CN109096392B - 皮肤修复用胶原蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种皮肤修复用胶原蛋白及其制备方法。本发明以海参为原料，采用超高压处理法、蛋白酶酶解法等方法对海参进行处理，同时使用脱腥剂对酶解液进行脱腥处理，制备出的皮肤修复用胶原蛋白活性成分含量高，可溶性好，吸收性高，且无腥味，具有抗氧化、抗发炎、DNA保护能力、保湿能力、抗皱机能与皮肤美白效果等多种功效，可作为原材料应用于化妆品、营养保健品、食品及医用等多个领域。
Description
技术领域
本发明涉及肽或蛋白质的制备方法，具体涉及皮肤修复用胶原蛋白及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白是一种重要的功能性蛋白质，因其具有很强的生物活性及生物功能，引起了广泛关注，市场潜力巨大，经济价值较高，已经广泛应用于美容保健、医药、食品、日用化工、生物合成、药用胶囊等领域。
目前，大多数胶原蛋白处理的方法有酸法、碱法、酶法、盐法以及热水浸提法等，其中酶法条件温和，对环境污染较少，较为优越。市场上所应用的胶原蛋白多来自牛、猪及鸡等哺乳动物或家禽动物的胶原蛋白组织提取物，但近年来，牛的疯牛病，猪的口蹄疫及家禽类的禽流感等家畜、家禽类疾病接连发生，家畜、家禽类的胶原白的安全性受到质疑，加上一些消费者使用家畜类胶原蛋白有过敏的倾向。因此，使用陆产动物所提取的胶原蛋白，存有安全隐忧。而水产胶原蛋白作为替代品之一，与其他胶原蛋白比，具有高溶解性、渗透性强、蛋白质易分解、易消化吸收等优点，越来越受到人们的关注。
海参是常见的水产品之一，作为一种传统的滋补食品，同人参、燕窝、鱼翅齐名，是世界八大珍品之一，具有提高记忆力、延缓性腺衰老，防止动脉硬化、糖尿病以及抗肿瘤等作用。现代研究表明海参富含胶原蛋白，海参胶原蛋白含量可占海参体壁粗蛋白的60％以上，这种活性成分也是海参中具有滋补营养作用的多种功能成分中含量最多的一种。因此从海参中提取胶原蛋白是提升胶原蛋白品质的一个方向，也是海参深加工和精细化利用的重要途径。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种皮肤修复用胶原蛋白及其制备方法。
一种皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将海参放入水中进行泡发，沥干水分后刨开干海参的腹部，去除沙嘴并用水清洗干净，得到预处理的海参；
Ⅱ.将上述预处理的海参进行粉碎处理，得到海参肉糜，按质量体积比1：(10-20)(g/mL)向海参肉糜中加入水，混匀后得到匀浆液；
Ⅲ.向上述匀浆液中加入pH值调节剂，调节pH至7-8.5后，加入复合酶，所述匀浆液、复合酶的质量比为100：(0.1-0.5)，在45-60℃下进行酶解，灭酶活，得到酶解液；
Ⅳ.向上述酶解液中加入酶解液质量0.2-0.6％的脱腥剂，在30-45℃下搅拌0.5-2h，得到脱腥后的酶解液；接着离心处理脱腥后的酶解液，所得上清液再进行膜分离处理，得到滤液；
Ⅴ.上述滤液经浓缩、干燥处理后得到皮肤修复用胶原蛋白。
优选地，所述皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将海参放入水中进行泡发，沥干水分后刨开干海参的腹部，去除沙嘴并用水清洗干净，得到预处理的海参；
Ⅱ.将上述预处理的海参进行粉碎处理，得到海参肉糜，按质量体积比1：(10-20)(g/mL)向海参肉糜中加入水，混匀后得到匀浆液；
Ⅲ.向上述匀浆液中加入pH值调节剂，调节pH至7-8.5后，加入复合酶，所述匀浆液、复合酶的质量比为100：(0.1-0.5)，在45-60℃下进行酶解，灭酶活，得到第一酶解液；接着向第一酶解液加入第一酶解液质量0.01-0.05％的风味蛋白酶，用柠檬酸调节pH为5-6.5，在30-50℃下进行酶解，灭酶活，得到第二酶解液；
Ⅳ.向所得第二酶解液中加入第二酶解液质量0.2-0.6％的脱腥剂，在30-45℃下搅拌0.5-2h，得到脱腥后的酶解液；接着离心处理脱腥后的酶解液，所得上清液再进行膜分离处理，得到滤液；
Ⅴ.上述滤液经浓缩、干燥处理后得到皮肤修复用胶原蛋白。
更优选地，所述皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将海参放入水中进行泡发，沥干水分后刨开干海参的腹部，去除沙嘴并用水清洗干净，得到清洗后的海参；向清洗后的海参中加入清洗后的海参质量10-20倍的水，超高压处理，泄压后得到预处理的海参；
Ⅱ.将上述预处理的海参进行粉碎处理，得到海参肉糜，按质量体积比1：(10-20)(g/mL)向海参肉糜中加入水，混匀后得到匀浆液；
Ⅲ.向上述匀浆液中加入pH值调节剂，调节pH至7-8.5后，加入复合酶，所述匀浆液、复合酶的质量比为100：(0.1-0.5)，在45-60℃下进行酶解，灭酶活，得到第一酶解液；接着向第一酶解液加入第一酶解液质量0.01-0.05％的风味蛋白酶，用柠檬酸调节pH为5-6.5，在30-50℃下进行酶解，灭酶活，得到第二酶解液；
Ⅳ.向所得第二酶解液中加入第二酶解液质量0.2-0.6％的脱腥剂，在30-45℃下搅拌0.5-2h，得到脱腥后的酶解液；接着离心处理脱腥后的酶解液，所得上清液再进行膜分离处理，得到滤液；
Ⅴ.上述滤液经浓缩、干燥处理后得到皮肤修复用胶原蛋白。
所述脱腥剂包括姜根提取物、紫苏叶提取物、藤茶提取物中的一种或多种。
优选地，所述脱腥剂由姜根提取物、紫苏叶提取物、藤茶提取物按(1-5)：(1-5)：(1-5)的质量比混合而成。
所述复合酶包括胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的两种或多种。
优选地，所述复合酶由胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶按(1-3)：(1-3)：(1-3)的质量比混合而成。
所述pH值调节剂包括氨水、NaOH溶液、Na2CO3溶液、NaHCO3溶液中的一种或多种。
所述膜分离处理为：在分离温度为35-55℃、工作压力为0.1-0.3MPa的条件下采用超滤膜进行超滤。
所述超滤膜的截留分子量为150000-250000Da。
所述超高压处理的温度控制在30-60℃，工作压力控制在100-500MPa。
优选地，所述超高压处理的温度控制在30-60℃，工作压力控制在200-400MPa。
所述皮肤修复用胶原蛋白采用本发明所述皮肤修复用胶原蛋白的制备方法制备而成。
由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比具有如下有益效果：本发明使用脱腥剂处理酶解液，充分去除了原料中三甲胺等腥味物质，有效去除产品中的腥味；同时采用超高压处理与二次酶解相结合的方式对胶原蛋白进行提取，使原料分解更加充分，提高了胶原蛋白中的活性成分含量。本发明皮肤修复用胶原蛋白活性成分含量高，可溶性好，吸收性高，且无腥味，具有抗氧化、抗发炎、DNA保护能力、保湿能力、抗皱机能与皮肤美白效果等多种功效，可作为原材料应用于化妆品、营养保健品、食品及医用等领域中。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
实施例中各原料及设备介绍：
干海参，海参为海参属海参纲海洋棘皮动物，拉丁学名：Holothuroidea，产地辽宁，购自大连市双兴综合批发市场养参人水产商行。
姜根，姜科姜属多年生草本植物的根茎，拉丁学名：Zingiber officinale Rosc.，品种莱芜大姜，货号785，购自沂水县常慧果蔬购销中心。
紫苏叶，为唇形科塔花族双子叶植物的叶，拉丁学名：Folium Perillae，产地江苏，购自亳州谦水堂中药材有限公司。
藤茶，葡萄科蛇葡萄属藤本植物的叶，拉丁学名：Ampelopsis grossedentata，品种茅岩莓，购自本草拾遗生物研究源头厂家。
姜根提取物的制备方法为：将姜根置于50℃下干燥6h，粉碎至40目后加入50wt％乙醇水溶液中，所述姜根与50wt％乙醇水溶液的质量体积比为1：8(g/mL)，在70℃、微波功率为560W的条件下微波处理5min，经100目滤布过滤，所得滤液置于旋转蒸发仪，在温度为50℃、绝对压强为0.05MPa的条件下浓缩直至含水量为5％，得到姜根提取物。
紫苏叶提取物的制备方法为：将紫苏叶置于50℃下干燥5h，粉碎至40目筛称取按1:4的料液比加入80wt％的乙醇水溶液，85℃下提取3h，经150目滤布过滤，所得滤液置于温度为55℃、绝对压强为0.05MPa的旋转蒸发仪浓缩至含水量为5％，即得。
藤茶提取物的制备方法与紫苏叶提取物的制备方法相同，区别仅在于将紫苏叶替换为藤茶。
胰蛋白酶，酶活力为10万U/g，食品级，购自世纪华星生物工程源头厂家。
碱性蛋白酶，酶活力为20万/g，食品级，购自世纪华星生物工程源头厂家。
木瓜蛋白酶，酶活力为20万U/g，食品级，购自世纪华星生物工程源头厂家。
风味蛋白酶，酶活力为3万U/g，食品级，购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司。
超高压处理设备为HPP.L3-600/0.6型超高压设备，购自天津市华泰森淼生物工程技术有限公司。
微波设备为LWMC-205型可调功率微波化学反应器，购自南京陵江科技开发有限责任公司。
绞肉设备为TJ12-H型绞肉机，孔板尺寸为6/8mm，购自广东恒联食品机械有限公司。
匀浆设备为JJ-2型组织捣碎匀浆机，购自江苏省金坛市友联仪器研究所。
超滤膜的型号为UOF-4，截留分子量为20万，购自天津膜天膜工程技术有限公司。
喷雾干燥设备为ZOLLO-6000Y型喷雾干燥机，购自上海左乐仪器有限公司。
实施例1
一种皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将干海参置于50℃的去离子水中进行泡发，所用去离子水与海参的质量比为15：1，浸泡10h取出，静置15min，沥干水分，用剪刀刨开海参的腹部，去除沙嘴并用20℃的水清洗海参3次，每次清洗所用水与海参的质量比为2：1，得到预处理的海参；
Ⅱ.将上述预处理的海参置于20℃的绞肉设备中，所述绞肉机的生产能力120kg/h，功率为0.55kw，绞碎后得到直径为6mm的海参肉糜，按质量体积比1：10(g/mL)向海参肉糜中加入去离子水，在20℃、1500r/min的条件下搅拌30min，得到匀浆液；
Ⅲ.向上述匀浆液加入0.5mo1/L氢氧化钠溶液，调节pH至7.5后加入胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶，所述匀浆液、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的质量比为100：0.05：0.05：0.05，在50℃下酶解3h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到酶解液；
Ⅳ.向所得酶解液中加入酶解液质量0.3％的脱腥剂，在35℃、1500r/min的条件下搅拌1h，得到脱腥后的酶解液；接着将脱腥后的酶解液置于20℃、8 000r/min的条件下离心5min，所得上清液用截留分子量为200000Da的超滤膜进行超滤，所述超滤过程的分离温度为45℃，工作压力为0.1MPa，超滤时间60min，得到滤液；
Ⅴ.将上述滤液置于80℃、绝对压强为0.08MPa的条件下进行浓缩，浓缩至原体积的20％，得到浓缩液，接着将所得浓缩滤液进行喷雾干燥，所述喷雾干燥的进风温度和出风温度分别为165℃、75℃，热风风速为4m3/min，供料速度为35mL/min，得到皮肤修复用胶原蛋白。
所述脱腥剂由姜根提取物、紫苏叶提取物、藤茶提取物按1：1：1的质量比混合而成。
实施例2
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述脱腥剂由姜根提取物、紫苏叶提取物按1：1的质量比混合而成。
实施例3
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述脱腥剂由紫苏叶提取物、藤茶提取物按1：1的质量比混合而成。
实施例4
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述脱腥剂由姜根提取物、藤茶提取物按1：1的质量比混合而成。
对比例1
一种皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将干海参置于50℃的去离子水中进行泡发，所用去离子水与海参的质量比为15：1，浸泡10h取出，静置15min，沥干水分，用剪刀刨开海参的腹部，去除沙嘴并用20℃的水清洗海参3次，每次清洗所用水与海参的质量比为2：1，得到预处理的海参；
Ⅱ.将上述预处理的海参置于20℃的绞肉设备中，所述绞肉机的生产能力120kg/h，功率为0.55kw，绞碎后得到直径为6mm的海参肉糜，按质量体积比1：10(g/mL)向海参肉糜中加入去离子水，在20℃、1500r/min的条件下搅拌30min，得到匀浆液；
Ⅲ.向上述匀浆液加入0.5mo1/L氢氧化钠溶液，调节pH至7.5后加入胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶，所述匀浆液、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的质量比为100：0.05：0.05：0.05，在50℃下酶解3h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到酶解液；
Ⅳ.将上述酶解液置于20℃、8 000r/min的条件下离心5min，所得上清液用截留分子量为200000Da的超滤膜进行超滤，所述超滤过程的分离温度为45℃，工作压力为0.1MPa，超滤时间60min，得到滤液；
Ⅴ.将上述滤液置于80℃、绝对压强为0.08MPa的条件下进行浓缩，浓缩至原体积的20％，得到浓缩液，接着将所得浓缩滤液进行喷雾干燥，所述喷雾干燥的进风温度和出风温度分别为165℃、75℃，热风风速为4m3/min，供料速度为35mL/min，得到皮肤修复用胶原蛋白。
实施例5
一种皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将干海参置于50℃的去离子水中进行泡发，所用去离子水与海参的质量比为15：1，浸泡10h取出，静置15min，沥干水分，用剪刀刨开海参的腹部，去除沙嘴并用20℃的水清洗海参3次，每次清洗所用水与海参的质量比为2：1，得到预处理的海参；
Ⅱ.将上述预处理的海参置于20℃的绞肉设备中，所述绞肉机的生产能力120kg/h，功率为0.55kw，绞碎后得到直径为6mm的海参肉糜，按质量体积比1：10(g/mL)向海参肉糜中加入去离子水，在20℃、1500r/min的条件下搅拌30min，得到匀浆液；
Ⅲ.向上述匀浆液加入0.5mo1/L氢氧化钠溶液，调节pH至7.5后加入胰蛋白酶、碱性蛋白酶，所述匀浆液、胰蛋白酶、碱性蛋白酶的质量比为100：0.075：0.075，在50℃下酶解3h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到酶解液；
Ⅳ.向所得酶解液中加入酶解液质量0.3％的脱腥剂，在35℃、1500r/min的条件下搅拌1h，得到脱腥后的酶解液；接着将脱腥后的酶解液置于20℃、8 000r/min的条件下离心5min，所得上清液用截留分子量为200000Da的超滤膜进行超滤，所述超滤过程的分离温度为45℃，工作压力为0.1MPa，超滤时间60min，得到滤液；
Ⅴ.将上述滤液置于80℃、绝对压强为0.08MPa的条件下进行浓缩，浓缩至原体积的20％，得到浓缩液，接着将所得浓缩滤液进行喷雾干燥，所述喷雾干燥的进风温度和出风温度分别为165℃、75℃，热风风速为4m3/min，供料速度为35mL/min，得到皮肤修复用胶原蛋白。
所述脱腥剂由姜根提取物、紫苏叶提取物、藤茶提取物按1：1：1的质量比混合而成。
实施例6
一种皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将干海参置于50℃的去离子水中进行泡发，所用去离子水与海参的质量比为15：1，浸泡10h取出，静置15min，沥干水分，用剪刀刨开海参的腹部，去除沙嘴并用20℃的水清洗海参3次，每次清洗所用水与海参的质量比为2：1，得到预处理的海参；
Ⅱ.将上述预处理的海参置于20℃的绞肉设备中，所述绞肉机的生产能力120kg/h，功率为0.55kw，绞碎后得到直径为6mm的海参肉糜，按质量体积比1：10(g/mL)向海参肉糜中加入去离子水，在20℃、1500r/min的条件下搅拌30min，得到匀浆液；
Ⅲ.向上述匀浆液加入0.5mo1/L氢氧化钠溶液，调节pH至7.5后加入碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶，所述匀浆液、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的质量比为100：0.075：0.075，在50℃下酶解3h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到酶解液；
Ⅳ.向所得酶解液中加入酶解液质量0.3％的脱腥剂，在35℃、1500r/min的条件下搅拌1h，得到脱腥后的酶解液；接着将脱腥后的酶解液置于20℃、8 000r/min的条件下离心5min，所得上清液用截留分子量为200000Da的超滤膜进行超滤，所述超滤过程的分离温度为45℃，工作压力为0.1MPa，超滤时间60min，得到滤液；
Ⅴ.将上述滤液置于80℃、绝对压强为0.08MPa的条件下进行浓缩，浓缩至原体积的20％，得到浓缩液，接着将所得浓缩滤液进行喷雾干燥，所述喷雾干燥的进风温度和出风温度分别为165℃、75℃，热风风速为4m3/min，供料速度为35mL/min，得到皮肤修复用胶原蛋白。
所述脱腥剂由姜根提取物、紫苏叶提取物、藤茶提取物按1：1：1的质量比混合而成。
实施例7
一种皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将干海参置于50℃的去离子水中进行泡发，所用去离子水与海参的质量比为15：1，浸泡10h取出，静置15min，沥干水分，用剪刀刨开海参的腹部，去除沙嘴并用20℃的水清洗海参3次，每次清洗所用水与海参的质量比为2：1，得到预处理的海参；
Ⅱ.将上述预处理的海参置于20℃的绞肉设备中，所述绞肉机的生产能力120kg/h，功率为0.55kw，绞碎后得到直径为6mm的海参肉糜，按质量体积比1：10(g/mL)向海参肉糜中加入去离子水，在20℃、1500r/min的条件下搅拌30min，得到匀浆液；
Ⅲ.向上述匀浆液加入0.5mo1/L氢氧化钠溶液，调节pH至7.5后加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，所述匀浆液、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的质量比为100：0.075：0.075，在50℃下酶解3h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到酶解液；
Ⅳ.向所得酶解液中加入酶解液质量0.3％的脱腥剂，在35℃、1500r/min的条件下搅拌1h，得到脱腥后的酶解液；接着将脱腥后的酶解液置于20℃、8 000r/min的条件下离心5min，所得上清液用截留分子量为200000Da的超滤膜进行超滤，所述超滤过程的分离温度为45℃，工作压力为0.1MPa，超滤时间60min，得到滤液；
Ⅴ.将上述滤液置于80℃、绝对压强为0.08MPa的条件下进行浓缩，浓缩至原体积的20％，得到浓缩液，接着将所得浓缩滤液进行喷雾干燥，所述喷雾干燥的进风温度和出风温度分别为165℃、75℃，热风风速为4m3/min，供料速度为35mL/min，得到皮肤修复用胶原蛋白。
所述脱腥剂由姜根提取物、紫苏叶提取物、藤茶提取物按1：1：1的质量比混合而成。
实施例8
一种皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将干海参置于50℃的去离子水中进行泡发，所用去离子水与海参的质量比为15：1，浸泡10h取出，静置15min，沥干水分，用剪刀刨开海参的腹部，去除沙嘴并用20℃的水清洗海参3次，每次清洗所用水与海参的质量比为2：1，得到预处理的海参；
Ⅱ.将上述预处理的海参置于20℃的绞肉设备中，所述绞肉机的生产能力120kg/h，功率为0.55kw，绞碎后得到直径为6mm的海参肉糜，按质量体积比1：10(g/mL)向海参肉糜中加入去离子水，在20℃、1500r/min的条件下搅拌30min，得到匀浆液；
Ⅲ.向上述匀浆液加入0.5mo1/L氢氧化钠溶液，调节pH至7.5后加入胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶，所述匀浆液、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的质量比为100：0.05：0.05：0.05，在50℃下酶解1.5h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到第一酶解液；接着向第一酶解液加入第一酶解液质量0.01％的风味蛋白酶，加入柠檬酸，调节pH为6.5，在45℃下酶解1.5h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到第二酶解液；
Ⅳ.向所得第二酶解液中加入第二酶解液质量0.3％的脱腥剂，在35℃、1500r/min的条件下搅拌1h，得到脱腥后的酶解液；接着将脱腥后的酶解液置于20℃、8 000r/min的条件下离心5min，所得上清液用截留分子量为200000Da的超滤膜进行超滤，所述超滤过程的分离温度为45℃，工作压力为0.1MPa，超滤时间60min，得到滤液；
Ⅴ.将上述滤液置于80℃、绝对压强为0.08MPa的条件下进行浓缩，浓缩至原体积的20％，得到浓缩液，接着将所得浓缩滤液进行喷雾干燥，所述喷雾干燥的进风温度和出风温度分别为165℃、75℃，热风风速为4m3/min，供料速度为35mL/min，得到皮肤修复用胶原蛋白。
所述脱腥剂由姜根提取物、紫苏叶提取物、藤茶提取物按1：1：1的质量比混合而成。
实施例9
一种皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将干海参置于50℃的去离子水中进行泡发，所用去离子水与海参的质量比为15：1，浸泡10h取出，静置15min，沥干水分，用剪刀刨开海参的腹部，去除沙嘴并用20℃的水清洗海参3次，每次清洗所用水与海参的质量比为2：1，得到清洗后的海参；将清洗后的海参放入超高压处理设备中，加入清洗后的海参质量20倍的去离子水，在50℃下100MPa处理5min，泄压后取出，得到预处理的海参；
Ⅱ.将上述预处理的海参置于20℃的绞肉设备中，所述绞肉机的生产能力120kg/h，功率为0.55kw，绞碎后得到直径为6mm的海参肉糜，按质量体积比1：10(g/mL)向海参肉糜中加入去离子水，在20℃、1500r/min的条件下搅拌30min，得到匀浆液；
Ⅲ.向上述匀浆液加入0.5mo1/L氢氧化钠溶液，调节pH至7.5后加入胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶，所述匀浆液、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的质量比为100：0.05：0.05：0.05，在50℃下酶解1.5h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到第一酶解液；接着向第一酶解液加入第一酶解液质量0.01％的风味蛋白酶，加入柠檬酸，调节pH为6.5，在45℃下酶解1.5h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到第二酶解液；
Ⅳ.向所得第二酶解液中加入第二酶解液质量0.3％的脱腥剂，在35℃、1500r/min的条件下搅拌1h，得到脱腥后的酶解液；接着将脱腥后的酶解液置于20℃、8 000r/min的条件下离心5min，所得上清液用截留分子量为200000Da的超滤膜进行超滤，所述超滤过程的分离温度为45℃，工作压力为0.1MPa，超滤时间60min，得到滤液；
Ⅴ.将上述滤液置于80℃、绝对压强为0.08MPa的条件下进行浓缩，浓缩至原体积的20％，得到浓缩液，接着将所得浓缩滤液进行喷雾干燥，所述喷雾干燥的进风温度和出风温度分别为165℃、75℃，热风风速为4m3/min，供料速度为35mL/min，得到皮肤修复用胶原蛋白。
所述脱腥剂由姜根提取物、紫苏叶提取物、藤茶提取物按1：1：1的质量比混合而成。
实施例10
一种皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将干海参置于50℃的去离子水中进行泡发，所用去离子水与海参的质量比为15：1，浸泡10h取出，静置15min，沥干水分，用剪刀刨开海参的腹部，去除沙嘴并用20℃的水清洗海参3次，每次清洗所用水与海参的质量比为2：1，得到清洗后的海参；将清洗后的海参放入超高压处理设备中，加入清洗后的海参质量20倍的去离子水，在50℃下200MPa处理5min，泄压后取出，得到预处理的海参；
Ⅱ.将上述预处理的海参置于20℃的绞肉设备中，所述绞肉机的生产能力120kg/h，功率为0.55kw，绞碎后得到直径为6mm的海参肉糜，按质量体积比1：10(g/mL)向海参肉糜中加入去离子水，在20℃、1500r/min的条件下搅拌30min，得到匀浆液；
Ⅲ.向上述匀浆液加入0.5mo1/L氢氧化钠溶液，调节pH至7.5后加入胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶，所述匀浆液、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的质量比为100：0.05：0.05：0.05，在50℃下酶解1.5h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到第一酶解液；接着向第一酶解液加入第一酶解液质量0.01％的风味蛋白酶，加入柠檬酸，调节pH为6.5，在45℃下酶解1.5h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到第二酶解液；
Ⅳ.向所得第二酶解液中加入第二酶解液质量0.3％的脱腥剂，在35℃、1500r/min的条件下搅拌1h，得到脱腥后的酶解液；接着将脱腥后的酶解液置于20℃、8 000r/min的条件下离心5min，所得上清液用截留分子量为200000Da的超滤膜进行超滤，所述超滤过程的分离温度为45℃，工作压力为0.1MPa，超滤时间60min，得到滤液；
Ⅴ.将上述滤液置于80℃、绝对压强为0.08MPa的条件下进行浓缩，浓缩至原体积的20％，得到浓缩液，接着将所得浓缩滤液进行喷雾干燥，所述喷雾干燥的进风温度和出风温度分别为165℃、75℃，热风风速为4m3/min，供料速度为35mL/min，得到皮肤修复用胶原蛋白。
所述脱腥剂由姜根提取物、紫苏叶提取物、藤茶提取物按1：1：1的质量比混合而成。
实施例11
一种皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将干海参置于50℃的去离子水中进行泡发，所用去离子水与海参的质量比为15：1，浸泡10h取出，静置15min，沥干水分，用剪刀刨开海参的腹部，去除沙嘴并用20℃的水清洗海参3次，每次清洗所用水与海参的质量比为2：1，得到清洗后的海参；将清洗后的海参放入超高压处理设备中，加入清洗后的海参质量20倍的去离子水，在50℃下300MPa处理5min，泄压后取出，得到预处理的海参；
Ⅱ.将上述预处理的海参置于20℃的绞肉设备中，所述绞肉机的生产能力120kg/h，功率为0.55kw，绞碎后得到直径为6mm的海参肉糜，按质量体积比1：10(g/mL)向海参肉糜中加入去离子水，在20℃、1500r/min的条件下搅拌30min，得到匀浆液；
Ⅲ.向上述匀浆液加入0.5mo1/L氢氧化钠溶液，调节pH至7.5后加入胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶，所述匀浆液、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的质量比为100：0.05：0.05：0.05，在50℃下酶解1.5h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到第一酶解液；接着向第一酶解液加入第一酶解液质量0.01％的风味蛋白酶，加入柠檬酸，调节pH为6.5，在45℃下酶解1.5h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到第二酶解液；
Ⅳ.向所得第二酶解液中加入第二酶解液质量0.3％的脱腥剂，在35℃、1500r/min的条件下搅拌1h，得到脱腥后的酶解液；接着将脱腥后的酶解液置于20℃、8 000r/min的条件下离心5min，所得上清液用截留分子量为200000Da的超滤膜进行超滤，所述超滤过程的分离温度为45℃，工作压力为0.1MPa，超滤时间60min，得到滤液；
Ⅴ.将上述滤液置于80℃、绝对压强为0.08MPa的条件下进行浓缩，浓缩至原体积的20％，得到浓缩液，接着将所得浓缩滤液进行喷雾干燥，所述喷雾干燥的进风温度和出风温度分别为165℃、75℃，热风风速为4m3/min，供料速度为35mL/min，得到皮肤修复用胶原蛋白。
所述脱腥剂由姜根提取物、紫苏叶提取物、藤茶提取物按1：1：1的质量比混合而成。
实施例12
一种皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将干海参置于50℃的去离子水中进行泡发，所用去离子水与海参的质量比为15：1，浸泡10h取出，静置15min，沥干水分，用剪刀刨开海参的腹部，去除沙嘴并用20℃的水清洗海参3次，每次清洗所用水与海参的质量比为2：1，得到清洗后的海参；将清洗后的海参放入超高压处理设备中，加入清洗后的海参质量20倍的去离子水，在50℃下400MPa处理5min，泄压后取出，得到预处理的海参；
Ⅱ.将上述预处理的海参置于20℃的绞肉设备中，所述绞肉机的生产能力120kg/h，功率为0.55kw，绞碎后得到直径为6mm的海参肉糜，按质量体积比1：10(g/mL)向海参肉糜中加入去离子水，在20℃、1500r/min的条件下搅拌30min，得到匀浆液；
Ⅲ.向上述匀浆液加入0.5mo1/L氢氧化钠溶液，调节pH至7.5后加入胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶，所述匀浆液、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的质量比为100：0.05：0.05：0.05，在50℃下酶解1.5h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到第一酶解液；接着向第一酶解液加入第一酶解液质量0.01％的风味蛋白酶，加入柠檬酸，调节pH为6.5，在45℃下酶解1.5h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到第二酶解液；
Ⅳ.向所得第二酶解液中加入第二酶解液质量0.3％的脱腥剂，在35℃、1500r/min的条件下搅拌1h，得到脱腥后的酶解液；接着将脱腥后的酶解液置于20℃、8 000r/min的条件下离心5min，所得上清液用截留分子量为200000Da的超滤膜进行超滤，所述超滤过程的分离温度为45℃，工作压力为0.1MPa，超滤时间60min，得到滤液；
Ⅴ.将上述滤液置于80℃、绝对压强为0.08MPa的条件下进行浓缩，浓缩至原体积的20％，得到浓缩液，接着将所得浓缩滤液进行喷雾干燥，所述喷雾干燥的进风温度和出风温度分别为165℃、75℃，热风风速为4m3/min，供料速度为35mL/min，得到皮肤修复用胶原蛋白。
所述脱腥剂由姜根提取物、紫苏叶提取物、藤茶提取物按1：1：1的质量比混合而成。
实施例13
一种皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将干海参置于50℃的去离子水中进行泡发，所用去离子水与海参的质量比为15：1，浸泡10h取出，静置15min，沥干水分，用剪刀刨开海参的腹部，去除沙嘴并用20℃的水清洗海参3次，每次清洗所用水与海参的质量比为2：1，得到清洗后的海参；将清洗后的海参放入超高压处理设备中，加入清洗后的海参质量20倍的去离子水，在50℃下500MPa处理5min，泄压后取出，得到预处理的海参；
Ⅱ.将上述预处理的海参置于20℃的绞肉设备中，所述绞肉机的生产能力120kg/h，功率为0.55kw，绞碎后得到直径为6mm的海参肉糜，按质量体积比1：10(g/mL)向海参肉糜中加入去离子水，在20℃、1500r/min的条件下搅拌30min，得到匀浆液；
Ⅲ.向上述匀浆液加入0.5mo1/L氢氧化钠溶液，调节pH至7.5后加入胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶，所述匀浆液、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的质量比为100：0.05：0.05：0.05，在50℃下酶解1.5h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到第一酶解液；接着向第一酶解液加入第一酶解液质量0.01％的风味蛋白酶，加入柠檬酸，调节pH为6.5，在45℃下酶解1.5h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到第二酶解液；
Ⅳ.向所得第二酶解液中加入第二酶解液质量0.3％的脱腥剂，在35℃、1500r/min的条件下搅拌1h，得到脱腥后的酶解液；接着将脱腥后的酶解液置于20℃、8 000r/min的条件下离心5min，所得上清液用截留分子量为200000Da的超滤膜进行超滤，所述超滤过程的分离温度为45℃，工作压力为0.1MPa，超滤时间60min，得到滤液；
Ⅴ.将上述滤液置于80℃、绝对压强为0.08MPa的条件下进行浓缩，浓缩至原体积的20％，得到浓缩液，接着将所得浓缩滤液进行喷雾干燥，所述喷雾干燥的进风温度和出风温度分别为165℃、75℃，热风风速为4m3/min，供料速度为35mL/min，得到皮肤修复用胶原蛋白。
所述脱腥剂由姜根提取物、紫苏叶提取物、藤茶提取物按1：1：1的质量比混合而成。
实施例14
一种皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将干海参置于50℃的去离子水中进行泡发，所用去离子水与海参的质量比为15：1，浸泡10h取出，静置15min，沥干水分，用剪刀刨开海参的腹部，去除沙嘴并用20℃的水清洗海参3次，每次清洗所用水与海参的质量比为2：1，得到清洗后的海参；将清洗后的海参放入超高压处理设备中，加入清洗后的海参质量20倍的去离子水，在50℃下600MPa处理5min，泄压后取出，得到预处理的海参；
Ⅱ.将上述预处理的海参置于20℃的绞肉设备中，所述绞肉机的生产能力120kg/h，功率为0.55kw，绞碎后得到直径为6mm的海参肉糜，按质量体积比1：10(g/mL)向海参肉糜中加入去离子水，在20℃、1500r/min的条件下搅拌30min，得到匀浆液；
Ⅲ.向上述匀浆液加入0.5mo1/L氢氧化钠溶液，调节pH至7.5后加入胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶，所述匀浆液、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的质量比为100：0.05：0.05：0.05，在50℃下酶解1.5h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到第一酶解液；接着向第一酶解液加入第一酶解液质量0.01％的风味蛋白酶，加入柠檬酸，调节pH为6.5，在45℃下酶解1.5h，接着在90℃下保温5min，灭酶活，得到第二酶解液；
Ⅳ.向所得第二酶解液中加入第二酶解液质量0.3％的脱腥剂，在35℃、1500r/min的条件下搅拌1h，得到脱腥后的酶解液；接着将脱腥后的酶解液置于20℃、8 000r/min的条件下离心5min，所得上清液用截留分子量为200000Da的超滤膜进行超滤，所述超滤过程的分离温度为45℃，工作压力为0.1MPa，超滤时间60min，得到滤液；
Ⅴ.将上述滤液置于80℃、绝对压强为0.08MPa的条件下进行浓缩，浓缩至原体积的20％，得到浓缩液，接着将所得浓缩滤液进行喷雾干燥，所述喷雾干燥的进风温度和出风温度分别为165℃、75℃，热风风速为4m3/min，供料速度为35mL/min，得到皮肤修复用胶原蛋白。
所述脱腥剂由姜根提取物、紫苏叶提取物、藤茶提取物按1：1：1的质量比混合而成。
测试例1
脱腥效果评价：采用0-10分制评定气味强度，取平均值为最后得分，对本发明实施例1-4以及对比例1中皮肤修复用胶原蛋白进行脱腥感官评分。其中鉴评小组由10名(23-28岁、男女各5人)评定员组成，系统学习过感官评定课程，有丰富的感官评定经验，评分标准为无腥味0分，略有腥味1分，腥味较弱2分，有腥味3分，腥味一般4分，腥味偏重5分，腥味较重6分，腥味很重7分。最终评定腥味值如下表见表1。
表1：腥味值评价结果表
| 组别 | 腥味值 |
| 实施例1 | 0 |
| 实施例2 | 1 |
| 实施例3 | 2 |
| 实施例4 | 1 |
| 对比例1 | 4 |
由测试结果可知，实施例1在皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，使用了由姜根提取物、紫苏叶提取物、藤茶提取物的脱腥剂，其腥味值低于实施例2-4(由姜根提取物、紫苏叶提取物、藤茶提取物任意两种组合的脱腥剂)以及对比例1(未使用脱腥剂)。
测试例2
大鼠皮肤创面愈合实验研究：参考测定本发明制备的皮肤修复用胶原蛋白对大鼠皮肤创面愈合的影响。
Ⅰ.实验动物及分组：选取体重在300g左右的成年雄性Wistar大鼠(购自青岛派特福德白鼠养殖专业合作社)，随机分为12组，第1组为空白对照组，第2-12组为实验组，分别测定实施例1、
实施例5-14中的皮肤修复用胶原蛋白，每组10只大鼠。
Ⅱ.大鼠创面模型制备：大鼠麻醉后固定四肢，消毒后在背部距脊柱左侧1.5cm、距前肢根部3.0cm处做一直径5mm的圆形全层皮肤伤口，将成模当天记为第0d。
Ⅲ.实验方法：实验组每天在皮肤伤口处涂抹2mL本发明皮肤修复用胶原蛋白溶液，其中皮肤修复用胶原蛋白溶液的制备方法为：将1g的皮肤修复用胶原蛋白加入1L的蒸馏水中，混匀后即得；空白对照组每天涂抹2mL的蒸馏水。所有大鼠在常规条件下单笼饲养。每天同一时间清创换药,至创面有完整上皮覆盖。
Ⅳ.伤口愈合率测定：实验7d后，参考丁进锋的期刊文章《海蜇胶原蛋白提取工艺及促愈合作用研究》1.3.2.2节的计算方法。
各组结果如下表2所示，比较各组测试结果，通过统计学分析方法得P＜0.05，表明样本均数差别具有统计学意义。
表2：伤口愈合率测试结果表
由测试结果可知，实施例1采用由胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶组合的复合酶，制备出的皮肤修复用胶原蛋白活性成分含量高，应用于大鼠伤口治疗中，其伤口愈合率高于实施例5-7空气净化剂(胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶任意两种组合的复合酶)；而实施例8在复合酶对原料进行酶解之后，再采用风味蛋白酶进行二次酶解，原料分解更加充分，提高了胶原蛋白的含量；实施例9-14对原料进行超高压处理，有效地保留了原料中的胶原蛋白的含量，进一步提高产品中胶原蛋白的含量。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡依本发明专利构思所述的原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内；本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
Ⅰ.将海参放入水中进行泡发，沥干水分后刨开干海参的腹部，去除沙嘴并用水清洗干净，得到清洗后的海参；向清洗后的海参中加入清洗后的海参质量10-20倍的水，超高压处理，泄压后得到预处理的海参；
Ⅱ.将上述预处理的海参进行粉碎处理，得到海参肉糜，按质量体积比1g：(10-20)mL向海参肉糜中加入水，混匀后得到匀浆液；
Ⅲ.向上述匀浆液中加入pH值调节剂，调节pH至7-8.5后，加入复合酶，所述匀浆液、复合酶的质量比为100：(0.1-0.5)，在45-60℃下进行酶解，灭酶活，得到第一酶解液；接着向第一酶解液加入第一酶解液质量0.01-0.05％的风味蛋白酶，用柠檬酸调节pH为5-6.5，在30-50℃下进行酶解，灭酶活，得到第二酶解液；
Ⅳ.向所得第二酶解液中加入第二酶解液质量0.2-0.6％的脱腥剂，在30-45℃下搅拌0.5-2h，得到脱腥后的酶解液；接着离心处理脱腥后的酶解液，所得上清液再进行膜分离处理，得到滤液；
Ⅴ.上述滤液经浓缩、干燥处理后得到皮肤修复用胶原蛋白；
所述超高压处理的温度控制在30-60℃，工作压力控制在200-400MPa。
2.如权利要求1所述皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述复合酶由胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶按(1-3)：(1-3)：(1-3)的质量比混合而成。
3.如权利要求1所述皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述pH值调节剂包括氨水、NaOH溶液、Na2CO3溶液、NaHCO3溶液中的一种或多种。
4.如权利要求1中所述皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述脱腥剂包括姜根提取物、紫苏叶提取物、藤茶提取物中的一种或多种。
5.如权利要求1-3任一项所述皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述膜分离处理为：在分离温度为35-55℃、工作压力为0.1-0.3MPa的条件下采用超滤膜进行超滤。
6.如权利要求5所述皮肤修复用胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述超滤膜的截留分子量为150000-250000Da。
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