MX2015003687A

MX2015003687A - Nuevo virus de vacuna ankara modificado (mva) y sus usos.

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Publication number: MX2015003687A
Application number: MX2015003687A
Authority: MX
Inventors: Ingo Jordan; Volker Sandig
Original assignee: Probiogen Ag
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2015-06-15
Also published as: US9732325B2; CN104812894A; BR112015006798A2; JP2015535687A; RU2015115898A; IN2015DN02335A; EP2900810B1; DK2900810T3; AU2012391162A1; CA2885240A1; US20150299666A1; CN104812894B; WO2014048500A1; EP2900810A1

Abstract

La presente invención se relaciona con un nuevo virus de de vacuna Ankara modificado (MVA). La presente invención también se relaciona con un método para cultivar el virus de MVA y con un método para producir el virus de MVA. Además, la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende tal virus de MVA y con uno o más excipientes, diluyentes y/o vehículos aceptables farmacéuticos. Además, la presente invención se relaciona con una vacuna que comprende tal virus de MVA. Además, la presente invención se relaciona con el virus de MVA para el uso en medicina.

Description

X NUEVO VIRUS DE VACUNA ANKARA MODIFICADO (MVA) Y SUS USOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un nuevo virus de vacuna Ankara modificado (MVA, por sus siglas en inglés) . La presente invención también se relaciona con un método para cultivar tal virus de MVA y con un método para producir tal virus de MVA. Además, la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende tal virus de MVA y con uno o más excipiente (s), diluyente(s) y/o vehículo (s) farmacéuticos. Además, la presente invención se relaciona con una vacuna que comprende el virus de MVA. Además, la presente invención se relaciona con el virus de MVA para el uso en medicina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las vacunas son una de las intervenciones de salud humana más eficaces disponibles y protegen contra un espectro muy amplio de enfermedades infecciosas. Sin embargo, la inmunidad protectora o terapéutica todavía no puede enfrentarse contra una serie de patógenos latentes y crónicos. Los métodos convencionales que provocan principalmente respuestas de anticuerpos no han tenido éxito. Las razones incluyen que los epítopos pueden ser variables, con frecuencia enmascarada o protegida por señuelos Ref.255142 microbianos, o porque el patógeno se esconde en una forma no accesible a los anticuerpos.

En comparación con la vacunación con viriones inactivados o subunidades purificadas, las vacunas vivas inducen una amplia respuesta que también involucra el compartimiento celular del sistema inmune. Sin embargo, debido al aumento del número de individuos inmunocomprómetidos y la expansión de la movilidad internacional, el uso de cepas con capacidad de replicación puede estar asociado con riesgos, tales como la reversión a formas más patógenas (Zurbriggen et al., 2008 en Appl Environ Microbiol 74, 5608-5614) o son los eventos adversos graves, tanto en los beneficiarios y personas de contacto de los vacunados (Kemper et al. 2002 en Ef Clin Pract 5, 84-90; Parrino and Graham 2006 en J Allergy Clin Immunol 118, 1320-1326).

Las vacunas vectorizadas modernas (Excler et al.2010 en Biologicals 38, 511-521; Plotkin 2009 en Clin Vaccine Immunol 16, 1709-1719) combinan las ventajas de una infección atenuada con el fuerte perfil de seguridad inherente a vectores de hospedador restringido que no pueden replicarse en el receptor humano o animal. Los vectores hiperatenuados especialmente prometedores son los poxvirus de hospedador restringido, que incluyen el virus de vacuna modificado de Ankara (MVA). Los poxvirus hiperatenuados han demostrado seguridad en las pruebas clínicas (Cebere et al. 2006 en Vaccine 24, 417-425; Dorrell et al.2007 en Vaccine 25, 3277-3283; Gilbert et al.2006 en Vaccine 24, 4554-4561; Mayr 2003 en Comp Immunol Microbiol Infect Dis 26, 423-430; Webster et al. 2005 en Proc Nati Acad Sci USA 102, 4836-4841) e incluso, son estimuladores eficientes de la respuesta inmune (Drillien et al.2004 en J Gen Virol 85, 2167-2175; Liu et al.2008 en BMC Immunol 9, 15; Ryan et al.2007 en Vaccine 25, 3380-3390; Sutter and Moss 1992 en Proc Nati Acad Sci USA 89, 10847-10851; Sutter et al. 1994 en Vaccine 12, 1032-1040). Particularmente, el virus de MVA se relaciona con virus de vacuna, un miembro de los géneros Orthopoxvirus en la familia de Poxviridae . El virus de MVA ha sido generado por 516 pasajes en serie sobre fibroblastos de embrión de pollo del virus Ankara de vacuna de corioalantoides (CVA). En el curso del proceso de atenuación por pases repetidos de material derivado de pollo como sustrato de producción, el virus de MVA ha perdido aproximadamente 15% del ADN genómico en múltiples sitios (Mayr and Munz 1964 en Zentralbl Bakteriol Orig 195, 24-35; Mcyer et al., 1991 en J Gen Virol 72 (Pt 5), 1031-1038). El virus de MVA se ha analizado para determinar alteraciones en el genoma con relación a la cepa CVA de tipo salvaje. Se han identificado seis eliminaciones principales de ADN genómico (eliminación I, II, III, IV, V y VI), que totalizan 31,000 pares de bases (Meyer et al., 1991 en J Gen Virol 72 (Pt 5), 1031-1038). Llegó a ser severamente una célula hospedera restringida a células aviares. Mientras que el virus de vacuna parental tiene una amplia gama de hospedadores, el virus de MVA tiene una gama de hospedadores muy estrecha. Por ejemplo, MVA no se replica en células humanas y de primate no humano. En la línea celular HeLa humana, el bloque de replicación parece presentarse en una etapa definida en el paquete del genoma (Sancho et al., 2002 en J Virol 76, 8318-8334). Además, las líneas de células HEK 293 y Vero no son un sistema de producción preferido. Además, se demostró en una variedad de modelos animales que el virus de MVA resultante fue significativamente avirulento (Mayr and Danner 1978 en Dev Biol Stand 41, 225-234). Además, la cepa MVA se ha probado en pruebas clínicas como una vacuna para inmunizar contra la enfermedad de la viruela humana (Mayr 2003 en Comp Immunol Microbiol Infect Dis 26, 423-430). Estos estudios incluyeron más de 120,000 humanos, incluyendo pacientes de alto riesgo, y demostraron que, en comparación con CVA, MVA, tuvieron una virulencia o infecciosidad disminuida, mientras que se mantuvo una buena inmunogenicidad.

Sin embargo, la provisión de un suministro adecuado del virus de MVA es un reto. Por un lado, el virus de MVA tiene que ser dado en dosis altas, ya que se replica en niveles muy bajos o no en absoluto en el receptor. Por otro lado, los sistemas de producción de virus de MVA que están actualmente disponibles son consumidores de tiempo y costosos y no pueden satisfacer las necesidades de la industria farmacéutica.

Como se mencionó anteriormente, la investigación y la producción de MVA depende de células aviarias. En la actualidad, las cepas de vacunas adaptadas a hospedadores aviares se producen sólo en huevos de pollo embrionados o en fibroblastos preparados de tales huevos. Esta teenología se asocia con otras desventajas, que incluyen el flujo continuo de material primario de origen animal en un proceso de producción clínica demandante y costos para el mantenimiento de rebaños donadores de SPF (libres de patógenos específicos). Debido a que es corto el tiempo de colección de los huevos embrionados con la producción de la vacuna, las pruebas para agentes extraños se lleva a cabo en el producto final (Philipp and Kolla 2010 en Biologicals 38, 350-351). Ocasionalmente, los lotes de vacunas completas tienen que ser desechados cuando se confirma la contaminación por pruebas de calidad (Enserink 2004 en Science 306, 385). Últimamente, para facilitar la aplicación industrial y los programas de vacunas en los países desarrollados o los países recientemente industrializados, los inventores de la presente invención diseñaron y generaron una línea de células hospederas totalmente permisiva para las cepas de vacunas que depende de sustratos aviares (Jordán et al.2009 en Vaccine 27, 748-756). También desarrollaron un proceso de producción químicamente definido, altamente eficiente y totalmente escalable para estos virus (Jordán et al.2011 en Biologicals 39, 50-58).

En la presente, por primera vez y con la teenología anterior a la mano, los inventores caracterizaron cepas estables de las generaciones posteriores de un virus de MVA ya adaptado e hiperatenuado sobre un sustrato celular completamente permisivo para el mismo virus hiperatenuado bajo condiciones altamente artificiales impuestas por la producción de virus en un cultivo en suspensión químicamente definido. Este es un experimento inusual y el resultado es sorprendente. Como se describe en Principies of Virology (ISBN-10: 1555814433), la motivación de los pasos en serie es, en general para adaptar los virus a sustratos inicialmente con baja permisividad: "Los virus menos virulentos (atenuados) pueden seleccionarse por el crecimiento de células distintas de las del hospedador normal, o por propagación a temperaturas no fisiológicas. Los mutantes capaces de propagar mejor bajo estas condiciones selectivas surgen durante la replicación viral. Cuando se aíslan, se purifican y subsecuentemente se prueban tales mutantes para la patogenicidad en modelos apropiados, algunas pueden ser menos patógenas que sus padres".

La caracterización anterior resultó en la identificación de nuevos virus de MVA con mutaciones puntuales en las proteínas estructurales. Este resultado es consistente con la propagación de virus en condiciones de cultivo artificiales en lugar de la selección dentro de una cierta célula hospedera. Los nuevos virus de MVA muestran propiedades benéficas en un cultivo en suspensión químicamente definido en comparación con cepas conocidas de virus de MVA, tales como un aumento de la actividad infecciosa y un mayor número de unidades infecciosas en el espacio extracelular. Estas propiedades benéficas mejoran la producción industrial de tales virus de MVA. En particular, permiten la producción de las nuevas cepas de virus de MVA en altos rendimientos. Además, las cepas del virus de MVA novedosas pueden aislarse directamente del sobrenadante libre de células que facilita la purificación y, de esta manera, la logística y la operación de biorreactores que producen tales virus de MVA. Esto, a su vez, reduce los costes de producción del virus de MVA.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención se relaciona con un virus de Ankara de vacuna modificada (MVA) que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto génico A3L y/o un producto del gen A34R, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácido de tal producto(s) de genes.

En un segundo aspecto, la presente invención se relaciona con un genoma del virus de MVA de acuerdo con el primer aspecto.

En un tercer aspecto, la presente invención se relaciona con una célula que comprende un virus de MVA de acuerdo con el primer aspecto o un genoma de acuerdo con el segundo aspecto.

En un cuarto aspecto, la presente invención se relaciona con un método para cultivar un virus de MVA de acuerdo con el primer aspecto que comprende las etapas de: (i) proporcionar una célula de acuerdo con el tercer aspecto, (ii) cultivar la célula, y (iii) aislar el virus de MVA.

En un quinto aspecto, la presente invención se relaciona con un método para producir un virus de MVA de acuerdo con el primer aspecto, que comprende las etapas de: (i) infectar una célula con un virus de MVA, (ii) cultivar la célula, (iii) aislar el virus de MVA, y (iv) repetir las etapas (i) a (iii) con el virus de MVA aislado en la etapa (iii) hasta que se detecta un virus de MVA que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto génico A3L y/o un producto del gen A34R, en el que tal secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácidos de tal producto(s) de genes.

En un sexto aspecto, la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un virus de MVA de acuerdo con el primer aspecto o un genoma de acuerdo con el segundo aspecto y uno o más excipiente (s), diluyente(s), y/o portador(es) farmacéuticamente aceptable.

En un séptimo aspecto, la presente invención se relaciona con una vacuna que comprende un virus de MVA de acuerdo con el primer aspecto o un genoma de acuerdo con el segundo aspecto.

En un octavo aspecto, la presente invención se relaciona con un virus de MVA de acuerdo con el primer aspecto o un genoma de acuerdo con el segundo aspecto, para el uso en medicina.

En un noveno aspecto, la presente invención se relaciona con un virus de MVA que comprende una secuencia de ácido nucleico, en el que el gen A3L y/o el gen A9L se elimina funcionalmente.

En un décimo aspecto, la presente invención se relaciona con una célula que comprende un gen A3L, un gen A9L y/o el gen A34R de un virus de MVA y que expresa tal gen(es).

En un undécimo aspecto, la presente invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico que comprende un gen A3L, un gen A9L y/o el gen A34R de un virus MVA, en donde el (los) gen (es) está(n) unido(s) operativamente a una secuencia de ácido nucleico heteróloga.

En un decimosegundo aspecto, la presente invención se relaciona con un método para producir un virus de MVA recombinante que comprende las siguientes etapas: (i) proporcionar una célula, (ii) introducir un virus de MVA de acuerdo con el noveno aspecto y una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el undécimo aspecto en la célula, y (iii) cultivar la célula en condiciones que permitan la recombinación homologa entre la secuencia de ácido nucleico del virus de MVA y la molécula de ácido nucleico obteniendo de este modo el virus de MVA recombinante.

Esta breve descripción de la invención no describe todas las características de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A-1D: (fig.1A) paso ciego de MVA, en donde no se conoció la concentración del virus de entrada del paso anterior. MOI pretendido fue de 0.01 a 0.1 ó 2xl04 a 2xl05 pfu/ml de virus de entrada a 2 x 106 células/mL en el momento de la infección. (fig. IB) Repetir el experimento mostrado en (fig. 1A) con excepción de que cada pasaje se inició con MOI definido de 0.05, y tal alto y bajo MVA de pasaje siempre se investigó en paralelo. Observar el aumento repentino en los rendimientos de nuevo empezando con el paso 10 de reproducibilidad de demostración de MVA. (fig.1C) Los títulos pico usualmente se obtuvieron 48 h después de la infección. Sólo estos rendimientos se muestran en esta tabla. Observar los rendimientos constantes en el paso de la referencia de los experimentos individuales (dentro de la variación del método de titulación, símbolos en negrita) y los mejoramientos gradual a repentino en los rendimientos conforme aumenta el número de pasos, (fig. ID) Relación de rendimientos en MVA del paso alto a bajo 48 h post-infección. El cálculo se realizó con datos de panel (fig. 1C). Una relación de 1 indica propiedades similares y se observa para MVA de paso 10 al paso 23.

Figura 2: Localización de las mutaciones aquí descritas en el genoma de vacuna Ankara corioalantoides (CVA, entrada GenBank AM501482), el virus parental de vacuna Ankara modificada altamente atenuada (MVA). Se muestran los sitios seleccionados de la enzima de restricción para la orientación, las repeticiones terminales invertidas, y los sitios de eliminación (Mcyer, et al., 1991 en J Gen Virol 72 (Pt 5), 1031-1038) (cuadros claros con números romanos). Los genes afectados (A3L, A9L y A34R) se indican con cuadros en negritas. Las líneas discontinuas indican los cambios de secuencia asociados. Se muestra la hebra codificante, los alfanuméricos describen la mutación en el ADN y nivel de aminoácidos en los genes respectivos en la cepa MVA-CR.

FIGURAS 3A-3F: nomenclatura de los diferentes linajes agregados a los datos mostrados parcialmente en la Figura 1. (fig. 3A) pase ciego de MVA, en donde no se conoció la concentración de virus de entrada del paso anterior. MOI pretendido fue de 0.01 a 0.1 ó 2xl04 a 2xl05 pfu/mL de virus de entrada a 2x10s células/mL en el momento de la infección. En este experimento, MVA-A2 se ha cultivado en linaje MVA-X, conduciendo a aislados MVA-X14 y MVA-X20. (fig.3B) Repetir el experimento mostrado en (fig. 3A) con excepción de que cada pasaje se inició con MOI definido de 0.05, y que MVA de pasaje alto y bajo siempre se investigaron en paralelo: la baja hebra de pasaje se inició con MVA-A2, la hebra de pasaje de referencia alta se inició con MVA-X14. Observar el aumento repentino en los rendimientos nuevamente empezando con el paso 10 de MVA demostrando reproducibilidad. (fig.3C) Los títulos del pico usualmente se obtuvieron 48 h después de la infección. Solamente estos rendimientos se muestran en esta tabla. Observar los rendimientos constantes en el paso de referencia de los experimentos individuales (dentro de la variación del método de titulación, símbolos en negrita) y mejoramientos gradual a repentino en los rendimientos conforme el número de paso aumenta. En este experimento controlado, MVA-A2 conduce al linaje MVA-CR, y MVA-X14 conduce al linaje MVA-Y. Se secuenciaron el ADN genómico de las cepas MVA-A2, MVA-CR7 y MVA-CR11. (fig. 3D) Genotipo G256T en A34R se enriquece por los inventores: observar que aparece súbitamente y que se acumula continuamente la resistencia a BsaWI en MVA-X14, MVA-Y23 y MVA-CR11. Los amplicones de PCR no digerido junto con un control sin molde se muestran en (fig. 3F). (fig. 3E) Relación de los rendimientos en MVA de pasaje alto a bajo, 48 h post-infección. El cálculo se realizó con datos de panel (fig. 3C). Una relación de 1 indica propiedades similares y se observa para MVA de paso 10 al paso 23.

FIGURAS 4A y 4B: MVA-CR es una nueva cepa y MVA-CR19 es un aislado puro de esta cepa. (fig. 4A) Progreso de la purificación de placas seguido por digestión de enzimas de restricción de diagnóstico. (fig. 4B) cromatogramas de secuenciación convencionales demuestran que el aislado del virus MVA-CR19 tiene el nuevo genotipo puro en los tres genes A3L, A9L y A34R.

FIGURA 5: fenotipos de placa macroscópica de MVA-A2 y MVA-CR19 en monocapas de células teñidas con cristal violeta. Observar la aparición de cometas en MVA-CR19 ya 72 h post infección en un momento en que las células CR infectadas de MVA-A2 aparecen salpicadas de placas circulares. 96 h después de la infección el cultivo está en CPE fulminante después de la infección con MVA-CR19, y por lo tanto, la intensidad de la mancha global aparece más débil debido a la extensa pérdida de masa celular. En este momento los cometas puntuales son visibles también después de la infección con MVA-A2. Una relación inversa es visible en el cultivo R05T de mamífero: las placas son prominentes y con forma de cometas 120 h post-infección sólo después de la infección con MVA-A2 parental. El aislado de MVA-CR19 parece estar altamente atenuado para esta línea celular. El panel izquierdo muestra las placas tan visibles a simple vista (barra de escala de 0.5 cm), el panel derecho muestra las células después de la ampliación inicial de 40 x (barra de escala de 100 mm).

FIGURA 6: fenotipo de placa en 40 veces de aumento inicial. Observar que las placas son más pronunciadas en las células CR (fila superior) infectadas con MVA-CR19 en comparación con MVA-A2; tamaño de la placa causada por MVA-CR11 es intermedio como si la mutación ejerciera una función auxiliar ya en una mezcla de genotipos. La situación inversa se observó en las células R05T con MVA-CR19 apareciendo más atenuada que MVA-A2 (fila inferior); de nuevo con MVA-CR11 en una posición intermedia.

FIGURAS 7A y 7B: Liberación del virus de la célula productora CR en cultivos en suspensión. A2 y CR19 se refiere a un aislado de MVA., CD-U3 y CD-VP4 se refiere a 1 volumen de medio correspondiente adicionado para la producción del virus correspondiente, la proliferación celular se realizó siempre en CD-U3. (fig.7A) Cinética de la replicación de aislados MVA-A2 y MVA-CR19 en medio de proliferación celular con (símbolos en negrita) o sin (símbolos abiertos) la adición de medio de producción de virus. La línea punteada a 105 pfu/mL corresponde al virus de entrada, MOI de 0.05. (fig. 7B) Distribución de unidades infecciosas en el sobrenadante o lisado completo (virus sobrenadante y asociada a las células) 48 h post-infección. Columnas blancas indican pfu/mL del lisado completo, columnas oscuras la concentración de unidades infecciosas liberadas en el sobrenadante celular. Los gráficos circulares en la parte superior de las columnas se refieren a unidades infecciosas en el espacio libre de células (SN) con relación al lisado completo (LYS). Las curvas mostradas en (fig. 7A) son el promedio de tres experimentos paralelos independientes, la desviación estándar no se muestra para mantener la claridad en una comparación de cuatro curvas independientes. En (fig. 7B) la desviación estándar de las tres repeticiones se muestra para los valores de 48 h. Las muestras usadas para obtener estos puntos de datos son de la cinética del panel (fig.7A).

FIGURA 8: la liberación del virus a partir de células productores adherentes cultivadas en presencia de suero. Columnas blancas indican pfu/mL del lisado completo, columnas oscuras la concentración de unidades infecciosas liberadas en el sobrenadante celular, y los gráficos circulares en la parte superior de las columnas el porcentaje de virus sin células en el lisado. Los cultivos se probaron para la MVA-A2 o MVA-CR1948 h p.i. en células CR o CR.pIX infectados y 144 h p.i. en células R05T.

FIGURAS 9A-9C: generaciones secuenciales de MVA en células adherentes CR dependientes de suero y células R05T de mamífero. MVA-B es el linaje derivado de células adherentes CR y MVA-R es el linaje derivado de las células R05T. (fig. 9A) La infección secuencial se realizó sin conocer el título de la generación previa. Las fluctuaciones resultantes en el virus de entrada se muestran en la curva inferior (negra), el rendimiento se muestra en la curva superior. Las unidades son loglO de pfu/mL. (fig. 9B) La división de rendimiento por virus de entrada describe la ampliación del virus para cada generación. MVA-X (curva superior interrumpida) es el linaje que se deriva de la cultivo en suspensión químicamente definido mostrado en las Figuras 1A-1D. Los números de generación mayores indican una mayor generación de ampliación con valor de pico de 10,000 virus de la progenie infecciosa por pfu de virus de entrada.

FIGURA 10: Especificidad excelente para el ambiente en suspensión definido químicamente. Secuencia de la región C1915T A3L, G256T A223G y A34R A9L en cepas de MVA-B y MVA-R. Los dos linajes que pasaron en cultivos adherentes de origen de pato o murciélago de la fruta mantienen secuencia de tipo natural sin ningún signo en absoluto de los cambios del genotipo en los marcos de lectura abierta descritos en la presente.

FIGURA 11: Apariencia de células Vero después de la tinción para la prueba de microfoco. Los focos son más prominentes en las titulaciones de MVA-R18 (cepa de virus o el linaje obtenido por pases en células de la Egyptian rousette) de MVA-B20 (obtenido de la línea celular adherente de pato de Moscovia) que se aisló en paralelo. Una nueva replicación limitada adquirida en células de origen primate indica el potencial para una mayor estimulación inmune como cepa de vacuna.

FIGURAS 12A-12C: Atenuación de aislados de MVA-CR, MVA-CR11 y MVA-CR19. Panel (fig.12A) muestra las propiedades de replicación del aislado de MVA-CR11, nuevamente en una posición intermedia para aislar MVA-CR19 mostrado en (fig. 12B). (fig. 12C) muestra ejemplos del efecto citopático (o ausencia de efecto citopático) en células no aviares infectadas causadas por MVA-CR19. Las imágenes a una ampliación de 200 veces inicial (con barra de escala de 20 mm) muestran las células en el día 9 de la tabla (fig.12B).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de que la presente invención se describa en detalle a continuación, se entenderá que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos en la presente, ya que éstos pueden variar. También se entenderá que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir las modalidades particulares solamente, y no se pretende limitar el alcance de la presente invención, que se limitará solamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos téenicos y científicos usados en la presente tienen los mismos significados que se entienden comúnmente por un experimentado en la técnica.

De preferencia, los términos usados en la presente se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations) ", Leuenberger, H.G., Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvética Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza) . Varios documentos se citan en el texto de esta descripción. Cada uno de los documentos citados en la presente (incluyendo todas las patentes, solicitudes de patentes, publicaciones científicas, descripciones del fabricante, instrucciones, presentaciones de secuencia de número de Acceso GenBank, etc.), ya sea supra o infra, se incorporan como referencia en su totalidad.

Nada en la presente debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a antedatar tal descripción en virtud de la invención anterior.

A continuación, se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se listan con modalidades específicas, sin embargo, se debe entender que se pueden combinar de cualquier manera y en cualquier número para crear modalidades adicionales. Los varios ejemplos descritos y las modalidades preferidas no deberían construirse para limitar la presente invención solamente a las modalidades descritas explícitamente. Esta descripción debe entenderse que soporta y abarcar las modalidades que combinan las modalidades descritas explícitamente con cualquier número de elementos descritos y/o preferidos. Además, cualquiera de las permutaciones y combinaciones de todos los elementos descritos en esta solicitud debería considerarse descrito por la descripción de la presente solicitud, a menos que el contexto indique lo contrario.

A lo largo de esta descripción y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende", y las variaciones, tales como "que comprende" y "comprendiendo", se entenderá que implican la inclusión de un número entero indicado o etapa o grupo de números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de número entero o etapa. Como se usa en esta descripción y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen las referentes en plural, a menos que el contenido indique claramente lo contrario.

El término "virus atenuado", como se usa en la presente, se refiere a un virus con virulencia comprometida en el destinatario pretendido, por ejemplo, humano o animal receptor. Tal propiedad se puede lograr mediante la adaptación de un virus a intervalos de temperatura estrechos o intervalos de hospedadores estrechos y a otros ambientes de replicación artificiales, incluyendo medios definidos químicamente. La replicación de tal virus se restringe en las células derivadas del destinatario, por ejemplo, receptor humano o animal, o en células extraídas del ambiente del tejido. Se puede replicar a altos títulos fuera del destinatario (por ejemplo, en un cultivo celular permisivo o de animales de laboratorio). Un ejemplo de una cepa de virus atenuado es la cepa de Edmonston de virus de sarampión atenuado de Ender, dada para proteger contra la enfermedad de sarampión grave o la cepa del virus de vacuna usada en la campaña de erradicación de la viruela de la Organización Mundial de la Salud (OMS) en la década de 1970.

El término "virus altamente atenuado", como se usa en la presente, se refiere a un virus con virulencia bloqueada en el destinatario, por ejemplo, humano o animal receptor. Tal propiedad se puede lograr mediante la adaptación de un virus a intervalos de temperatura estrechos o intervalos de hospedadores estrechos y a otros ambientes de replicación artificiales, incluyendo los medios definidos químicamente. La replicación de tal virus se bloquea en las células derivadas del destinatario, por ejemplo, receptor humano o animal, o en células removidas del ambiente del tejido. Se puede replicar a altos títulos fuera del destinatario (por ejemplo, en una célula permisiva/cultivo celular o de animales de laboratorio). El virus de MVA de la presente invención es un virus altamente atenuado. No se replica en células de primates humanos o no humanos.

El término "virus de hospedador restringido", como se usa en la presente, se refiere a un virus que (sólo o principalmente) se replica en un organismo hospedador específico, por ejemplo, en una célula, tal como una célula aviar o en un animal, tal como un animal de laboratorio. No se replica o se replica solamente en niveles muy bajos en otros organismos, por ejemplo, en otras células que las células aviares. Un virus de hospedador restringido puede lograrse por "pasaje de virus (en serie)" de un virus en un organismo hospedador, por ejemplo, en células aviares. El virus de MVA de la presente invención se restringe a células aviares. No se replica en células humanas.

El término "pasajes de virus", como se usa en la presente, se refiere a un proceso que involucra infectar una serie de organismos hospedador, por ejemplo, células o animales tales como animales de laboratorio, con un virus. Cada vez que el virus se da un tiempo para incubar, y luego el siguiente organismo hospedador está infectado con el virus incubado. Este proceso también se puede designar como "pasaje de virus en serie". Por ejemplo, el pasaje de virus en serie permite la generación de virus atenuados (altamente) y/o el hospedador restringido. El virus de MVA de la presente invención es un virus altamente atenuado. Se restringe a células aviares. Se no se replica en células de primates humanos o no humanos.

Cuando un organismo hospedador, por ejemplo, una célula tal como una célula aviar o de un animal, tal como un animal de laboratorio, se define por el término "permisivo", se refiere al hecho de que el virus es capaz de eludir las defensas de tal organismo y es capaz para invadir una célula, replicarse en tal célula, y escapar de la célula. Por lo general, esto ocurre cuando el virus se ha modulado una o varias de las defensas intrínsecas celulares del organismo y/o el sistema inmunitario de tal organismo.

El término "destinatario", como se usa en la presente, se refiere a un paciente que puede recibir un virus, por ejemplo, que puede ser vacunado con un virus. El paciente puede ser un ser humano o un animal. El animal puede ser un miembro de la especie de mamífero, tal como un canino, felino, altramuz, comadreja, roedores (por ejemplo, un ratón, rata o hámster), un equino, bovino, un ovino, un caprino, porcino, murciélago (por ejemplo, un murciélago grande o pequeño) o un primate no humano (por ejemplo, un mono, tal como un gran simio). Particularmente, el virus de MVA de la presente invención no se replica en los receptores de primates humanos o no humanos.

El término "organismo hospedador", como se usa en la presente, se refiere a un organismo que se puede usar para la producción y/o adaptación del virus. El organismo hospedador puede ser una célula o un animal, tal como un animal de laboratorio. La célula puede ser una célula aviar (por ejemplo, tal como una célula de pollo, codorniz, ganso o pato, tal como una célula de retina (CR) de pato). El animal, particularmente el animal de laboratorio, puede ser un ave (por ejemplo, un pollo, codorniz, ganso o pato), canino, comadreja, roedores (por ejemplo, un ratón, rata o hámster), un ovino, un caprino, porcino, murciélago (por ejemplo, un murciélago grande o pequeño) o un primate no humano (por ejemplo, un mono, tal como un gran simio). Particularmente, el virus de MVA de la presente invención se replica en una célula aviar (por ejemplo, en una célula de pollo, codorniz, ganso o pato) o en un ave (por ejemplo, en un pollo, codorniz, ganso o pato).

El término "infeccioso", como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de un virus para replicarse en una célula y para producir partículas virales. La infectividad puede ser evaluada ya sea mediante la detección de la carga de virus o mediante la observación de la progresión de la enfermedad en un humano o en un animal.

El término "vacuna", como se usa en la presente, se refiere a un agente que se puede usar para provocar una inmunidad protectora en un receptor, por ejemplo, receptor humano o animal. Para ser eficaz, una vacuna puede provocar inmunidad en una parte de la población inmunizada, ya que algunas personas pueden fallar para montar una respuesta inmune robusta o protectora, o, en algunos casos, cualquier respuesta inmune. Esta incapacidad puede provenir de los antecedentes genéticos del destinatario o debido a una afección de inmunodeficiencia (ya sea adquirida o congénita) o inmunosupresión (por ejemplo, debido al tratamiento con quimioterapia o el uso de fármacos inmunosupresores). La eficacia de la vacuna puede establecerse en modelos animales. La vacuna de la presente invención comprende el virus de MVA de acuerdo con el primer aspecto o el genoma de acuerdo con el segundo aspecto. A este respecto, cabe señalar que el propio virus de MVA puede ser la vacuna. Se confiere protección contra la viruela. Sin embargo, tal virus además puede comprender una secuencia de ácido nucleico heteróloga, por ejemplo, una secuencia que codifica un antígeno, en particular un epítopo de un antígeno, contra el que pueden obtenerse una inmunidad protectora adicional en el receptor. Un virus de MVA que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga también puede ser designado como virus de MVA recombinante.

El término "vacuna", como se usa en la presente, significa que un destinatario, por ejemplo, humano o animal receptor, se estimula con un virus infeccioso, por ejemplo, en una forma atenuada o inactivada de tal virus infeccioso, para inducir una inmunidad específica. En la presente invención, el destinatario se estimula con el virus de MVA de acuerdo con el primer aspecto o con el genoma de acuerdo con el segundo aspecto, para inducir inmunidad contra la viruela. Sin embargo, en el contexto de la presente invención, el término "vacunación" también cubre la estimulación de un destinatario con un virus de MVA, que además comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga. La secuencia heteróloga es una secuencia contra la que una inmunidad protectora adicional debe ser estimulada. Se puede codificar un antígeno, en particular un epítopo de un antígeno. Un virus de MVA que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga también puede ser designado como virus de MVA recombinante.

Ejemplos de tales epítopos que son heterólogos a tal cubierta de virus, por ejemplo, epítopos de proteínas de otros virus, tales como el virus de influenza, virus de hepatitis, por ejemplo, virus de la hepatitis C, virus de inmunodeficiencia humana (V1H), Flavivirus, Paramyxovirus, Hantavirus o Filovirus, o epítopos derivados de proteínas que se asocian con el desarrollo de tumores y cáncer. Después de la administración de la vacuna en el cuerpo del receptor, los epítopos se expresan y se presentan al sistema inmune y puede inducirse una respuesta inmune específica contra estos epítopos. El destinatario es, por lo tanto, inmunizado contra la proteína que contiene el epítopo.

El término "secuencia de ácido nucleico heteróloga", como se usa en la presente, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que no se encuentra normalmente íntimamente asociada con el virus, particularmente con el virus de MVA de acuerdo con la presente invención, en la naturaleza. Un virus que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga también puede ser designado como un virus recombinante.

El término "proteger", como se usa en la presente, significa prevenir o tratar, o ambos, conforme sea apropiado, el desarrollo o la continuación de una enfermedad (por ejemplo, viruela) en un destinatario, por ejemplo humano.

El término "inmunidad protectora", como se usa en la presente, comprende una inmunidad humoral (anticuerpo) o inmunidad celular, o ambas, efectiva para, por ejemplo, eliminar o reducir la carga de un patógeno (por ejemplo, virus, tales como virus de la viruela) o célula infectada o producir cualquier otro alivio mensurable de la infección en un paciente inmunizado (vacunado).

Como se mencionó anteriormente, los inventores de la presente invención caracterizan los aislados estables de las generaciones posteriores de un virus de MVA ya adaptado e hiperatenuado sobre un sustrato celular completamente permisivo para el mismo virus hiperatenuado bajo condiciones altamente artificiales impuestas por la producción de virus en un cultivo en suspensión químicamente definido. La caracterización anterior resultó en la identificación de nuevos virus de MVA con mutaciones puntuales en las proteínas estructurales. Los nuevos virus de MVA muestran propiedades benéficas en un cultivo en suspensión químicamente definido, en comparación con las cepas conocidas de virus de MVA, tales como un aumento de la actividad infecciosa y un mayor número de unidades infecciosas en el espacio extracelular. Estas propiedades benéficas mejoran la producción industrial de tal virus de MVA. En particular, permiten la producción de las nuevas cepas de virus de MVA en altos rendimientos. Además, las nuevas cepas del virus de MVA pueden aislarse directamente a partir del sobrenadante libre de células que facilita la purificación y, de esta manear, la logística y la operación de biorreactores que producen tales virus de MVA. Esto, a su vez, reduce los costos de producción del virus de MVA.

En consecuencia, el primer aspecto de la presente invención se relaciona con un virus de vacuna Ankara modificado (mutado) (MVA) que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto del gen A3L y/o un producto del gen A34R, en el que la secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 mutación(es)) que resulta en por lo menos una modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 modificaciones de la secuencia de aminoácido(s)) del producto(s) del gen (es decir, el producto del gen A3L y/o el producto del gen A34R).

Cabe señalar que la secuencia de ácido nucleico que codifica los productos génicos anteriores, comprende por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2 ó 3 mutaciones) que resulta en una/por lo menos una modificación de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificación de secuencia de aminoácido(s) de cada uno de tales productos génicos.

La modificación de la secuencia de aminoácido(s) (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 modificación de aminoácido(s) puede ser una eliminación de aminoácido (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 eliminación de aminoácido(s)), inserción de aminoácido(s) (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 inserción de aminoácido(s)), de adición de aminoácido(s) (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 adiciones de aminoácidos(s)) y/o el reemplazo de aminoácido (s) (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 aminoácidos de reemplazamiento). Una "sustitución de aminoácido" también puede ser designada en la presente como una "sustitución de aminoácidos". El término "inserción de aminoácido", como se usa en la presente, se refiere a una modificación de aminoácidos que tiene lugar dentro de la secuencia de aminoácidos de la A3L, A34R, y/o el producto(s) de gen A9L, mientras que el término "adición de aminoácido", como se usa en la presente, se refiere a una modificación de aminoácidos que tiene lugar en el extremo N- o C-terminal de la A3L, A34R, y/o el producto(s) del gen A9L.

En una modalidad, el virus de MVA comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto génico A3L, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2, o 3 mutación(es)), resultando en una/por lo menos una modificación de aminoácido de la secuencia (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido(s)) de tal producto génico A3L. En otra modalidad, el virus de MVA comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto del gen A34R, en el que la secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2 ó 3 mutación(es)), resultando en una/por lo menos una modificación de aminoácido de la secuencia (por ejemplo, 1, 2, 3 o modificación de aminoácido(s)) de tal producto del gen A34R.

De preferencia, la secuencia de ácido nucleico además codifica un producto del gen A9L, en el que la secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2 ó 3 mutación(es)) que resulta en una/por lo menos una modificación de la secuencia de ácido (por ejemplo 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido) del producto del gen.

Más preferentemente, (i) el virus comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto del gen A3L y un producto del gen A9L, en el que la secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 mutación(es)) que resulta en una/por lo menos una modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 modificaciones de aminoácido) de tales productos de genes (es decir, el producto del gen A3L y el producto del gen A9L), (ii) el virus comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto del gen A34R y un producto del gen A9L, en el que la secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 mutación(es)) que resulta en una/por lo menos una modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 modificaciones de aminoácido(s)) de tales productos de genes (es decir, el producto del gen A34R y el producto del gen A9L), o (iii) el virus comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto del gen A3L, un producto del gen A34R y un producto del gen A9L, en donde la secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 mutación(es)) que resulta en una/por lo menos una modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 modificaciones de aminoácido) de tales productos de genes (es decir, el producto del gen A3L, el producto del gen A34R y el producto del gen A9L).

Cabe señalar que la secuencia de ácido nucleico que codifica los productos génicos anteriores comprende por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2 ó 3 mutaciones) que resulta en una/por lo menos una modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido) de cada uno de los productos del gen.

Tales modificaciones de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 modificaciones de aminoácidos) puede ser una eliminación de aminoácido (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 eliminaciones de aminoácido), inserciones de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 inserciones de aminoácidos), de adición de aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 adiciones de aminoácidos) y/o reemplazamiento de aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 Ó 9 sustituciones de aminoácidos).

Los inventores de la presente invención descubrieron sorprendentemente que un virus de MVA mutado puede producirse en mayores rendimientos que un virus de MVA no mutado.

Se prefiere que: (i) la modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, eliminación o sustitución de aminoácidos) esté en una región de aminoácidos que abarque las posiciones 634 a 644, de preferencia de las posiciones de aminoácidos 636 a 642, del producto del gen A3L, de acuerdo con la SEC ID NO: 1 o las posiciones de aminoácidos correspondientes a la misma, (ii) la modificación de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, eliminación o sustitución de aminoácidos) esté en una región de aminoácidos que abarque las posiciones 81 a 91, de preferencia de las posiciones de aminoácidos 83 a 89, del producto del gen A34R, de acuerdo con la SEC ID NO: 2 o las posiciones de aminoácido correspondientes a la misma, y/o (iii) la modificación de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, eliminación o sustitución de aminoácidos amino ácido) esté en una región de aminoácidos que abarque las posiciones 70 a 80, de preferencia de las posiciones de aminoácidos 72 a 78, del producto del gen A9L de acuerdo con la SEC ID NO: 3, o las posiciones de aminoácidos correspondientes a los mismos.

De esta manera, la modificación de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, eliminación de aminoácidos o sustitución de aminoácidos) puede ser: (i) en la posición de aminoácido 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643 ó 644 del producto del gen A3L de acuerdo con la SEC ID NO: 1, o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma, (ii) en la posición de aminoácido 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ó 91 del producto del gen A34R de acuerdo con la SEC ID NO: 2, o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma, y/o (iii) en la posición de aminoácido 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 del producto del gen A9L de acuerdo con la SEC ID NO: 3, o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma.

En el contexto de la presente invención, se dice que los residuos de aminoácidos en dos o más productos génicos "corresponden" entre sí, si los residuos ocupan una posición análoga en las estructuras de productos de genes. Como es bien conocido en la téenica, las posiciones análogas en dos o más productos de genes pueden determinarse alineando las secuencias del producto del gen con base en la secuencia de aminoácidos o similitudes estructurales. Tales herramientas de alineación son bien conocidas por la persona experimentada en la técnica y pueden ser, por ejemplo, obtenidas en la World Wide Web, por ejemplo, ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw) o Align (http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html) usando los parámetros estándares, de preferencia por Align EMBOSS:: needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5. Los experimentados en la técnica entienden que puede ser necesario introducir espacios en cualquier secuencia para producir un alineamiento satisfactorio. Los residuos de aminoácidos en dos o más productos génicos se dice que "corresponden" si los residuos se alinean en el mejor alineamiento de secuencia. El "mejor alineamiento de secuencia" entre dos productos de genes se define como el alineamiento que produce el mayor número de residuos idénticos alineados. La "región de mejor alineamiento de secuencia" termina y, de esta manera, determina las medidas y límites de la longitud de la secuencia de comparación para el propósito de la determinación del registro de similitud, si la similitud de secuencia, de preferencia de identidad, entre dos secuencias alineadas cae a menos de 30%, de preferencia a menos de 20%, más preferentemente a menos de 10% en una longitud de 10, 20 ó 30 aminoácidos.

Se prefiere además que: (i) la modificación de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, eliminación de aminoácidos o sustitución de aminoácidos) esté en la posición del aminoácido 639 del producto del gen A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma, (ii) la secuencia de modificación de aminoácidos (por ejemplo, eliminación de aminoácido o sustitución de aminoácidos) esté en la posición del aminoácido 638 del producto del gen A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma, (iii) la modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, eliminación de aminoácido o sustitución de aminoácido) esté en la posición de aminoácido 86 del producto del gen A34R o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma, (iv) la modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, eliminación o sustitución de aminoácido) esté en la posición del aminoácido 75 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma, y/o (v) la modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, eliminación o sustitución de aminoácido) esté en la posición de aminoácido 74 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma.

Es más preferido que la modificación de la secuencia de aminoácido sea una eliminación de aminoácidos o sustitución de aminoácidos, en donde: (i) H en la posición de aminoácido 639 del producto del gen A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma se elimina o se reemplaza por un aminoácido hidrófobo, de preferencia A, V, I, L, M, M, Y o W, un aminoácido negativo, de preferencia D o E, o un aminoácido polar no cargado, preferentemente S, T, N o Q, (ii) R en la posición del aminoácido 638 del producto génico A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma se elimina o se sustituye por un aminoácido hidrófobo, preferentemente A, V, I, L, M, F, Y o W, un aminoácido negativo, de preferencia D o E, o un aminoácido polar no cargado, preferentemente S, T, N o Q, (iii) D en la posición de aminoácido 86 del producto del gen A34R o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma se elimina o se sustituye por un aminoácido hidrófobo, de preferencia A, V, I, L, M, F, Y o W, un aminoácido positivo, de preferencia R, H o K, o un aminoácido polar no cargado, de preferencia S, T, N o Q, (iv) K en la posición del aminoácido 75 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma que se elimina o se sustituye por un aminoácido hidrófobo, de preferencia A, V, I, L, M, F, Y o W, un aminoácido negativo, de preferencia D o E, o un aminoácido polar no cargado, de preferencia S, T, N o Q, y/o (v) K en la posición de aminoácido 74 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma que se elimina o se sustituye por un aminoácido hidrófobo, de preferencia A, V, I, L, M, F, Y o W, un aminoácido negativo, de preferencia D o E, o un aminoácido polar no cargado, de preferencia S, T, N o Q.

Se prefiere incluso más que la sustitución de aminoácido sea una sustitución de aminoácidos de: (i) H en la posición amino ácido 639 del producto del gen A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y (mutante del producto del gen H639Y A3L), (ii) R en la posición del aminoácido 638 del producto de gen A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y (mutante del producto del gen R638Y A3L), (iii) D en la posición amino ácido 86 del producto del gen A34R o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y (mutante del producto del gen D86Y A34R), (iv) K en la posición del aminoácido 75 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por E (mutante del producto del gen K75E A9L), y/o (v) K en la posición de aminoácido 74 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por E (mutante del producto del gen K74E A9L).

Además, se prefiere aún más que la sustitución de aminoácido sea una sustitución de aminoácidos de: (i) H en la posición del aminoácido 639 del producto de gen A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y y D en la posición de aminoácido 86 del producto del gen A34R o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y (mutante del producto del gen H639Y A3L/D86Y A34R), (ii) H en la posición del aminoácido 639 del producto del gen A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y y K en la posición del aminoácido 75 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por E (mutante del producto del gen H639Y A3L/K75E A9L), (iii) D en la posición de aminoácido 86 del producto del gen A34R o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y y K en la posición del aminoácido 75 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por E (mutante del producto del gen A34R D86Y/K75E A9L), o (iv) H en la posición del aminoácido 639 del producto del gen A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y, D en la posición de aminoácido 86 del producto del gen A34R o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y, y K en la posición del aminoácido 75 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por E (mutante del producto del gen H639Y A3L/D86Y A34R/K75E A9L).

Se prefiere más que: (i) el producto del gen A3L con la mutación H639Y tenga una secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEC ID NO: 4 o sea una variante del mismo que es por lo menos 85%, de preferencia 90%, más preferentemente 95%, y más preferentemente 99%, por ejemplo por lo menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99%, idéntica a la secuencia de aminoácidos, en la que la variante (todavía) comprende el aminoácido Y en la posición de aminoácido 639 o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma, (ii) el producto del gen A34R con la mutación D86Y tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 5 o es una variante del mismo que es por lo menos 85%, de preferencia 90%, más preferentemente 95%, y más preferentemente 99%, por ejemplo por lo menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99%, idéntica a la secuencia de aminoácidos, en el que la variante (todavía) comprende el aminoácido Y en la posición de aminoácido 86 o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma, y/o (iii) el producto del gen A9L con la mutación K75E tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 6 o es una variante del mismo que es por lo menos 85%, de preferencia 90%, más preferentemente 95%, y más preferentemente 99%, por ejemplo por lo menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99%, idéntica a la secuencia de aminoácidos, en el que la variante (todavía) comprende el aminoácido E en la posición del aminoácido 75 o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma.

Se prefiere particularmente que la identidad de secuencia sea (i) por lo menos 85%, 90%, 95% ó 99% en un tramo continuo de por lo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 180, 200, 300, 400, 500, 600, o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia respectiva, de acuerdo con la SEC ID NO: 4, (ii) por lo menos 85%, 90%, 95% ó 99% sobre un tramo continuo de por lo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia respectiva de acuerdo con la SEC ID NO: 5, o (iii) por lo menos 85%, 90%, 95% ó 99% en un tramo continuo de por lo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia respectiva de acuerdo con la SEC ID NO: 6. Además, se prefiere particularmente que la identidad de secuencia sea por lo menos 85% en toda la longitud, sea por lo menos 90% en toda la longitud, sea por lo menos 95% sobre la longitud total, o sea por lo menos 99% en toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de referencia respectiva, de acuerdo con la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, o la SEC ID NO: 6.

De preferencia, las variantes anteriores son variantes funcionalmente activas. Esto significa que la variación(es) (adicional) en la secuencia de aminoácidos afecta negativamente a las propiedades benéficas del virus de MVA, de acuerdo con la presente invención, en comparación con los virus de MVA conocidos, tales como un aumento de la actividad infecciosa y/o un mayor número de unidades infecciosas en el espacio extracelular durante el cultivo. Tales propiedades benéficas permiten, por ejemplo, la producción del virus de MVA, de acuerdo con la presente invención, en altos rendimientos. Los experimentos para probar que dicen que las propiedades benéficas están todavía presentes en las variantes anteriores, se describen en la sección experimental.

El producto del gen A3L mencionado anteriormente (también designado como proteína P4b) de MVA es una de las tres principales proteínas del núcleo y se procesa por la proteasa viral codificada 17L durante la maduración del virión inmaduro (IV, por sus siglas en inglés) esférico y no infeccioso al virión intracelular maduro (IMV, por sus siglas en inglés). El producto del gen A3L de MVA contribuye a la morfogénesis del virión en una etapa muy temprana para permitir reordenamientos de condensación y de membrana correctos en la transición hacia el IMV infeccioso. Además, el producto del gen A34R antes mencionado de MVA desestabiliza la membrana del virus de cubierta extracelular (EEV) y es, de esta manera, extremadamente importante para la actividad infecciosa en el espacio extracelular y para la propagación de virus. El EEV se ha desarrollado como un vehículo para permitir que el virus se propague a sitios distantes. La membrana adicional del EEV no está equipada para mediar la fusión con la célula blanco y debe interrumpirse para liberar el IMV, la unidad infecciosa de virus real. Además, el producto del gen A34R de MVA modula la velocidad a la que el virus de cubierta asociado a la célula (CEV) se separa de la célula productora. Además, el producto del gen A9L de MVA está, como el producto del gen A3L, involucrado en las primeras etapas de la maduración de MVA. Es un factor importante para corregir la condensación del núcleo del IMV.

De preferencia, el virus de MVA es un virus de MVA aislado. El término "virus MVA aislado", como se usa en la presente, se refiere a un virus que se retira de su entorno nativo o de cultivo. De esta manera, un virus de MVA aislado puede estar libre de algunos o de todos los componentes celulares, es decir, componentes de las células en las que el virus se produce de forma natural o en el que se cultiva (por ejemplo, componentes citoplasmáticos o membrana). También puede ser libre de algunos o todos los componentes (por ejemplo, el medio de cultivo o impurezas relacionadas con el cultivo como los restos del cultivo).

El virus de MVA aislado puede purificarse adicionalmente. Por lo tanto, más preferentemente, el virus de MVA es un virus de MVA purificado. El término "virus de MVA purificado", como se usa en la presente, se refiere a un virus que ha sido aislado bajo condiciones que reducen o eliminan la presencia de materiales no relacionados, es decir contaminantes, incluyendo materiales nativos, por ejemplo, residuos celulares, restos celulares, proteínas celulares, moléculas de ADN celulares y/o moléculas de ARN celulares, a partir del cual se obtuvo el virus. De preferencia, el virus de MVA purificado está sustancialmente libre de componentes de células y/o de cultivo. Como se usa en la presente, el término "sustancialmente libre" se usa operacionalmente, en el contexto de las pruebas analíticas del material. Un virus de MVA purificado que está sustancialmente libre de contaminantes es preferentemente por lo menos 50% puro, más preferentemente por lo menos 90% puro, e incluso más preferentemente por lo menos 99% ó 100% puro. La pureza puede evaluarse por cromatografía, electroforesis en gel, inmunoensayo, análisis de composición, prueba biológica, y otros métodos conocidos en la téenica.

Se prefiere que el virus de MVA además comprenda una secuencia de ácido nucleico heteróloga. El término "secuencia de ácido nucleico heteróloga" se definió anteriormente. La expresión de la secuencia de ácido nucleico heteróloga puede estar bajo el control transcripcional de un promotor del virus de MVA. La secuencia de ácido nucleico heteróloga se inserta en la secuencia de ácido nucleico del virus de MVA. En una modalidad preferida de la presente invención, la inserción de la secuencia de ácido nucleico heteróloga está en una región no esencial de la secuencia/genoma de ácido nucleico del virus de MVA. En una modalidad más preferida de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico heteróloga se inserta en un sitio de supresión que se presenta naturalmente (por ejemplo, eliminación del sitio I, II, III, IV, V o VI) de la secuencia/genoma de ácido nucleico de MVA. Métodos de cómo insertar las secuencias de ácido nucleico heterólogo en el genoma del virus de MVA son conocidos para experimentado en la téenica.

Es más preferido que la secuencia de ácido nucleico heteróloga se seleccione entre una secuencia que codifica un antígeno, en particular un epítopo de un antígeno, un compuesto de diagnóstico, o un compuesto terapéutico. El término "epítopo (también conocido como determinante antigénico) " se refiere a la parte de un antígeno que es reconocido por el sistema inmune, específicamente por anticuerpos, células B o células T.

El antígeno o epítopo pueden ser útiles como una vacuna para inducir una respuesta inmune contra tal antígeno o epítopo. Ejemplos de tales antígenos que son heterólogos a la cubierta del virus, por ejemplo, proteínas de otros virus, tales como el virus de influenza, virus de hepatitis, por ejemplo, virus de hepatitis C, virus de inmunodeficiencia humana (V1H), Flavivirus, Paramyxovirus, Hantavirus o Filovirus, o proteínas que se asocian con el desarrollo de tumores y el cáncer, tales como Her2/neu o MUC-1. Ejemplos de tales epítopos que son heterólogos a la cubierta del virus, por ejemplo, epítopos de proteínas derivadas de otros virus, tales como el virus de influenza, virus de hepatitis, por ejemplo, virus de hepatitis C, virus de inmunodeficiencia humana (V1H), Flavivirus, Paramyxovirus, Hantavirus o Filovirus, o epítopos derivados de proteínas que se asocian con el desarrollo de tumores y el cáncer, tales como péptidos extracelulares de Her2/neu o MUC-1.

El compuesto terapéutico puede ser cualquier compuesto con un efecto terapéutico. Por ejemplo, el compuesto terapéutico puede ser un compuesto que afecta o participa en el crecimiento de tejido, el crecimiento celular, la diferenciación celular, un compuesto que es capaz de invocar una acción biológica, tal como una respuesta inmune, o un compuesto que puede desempeñar cualquier otra función en uno o más procesos biológicos. En particular, este compuesto puede ser un compuesto antimicrobiano, un compuesto antiviral, un compuesto anti-fúngico, un compuesto inmunosupresor, un factor de crecimiento, una enzima, un compuesto antiinflamatorio, o un compuesto anti-alérgico. El compuesto terapéutico también puede ser un ácido nucleico antisentido.

El compuesto de diagnóstico puede ser cualquier compuesto con un efecto de diagnóstico. Por ejemplo, el compuesto de diagnóstico puede ser una proteína de marcador/reportero, tal como un anticuerpo, GFP, EGFP, b-galactosidasa, o una proteína que confiere resistencia a antibióticos, tal como bla (beta-lactamasa) contra la ampicilina o npt (neomicina fosfotransferasa) contra la neomicina o G418. Tal proteína de marcador/reportero puede usarse para identificar o aislar el virus, por ejemplo, usando la teenología de hibridación, microscopía de fluorescencia, o pruebas de ELISA. Además, la proteína que confiere resistencia a los antibióticos comprendida en el virus confiere resistencia contra la selección de antibióticos a la célula infectada.

Como ya se mencionó anteriormente, el virus de MVA es un virus altamente atenuado. En una modalidad de la presente invención, el virus de MVA es capaz de la replicación productiva en las células aviares. El término "replicación productiva", como se usa en la presente, puede significar que un virus causa un efecto citopático y se replica a niveles que eventualmente causan la muerte celular masiva en el cultivo infectado. Para la replicación reproductiva, más virus se pueden recuperar por lo menos una vez a partir de un cultivo infectado de virus que se ha agregado para infectar el cultivo. A diferencia de la replicación productiva, la replicación reproductiva se puede presentar a niveles muy bajos sin el acompañamiento del efecto citopático y ocasionalmente puede conducir a la pérdida de virus en un cultivo de supervivencia.

De preferencia, las células aviares son células de pollo, codorniz, ganso o pato (por ejemplo, células de somita de pato o retina de pato). Estas células aviares (por ejemplo, células de pollo, codorniz, ganso, pato, tales como las células de somita de pato o de la retina de pato) pueden ser células primarias (o células de un cultivo de células primarias), células secundarias (o células de un cultivo celular secundario), o células inmortalizadas (o células de una línea celular). Los términos "célula primaria" o "cultivo celular primario", como se usa en la presente, se refieren a una célula o cultivo o que, por lo general, no puede ser pasado más allá de 50 duplicaciones de la población antes de sufrir senescencia, interrupción del cultivo o muerte celular. Los términos "célula secundaria" o "cultivo celular secundario", como se usa en la presente, se refieren a una célula o cultivo que se deriva directamente de una célula primaria o cultivo celular primario. El límite de duplicación de la población sigue siendo válido. Los términos de una "célula inmortalizada" o "cultivo celular inmortalizado", como se usa en la presente, se refieren a una célula o cultivo y su progenie que no se limita por el número de duplicaciones celulares potenciales. Un cultivo celular puede consistir en células primarias, células secundarias o células inmortalizadas (es decir, células de una línea celular). En las modalidades preferidas de la presente invención, las células son de una línea celular CR o CR.pIX. Las líneas celulares CR y CR.pIX se derivan de células inmortalizadas de retina pato de Moscovia (Jordán, et al.2009 en Vaccine 27, 748-756), diseñados para la producción de vacunas. La línea celular CR.pIX ha integrado de manera más estable en su genoma un gen que codifica la proteína pIX de adenovirus y expresa tal gen. En otras modalidades preferidas de la presente invención, las células son células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF). Estas células son células primarias.

En otra modalidad de la presente invención, el virus de MVA no es capaz de replicación productiva en células de mamífero, en donde las células de mamífero no son células de riñón de hámster bebé (BHK, por sus siglas en inglés), células de R05T de murciélago de fruta, células R05R de murciélago de fruta o células R06E murciélago de fruta. Las células R05T, R05R y R06E son células obtenidas por inmortalización de células primarias de Egyptian rousette. Estas son una de las pocas líneas de células de mamíferos permisivas para MVA (Jordán et al.2009 en Virus Res 145, 54-62). En una modalidad preferida de la presente invención, el virus de MVA no es capaz de replicación productiva en células de primates, más preferentemente células humanas.

El virus de MVA, de acuerdo con la presente invención, puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto del gen A3L que tiene una secuencia de aminoácido antes de la modificación del amino ácido de acuerdo con la SEC ID NO: 1 y/o un producto del gen A34R que tiene una secuencia de aminoácido antes de la modificación del aminoácido de acuerdo con la SEC ID NO: 2. Esta secuencia de ácido nucleico puede codificar además un producto del gen A9L que tiene una secuencia de aminoácido antes de la modificación del aminoácido de acuerdo con la SEC ID NO: 3.

Además, el gen de A3L respectivo puede tener una secuencia de ácido nucleico antes de la mutación, de acuerdo con la SEC ID NO: 7, el gen de A34R respectivo puede tener una secuencia de ácido nucleico antes de la mutación de acuerdo con la SEC ID NO: 8, y/o el gen de A9L respectivo puede tener una secuencia de ácido nucleico antes de la mutación de acuerdo con la SEC ID NO: 9.

Además, el gen de A3L mutado puede tener una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID NO: 10, el gen A34R mutado puede tener una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID NO: 11, y/o el gen mutado de A9L puede tener un secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID NO: 12.

Además, el virus de MVA de acuerdo con la presente invención, puede comprender una secuencia de ácido nucleico antes de la mutación de acuerdo con el número de acceso AY603355 (versión AY603355.1 y GL47088326).

En un segundo aspecto, la presente invención se relaciona con un genoma del virus de MVA (mutado), de acuerdo con el primer aspecto.

En un tercer aspecto, la presente invención se relaciona con una célula que comprende un virus de MVA (mutado) de acuerdo con el primer aspecto o un genoma de acuerdo con segundo aspecto. La célula que comprende un virus de MVA, de acuerdo con el primer aspecto, o un genoma de acuerdo con el segundo aspecto, también puede ser designada como una célula hospedera. Esta célula puede ser para el cultivo del virus de MVA de acuerdo con el primer aspecto. La célula puede ser cualquier célula en la que el virus de MVA, de acuerdo con el primer aspecto, es capaz de replicarse. Se prefiere que la célula no sea una célula de primate, en particular una célula humana. Además, se prefiere que la célula sea una célula aviar. Tal célula aviar es preferentemente una célula de pollo, codorniz, ganso o pato (por ejemplo, una célula de somita de pato o retina de pato). La célula aviar (por ejemplo, célula de pollo, codorniz, ganso o pato, tal como célula de somita de pato o retina de pato) puede ser una célula primaria (o una célula de un cultivo celular primario), una célula secundaria (o una célula de un cultivo celular secundario), o una célula inmortalizada (o una célula de una línea celular). En cuanto a la definición de los términos "célula primaria", "cultivo de células primarias", "célula secundaria", "cultivo de células secundarias", "célula inmortalizada" o "cultivo celular inmortalizado", se refiere al primer aspecto de la presente invención. En las modalidades preferidas de la presente invención, la célula es de una línea celular CR o CR.pIX. Las líneas celulares RC y CR.pIX se derivan de células inmortalizadas de retina de pato de Moscovia (Jordán, et al. 2009 en Vaccine 27, 748-756), diseñados para la producción de vacunas. La línea celular CR.pIX ha integrado más establemente en su genoma un gen que codifica la proteína pIX de adenovirus y expresa tal gen. En otras modalidades preferidas de la invención, las células son células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF). Estas células son células primarias.

De preferencia, la célula es una célula aislada. El término "célula aislada", como se usa en la presente, se refiere a una célula que se retira de su ambiente nativo o de cultivo. De esta manera, una célula aislada puede estar libre de algunos o de todos los componentes nativos o de cultivo, es decir, componentes del organismo en el que se produce naturalmente la célula (por ejemplo, órgano, particularmente tejido) o en el que se cultiva (por ejemplo, medio de cultivo o impurezas relacionadas con el cultivo, tales como restos de cultivo).

La célula puede estar infectada con un virus de MVA de acuerdo con el primer aspecto, o transíectarse con un genoma de acuerdo con el segundo aspecto. Las téenicas de cómo se infecta o transfecta una célula son conocidos por la persona experimentada.

Se prefiere además que la célula sea una célula no adherente/suspensión. En general, las células se pueden cultivar en suspensión o cultivos adherentes. Algunas células viven naturalmente en suspensión, sin ser unidas a una superficie, tales como las células que existen en la corriente sanguínea (por ejemplo, células hematopoyéticas). Las células adherentes (por ejemplo, células primarias) requieren una superficie, tal como el cultivo de tejidos de soporte de plástico o de micro-soporte, que puede estar recubierto con componentes de la matriz extracelular para aumentar las propiedades de adhesión y proporcionar otras señales necesarias para el crecimiento y la diferenciación. La mayoría de las células derivadas de tejidos sólidos son adherentes. Las células adherentes se usan a menudo en su forma original para la investigación en biología celular. También hay células que han sido modificadas para ser capaces de sobrevivir en cultivos en suspensión, de modo que puedan ser cultivadas a una densidad más alta que las condiciones adherentes permitirían. Bajo condiciones adherentes, el crecimiento se limita a saber, por la superficie, lo que puede limitar los rendimientos del producto. Tales células adaptadas en suspensión o células adaptadas para el crecimiento no adherente se usan, generalmente, para la producción de proteína a granel o cosecha de lotes. Bajo condiciones no adherentes, el crecimiento se limita por la concentración de células en el medio de cultivo, lo que permite un aumento de escala más fácil.

Los términos "no adherentes" y "suspensión" se usan en la presente de manera intercambiable. En el contexto de la presente invención, los términos "célula no adherente" y "células en suspensión" se refieren a una célula que es capaz de sobrevivir en un cultivo en suspensión sin estar unida a una superficie (por ejemplo, soporte o micro-soporte de plástico de cultivo de tejido). Tal célula puede ser una célula que puede vivir de forma natural en suspensión sin estar unida a una superficie. La célula también puede ser una célula que ha sido modificada o adaptada para ser capaz de sobrevivir en un cultivo en suspensión sin estar unida a una superficie (por ejemplo, soporte o micro-soporte de plástico de cultivo de tejido). Como se mencionó anteriormente, la mayoría de las células están en su forma original, no modificada o no adaptada, las células adherentes. Una célula no adherente se puede cultivar usualmente a una densidad más alta que las condiciones adherentes permitirían. Es, de esta manera, más adecuado para el cultivo a escala industrial, por ejemplo, en una instalación de un biorreactor o en un cultivo agitado. A menudo, las células tienen que adaptarse a un cultivo de células no adherentes. Debido a que las células originales experimentarían apoptosis bajo condiciones libres de suero y/o en ausencia de una superficie adecuada, esta adaptación es un proceso prolongado que requiere el paso con cantidades decrecientes de suero (por ejemplo, filas de dilución de 10% a 0% de suero fetal de carnero (FCS)), por lo que se selecciona una población celular irreversiblemente modificada. Las células no adherentes adaptadas se conocen en la téenica. La persona experimentada está consciente de los protocolos para la transferencia de una célula desde un estado adherente en un estado no adherente (ver, por ejemplo, Appl Microbiol Biotechnol.2008 Mar; 78 (3): 391-9 Epub 09 de enero de 2008).

En contraste con esto, el término "células adherentes", como se usa en la presente, se refiere a una célula que requiere una superficie, tal como el soporte o micro-soporte de plástico de cultivo de tejidos. Tal superficie se puede recubrir con componentes de matriz extracelular para aumentar las propiedades de adhesión y proporcionar otras señales necesarias para el crecimiento y la diferenciación. Estas células requieren pases periódicos, pero permiten una fácil inspección visual bajo el microscopio invertido. Estas células tienen que ser disociadas enzimáticamente (por ejemplo, con tripsina). Además, el crecimiento de células adherentes se limita por área superficial, lo que puede limitar los rendimientos del producto.

En las modalidades preferidas de la presente invención, la célula no adherente/suspensión crece bajo condiciones libres de suero. El término "condiciones libres de suero", como se usa en la presente, se refiere a las condiciones, en donde las células crecen en un medio que carece de suero animal. En lugar de ello, las células crecen en un medio desprovisto de cualquier componente de origen animal y, de preferencia, en un medio sin ningunas mezclas complejas de componentes biológicos, un llamado "medio químicamente definido".

En un cuarto aspecto, la presente invención se relaciona con un método para cultivar un virus de MVA (mutado) de acuerdo con el primer aspecto, que comprende las etapas de: (i) proporcionar una célula de acuerdo con el tercer aspecto, (ii) cultivar la célula, y (iii) aislar el virus de MVA (mutado).

La célula de acuerdo con el tercer aspecto comprende un virus de MVA (mutado) de acuerdo con el primer aspecto o un genoma de acuerdo con el segundo aspecto. La célula puede cultivarse en la etapa (ii) en un medio de proliferación celular y posteriormente en un medio de producción de virus, o la célula puede cultivarse (únicamente) en la etapa (ii) en un medio de proliferación celular. De preferencia, la célula (únicamente) se cultiva en la etapa (ii) en un medio de proliferación celular. El uso de un solo medio tiene la ventaja de que facilita el proceso de cultivo del virus de MVA, en particular el proceso de cultivo de virus de MVA industrial. Por ejemplo, facilita la logística y la operación de biorreactores que producen tal virus de MVA.

Se prefiere que la célula se cultive en un medio de proliferación celular entre 1 día y 3 días, por ejemplo 1, 2, ó 3 días, y que la célula se cultiva posteriormente en un medio de la producción del virus entre 1 a 10 días, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 días. También se prefiere que la célula se cultive únicamente en un medio de proliferación entre 1 a 10 días, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 días.

El término "medio de proliferación celular", como se usa en la presente, se refiere a un medio que soporta la división celular durante por lo menos 10 duplicaciones celulares de modo que, por ejemplo, una semilla de 8xl05 células por el paso en tal medio puede ser llevada a aproximadamente 4xl08 células, por ejemplo, suficientes para un biorreactor de 200 litros. El término "células proliferantes", como se usa en la presente, se refiere a las células de división, es decir, células que pueden dividir por otros por lo menos 10 duplicaciones celulares con una velocidad de duplicación de por lo menos una vez en 48 horas o menos.

Se prefiere que el medio de proliferación celular esté libre de suero. Un medio libre de suero está particularmente desprovisto de suero animal. En vez de esto, las células crecen en un medio desprovisto de cualquier componente animal y, de preferencia en un medio sin ningunas mezclas complejas de componentes biológicos, llamado "medio químicamente definido". Se prefiere además que el medio de proliferación celular tenga un bajo contenido de proteína y/o un bajo contenido de sal. De preferencia, el (bajo) contenido de proteína está en un intervalo de entre 10 y 250 ng/ml, más preferentemente entre 50 y 200 ng/ml, incluso más preferentemente entre 50 y 150 ng/ml, y más preferentemente entre 50 y 100 ng/ml, por ejemplo 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 ó 250 ng/ml. De preferencia, el (bajo) contenido en sal está en un intervalo de entre 150 y 350 mOsm/kg, más preferentemente entre 180 y 350 mOsm/kg, incluso más preferentemente entre 200 y 320 mOsm/kg, y más preferentemente entre 250 y 300 mOsm/kg, por ejemplo, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340 ó 350 mOsm/kg. Se prefiere que el medio de proliferación celular anterior además incluya glucosa. De preferencia, el contenido de glucosa está en un intervalo de entre 1 y 6 g/1, más preferentemente entre 2.5 y 5.5 g/1, incluso más preferentemente entre 3.5 y 5 g/1, y más preferentemente entre 4 y 4.5 g/1, por ejemplo, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5 ó 6 g/1. Por lo tanto, en una modalidad de la presente invención, el medio de proliferación celular está libre de suero, tiene un bajo contenido de proteínas, y tiene un bajo contenido de sal. En otra modalidad preferida de la invención, el medio de proliferación celular está libre de suero, tiene un bajo contenido de proteínas, tiene un bajo contenido de sal y además comprende glucosa. Las cantidades preferidas se describieron anteriormente.

El término "medio de producción de virus", como se usa en la presente, se refiere a un medio que mejora la producción de un virus en un cultivo de células en proliferación. Con la adición de un medio de producción de virus, los agregados de células se inducen y la proliferación celular en el cultivo disminuye por un factor de por lo menos 2 o se detiene completamente. Se prefiere que el medio de producción virus comprenda CaCl2, MgSC>4 y/o NaCl. De preferencia, el contenido de CaCl2 se encuentra en un intervalo de entre 150 y 250 mg/1, más preferentemente entre 180 y 250 mg/1, y más preferentemente entre 200 y 220 mg/1, por ejemplo, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245 Ó 250 mg/1, el contenido de MgSC se encuentra en un intervalo de entre 50 y 150 mg/1, más preferentemente entre 70 y 150 mg/1, y más preferentemente entre 90 y 120 mg/1, por ejemplo 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 ó 150 mg/1, y/o el contenido de NaCl está en un intervalo de entre 5,000 y 7,500 mg/1, más preferentemente entre 6,000 y 7,000 mg/1, y más preferentemente entre 6,500 y 6,800 mg/1, por ejemplo, 5,000, 5,500, 6,000, 6,500, 7,000 ó 7,500 mg/1. Por ejemplo, el medio de producción de virus puede incluir un contenido de sal de 205 mg/1 de CaCl2, 100 mg/1 de MgSC>4 y/o 6,500 mg/1 de NaCl.

De preferencia, la célula se cultiva en la etapa (ii) en un cultivo agitado o en un biorreactor. Los biorreactores en general se clasifican de forma similar a los reactores químicos de acuerdo a sus características de mezclado. El biorreactor puede ser un reactor de tanque agitado (bien mezclado) o un rector de flujo de tapón (tubular). En un biorreactor bien mezclado ideal, la mezcla se asume que es lo suficientemente intensa que el fluido (células y medio de cultivo) es homogénea a través del reactor. En las modalidades preferidas, el biorreactor es un lote biorreactor de alimentación por lotes, por lotes o continuo o el cultivo es un proceso de cultivo por lotes, alimentado por lotes o continuo. En general, un biorreactor se denomina usualmente continuo, cuando las corrientes de alimentación y de productos se alimentan y retiran continuamente del sistema. En principio, un reactor puede tener un flujo de recirculación continuo, pero no la alimentación continua de la cosecha de nutrientes o productos; todavía es un biorreactor por lotes. Un biorreactor de alimentación por lotes tiene, generalmente, alimentación intermitente. Puede o no puede tener el retiro del medio durante la corrida. El término "cultivo de alimentación por lotes", como se usa en la presente, puede referirse a un proceso de cultivo de células, en las que se proporciona una cantidad definida de células en un medio de cultivo adecuado y cultivadas en suspensión durante un tiempo prolongado (normalmente 4-10 días) tiempo durante el cual no se elimina ningún medio. Sin embargo, los componentes adicionales se proporcionan al cultivo en algún momento subsiguiente al comienzo del proceso de cultivo. Los componentes proporcionados comprenden típicamente suplementos nutricionales para las células que se han agotado durante el proceso de cultivo. Un cultivo de alimentación por lotes se detiene típicamente en un punto donde la relación de células vivas a muertas cae por debajo de un valor crítico.

El virus de MVA, de acuerdo con el primer aspecto, se puede aislar a partir del sobrenadante libre de células y/o U sado celular. El aislamiento del virus de MVA, de acuerdo con el primer aspecto del sobrenadante libre de células y/o U sado celular, se puede realizar de acuerdo con procedimientos estándares fácilmente disponibles para la persona experimentada. De preferencia, el virus de MVA de acuerdo con el primer aspecto, se aísla a partir del sobrenadante libre de células. Los inventores de la presente invención a saber, han demostrado que el virus de MVA de acuerdo con el primer aspecto se puede aislar directamente a partir del sobrenadante libre de células que facilita el proceso de aislamiento del virus de MVA, en particular el proceso de aislamiento del virus de MVA industrial. Esto, a su vez, reduce los costes de producción de virus de MVA. Por ejemplo, la lisis celular para el aislamiento del virus de MVA no se requiere más. De esta manera, puede reducirse la contaminación del aislado del virus de MVA con material celular, en particular el ADN celular. Como consecuencia, los valores de ADN límite de la Organización Mundial de la Salud para preparaciones virales se pueden obtener más fácil.

Varios procedimientos de aislamiento de virus son conocidos en la téenica. Un procedimiento de aislamiento que es útil de acuerdo con la invención no interfiere con los virus a ser aislados. Por ejemplo, deberían evitarse la exposición prolongada a las fuerzas de corte impulsoras y otros factores que se producen durante el aislamiento. Se prefiere que el aislamiento en la etapa (iii) se logre separando el virus de las células a través de centrifugación, sedimentación y/o filtración, por ejemplo, mediante centrifugación y filtración, a través de sedimentación y filtración, por medio de sedimentación y centrifugación, o por medio de centrifugación, sedimentación y filtración. La persona experimentada en la téenica es capaz de adaptarse/ajustar fácilmente los parámetros de separación adecuados, por ejemplo, la aceleración de la fuerza/fuerza G y/o tiempo usando centrifugación para la separación, el tamaño del filtro usando filtración para la separación, y/o tiempo de sedimentación usando sedimentación para la separación, con el fin de aislar el virus cultivado en tales células.

En un quinto aspecto, la presente invención se relaciona con un método para producir un virus de MVA (mutado) de acuerdo con el primer aspecto que comprende las etapas de: (i) infectar una célula con un virus de MVA, (ii) cultivar la célula, (iii) aislar el virus de MVA, y (iv) repetir las etapas (i) a (iii) con el virus de MVA aislado en la etapa (iii) hasta que se detecta un virus de MVA (mutado) que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto del gen A3L y/o un producto del gen A34R, en el que la secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 mutación(es)) que resulta en una modificación de la secuencia de ácido en por lo menos una secuencia de aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 modificación de secuencia de aminoácido(s)) de tal producto(s) del gen (es decir, el producto del gen A3L y/o el producto del A34R).

Debería observarse que la secuencia de ácido nucleico que codifica los productos génicos anteriores comprende por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2 ó 3 mutación (es)) que resulta en una modificación de aminoácidos en por lo menos una (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificación de secuencia de aminoácido(s)) de cada uno de los productos génicos.

Tal modificación de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 modificaciones de aminoácido) puede ser una eliminación de aminoácido (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 eliminaciones de aminoácido), inserciones de aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 inserciones de aminoácidos) de adición de aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 adiciones de aminoácidos) y/o aminoácido de reemplazamiento de aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 reemplazamientos de aminoácidos).

De preferencia, las etapas (i) a (iii) se repiten hasta que se detecta un virus de MVA que comprende una secuencia de ácido nucleico adicional que codifica un producto del gen A9L, en el que la secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2 ó 3 mutaciones) que resulta en por lo menos una modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de la secuencia de aminoácidos) del producto del gen.

Más preferentemente, (i) se detecta un virus de MVA que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto del gen A3L y un producto del gen A9L, en donde tal secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 mutaciones) que resulta en por lo menos una modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 modificaciones de aminoácido) de tales productos de genes (es decir, el producto del génico A3L y el producto del gen A9L), (ii) se detecta un virus de MVA que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto del gen A34R y un producto del gen A9L, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 mutaciones) que resulta en por lo menos una modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 modificaciones de aminoácido) de tales productos de genes (es decir, el producto del gen A34R y el producto del gen A9L), o (iii) se detecta un virus de MVA que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto del gen A3L, un producto del gen A34R y un producto del gen A9L, en el que la secuencia de ácido nucleico que comprenden al menos una mutación (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 mutaciones) que resulta en por lo menos una modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ó 9 modificaciones aminoácido) de tales productos de genes (es decir, el producto del gen A3L, es decir el producto del gen A34R y el producto del gen A9L).

Debería observarse que la secuencia de ácido nucleico que codifica los productos génicos anteriores, comprende por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2 ó 3 mutaciones) que resulta en un por lo menos una modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido) de cada uno de los productos génicos.

Tales modificaciones de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 modificaciones de aminoácido) pueden ser una eliminación de aminoácido (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 eliminaciones de aminoácido), inserciones de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 inserciones de aminoácidos), de adición de aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 adiciones de aminoácidos) y/o sustitución de aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 sustituciones de aminoácidos).

En cuanto a las modalidades preferidas de las modificaciones de aminoácidos, que se conoce con el primer aspecto de la presente invención.

El virus de MVA proporcionado en la etapa (i) comprende, en particular, una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto de gen A3L, un producto del gen A34R, y un producto del gen A9L, en el que la secuencia de ácido nucleico no comprende una mutación que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácidos de los productos génicos. En particular, no comprende las modificaciones del aminoácido preferidos mencionados en el primer aspecto de la presente invención.

El virus de MVA en la etapa (i) puede comprender una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el número de acceso AY603355 (versión AY603355.1 y GI:47088326).

Se prefiere que las etapas (i) a (iii) se repitan por lo menos 2 veces, de preferencia por lo menos 7 veces, más preferentemente por lo menos 14 veces, más preferentemente por lo menos 20 veces, por ejemplo por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 veces.

Se prefiere además que la célula sea cultivada en un medio de producción de virus. En cuanto a la definición del término "medio de producción virus" y en cuanto a las modalidades preferidas del "medio de producción virus", se refiere como el cuarto aspecto de la presente invención.

El virus puede ser cultivado en la etapa (ii) en un medio de la producción de virus de entre 1 a 10 días, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 días. En cuanto a las condiciones de cultivo preferidas y las formas de aislamiento, también se conoce como el cuarto aspecto de la presente invención.

La célula en la etapa (i) puede ser cualquier célula en la que el virus de MVA sea capaz de replicar. Se prefiere que la célula no sea una célula de primate, en particular una célula humana. Además, se prefiere que la célula sea una célula aviar. Tal célula aviar es preferentemente una célula de pollo, codorniz, ganso o pato (por ejemplo, una célula de somita de pato o retina de pato). La célula aviar (por ejemplo, célula de pollo, codorniz, ganso o pato, tal como célula de somita de pato o de retina de pato) puede ser una célula primaria (o una célula de un cultivo de células primarias), una célula secundaria (o una célula de un cultivo de célula secundaria), o una célula inmortalizada (o una célula de una línea celular). En cuanto a la definición de los términos "célula primaria", "cultivo de células primarias", "célula secundaria", "cultivo de células secundarias", "células inmortalizadas" o "cultivo celular inmortalizado", se refiere al primer aspecto de la presente invención. En las modalidades preferidas de la presente invención, la célula es de una línea celular CR o CR.pIX. Las líneas celulares RC y CR.pIX se derivan de células de la retina pato de Moscovia inmortalizadas (Jordán, et al. 2009 en Vaccine 27, 748-756). La línea celular CR.pIX ha integrado más de manera estable en su genoma un gen que codifica la proteína pIX de adenovirus y expresa tal gen. En otras modalidades preferidas de la invención, las células son células fibroblastos de embrión de pollo (CEF). Las células son células primarias.

En un sexto aspecto, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un virus de MVA, de acuerdo con el primer aspecto, o un geno a de acuerdo con el segundo aspecto y uno o más excipientes, diluyentes y/o soportes farmacéuticamente aceptables.

Como se mencionó anteriormente, el virus de MVA mutado de acuerdo con el primer aspecto, es un hospedador altamente restringido y, de esta manera, altamente atenuado. Es, por tanto, ideal tratar una amplia gama de receptores.

Los términos "hospedador restringido", "altamente atenuada" y "receptor" se definieron anteriormente. De preferencia, los receptores son primates, más preferentemente humanos.

El término "excipiente", cuando se usa en la presente, se pretende indicar todas las sustancias de una composición farmacéutica que no sean ingredientes activos. Ejemplos de los excipientes incluyen, pero no se limitan a, aglutinantes, lubricantes, espesantes, agentes de superficie activa, conservadores, emulsificantes, amortiguadores, agentes saborizantes y/o colorantes. Vehículos y/o diluyentes aceptables para el uso terapéutico son bien conocidos en la téenica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.

R Gennaro edit. 1985). Ejemplos de los soportes adecuados incluyen, pero no se limitan a, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, una cera de bajo punto de fusión y/o manteca de cacao.

Ejemplos de diluyen es adecuados incluyen, pero no se limitan a, etanol, glicerol y/o agua. Los excipientes, diluyentes y/o vehículos farmacéuticos se pueden seleccionar con respecto a la vía de administración pretendida y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender además un aglomerante adecuado, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento y/o agente solubilizante . Ejemplos de los aglomerantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, almidón, gelatina, azúcares naturales, tales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y/o polietilenglicol. Ejemplos de los lubricantes adecuados incluyen, pero no están limitados a, oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio y/o cloruro de sodio. Los conservadores, estabilizadores, colorantes, antioxidantes, agentes de suspensión y/o agentes aromatizantes también pueden estar comprendidos en la composición farmacéutica. Ejemplos de los conservadores incluyen, pero no se limitan a, benzoato de sodio, ácido sórbico y/o ésteres del ácido p-hidroxibenzoico.

La composición farmacéutica contemplada por la presente invención se puede formular y/o administrar de diversas maneras bien conocidas por la persona experimentada. De preferencia, la composición farmacéutica de la presente invención está en la forma líquida, por ejemplo en forma de una solución, tal como una solución de inyección. La solución se puede inyectar, por ejemplo, intramuscular o parenteral. El modo de administración, la dosis y el número de administraciones de la composición farmacéutica pueden ser optimizados por el experimentado en la materia de una manera conocida.

En un séptimo aspecto, la presente invención se relaciona además con una vacuna que comprende un virus de MVA, de acuerdo con el primer aspecto o un genoma de acuerdo con el segundo aspecto.

Como se mencionó anteriormente, el virus de MVA (mutado), de acuerdo con el primer aspecto, es un hospedador altamente restringido y, por lo tanto, altamente atenuado. Es, por lo tanto, una vacuna ideal para tratar una amplia gama de receptores. Los términos "hospedador restringido", "altamente atenuado", "receptor" y "vacuna" se han definido anteriormente. De preferencia, los receptores son primates, más preferentemente humanos. A este respecto, debería observarse que el propio virus de MVA puede ser la vacuna. Confiere protección contra la viruela. Sin embargo, el virus o el genoma puede comprender además una secuencia de ácido nucleico heteróloga, por ejemplo, una secuencia que codifica un antígeno, en particular un epítopo de un antígeno, contra el que puede provocarse una inmunidad protectora, en particular una inmunidad protectora adicional, en el receptor. El término "secuencia de ácido nucleico heteróloga" se definió anteriormente. Ejemplos de tales antígenos cubren, por ejemplo, proteínas de otros virus, tales como el virus de la influenza, virus de hepatitis, por ejemplo, virus de hepatitis C, virus de la inmunodeficiencia humana (V1H), Flavivirus, el virus de Paramyxovirus, Hantavirus o Filovirus o proteínas que se asocian con el desarrollo de tumores y cáncer, tales como Her2/neu o MUC-1. Ejemplos de tales epítopos cubren, por ejemplo, epítopos de proteínas derivadas de otros virus, tales como el virus de influenza, virus de hepatitis, por ejemplo, virus de hepatitis C, virus de la inmunodeficiencia humana (V1H), Flavivirus, Paramyxovirus, Hantavirus o Filovirus, o epítopos derivados de proteínas que se asocian con el desarrollo de tumores y cáncer, tales como péptidos extracelulares de Her2/neu o MUC-1. Un virus de MVA que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga también puede ser designado como virus de MVA recombinante. Después de la administración de la vacuna en el cuerpo del receptor, los antígenos, en particular los epítopos, se expresan y se presentan al sistema inmune y puede inducirse una respuesta inmune específica contra tales antígenos, en particular los epítopos. De esta manera, el destinatario es inmunizado contra tales antígenos, particularmente epítopos.

De preferencia, la vacuna comprende un virus de MVA de acuerdo con el primer aspecto o un genoma de acuerdo con el segundo aspecto es un virus de la viruela, virus de influenza, un virus de hepatitis, por ejemplo, un virus de hepatitis C, un virus de la inmunodeficiencia humana (V1H), un Flavivirus, un paramixovirus, un hantavirus, y/o una vacuna de Filovirus. También se puede usar en la vacunación contra el cáncer de mama, melanoma, cáncer pancreático o cáncer de próstata.

La vacuna contemplada por la presente invención se puede formular y administrar de diversas maneras bien conocidas por la persona experimentada. De preferencia, la vacuna de la presente invención está en la forma líquida, por ejemplo en la forma de una solución, tal como una solución de inyección. Tal solución puede inyectarse, por ejemplo, intramuscular o parenteral . El modo de administración, la dosis y el número de administraciones de la vacuna pueden ser optimizados por el experimentado en la materia de una manera conocida. Para la formulación o preparación de la vacuna, el virus de MVA, en particular el virus de MVA recombinante, de acuerdo con el primer aspecto se convierte en una forma fisiológicamente aceptable. Esto puede hacerse basándose en la experiencia en la preparación de vacunas de poxvirus usadas para la vacunación contra la viruela (como se describe por (Stickl et al. 1974 en Dtsch Med Wochenschr 99, 2386-2392)). Esta vacuna es particularmente útil para inducir las respuestas inmunes en los receptores inmunocomprometidos, tales como primates, incluyendo los humanos. El término "inmunocomprómetido", como se usa en la presente, describe el estado del sistema inmune de un destinatario, que muestra sólo respuestas inmunitarias incompletas o tiene una eficacia reducida en la defensa contra los agentes infecciosos.

En un octavo aspecto, la presente invención se relaciona con un virus de MVA, de acuerdo con el primer aspecto, o un genoma según el segundo aspecto, para el uso en medicina. De preferencia, el virus de MVA, de acuerdo con el primer aspecto, o el genoma de acuerdo con el segundo aspecto, es para su uso en la vacunación y/o terapia. En particular, el destinatario es estimulado con el virus MVA de acuerdo con el primer aspecto o con el genoma de acuerdo con el segundo aspecto, para inducir una inmunidad específica. De preferencia, los receptores son primates, más preferentemente humanos. Los primates, tales como los humanos, pueden ser inmunocomprometidos. A este respecto, debería observarse que el propio virus de MVA puede ser la vacuna. Se confiere protección contra la viruela. Sin embargo, el virus o el genoma puede comprender además una secuencia de ácido nucleico heteróloga, por ejemplo, una secuencia que codifica un antígeno, en particular un epítopo de un antígeno, contra el que puede provocarse una inmunidad protectora, en particular una inmunidad protectora adicional en el receptor. Los términos "vacunación", "receptor", "secuencia de ácido nucleico heteróloga" se han definido anteriormente. Los antígenos preferidos, particularmente epítopos, se describen en el primer y séptimo aspecto de la presente invención. De preferencia, tales virus de MVA o genoma es para su uso en la vacunación contra el virus de la viruela, virus de influenza, virus de hepatitis, por ejemplo, el virus de hepatitis C, virus de la inmunodeficiencia humana (V1H), Flavivirus, paramixovirus, Hantavirus, Filovirus, tumores y/o cáncer como cáncer de mama, melanoma, cáncer pancreático o cáncer de próstata .

Alternativa o adicionalmente, el destinatario se estimula reto con el virus de MVA de acuerdo con el primer aspecto o con el genoma de acuerdo con el segundo aspecto, para provocar un efecto terapéutico. Como se mencionó anteriormente, la secuencia heteróloga comprendida en tal virus o el genoma pueden codificar un compuesto terapéutico.

Por ejemplo, el compuesto terapéutico puede ser un compuesto que afecta o participa en el crecimiento de tejido, el crecimiento celular, la diferenciación celular, un compuesto que es capaz de invocar una acción biológica, tal como una respuesta inmune, o un compuesto que puede desempeñar cualquier otra función en uno o más procesos biológicos. En particular, el compuesto puede ser un compuesto antimicrobiano, un compuesto antiviral, un compuesto anti-fúngico, un compuesto inmunosupresor, un factor de crecimiento, una enzima, un compuesto antiinflamatorio o un compuesto anti-alérgico. El compuesto terapéutico también puede ser un ácido nucleico antisentido.

El modo de vacunación, la dosis de vacunación, y el número de vacunación pueden ser optimizados por el experimentado en la téenica de una manera conocida. La vacuna puede formularse y administrarse de diversas maneras bien conocidas por la persona experimentada. De preferencia, la vacuna se administra en forma líquida. De preferencia, la vacuna se inyecta, por ejemplo, intramuscular o parenteral. Se prefiere que el virus de MVA, de acuerdo con el primer aspecto, o el genoma de acuerdo con el segundo aspecto, se administre en una cantidad farmacéuticamente eficaz para el receptor. El término "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de virus de MVA o genoma que es eficaz en una ruta particular de administración para provocar una respuesta inmune.

En un noveno aspecto, la presente invención se relaciona con un virus de MVA que comprende una secuencia de ácido nucleico, en donde el gen A3L y/o gen de A9L se suprime funcionalmente. De preferencia, el gen de A34R se elimina más funcionalmente.

Más preferentemente, (i) el gen de A3L y el gen de A9L se eliminan funcionalmente, (ii) el gen A3L y el gen de A34R se eliminan funcionalmente, (iii) el gen de A9L y el gen de A34R se eliminan funcionalmente, o (iv) el gen de A3L, el gen de A9L, y el gen de A34R se suprimen funcionalmente.

El gen de AL3 (no eliminado) puede tener una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID NO: 7, (no eliminado) el gen A34R puede tener una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID NO: 8, y/o el gen de A9L (no eliminado) puede tener una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID NO: 9. Además, el virus de MVA puede comprender una secuencia de ácido nucleico antes de la eliminación, de acuerdo con el número de acceso AY603355 (versión AY 603355.1 y GI:47088326).

En el contexto de la presente invención, el término "eliminación funcionalmente" de los genes A3L, A9L, y/o A34R mencionados anteriormente se debe entender que los genes se eliminan a tal grado que se reduce la actividad biológica de los productos de los genes A3L, A9L, y/o A34R respectivos, de preferencia abolida, o se modifica. Por ejemplo, la actividad biológica se puede reducir por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ó 200% en comparación con los productos del gen A3L, A9L y/o A34R activos biológicos (no eliminados).

Tal eliminación funcionalmente puede llevarse a cabo mediante la eliminación parcial de los genes A3L, A9L, y/o A34R, eliminando completamente los genes A3L, A9L y/o A34R, y/o mediante la introducción de uno o más codones de paro en los genes A3L, A9L y/o A34R.

La reducción o desaparición de la actividad biológica de los productos de los genes A3L, A9L y/o A34R respectivos en comparación con los productos de los genes A3L, A9L y/o A34R activos biológicos (no eliminado) puede ser probado con una variedad de experimentos conocidos por la persona experimentada. Una forma de detectar la reducción o desaparición de la actividad biológica de los productos de los genes A3L, A9L y/o A34R respectivos, en comparación con los productos de los genes A3L, A9L y/o A34R (no eliminado) es la conducción de una prueba cometa, como se describe en el Ejemplo 6. Para la prueba cometa, una monocapa celular de células permisivas adherentes se infecta con un número adecuadamente bajo de virus, tales como 0.01 a 0.001 virus por célula hospedera. La progenie derivada de un virus eliminado en los genes A3L, A9L y/o A34R no escapará de la célula infectada inicialmente y causará placas circulares pequeñas y cerrados (una colección vecina de células que muestran un efecto citopático) o no causará ningunas placas en absoluto. Un virus equipado con los productos de los genes A3L, A9L y/o A34R activos causará placas claramente visibles también a simple vista; las placas se expandirán dentro de 2-7 días y eventualmente consumirán completamente la monocapa celular.

Con respecto a la descripción de los productos génicos del gen A3L, gen A9L y el gen A34R, que se conoce como el primer aspecto de la presente invención.

De preferencia, el virus de MVA es un virus de MVA aislado. El término "virus MVA aislado", como se usa en la presente, se refiere a un virus que se retira de su ambiente nativo o el cultivo. Por lo tanto, un virus de MVA aislado puede estar libre de algunos o de todos los componentes celulares, es decir, componentes de las células en las que el virus se produce de forma natural o en el que se cultiva (por ejemplo, componentes citoplasmáticos o membrana). También puede ser libre de algunos o todos los componentes (por ejemplo, el cultivo de medio de cultivo o impurezas relacionadas con la cultura como los restos del cultivo).

El virus de MVA aislado puede purificarse adicionalmente. De esta manera, más preferentemente, el virus de MVA es un virus de MVA purificado. El término "virus MVA purificado", como se usa en la presente, se refiere a un virus que ha sido aislado bajo condiciones que reducen o eliminan la presencia de materiales no relacionados, es decir contaminantes, incluyendo materiales nativos, por ejemplo, residuos celulares, restos celulares, proteínas celulares, moléculas de ADN celulares, y/o moléculas de ARN celulares, a partir del cual se obtiene el virus. El virus de MVA purificado está preferentemente sustancialmente libre de células y/o componentes del cultivo. Tal como se usa en la presente, el término "sustancialmente libre" se usa operacionalmente, en el contexto de las pruebas analíticas del material. Un virus de MVA purificado que está sustancialmente libre de contaminantes es, preferentemente, por lo menos 50% puro, más preferentemente por lo menos 90% puro, e incluso más preferentemente por lo menos 99% ó 100% puro. La pureza puede evaluarse por cromatografía, electroforesis en gel, inmunoensayo, análisis de la composición, prueba biológica y otros métodos conocidos en la téenica .

Se prefiere además que el gen eliminado funcionalmente sea sustituido por una secuencia de ácido nucleico heteróloga. Por ejemplo, el gen de A3L eliminado funcionalmente se sustituye por una secuencia de ácido nucleico heteróloga, el gen de A9L eliminado funcionalmente se sustituye por una secuencia de ácido nucleico heteróloga, y/o el gen de A34R eliminado funcionalmente se sustituye por una secuencia de ácido nucleico heteróloga. Los métodos de cómo insertar las secuencias de ácido nucleico heterólogas en el genoma del virus de MVA son conoc.idos por la persona experimentada. La expresión de la secuencia de ácido nucleico heteróloga puede estar bajo el control transcripcional de un promotor del virus de MVA.

El término "secuencia de ácido nucleico heteróloga" se ha definido anteriormente. De preferencia, la secuencia de ácido nucleico heteróloga se selecciona entre una secuencia que codifica un antígeno, en particular un epítopo de un antígeno, un compuesto de diagnóstico o un compuesto terapéutico.

El antígeno o epítopo pueden ser útiles como una vacuna para inducir una respuesta inmune contra el antígeno o epítopo. Ejemplos de tales antígenos que son heterólogos a la cubierta de virus, por ejemplo, proteínas de otros virus, tales como el virus de influenza, virus de hepatitis, por ejemplo, virus de hepatitis C, virus de inmunodeficiencia humana (V1H), Flavivirus, Paramyxovirus, Hantavirus o Filovirus, o proteínas que están asociadas con el desarrollo de tumores y el cáncer, tales como Her2/neu o MUC-1. Ejemplos de tales epítopos que son heterólogos a la cubierta de virus, por ejemplo, epítopos de proteínas derivadas de otros virus, tales como el virus de influenza, virus de hepatitis, por ejemplo, virus de hepatitis C, virus de inmunodeficiencia humana (V1H), Flavivirus, Paramyxovirus, Hantavirus o Filovirus, o epítopos derivados de proteínas que están asociadas con el desarrollo de tumores y el cáncer, tales como péptidos extracelulares de Her/2 o MUC-1.

El compuesto terapéutico puede ser cualquier compuesto con un efecto terapéutico. Por ejemplo, el compuesto terapéutico puede ser un compuesto que afecta o participa en el crecimiento de tejido, el crecimiento celular, la diferenciación celular, un compuesto que es capaz de invocar una acción biológica, tal como una respuesta inmune, o un compuesto que puede desempeñar cualquier otra función en uno o más procesos biológicos. En particular, el compuesto puede ser un compuesto antimicrobiano, un compuesto antiviral, un compuesto anti-fúngico, un compuesto inmunosupresor, un factor de crecimiento, una enzima, un compuesto antiinflamatorio, o un compuesto anti-alérgico. El compuesto terapéutico también puede ser un ácido nucleico antisentido.

El compuesto de diagnóstico puede ser cualquier compuesto con un efecto de diagnóstico. Por ejemplo, el compuesto terapéutico puede ser una proteína marcador/reportero, tal como un anticuerpo, GFP, EGFP, b-galactosidasa, o una resistencia a los antibióticos que confiere la proteína, tal como bla (beta-lactamasa) contra la ampicilina o npt (neomicina fosfotransferasa) contra la neomicina o G418. Tal proteína marcador/reportero puede usarse para identificar o aislar el virus, por ejemplo, usando la teenología de hibridación, microscopía de fluorescencia, o pruebas ELISA. Además, la proteína que confiere resistencia a los antibióticos comprendida en el virus, confiere resistencia contra los antibióticos de selección a la célula infectada.

En las modalidades preferidas de la presente invención, el virus comprende un producto del gen A3L, un producto del gen A9L, y/o un producto del gen A34R, en donde el producto del gen comprende preferentemente por lo menos una modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 modificaciones de la secuencia de aminoácido). En una modalidad de la presente invención, el virus comprende un producto del gen A3L, en donde el producto del gen comprende por lo menos una modificación de aminoácido (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido). En otra modalidad de la presente invención, el virus comprende un producto del gen A9L, en el que el producto del gen comprende una modificación de por lo menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido). En una modalidad adicional de la presente invención, el virus comprende un producto del gen A34R, en donde el producto del gen comprende por lo menos una modificación de aminoácido (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido).

En una modalidad más preferida de la presente invención, el virus comprende: (I) un producto del gen A9L, en el que el producto génico comprende por lo menos una modificación del aminoácido (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido) y un producto del gen A34R, en donde el producto génico, comprende por lo menos una modificación de aminoácido (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido, (ii) un producto del gen A9L, en donde el producto génico comprende por lo menos una modificación del aminoácido un amino (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido) y un producto del gen A3L, en donde el producto del gen comprende por lo menos una modificación de un aminoácido (por ejemplo 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido), (iii) un producto del gen A34R, en donde el producto del gen comprende por lo menos una modificación de aminoácido (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido) y el producto del gen A3L, en donde el producto del gen comprende por lo menos una modificación de aminoácido, por ejemplo 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido), o (Iv) un producto del gen A9L, en donde el producto del gen comprende por lo menos una modificación del aminoácido (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido), un producto del gen A34R, en donde el producto del gen comprende por lo menos una modificación de aminoácido (por ejemplo 1, 2 ó 3 modificación de aminoácido) y un producto del gen A3L, en el que el producto génico comprende por lo menos una modificación del aminoácido (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificación de aminoácido).

La modificación de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 modificaciones de aminoácido) puede ser una eliminación de aminoácido (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 eliminación de aminoácido), la inserción de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 inserciones de aminoácidos), de adición de aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 adiciones de aminoácidos) y/o de sustitución de aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 Ó 9 reemplazamientos de aminoácidos). Una "sustitución de aminoácido" también puede ser designada en la presente como una "sustitución de aminoácidos". El término "inserción de aminoácido", como se usa en la presente, se refiere a una modificación de aminoácidos que tiene lugar dentro de la secuencia de aminoácidos de los productos de los genes A3L, A34R y/o A9L, mientras que el término "adición de aminoácido", como se usa en la presente, se refiere a una modificación de aminoácidos que tiene lugar en el extremo N- o C-terminal de los productos de los genes A3L, A34R y/o A9L. En cuanto a las modalidades preferidas de las modificaciones de aminoácidos, se refiere como el primer aspecto de la presente invención.

En un décimo aspecto, la presente invención se relaciona con una célula que comprende un gen de A3L, un gen de A9L y/o un gen de A34R de un virus de MVA y que expresa tal gen(es).

Se prefiere que la célula comprenda: (i) un gen de A3L y un gen de A9L, (ii) un gen de A3L y un gen de A34R, (iii) un gen de A9L y un gen de A34R, o (iv) un gen de A3L, un gen de A9L y un gen de A34R.

La célula también puede ser designada como célula recombinante. En particular, los genes se aíslan del virus de MVA/genoma del virus de MVA, es decir, los genes no están comprendidos en/parte del virus de MVA/genoma del virus MVA.

La célula puede transíectarse con el gen de A3L, gen de A9L y/o el gen de A34R del virus de MVA. El gen A3L, gen A9L, y/o el gen A34R del virus de MVA se pueden mantener estable o transitoriamente presentes en la célula. De preferencia, el gen de A3L, gen de A9L y/o el gen de A34R del virus de MVA se mantiene establemente en la célula.

El gen de A3L puede tener una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID NO: 7, el gen de A34R puede tener una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID NO: 8, y/o el gen de A9L puede tener una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID NO: 9.

Se prefiere que la célula comprenda además un virus de MVA de acuerdo con el noveno aspecto. La célula es capaz de proporcionar in trans el producto(s) de gen (es decir, el producto del gen A3L, A9L y/o A34R) del gen eliminado funcionalmente (es decir, los genes A3L, A9L y/o A34R del virus de MVA de acuerdo con el noveno aspecto. Por ejemplo, (i) si el gen A3L se elimina funcionalmente en el virus de MVA de acuerdo con el noveno aspecto, la célula que comprende el gen de A3L y que expresa tal gen es capaz de proporcionar in trans el producto del gen A3L, (ii) si el gen A9L se suprime funcionalmente en el virus de MVA de acuerdo con el noveno aspecto, la célula que comprende el gen A9L y que expresa tal gen es capaz de proporcionar in trans el producto del gen A9L, y/o (iii) si el gen A34R se elimina funcionalmente en el virus de MVA de acuerdo con el noveno aspecto, la célula que comprende el gen A34R y que expresa el gen es capaz de proporcionar in trans el producto del gen A34R.

El producto del gen A3L puede tener una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 1, el producto del gen A34R puede tener una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 2, y/o el producto del gen A9L puede tener una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 3.

Se prefiere además que: (i) el gen A3L del virus de MVA comprenda por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2 ó 3 mutaciones) que resulta en por lo menos una modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de la secuencia de aminoácidos) del producto del gen, (ii) el gen A9L del virus de MVA comprenda por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2 ó 3 mutaciones) que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de la secuencia de aminoácido del producto del gen, y/o (iii) el gen A34R del virus de MVA comprenda por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2 ó 3 mutaciones) que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de la secuencia de aminoácido) del producto del gen.

La modificación de la secuencia de aminoácidos(s) (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 modificaciones del aminoácido) puede ser una eliminación de aminoácido (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 eliminaciones de aminoácido), inserción de aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 inserción de aminoácido(s)), de adición de aminoácido(s) (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 adiciones de aminoácido (s)) y/o reemplazamiento(s) de aminoácido(s) (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 reemplazamientos de aminoácido(s). En cuanto a las modalidades preferidas de las modificaciones de aminoácidos, se refiere como el primer aspecto de la presente invención.

Por lo tanto, la célula no es sólo capaz de proporcionar in trans el producto(s) de gen (es decir, el producto del gen A3L, producto del gen A9L y/o el producto del gen A34R) del gen(es) eliminado funcionalmente (es decir, el gen A3L, gen A9L y/o el gen A34R) del virus de MVA de acuerdo con el noveno aspecto (ver anteriormente). Es también (alternativamente) capaz de proporcionar in trans el producto del gen que tiene por lo menos una modificación de la secuencia de aminoácido (es decir, el producto del gen A3L, en donde el producto del gen comprende por lo menos una modificación del aminoácido (por ejemplo 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido), producto del gen A9L, en donde el producto del gen comprende por lo menos una modificación del aminoácido (por ejemplo 1, 2 ó 3 modificación de aminoácido), y/o el producto del A34R, en donde el producto del gen comprende por lo menos una modificación de aminoácido (por ejemplo 1, 2 ó 3 modificaciones de aminoácido) del gen eliminado funcionalmente (es decir, el gen A3L, el gen A9L, y/o el gen A34R) del virus de MVA, de acuerdo con el noveno aspecto. En consecuencia, tal célula es para la producción de un virus de MVA (no mutado) que comprende un producto del gen A3L, un producto del gen A9L, y/o un producto del gen A34R que no tiene una modificación de la secuencia de aminoácido o para producir un virus de MVA (utado) que comprende un producto del gen A3L, un producto del gen A9L, y/o un producto del gen A34R que tiene una modificación de la secuencia de aminoácidos. En cuanto a las modalidades preferidas de las modificaciones de aminoácidos, se refiere como el primer aspecto de la presente invención.

La célula puede ser una célula de mamífero tal como un humano o una célula de primate o una célula aviar. La célula aviar es preferentemente una célula de pollo, codorniz, ganso o pato (por ejemplo, una célula de somita de pato o célula de retina de pato). La célula aviar (por ejemplo, célula de pollo, codorniz, ganso o pato, tal como célula de somita de pato o célula de retina de pato) puede ser una célula primaria (o una célula de un cultivo celular primario), una célula secundaria (o una célula de un cultivo celular secundario), o una célula inmortalizada (o una célula de una línea celular). En cuanto a la definición de los términos "célula primaria", "cultivo de células primarias", "célula secundaria", "cultivo de células secundarias", "célula inmortalizada", o "cultivo de células inmortalizadas", se refiere al primer aspecto de la presente invención. En las modalidades preferidas de la presente invención, la célula es de una línea celular CR o CR.pIX. Las líneas celulares CR y CR.pIX se derivan de células de la retina de pato de Moscovia inmortalizadas (Jordán, et al.2009 en Vaccine 27, 748-756). La línea celular CR.pIX ha integrado más establemente en su genoma un gen que codifica la proteína pIX de adenovirus y que expresa tal gen. En otras modalidades preferidas de la invención, las células son células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF). Estas células son células primarias.

En un undécimo aspecto, la presente invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico que comprende un gen A3L, un gen A9L y/o el gen A34R de un virus de MVA, en donde preferentemente tal gen(es) está se une operativamente a una secuencia de ácido nucleico heteróloga. En una modalidad de la presente invención, la molécula de ácido nucleico comprende un gen A3L, en el que preferentemente el gen se une operativamente a una secuencia de ácido nucleico heteróloga. En otra modalidad de la presente invención, la molécula de ácido nucleico comprende un gen A9L, en el que preferentemente el gen se une operativamente a una secuencia de ácido nucleico heteróloga. En una modalidad adicional de la invención, la molécula de ácido nucleico comprende un gen A34R, en donde preferentemente el gen está unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico heteróloga.

Se prefiere que la molécula de ácido nucleico comprenda: (i) un gen A3L, en el que preferentemente tal gen está unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico heteróloga, y un gen A9L, en el que preferentemente tal gen está unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico heteróloga, (ii) un gen A3L, en donde preferentemente tal gen está unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico heteróloga, y un gen A34R, en el que preferentemente tal gen está unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico heteróloga, (iii) un gen de A9L, en el que preferentemente tal gen está unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico heteróloga, y un gen A34R, en el que preferentemente tal gen está unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico heteróloga, o (iv) un gen A3L, en el que preferentemente tal gen está unido operativamente a una secuencia heteróloga de ácido nucleico, un gen A9L, en el que preferentemente tal gen está unido operativamente a una secuencia heteróloga de ácido nucleico, y un gen A34R, en el que preferentemente tal gen está unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico heteróloga.

La molécula de ácido nucleico también puede ser designada como molécula de ácido nucleico recombinante. En Particular, el gen(es) mencionado anteriormente se aísla del virus de MVA/genoma del virus de MVA, es decir, el gen (es) no está comprendido en/parte del virus de MVA/genoma del virus de MVA.

El gen A3L puede tener una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID NO: 7, el gen A34R puede tener una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID NO: 8, y/o el gen A9L puede tener una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID NO: 9.

El término "enlazado operativamente" significa que el gen de A3L, A9L o A34R se enlaza a la secuencia de ácido nucleico heteróloga, de tal manera que la expresión en el marco de una construcción correspondiente puede verse afectada, por ejemplo, evitando cambios del marco o codones de paro, o por separación del ácido nucleico heterólogo a través de un sitio de entrada ribosómico interno que permite la traducción para iniciar la independencia de la estructura de la tapa 5' del ARNm. Tales sitios de entrada ribosómicos internos son conocidos en la téenica y se pueden derivar, por ejemplo, de poliovirus o ARN genómico del virus de la encefalomiocarditis.

El término "secuencia de ácido nucleico heteróloga" se ha definido anteriormente. De preferencia, la secuencia de ácido nucleico heteróloga se selecciona entre una secuencia que codifica un antígeno, un epítopo, un compuesto de diagnóstico, o un compuesto terapéutico. Más preferentemente, la secuencia de ácido nucleico heteróloga es una secuencia de codificación para un compuesto de diagnóstico. El compuesto de diagnóstico puede ser cualquier compuesto con un efecto de diagnóstico. Por ejemplo, el compuesto terapéutico puede ser una proteína marcador/reportera, tal como un anticuerpo, GFP, EGFP, b-galactosidasa, o una resistencia a los antibióticos que confiere proteína, tal como bla (beta-lactamasa) contra la ampicilina o npt (neomicina fosfotransferasa) contra la neomicina o G418. La proteína marcadora/reportera puede usarse para identificar o aislar el virus, por ejemplo, usando la teenología de hibridación, microscopía de fluorescencia, o pruebas ELISA. Además, la proteína que confiere resistencia a los antibióticos comprendida en el virus confiere resistencia contra los antibióticos de selección a la célula infectada. En cuanto a las modalidades preferidas del antígeno, epítopo o compuesto terapéutico, se refiere como el primer aspecto de la presente invención.

De preferencia, (i) el gen A3L del virus de MVA comprende por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2 ó 3 mutación (es)) que resulta en por lo menos una modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de la secuencia de aminoácidos del producto del gen, (ii) el gen A9L del virus de MVA comprende por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2 ó 3 mutación (es)) que resulta en por lo menos una modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de la de la secuencia de aminoácido) del producto del gen, y/o (iii) el gen A34R del virus de MVA comprende por lo menos una mutación (por ejemplo, 1, 2 ó 3 mutación (es)) que resulta en por lo menos una modificación de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, 1, 2 ó 3 modificaciones de la secuencia de aminoácidos) del producto del gen.

La modificación de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 modificaciones de aminoácidos) puede ser una eliminación de aminoácido (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 eliminaciones de aminoácido), la inserción de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 Ó 9 inserciones de aminoácido(s)), de adición de aminoácido(s) (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ó 9 adiciones de aminoácido (s)) y/o sustitución de aminoácido(s) (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 sustitución de aminoácidos). En cuanto a las modalidades preferidas de las modificaciones de aminoácidos, se refiere como el primer aspecto de la presente invención.

En un decimosegundo aspecto, la presente invención se relaciona con un método para producir un virus de MVA recombinante que comprende las etapas de: (i) proporcionar una célula, (ii) introducir un virus de MVA de acuerdo con un noveno aspecto y una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el undécimo aspecto en la célula, y (iii) cultivar la célula en condiciones que permitan la recombinación homologa entre la secuencia de ácido nucleico del virus de MVA y la molécula de ácido nucleico obteniendo de este modo el virus de MVA recombinante.

La célula puede ser una célula de mamífero, tal como una célula de humano o una célula de primate o una célula aviar. Tal célula aviar es preferentemente una célula de pollo, codorniz, ganso o pato (por ejemplo, una célula de somita de pato o célula de retina de pato). La célula aviar (por ejemplo, célula de pollo, codorniz, ganso o pato, tal como célula de somita de pato o célula de retina de pato) puede ser una célula primaria (o una célula de un cultivo de células primarias), una célula secundaria (o una célula de un cultivo de células secundarias), o una célula inmortalizada (o una célula de una línea celular). En cuanto a la definición de los términos "célula primaria", "cultivo de células primarias", "célula secundaria", "cultivo de células secundarias", "células inmortalizadas", o "cultivo celular inmortalizado", se refiere al primer aspecto de la presente invención. En las modalidades preferidas de la presente invención, la célula es de una línea celular CR o CR.pIX. Las líneas celulares CR y CR.pIX se derivan de células de la retina de pato de Moscovia inmortalizadas (Jordán, et al. 2009 en Vaccine 27, 748-756). La línea celular CR.pIX ha integrado más establemente en su genoma un gen que codifica la proteína pIX de adenovirus y expresa tal gen. En otras modalidades preferidas de la invención, las células son células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF). Estas células son células primarias.

De preferencia, la célula se infecta con el virus de MVA de acuerdo con el noveno aspecto y/o tal célula se transfecta con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con el undécimo aspecto. La persona experimentada está consciente de las condiciones que permiten la recombinación homologa entre la secuencia de ácido nucleico del virus de MVA y la molécula de ácido nucleico con el fin de obtener un virus de MVA recombinante. Además, la persona experimentada está consciente de la prueba experimental para evaluar si la recombinación homologa ha tenido éxito.

Diversas modificaciones y variaciones de la invención serán evidentes para los experimentados en la téenica sin apartarse del alcance de la invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con las modalidades preferidas específicas, debe entenderse que la invención, como se reivindica, no debe limitarse indebidamente a tales modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvias para los experimentados en la técnica en los campos relevantes, se destinan para ser cubiertas por la presente invención.

Las Figuras y Ejemplos son meramente ilustrativos de la presente invención y no se deben interpretar para limitar el alcance de la invención de ninguna manera tal como se indica por las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Aislados en serie de MVA en cultivos en suspensión químicamente definidos En este ejemplo, se investigaron las propiedades de las generaciones sucesivas de MVA en una línea celular ya totalmente permisiva para este virus. El ambiente selectivo se impone por los medios químicamente definidos y la ausencia de componentes de estabilización del virión, tales como abundante proteína extracelular y los lípidos contenidos en el lisado mínimamente purificado de huevos embrionados o suplementos de suero de bovino encontrados comúnmente en cultivos de células de vertebrados.

Con la motivación para confirmar la estabilidad esperada de un virus de ADN, se pasó MVA en la línea celular CR. Para el experimento, se usó la cepa MVA de acuerdo con el número de acceso AY603355 (versión AY603355.1 y GI:47088326). El cultivo en suspensión y el procedimiento químicamente definido empleado está totalmente dentro de las restricciones sugeridas por las autoridades reguladoras y se desarrolló y presentó anteriormente (Jordán, et al.2011 en Biologicals 39, 50-58). Brevemente descrito en la presente, para producir poxvirus hiperatenuado a altos títulos, los cultivos en suspensión de CR o CR.pIX en medio CD-U3 se permitió que proliferan a 4xl06 células/mL. Se adicionó un volumen de medio de producción de virus CD-VP4 y el cultivo inoculado con virus a una multiplicidad de infección (MOI), como se indica, usualmente dentro de 0.01 y 0.1. Las líneas celulares CR y CR.pIX se derivan de células inmortalizadas de retina pato de Moscovia (Jordán, et al.2009 en Vaccine 27, 748-756) y se diseñaron para la producción de vacunas. El medio CD-U3 (PAA, catálogo #T1250,3001) es una versión mejorada del medio de proliferación celular CD-U2 y CD-VP4 (Biochrom catálogo #F9127) es un medio de producción de virus desarrollado para complementar el medio de proliferación durante la replicación del virus (Jordán, et al.2011 en Biologicals 39, 50-58). Todos los cultivos descritos en los siguientes ejemplos se realizaron a 37°C en una atmósfera enriquecida al 8% de COå . Los cultivos en suspensión se incubaron en una incubadora con agitación (Infors) con 5 cm de amplitud y 180 rpm para tubos agitados y 150 rpm para matraces de agitación.

Las muestras se retiraron de los cultivos en suspensión a intervalos definidos y el virus infeccioso por lo general se liberó por sonicación durante 45 s con una unidad S250-D Branson alimentación de una punta de sonicador de 3.2 mm con 10% de energía.

El número de unidades infecciosas se determinó adicionando diluciones en serie de una preparación de virus a monocapas Vero 80% confluentes en medio DMEM:F12 (Gibco) que contiene 5% de FCS. MVA no puede replicarse en células Vero, de esta manera usando un sustrato para cuantificar estrictamente sólo el virus de entrada. Después de 48 horas, las células se fijaron con metanol y se incubaron con anticuerpos policlonales del virus de vacuna (Quartett Immunodiagnostika, Berlín, Alemania) a una dilución 1:1000 en PBS que contiene 1% de suero fetal de carnero. Dos etapas de lavado se realizaron con PBS que contiene 0.05% de Tween 20 y anticuerpo secundario al anticuerpo específico de vacuna se adiciona a 1:1000. Este anticuerpo secundario se acopla a la enzima peroxidasa que cataliza una reacción de color tras la incubación con el reactivo AEC (3-amino-9-etil-carbozol; 0.3 mg/mL en amortiguador de acetato 0.1 M, pH 5.0 que contiene H2SO2 al 0.015%). Los focos infectados se identifican por microscopio de luz y unidades formadoras de placa/mL se calculan a partir de la dilución máxima de la suspensión de MVA que produce una reacción colorante positiva. Todas las titulaciones se llevaron a cabo en réplicas paralelas (dando un total de cuatro valores de titulación por muestra).

Esta es la primera vez que MVA, ya adaptada para la proliferación en células de pollo primarias, se ha expuesto en serie a un cultivo inmortal (en lugar de primario) que, al mismo tiempo, es un sustrato de la producción aviar no derivada de pollo. Además, se realizó el paso en medio de cultivo químicamente definido sin la adición de suero, albúmina, u otros componentes esperados para estabilizar los virus.

Como se muestra en las Figuras 1A/3A, hay un aumento gradual en el rendimiento con el aumento del paso. Este experimento inicial se llevó a cabo de tal manera que se estimó el rendimiento del virus de cada generación inmediatamente anterior y con esta estimación, que tuvo como objetivo infectar el cultivo posterior con una MOI de 0.01 a 0.1. Debido al tiempo requerido hasta que las titulaciones puedan evaluarse, el verdadero MOI varió de paso a paso y en este caso (cualquier pasaje también podría tener un efecto atenuante o de amortiguación sobre la replicación del virus) los rendimientos y MOI aumentaron con el aumento del pasaje. Después de haber descubierto un efecto del pasaje potencial sorprendente para MVA en una línea celular totalmente permisiva, se repitió el experimento en condiciones más rigurosas.

Los datos mostrados en las Figuras IB a 1C se obtuvieron ajustando MOI de cada pasaje a 0.05 con el virus aislado 48 h post-infección del pasaje previo respectivo. El penúltimo paso de 14 virus del experimento inicial de la Figura 1A/3A se usó como referencia de alto pasaje. Por lo tanto, cualquiera de los cambios en las propiedades de MVA se confirma en este experimento de repetición.

La Figura IB muestra la cinética de los diversos pasajes superpuestos. Para cada experimento, se cuantificaron dos infecciones paralelas independientes de duplicados independientes empezando con un bajo pasaje y el MVA de alto pasaje. En el paso 10 y 11 de la hebra iniciado con el virus de bajo pasaje se observó un fuerte cambio de (ya alto) rendimientos en el intervalo de 10x8 pfu/mL hasta más allá de 109 pfu/ml.

Para visualizar mejor el efecto, la Figura 1C representa solamente los títulos de virus pico de 48 h contra los números de pasajes. Los pasajes de MVA partiendo con el paso 14 oscilan alrededor de 3.4xl09 pfu/mL, mientras que por debajo de 10 MVA pasajes están en el intervalo de 3.8xl08 pfu/mL. El virus del pasaje 10 y 11 se replica repentinamente a un valor de pico medio de 3.66xl09 pfu/mL. Ya que la determinación de los títulos de virus se asocia con variaciones, la Figura 1D/3D representa las relaciones de un virus de pasaje bajo a alto para cada pasaje particular. Como propiedades de replicación de virus de alto pasaje se mantienen estables, este método estandariza contra las desviaciones de titulación. Un gran número indica una ventaja de virus de alto pasaje, una relación de 1 indica que las propiedades de pasaje de virus bajo y alto son altamente similares o incluso idénticas.

Los datos en la Figura ID muestran que con cada rendimiento de generación del virus pasaje inferior se aproxima al rendimiento de virus de alto pasaje. Mientras que una cantidad 20 veces mayor del virus de alto pasaje está siendo liberada al inicio del experimento, este número disminuye a la paridad después del paso 10. En este experimento particular, un paso adicional hacia el fenotipo de alto pasaje comienza en el pasaje 8. El virus de ultra-alto rendimiento se obtiene con el pasaje 10, que se muestra que se mantiene en el pasaje 11. En general, la estabilidad se demuestra para más de 8 pasajes empezando con el linaje de referencia independiente iniciando con el pasaje 14.

Ejemplo 2: Secuenciación de ADN genómico de MVA A continuación se determinó la secuencia de ADN de los pasajes del virus seleccionado: 100 mL de cultivos de AGE1.CR a 2xl06 células/mL se infectaron con MVA a 0.01 MOI en una mezcla 1:1 de medios CD-U3 y CD-VP4 como se describió (Jordán, et al. 2011 en Biologicals 39, 50-58). Células 48 h post-infección se removieron por centrifugación con 200 x g. Se adicionó polietilenglicol a 8% (de una solución patrón al 13% p/v en agua pura) al sobrenadante clarificado. Después de la incubación en hielo durante 30 minutos, la suspensión se centrifugó durante 60 minutos con 6600 x g y el sedimento translúcido que contiene las partículas virales se resuspendió en 500 m!3 de PBS.

ADN extraviral se digirió con 8 unidades de Turbo DNase (Ambion), entonces el total de ADN (genoma predominantemente viral) se aisló con el kit de mino preparación de sangre de ADN (Qiagen) y, ambos procedimientos de acuerdo con las descripciones de los fabricantes.

Para calcular los rendimientos esperados: 178 kpb del genoma de MVA y 660 g/mol por pb de ADN corresponde a 1.17xl08 g de ADN por mol de virus. Dividido por NA de 6.02xl023 por mol esto produce 1.95xl016 g de ADN por partícula de MVA. Suponiendo un rendimiento de 108 pfu/mL, 1.95xl0-8 g de ADN viral/mL o se puede esperar 19.5 ng/mL.

Se obtuvieron aproximadamente 8 mg de ADN total en las preparaciones y se realizaron qPCR multiplex para estimar adicionalmente las relaciones de ADN genómico viral a ADN celular. Los niveles de MVA se cuantificaron con qPCR contra el gen de MVA128L de proteína de membrana del virus maduro intracelular, pb 120.811-120.898 de GenBank #U94848, con CgTTTTgCATCATACCTCCATCTT (SEC ID NO: 13) , 6FAM- AggCATAAACgATTgCTgCTgTTCCTCTgT-BHQ1 (SEC ID NO: 14) y gCgggTgCTggAgTgCTT (SEC ID NO: 15). Para la detección del ADN celular del transgen E1A se cuantificó con TgACTCCggTCCTTCTAACACA (SEC ID NO: 16), YAK- CCCggTggTCCCgCTgTgC-BHQ1 (SEC ID NO: 17), y TCACggCAACTggTTTAATgg (SEC ID NO: 18). En un volumen de reacción final de 25 mL, cebadores 100 nM y sondas de 80 nM se mezclaron con dNTPs a 200 mM y Taq Man Universal PCR Master Mix (#4324018, Applied Biosystems) a una concentración 1 x. El termocielado se realizó en un ABI Prism 7000 con 2 minutos a 50°C, 10 minutos a 95°C, y 40 ciclos de 15 s a 95°C y 1 minuto a 60°C. Los valores Ct típicos fueron 16 para MVA y 33 para el ADN celular. Las diferencias de los valores de Ct indican diferencias en la concentración molecular relativa, de modo que la relación de ADN viral a hospedador es de 2(33_16) Ó 130,000: 1, que es adecuado para la secuenciación del genoma completo.

Las secuencias se obtuvieron con la teenología Roche/454 GS FLX+. El ADN genómico viral de pasajes 2, 7 y 11 (que se muestra en las Figuras 1A-1D) se secuenciaron con una cobertura de 50 veces para cada genoma y se montaron usando un algoritmo no forzado (sin guía de secuencia). La alineación de los tres pasajes reveló una conservación de secuencia extremadamente alta, como se espera de virus de la viruela. Un número de eliminaciones de una sola base en repeticiones de nucleótidos representan más probablemente los artefactos de secuenciación (por ejemplo tttttat-aaaataa contra tttttataaaaataa) y no fueron incluidos en análisis adicionales.

Hubo solamente tres mutaciones puntuales que se ajustan a la definición de no artefacto y que se descubrieron en el pasaje estudiado 11 del genoma viral. Las tres mutaciones puntuales estuvieron en regiones codificantes, cada una afectó una proteína estructural diferente, y cada una cambió la composición de aminoácidos. Consideramos estos cambios altamente significativos y completamente inesperados. De esta manera, se ha recuperado una nueva cepa de MVA que se llama MVA-CR en el resto del texto.

La primera de las tres mutaciones descubiertas en MVA-CR es en la posición 111561 pb de la cepa CVA usada en la presente para propósitos de orientación (GenBank #AM501482). Esta mutación es una transición de C a T de nucleótido 1915 (abreviado como C1915T) en la secuencia de codificación del gen llamado A3L, de acuerdo con una notación genómica de poxvirus común (Mcyer, et al., 1991 en J Gen Virol 72 (Pt 5), 1031-1038; Rosel et al 1986 en J Virol 60, 436-449). El producto del gen es el principal precursor de P4b de la proteína central. La mutación C1915T provoca un cambio en la secuencia de aminoácidos de His (CAU) a Tyr (UAU) en el codón 639. Observar que el gen A3L está en orientación antisentido en el genoma del poxvirus, de manera que C1915T en la secuencia codificante corresponde a GL111561A en el ADN genómico de CVA.

La segunda mutación es una transición A223G en la secuencia codificante de la proteína de membrana de virión de 10.6 k, codificada por A9L, una transición T119151C en el genoma de CVA. La mutación A223G cambia el codón 75 de Lys (AAG) a Glu (GAG).

La tercera mutación es una transversión G256T en la secuencia codificante de la glucoproteína de membrana EEV, codificada por A34R, una transversión G144417T en el ADN genómico de CVA. La mutación G256T cambia el codón 86 de Asp (GAT) de Tyr (UAU).

La localización en el geno a de MVA usado en este experimento, el número de acceso AY603355 (versión AY603355.1 y GI:47088326): A3L, 100334 pb a 102268 pb en la hebra complementaria; A9L, 107855 pb a 108139 pb en la hebra complementaria; y A34R, 129078..129584 en la hebra genómica.

La cepa usada es el virus obtenido de la American Type Culture Collection (ATCC) con el número #VR-1508.

Las tres mutaciones afectan a las proteínas de MVA que son componentes de partículas infecciosas. Las funciones de las proteínas afectadas en mayor detalle son: Producto del gen A3L: El producto del gen A3L, P4b, es una de los tres proteínas principales del núcleo y procesados por la proteasa viral codificada-17L (Byrd et al.2002 en J Virol 76, 8973-8976). Durante la maduración del virión inmaduro (IV) esférico y no inmaduro al virión maduro intracelular (IMV). La proteína P4b contribuye a la morfogénesis del virión en una etapa muy temprana. Está implicado en la condensación correcta y los reordenamientos de membrana en la transición hacia el IMV infeccioso (Heljasvaara et al.2001 en J Virol 75, 5778-5795; Kato et al. 2004 en Virology 330, 127-146.).

Producto del gen A9L: Este producto génico, similar a P4b, está involucrado en las primeras etapas de la maduración MVA. Es un factor importante corregir la condensación correcta del núcleo de la IMV (Yeh et al.2000 en J Virol 74, 9701-9711).

Producto del gen A34R: El virus envuelto extracelular (EEV) se ha desarrollado como un vehículo para permitir que el virus se propague a sitios distantes. La membrana adicional de la EEV no está equipada para mediar la fusión con la célula blanco y debe ser interrumpido para liberar el IMV, la unidad infecciosa real del virus de vacuna. Los estudios con mutantes de eliminación de A34R demostraron que mediante la desestabilización de la membrana externa de EEV, este factor es extremadamente importante para la actividad infecciosa en el espacio extracelular y para la propagación del virus de vacuna (Husain et al.2007 en Virology 366, 424-432). La proteína A34R, junto con las proteínas A33R y B5R (Blasco et al 1993 en J Virol 67, 3319-3325; Katz et al.2002 en J Virol 76, 11637-11644; Meiser et al.2003 en J Gen Virol 84, 1383-1392), modula la velocidad a la que el virus de cubierta celular (CEV) se separa de la célula productora.

Un virus de MVA con las mutaciones anteriores nunca se ha descrito anteriormente. Por lo tanto, los pases de MVA en los cultivos en suspensión químicamente definidos de una línea celular estable aviar mejoró la entidad infecciosa real, el virus maduro, por los cambios en dos proteínas integrales, los productos del gen A3L y A9L. Estos cambios aumentan la infectividad, mejoran las tasas de maduración, y/o aumentan la estabilidad en un ambiente que no contiene los componentes de estabilización esperados de suero. Además, se detectó una mutación puntual en el producto del gen A34R que modula propiedades de la forma extracelular del virus. Este cambio aumentar las tasas de separación y disminuyen la estabilidad de la envoltura viral exterior que enmascara la infectividad de la partícula madura.

Ejemplo 3: Experimentos de confirmación Para impedir los artefactos de secuenciación como una explicación del descubrimiento inesperado, se han realizado experimentos de confirmación. Para confirmar la presencia de MVA-CR en la preparación, se diseñaron cebadores para la amplificación de todos los marcos de lectura abiertos afectados, para las reacciones de secuenciación adicionales. La PCR se realizó con ADN polimerasa KOD HiFi (TOYOBO Novagen) 36 ciclos de 20 s, 55°C de recocido, 60 s 72°C de amplificación (120 s para A3L), y 20 s 94°C de desnaturalización. Los cebadores (f = delantero y r inverso) para la amplificación de la secuencia de codificación de A9L fueron GCAAACGCGATAAGGATACG (a91f) (SEC ID NO: 19) y AAGCGGATGCAGAATAGACG (a91r) (SEC ID NO: 20) y de A34R fueron gCggAATCATCAACACTACCC (a34rf) (SEC ID NO: 21) y TAATAACAAACgCggCgTCCATggC (a34rr) (SEC ID NO: 22). La secuenciación del marco de lectura abierto A3L bastante grande se extendió con varios cebadores: la amplificación se realizó con GCAGAAGAACACCGCTTAGG (a31f) (SEC ID NO: 23) y ATGGAAGCCGTGGTCAATAG (a31r) (SEC ID NO: 24), la secuenciación se preforman con TGAGAGCTCGCATCAATC (a31f2) (SEC ID NO: 25), ATCGGACTGTCGGATGTTGTG (a31f3) (SEC ID NO: 26) y CTAGAATCGGTGACCAACTC (a31r3) (SEC ID NO: 27).

Casualmente, la mutación D86Y en A34R introduce un sitio blanco para la enzima de restricción Accl: de ccggatact a ccG/TATACt (negrita para la mutación, letras en mayúsculas con el sitio blanco de restricción). Al mismo tiempo, el sitio BsaWI de la de tipo salvaje se pierde por la mutación D86Y, desde agA/CCGGAt a agaccgtat. La digestión del amplicón A34R de 772 pb con Accl produce 399 y 373 pb para el MVA parental, y 399, 316 y 57 pb para MVA-CR. Por el contrario, la digestión con BsaWI produce 452 y 320 pb para MVA parental y 772 pb para MVA-CR. Los fragmentos se separaron por electroforesis en gel agarosa al 3% en el amortiguador TAE.

La Figura 3D muestra que la mutación en D86Y A34R es parte de la población MVA-CR11. También se obtuvo de forma independiente en los linajes X14. Este resultado confirma que la mutación descubierto en la presente no es un evento de oportunidad, sino que se conecta con el medio ambiente, en efecto, durante la replicación del virus.

También confirmaron estos resultados sorprendentes por secuenciación convencional de los fragmentos amplificados. Debido a que la secuenciación intencionalmente se realizó directamente en las reacciones de PCR purificadas sin subclonación, se esperan que los cromatogramas mostrados en las Figuras 4A y 4B reflejen la secuencia promedio, es decir, no sólo la secuencia más abundante, sino también la presencia de variaciones de la secuencia. La purificación de la reacción de PCR se realizó mediante la resolución de los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa, la escisión de la porción de gel que contiene la señal prominente única, y el aislamiento de la mezcla de ADN en el mismo usando el kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuenciación también se realizó con los mismos cebadores usados para la amplificación.

Se confirmó la presencia de las tres mutaciones observadas en MVA-CR11 y en el linaje independiente X14. Ejemplo 4: Aislamiento y purificación de la nueva cepa MVA-CR Para obtener un virus de MVA-CR puro, se realizó la purificación de placas: lxlO6 células de CR adherentes se sembraron por pozo de una placa de 6 pozos en medio DMEM:F12 que contiene 5% de FCS (Biochrom). Después de 24 h, sólo se adicionó 104 pfu total de MVA-CR16, es decir, un descendiente de MVA-CR11 que había sido pasado durante 5 generaciones adicionales en cultivos en suspensión CR químicamente definidos. Para infectar con un bajo número de unidades infecciosas permite obtener placas bien separadas. Después de 30 minutos, se reemplazó el medio de cultivo con 0.8% de agarosa de baja gelificación (Sigma # A9045) en medio DMEM:F12 que contiene 5% de FCS. La superposición de agarosa evita la difusión de virus de la progenie liberado por la monocapa infectada, de modo que las placas individuales no se contaminan de forma cruzada. El recubrimiento también permite el aislamiento de virus de la progenie por la recuperación de los pequeños (aproximadamente 2 mm de diámetro) núcleos de agarosa con una aguja hueca. Tales núcleos de agarosa se recogieron de los focos de efecto citopático y se transfirieron a una monocapa de células adherentes fresca a 80% de máxima confluencia en placas de 12 pozos, cada núcleo de agarosa en un pozo separado. El virus se difunde fuera del núcleo de agarosa, infecta las células en el pozo, y el virus obtenido por este procedimiento se considera purificada, ya que es (en teoría) derivado de una sola placa inicial. Sin embargo, algunos virus tienden a agregarse, un problema también encontrado con los poxvirus, de modo que un cultivo hospedador particular puede infectarse con una mezcla de virus. Como se muestra en la Figura 4, el aislado #9 de esta preparación eliminado por 17 generaciones de MVA-A2 (aquí denominado MVA-CR17*, con un asterisco para indicar la purificación de placas como la manipulación adicional) se considera puro y se eligió para la purificación adicional de la placa. La segunda ronda dio los genotipos A34R deseados. El aislado #1 de esta segunda ronda se eligió y se amplificó en los cultivos de CR químicamente definidos. Los genes A3L, A9L y A34R se secuenciaron directamente de PCR sin ninguna subclonación de los fragmentos y reveló una población nueva, pura y única.

En resumen, mediante el aislamiento repetido del virus derivado de un proceso químicamente definido en una línea celular inmortal, se obtuvo y purificó adicionalmente una nueva cepa de virus de vacuna, con la cepa de acuerdo con el significado de la definición microbiológica "los descendientes de un solo aislamiento en el cultivo puro [...] que se puede distinguir de otros aislados [...] por las características fenotípicas y genotípicas "(van Belkum et al. 2007 en Clin Microbiol Infect 13 Suppl 3, 1-46). Se llama esta cepa MVA-CR. El primer miembro totalmente purificado, tangible de esta cepa es MVA-CR19, y las características distintivas son por lo menos una de las mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en C1915T en A3L, A223G en A9L y G256T en los genes A34R, todos los números se refieren a la hebra de codificación.

Ejemplo 5: Propiedades de MVA-CR (rendimiento) El rendimiento de una preparación que contiene MVA-CR es mayor en casi 10 veces comparado con una población que contiene la cepa parental. Esta es una propiedad extremadamente importante. La hiperatenuación de las vacunas a base de MVA es una característica de seguridad importante, pero es a costa del requerimiento de la dosis: 108 unidades infecciosas de MVA por vacunación se estiman que son requeridos para la estimulación eficiente del sistema inmunológico (Coulibaly et al.2005 en Virology 341, 91-101; Gilbert, et al. 2006 in Vaccine 24, 4554-4561) y para programas globales contra las enfermedades infecciosas, cientos de millones de dosis de los poxvirus altamente atenuados pueden requerirse anualmente. Por comparación, las cepas menos atenuadas con potencial de replicación limitado también producidas en células aviares incluyen las vacunas contra el sarampión, paperas y la fiebre amarilla; estos requieren solamente 103 a 5.5xl04 unidades infecciosas por dosis (información de los prospectos de YF-VAX® de Sanofi Pasteur y MMR®II de Merck). La dosis protectora de la cepa de vacuna Dryvax en la vacunación rutinaria contra la viruela es de 2.5xl05 unidades infecciosas (Rotz et al. 2001 en MMWR Reco Rep 50, 1-25; cuestionario CE21-27), 400 veces menor que la dosis recomendada para las vacunas a base de MVA. Por lo tanto, para alcanzar todos los vacunados destinados, se requerirán nuevos sistemas de producción altamente eficientes y robustos para vacunas a base de MVA, y se requieren nuevas cepas de MVA para complementar los avances teenológicos.

Ejemplo 6: Propiedades de MVA-CR (escapar de células hospederas) Otra propiedad igualmente importante pertenece a la pureza de la preparación del virus. Para cualquier vacuna derivada de una línea celular continua, se requiere la purificación de la preparación para agotar los componentes derivados de células hospedadoras. Con respecto al ADN residual, un nivel máximo de 10 ng por dosis (Hess et al. 2012 en Vaccine 30, 2715-2727) se considera aceptable. Una parte considerable de MVA convencional se asocia altamente a las células. Las nuevas mutaciones que se han identificado facilitan la liberación del virus y la disociación de la célula hospedera. La desestabilización de la membrana externa de EEV condujo a una mayor fracción de unidades infecciosas reales del virus (viriones que corresponden al IMV) presentes en el volumen extracelular.

Para propósitos de confirmación, se llevó a cabo una "prueba cometa" como se describió anteriormente para los virus de la vacuna no atenuadas (Mcintosh and Smith 1996 en J Virol 70, 272-281). Esta prueba visualiza la capacidad de un virus para escapar de la célula hospedera: las placas circulares indican una fuerte asociación celular, mientras que las placas de cometa alargadas sugieren que los virus de la progenie se disocian de la célula hospedera para iniciar la infección en los sitios más lejanos. En estos experimentos, lxlO6 células CR adherentes ó 1.5xl06 R05T se sembraron en un matraz T25. R05T es una línea celular obtenida por inmortalización de células primarias de Egyptian rousette. Esta es una de las muy pocas líneas celulares de mamíferos permisivas para MVA (Jordán, et al. 2009 en Virus Res 145, 54-62) y sirve como referencia en los experimentos descritos en la presente. Después de 24 h, se adicionaron 50,000 pfu de MVA-A2 o MVA-CR19. Los matraces se pusieron en una incubadora y se mantuvieron en reposo durante por lo menos 72 h para garantizar que se reinfecta el virus liberado en la vecindad inmediata, de modo que aún se puede asociar con la placa primaria. La monocapa celular se fija mediante la adición de 0.2 volúmenes de 10% de formaldehído en PBS directamente al medio. Como se muestra en la Figura 5, después de la tinción con cristal violeta al 0.05% (Sigma) en agua, son visibles diferentes morfologías de placa de MVA-A2 y MVA-CR 19 incluso a simple vista.

La Figura 6 muestra placas típicas a una ampliación inicial 40 x en monocapas de CR y células R05T infectadas con MVA-A2, MVA-CR11 o MVA-CR19. En esta mayor ampliación, se observó más claramente la mayor atenuación de MVA-CR19 en R05T y se confirmó la presencia de las placas prominentes causadas por MVA-CR19 en células CR.

A continuación se examinó si el fenotipo de la placa en cultivos adherentes es una indicación de una mayor movilidad viral también dentro de cultivos químicamente definidos. Por lo tanto, se infectaron cultivos de suspensión CR.pIX con los aislados MVA-A2 y MVA-CR19 como se describe en el ejemplo 1, pero esta vez se centrifugaron las muestras durante 5 minutos a 200 xg para obtener un sobrenadante libre de células (abreviado "SN"). El sedimento de células se descartó y el virus en el SN se sometió a tres ciclos de congelación/descongelación (-85°C/37°C) para romper la membrana exterior de EEV para aumentar la infectividad.

Además, se probó la replicación del virus también en un proceso monofásico solamente en medio de proliferación celular CD-U3 sin la adición del medio de producción del virus CD-VP4. Se ha demostrado previamente que un proceso bifásico, donde se adiciona CD-VP4 en el momento de la infección, aumenta los rendimientos de los poxvirus significativamente hiperatenuados (Jordán, et al. 2011 en Biologicals 39, 50-58). Por esta razón, fue muy sorprendente que una comparación de la cinética de replicación, como se muestra en la Figura 7A, indicara que el aislado MVA-CR19 se replica con la misma eficiencia en el proceso monofásico que en el ambiente bifásico (curvas grises). Para MVA-A2, las diferencias de por lo menos 10 veces (curvas negras, los símbolos abiertos para el proceso monofásico).

Por lo tanto, se han obtenido las mutaciones de ganancia de función que facilitan la liberación de MVA a partir de la célula hospedera. Esto se confirma en los datos mostrados en las Figuras 7A y 7B también cuando se compara unidades infecciosas en el sobrenadante (SN) y en el lisado completo. Para la tabla en el panel B, 48 h post-infección se probó no solamente de SN, sino también de un lisado sonicado de la suspensión celular completa. Un mayor porcentaje de virus MVA-CR19 infeccioso está en el compartimiento libre de células (74.0% en el proceso monofásico, 37.5% en el proceso bifásico) en comparación con MVA-A2 (3.6% y 4.9%, respectivamente).

El hecho de que más virus MVA-CR19 sea atrapado en las células hospederas en presencia del medio de la producción de virus, es consistente con la intención para inducir agregados celulares para facilitar la propagación del virus de célula a célula. Esta observación también se confirma en cultivos adherentes que se muestran en la Figura 8, donde la liberación de MVA-CR19 en comparación con MVA-A2 se facilita en todas los cultivos probados, aunque con diferencias mucho menos pronunciadas. Como se discutió anteriormente, la membrana exterior de la EEV interfiere con la infectividad de MVA y una razón para el aumento de la infectividad extracelular de MVA-CR se debe a la disminución de la estabilidad de este componente. Sin agitación y en presencia de virión de estabilización de suero fetal bovino, esta membrana exterior de MVA-CR19 se retiene durante intervalos de tiempo mayores, nivelando esta ventaja potencial de MVA-CR19. Además, las concentraciones de cationes divalentes se elevan en los medios diseñados para los cultivos adherentes, ya que se conoce que promueven la adhesión celular (Attramadal 1969 en J Periodontal Res 4, 166). Aumento de la concentración de Mg2+ y Ca2+, probablemente, también fortalece la asociación de las cápsides del virus a las membranas plasmáticas, nuevamente nivelando cualquier ventaja que se observó para MVA-CR en cultivos en suspensión químicamente definidos.

De esta manera, MVA-CR19 ha ganado un aumento en la capacidad para escapar de la célula hospedera. Completamente inesperado y sorprendente, sin embargo, es la tendencia clara que con el aumento de la pureza de la cepa MVA-CR (que se ha obtenido con el aislado MVA-CR19) la atenuación en la línea celular R05T parece aumentar, manifestada por focos totalmente confinados en esta línea celular. Las propiedades son extremadamente valiosas: la nueva cepa MVA-CR sigue siendo altamente atenuada y, al mismo tiempo, escapa más fácilmente de la célula productora. Un aumento de la fracción de virus extracelular facilita la purificación enormemente como los sobrenadantes libres de células, en lugar de que puedan usarse los U sados de células enteras como la cosecha a granel. Además, los verdaderos procesos de producción monofásicos son posibles: MVA-CR puede ser producido a títulos altos en el mismo medio de cultivo que también se usa para la proliferación celular. Excepto para la adición de pequeños volúmenes (menos de 5 a 20% del volumen de cultivo) de la alimentación para proporcionar la glucosa y otros nutrientes, o para regular el pH, ya no se requiere del medio de producción de virus.

Ejemplo 7: Propiedades de MVA-CR (especificidad para el proceso químicamente definido) Para caracterizar adicionalmente las presiones selectivas que accionan la emergencia de la cepa MVA-CR, también se aislaron las generaciones sucesivas de MVA a partir de líneas celulares adherentes CR y R05T en un experimento que refleja el experimento inicial descrito en el Ejemplo 1. La línea celular adherente CR se ha usado para examinar si la emergencia de MVA-CR también está influenciada por las características de la célula hospedera, además de las condiciones de cultivo. R05T como una línea celular de mamífero, incluso MVA permisiva, sirve como una referencia, nuevamente probando la especificidad de la selección y la estabilidad de MVA parental.

Para este experimento, 1.5xl06 células de CR.pIX y 1x106 de R05T se sembraron en matraces T25 para cada generación. La infección se realizó a una MOI estimada de 0.1. El virus de entrada real, tal como se determina por titulación en etapas posteriores se muestra en la Figura 9A. Para las generaciones de virus secuenciales, los cultivos de CR con efecto citopático completo se recuperaron de 48 h a 72 h post-infección y los cultivos R05T de 72 h a 96 h. El virus se liberó a partir del lisado por sonicación como se describe en el ejemplo 1.

La Figura 9B representa la amplificación del virus a través de la relación de virus de entrada a la progenie del virus liberado para cada generación obtenida de cultivos de CR en suspensión, CR adherente o R05T adherente, respectivamente. Los datos para el cálculo de la amplificación en suspensión se obtienen a partir del primer experimento descrito en el ejemplo 1. Las líneas de regresión lineal de los tres experimentos indica que la eficiencia de la replicación del virus aumenta con el número de generación que sugiere cierta adaptación del MVA en los tres sistemas. El efecto parece ser mayor en las células de R05T de mamífero, que también se remueven más alejado del hospedador de pollo afín de MVA.

Sin embargo, una confirmación verdaderamente sorprendente y extremadamente fuerte de este estudio es el hecho de que aunque MVA se adapta a los cultivos dependientes del suero, el genotipo G256T en A34R no emerge y acumula en cualquiera de estos dos sistemas. Esto se muestra de forma concluyente en la Figura 9C, con el mismo método establecido en el ejemplo 3.

Las observaciones mostradas en la Figura 9C han sido confirmadas por secuenciación de los genes A3L, A9L y A34R. Como se muestra en la Figura 10, no hay indicaciones en absoluto de que el nuevo genotipo de MVA-CR surge o emerge en los virus pasados en las líneas de células adherentes derivadas de pato o del murciélago de la fruta.

El aumento secuencial de la tasa de amplificación es el más grande para MVA derivado de R05T. Además, en la determinación de unidades infecciosas, se observó que la cepa de MVA-R, por ejemplo aislado de MVA-R18 mostrada en la Figura 11, produce una señal más fuerte y a menudo focos que implican más de una célula en comparación con MVA-B20 que se aisló en paralelo (las replicación de MVA es más rápida en las células CR que resultan en una ventaja de 2 generaciones al final de las 12 semanas del experimento). Los focos que implican varias células y una tinción más fuerte conduce a la conclusión de que la replicación se limita a la línea celular del indicador Vero generalmente no permisiva. La cepa de MVA-R, a diferencia de todas las cepas derivadas de CR examinadas en la presente (MVA-B, MVA-X, MVA-Y y MVA-CR adecuado) parece que es menos atenuada en un sistema de mamífero. Tal virus puede tener propiedades deseables distintas de la cepa MVA- CR: puede ser más inmunogénicos debido a la replicación limitada en el sitio de la infección y puede ser extremadamente adecuado como una estructura para las vacunas vectorizadas en animales (especialmente quirópteros que son difíciles de alcanzar la vacunación contra la rabia).

En resumen, la replicación de MVA en un cultivo en suspensión químicamente definido es la fuerza impulsora principal para la aparición de MVA-CR. Por lo general, las interacciones del parásito (virus) y el hospedador forman un ambiente selectivo. Sin embargo, en la presente el medio artificial químicamente definido, el cultivo en suspensión o la combinación de ambos (que cumple mejor con los requisitos para la producción industrial de una vacuna) es claramente la fuerza motriz principal en la transformación del genotipo inicial MVA de tipo salvaje hacia MVA- CR.

Ejemplo 8: Propiedades de MVA-CR: atenuación La atenuación describe cualquier pérdida de potencial de replicación de una población de virus, en comparación con la población parental. En comparación con el virus de vacuna, MVA ha perdido el potencial de replicarse en la mayoría de células de mamíferos, especialmente en células de primates (incluyendo humanos). Esta propiedad es una característica importante que permite la aplicación de MVA como el vector de vacuna también en receptores humanos inmunocomprometidos.

Para probar si la atenuación de la MVA-CR se ha mantenido, se infectaron monocapas adherentes de CR, las líneas celulares Vero y R05T con MVA-A2, MVA-CR11 y MVA-CR19. Las células se sembraron con 5x10s (CR), 2xl05 (R05T), y lxlO5 (R06E y Vero), respectivamente, por pozo de una placa de 6 pozos y MVA se adicionó a una MOI de 0.1. El lisado celular se preparó mediante la congelación de las placas y sonicación de un lisado de descongelado de los mismos, en los puntos de tiempo indicados. Todas las muestras se almacenaron a -85°C y al final del experimento se titularon juntos en una prueba de microfoco en células Vero como se describió anteriormente. Los datos de replicación en las Figuras 12A-12C confirman que la cepa MVA-CR es totalmente atenuada y no se replica en Vero, se replica muy lentamente en R06E (también una línea celular de la Egyptian rousette), moderadamente en R05T y con muy cultivos de CR de altas productividades. Un fenotipo de replicación similar se ha confirmado previamente por MVA-A2 (Jordán et al., 2012 en Viruses 4, 889-900).

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Virus de Ankara de vacuna modificada (MVA), caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto del gen A3L y/o un producto del gen A34R, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácido de tal producto del gen.

2. El virus de MVA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico además codifica un producto del gen A9L, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácido de tal producto del gen.

3. El virus de MVA de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque: (i) el virus comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto del gen A3L y un producto del gen A9L, en el que la secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácido de tales productos de genes, o (ii) el virus comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto del gen A34R y un producto del gen A9L, en el que la secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácido de tales productos de genes.

4. El virus de MVA de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto del gen A3L, un producto del gen A34R y un producto del gen A9L, en donde tal secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácido de tales productos del gen.

5. El virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque: (i) la modificación de la secuencia de aminoácido está en una región de aminoácidos que abarca las posiciones 634 a 644 del producto del gen A3L, de acuerdo con la SEC ID NO: 1 o las posiciones de aminoácidos correspondientes a la misma, (ii) la modificación de la secuencia de aminoácidos está en una región de aminoácidos que abarca las posiciones 81 a 91 del producto del gen A34R, de acuerdo con la SEC ID NO: 2 o las posiciones de aminoácido correspondientes a la misma, y/o (iii) la modificación de la secuencia de aminoácidos está en una región de aminoácidos que abarca las posiciones 70 a 80 del producto del gen A9L de acuerdo con la SEC ID NO: 3, o las posiciones de aminoácidos correspondientes a los mismos.

6. El virus de MVA de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque: (i) la modificación de la secuencia de aminoácidos está en la posición del aminoácido 639 del producto del gen A3L, (ii) la secuencia de modificación de aminoácidos está en la posición del aminoácido 638 del producto del gen A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma, (iii) la modificación de la secuencia de aminoácido está en la posición de aminoácido 86 del producto del gen A34R o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma, (iv) la modificación de la secuencia de aminoácido está en la posición del aminoácido 75 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma, y/o (v) la modificación de la secuencia de aminoácido está en la posición de aminoácido 74 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma.

7. El virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque la modificación de la secuencia de aminoácido es una eliminación de aminoácido o reemplazamiento de aminoácido, en donde: (i) H en la posición de aminoácido 639 del producto del gen A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma se elimina o se reemplaza por un aminoácido hidrófobo, de preferencia A, V, I, L, M, M, Y o W, un aminoácido negativo, de preferencia D o E, o un aminoácido polar no cargado, preferentemente S, T, N o Q, (ii) R en la posición del aminoácido 638 del producto génico A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma se elimina o se sustituye por un aminoácido hidrófobo, preferentemente A, V, I, L, M, F, Y o W, un aminoácido negativo, de preferencia D o E, o un aminoácido polar no cargado, preferentemente S, T, N o Q, (iii) D en la posición de aminoácido 86 del producto del gen A34R o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma se elimina o se sustituye por un aminoácido hidrófobo, de preferencia A, V, I, L, M, F, Y o W, un aminoácido positivo, de preferencia R, H o K, o un aminoácido polar no cargado, de preferencia S, T, N o Q, (iv) K en la posición del aminoácido 75 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma que se elimina o se sustituye por un aminoácido hidrófobo, de preferencia A, V, I, L, M, F, Y o W, un aminoácido negativo, de preferencia D o E, o un aminoácido polar no cargado, de preferencia S, T, N o Q, y/o (v) K en la posición de aminoácido 74 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma que se elimina o se sustituye por un aminoácido hidrófobo, de preferencia A, V, I, L, M, F, Y o W, un aminoácido negativo, de preferencia D o E, o un aminoácido polar no cargado, de preferencia S, T, N o Q.

8. El virus de MVA de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el reemplazamiento de aminoácido está en un reemplazamiento de aminoácido de: (i) H en la posición amino ácido 639 del producto del gen A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y (mutante del producto del gen H639Y A3L), (ii) R en la posición del aminoácido 638 del producto de gen A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y (mutante del producto del gen R638Y A3L), (iii) D en la posición amino ácido 86 del producto del gen A34R o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y (mutante del producto del gen D86Y A34R), (iv) K en la posición del aminoácido 75 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por E (mutante del producto del gen K75E A9L), y/o (v) K en la posición de aminoácido 74 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por E (mutante del producto del gen K74E A9L).

9. El virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque el reemplazamiento de aminoácido es un reemplazamiento de aminoácido de: (i) H en la posición del aminoácido 639 del producto de gen A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y y D en la posición de aminoácido 86 del producto del gen A34R o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y (mutante del producto del gen H639Y A3L/D86Y A34R), (ii) H en la posición del aminoácido 639 del producto del gen A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y y K en la posición del aminoácido 75 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por E (mutante del producto del gen H639Y A3L/K75E A9L), (iii) D en la posición de aminoácido 86 del producto del gen A34R o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y y K en la posición del aminoácido 75 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por E (mutante del producto del gen A34R D86Y/K75E A9L), o (iv) H en la posición del aminoácido 639 del producto del gen A3L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y, D en la posición de aminoácido 86 del producto del gen A34R o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por Y, y K en la posición del aminoácido 75 del producto del gen A9L o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma por E (mutante del producto del gen H639Y A3L/D86Y A34R/K75E A9L).

10. El virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque: (i) el producto del gen A3L con la mutación H639Y tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEC ID NO: 4 o es una variante del mismo que es por lo menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos, en donde la variante comprende el aminoácido Y en la posición de aminoácido 639 o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma, (ii) el producto del gen A34R con la mutación D86Y tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 5 o es una variante del mismo que es por lo menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos, en el que la variante comprende el aminoácido Y en la posición de aminoácido 86 o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma, y/o (iii) el producto del gen A9L con la mutación K75E tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 6 o es una variante del mismo que es por lo menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos, en donde la variante comprende el aminoácido E en la posición del aminoácido 75 o en una posición de aminoácido correspondiente a la misma.

11. El virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque además comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga.

12. El virus de MVA de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico heteróloga se selecciona de una secuencia que codifica un antígeno, particularmente un epítopo de un antígeno, un compuesto de diagnóstico o un compuesto terapéutico.

13. El virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el virus es capaz de la replicación productiva en células aviares.

14. El virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el virus no es capaz de la replicación productiva en células de primates, más preferentemente células humanas.

15. Genoma del virus de MVA, caracterizado porque es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

16. Célula, caracterizada porque comprende un virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14 o un genoma de conformidad con la reivindicación 15.

17. La célula de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque es una célula no adherente/en suspensión.

18. La célula de conformidad con la reivindicación 16 ó 17, caracterizada porque es una célula aviar.

19. Método para cultivar un virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) proporcionar una célula de conformidad con las reivindicaciones 16 a 18. (ii) cultivar la célula, y (iii) aislar el virus de MVA.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la célula se cultiva en un medio de proliferación celular y, subsecuentemente en un medio de producción de virus o la célula se cultiva exclusivamente en un medio de proliferación celular.

21. El método de conformidad con las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizado porque el virus de MVA se aísla del sobrenadante libre de células y/o lisado celular.

22. Método para producir un virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) infectar una célula con un virus de MVA, (ii) cultivar la célula, (iii) aislar el virus de MVA, y (iv) repetir las etapas (i) a (iii) con el virus de MVA aislado en la etapa (iii) hasta que se detecta un virus de MVA que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto génico A3L y/o un producto del gen A34R, en donde tal secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácidos de tal producto(s) de genes.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque las etapas (i) a (iii) se repiten hasta un virus de MVA que comprende una secuencia de ácido nucleico que además codifica un producto del gen A9L, en donde se detecta la secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una mutación que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácido del producto del gen.

24. El método de conformidad con las reivindicaciones 22 ó 23, caracterizado porque la célula se cultiva en un medio de producción de virus.

25. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14 o un genoma de conformidad con la reivindicación 15, y uno o más excipientes, diluyentes y/o vehículos aceptables farmacéuticos.

26. Vacuna, caracterizada porque comprende un virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14 o un genoma de conformidad con la reivindicación 15.

27. Virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14 o un genoma de conformidad con la reivindicación 15, para usarse en medicina.

28. El virus de MVA o el genoma de conformidad con la reivindicación 27, para usarse en la vacunación.

29. Virus de MVA que comprende una secuencia de ácido nucleico, caracterizado porque el gen de A3L y/o el gen de A9L se elimina funcionalmente.

30. El virus de MVA de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el gen de A34R además se elimina funcionalmente.

31. El virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 29 ó 30, caracterizado porque el gen eliminado funcionalmente se reemplaza por una secuencia de ácido nucleico heteróloga.

32. El virus de MVA de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico heteróloga se selecciona de una secuencia que codifica un antígeno, particularmente un epítopo de un antígeno, un compuesto de diagnóstico o un compuesto terapéutico.

33. El virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 29 a 32, caracterizado porque el virus comprende un producto del gen A3L, un producto del gen A9L y/o un producto del gen A34R, en donde el producto del gen comprende preferentemente una modificación de la secuencia de aminoácido.

34. Célula, caracterizada porque comprende un gen de A3L, gen de A9L y/o A34R de un virus de MVA y que expresa tales genes.

35. La célula de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque: (i) el gen de A3L del virus de MVA comprende por lo menos una mutación que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácido del producto del gen, (ii) el gen de A9L del virus de MVA comprende por lo menos una mutación que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácido del producto del gen, y/o (iii) el gen de A34R del virus de MVA comprende por lo menos una mutación que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácido del producto del gen.

36. La célula de conformidad con las reivindicaciones 34 ó 35, caracterizada porque además comprende un virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 29 a 33.

37. La célula de conformidad con las reivindicaciones 34 a 36, caracterizada porque es una célula aviar.

38. Molécula de ácido nucleico, caracterizada porque comprende un gen de A3L, gen de A9L y/o gen de A34R de un virus de MVA, en donde los genes se enlazan operablemente a una secuencia de ácido nucleico heteróloga.

39. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque: (i) el gen de A3L del virus de MVA comprende por lo menos una mutación que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácido del producto del gen, (ii) el gen de A9L del virus de MVA comprende por lo menos una mutación que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácido del producto del gen, y/o (iii) el gen de A34R del virus de MVA comprende por lo menos una mutación que resulta en una modificación de la secuencia de aminoácido del producto del gen.

40. Método para producir un virus de MVA recombinante, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) proporcionar una célula, (ii) introducir un virus de MVA de conformidad con las reivindicaciones 29 a 33 y una molécula de ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 38 ó 39 en la célula, y (iii) cultivar la célula bajo condiciones que permiten la recombinación homologa entre la secuencia de ácido nucleico del virus de MVA y la molécula de ácido nucleico obteniendo de este modo el virus de MVA recombinante.