게는 약 3 g의 곤약을 칭량하고, 몰드에 넣는다.
6. 대략 1-15 mm, 바람직하게는 약 8 mm의 두께로 몰드에 알기네이트 용액을 첨가한다.
7. 모든 가루가 용해될 때까지 혼합물을 교반한다.
8. 형상이 고정될 때가지 30분 동안 적은 열로 혼합물을 찐다.
9. 뚜껑으로 몰드를 덮고, 30분 동안 실온하에 방치한다.
10. 0.1-2 %, 바람직하게는 약 1.5 % 칼슘 락테이트를 칭량하고 교반함으로써 수중에 용해시킨다.
11. 적어도 2.5시간 동안 0.1-2 %, 바람직하게는 약 1.5 % 칼슘 락테이트 용액으로 스캐폴드를 침지시킴으로써, 스캐폴드 주변으로의 멤브레인의 형성을 가능하게 한다.
[서열 목록]
<160> 서열식별번호의 수: 3
<210> 서열식별번호 1
<211> 길이: 23
<212> 유형: RNA
<213> 생물: 호모 사피엔스(Homo sapiens)
<220> 특징:
<223> 기타 정보: miRBase 수탁 번호: MI0033728
<400> 서열: 1
uagcuuauca gacugguguu ggc 23
<210> 서열식별번호 2
<211> 길이: 22
<212> 유형: RNA
<213> 생물: 호모 사피엔스
<220> 특징:
<223> 기타 정보: miRBase 수탁 번호: MI0000449
<400> 서열: 2
uaacagucua cagccauggu cg 22
<210> 서열식별번호 3
<211> 길이: 22
<212> 유형: RNA
<213> 생물: 호모 사피엔스
<220> 특징:
<223> 기타 정보: miRBase 수탁 번호: MI0000822
<400> 서열: 3
uuuggucccc uucaaccagc ua 22

Claims (8)

  1. 동물 또는 식물 공급원으로부터 조직을 단리하여 세포들의 세포 현탁액을 제조하는 것;
    단백질의 발현을 조절하는 1종 이상의 마이크로 RNA의 수준을 변경하는 것에 의해 단리된 세포에서의 단백질의 발현을 증가시키는 것; 및
    배양 배지 중 식품 등급 스캐폴드상에서 세포를 성장시키는 것이며, 세포는 동물 기관을 모방한 고체 또는 반-고체 구조로 성장하는 것
    을 포함하는, 시험관내 세포 배양에 의한 고기 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 조직을 단리하는 것이 어류로부터 기관 조직을 단리하는 것을 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 기관 조직이 오스테이크타이에스(Osteichthyes) 강에 속하는 어류의 어류 부레로부터 유래하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 단백질이 콜라겐 I인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 마이크로 RNA가 마이크로 RNA21 (miR-21), 마이크로 RNA 133 (miR133) 억제제 또는 이들의 조합인 방법.
  6. 동물 또는 식물 공급원으로부터 조직을 단리하여 세포들의 세포 현탁액을 제조하는 것;
    배양 배지 중 식품 등급 스캐폴드상에서 세포를 성장시키는 것이며, 세포는 동물 기관을 모방한 고체 또는 반-고체 구조로 성장하는 것; 및
    세포를 세포의 성장을 지원하는 영양소, 성장 인자 및 시토카인을 분비하는 생물조작된 세포와 공동-배양하는 것
    을 포함하는, 시험관내 세포 배양에 의한 고기 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 조직을 단리하는 것이 어류로부터 기관 조직을 단리하는 것을 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 기관 조직이 오스테이크타이에스 강에 속하는 어류의 어류 부레로부터 유래하는 것인 방법.
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