CN101142319B - 基于使用修饰安卡拉痘苗病毒的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组MVA，其携带编码融合蛋白的核酸序列。本发明还涉及包含所述重组MVA的试剂盒，以及在哺乳动物中增强T细胞应答的方法。

Description

基于使用修饰安卡拉痘苗病毒的疫苗

技术领域

本发明涉及重组的修饰安卡拉痘苗病毒(MVA)，其携带编码融合蛋白的核酸序列。本发明还涉及包含所述重组MVA的试剂盒，以及在哺乳动物中增强T细胞应答的方法。

背景技术

痘苗病毒(VV)属于痘病毒科的正痘病毒属。作为预防天花的活疫苗，痘苗病毒的某些株已应用多年，例如英国Lister Institute的Elstree株。由于接种可能引发并发症(Sch

r，Zeitschr.für Pr

ventivmedizin 18，41-44，1973)，并且由于世界卫生组织(WHO)于1980年宣告天花已经绝迹，如今只有高危人群才进行接种以抵御天花。

痘苗病毒还用作生产和输送外源抗原的载体(Smith等人，Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2，383-407，1984)。在DNA重组技术的帮助下，使得可以将编码外源抗原的DNA序列(基因)导入痘苗病毒基因组中。如果该基因在病毒DNA的某个对痘苗病毒的生命周期非必要的位点进行整合，那么新产生的重组痘苗病毒就可能具有侵染性，也就是说，可以侵染外源细胞并且表达所整合的DNA序列(欧洲专利申请No.83,286和No.110,385)。如此产生的重组痘苗病毒一方面可用作预防感染的活疫苗，另一方面也可用于在真核细胞中生产异源蛋白。

痘苗病毒是最为广泛评价的活载体，并且由于其具有高度稳定、制备廉价、便于给予、可以提供大量外源DNA的独特性质，有利于将其用作重组疫苗。其具有既可以诱导抗体应答又可以诱导细胞毒素应答的优点，可通过更自然的方式向免疫系统提供抗原，已在多种动物模型中成功地作为用于抵御传染性疾病的载体疫苗。此外，痘苗载体还是非常有价值的研究工具，它可以用来分析重组蛋白的结构-功能关系、确定体液和细胞介导的免疫应答的靶标、研究抵御特定疾病的免疫防御类型。

然而，痘苗病毒对人具有传染性，考虑到安全性和相关规定，痘苗病毒作为表达载体在实验室中的使用受到影响。此外，由于重组痘苗病毒载体的增殖性复制，重组痘苗病毒未来可能的应用，例如生产用于人类的新治疗或预防方法的重组蛋白或重组病毒颗粒会受到阻碍。文献中记载的大多数重组痘苗病毒都是基于痘苗病毒的Western Reserve(WR)株。另一方面，众所周知该株具有很强的神经毒性，因此不适用于人类和动物(Morita等人，Vaccine 5，65-70，1987)。

出于对痘苗病毒标准株安全性的考虑，已经从高度减毒的病毒株中开发出痘苗载体。其特征在于具有有限的体外复制能力并且在体内无毒性。专门培养这些病毒株，以避免出现那些早已公知的不期望的副作用。因而，通过将痘苗病毒的安卡拉株(CVA)在鸡胚成纤维细胞中经过长期的连续传代就可能培育出MVA(参见Mayr，A.，Hochstein-Mintzel，V和Stickl，H.，Infection 3，6-14，1975；瑞士专利No.568 392)。按照布达佩斯条约的要求，该MVA病毒于1987年12月15日保藏于CNCM(InstitutPasteur，Collectione Nationale de Cultures de Microorganisms，25，rue deDocteur Roux，75724 Paris Cedex 15)，保藏编号为I-721。

对该MVA病毒进行分析以确定其相对于野生型CVA株基因组的变化。已经确定存在六个主要的缺失(缺失I、II、III、IV、V和VI)(Meyer，H.，Sutter，G.和Mayr A.J.Gen.Virol.，72，1031-1038，1991)。该修饰安卡拉痘苗病毒仅有很低的毒性，也就是说，其用于接种时不产生副作用。因而特别适于无免疫应答受试者的初级接种。该MVA株的优异性质已被大量的临床试验所证实(Mayr等人，Zbl.Bakt.Hyg.I，Abt.Org.B，167，375-390，1987；Stickl等人，Dtsch.med.Wschr.，99，2386-2392，1974)。

作为表达重组基因的安全的病毒载体，修饰安卡拉痘苗病毒(MVA)是有价值的工具，其可以用于各种不同的目的，例如在体外研究蛋白质功能，或在体内诱导产生抗原特异性的细胞免疫应答或体液免疫应答。MVA的主要优点是尽管在人类和大多数哺乳动物细胞中具有复制缺陷，仍能进行高水平的基因表达。作为疫苗，MVA具有优异的安全记录，能在生物安全I级条件下操作，并已证明当在动物体内输送异源抗原时，具有免疫原性和保护作用，首个人类候选疫苗已经进入临床阶段。

虽然MVA在大多数哺乳动物细胞系中不能复制，但是其保持对病毒和异源基因的未受损表达(Sutter和Moss，1992)。正如初级免疫-强化免疫策略(prime-boost strategies)(Meseda等人，2002；Amara等人，2002)和正在进行的临床试验(McConkey等人，2003；Cosma等人，2003；Hanke等人，2002)中广泛使用所表明的那样，其对人无致病性，即使在无免疫应答的宿主中也具有内在的无毒性、外源抗原的高水平表达以及对免疫应答的辅助作用，使得重组MVA(rMVA)成为预防性和治疗性接种的理想载体。

事实上，基于重组MVA(rMVA)的疫苗引起体液和细胞介导的适应性免疫应答(Ramirez等人，2000)，并已证明其在几种传染性疾病的动物模型中(Hanke等人，1999；Barouch等人，2001；Weidinger等人，2001；Schneider等人，1998；Sutter等人，1994b；Hirsch等人，1996；Wyatt等人，1996)，甚至在一些肿瘤模型中(Carroll等人，1997；Rosales等人，2000；Drexler等人，1999)具有保护作用。

已经详细记载了产生rVV的标准方法(Earl等人，1998)，其依赖于受体VV DNA和转染传递质粒之间的体内同源重组，其中外源基因以VV序列形成侧翼。产生重组MVA的其它方法为例如WO 04074493、WO03023040和WO 9702355公开的方法。

WANG等人在Blood，2004年8月，第104卷，第3期公开了一种将造血干细胞移植后限制巨细胞病毒(CMV)发病和死亡的免疫治疗方法。其中一种方法包含尝试将泛素-修饰CMV-抗原插入痘苗病毒(VV)的Western Reserve强毒株以及高减毒株、修饰安卡拉痘苗病毒(MVA)中。泛素-修饰CMV-抗原是磷蛋白65(pp65)、磷蛋白150(pp150)和立即早期蛋白1(IE1)免疫显性抗原。

但是，WANG等人表明抗原泛素化对rMVA中携带的CMV-抗原的初级免疫力没有影响或仅有轻微的影响。

虽然修饰安卡拉痘苗病毒被认为是重组基因表达的有价值和安全的病毒载体，但是人们普遍认为MVA对于哺乳动物，特别是人类具有给药上限。例如，重组MVA对于人类给药一般限于每次给予5×10⁸IU(感染单位)。在这种情况下，由rMVA产生的免疫应答可能不足以实现期望的治疗效果，这是不利之处。因此，非常希望降低在哺乳动物中获得特定免疫应答所需的感染单位的数目。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供一种基于MVA的接种系统，其用相对低的感染单位或数目降低的感染单位在哺乳动物特别是人类中实现足够高的免疫应答。本发明进一步的问题在于为基于MVA的接种方案提供一种改进的强化免疫剂，其使得对于选择的抗原产生增强的再次免疫应答。

这些问题通过独立权利要求的主题得到解决。本发明的优选实施方式体现在从属权利要求中。

概括地说，本发明产生下列优点和效果：

出乎意料地发现在接种方案(即：初级免疫-强化免疫接种方案)中，各种重组MVA颗粒的组合显示出比现有技术的方法具有增强的细胞免疫应答。换句话说，发现用于初级免疫的外源蛋白与产生泛素化外源蛋白的重组MVA组合使免疫应答增强，并且为了获得足够的免疫应答，所需给予哺乳动物的rMVA感染单位较少。这些结果是令人惊奇的，因为其他科学家，例如WANG等在上文提及的文献Blood，第104卷，第3期表明抗原泛素化并不影响rMVA的免疫原性。

本发明中，已经证实携带泛素化外源蛋白的rMVA的初级免疫应答相对较低，然而将所述rMVA用作强化免疫剂时，可显示高的免疫应答。本发明人发现：通过使用本发明的接种系统，接种中使用的rMVA的感染单位总量可以显著降低。

首先，本发明人通过杂交-PCR构建泛素/酪氨酸酶融合基因(Ub-Tyr)(图1b)。然后，经过同源重组和随后的宿主细胞选择，可以成功地产生重组MVA病毒，其中将所述融合基因稳定整合于病毒基因组中，并且产生作为泛素化融合蛋白的Ub-Tyr(图1a)。在体外，通过快速和几乎完全的蛋白酶体依赖性降解，泛素化导致靶蛋白的细胞质不稳定性，使得泛素化融合蛋白的半衰期显著降低(图2)。如上所述，通过体内检测免疫原性，令人惊奇地发现：与不包含泛素化抗原的MVA相比，包含泛素化抗原的MVA疫苗显示出弱的初级应答，但是显示出显著增强的再次免疫应答(见图4和5)。

本申请中，要求保护一种使用rMVA载体通过产生抗原以优化产生细胞毒素CD8+T细胞(CTL)的新方法，所述抗原设计得用于快速蛋白酶体降解以增强用于主要组织相容性复合体(MHC)I类分子特异性呈递的肽生产。构建了表达泛素/外源蛋白融合蛋白的MVA疫苗，并通过Western印迹法、放射免疫沉淀法和铬释放法在体外对其进行表征。

在HLA-A*0201-转基因小鼠中进行体内接种研究，并通过细胞内细胞因子合成和四聚体结合法分析CTL应答。MVA产生的泛素化酪氨酸酶(Ub-Tyr)在体外经历了快速降解，该快速降解在蛋白酶体抑制剂存在时得到特异性抑制。此外，泛素化导致受感染靶细胞的外源蛋白特异性CTL识别显著增强，表明即使在病毒感染的早期时间点，肽生产增加，并且在细胞表面获得的MHC I类分子-肽的密度更高。在初级免疫-强化免疫接种研究中，即使是低剂量的疫苗，MVA-Ub-外源蛋白也能极其有效地增强Tyr-特异性CTL回忆应答。

本文提供的数据表明输送不同配方抗原的MVA疫苗可选择性地用于初级免疫或强化免疫，这对于具有改进免疫原性的基于优化MVA的接种方案的开发非常重要。

本发明的第一方面涉及一种试剂盒，包含下列组分：

a)第一组分，包含一种或多种外源蛋白或编码所述外源蛋白或其功能部分的核酸；以及

b)第二组分，包含重组修饰安卡拉痘苗病毒(MVA)，其携带编码融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包含：

-泛素或其功能部分；以及

-一种或多种外源蛋白或其功能部分；

其中所述第一组分和第二组分还选择性地包含药学上可接受的载体。

应当注意：上述两组分中使用的外源蛋白通常相同，但也可以不同。

本文所用的术语“外源蛋白”也包括另一种情况，即在一个重组MVA颗粒中包含不仅一种，而且两种或更多种不同的外源蛋白。因此，可通过仅仅一次接种获得对几种疾病的免疫原性。使用两种或更多种外源蛋白也会有助于避免或抵御特定病毒性疾病和肿瘤疾病的逃避机制。

此外，术语“外源蛋白”是指非天然存在的作为MVA一部分的蛋白，即异源蛋白(以及编码该蛋白的核酸)。

泛素是一种小的胞质蛋白，其高度保守。泛素在生物体中对调节细胞内蛋白的可控降解发挥基础性作用。

泛素的多肽链由76个氨基酸组成。但本发明中使用的术语“泛素”不局限于这个确定的蛋白。该术语也包含和包括称为“类泛素蛋白”的蛋白超家族的蛋白，即显示类泛素折叠基序的蛋白，以及其片段和融合蛋白。因此，本发明还包含泛素蛋白，其为选自类泛素蛋白的蛋白超家族的蛋白，这些蛋白通过取代、插入、缺失、化学修饰等进行改变，但却保留了其特有的折叠基序，或者其使得目的蛋白导入细胞降解器中。

更多的用于这方面的蛋白的例子是小的类Ub调节剂(SUMO；参见Yun-Cai Liu，Annu.Rev.Immunol.，2004，22：81-127)，PEST序列(DuaneA.Sewell等人，CANCER RESEARCH，64，8821-8825，December 15，2004年12月15日)。有关更深入的信息，还可参见Chien-Fu Hung等人，CANCER RESEARCH，63，2393-2398，2003年5月15日。

如上述说明，本文所用的术语“功能部分”指上述蛋白或编码该蛋白的核酸，其与野生型蛋白/核酸相比，包含一个或多个取代、插入和/或缺失，而没有改变其功能。这些缺失是在核酸序列的5′-末端或3′-末端或者在核酸序列内优选缺失1个，但也可以缺失2、3、4或更多的核苷酸，或者这些核苷酸被其它核苷酸所取代。所述的外源蛋白的“功能部分”也可为截短蛋白，只要所述截短蛋白实现其生理机能，即在特定疾病治疗和/或预防中提供有效的免疫原性即可。因此，用于本发明的外源蛋白还可以认为是一种在相关技术领域中具有公知含义的“抗原”。本文的抗原是指一种物质，该物质被免疫系统识别为引起免疫应答的外源物质或毒性物质。

步骤a)中使用的外源蛋白或抗原以在宿主中表达外源蛋白自身的核酸形式、表达外源蛋白的重组细菌形式、蛋白形式的外源蛋白和/或由病毒载体携带的外源蛋白形式存在。

在优选的实施方式中，所述病毒载体是修饰安卡拉痘苗病毒(MVA)。

根据优选的实施方式，所述融合蛋白还包含泛素和外源蛋白之间的连接体。该连接体优选包含增强泛素/蛋白融合体稳定性的氨基酸，例如融合蛋白泛素部分第76位的丙氨酸；或导致泛素部分优先被切割的氨基酸，例如融合蛋白泛素部分第76位的甘氨酸，从而暴露包含在该融合蛋白内的导致该蛋白中该部分降解增强的氨基酸，例如在该融合蛋白的剩余部分第1位的精氨酸；和/或包含被细胞内另外的泛素分子瞄准作为识别信号从而导致降解增强的氨基酸的那些氨基酸。

如本文所用的术语“重组MVA”指那些通过例如DNA重组技术已经发生遗传改变的MVA，并用于例如作为疫苗或者作为表达载体。

根据本发明，可以通过几项周知的技术，例如基于K1L基因的选择方案制备重组MVA痘苗病毒。例如，将包含编码痘苗病毒(VV)K1L蛋白或编码源自于K1L的多肽的DNA序列以及编码外源蛋白(或泛素/外源蛋白的融合蛋白)的DNA序列的DNA构建体导入细胞中，优选导入真核细胞中，所述的两种DNA序列在MVA基因组内的非必要位点以DNA序列形成侧翼，所述非必要位点为例如天然发生的缺失位点，例如缺失III。优选地，使用鸟类、哺乳动物和人类的细胞。优选的真核细胞是被突变MVA有效感染的BHK-21(ATCC CCL-10)、BSC-1(ATCC CCL-26)、CV-1(ECACC 87032605)或MA104(ECACC 85102918)细胞，其中在MVA基因组中的所述K1L基因序列及其启动子序列或所述序列的功能部分已被失活，使得可以进行同源重组。进一步优选的宿主细胞是鸡成纤维细胞、鹌鹑成纤维细胞、QT-9细胞、Vero细胞、MRC-5细胞、B细胞或人类初级细胞(例如初级成纤维细胞、树突细胞)。更多的详细信息参见WO04074493，其以全文并入本文。

如果将DNA构建体导入到真核细胞中，并且将编码K1L的DNA和外源DNA与病毒DNA重组，就可能通过在需要K1L功能支持病毒生长的细胞例如RK-13细胞中传代分离到所需重组痘苗病毒MVA。该重组病毒可通过已知的噬斑纯化方式进行克隆(比较Nakano等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，1593-1596，1982)；Franke等人，Mol.Cell.Biol.，1918-1924，1985；Chakrabarti等人，Mol.Cell.Biol.，3403-3409，1985；Fathi等人，Virology 97-105，1986)。

被插入的DNA构建体可以是线状的或环状的。优选使用环状的DNA。特别优选使用质粒。

所述DNA构建体可以含有位于MVA基因组内非必要位点左侧和右侧的侧翼序列，所述非必要位点例如是缺失III(Sutter，G.和Moss，B.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10847-10851，1992)、MVA基因组内改造的K1L缺失位点或根据本发明的突变MVA基因组内的任意非必要位点。

可以将所述外源DNA序列插到非必要位点例如天然发生的缺失位点的侧翼序列之间。

所述外源DNA序列可以是编码治疗性多肽的基因，所述治疗性多肽如分泌型蛋白质，例如：抗体多肽、趋化因子、细胞因子或干扰素，或者所述外源DNA序列可以是致病因子多肽，所述致病因子多肽可优选用作接种目的或者用于生产治疗性多肽或者有科研价值的多肽。所述致病因子可理解为是能引起疾病的病毒、细菌和寄生虫，以及在有机体中无限增殖并可能导致病理生长的肿瘤细胞。这些致病因子的例子记载于Davis，B.D.等人的Microbiology，3rd ed.，Harper International Edition。优选的致病因子的基因为下列致病因子的基因：流感病毒、麻疹和呼吸道合胞病毒、登革热病毒、人类免疫缺陷病毒例如HIV I和HIV II、人类肝炎病毒例如HCV和HBV、疱疹病毒、乳头瘤病毒、恶性疟原虫和引发结核的分支杆菌。

优选的编码肿瘤相关抗原的基因是与黑色素瘤相关的分化抗原例如酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白1和酪氨酸酶相关蛋白2的基因；肿瘤-睾丸抗原例如MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3和BAGE的基因；在肿瘤上过度表达的非突变型共用抗原例如Her-2/neu，MUC-1和p53的基因。

用于本发明的其它外源序列是包含人工抗原决定簇或含有例如小基因、多表位基因(polytopes)等序列的抗原决定簇的多肽序列。

所述DNA构建体可以通过转染导入到细胞中，例如用磷酸钙沉淀法(Graham等人，Virol.，52，456-467，1973；Wigler等人，Cell，777-785，1979)、电穿孔法(Neumann等人，EMBO J.，1，841-845，1982)、显微注射法(Graessmann等人，Meth.Enzymoloy，101，482-492，1983)、脂质体法(Straubinger等人，Methods in Enzymology，101，512-527，1983)、原生质球法(Schaffner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，2163-2167，1980)或是通过本领域技术人员公知的其他方法。优选使用磷酸钙沉淀法进行转染。

为了制备疫苗，将本发明的重组MVA转化成生理可接受的形式，然后并入试剂盒。这可基于多年来制备用于抵御天花进行接种的疫苗的经验(Kaplan，Br.Med.Bull.25，131-135，1969)完成。典型地，在安瓿中，优选在玻璃安瓿中，将约10⁶-10⁸重组MVA颗粒在含有2％胨和1％人白蛋白的100ml磷酸盐缓冲液(PBS)中冻干。关于给予的MVA剂量的进一步信息将在下文给出。冻干品可含有适合于肠胃外给药的补充剂(如甘露醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮)或者其他助剂(如抗氧化剂、稳定剂等)。然后将玻璃安瓿密封，并可优选在-20℃以下保存几个月。

为了接种，可以将冻干品溶解于0.1-0.2ml的水溶液中，优选溶解于生理盐水中，并经肠胃外给药，例如皮内接种。本发明的疫苗优选为皮内注射。在注射部位可能会有轻微的红肿，有时还会发痒(Stickl等人，参见上文)。本领域的技术人员可以通过已知方法选择给药方式、剂量和给药次数。为了获得对外源抗原高水平的免疫应答，在一定时期内适当接种多次疫苗是有利的。

根据优选的实施方式，在本发明的试剂盒中，以重组MVA颗粒的感染单位(IU)测定，所述第一组分与所述第二组分的量的比例为1∶5-1∶20，优选为1∶10。例如，用于初级免疫步骤的重组MVA(不包含泛素)的IU是每只小鼠10⁵-10⁶。与现有技术的方法相比，这是比较低的颗粒量。为获得与使用10⁷-10⁸IU的不包含泛素的重组颗粒相同的T细胞应答(现有技术的强化免疫步骤)，使用重组MVA(包含泛素)进行动物的强化免疫使用的剂量为约10⁶-10⁷。因此，相对于现有技术，用于强化步骤的IU数量可以降低约90％。

重组MVA对于人类的给药上限为约5×10⁸IU，并且仅使用比该上限明显低的重组MVA量就可以实现增强的免疫应答。

本发明的第二方面为试图将本文所定义的重组MVA或试剂盒用于抗癌治疗或预防传染性疾病。

本发明的第三方面还涉及使用本文定义的试剂盒制备用于增强哺乳动物中T细胞应答方法中使用的药物，所述方法包含如下步骤：

a)提供本文定义的试剂盒；

b)使用对获得初级免疫应答有效量的第一组分初级免疫哺乳动物；

c)使用对获得再次免疫应答有效量的第二组分强化免疫所述哺乳动物。

该试剂盒可优选用于制备治疗癌症或预防传染性疾病的药物。

根据进一步优选的实施方式，所述强化免疫步骤在初级免疫步骤之后的第2-12周，优选第4-8周进行。如上所述，本文公开的试剂盒用于接种方法。

优选地，治疗的哺乳动物是人类。

本发明进一步提供一种在哺乳动物中增强T细胞应答的方法，包含如下步骤：

a)提供本文定义的试剂盒；

b)使用对获得初级免疫应答有效量的第一组分初级免疫哺乳动物；

c)使用对获得再次免疫应答有效量的第二组分强化免疫所述哺乳动物。

在替代方法中，从患者体内分离或回体法(ex vivo)产生树突细胞(DC)，然后使用表达本发明的泛素化抗原的rMVA感染该树突细胞。可将这些感染的树突细胞作为疫苗过继转移回患者体内，以直接初级免疫幼T细胞或扩增现有的对各自的抗原具有特异性的T细胞。还可以将这些受感染的树突细胞用于在体外初级免疫T细胞或扩增T细胞，以将这些体外产生的T细胞过继转移到接受者体内。

再一方面，本发明包含一种重组MVA，其携带编码融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包含：

a)泛素或其功能部分；以及

b)如上所述的外源蛋白或其功能部分，

其中重组MVA包含巨细胞病毒产生的抗原的融合蛋白，并且不包含泛素。

又一方面，本发明提供一种重组MVA在初级-强化免疫接种中作为强化免疫剂的应用，所述重组MVA携带编码融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包含：

-泛素或其功能部分；以及

-一种或多种外源蛋白或其功能部分。

如上所述，令人惊奇地发现该重组MVA显示与包含的外源蛋白无关的增强的再次免疫应答。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它文献都以其全文并入本文。当出现不一致时，本说明书包括定义将起支配作用。另外，所述的材料、方法和实施例只是说明性的，而不是用于限制本发明。

附图说明

通过以下附图进一步说明本发明：

图1.在痘苗病毒-特异性启动子P7.5的控制下，表达泛素/酪氨酸酶融合基因的重组MVA的构建。(A)病毒基因组插入位点(缺失III)和病毒中间体以及在同源重组之后获得的最终构建体的示意图。(B)杂交PCR(琼脂糖凝胶)之后获得的重组泛素/酪氨酸酶融合基因。作为对照，还显示出泛素或酪氨酸酶单独的DNA片段。

图2.在使用编码原始酪氨酸酶(MVA-hTyr P7.5)或泛素化酪氨酸酶(MVA-ubi/hTyr P7.5)或亲代MVA(MVA-wt)的重组MVA感染的BHK细胞中，人酪氨酸酶基因表达的Western印迹分析。在标明的感染后小时数(h.p.i.)收集细胞。通过8％SDS-PAGE分离细胞裂解物。用抗酪氨酸酶mAb T311和过氧化物酶标记的抗小鼠IgG二抗探测由该凝胶产生的印迹，并使用增强的化学发光(ECL)进行显示。

图3.在痘苗病毒-特异性启动子P7.5(MVA-hTyr P7.5(●))的控制下或以泛素化的形式(MVA-ubi/hTyr P7.5(■))，使用表达人酪氨酸酶的重组MVA感染的靶细胞的抗原呈递能力。在6-h[⁵¹Cr]释放法中，测定由抗人酪氨酸酶肽抗原决定簇369-377的A*0201限制性鼠CTL应答引起的特异性裂解。

图4.由产生原始酪氨酸酶或泛素化酪氨酸酶的重组MVA病毒单免疫诱导的急性期酪氨酸酶-特异性初级CD8+T细胞应答。HHD-小鼠使用10⁷IU的MVA-hTyr P7.5(灰色条带)、MVA-ubi/hTyr P7.5(黑色条带)或MVA-wt(白色条带)进行初级免疫。在第8天分析MVA特异性T细胞应答和酪氨酸酶特异性T细胞应答。(A)使用对人酪氨酸酶抗原决定簇369-377具有特异性的嵌合A2K^b-四聚体对脾细胞进行染色，以VV抗原决定簇VP35#1或HER-2抗原决定簇43 5作为对照。(B)使用人酪氨酸酶抗原决定簇369-377对牌细胞进行肽刺激、以VV抗原决定簇VP35#1或HER-2抗原决定簇43 5作为对照，然后筛选胞内干扰素γ产量(ICS)。用平均数±标准偏差(s.d.)表示四只小鼠的全部结果。

图5.由异源DNA-MVA初级-强化免疫接种诱导的急性期酪氨酸酶-特异性再次CD8+T细胞应答。A2K^b-小鼠使用编码酪氨酸酶的DNA疫苗通过肌肉注射进行两次初级免疫，并使用10⁷IU的产生原始酪氨酸酶(MVA-hTyr)或泛素化酪氨酸酶(MVA-ubi/hTyr)的重组MVA通过腹腔注射进行一次强化免疫。在最后接种之后的第5天，通过嵌合A2K^b-四聚体染色(A)或ICS(B)分析脾细胞对人酪氨酸酶抗原决定簇369-377的特异性。对于至少三次独立实验，结果具有代表性。

图6.由异源MVA-MVA初级-强化免疫接种诱导的急性期酪氨酸酶-特异性再次CD8+T细胞应答。HHD-小鼠使用10⁷IU的产生原始酪氨酸酶(MVA-hTyr)酪氨酸酶的重组MVA通过腹腔注射进行初级免疫，并用10⁸IU的产生原始酪氨酸酶(MVA-hTyr)或泛素化酪氨酸酶(MVA-ubi/hTyr)的重组MVA通过腹腔注射进行强化免疫。在最后接种之后的第5天，收集脾细胞，该脾细胞使用人酪氨酸酶抗原决定簇369-377进行肽刺激、以VV抗原决定簇B22R或HER-2抗原决定簇435作为对照，然后筛选胞内干扰素γ产量(ICS)。

图7.使用编码原始酪氨酸酶(MVA-hTyr P7.5)或泛素化酪氨酸酶(MVA-ubi/hTyr P7.5)或亲代MVA(MVA-wt)的重组MVA感染的RMA细胞的脉冲追踪实验。5小时后，将感染细胞饥饿培养20分钟，然后用50μCi³⁵S-标记的甲硫氨酸和半胱氨酸脉冲45分钟，然后用RPMI培养基进行追踪。在标明的时间点，使用抗酪氨酸酶mAb C-19进行免疫沉淀。通过8％SDS-PAGE分离沉淀物，并在磷屏成像上进行显示。泛素化酪氨酸酶的体内半衰期显著降低，并可估计小于30分钟，而原始酪氨酸酶的体内半衰期估计大于10小时(Jiménez等人，1988)。

图8.在感染的RMA和HeLa细胞中，由重组MVA表达的泛素化人酪氨酸酶的免疫沉淀。

图9.体内MVA-ubi/hTyr的免疫原性：在HHD-小鼠的MVA/MVA初级-强化接种之后测定的HLA-A*0201-限制性酪氨酸酶-抗原决定簇-特异性CD8+T细胞应答(回忆应答)。全部小鼠使用10⁵IU(A)或10⁷IU(B)的MVA-hTyr进行初级免疫，并用10⁷IU的MVA-Ub-hTyr或MVA-hTyr进行强化免疫。在强化免疫后的第5天，筛选脾细胞的胞内干扰素γ产量(ICS)。

图10.以较小剂量的初级接种之后，相对于MVA-hTyr强化免疫动物，MVA-Ub/hTyr的高效体内细胞毒性。HHD-小鼠使用10⁷(A)或10⁶(B)IU的MVA-hTyr进行初级免疫，然后在初级免疫后的第30天，使用10⁷IU的MVA-hTyr或MVA-Ub/hTyr进行强化免疫。在强化免疫后的第5天，评价使用人酪氨酸酶抗原决定簇369-377或以HER-2抗原决定簇435-443作为对照标记的静脉注射的自体脾细胞的快速体内死亡。比较在血液或脾中标明的不同初级免疫剂量的靶细胞的特异性5小时体内裂解。

图11.在免疫之前，使用重组MVA转化的细胞强化免疫的急性期酪氨酸酶-特异性再次CD8+T细胞应答。HHD-小鼠使用10⁷IU的产生原始酪氨酸酶(MVA-hTyr)的重组MVA通过腹腔注射进行初级免疫，并使用10⁶RMA-HHD细胞通过腹腔注射进行强化免疫，所述的RMA-HHD细胞使用产生原始酪氨酸酶(MVA-hTyr)或泛素化酪氨酸酶(MVA-ubi/hTyr)的重组MVA以10IU/细胞进行感染。在最后接种后的第5天收集脾细胞，使用人酪氨酸酶抗原决定簇369-377对所述脾细胞进行肽刺激、以HER-2抗原决定簇435-443作为对照，然后筛选胞内干扰素γ产量(ICS)。

具体实施方式

实施例

材料和方法

质粒的构建

构建泛素/酪氨酸酶融合基因，将其克隆到MVA转移载体pIIIdHR-P7.5中。本文我们建立了一种杂交PCR方法，其中可将泛素(Ub)基因融合到酪氨酸酶(hTyr)cDNA中，而没有插入任何另外的非Ub或非hTyr DNA序列。因为表达为蛋白融合体的泛素在其G76残基处被胞质蛋白酶切割，我们致力于将G76突变为A76，已经显示当由质粒载体表达时，A76抑制胞质切割(Rodriguez F等人，J Virol，1997)。

在第一步骤中，根据厂家(Titan One Tube RT-PCR System，Roche)的说明书，在标准的逆转录酶PCR中，从鼠B16黑素瘤细胞的RNA制剂中扩增泛素。选择引物5′-GGG CGG ATC CGA CCA TGC AGA TCT TCGTGA AGA CCC TGAC-3′和5′-CAA AAC AGC CAG GAG CAT CGC ACCTCT CAG GCG AAG GAC CAG-3′，以在所得片段的5′-末端产生BamHI限制性位点(带有下划线)，并且在3′-末端与hTyr有15bp的重叠，此外，将泛素残基G76突变为A76(拉丁文和带有下划线的残基)。

在第二步骤中，使用标准PCR从质粒pcDNAI-hTyr扩增人酪氨酸酶(Drexler等人，Cancer Res，1999)。将hTyr cDNA使用引物5′-CGC CTGAGA GGT GCG ATG CTC CTG GCT GTT TTG TAC TGC CTG-3′和5′-GGG CGT TTA AAC TTA TAA ATG GCT CTG ATA CAA GCT GTGGT-3′进行延伸，使其在5′-末端与泛素有18bp的重叠并在3′-末端具有PmeI限制性位点(带有下划线)。

纯化产生的片段(PCR纯化试剂盒，Qiagen)，并在使用引物5′-GGGCGG ATC CGA CCA TGC AGA TCT TCG TGA AGA CCC TGAC-3′和5′-GGG CGT TTA AAC TTA TAA ATG GCT CTG ATA CAA GCT GTGGT-3′的杂交PCR中作为模板。为了制备MVA转移载体pIIIdHR-P7.5-Ub-hTyr，将泛素/酪氨酸酶融合基因(Ub-hTyr)克隆到pIIIdHR-P7.5的独特的BamHI/PmeI限制性位点中，其含有P7.5早期/晚期启动子、lacZ基因序列、K1L宿主范围选择基因和用于整合到MVA基因组的缺失III中的侧翼MVA-DNA序列。

然后通过电穿孔法将载体pIIIdHR-P7.5-Ub-hTyr转移到大肠杆菌DH10B(Gibco)中，并通过氨苄青霉素抗性进行选择。扩增并制备质粒-DNA(Maxiprep Kit，Qiagen)。

重组病毒的制备

通过同源重组，随后进行如前所述的短暂的宿主范围选择(Staib等人，2004)获得重组病毒。简言之，在六孔组织培养板中，将单层的鸡胚成纤维细胞(CEF)培养至80％融合，然后使用野生型MVA(MVA-wt)以每个细胞0.01的感染复数(MOI)进行感染。1小时后，感染细胞使用转染试剂(FuGENE6，Roche)对质粒pIIIdHR-P7.5-Ub-hTyr转染，并在无血清的RPMI培养基中培养8小时。然后洗涤细胞，并在RPMI/10％FCS中培养48小时后收集细胞，冻融3x并在杯状超声波仪中超声处理。将释放的病毒逐级稀释，并用于感染用于宿主范围选择的兔肾细胞(RK-13)。通过DNA提纯和PCR，在RK-13细胞上进行2-3次噬斑传代后，在显微镜下筛选典型噬斑以获得重组基因和野生型DNA(wt-DNA)。使用产生重组MVA-Ub-hTyr的无MVA-wt的噬斑对CEF细胞进行噬斑纯化，以除去K1L宿主范围选择基因，然后扩增。纯化病毒原料，滴定，并通过PCR分析野生型MVA的不存在和MVA-Ub-hTyr的存在。

Western印迹分析

使用Western印迹分析确认泛素化酪氨酸酶的表达和降解。在所述特异性蛋白酶体抑制剂存在时，使用MOI为10的编码原始酪氨酸酶(MVA-hTyr P7.5)或泛素化酪氨酸酶(MVA-ub/hTyr P7.5)或亲代MVA(MVA-wt)的重组MVA感染幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠成纤维细胞(NIH3T3)、鼠T淋巴瘤细胞(RMA)和人类宫颈癌细胞(HeLa)。在标明的时间收集细胞，冻融并进行超声。如所述进行免疫沉淀(参见图8)。通过在SDS-8％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离细胞裂解物，并且在含有25mMTris、192mM甘氨酸和20％甲醇(pH8.6)的缓冲液中将细胞裂解物电印迹到硝化纤维上1小时。室温下在含有1％BSA和0.1％NP40的PBS阻滞缓冲液中将印迹阻滞1小时，然后在室温下使用在阻滞缓冲液中稀释100倍的mAb T311(Novocastra)培养过夜。在用0.1％NP40的PBS洗涤之后，在室温下使用辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG二抗(Dianova)，将印迹培养1小时，并通过增强的化学发光(ECL)显示。

结果：由MVA-Ub-Tyr表达的泛素化酪氨酸酶在尺寸上比由MVA-Tyr表达的原始酪氨酸酶稍大，表明已融合于8kD-单泛素。仅在不影响原始酪氨酸酶的表达或检测的特异性蛋白酶体抑制剂存在时，可检测到由MVA-Ub-Tyr表达的泛素化酪氨酸酶。当蛋白酶体被有效抑制时，对于表达蛋白的总量，两种构建体之间没有差别。蛋白酶体未被抑制时，泛素化酪氨酸酶的蛋白量低于Western印迹分析的检测水平，说明酪氨酸酶的泛素化导致快速的蛋白酶体依赖性降解。

免疫沉淀

如上所述的Western印迹分析制备细胞裂解物，并用0.2μg的mAbC-19(Santa Cruz Biotech，Heidelberg)在振摇装置中4℃培养1小时。然后加入20μl小心振摇的蛋白-G-琼脂糖(Santa Cruz Biotech，Heidelberg)，在摇床上4℃将探针培养过夜。

脉冲追踪实验和放射免疫沉淀

使用编码原始酪氨酸酶(MVA-hTyr P7.5)或泛素化酪氨酸酶(MVA-ubi/hTyr P7.5)或亲代MVA(MVA-wt)的重组MVA感染RMA细胞，使用该感染的RMA细胞进行脉冲追踪实验。5小时后，将感染细胞用不含甲硫氨酸/半胱氨酸、含有1％的过谷氨酰胺和1％丙酮酸的Dubecco′s培养基饥饿培养20分钟，然后用50μCi³⁵S-标记的甲硫氨酸和半胱氨酸脉冲45分钟，随后用RPMI培养基进行追踪。在标明的时间，用抗酪氨酸酶mAb C-19进行免疫沉淀。通过8％SDS-PAGE分离沉淀物，并在磷屏成像仪上显示。

结果：脉冲追踪实验显示由MVA-Tyr和MVA-Ub-Tyr表达的放射性标记的蛋白量相近。再次显示预期的泛素化酪氨酸酶的尺寸增加。在4小时的观察期内，由MVA-Tyr表达的原始酪氨酸酶稳定，而由MVA-Ub-Tyr表达的泛素化酪氨酸酶经历了快速降解。泛素化酪氨酸酶的体内半衰期显著降低，并可估计小于30分钟。相反，与我们的结果一致，原始酪氨酸酶的体内半衰期估计大于10小时(Jiménez等人，1988)。

铬释放法

在6-h[⁵¹Cr]释放法中，测定由抗人酪氨酸酶肽抗原决定簇369-377的A*0201限制性鼠CTL应答引起的特异性裂解。简言之，使用MVA-wt、MVA-hTyr或MVA-Ub-Tyr以MOI为5对HLA-A*0201阳性A375细胞进行感染3小时，洗涤一次，在37℃下，使用100μCi Na⁵¹CrO₄标记1小时，然后洗涤4次。将标记的靶细胞以1×10⁴细胞/孔放在U型底96孔平板上，在37℃另外培养8小时。感染后15小时，以各种E∶T比与靶细胞一起培养效应细胞。6小时后，收集每孔100μl的上清液，并测定特异性⁵¹Cr释放。

结果：酪氨酸酶的泛素化导致受感染的靶细胞的Tyr-特异性CTL识别显著增强，表明即使在病毒感染的早期时间点，肽生产增加，并且在细胞表面获得更高的MHCI类分子-肽的密度。

小鼠和接种程序

HLA-A*0201-转基因HHD-小鼠或A2K^b-小鼠为在无特异性致病因子条件下室内饲养得到。用标明的重组MVA剂量(腹腔注射)或DNA(肌肉注射)接种小鼠。在接种后的第8天，分析由单免疫小鼠诱导的急性期酪氨酸酶-特异性初级CD8+T细胞应答。在最后免疫后的第5天，分析由MVA-MVA或DNA-MVA初级-强化免疫小鼠诱导的急性期酪氨酸酶-特异性再次CD8+T细胞应答。所述小鼠进行一次初级免疫(重组MVA)，并在初级免疫后的第30天进行强化免疫，或者所述小鼠在一周间隔内进行两次初级免疫(DNA)，并在第一次初级免疫后的第30天进行强化接种。处死小鼠，取脾，通过ICS或四聚体结合法进行分析。

胞内细胞因子染色

使用人酪氨酸酶抗原决定簇369-377对来自接种小鼠的脾细胞进行5小时的肽刺激、以VV抗原决定簇VP35#l或B22R或HER-2抗原决定簇435作为对照。在最后的3小时，加入Brefeldin A(GolgiPlug，Pharmingen)。根据厂家的说明，使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(Pharmingen)对产生IFNγ的胞内细胞因子进行染色。在FACSCalibur或FACSCanto(两者都来自Becton Dickinson)上测得数据。进一步用FLOWJO(Tree Star)软件分析获得的数据。

通过MHC四聚体染色分析表型T细胞

如上所述，制备嵌合的A2K^b四聚体剂(Busch等人，1998)。使用ethidium monazide(分子探针)培养细胞以辨别存活/死亡和抗小鼠-Fc-Ab，以避免表面标记物抗体(Abs)的非特异性结合，洗涤三次，随后用mAbs抗CD8α(克隆53-5.8)和抗CD62L(克隆MEL-14)(两者均来自Pharmingen)对MHC四聚体和表面标记物染色45分钟，并再次洗涤三次。在4℃下进行所有的步骤。在FACSCalibur或FACSCanto(两者都来自Becton Dickinson)上测得数据。进一步用FLOWJO(Tree Star)软件分析获得的数据。

结果：显示与MVA-hTyr相比，通过使用MVA-Ub-hTyr强化免疫引起的Tyr特异性细胞毒素CD8+T细胞(CTL)应答，产生干扰素γ的细胞增加2倍，四聚体结合细胞增加达3倍。在使用DNA-或MVA-hTyr进行初级免疫的小鼠中，A2K^b-小鼠和HHD-小鼠均显示MVA-Ub-hTyr对于最有效增强Tyr-特异性CTL回忆应答的能力。明显地，当使用MVA-hTyr进行强化免疫时，与刺激产生可比较量的干扰素γ生产抗原决定簇特异性CD8+T细胞所需的10⁷IU相比，仅用10⁵IU的MVA-hTyr进行初级接种后，MVA-Ub-hTyr就可以引起强的回忆应答(图9)。

在本实施例中，通过使用表达泛素化抗原的重组MVA引起再次免疫应答，可使初级免疫的病毒剂量降低达100倍。该数据显示通过使用表达泛素化抗原的重组MVA强化再次免疫应答，可以在显著较低的病毒剂量下引起较强的靶抗原-特异性细胞毒素CD8+T细胞应答。重要地是，这也证明需要较低剂量进行初级免疫还减少了在抗如VV抗原决定簇B22R的再次应答中的VV-特异性CD8+T细胞。

体内CTL试验

制备幼鼠的自体脾细胞，将其分为两组。其中一组使用人酪氨酸酶抗原决定簇369-377(1μM)进行脉冲，然后用高浓度(5μM)的5，6-羧基-荧光素琥铂酰亚胺酯(CFSE，分子探针)标记，另一组用HER-2抗原决定簇435-443(1μM)作为对照进行脉冲，然后用低浓度(0.5μM)的CFSE标记。将CFSE标记的10⁷肽脉冲细胞/ml PBS于37℃在5％CO₂恒温箱中用CFSE培养10分钟。为了终止标记反应，加入20mlRPMI/10％FCS。用PBS洗涤三次除去游离的CFSE后，每组的1×107细胞以1∶1混合于200μl的PBS中，将其通过尾部静脉注射给每只受体小鼠。在5小时之后收集受体小鼠的脾和血液，在FACSCanto血细胞计数器(Becton-Dickinson)分析靶细胞的特异性裂解。得到至少5,000个CFSE“低”标记细胞。通过如下公式计算体内特异性裂解：100-([(％在接种应答子中“高”CFSE/在接种应答子中“低”CFSE)/(％在天然应答子中“高”CFSE/在天然应答子中“低”CFSE]×100)。

SEQUENCE LISTING

序列表

<110>GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH

     GSF环境与健康研究中心有限公司

<120>MVA vaccine

     MVA疫苗

<130>P20168

<140>PCT

<141>2006-01-24

<150>EP 05001362.2

<151>2005-01-24

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>40

<212>DNA

<213>Artificial

    人工序列

<220>

<223>Primer

    引物

<400>1

gggcggatcc gaccatgcag atcttcgtga agaccctgac                    40

<210>2

<211>42

<212>DNA

<213>Artificial

     人工序列

<220>

<223>Primer

     引物

<400>2

caaaacagcc aggagcatcg cacctctcag gcgaaggacc ag                42

<210>3

<211>42

<212>DNA

<213>Artificial

    人工序列

<220>

<223>Primer

     引物

<400>3

cgcctgagag gtgcgatgct cctggctgtt ttgtactgcc tg                42

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Primer

     引物

<400>4

gggcgtttaa acttataaat ggctctgata caagctgtgg t                 41

<210>5

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<212>DNA

<213>Artificial

     人工序列

<220>

<223>Primer

     引物

<400>5

gggcggatcc gaccatgcag atcttcgtga agaccctgac                   40

<210>6

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial

     人工序列

<220>

<223>Primer

     引物

<400>6

gggcgtttaa acttataaat ggctctgata caagctgtgg t                 41

Claims (24)

1.一种试剂盒，包含下列组分：

a)第一组分，包含一种或多种外源蛋白或编码所述外源蛋白或其功能部分的核酸，与野生型蛋白相比，所述功能部分包含一个或多个取代、插入和/或缺失，同时与所述野生型蛋白具有相同的功能；以及

b)第二组分，包含重组修饰安卡拉痘苗病毒，其携带编码融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包含：

-泛素或其功能部分，与野生型蛋白相比，所述功能部分包含一个或多个取代、插入和/或缺失，同时与所述野生型蛋白具有相同的功能；以及

-一种或多种外源蛋白，即一种或多种非天然存在的作为修饰安卡拉痘苗病毒一部分的蛋白或其功能部分，与野生型蛋白相比，所述功能部分包含一个或多个取代、插入和/或缺失，同时与所述野生型蛋白具有相同的功能；

其中所述第一组分和第二组分还选择性地包含药学上可接受的载体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述融合蛋白还包含泛素和所述外源蛋白之间的连接体。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述外源蛋白为选自治疗性多肽和致病因子多肽及其功能部分的异源多肽。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其中所述治疗性多肽选自分泌型蛋白质。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其中所述分泌型蛋白质选自抗体多肽、趋化因子、细胞因子和干扰素组成的组。

6.如权利要求3所述的试剂盒，其中所述致病因子选自病毒、细菌、原生动物和寄生虫以及肿瘤细胞或肿瘤细胞相关抗原及其功能部分。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述病毒选自流感病毒、麻疹和呼吸道合胞病毒、登革热病毒、人类免疫缺陷病毒、人类肝炎病毒、疱疹病毒或乳头瘤病毒。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述原生动物是恶性疟原虫。

9.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述细菌是引发结核的分支杆菌。

10.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述肿瘤细胞相关抗原选自黑色素瘤相关的分化抗原、肿瘤-睾丸抗原以及在肿瘤上过度表达的非突变型共用抗原。

11.如权利要求10所述的试剂盒，其中所述黑色素瘤相关的分化抗原选自酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1和酪氨酸酶相关蛋白2组成的组。

12.如权利要求10所述的试剂盒，其中所述肿瘤-睾丸抗原选自MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3和BAGE组成的组。

13.如权利要求10所述的试剂盒，其中所述在肿瘤上过度表达的非突变型共用抗原选自Her-2/neu、MUC-1和p53组成的组。

14.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中在修饰安卡拉痘苗病毒基因组内的非必要位点以DNA序列形成所述融合蛋白和/或外源蛋白编码区域各自的侧翼。

15.如权利要求14所述的试剂盒，其中所述非必要位点为修饰安卡拉痘苗病毒基因组内的缺失III。

16.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中以重组修饰安卡拉痘苗病毒颗粒的感染单位(IU)测定，所述第一组分与所述第二组分的量的比例为1∶5-1∶20。

17.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述第一组分与所述第二组分的量的比例为1∶10。

18.如权利要求1或2所述的试剂盒在制备用于治疗癌症或用于预防传染性疾病的药物中的应用。

19.如权利要求1或2所述的试剂盒在制备用于在哺乳动物中增强T细胞应答方法使用的药物中的应用，所述方法包含如下步骤：

a)提供如权利要求1或2所述的试剂盒；

b)使用对获得初级免疫应答有效量的第一组分初级免疫哺乳动物；

c)使用对获得再次免疫应答有效量的第二组分强化免疫所述哺乳动物。

20.权利要求19所述的应用在制备用于治疗癌症或预防传染性疾病的药物中的应用。

21.如权利要求19或20所述的应用，其中所述强化免疫步骤在所述初级免疫步骤之后的第2-12周进行。

22.如权利要求21所述的应用，其中所述强化免疫步骤在所述初级免疫步骤之后的第4-8周进行。

23.如权利要求19或20所述的应用，其中所述接受治疗的动物是人类。

24.重组修饰安卡拉痘苗病毒在制备初级-强化免疫接种中作为强化免疫剂的用于治疗癌症或预防传染性疾病的药物中的应用，所述重组修饰安卡拉痘苗病毒携带编码融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包含：

-泛素或其功能部分，与野生型蛋白相比，所述功能部分包含一个或多个取代、插入和/或缺失，同时与所述野生型蛋白具有相同的功能；以及

-一种或多种外源蛋白，即一种或多种非天然存在的作为修饰安卡拉痘苗病毒一部分的蛋白或其功能部分，与野生型蛋白相比，所述功能部分包含一个或多个取代、插入和/或缺失，同时与所述野生型蛋白具有相同的功能。

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