CN104109705B - 一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，包括以下步骤：(1)除去海鲈鱼加工副产物中的杂蛋白及杂质，并打开胶原蛋白的三股螺旋结构；(2)加酸提取预处理后海鲈鱼加工副产物中的胶原蛋白，冷冻干燥后得到的胶原蛋白粉作为下一步酶解制备胶原蛋白肽的底物；(3)加水制成胶原蛋白溶液，向其中加入蛋白酶进行酶解，将胶原蛋白转化成胶原蛋白肽；(4)灭酶，冷却；(5)脱腥脱色；(6)离心，取上清液；(7)通过膜分离截留上清液中分子量1000~3000Da的胶原蛋白肽组分；(8)将膜分离所得的胶原蛋白肽组分旋转蒸发浓缩；(9)冻干成粉末。该方法是由酶法结合膜分离技术从海鲈鱼加工副产物中制备具有伤口愈合作用的高活性的生物活性肽。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物活性肽的制备方法，尤其涉及一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法。
背景技术
海鲈鱼（学名 Lateolabrax japonicus）又称七星鲈、花鲈，为辐鳍鱼纲鲈形目真鲈科花鲈属，分布于西太平洋，是广东省产量最大的海洋经济鱼。海鲈鱼在加工过程中会产生大量鱼头、鱼骨和鱼皮等副产物，通常丢弃或者加工成动物饲料，既污染了环境又浪费了资源。Nagai等发现海鲈的鱼皮、鱼骨和鱼鳍中胶原蛋白的含量分别为51.4%、40.7%和41.6%（以干基计）。胶原蛋白由于其三股螺旋结构性质比较稳定，进入人体小肠后吸收率很低；但是降解为胶原蛋白肽以后吸收率可高达90%。因此，从鱼加工副产物中制备生物活性肽已经成为研究热点。已有报道采用木瓜蛋白酶水解鱼皮明胶制备抗氧化肽，Zhuang等采用碱性蛋白酶水解海蜇胶原蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽。然而，从鱼加工副产物中制备具有伤口愈合作用生物活性肽的研究还很少。
目前，针对创伤患者专用型临床营养品在市场上非常缺乏，急需开发有助于伤口愈合的功能配料。成纤维细胞是非常重要的创伤修复细胞，在伤口愈合过程中参与肉芽组织形成，合成并分泌胶原、纤维连接蛋白和透明质酸等细胞外基质来参与皮肤组织重塑过程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，该方法是由酶法结合膜分离技术从海鲈鱼加工副产物中制备具有伤口愈合作用的高活性的生物活性肽，可以解决现有海鲈鱼加工副产物浪费得不到合理利用以及创伤患者专用临床营养品配料缺乏的问题。
为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，包括以下步骤：
(1) 预处理：将海鲈鱼加工副产物洗净绞碎，依次经碱性溶液脱杂蛋白、酸脱钙和脱脂处理，除去杂蛋白及杂质，并打开胶原蛋白的三股螺旋结构，便于酶解；
(2) 胶原蛋白的提取：加酸提取预处理后海鲈鱼加工副产物中的胶原蛋白，冷冻干燥后得到的胶原蛋白粉作为下一步酶解制备胶原蛋白肽的底物；
(3) 酶解：加水制成胶原蛋白溶液，向其中加入蛋白酶进行酶解，将胶原蛋白转化成胶原蛋白肽；
(4) 灭酶：对得到的酶解液进行灭酶，冷却；
(5) 脱腥脱色：向灭酶后的酶解液中加入适量活性炭，以脱腥脱色；
(6) 离心：将脱腥脱色后的酶解液离心，取上清液；
(7) 膜分离：通过膜分离截留上清液中分子量1000~3000Da的胶原蛋白肽组分；
(8) 浓缩：将膜分离所得的胶原蛋白肽组分旋转蒸发浓缩，便于冻干；
(9) 冻干：将浓缩后上清液冷冻干燥成粉末，即为成品，于干燥条件下贮存起来。
以海鲈鱼加工副产物为原料，其中必存在杂蛋白、钙、油脂等杂质，这必会影响胶原蛋白的纯度，因而在提取胶原蛋白前必须去除上述杂质。杂蛋白能溶解于碱性溶液中，因此在预处理中采用碱性溶液对海鲈鱼加工副产物进行处理，将杂蛋白溶解除去，然后在脱钙脱脂。在碱性溶液对海鲈鱼加工副产物溶解杂蛋白的同时，由于碱性溶液的水解作用，使得胶原蛋白的三股螺旋结构被打开，有利于提高后续酶解效果。
进一步地，所述步骤(1)中具体处理步骤为：往海鲈鱼加工副产物中添加其质量15~20倍的0.1mol/L的氢氧化钠溶液浸泡15~30h，以去除杂蛋白；用蒸馏水洗至中性，再用其质量15~20倍的0.6mol/L的盐酸浸泡15~30h以脱钙；用蒸馏水洗至中性，最后用其质量2~3倍的8~12%的乙醚浸泡15~30h，反复两次，共脱脂40~48h。
进一步地，所述步骤(2)中具体处理步骤为：脱脂完成后，海鲈鱼加工副产物经蒸馏水洗涤，沥干，用等量的0.5mol/L的乙酸溶液浸泡2~3d，4000~4500r/min离心15~20min后取上清，冷冻干燥后，以海鲈鱼加工副产物的干重计，胶原蛋白得率为10-22%。
进一步地，所述步骤(3)中胶原蛋白溶液的质量体积浓度为10%，所用蛋白酶为碱性蛋白酶。碱性蛋白酶的酶解条件是：酶添加量为底物重量的2~3%、酶解温度45~50℃、酶解时间2~4h和pH值 8.5~9.5，在此条件下胶原蛋白肽提取率为40~48.6%。
进一步地，所述步骤(4)中，灭酶操作是：90~95℃水浴加热10~15min灭酶。
进一步地，所述步骤(5)中脱腥脱色条件为：加入胶原蛋白重量4~6%的活性炭，45℃水浴加热40-50min。
进一步地，所述步骤(6)中的具体操作为：4000~4500r/min离心15~20min。
进一步地，所述步骤(7)中的具体操作为：依次采用3000Da和1000Da的超滤膜截留离心后的上清液，分离得到1000~3000Da的胶原蛋白肽组分。
进一步地，所述步骤(8)中的具体操作为：将分离得到的胶原蛋白肽组分于50℃旋转蒸发20-30min。
进一步地，所述步骤(9)中的具体操作为：-80至-20℃冷冻干燥40~48h即可得海鲈鱼胶原蛋白肽产品。
本发明所得的海鲈鱼胶原蛋白肽产品含苯丙氨酸20~50μg/100mg，甘氨酸30~50μg/100mg，赖氨酸10~20μg/100mg。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
(1) 本发明以成纤维细胞增殖活性为评价指标，筛选采用碱性蛋白酶结合膜分离技术来制备具有伤口愈合作用的生物活性肽，分子量在1000-3000Da，含苯丙氨酸20~50μg/100mg，甘氨酸30~50μg/100mg，赖氨酸10~20μg/100mg，通过动物实验验证该生物活性肽可以增加伤口组织的羟脯氨酸含量和促进伤口愈合，因此可用作创伤患者专用临床营养品的配料。
本发明制备的海鲈鱼胶原蛋白肽促进伤口愈合的动物实验结果：
1、试验条件
1.1样品
本发明制备的海鲈鱼胶原蛋白肽粉末（SBCP）。
1.2 实验动物
KM小鼠，雄性，体重18-22g，SPF级，由南方医科大学实验动物中心提供。
1.3分组及处理
(1)分组
KM小鼠72只，适应性喂养1周后随机分为4组，每组18只，包括对照组（Control）和3个SBCP剂量组。SBCP低剂量组（Low）给药浓度为0.2g/ kg•bw，SBCP中剂量组（Moderate）给药浓度为0.66 g/ kg•bw，高剂量组（High）给药浓度为2.0 g/ kg•bw。
(2)处理
每日除了饲喂各组小鼠2 g/10g•bw基础饲料，还需在上午11：00灌胃相应的药物，灌胃体积为200μl/10g•bw。对照组给予等体积生理盐水灌胃。分别在第5、9、15天各组随机挑选6只小鼠拉颈处死。
1.4数据分析
采用SPSS进行数据分析。
2、实验结果
2.1海鲈鱼胶原蛋白肽对小鼠皮肤伤口愈合率的影响如表1和图1所示：
表1和图1所示的实验结果表明：在伤口愈合的前4天，四组小鼠的伤口愈合率无显著差异，第6天，中剂量组小鼠的伤口愈合率显著高于对照组(p<0.05)，从第10天开始，低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠的伤口愈合率均显著高于对照组(p<0.05)，这个结果表明海鲈鱼胶原蛋白肽具有促进小鼠伤口愈合的作用。
2.2海鲈鱼胶原蛋白肽对小鼠皮肤伤口组织中羟脯氨酸含量的影响如表2所示：
实验结果表明：在伤口愈合过程中，低剂量组小鼠伤口组织的羟脯氨酸含量和对照组无显著差异，而从第9天开始，中剂量组小鼠伤口组织的羟脯氨酸含量显著高于对照组(p<0.05)，第15天，高剂量组小鼠的伤口组织中羟脯氨酸含量也显著高于对照组(p<0.05)，这个结果表明服用海鲈鱼胶原蛋白肽可以增加伤口组织的羟脯氨酸含量，从而促进伤口愈合。
综上所述，海鲈鱼胶原蛋白肽可以显著提高伤口组织中羟脯氨酸含量，具有促进伤口愈合的作用。
(2) 成纤维细胞是非常重要的创伤修复细胞，参与了创伤愈合的全过程，以成纤维细胞增殖活性为评价指标，比较不同的胰蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶分别水解海鲈鱼副产物中的胶原蛋白制备的胶原蛋白肽对NIH/3T3成纤维细胞增殖的影响，发现碱性蛋白酶制备的胶原蛋白肽促进NIH/3T3成纤维细胞增殖活性最好，碱性蛋白酶制备的生物活性肽能使NIH/3T3成纤维细胞培养48h后增殖1倍，优于胰蛋白酶和木瓜蛋白酶（参见图2）。因此，本发明采用碱性蛋白酶对海鲈鱼加工副产物中的胶原蛋白进行酶解，获得活性较高的胶原蛋白肽。同时，本发明还以与伤口愈合密切相关的NIH/3T3成纤维细胞增殖活性为评价指标，优化建立了酶法制备胶原蛋白肽的工艺条件，结合膜分离技术分离得到了分子量在1000-3000Da的生物活性肽。
(3) 本发明为海鲈鱼加工副产物综合利用提供一种新的途径，拓宽了海鲈鱼加工副产物的利用途径，增加了其附加值，同时也可以提升产品的附加值和企业的竞争力，也对促进功能食品行业的健康持续发展具有重要意义。
附图说明
图1是海鲈鱼胶原蛋白肽对小鼠伤口愈合率的影响。
图2是比较不同蛋白酶制备的胶原蛋白肽对NIH/3T3细胞增殖率的影响的曲线图。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员理解，下面将结合实施例对本发明进行进一步描述。
实施例1
(1) 将1kg海鲈鱼的鱼皮和鱼骨洗净绞碎，用15L的0.1mol/L的氢氧化钠溶液浸泡15h，以去除杂蛋白；用蒸馏水洗至中性，再用15L的0.6mol/L的盐酸浸泡15h，以脱钙；用蒸馏水洗至中性，最后用2L的10%的乙醚浸泡24h，反复两次，共脱脂48h；
(2) 脱脂完成后，经蒸馏水反复洗涤，沥干，用1L的0.5mol/L的乙酸溶液浸泡3d，4000r/min离心20min后取上清，冻干即可得200g胶原蛋白；
(3) 在200g胶原蛋白中加入2L蒸馏水和4.6g碱性蛋白酶，在温度45℃和pH值 9.0的条件下酶解3.0h，胶原蛋白肽的提取率为48%；
(4) 90℃水浴加热10min灭酶；
(5) 加入10g活性炭，45℃水浴加热40min；
(6) 4000r/min离心20min；
(7) 依次采用3000Da和1000Da的超滤膜截留离心后的上清液，分离得到1000~3000Da的胶原蛋白肽组分；
(8) 50℃旋转蒸发25min
(9) -80℃冷冻干燥40h即可得海鲈鱼胶原蛋白肽粉，该产品含苯丙氨酸50μg/100mg，甘氨酸32μg/100mg，赖氨酸12μg/100mg。
制备的海鲈鱼胶原蛋白肽按前述动物实验部分描述的方法进行伤口愈合实验，中、高剂量组在第14天的伤口愈合率分别为95.2%、92.8%，显著高于对照组（84.6%）(p<0.05)；并且中、高剂量组伤口组织中羟脯氨酸含量分别为2.7、2.4 mg·g-1 组织，显著高于对照组（2.1 mg·g-1 组织）(p<0.05)。
实施例2
(1) 将300g海鲈鱼的鱼头和鱼骨洗净绞碎，用6L的0.1mol/L的氢氧化钠溶液浸泡30h，以去除杂蛋白；用蒸馏水洗至中性，再用6L的0.6mol/L的盐酸浸泡30h，以脱钙；用蒸馏水洗至中性，最后用0.9L的10%的乙醚浸泡24h，反复两次，共脱脂48h；
(2) 脱脂完成后，经蒸馏水洗涤，沥干，用0.3L的0.5mol/L的乙酸溶液浸泡3d，4500r/min离心15min后取上清，冻干即可得30g胶原蛋白；
(3) 在30g胶原蛋白中加入0.3L蒸馏水和0.9g碱性蛋白酶，在温度50℃和pH值9.5的条件下酶解4.0h，胶原蛋白肽的提取率为42%；
(4) 95℃水浴加热15min灭酶；
(5) 加入1.8g活性炭，45℃水浴加热50min；
(6) 4500r/min离心15min；
(7) 依次采用3000Da和1000Da的超滤膜将离心后的上清液截留分离得到1000~3000Da的胶原蛋白肽组分；
(8)50℃旋转蒸发30min
(9) -60℃冷冻干燥48h即可得海鲈鱼胶原蛋白肽粉，该产品含苯丙氨酸20μg/100mg，甘氨酸42μg/100mg，赖氨酸12μg/100mg。
制备的海鲈鱼胶原蛋白肽按前述动物实验部分描述的方法进行伤口愈合实验，中、高剂量组在第14天的伤口愈合率分别为96.1%、93.9%，显著高于对照组（82.6%）(p<0.05)；并且中、高剂量组伤口组织中羟脯氨酸含量分别为2.6、2.5 mg·g-1 组织，显著高于对照组（1.9 mg·g-1 湿重）(p<0.05)。
实验例3：
(1) 将1kg海鲈鱼的鱼皮和鱼骨洗净绞碎，用20L的0.1mol/L的氢氧化钠溶液浸泡24h，以去除杂蛋白；用蒸馏水洗至中性，再用20L的0.6mol/L的盐酸浸泡24h，以脱钙；用蒸馏水洗至中性，最后用20L的10%的乙醚浸泡24h，反复两次，共脱脂48h；
(2) 脱脂完成后，经蒸馏水反复洗涤，沥干，用1L的0.5mol/L的乙酸溶液浸泡2d，4400r/min离心15min后取上清，冻干即可得200g胶原蛋白；
(3) 在200g胶原蛋白中加入2L蒸馏水和4.6g碱性蛋白酶，在温度45℃和pH值 9.0的条件下酶解2.0h，胶原蛋白肽的提取率为45%；
(4) 95℃水浴加热10min灭酶；
(5) 加入12g活性炭，45℃水浴加热40min；
(6) 4500r/min离心15min；
(7) 依次采用3000Da和1000Da的超滤膜截留离心后的上清液，分离得到1000~3000Da的胶原蛋白肽组分；
(8) 50℃旋转蒸发25min
(9) -50℃冷冻干燥48h即可得海鲈鱼胶原蛋白肽粉，该产品含苯丙氨酸45μg/100mg，甘氨酸32μg/100mg，赖氨酸20μg/100mg。
制备的海鲈鱼胶原蛋白肽按前述动物实验部分描述的方法进行伤口愈合实验，中、高剂量组在第14天的伤口愈合率分别为97.1%、93.3%，显著高于对照组（86.6%）(p<0.05)；并且中、高剂量组伤口组织中羟脯氨酸含量分别为2.7、2.6 mg·g-1 湿重，显著高于对照组（2.0mg·g-1 湿重）(p<0.05)。
以上所述实施例仅表达了本发明的部分种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)预处理：将海鲈鱼加工副产物洗净绞碎，依次经碱性溶液脱杂蛋白、酸脱钙和脱脂处理，除去杂蛋白及杂质，并打开胶原蛋白的三股螺旋结构，便于酶解；
(2)胶原蛋白的提取：加酸提取预处理后海鲈鱼加工副产物中的胶原蛋白，冷冻干燥后得到的胶原蛋白粉作为下一步酶解制备胶原蛋白肽的底物；
(3)酶解：加水制成胶原蛋白溶液，向其中加入碱性蛋白酶进行酶解，酶添加量为底物重量的2～3％，酶解温度45～50℃，酶解时间2～4h和pH值8.5～9.5，将胶原蛋白转化成胶原蛋白肽；
(4)灭酶：对得到的酶解液进行灭酶，冷却；
(5)脱腥脱色：向灭酶后的酶解液中加入适量活性炭，以脱腥脱色；
(6)离心：将脱腥脱色后的酶解液离心，取上清液；
(7)膜分离：通过膜分离截留上清液中分子量1000～3000Da的胶原蛋白肽组分，其含苯丙氨酸20～50μg/100mg，甘氨酸30～50μg/100mg，赖氨酸10～20μg/100mg；
(8)浓缩：将膜分离所得的胶原蛋白肽组分旋转蒸发浓缩，便于冻干；
(9)冻干：将浓缩后上清液冷冻干燥成粉末，即为成品，于干燥条件下贮存起来。
2.根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述步骤(1)中具体处理步骤为：往海鲈鱼加工副产物中添加其质量15～20倍的0.1mol/L的氢氧化钠溶液浸泡15～30h，以去除杂蛋白；用蒸馏水洗至中性，再用其质量15～20倍的0.6mol/L的盐酸浸泡15～30h以脱钙；用蒸馏水洗至中性，最后用其质量2～3倍的8～12％的乙醚浸泡15～30h，反复两次，共脱脂40～48h。
3.根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述步骤(2)中具体处理步骤为：脱脂完成后，海鲈鱼加工副产物经蒸馏水洗涤，沥干，用等量的0.5mol/L的乙酸溶液浸泡2～3d，4000～4500r/min离心15～20min后取上清，冷冻干燥后，以海鲈鱼加工副产物的干重计，胶原蛋白得率为10-22％。
4.根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述步骤(3)中胶原蛋白溶液的质量体积浓度为10％。
5.根据权利要求4所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所得胶原蛋白肽提取率为40～48.6％。
6.根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，灭酶操作是：90～95℃水浴加热10～15min灭酶。
7.根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述步骤(5)中脱腥脱色条件为：加入胶原蛋白重量4～6％的活性炭，45℃水浴加热40-50min。
8.根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述步骤(7)中的具体操作为：依次采用3000Da和1000Da的超滤膜截留离心后的上清液，分离得到1000～3000Da的胶原蛋白肽组分。
9.根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述步骤(6)中的具体操作为：4000～4500r/min离心15～20min；所述步骤(8)中的具体操作为：将分离得到的胶原蛋白肽组分于50℃旋转蒸发20-30min；所述步骤(9)中的具体操作为：-80至-20℃冷冻干燥40～48h即得海鲈鱼胶原蛋白肽产品。
10.一种权利要求1～9任一项所述的方法制备的海洋胶原蛋白肽用于制备伤口愈合药物的用途。
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