CN115443072A - 使用物种特异性或属特异性蛋白改善细胞生长的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一个通过体外细胞培养生产肉类的方法,包括从动物或植物源中分离组织并制备细胞悬浮液，并在培养基中的食品级支架上增长细胞，将细胞增长成模拟动物器官的固体或半固体结构。

Description

使用物种特异性或属特异性蛋白改善细胞生长的方法及其 应用

技术领域

本发明的实施例涉及使用体外细胞培养生产肉类的改良方法。本发明的实施例还涉及使用生长因子改进增长细胞方法。

背景技术

动物肉蛋白质含量高，足够提供构建用于支持身体所需蛋白质的所有氨基酸。传统食用肉是从农场饲养的动物或鱼类中获取的。然而，农业和水产养殖业消耗大量的能源和资源，其碳足印亦高。农业或水产养殖生产的肉类亦会对公共健康造成威胁，因为肉类可能在生产过程中接触到致病原、污染物和毒素。人口增长、肉类需求增加、环境问题、土地和水资源有限、生物多样性丧失以及对动物屠宰的负面看法等一系列问题促使科学家开发出替代生产肉类的技术。

体外细胞培养肉生产是指利用细胞培养技术在实验室中培养动物肌肉组织或器官组织以制造肉类和肉制品的过程。如本文所述，体外细胞培养肉和肉制品包括动物蛋白制品以及可溶性和固体的非肉制品。虽然体外细胞培养肉和肉制品仍处于早期开发阶段，与传统肉制品相比，体外细胞培养肉和肉制品具有更多优势，例如健康和环境上的优势，以及对动物的好处。体外细胞培养肉和肉制品是下一代新兴技术，属于比细胞农业或从细胞培养制造农产品更广阔的领域。

从动物活检中获取的细胞(例如肌肉细胞、体细胞、干细胞等)可以作为用于生产体外细胞培养肉的细胞，这些细胞被放在生物反应器或其他无菌环境的培养基中独立于动物活体生长。细胞可以通过在生物反应器中的可食用三维支架上，模仿动物器官生长成半固体或固体。起始细胞可以是直接从动物组织中获得的原代细胞，也可以是连续细胞系。如果在正确的条件下及适当的培养基中生长，原代细胞将根据其细胞脱氧核糖核酸末端端粒的长度所限的次数生长和增殖。而连续细胞系则可以在体外长期培养。细胞生物学端粒研究已经能够将原代细胞转化为不朽的连续细胞系。通过利用病毒癌基因、化学处理或端粒酶逆转录酶的过度表达，我们可以将原代细胞转化为连续的细胞系，以防止端粒缩短。

培养基含有细胞增殖所需的成分，如氨基酸、盐、维生素、生长因子和缓冲系统，以控制pH值。目前的方法是向培养基中添加胎牛血清(FBS)，以提供重要的大分子、生长因子和免疫分子。然而，胎牛血清来自未出生的小牛不符合不含动物产品的指标。因此从事生产体外细胞培养肉研究的科学家认为在无动物成分的培养基中培养细胞是的一个重要的因素。而某些生长因子可能来自于人类。

一般来说，蛋白组分占超过95％的培养基成本。过量的重组人生长因子(例如胰岛素、胰岛素样生长因子-1(IGF-1))、人血清白蛋白(HSA)或胎牛血清(FBS)经常被添加到基础培养基中作为补充。虽然人类蛋白质因子和FBS有效促进人类细胞的生长和分化，但它们对来自关系遥远的物种(例如鱼、鸟)的细胞的生物活性较低。这导致培养时间长和细胞质量低。为了弥补非人细胞的低生物活性，过高水平的人蛋白因子或FBS被添加到生长培养基中，导致了高成本。

目前的体外细胞培养肉生产涵盖大多数商品肉类种类，例如基于细胞的牛肉、猪肉和家禽肉类。然而，这些肉类具有复杂的组织结构和涉及多种细胞，当前的生物医学技术难以生产这些肉类，成本也很高。体外细胞培养肉生产还缺乏提高肉类蛋白质水平和生物产量的非转基因方法。此外，如上所述，当前的细胞培养技术仍然依赖动物成分(如胎牛血清)作为营养源，以及昂贵的非食品级生长因子。

发明概要

本发明提供可供人类食用的体外细胞培养肉类的生产方法，为上述挑战提供解决方案。

本发明的一个目的是提供一种使用物种特异性或属特异性生长因子培养细胞的替代方法。这种方法不仅通过降低生长因子的使用量来降低培养基成本，而且还通过增强细胞反应以缩短培养时间并提高细胞质量。使用物种特异性或属特异性生长因子或有助于增强细胞反应(例如，生长、分化)并打破使用非物种特异性或非属特异性生长因子时遇到的最大细胞反应。

本发明的另一个目的是提供一种评估不同物种来源的生长因子在刺激细胞生长上的功效的方法。

根据本发明的一个实施例，体外细胞培养生产肉类的方法包括从动物或植物来源分离组织，并制备细胞悬浮液。该方法还包括在培养基中的食品级支架上增长细胞，使细胞模拟动物器官生长成固体或半固体结构。该方法还包括将包含(i)与细胞基因上相同或相似的物种的生长因子和/或(ii)与细胞基因上相同的属的生长因子引入细胞的培养基。此外，该方法还包括在培养基中的食品级支架上生长细胞，细胞生长成模拟动物器官的固体或半固体结构。

根据发明的另外一个实施例，通过体外细胞培养生产肉类的方法包括从植物或动物源中分离组织，制备细胞悬浮液，并在培养基中的食品级支架上增长细胞，以使细胞生长成模拟动物器官的固体或半固体结构。该方法还将细胞与生物工程细胞一同培养。所述生物工程细胞会分泌营养物质、生长因子和细胞因子以支持细胞生长,这些生物工程细胞与所述细胞是(i)在基因上属于相同或相似的物种和/或(ii)在基因上属于相同的属。

在一些实施例中，当一物种与细胞的DNA序列超过90％匹配时，该物种与细胞在基因上相似。

本发明的实施例应用了供人类食用的体外细胞培养肉类生产方法，为上述挑战提供了解决方案。

附图简要说明

为更好地理解本发明，可以参考详细说明并结合附图一并考虑。图中的组件不一定按比例缩放，而是强调解说本发明背后的原理。

图1是根据本发明一个实施例的通过体外细胞培养进行肉类生产的方法的流程图。

图2是根据本发明一个实施例用于增强转录后蛋白质表达的方法的示意图。

图3是根据本发明一个实施例用于增强转录后表达胶原1型α1(COL1A1)的方法的示意图。

图4是根据本发明一个实施例用于增强转录后表达胶原1型α2(COL1A2)的方法的示意图。

图5是根据本发明一个实施例，用于体外细胞培养肉类生产的具有固相生物反应器的示意图或概念横截面图。

图6是根据本发明的一个与图5类似的实施例，但具有第二固相的生物反应器的示意图或概念横截面图。

图7是一个说明用不同浓度(1pg/mL至100ng/mL)的重组人IGF-1(Oryzogen)处理MCF-7细胞后的各个细胞数的图表。在第10天收获细胞用于直接细胞计数。

图8是一个说明用1.5nM重组人IGF-1(来自3个不同供应商)、重组小鼠IGF-1和重组鱼(金枪鱼、鲷鱼)IGF-1处理MCF-7细胞后其各自的相对荧光的图表。在第7天收获细胞并进行CyQUANT细胞增殖测定。

详细说明

图1显示用于生产体外细胞培养肉的方法10。如本文所述，“体外细胞培养肉生产”是指基于细胞的肉类生产过程或基于细胞的农业过程，其中来自动物和/或植物的组织在实验室中使用细胞培养技术增长以制造肉类和肉类产品。在区块12，组织从动物或植物中分离。在一个实施例中，该组织源自硬骨鱼纲的骨性鱼，包括咸水鱼，例如石斑鱼、鲈鱼或黄鱼。在其他实施例中，其他类型的动物组织也可以被分离，例如牛组织。在一些实施例中，区块12可从鱼收集器官组织，例如鱼鳔，并制备细胞悬浮液。尽管以下描述主要源自鱼类的组织，但这些概念可应用于源自其他动物和/或植物的组织，以提供其他类型的体外细胞培养肉和/或动物蛋白产品，以及素食肉和/或蛋白产品。

许多分离的细胞是成体细胞，可以使用医学研究中已建立的各种方法使其持续增殖(区块14)。例如，特定基因，如山中(Yamanaka)因子，可用于将成年细胞重新编程为干细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。作为替代选择，分离的成年细胞可以通过端粒酶逆转录酶的过度表达转化为连续的细胞系。在其他实施例中，可分离其他类型的细胞，例如成体干细胞和胚胎干细胞。在这方面，应当理解，本发明的方法包括细胞系的所有来源。

在下一个区块16中，通过在无菌室或容器(如生物反应器)中附着/粘附食品级生物兼容性支架，将细胞生长为模拟动物器官(如鱼器官)的固体或半固体结构。无菌室或容器可进行温度控制，并可具有入口和出口，用于引入和移除化学物、营养素和细胞等物质。食品级生物兼容性支架最终成为食用产品的一部分，由基于植物或基于真菌的材料制成，例如但不限于琼脂糖、海藻酸钠、壳聚糖、菌丝体和魔芋葡甘聚糖。海藻酸钠是一种从褐藻中自然提取的生物聚合物，具有生物兼容性。此外，从真菌中提取的植物性壳聚糖具有抗菌性能。在一些实施例中，区块16在没有抗生素或抗菌化合物的无菌容器中进行。区块18涉及向生物反应器提供培养基以支持细胞存活和生长。培养基可以是含有不同成分的缓冲溶液,所述成分包括但不限于无机盐(例如氯化钙(CaCl₂)、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、碳酸氢钠(NaHCO₃)、磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)、硫酸镁(MgSO₄)等)、氨基酸、维生素(例如硫胺素、核黄素、叶酸等)，和其他成分如葡萄糖，-巯基乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)和丙酮酸钠。生长培养基的非限制性示例包括但不限于莱柏维兹的L-15(Leibovitz’s L-15)培养基、Eagle’s培养基(MEM)、培养基199、杜尔贝科的改良Eagle培养基(DMEM)、Ham’s F12营养混合液、Ham’s F10营养混合液、MacCoy’s 5A培养基、Glasgow改良Eagle培养基(GMEM)、Iscove’s改良Dulbecco培养基和RPMI 1640。

根据区块20，将食品级生长因子和细胞因子引入生物反应器中的培养基中能够支持细胞生长和增殖。生长因子和细胞因子可包括但不限于胰岛素生长因子1(IGF-1)、胰岛素、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、白细胞介素11(IL-11)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)和转铁蛋白。本发明使用了(i)与分离的细胞在基因上属于相同或相似的物种和/或(ii)与分离的细胞(即在区块16处生长的细胞)在基因上属于相同的属的生长因子。本发明发现使用与分离细胞遗传距离较远的物种的生长因子和血清相比，使用(i)与分离细胞基因上相同或相似的物种和/或(ii)与分离细胞基因上相同的属的生长因子对分离细胞的生物活性更高。由于增强的兼容性，当使用在(i)基因上相同或相似的物种和/或(ii)基因上相同的属的生长因子培养分离细胞时，无需提供大剂量的“次优”生长因子。更高的生物活性还有助于减少培养基中所需的生长因子数量，缩短培养时间并提高细胞质量。由于培养基中刺激细胞生长和分化所需的生长因子水平降低，培养基的成本可以降低。此外，次优的生长因子的使用限制了最大细胞反应(生长、分化)的幅度。在某些情况下，无论提供多少次优的生长因子，都无法达到某些响应。物种特异性和/或属特异性生长因子可以帮助克服这些限制。

在一些实施例中，当一物种与分离细胞的DNA序列超过90％匹配时，该物种与分离细胞在基因上相似。

物种特异性或属特异性生长因子对分离细胞的受体能够产生有效作用。与通常不考虑分离细胞的物种的情况下均补充高水平人类蛋白质生长因子和/或FBS的常规生长培养基相比，使用物种特异性或属特异性生长因子体现更好的优化。氨基酸序列的物种特异性或属特异性变异以及生长因子和细胞受体的翻译后修饰可能是造成这种现象的原因。

如下文将更详细讨论，为了判断哪个种类的某种生长因子的对目标分离细胞发挥最高的生物活性，首先将目标细胞接种在完全培养基(即基础培养基+FBS)中。在达到目标汇合度(约20％-70％)后，以不同物种的生长因子于一浓度范围内(例如1pM–1μM)处理目标细胞。目标细胞被保存在培养箱中，直到达到所定的研究参数(例如细胞生长、分化标志物、细胞产物)的所需时间点。例如，当处理组之间的细胞汇合度存在差异时(大约2-10天)，可以通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定法、CyQUANT测定或任何其他适当的细胞增殖/死亡测定法来测量细胞生长。基于其EC50值(最大有效浓度的一半)比较各种物种的生长因子的生物活性。为了成本效益，应使用EC50值最低的生长因子培养目标细胞。但是，如果目标是获得最短的培养时间或最高的细胞质量，则选择引发最高最大细胞反应的生长因子。生长因子的最佳剂量定义为引发最大细胞反应所需的最低浓度。

在一些实施例中，区块20可涉及在没有胎牛血清(FBS)的情况下共同培养生物工程细胞和分离细胞。生物工程细胞被改造以分泌上述生长因子和细胞因子，并根据生长和增殖的需要向分离细胞提供这些生物分子。如本文所述，“生物工程”细胞并不等同于转基因细胞。生物工程细胞有一个特定的基因，该基因过度表达一种或多种特定的蛋白质。生物工程细胞可以是鱼细胞，也可以是其他类型的动物细胞，如牛细胞。生物工程细胞和分离细胞可以是在基因上属于相似或相同的物种。此外，生物工程化细胞和分离细胞可以属于同一属。作为非限制性示例，生物工程鱼细胞可与分离的鱼细胞共同培养，或生物工程牛细胞可与分离的牛细胞共同培养。在一些实施例中，如果鸡细胞被用作分离细胞，则生物工程细胞可以是鸡细胞或鸟细胞。在另一些实施例中，如果黄鱼细胞被用作分离细胞，则生物工程细胞可以是黄鱼细胞或其他鱼细胞。生物工程细胞不存在于最终的肉制品中。本发明的共同培养方法消除了培养基中对动物源性胎牛血清(FBS)的需要。此外，该共同培养方法在原位向分离细胞持续提供食品级特异性生长因子和细胞因子，并简化生产过程和降低其成本，其中生长因子是与分离细胞是(i)在基因上属于相同或相似的物种和/或(ii)在基因上属于相同的属。然而，在其他实施例中，FBS或其他血清可用于供应生长因子、细胞因子和其他营养物以支持块16期间的细胞生长。

在一些实施例中，区块20包含与分离细胞在基因上属于相同或相似物种的重组生长因子。在另一些实施例中，与分离细胞属于相同的属的重组生长因子被使用。重组生长因子被加入到生长培养基中。相比使用来自关系遥远物种的生长因子和血清，此类重组生长因子对分离细胞产生的生物活性较高。细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或任何其他合适的蛋白质表达系统可用于生产此类重组生长因子。可以通过(但不限于)亲和层析、离子交换层析、尺寸排阻层析或其组合进行蛋白质纯化。

在一些实施例中，赤石斑鱼(鱼)的重组生长因子被使用，其与青石斑鱼(鱼)的鱼肌肉细胞或鳔细胞在基因上属于相似的物种。用于培养青石斑鱼的重组生长因子是赤石斑鱼的IGF-1、胰岛素和/或转铁蛋白。这种IGF-1的浓度范围为10ng/mL至100ng/mL。胰岛素的浓度范围为1μg/mL–10μg/mL。转铁蛋白的浓度范围为0.5μg/mL–5μg/mL。

此外，根据区块22，细胞中的蛋白质表达或可被增加以提高所得肉制品中的生物量产量。如本文所用，“生物量产量”是指所得肉制品中可消化物质(例如蛋白质)的量，该物质在消耗后可用于能源生产。具体来说，区块22涉及通过改变细胞中的微核糖核酸水平来增加蛋白质表达，并在培养之前对细胞进行操纵。微核糖核酸是一种内源性的、短的、非编码的单链核糖核酸序列，涉及调节转录后基因的表达。区块22涉及通过促进信使核糖核酸(mRNA)翻译增加蛋白表达的上调微核糖核酸的数量，和/或通过抑制信使核糖核酸翻译减少蛋白表达的下调微核糖核酸的数量。通过向细胞中引入微核糖核酸、微核糖核酸模拟物或微核糖核酸抑制剂，可以增加或减少微核糖核酸的水平。微核糖核酸模拟物具有与微核糖核酸相同的功能，但在调节蛋白质表达方面可能更稳定和有效。在一些实施例中，电穿孔法可用于将游离型载体引入执行表达特定微核糖核酸指令的细胞。作为替代选择，或与此相互结合，腺相关病毒可以用作携带游离型指令的载体，以表达特定的微核糖核酸。通过转染将目标微核糖核酸抑制剂引入细胞，可以减少目标下调微核糖核酸的数量。要注意的是，根据本发明增加蛋白质表达/生物量产量的方法是在不修改细胞基因组的情况下进行的。

图2概要性地描绘了细胞系中增强转录后蛋白质表达的方法。可以增加一个或多个上调微核糖核酸(miRNA)，以增加所选蛋白质的信使核糖核酸翻译和蛋白质生产。作为替代选择，或与此相互结合，一个或多个下调微核糖核酸可被抑制剂(抗微核糖核酸)阻断，以增加所选蛋白质的信使核糖核酸翻译和蛋白质生产。

鱼鳔主要包括成纤维细胞和胶原蛋白。I型胶原(胶原蛋白I)是鱼鳔中的主要蛋白质，增加培养的鱼鳔细胞中I型胶原的表达可能会提高生物产量。鱼鳔细胞中的I型胶原包括胶原1型α1(COL1A1)和胶原1型α2(COL1A2)。COL1A1和COL1A2的表达通过上调微核糖核酸21(miR-21)而增加，因此提高上调微核糖核酸21的水平可提高鱼鳔细胞中胶原1型α1和胶原1型α2的生成。此外，下调微核糖核酸29a(miR-29a)可降低胶原1型α1和胶原1型α2的表达，因此降低下调微核糖核酸29a的水平或阻断下调微核糖核酸29a的作用可提高鱼鳔细胞中胶原1型α1和胶原1型α2的生成。图3-4显示通过提高上调微核糖核酸21水平和通过使用抑制剂(抗miR29a)阻断下调微核糖核酸29a的作用来提高胶原1型α1(图3)和胶原1型α2(图4)的生成。胶原1型α1和胶原1型α2产量的增加使肉制品的产量增加。类似的策略可用于提高其他类型动物细胞中的相关蛋白质水平。

图5显示用于培养分离细胞的示例性生物反应器30。细胞附着在由食品级支架34提供的固相支架32上并在其上生长，该支架34固定在生物反应器30的无菌室36中。支架34可以决定肉制品的形状。食品级支架34由基于植物或基于真菌的材料制成，例如但不限于琼脂糖、海藻酸钠、壳聚糖、菌丝体和魔芋葡甘聚糖。固相支架32可以是多孔的，以便细胞可以附着支架32的内表面并在其上生长。向细胞提供营养的培养基通过入口38引入生物反应器30，并通过出口40从生物反应器30中排空。

图6所示的生物反应器50类似于图5的生物反应器30，不同的是生物反应器50还包括第二固相52，而第二固相52通过细网54与固相支架32分隔开。第二固相52可包含或支持生物工程细胞，该生物工程细胞会在其原本位置为固相支架32上生长的细胞分泌营养素、生长因子和细胞因子，并可将生物工程细胞与固相支架32上的细胞分离。第二固相52由基于植物的材料制成，类似于固相支架32。营养素、生长因子和细胞因子可渗透网54，细胞则不能渗透网54。图6的生物反应器50允许生物工程细胞与生长细胞共同培养。在某些实施例中，图5和6的生物反应器可以串联布置。在其他实施例中，多个生物反应器30可以与多个生物反应器50或生物反应器30和50的混合串联布置，以扩大规模。生物反应器30可主要用于生物质生产，而生物反应器50则可用于向生长细胞提供营养、生长因子和细胞因子。

本发明的体外细胞培养肉生产方法提供了具有单个细胞类型的简单组织的肉制品。与其他具有多个细胞类型的养殖肉类相比，具有单个细胞类型的肉类产品更容易制造、开发和商业化。本发明的其他实施例提供了具有多个细胞类型的肉制品。此外，申请人发现一种通过改变生长细胞中的微核糖核酸水平或活性来增加生物质/蛋白质生产的方法。例如，两个关键的微核糖核酸(上调微核糖核酸21和下调微核糖核酸29a)被用于提高鱼鳔细胞中的主要蛋白质(胶原蛋白I)的水平。据申请人所知，改变微核糖核酸水平或活性以提高养殖肉制品中蛋白质/生物量产量的做法尚未被其他人用于开发养殖肉制品此领域。与已知的基因敲入或敲除方法相比，将目标放在微核糖核酸以增加蛋白质产量可能会对细胞造成更少的压力。生物工程细胞将会与生长中的动物细胞共同培养，为生长中的鱼类细胞提供用于原位细胞生长和增殖的食物级生长因子和细胞因子，减少或消除培养基中对源自于动物的胎牛血清需求。共同培养技术亦能够简化生产过程和降低生产成本。

此外，养殖肉制品中的营养素可以被定制成更健康的食品。例如，养殖肉制品可根据营养师或个人基因测试的饮食建议来定制。在特定条件下培养细胞可以丰富肉制品中的高密度胆固醇、多不饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸等健康营养素。作为替代选择，或与此相互结合，可以通过在特定条件下培养细胞来减少对健康有害的营养素，如低密度胆固醇和饱和脂肪酸。微量营养素，如维生素和矿物质，也可能得到加强。养殖肉制品的营养定制可通过各种方式取得，例如但不限于：1)在细胞培养过程中调整喂给生长细胞的营养，和/或2)控制带有不同细胞的分层支架的比例。

养殖食品的生产是在清洁、无菌和高度控制的过程中进行的。因此，可将食品中的营养素被微生物(如细菌或真菌)降解此类不希望发生的情形被最小化。因分解营养物质而产生的不良味道和气味亦会被最小化。这种特性使养殖食品在烹饪中有新的用途，并有助于创造出新的食谱。养殖食品的一个例子是从鱼鳔中提取的养殖鱼肚。传统鱼肚中的胺由于在生产过程中被细菌降解而产生不良的鱼腥味和气味。这种不受欢迎的特性限制了食物的用途，导致鱼肚只能用于热食或暖食的菜肴。采用细胞培养技术生产的养殖鱼肚没有令人讨厌的鱼腥味和气味。除了热菜外，养殖鱼肚还可以用于甜品或在冷冻或室温下食用的即食菜。

物种特异性或属特异性生长因子的确定

本文将详细讨论确定物种特异性或属特异性生长因子的方法。它包括两个主要步骤，即细胞生长刺激步骤和测量细胞生长步骤。

细胞生长刺激步骤

MCF-7人上皮细胞系在完全培养基DMEM/F12、10％FBS中在加湿培养箱(34℃；5％CO2；95％空气)中培养。以1:4至1:8的比例分割细胞以进行日常培养。

在达到约80％汇合时，通过胰蛋白酶/EDTA使细胞脱离。为了研究生长因子对细胞生长的影响，将细胞以3x 10⁴个细胞/cm2的密度在完全培养基中接种到24孔板(如果通过细胞计数测量细胞生长)或96孔板(如果细胞生长由CyQUANT细胞增殖检测试剂盒测量)。将细胞放回培养箱。

24小时后，除去培养基。通过添加无血清培养基DMEM/F12、0.1％人血清白蛋白(Sigma Aldrich),0.2％普利莫星(Primocin)使细胞预适应无血清条件。将细胞在该培养基中保持在培养箱内至少16小时。

为要查验其生长刺激作用,以无血清培养基制备每个物种/属的生长因子(例如重组人IGF-1、人IGF-1-LR3、小鼠IGF-1、鲷鱼IGF-1和金枪鱼IGF-1)10x的工作浓度。将10x生长因子添加到孔中，使细胞被1x生长因子处理(例如，将50μL 10x生长因子添加到含有450μL无血清培养基的孔中)(例如1pM–1μM)。将细胞放回培养箱。

每天在显微镜下观察细胞的细胞生长迹象。当治疗组之间的细胞汇合度存在明显差异时(通常在第2天至第10天之间检测到)，通过细胞计数、CyQUANT细胞增殖测定或任何其他细胞增殖/死亡测定来量化细胞生长。

测量细胞生长步骤

有两种测量细胞生长的方法，即台盼蓝排除法和CyQUANT细胞增殖测定试剂盒。

台盼蓝排除

细胞应该已经在24孔板中处理过。吸出培养基并用胰蛋白酶-EDTA脱离细胞。

通过将1个体积的完全培养基添加到孔中来停止胰蛋白酶活性。确保通过在孔内吸移液体3-5次以脱离所有细胞。

将细胞悬浮液收集到1.5mL管中。以400x g离心该管5分钟，使细胞沉淀。

在不干扰细胞沉淀的情况下去除上清液。在200μL DMEM/F12基础培养基中重悬细胞沉淀。

将10μL细胞悬液与10μL 0.4％台盼蓝溶液混合。

2分钟后，将10μL细胞/台盼蓝混合物添加到Countess II FL一次性载玻片或血细胞计数器的每个腔室中。如果使用Countess II FL系统，将载玻片插入Countess II FL自动细胞计数仪的载玻片架中，并确定细胞浓度和存活率。如果使用血细胞计数器，用显微镜计数细胞。

计算每个治疗组中的细胞数量。每孔的活细胞数等于活细胞浓度(细胞/毫升)。

CyQUANT细胞增殖测定试剂盒

CyQUANT细胞增殖测定试剂盒通过测量样品中的核酸含量来量化细胞生长。细胞事先已经被接种到96孔板上，优选地在每个处理组一式三份的孔中。

通过多通道移液器尽可能多地去除培养基。避免用移液器吸头刮伤孔底。

在-80℃冰箱中冷冻板。该板可在-80℃下储存长达4周。

在室温下解冻板和测定试剂盒试剂。

为每个孔混合根据表1的试剂盒试剂。

表1

当板完全解冻时，将200μL CyQUANT GR染料/裂解缓冲液混合物添加到每个样品孔和三个空孔(空白)中。将板在室温下孵育5分钟，避光。

使用多通道移液器，将160μL从96孔板的每个孔转移到黑色96孔板的相应孔中。

使用荧光酶标仪(例如Molecular Devices SpectraMax iD5)测量样品荧光。将激发和发射波长分别设置为480nm和520nm。

计算空白孔的荧光读数的平均值。从所有样品荧光读数中减去该平均读数以校正背景荧光。

计算载体组的平均校正荧光。通过将样本读数(即IGF-1组)除以平均载体读数，将治疗组荧光读数表示为对照倍数(FOC)。

例子一

IGF-1以剂量依赖性方式刺激MCF-7细胞的生长

为了验证IGF-1刺激人MCF-7细胞的生长，用渐增剂量的人IGF-1(0pg/mL–100ng/mL)处理细胞10天，并进行细胞计数处理。如图7所示，虽然1-100pg/mL IGF-1没有增加细胞的数量，但更高的IGF-1浓度(1-100ng/mL)以剂量依赖性方式促进细胞生长。因此，MCF-7细胞适用于评估IGF-1的生长刺激活性。

例子二

人IGF-1，而非小鼠或鱼IGF-1，促进人MCF-7细胞的生长

为了研究IGF-1的生长刺激活性是否取决于其物种来源，我们以1.5nM的各种物种(即人、小鼠和鱼(鲷鱼、金枪鱼)的重组IGF-1处理MCF-7细胞。7天后，通过CyQUANT细胞增殖测定评估细胞生长(图8)。虽然多个来源的人IGF-1一致性地增加MCF-7细胞生长(约50-100％增加)，小鼠和鱼IGF-1没有增加细胞生长(图8)。这些发现表明，与人类MCF-7细胞属于同种的人类IGF-1在促进MCF-7细胞生长方面比鱼和小鼠IGF-1更有效。

本发明表明，使用与培养细胞的细胞类型(i)在基因上属于相同或相似的物种或(ii)属于相同的属的生长因子和白蛋白更有效。这些生长因子或蛋白质因子的使用可以减少，同时达到相同的生长速率。使用物种特异性生长因子和/或属特异性生长因子有望降低培养基成本，特别是在培养肉的大规模细胞生产和使用培养细胞团的其他应用中。使用更具生物活性的生长因子还可以减少程序时间并提高培养肉或细胞团的质量(例如质地、味道、营养价值)。

上述描述是说明性的而非限制性的。在阅读本发明的披露后，本领域技术人员可以清楚地看到本发明的实施例的许多变化。因此，实施例的范围不应根据上述描述来确定，而应参考待审的权利要求及其全部范围或等效范围来确定。

任何实施例的一个或多个特征可以与任何其他实施例的一个或多个特征相结合，而不脱离实施例的范围。除非有明确相反的指示，否则“一个(a)”、“一个(an)”或“这(the)”的意思是“一个或多个”。除非另有明确相反的指示，否则“和/或”旨在代表该术语最具包容性的含义。

虽然本发明可以以多种不同的形式体现，但应理解所提供的附图和讨论为本发明是一项或多项发明的原理的示例，并不旨在将任何一个实施例限制为所示的实施例。

因此，在其更广泛的方面,本发明的披露不限于上述所示和所述的具体细节、代表性系统和方法以及说明性示例。在不脱离本发明的范围或精神的情况下，可以对上述披露进行各种修改和变更，并且本发明旨在涵盖所有此类修改和变更，前提是它们落入权利要求及其等效物的范围。

示例性操作程序

A.鱼鳔细胞系的开发

1.从当地鱼市购买健康的黄鱼、鲈鱼或类似类别的鱼。

2.将鱼放在冰上直到细胞分离。

3.将鱼浸在10％的漂白剂中。

4.在无菌条件下从鱼身上取出鱼鳔。

5.用次氯酸清洗器官一次或多次。

6.在抗生素培养基(含有400lU/mL青霉素、400pg/mL链霉素的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)清洗器官一次或多次。

7.清洗后，将器官切成小块(2-3立方毫米)。

8.将切成小块的器官转移到含有0.25％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲生理盐水的离心管中。

9.在室温下连续振荡孵育1小时。

10.用100皮米网孔过滤上清液以去除未消化的组织。

11.将滤液以200克离心5分钟。

12.用完全培养基(含有200lU/mL青霉素、200pg/mL链霉素、10％牛血清的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)重悬细胞沉淀物。

13.将细胞接种到T25培养瓶中。

14.在24至28℃下孵育。

15.第二天去除未附上在组织培养瓶上的细胞。

16.每2至3天用新鲜培养基更换一半培养基。

17.当细胞形成完整的单层时，细胞被认为已建立。已建立的细胞可以进行继代培养。

B.以组织外植体开发鱼鳔细胞系

1.从当地鱼市购买健康的黄鱼、鲈鱼或类似类别的鱼。

2.将鱼放在冰上直到细胞分离。

3.将鱼浸在10％的漂白剂中。

4.在无菌条件下从鱼身上取出鱼鳔。

5.用次氯酸清洗器官一次或多次。

6.在抗生素培养基(含有400lU/mL青霉素、400pg/mL链霉素的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)清洗器官一次或多次。

7.清洗后，将器官切成小块(1-2立方毫米)。

8.将器官碎片分别放入含有完全培养基(含有200lU/mL青霉素、200pg/mL链霉素、10％牛血清的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)的24孔板中。

9.在24至28℃下孵育。

10.每2至3天用新鲜培养基更换一半培养基，不要干扰组织外植体。

11.孵育组织外植体，直至观察到贴壁细胞。

12.取出组织外植体。

13.当细胞形成完整的单层时，细胞被认为已建立。已建立的细胞可以进行继代培养。

C.以组织外植体开发鱼肌肉细胞系

1.从当地鱼市购买健康的石斑鱼、鳕鱼、比目鱼、大比目鱼、比目鱼或类似类别的鱼。

2.将鱼放在冰上直到细胞分离。

3.将鱼浸在10％的漂白剂中。

4.在无菌条件下去除鱼的肌肉。

5.用次氯酸清洗组织一次或多次。

6.在抗生素培养基(含有400lU/mL青霉素、400pg/mL链霉素的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)清洗组织一次或多次。

7.清洗后，将组织切成小块(2-3立方毫米)

8.将切成小块的组织转移到含有胶原酶和散酶的磷酸盐缓冲生理盐水的离心管中。

9.在室温下连续振荡孵育1小时。

10.用100皮米网孔过滤上清液以去除未消化的组织。

11.将滤液以200克离心5分钟。

12.用完全培养基(含有200lU/mL青霉素、200pg/mL链霉素、10％牛血清的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)重悬细胞沉淀物。

13.将细胞接种到T25培养瓶中。

14.在24至28℃下孵育。

15.第二天去除未附上在组织培养瓶上的细胞。

16.每2至3天用新鲜培养基更换一半培养基。

17.当细胞形成完整的单层时，细胞被认为已建立。已建立的细胞可以进行继代培养。

D.从组织外植体开发鱼肌肉细胞系

1.从当地鱼市购买健康的石斑鱼、鳕鱼、比目鱼、大比目鱼、比目鱼或类似类别的鱼。

2.将鱼放在冰上直到细胞分离。

3.将鱼浸在10％的漂白剂中。

4.在无菌条件下去除鱼的肌肉。

5.用次氯酸清洗组织一次或多次。

6.在抗生素培养基(含有400lU/mL青霉素、400pg/mL链霉素的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)清洗组织一次或多次。

7.清洗后，将肌肉切成小块(1-2立方毫米)。

8.将肌肉块分别放入含有完全培养基(含有200lU/mL青霉素、200pg/mL链霉素、10％牛血清的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)的24孔板中。

9.在24至28℃下孵育。

10.每2至3天用新鲜培养基更换一半培养基，不要干扰组织外植体。

11.孵育组织外植体，直至观察到贴壁细胞。

12.取出组织外植体。

13.当细胞形成完整的单层时，细胞被认为已建立。已建立的细胞可以进行继代培养。

E.成体干细胞分离和培养

1.从当地鱼市购买健康的石斑鱼、鳕鱼、比目鱼、大比目鱼、比目鱼或6个月或更小的类似类别的鱼。

2.将鱼放在冰上直到细胞分离。

3.将鱼浸在10％的漂白剂中。

4.在无菌条件下去除鱼的肌肉。

5.用次氯酸清洗组织一次或多次。

6.在抗生素培养基(含有400lU/mL青霉素、400pg/mL链霉素的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)清洗组织一次或多次。

7.清洗后，将组织切成小块(2-3立方毫米)。

8.将切成小块的组织转移到含有胶原酶和散酶的磷酸盐缓冲生理盐水的离心管中。

9.在室温下连续振荡孵育1小时。

10.用100皮米网孔过滤上清液以去除未消化的组织。

11.将滤液以200克离心5分钟。

12.用完全培养基(含有200lU/mL青霉素、200pg/mL链霉素、10％牛血清、100ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)重悬细胞沉淀。

13.在24至28℃下将细胞铺板在未有涂层的板上1小时。

14.收集上清液并置于涂有粘连蛋白、明胶、基质胶或类似基质的板上。

15.在24至28℃下孵育。

16.24小时后，洗去任何松散附着和未附上的细胞。

17.每天用完全培养基更换培养基(含有200lU/mL青霉素、200pg/mL链霉素、10％牛血清、100ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM)。

F.生成和培养诱导性多能干细胞

1.转染前2至4天，将细胞置于放有完整培养基(含10％胎牛血清的L15)的组织培养瓶中。转染当天(第0天)，细胞应约75至90％汇合。

2.从涂有明胶的6孔板中吸取培养基，并在每孔更换2毫升新鲜完整培养基。将有涂层的板放置在37℃下，直到可以使用为止。

3.置于37℃下解冻Epi5TM载体，将其放置在湿冰上直到可以使用为止。使用前，对解冻的载体进行短暂离心，将其收集在试管底部。

4.在磷酸盐缓冲生理盐水中清洗细胞。

5.在含有细胞的培养瓶中添加3毫升0.05％的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸。

6.在室温下放置培养瓶3分钟。

7.在每个培养瓶添加5至8毫升完整培养基。小心地将细胞转移到一个空的、无菌的15毫升锥形管中。

8.用台盼蓝染料排斥细胞活性测定法检查活性。

9.离心200克细胞2分钟。

10.小心吸取大部分上清液，用完整培养基重新悬浮。

11.将涂有明胶的培养皿上的细胞接种到6孔培养皿中，每孔培养50000至100000个细胞，在2毫升完整培养基中以30至60％的汇合度，并在24至28℃下培养过夜。

12.预热Opti-MEM/减血清培养基至室温，并按如下所述制备试管A和试管B。

13.在标记为试管A的1.5毫升微型离心管中,分别将1.2微升的两个Epi5^TM重新编程矢量混合物(总计2.4微升)添加到118微升的Opti-MEM培养基中。添加4.8微升的P3000^TM试剂并充分混合。

14.在标记为试管b含有预先加热121L的Opti MEM培养基的1.5毫升微型离心管中,稀释3.6微升的Lipofectamine 3000试剂。

15.为了制备转染主混合物，将试管A的内容物添加到试管B中，并充分混合。

16.将转染主混合物在室温下培养5分钟。

17.再混合一次，将250微升的转染主混合物加入到向每个孔中。

18.在24-28℃下培养过夜。

19.转染后24小时，从平板中吸取培养基。向每个孔中添加2毫升N2B27培养基(含有IX N-2补充剂，IX B27补充剂，100ng/mL碱性成纤维细胞生长因子重组蛋白的L15)。

20.每天以2毫升N2B27培养基更换旧培养基的方式更换N2B27培养基，共14天。

21.第14天吸取用过的N2B27培养基，更换为完整培养基。随后每天在每个孔中更换2毫升的培养基。

22.每隔一天在显微镜下观察培养板是否出现表明细胞已转化的细胞团。在转染后15至21天内，诱导性多能干细胞菌落将生长到合适的大小以进行转移。

23.菌落在第21天是不同的，可以挑选出来进行进一步的培养和扩展。

G.细胞继代培养方法

1.取出并丢弃培养基。

2.用磷酸盐缓冲生理盐水简短地冲洗细胞，去除所有含有胰蛋白酶抑制剂的微量血清。

3.向培养瓶添加2至3毫0.25％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸溶液。

4.在室温下培养1分钟。

5.加入5至8毫升完整生长培养基。

6.轻轻移液吸取细胞。

7.以1比2至1比3的继代培养比率将适当等分的细胞悬浮液添加到新的培养瓶中。

8.在24至28℃下培养。

H.悬浮培养适应性

1.以适合所述细胞的频率通过胰蛋白酶传代单层培养。

2.每次传代时，用磷酸盐缓冲生理盐水清洗细胞单层，并用0.25％胰蛋白酶覆盖。

3.室温孵育5分钟。

4.用完全培养基灭活酶。

5.收获细胞悬液，用台盼蓝染料排斥细胞活力测定法检测细胞活力。

6.将细胞悬浮液接种到另一个培养瓶中。

7.重复传代，直至悬浮细胞活力等于或大于90％。

8.在细胞密度为每毫升0.1至0.5百万的旋转瓶或摇瓶中，用50毫升完整培养基建立悬浮培养基。

9.在二氧化碳培养箱中，在最适合单层培养的相同温度、湿度和大气条件下，培养旋转瓶或摇瓶悬浮培养物。

10.每隔2至3天用新鲜培养基将细胞密度调节到每毫升0.1至0.5百万。

11.通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。

12.于可促进健康细胞生长的细胞密度下建立多个平行培养物。

13.使用部分培养物将细胞密度逐渐增加至每毫升100万。

14.如果细胞密度增加导致细胞死亡，则丢弃高密度培养物。

15.从步骤12重新启动细胞高密度培养的适应。

16.当细胞适应悬浮生长时，使用3L生物反应器扩大培养。

I.适应无血清培养基(植物水解液)

1.在DMEM/F12完全培养基(1:1DMEM培养基和Ham's F12培养基，2至4mM谷氨酰胺，10％胎牛血清)中培养细胞。

2.制备无血清培养基(1:1DMEM培养基和Ham's F12培养基，2至4mM谷氨酰胺，20％植物水解物例如大豆、棉籽、油菜、小麦、酵母或等效物)。

3.当细胞达到汇合时，用适应培养基I(40％新鲜完整培养基，40％前代条件培养基，20％无血清培养基)代替培养基。

4.每2至3天用台盼蓝染料排斥细胞活性测定法检查活性。

5.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤3。

6.当细胞达到汇合时，用适应培养基II(30％新鲜完整培养基，30％步骤1中细胞的条件培养基，40％无血清培养基)替换培养基。

7.每2至3天通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。

8.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤6。

9.当细胞达到汇合时，用适应培养基III(20％新鲜完整培养基，20％步骤1中细胞的条件培养基，60％无血清培养基)替换培养基。

10.每2至3天通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。

11.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤9。

12.当细胞达到汇合时，用适应培养基IV(10％新鲜完整培养基，10％步骤1中细胞的条件培养基，80％无血清培养基)替换培养基。

13.每2至3天通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。

14.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤12。

15.当细胞汇合时，用无血清培养基代替培养基。

16.每2至3天通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。

17.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤15。

18.无血清培养基的使用量可在每一步骤中逐步增加，即每一步骤增加20％或更少。

J.适应无血清培养基(化学定义)

1.在DMEM/F12完全培养基中培养细胞(1:1DMEM培养基和Ham's F12培养基，2至4mM谷氨酰胺，10％胎牛血清)。

2.制备无血清培养基(1:1DMEM培养基和Ham's F12培养基，2至4mM谷氨酰胺，65-130ug/mL抗坏血酸2-磷酸，550-1100ug/mL碳酸氢钠锭，14-28ng/mL亚硒酸钠，19-38ug/mL胰岛素，11-22ug/mL转铁蛋白，100-200ng/mL成纤维细胞生长因子，2-4ng/mL乙型转化生长因子)。

3.当细胞达到汇合时，用适应培养基I(40％新鲜完全培养基、40％前传代条件培养基、20％无血清培养基)更换培养基。

4.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。

5.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤3。

6.当细胞达到汇合时，用适应培养基II(30％新鲜完全培养基、30％步骤1中细胞的条件培养基、40％无血清培养基)更换培养基

7.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。

8.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤6。

9.当细胞达到汇合时，用适应培养基III(30％新鲜完全培养基、30％步骤1中细胞的条件培养基、40％无血清培养基)更换培养基。

10.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。

11.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤9。

12.当细胞达到汇合时，用适应培养基IV(10％新鲜完全培养基、10％步骤1中细胞的条件培养基、80％无血清培养基)更换培养基。

13.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。

14.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤12。

15.当细胞达到汇合时，用无血清培养基更换培养基。

16.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。

17.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤15。

18.无血清培养基的用量可在每一步骤逐渐增加。例如，每一步骤增加20％或更少。

K.增强转录后蛋白质表达

1.在完全培养基(Leibovitz's L-15或DMEM或EMEM与200IU/mL青霉素、200pg/mL链霉素、10％胎牛血清)或无血清培养基(DMEM/F12包含植物水解物或化学定义的化合物)中培养细胞。

2.移除并丢弃培养基。

3.使用PBS短暂地冲洗细胞以去除所有含有胰蛋白酶抑制剂的血清。

4.将2-3mL的0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液添加到培养瓶中。

5.在室温下孵育1分钟。

6.通过轻轻移液吸出细胞。

7.以200g离心细胞2分钟。

8.在完全培养基或无血清培养基中重悬细胞。

9.向6孔板的每个孔中加入50万个细胞。

10.在24-28℃下孵育过夜。

11.使用聚乙烯亚胺、脂质体、电穿孔法将微RNA寡核苷酸(miR-21、miR-29a、miR-21模拟物、miR-29a模拟物、抗miR-21、抗miR-29a或等效物)转染到细胞中，或其他方法。

12.在24-28℃下孵育过夜。

13.在相同的温度、湿度和大气的最佳培养条件下，将细胞转移至多层培养瓶、转瓶或摇瓶中的CO2培养箱中。

L.细胞培养支架(魔芋+树胶)

1.用几片藏红花烧开水，直至颜色变成淡黄色。

2.取出藏红花，将溶液静置至温热。

3.准备所有干料

a.魔芋–0.5至5％，优选地3％

b.泡打粉–0.3至3％，优选地3％

c.完善的黄原胶–0.2至2％，优选地1.5％

4.量取100毫升藏红花溶液。

5.依次加入泡打粉、黄原胶。加入每种成分后，充分搅拌混合物。

6.将魔芋一点一点洒在溶液上。继续搅拌。溶液应该变得糊状。

7.将魔芋混合物铺在模具中，厚度约为1至15毫米。

8.盖上模具，在室温下静置30分钟以上。

9.将模具放入4℃冰箱4小时。

10.将模具用小火蒸40分钟。

11.将模具在室温下静置2小时。

12.将支架在45至55℃下脱水15分钟。

M.细胞培养支架(藻酸盐+糯米粉)

1.称取0.1至2克(0.1至2％)，优选地约1克(1％)海藻酸钠。

2.在搅拌机中加入100毫升水。

3.将海藻酸盐粉末加入搅拌机，搅拌至溶解。

4.用塑料薄膜盖住容器，将藻酸盐溶液放入冰箱过夜，以消除气泡。

5.称取1至10克(1-10％)，优选地5克(5％)左右的糯米粉，放入模具中。

6.将海藻酸盐溶液加入模具中，约1至15毫米厚。

7.搅拌混合物直至所有粉末溶解。

8.用小火蒸30分钟直至定型。

9.盖上模具，在室温下静置30分钟。

10.称取1％的乳酸钙，搅拌溶解在水中。

11.将支架浸入1％的乳酸钙溶液中至少2.5小时，以便在支架周围形成膜。

Claims (9)

1.一种通过体外细胞培养生产肉类的方法，包括：

从动物或植物来源分离组织并制备细胞的细胞悬液；

加入包含一个或多个与所述细胞(i)在基因上属于相同或相似的物种的生长因子和/或(ii)在基因上属于相同的属的生长因子的培养基；

在处于培养基中的食品级支架上增长该细胞，所述细胞生长成模拟动物器官的固体或半固体结构。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离组织包括从鱼分离器官组织。

3.根据权利要求1所述的方法，还包括如下步骤:通过改变一种或多种调节蛋白质表达的微核糖核酸的水平来增加细胞中蛋白质的表达。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述器官组织源于硬骨鱼纲鱼的鱼鳔。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述蛋白质是胶原蛋白。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述微核糖核酸是微核糖核酸21(miR-21)﹑微核糖核酸29a(miR-29a)抑制剂或其组合。

7.一种通过体外细胞培养生产肉类的方法，包括：

从动物或植物来源分离组织并从该组织制备细胞的细胞悬液；

在处于培养基中的食品级支架上增长该细胞，所述细胞生长成模拟动物器官的固体或半固体结构；和

将所述细胞与多个分泌支持细胞生长的营养素、生长因子和细胞因子的生物工程细胞共同培养，其中所述工程细胞与所述细胞是(i)在基因上属于相同或相似的物种和/或(ii)在基因上属于相同的属。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述分离组织包括从鱼分离器官组织。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述器官组织源于硬骨鱼纲鱼的鱼鳔。

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