CN1723285B - 重组的mva及其产生方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可用于产生重组的MVA病毒的MVA突变体，以及被这些突变的MVA病毒感染的宿主细胞。本发明进一步涉及DNA-载体构建体，以及利用这些突变的MVA病毒和DNA-载体构建体产生重组MVA的方法。

Description

重组的MVA及其产生方法
技术领域
本发明涉及可用于产生重组的MVA病毒的MVA突变体，以及被该突变的MVA病毒感染的宿主细胞。本发明进一步涉及DNA-载体构建体，以及用该突变的MVA病毒和该DNA-载体构建体构建重组MVA的方法。 
背景技术
牛痘病毒(VV)属于痘病毒科(poxviruses)正痘病毒属(Orthopoxvirus)。牛痘病毒的某些毒株例如英国Lister研究所的Elstree株作为预防天花的活疫苗已经应用了许多年。由于接种疫苗可能引发并发症(Sch
Figure 10003_0
r，Zeitschr.FürPr
Figure 10003_1
ventivmedizin 18，41-44[1973])，并且1980世界卫生组织(WHO)宣布天花已经被消灭，所以如今只有高危人群才接种以预防天花。 
牛痘病毒已经被用作生产和传输外源抗原的载体(Smith等，Biotechnologyand Genetic Engineering Reviews 2，383-407[1984])。在DNA重组技术的辅助下，这使得可以将编码外源抗原的DNA序列(基因)引入到牛痘病毒基因组中。如果该基因在病毒DNA的整合位点对于牛痘病毒的生命周期不是必需的，那么产生的重组牛痘病毒就可能是有侵染性的。也就是说可以侵染外源细胞并且表达所整合的基因(欧洲专利申请No.83,286和No.110,385)。这样产生的重组病毒一方面可以用作预防感染的活疫苗，另一方面也可以用来在真核细胞中生产外源蛋白。 
牛痘病毒是被最广泛评估的活的载体，并且它所具有的高度稳定、操作廉价、便于管理、可以容纳大量的外源DNA的独特的性质也支持它被用作重组疫苗。牛痘病毒载体具有既可以诱导抗体反应又可以诱导细胞毒素反应的优点， 可以以一种更为自然的方式向免疫系统提供抗原，并且在多种的动物模型中成功地作为载体疫苗用于传染病的免疫保护。此外，牛痘病毒载体还是非常有价值的研究工具，它可以用来分析重组蛋白的结构-功能关系、鉴定体液和细胞介导的免疫反应的靶标、鉴别抗特定疾病免疫防御的类型。 
然而，牛痘病毒对人是有传染性的，并且出于安全性的考虑和规章制度，牛痘病毒作为表达载体在实验室中的使用受到了很大地影响。此外，重组牛痘病毒将来可能的应用，例如生产用于人类的新的治疗或预防方法的重组蛋白或重组病毒粒子，很可能由于重组牛痘病毒载体多产的复制而受到阻碍。文献中报道的大多数重组牛痘病毒都是基于牛痘病毒的西里瑟夫(Western Reserve，WR)毒株。另一方面，已知该毒株有很强的神经毒性，因此不适合用于人和动物(Morita等，Vaccine 5，65-70[1987])。 
出于对牛痘病毒标准毒株安全性的考虑，已经从高度减毒的病毒毒株中开发了牛痘载体。这些减毒的病毒毒株已被鉴定具有有限的体外复制能力，和体内无毒性。这些毒株需专门培养以避免出现不希望的副作用，这是早已知道的。因而，通过将牛痘病毒的安卡拉毒株(CVA)在鸡胚成纤维细胞中经过长时间的连续传代就可能培育出修饰的安卡拉牛痘病毒(modified vaccinia virus Ankara，MVA)(参见Mayr，A.，Hochstein-Mintzel，V和Stickl，H.(1975)Infection 3，6-14；瑞士专利No.568392)。该MVA病毒按照布达佩斯条约的要求在CNCM(法国国家微生物保藏中心，Institut Pasteur，Collectione Nationale de Cultures deMicroorganisms，25，rue de Docteur Roux，75724Paris Cedex 15)于1987年12月15日进行保藏，保藏号为I-721。 
该MVA病毒已被分析，以鉴定其相对于野生型CVA病毒在基因组上的变化。已经确定存在六个主要的缺失(缺失I、II、III、IV、V和VI)(Meyer，H.，Sutter，G.Mayr A.(1991)J.Gen.Virol.72，1031-1038)。这个修饰的安卡拉牛痘病毒只有很低的毒性，也就是说用于免疫接种时不具有副作用。因而特别适合无免疫应答的受试者的初次免疫。MVA毒株的卓越品质已被大量的临床试验所证明(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.I，Abt.Org.B 167，375-390(1987)，Stick等，Dtsch. med.Wschr.99，2386-2392，[1974])。 
作为用于表达重组基因的安全的病毒载体，修饰的安卡拉牛痘病毒(MVA)是一个有价值的工具，并且，还可以用于其它不同的目的，如在体外研究蛋白质功能，或在体内诱导产生抗原特异性的细胞免疫反应或体液免疫反应。MVA最主要的优点是即使在人类和大多数哺乳动物细胞中有复制缺陷的，但仍能进行基因的高水平表达。作为一种疫苗，MVA有很好的安全记录，能在生物安全I级的条件下操作，并已证明，当在动物体内提供异源抗原时，可产生免疫性和保护性(1-8)，其作为人类首选的疫苗已经进入到临床阶段(9-11)。 
而对于新构建体进行评估的需要不断增加，当与有复制能力的重组牛痘病毒相比较时，MVA载体的产生是不同的，这是由于该病毒的生长缺陷以及减少的细胞病变效应。因而需要快速简易的重组MVA的构建方法，以允许对多个候选的构建体进行比较评估。 
与亲代毒株相比，MVA有大约有占其基因组15％的缺失(30,000个碱基对)，包括K1L基因的大部分。仅有263bp长度的片段依然存在于MVA基因组中。正如在1998年Antoine，G.，F.Scheiflinger，F.Dorner和F.G.Falkner所描述的，MVA的K1L基因序列对应于其基因组上20685-20981位之间的022L开放阅读框的前263个碱基对。该修饰的安卡拉牛痘病毒的全基因组以及它与其它正痘病毒基因组的比较可以在《病毒学》(Virology)244：365-396中找到。 
以前，已经开发了一种简易高效的构建重组MVA的方法。该方法基于对牛痘病毒宿主范围基因K1L的短暂表达的选择。该方法基于通过短暂的宿主范围基因表达选则重组MVA(12)，以牛痘病毒K1L基因功能作为MVA能够在兔肾细胞系RK-13中存活的严格标记物。描述了构建体和新MVA载体质粒的使用，在所述质粒上携带有一个牛痘病毒宿主范围基因K1L的表达框架，作为短暂的可选择的标记。这些质粒既允许在MVA基因组上稳定地插入增加的重组基因，也允许对MVA基因组序列进行精确的靶向突变。重复DNA序列连接在K1L基因的两侧，被设计用来在非选择培养条件下通过同源重组从病毒基因组上除去标记基因。 
当上述选择的方法直接用于构建携带有包括来自水母Aequorea victoria的绿色荧光蛋白(gfp)的异源基因序列的多重重组MVA时，发明人发现一部分分离的重组MVA可以在RK-13细胞系中存活，但是不能表达感兴趣的目的基因。基于对分离的多重MVA分子水平的分析，发现了两个不同的导致目的基因不表达的原因：(i)在重组基因的插入位置只有标记基因K1L，并没有重组基因插入。(ii)MVA基因组的自然缺失II的区域被影响/截短(图1A)。第一种情形是由于首先在MVA基因组的侧翼I基因序列与现有技术中的转移质粒的侧翼I重复序列之间发生了一次单交叉(12)，接着又在残留的侧翼I序列间发生了一次同源重组，于是只有K1L标记序列稳定地插到了重组MVA基因组中。第二种情形是在MVA中与转移质粒中的K1L基因之间发生了同源重组。后一种重组的发生Tscharke和Smith也已经研究过(13)。 
因此，本发明的一个目的是为克服上述问题而提供一种改进的生产重组MVA的方法。本发明进一步的目的是提供可以被用于该重组方法的MVA突变体以及DNA-载体构建体。 
这体现在独立权利要求的主题中。本发明优选的实施例体现在从属权利要求中。 
发明内容
本发明提供了一种新的MVA突变体，其特征为该MVA的K1L基因序列(正如下面所定义的只包括一个片断)和优选的它的启动子序列或该启动子序列的一个功能部分已经通过在MVA基因组上引入突变或缺失，或同时引入突变和缺失而失活。 
正如上面所说到的，在MVA基因组(编码序列)中只提供K1L基因的264bp长度的片段。另外，相应的包括另外100bp的调控序列也被提供。该MVA K1L基因序列是MVA基因组上20685-20981之间的开放阅读框022L的一部分，正如Antoine，G.，F.Dorner，和F.G.Falkner在1998年所阐述的。这样就可以理解失活MVA K1L基因序列的一个功能部分和调控序列是完全可以达到本发明的目的。“失活”意味着在序列上的改变，以避免在MVA中的与转移质粒(DNA-载体构建体)上的K1L基因序列之间的同源重组，这样就避免了在MVA基因组的自然缺失II的区域引发的影响/截短(和导致目的基因不表达)。 
根据优选的实施方式，MVA的K1L基因，优选包括它的启动子序列，或该启动子序列的功能部分通过从病毒基因组缺失而失活。作为另一种备选方案，K1L基因功能缺陷的重组MVA可以通过序列突变来产生。例如插入突变，通过抑制K1L基因特异的同源重组使K1L基因失活。该重组的MVA可以成为方便的导入外源基因以及接下来筛选转染的毒株的方法，即，用于获得重组MVA的方法。 
正如前面所提到的，在MVA基因组中的失活通常意味着一定程度的失活，该失活导致避免MVA中和转移质粒(载体构建体)中的K1L基因的同源重组。在突变的情形下，本发明中失活的K1L序列与牛痘病毒(VV)中的K1L序列间的同源性低于50％，优选在10-50％之间，更优选在15-40％之间，最优选在20-30％之间。同源性为0的情况也可能存在。 
在缺失突变的情形中，所缺失的片断，至少包括MVA K1L基因的100bp，更优选包括150或200bp。如上面所说的，还可能缺失全部的264bp。此外，调控序列也应该缺失更大的程度，以避免同源重组的发生。K1L基因的编码区和调控序列完全缺失也是可能的(即，缺失约360bp)。 
使用最近建立起来的质粒DNA转染的方法用于被MVA感染的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)，随后在霉酚酸(mycophenolic acid)存在的情况下，通过用β-半乳糖苷酶筛选产生病毒(Sutter，G.和B.Moss.1992，PNAS USA 89：10847-10851)，从而产生具有从病毒基因组中删除K1L编码序列的突变MVA。 
本发明的原理是只要在RK-13细胞系中的MVA中不导入适当的DNA序列(K1L编码序列和或者任意地进一步的例如编码外源蛋白的DNA序 列)，复制就不发生。因此本方法/MVA突变体/DNA构建体是适于重组MVA的筛选。同时，它们也是产生MVA的有效工具。 
这里所采用的术语“重组的MVA”指的是那些经过例如DNA重组技术而被遗传改造的MVA，以及指的是被提供以用于诸如疫苗或是表达载体的用途的MVA。 
根据本发明，重组的MVA牛痘病毒可以通过下面的步骤制备。然而，应理解，本领域的技术人员能在本发明的范围内和运用他所具有的本领域的知识进行改变。此外，在此所引用的文献作为参考而全部引入。 
DNA构建体被导入到细胞，尤其是真核细胞中。优选鸟类、哺乳类和人类的细胞。该DNA构建体包括编码牛痘病毒(VV)K1L蛋白或K1L来源的多肽的DNA序列，以及编码外源多肽的DNA序列。上述两个DNA序列均被DNA序列侧面连接在非必需位点的侧面。所述的非必需位点，如MVA基因组中的缺失III等自然缺失区。优选的真核细胞是被本发明中的突变的MVA多产地感染的BHK-21(ATCC CCL-10)、BSC-1(ATCC CCL-26)、CV-1(ECACC 87032605)或者MA104(ECACC 85102918)细胞，并允许同源重组。进一步优选的宿主细胞是鸡的成纤维细胞，鹌鹑的成纤维细胞，QT-9细胞系，Vero细胞，MRC-5细胞，B-细胞或者是人的原发细胞(例如，原发成纤维细胞、树突状细胞)。 
正如上面所提到的，DNA构建体包括一个编码VV的K1L基因的序列或者是功能等效的基因的序列。在本发明中所说的功能等效是指与VV的K1L基因的核苷酸相比较包含一个或多个替换、插入、缺失的核苷酸，但不改变它的功能。这些缺失优选是1个核苷酸，但是也可以有2个、3个、4个或更多个核苷酸5’或3’或者在序列内部，或者这些核苷酸被其他的核苷酸所替代。根据本发明的这些VV的K1L等效蛋白编码的核酸可显示出和原始的VV的K1L基因的核苷酸例如至少有80％，更典型的为至少90％或是95％的序列一致性(如上所述)。 
在本文中，特别地，编码等效的VV的K1L蛋白的各种变化的VV的 K1L基因例如在序列中的缺失、插入和/或替换，被称为“沉默的”变化，这也被认为是本发明的一部分。 
例如，在核酸序列中的这种改变被认为引起一个等同的氨基酸的替代。优选的是，这样的氨基酸的替代是那种结构和化学性质相似的氨基酸之间的替换，即，保守性氨基酸的替换。 
氨基酸的替换可以依据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性(两性分子)的相似性来实现。例如，疏水性氨基酸有丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性和中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正(碱性的)电荷的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的氨基酸有天冬氨酸和谷氨酸。 
“插入”或“缺失”的数目通常是1到5个氨基酸。允许的变化的程度可以通过重组DNA方法在一个多肽序列上引入插入、缺失或替换的试验来决定。所得的变异体可以检测它们的生物活性。 
凡是影响蛋白质N端或C端部分的核苷酸的变化通常不会改变蛋白质的活性，因为这些部分通常不涉及生物活性。每一种建议的修饰均在现阶段现有技术的范围内，并且编码产物保持生物活性。 
如果DNA构建体被导入到真核细胞中，并且K1L编码DNA和外源DNA已经与病毒DNA重组，就可能通过在细胞中传代分离到期望的重组牛痘病毒MVA。这些细胞要求有K1L功能来支持病毒的生长，例如RK-13细胞。重组病毒的克隆可以通过已知的噬斑纯化的方式(Nakano等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，1593-1596[1982)；Franke等，Mol.Cell.Biol.1918-1924[1985]；Chakrabarti等，Mol.Cell.Biol.3403-3409[1985]；Fathi等，Virology 97-105[1986])。 
这些被插入的DNA构建体可以是线性的和环状的。环状的DNA优选被使用。特别优选使用质粒。 
这些DNA构建体可包含侧面连接如下位点的左侧和右侧的序列：在MVA基因组上非必需位点，例如缺失区III(Sutter，G.和Moss，B.(1992)Pr.C.Natl.Acad.Sci.USA 89，10847-10851)；MVA基因组上该设计的K1L缺失位点或任何根据本发明的突变MVA基因组内的非必需位点。
外源DNA序列可以被插到非必需位点，例如自然缺失区的两侧的序列之间。 
外源DNA序列可以是编码治疗性多肽的基因，治疗性多肽如分泌的蛋白质，例如：抗体的多肽、趋化因子(chemokines)、细胞因子(cytokines)或干扰素，或者是来源于病原体的可优选用作疫苗的多肽，或者用于生产有治疗或科研价值的多肽。病原体可理解为是能引起疾病的病毒、细菌、寄生虫，以及在生物体中无限增殖并可能导致病理生长的肿瘤。这些病原体的例子已被Davis，B.D.等人描述(《微生物》(Microbiology)，第三版，HarperInternational Edition)。优选的病原基因来源于流感病毒、麻疹和呼吸合胞病毒、登革热病毒、人类免疫缺陷病毒例如HIV I和HIV II、人类肝炎病毒例如HCV和HBV、疱疹病毒、乳头状瘤病毒、恶性疟原虫(malaria parasitePlasmodium falciparum)和引起肺结核的分枝杆菌(Mycobacteria)。 
优选的编码肿瘤相关抗原的基因来源于与黑色素瘤相关的鉴定抗原，例如酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白1和2；睾丸癌抗原，例如，MAGE-1、-2、-3和BAGE；在肿瘤中过表达的非突变型共用抗原(non-mutated sharedantigens)，例如，Her-2/neu，MUC-1和p53。 
为了使外源DNA序列或基因可以表达，必须在该DNA中提供调控序列，该调控序列是基因转录所必须的。该调控序列(被称作启动子)是本领域的技术人员已知的，例如，牛痘病毒特异性启动子，如在EP-A-198,328中所描述的牛痘11kD基因，和7.5kD基因(EP-A-110,385)或者允许启动牛痘病毒特异转录的异源痘病毒启动子，或者允许启动牛痘病毒特异转录的合成的启动子。 
根据优选的实施方式，本发明的DNA-载体构建体包括以下功能性连接的部分： 
-在其真正的启动子(K1L标记基因)，牛痘病毒特异启动子或者异源痘病毒启动子的转录调控下的VV的K1L编码序列 
-两个在K1L标记基因两侧的DNA序列用于随后通过同源重组从重组MVA中除去标记，优选的是两个相同的无活性的(例如，大肠杆菌lacZ基因来源的)DNA片段， 
-一个供外源基因可选自地连接的多克隆位点， 
-允许牛痘病毒特异转录的牛痘病毒特异性启动子或异源的痘病毒启动子，或允许牛痘病毒特异转录人造的启动子， 
所述部分通过两个MVA-DNA序列被连接到侧面，所述的MVA-DNA序列是外源基因的主要插入目标，插入到根据本发明上述的突变MVA基因组中的任何非必需位点中，MVA基因组的缺失区III内的位点，或者是MVA基因组中设计的K1L缺失位点。 
这些DNA构建体可以通过转染导入到细胞中，例如用磷酸钙沉淀法(Graham等，Virol.52，456-467[1973]；Wigler等，Cell 777-785[1979])，电穿孔法(Neumann等，EMBO J.1，841-845[1982])，显微注射法(Graessmann等，Meth.Enzymoloy 101，482-492(1983))，脂质体法(Straubinger等，Methodsin Enzymology 101，512-527(1983))，原生质体法(Schaffner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，2163-2167(1980))或是通过本领域技术人员了解的其他方法。磷酸钙沉淀法是优选的转染方法。 
为制备疫苗，依据本发明所产生的MVA牛痘病毒可以被转化成生理上可以接受的形式。基于多年来为防治天花接种制备疫苗的经验(Kaplan，Br.Med.Bull.25，131-135[1969])，这是可以实现的。典型的，在安瓿中，最好是玻璃安瓿中，约106-108个重组MVA颗粒于100ml添加了2％的蛋白胨和1％人血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中被冻干。冻干物可包括适合于肠胃外给药的膨胀剂(比如甘露醇、葡聚糖、糖、苷氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮)或者其他助剂(比如抗氧化剂、稳定剂)。然后将玻璃安瓿密封保存，最好在-20℃以下，可以保存几个月。 
为了接种，冻干物可以溶解于0.1-0.2ml的水溶液中，优选的是生理盐水，而且可以用于肠胃外给药的，例如，皮下接种。根据本发明的疫苗优选在皮内注射。在注射的位置可能会有轻微的红肿，有时还会发痒(Stickl等，supra)。给药的方式、剂量和注射次数是本领域的技术人员通过已知的方法是可以选择。在一定长度的时期内恰当地进行几次免疫有利于获得对异源抗原高水平的免疫反应。 
综上所述，本发明的生产重组MVA的方法包括以下几步：如上所述用突变的MVA感染宿主细胞，利用本发明的DNA-载体构建体转染宿主细胞，和通过在兔肾细胞RK-13上的生长来筛选修复的MVA，或者也可用其他细胞类型，这些类型主要要求具有K1L基因功能，使MVA或如权利要求1所述的突变MVA能多产的生长。 
附图说明
图1：可能存在的基于K1L的宿主细胞范围筛选的缺陷(pit-falls)和其去除的示意图。(A)是MVA基因组(HindIII的限制性酶切谱图)和pIIIdHR载体质粒的示意性谱图。缺失区II的位点：描述开放性阅读框(ORFs)，包括K1L的基因片段(阴影区)。缺失区III的位点：侧链-I和侧链-II指的是MVA-DNA序列，该MVA-DNA序列对于外源基因靶向插入MVA基因组中缺失III的位点是必需的。侧链-I-rep表示的是与侧链-I的右端同源的一个283bp MVA-DNA片段的重复序列，它可以通过同源重组的方法删除K1L的表达区。K1L-标记，K1L基因序列包括真正的启动子，Pvv，牛痘病毒的特异性启动子，MCS，多克隆位点。1和2是指采用常规的K1L筛选(虚线显示)潜在的不期望的同源重组事件。(B)从MVA基因组中去除K1L序列。最上面是MVA基因组的HindIII限制性酶切谱图，下面是位于MVA基因组上的缺失II位点上的开放阅读框(ORF)，包括成片段的K1L基因(阴影区)。pIInewLZ-gpt-del：K1L的缺失质粒，携带在261bpK1L片段两侧的MVA序列(N2L和K2L的基因序列)；N2L-rep，N2L开发阅读框5’区的315bp的重复区域；P11，牛痘病毒的晚期启动子；P7.5， 牛痘病毒的早期/晚期启动子；LacZ，编码β-半乳糖苷酶的大肠杆菌LacZ基因；gpt，编码叶黄素-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶的大肠杆菌gpt基因。最下面是位于MVA-IInew中的缺失II位点。(C)新的MVA转移质粒pIIIΔHR。侧链-I和侧链-II是指MVA-DNA序列，该序列对于外源基因靶向插入到MVA基因组中缺失III位点是必需的。K1L-标记是K1L基因的序列，包括真正的启动子、Pvv、牛痘病毒的特异性启动子、MCS、多克隆位点。两个相同的lacZ衍生的DNA片段(del)拷贝位于K1L标记基因的两侧，用于随后通过同源重组从重组的MVA上除去该可选择的标记。 
图2：包括用于HCV非结构蛋白3的基因序列的重组MVA的构建以及基因组结构。MVA基因组的HindIII限制性酶切的示意图位于最上面。HCV编码序列位于牛痘病毒早期/晚期启动子P7.5的转录控制因子的下游，并且通过同源重组的方法插入到MVA基因组缺失III的位点。侧链-I和侧链-II指的是MVA-DNA序列，该序列接近缺失III位点，并用于将目标重组到MVA基因组中。Rec2是指位于侧链1的右侧末端的283bp重复的MVA-DNA序列，并可以通过同源重组从最终的重组病毒基因组中去除K1L可选择的标记。重组MVA-HCV-NS3的基因组结构示于最下方。 
图3：MVA-P7.5-NS3的体外特性 
左图：病毒的DNA的PCR分析，用于检测插入到缺失III位点的基因序列和NS3的特异性序列。野生型MVA的DNA基因组，MVA-HCV-NS3和转移质粒pIII-dHR-P7.5-NS3，该质粒作为模板DNA用于扩增由琼脂糖凝胶电泳分离的独特的DNA片段。1-kB-梯(Gibco)作为标记(第一道)。右图：使用10IU/细胞的MVA或者MVA-P7.5-NS3感染CEF细胞，感染24小时后收集。细胞溶菌产物中的蛋白质通过SDS-10％PAGE分离，然后使用多克隆的HCV的特异性抗血清进行Western印迹分析。标准蛋白质的位置和分子量(kDa)在MW道上显示。 
以下实施例用于更好地理解本发明，而不是用来给人以本发明仅限于该实施例的主题的印象 
具体实施方式
为了提高K1L瞬时的选择性技术，发明人采取了两种方法：构建没有K1L的MVA(例如：MVA(IInew)，图1B)；设计一种新的DNA载体的构建体(转移质粒)(例如：pIIIΔHR，图1C)。 
1.病毒的生长和纯化
1.1MVA和MVA突变病毒的生长 
MVA病毒是毒性被大大地削弱了的牛痘病毒，通过在鸡胚成纤维细胞(CEF)中对原始的CVA毒株进行连续的传代培养而得到的。该产生历史的通常的观点、牛痘MVA毒株的特点和使用，参考Mayer等人在Infection3，6-14[1975]的文章中进行了总结。由于适应了CEF，MVA病毒在其它细胞体系中的生长受到了极大的限制。除了一种具有良好特性、容易保持细胞系的仓鼠(hamster)幼仔的肾细胞(BHK-21)可以支持MVA病毒的生长，而且可以像CEF一样高效的表达重组基因，而且在表达载体和活的重组疫苗的开发中已经被推荐用于标准的MVA增殖。(Drexler等，1998，J.Gen.Virol.，79，347-352)。 
MVA病毒在CEF细胞中能够正常地生长，而且它已经适应了该宿主细胞。为了制备CEF细胞，我们需要将11天龄的胚胎从孵化的鸡蛋中分离出来，去除末端，把鸡胚切成小块，慢慢地溶解在含有25％胰岛素的溶液中，在室温下放置2小时。最终的细胞悬浮液用1倍体积的培养基I(MEM Eagle，例如可购自Gibco，Basle，Switerland；Order No.072-1500中所提到的)稀释，培养基I包含5％的胎牛血清(FCS)，青霉素(100units/ml)，链霉素(100mg/ml)和2mM的谷氨酰胺，然后使用细胞筛过滤(例如，可购自Technomara AG，Zurich，Switzerland，Order No.Bellco 1985，150目)，然后使用台式离心机在 2000rpm、室温下离心5分钟使细胞沉淀(Hermle KG，D-7209 Gosheim，FRG)。细胞沉淀物占初始培养基I体积的1/4，使用这种方法得到的CEF细胞在细胞培养皿上分散开。他们继续在培养基I中生长，置于37℃的CO2培养箱中，根据所需的细胞密度培养1-2天，然后用来直接感染或者是经过1-2个进一步细胞传代以后感染。原始培养物的制备在R.I.Freshney所写的《动物细胞培养》中有清楚的描述(Alan R.Liss Verlag，New York[1983]，第11章，99页以后)。 
我们研究的MVA突变体常规是在CEF细胞或者在仓鼠幼体的肾细胞BHK-21(美国典型培养物保藏中心ATCC CCL-10)中繁殖的，所述细胞生长在含有最低含量必需物的培养基中(MEM)，其中含有10％的胎牛血清(FCS)。BHK-21细胞保存在含有5％CO2的潮湿空气中，温度保持在37℃。 
病毒感染使用以下的方法。细胞在175cm2的细胞培养瓶中培养。在细胞有80-90％汇合的时候除去培养基，将细胞置于MVA病毒的磷酸缓冲液(PBS/Dulbecco，例如Animed AG，Muttenz，Switzerland，Order No.23.100.10)悬浮液(每个细胞含0.01的感染粒子(＝pfu)，0.01ml/cm2)中孵育1个小时。然后加入培养基(0.2ml/cm2)，将培养瓶置于37℃条件下孵育2-3天，直到约80％的细胞已环绕。在进行下一处理之前(纯化等)，病毒的溶解产物与细胞和培养基一起在-30℃条件下储存在细胞培养瓶中，而不经处理。 
1.2病毒的纯化 
纯化步骤是为了获得尽可能纯的与MVA和WR病毒(Joklik，Virology18，9-18[1962]；Zwartouw等，J.gen.Microbiol.29，523-529[1962])一致的病毒制备物，其中不含任何宿主细胞所特有的成分。被感染并保存在-30℃的条件下的细胞培养物先解冻，将塑料基板上的残余细胞摇晃下来或刮下来，把细胞和病毒通过离心的方法(Sorvall离心机，GSA转子，10℃、5000rpm、1小时)与培养基分离。将含有病毒和细胞的沉淀部分一次悬浮 在PBS中(沉淀体积的10-20倍)，然后将悬浮液按照上面的方法再次离心。新的沉淀物溶解在10倍体积的RSB缓冲液中(10mM Tris-HCl pH 8.0，10mMKCl，1mM MgCl2)，然后将悬浮液进行短暂的超声处理(Labsonic 1510带有一个直径4毫米的探头，购自Bender and Hobein，Zürich，Switzerland；在60W、室温下进行2×10秒)以破碎剩余的完整细胞使得病毒粒子从细胞膜内释放出来。细胞核和较大的细胞碎片可以通过随后短暂的离心除去(Sorvall GSA转子，购自杜邦公司，D-6353Bad Nauheim，FRG；3000rpm、10℃离心3分钟)。沉淀物再次悬浮在上述的RSB缓冲液中，按上述方法进行超声和离心。所收集到的含有游离的病毒粒子上清液被合并，然后使用10ml含有35％蔗糖的10mM Tris-HCl pH 8.0将其分层，随后使用KontronTST 28.38/17转子(Kontron Instrumente，Zurish，Switzerland；相当于Beckman SW27转子)在10℃14,000rpm下离心90分钟。将上清液丢弃，含有病毒粒子的沉淀放入10ml，pH 8.0的10mM Tris-HCl缓冲液中，然后进行短暂的超声处理使微粒分布均匀(室温下进行2×10秒，使用上述的装置)，使用分级梯度的方法进行进一步的纯化过程。各级梯度分别包括含有蔗糖的5ml、pH 8.0的10mM Tris-HCl(蔗糖的浓度梯度为：20％、25％、30％、35％和40％)。该梯度使用Kontron TST 28.38/17转子在10℃下、14,000rpm下离心35分钟。离心以后在30％和40％蔗糖区域之间可以看到几条分散的含有病毒粒子的条带。将这个区域从梯度中虹吸出来(10ml)，蔗糖溶液用PBS缓冲液(20ml)稀释，然后离心将病毒沉淀出来(Kontron TST 28.38/17转子在10℃、14,000rpm下离心35分钟)。该沉淀这时主要含有纯的病毒粒子，将它放入PBS中，使得病毒的平均浓度达到(1～5)×109pfu/ml。纯化的病毒贮液可以直接使用或者按照随后试验的要求用PBS稀释。 
2.MVA病毒突变体的构建和鉴定
2.1K1L缺失质粒的构建 
为了从MVA基因上去除掉剩余的263bp的K1L序列和MVA ORF022L 的启动子序列(全部去除的序列包括MVA基因组中从20719到21169的区域，Antoine，G.，F.Scheiflinger，F.Dorner and F.G.Falkner，1998，Virology 244：365-396)，发明人构建了缺失的质粒pIInewLZ-gpt-del：pUCII-LZ(14)的侧链l，以前被用于MVA基因的缺失区II的位点的同源重组的质粒由不含K1L基因序列并且已经通过PCR方法从MVA基因组的DNA中分离出来的新的侧链(K2L)代替，所用的引物是IIflnewA：5’CAG CTG CAG CGG CCG CCTTAC ACC GTA CCC 3’(SEQ ID NO：1)，和IIflnewB：5’CAG GCA TGC GTAGAA CGT AGA TCC GG 3’(SEQ ID NO：2)。另外，N2L开放阅读框架(ORF)的5’区域有一个315bp的重复序列(也使用PCR的方法分离，使用引物delIIA：5’CAG CTG CAG CCA TAA TGG TCA ATC GCC 3’(SEQ ID NO：3)和delIIB：5’CAG GCG GCC GCG GTA TTC GAT GAT TAT TTT TAA CAAAAT AAC 3’(SEQ ID NO：4))，被插入到LacZ-gpt-序列组件的下游，形成了pIInewLZ-gpt-del，并且允许通过N2L基因序列的同源重组去除标记序列组件。 
2.2MVA突变体的形成 
MVA(IInew)通过pIInewLZ-gpt-del基因转染到感染了MVA(F6的独立克隆)的原鸡胚成纤维细胞(CEF)而获得，接下来使用前面所述的在霉酚酸存在的条件下筛选有β-半乳糖苷酶产生的病毒(7)。筛选到重组的MVA以后，选择压力被除去并且分离没有标记物的病毒(图1B)。 
3.重组MVA病毒的产生
3.1质粒载体的构建 
另外，为了排除在MVA转移质粒中存在的MVA重复序列和MVA基因组序列之间的同源重组的可能性，我们设计了一个新的质粒pIIIΔHR，该质粒包含K1L标记序列组件，其两侧与两个从lacZ基因衍生而来的短的216bp重复序列连接。 
K1L标记序列组件，即在其真正的启动子的控制转录下的K1L编码全序列，可以用来自Western Reserve牛痘病毒(由B.Moss博士提供，LVDNIH，Bethesda MD，USA)的基因组DNA中的一段1100-bp的DNA片段，通过PCR进行扩增，所使用的寡聚核苷酸K1L-5’-3CAG CAG CCC GGG TGCGAT AGC CAT GTA TCT ACT AAT CAG(SEQ ID NO：5)和K1L-3’-1CAGCAG CCC GGG GGA AAT CTA TCT TAT ATA CAC(SEQ ID NO：6)(限制性内切酶SmaI的酶切位点用下划线标出)。 
在两侧带有正向重复序列的K1L标记序列组件从pΔK1L中切下来，如前面描述过的(12)，并插入到pIIIdHR中，取代K1L标记和侧链I的重复序列以产生pIIIΔHR(图1C)。MVA重组病毒的最终基因组现在将包含目标基因序列和LacZ的基因片段。插入额外的外源DNA可能会导致载体病毒的不太“干净”，然而该惰性序列可能会充当一个普通的基因标记，便于对重组MVA的识别。 
3.2重组MVA的形成和分离 
最后，这些变化变化在感染/转染实验中对重组效率的影响被检测。CEF细胞被MVA(F6)或者MVA(IInew)感染，然后被pIIIdHR-gfp或者pIIIΔHR-gfp转染。48小时以后收集样品，然后用等分试样来感染单层RK13细胞。三天以后收集全部感染的单层细胞，将材料在RK13细胞进行二次传代。感染三天以后可见的/gfp荧光细胞聚集体的数目可以通过紫外/可见光显微镜来确定。然后发明人通过这个数据计算出正确重组结果的百分数，即，插入到MVA中的K1L标记序列组件和gfp基因(Table 1)。使用发明人所提出的常规的选择系统(MVA(F6)和pIIIdHR-gfp)，他们发现在第二次RK13传代后全部转化灶重组的30.5％为K1L和gfp。从MVA基因组中去除残余的K1L序列可以略微提高正确的重组(45％，MVA(IInew)和pIIIdHR-gfp)。然而，从MVA转移质粒上去除侧链I重复序列会引起预期的重组结果明显的增加(71％)甚至使用含有残余的K1L序列的MVA。发明人使用新的MVA 和gfp-转移质粒(MVA(IInew)和pIIIΔHR-gfp)实际上获得了达100％的效率。在平板稀释和确定转化灶的数目以前，首先进行RK13的第一次“盲”传代，因为我们观察到当计算在RK13第一代中GFP阳性细胞时，所得结果显示过高正确重组的结果，然而当进入下一次传代时，大约一半这些分离的病毒不能诱导转化灶的GFP-阳性病毒。观察到的这个现象可能是因为不稳定的单一重组的情况和/或来自携带质粒DNA的短暂gfp表达。 
总结起来发明人可以通过以下手段可以大大的提高基于K1L的选择技术：(i)去除MVA基因组中残留的K1L序列(ii)设计新的MVA转移质粒，其携带同源的非MVA序列以使短暂的标记基因缺失。虽然程度不同，但是每种方法独立使用都可以提高预期的重组病毒的产生。不含有K1L序列的MVA主干病毒和改造过的MVA载体质粒结合使用可以实现非常高效的选择，并且可以使基因准确的转移到目标基因组的位点上，而且可以几乎将MVA重组病毒单独分离。 
4.产生/选择rMVA的方法
通过这种方法成功构建了表达HCV-J细胞(基因型1b)中的非结构3(nonstructural 3，NS3)上的开放阅读框架(ORF)的重组MVA(rMVA)，这可以作为我们当前以缺失内在的K1L序列(MVA-IInew)的MVA亲代病毒为基础并且使用了同源的非MVA重复序列(LacZ)的转移质粒而产生rMVA这个新技术应用的一个例子。最初，我们曾试图使用Staib C.等在2000，Biotechniques 28：1137-1148所描述的方法，使用传统的宿主细胞范围选择的方法制备可以表达HCV-J毒株(基因型1b)中HCV NS3基因(MVA-HCV/NS3)的rMVA。 
包含HCV cDNA的质粒来自一篇关于慢性肝炎的日本专利，并由日本京都大学的Kunitada Shimotohno博士(Kato等，1990，PNAS 87：9524-9528)提供，该质粒用PCR扩增被用来制备NS3基因(编码HCV多肽的第1028-1658个氨基酸)，并且用于将PCR扩增的产品克隆到MVA的转移载 体pIII-dHR-P7.5中(图2)。使用MVA(克隆分离的F6)感染单层的CEF细胞，然后使用pIII-dHR-P7.5-NS3转染细胞，接下来使用K1L作为选择标记，用RK13细胞进行几步噬斑纯化(plaque purification)步骤，我们没有获得真正的重组病毒。我们分离了稳定结合在MVA基因组缺失区3(del3)位点的只带有K1L序列的rMVA，或者是根本不能获得稳定生长病毒后代的rMVA。作为一种补救措施，我们决定使用我们改造的新的K1L筛选技术，把NS3基因序列重新克隆到新的MVA载体质粒pIII-ΔHR-P7.5中，然后通过同源重组，使用改进的不含有K1L的分离MVA IInew作为用于整合该表达序列组件的受体病毒。事实上，通过这种策略上的改变，我们可以只经过几步噬斑纯化的过程，就产生并且分离出我们所要的重组病毒MVA-HCV/NS3。图3描述了通过PCR分析(左图)所得的rMVA病毒在体外的特性，检测到NS3的ORF已经准确的插入到了MVA基因组的del3位点，并且已经完全去除了K1L选择标记序列组件。而且，从Western印迹分析能够证明这种新形成的MVA-HCV/NS3可以在感染的CEF细胞中正确地产生NS3多肽(图3，右图)。MVA-HCV/NS3目前已经被评价为一种很有前途的可供选用的病毒载体，用于预防和/或治疗人类感染HCV的疫苗的研发。因此，在本专利申请中描述的我们改进的方法，已经使我们获得了一种您的重要的rMVA载体构建体，如果使用标准的方法，这将会很繁琐甚至是不可能的。 
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Figure G04801849519960504D000201
     表1：使用传统的与使用新的MVA和转移质粒方法的重组效率 
计算gfp-表达的转化灶*占光学显微镜下可见所有转化灶**的百分比。括号中的数字表示的是每个样品的两个不同的10倍稀释液中转化灶的实际数值，并且每个样品作了三个独立的实验。 

Claims (11)

1.一种DNA-载体构建体，包括编码牛痘病毒K1L基因和编码外源蛋白质的序列，其中牛痘病毒K1L和外源蛋白质的编码区在两侧连接有DNA序列，该DNA序列为在MVA基因组中侧面连接在MVA突变体基因组中设计的K1L缺失的位点的序列，其中在所述MVA突变体中，MVA基因组中的所有K1L基因序列和它的启动子序列已经通过缺失的方法而失活，以避免MVA中的K1L基因序列与所述DNA-载体构建体上的K1L基因序列之间的同源重组；该载体包括以下功能连接的组件：
-K1L标记基因，包括牛痘病毒的K1L编码序列和转录单元，
-两个DNA序列，连接在K1L标记基因的两侧，以通过同源重组随后从重组的MVA上除去该标记，
-克隆位点，异源基因可以任意地插入该位点；
-用于牛痘病毒的特异性转录的启动子；
所述组件侧面连接有两个MVA-DNA序列，这些序列对于外源基因靶向插入到MVA基因组中设计的K1L缺失的位点是必需的。
2.一种MVA突变体，其中在MVA基因组中的所有K1L基因序列和它的启动子序列已经通过缺失的方法而失活，以避免MVA中的K1L基因序列与权利要求1所述的DNA-载体构建体上的K1L基因序列之间的同源重组。
3.一种由权利要求2中所述的MVA感染的宿主细胞，其中所述宿主细胞为CEF细胞或BHK-21细胞。
4.一种产生重组MVA的方法，包括以下步骤：
-用根据权利要求2的MVA突变体感染MVA的宿主细胞；
-用权利要求1所述的DNA-载体构建体转染该宿主细胞；和
-通过在兔肾RK-13细胞中生长来筛选恢复的MVA。
5.根据权利要求4所述的方法，其中该DNA-载体构建体进一步包括编码外源蛋白质或它们的功能部分的DNA序列。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述DNA-载体构建体中的K1L标记基因包括其真正的启动子的转录控制序列。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述DNA-载体构建体中的所述两个DNA序列为两个相同的无活性的DNA片断。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述无活性的DNA片断为来自大肠杆菌的lacZ的DNA片断。
9.根据权利要求4所述的方法，其中所述DNA-载体构建体中的所述克隆位点为多克隆位点。
10.根据权利要求4所述的方法，其中所述DNA-载体构建体中的用于牛痘病毒的特异性转录的启动子为来自牛痘病毒的启动子，或可以使牛痘病毒特异性转录的异源痘病毒的启动子，或可以使牛痘病毒特异性转录的合成的启动子。
11.根据权利要求4～10中的任意一项所述的方法，其中所述DNA-载体构建体是质粒。
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