ES2944314T3 - Composiciones y procedimientos para generar una respuesta inmunitaria frente a un antígeno asociado a un tumor - Google Patents

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Abstract

Las composiciones y los métodos se describen para generar una respuesta inmunitaria a un antígeno asociado a un tumor tal como MUC1. Las composiciones y métodos descritos en el presente documento se refieren a un vector vaccinia Ankara (MVA) modificado que codifica uno o más antígenos virales para generar una respuesta inmunitaria protectora frente a una neoplasia que expresa el antígeno asociado al tumor en el sujeto al que se administra el vector. Las composiciones y métodos de la presente invención son útiles tanto profiláctica como terapéuticamente y pueden usarse para prevenir y/o tratar neoplasmas y enfermedades asociadas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y procedimientos para generar una respuesta inmunitaria frente a un antígeno asociado a un tumor
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento se refieren a composiciones, incluyendo composiciones vacunales, para generar una respuesta inmunitaria frente a un antígeno asociado a un tumor (TAA ); procedimientos de fabricación; y procedimientos de uso de las mismas. Las composiciones y los usos de las mismas de la presente invención son útiles tanto profiláctica como terapéuticamente.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Se calcula que en 2016 se diagnosticaron 1.685.210 nuevos casos de cáncer y se produjeron 595.690 muertes por cáncer en EE . UU. (Cancer Facts & Figures 2016, American Cancer Society 2016). Las vacunas contra el cáncer basadas en antígenos humanos asociados a tumores (TAA) se han probado en pacientes con cáncer avanzado o recurrente, en combinación con la terapia estándar o tras ella. La inmunogenicidad y la eficacia terapéutica de las vacunas contra el cáncer han sido difíciles de evaluar adecuadamente debido a los múltiples efectos altamente supresores del microambiente tumoral y a las acciones de la terapia estándar sobre el sistema inmunitario del paciente. En modelos animales de cáncer humano, las vacunas administradas en el contexto profiláctico son las más inmunógenas y previenen eficazmente el desarrollo y la progresión del cáncer.
Las vacunas basadas en TAA humanos son inmunogénicas y seguras y capaces de provocar una memoria a largo plazo que es importante para la prevención del cáncer.
Una TAA particular es la MUC-1, que pertenece a la familia de las mucinas y codifica una fosfoproteína glicosilada unida a la membrana. MUC1 tiene una masa proteica central de 120-225 kDa que aumenta a 250-500 kDa con la glicosilación. Se extiende 200-500 nm más allá de la superficie de la célula (Brayman M, Thathiah A, Carson DD, 2004, Reprod Biol Endocrinol. 2: 4). La proteína está anclada a la superficie apical de muchos epitelios por un dominio transmembrana. Estas repeticiones son ricas en residuos de serina, treonina y prolina, lo que permite una fuerte oglicosilación (Brayman M, Thathiah A, Carson DD, 2004, Reprod Biol Endocrinol. 2: 4). Se han descrito múltiples variantes del transcrito empalmadas alternativamente que codifican diferentes isoformas de este gen.
La cola citoplasmática de MUC-1 tiene una longitud de 72 aminoácidos y contiene varios sitios de fosforilación (Singh PK, Hollingsworth MA (agosto de 2006), Trends Cell Biol. 16 (9): 467-476). La proteína cumple una función protectora al unirse a patógenos y también funciona en una capacidad de señalización celular (Lindén SK et al.2009, PLoS Pathog. 5 (10): e1000617)
La sobreexpresión, la localización intracelular aberrante y los cambios en la glicosilación de esta proteína se han asociado a carcinomas. Concretamente, la sobreexpresión de MUC-1 se asocia a menudo con cánceres de colon, mama, ovario, pulmón y páncreas (Gendler S J (julio de 2001), J . Mammary Gland Biol Neoplasia. 6 (3): 339-353).
Los primeros enfoques que utilizan MUC-1 en constructos de vectores virales o las VLP para tratar o controlar el cáncer y otras enfermedades se han discutido en Fend et al, 2014, Pejawar-Gaddy et al, 2010, y el documento WO 2015/066715.
Sin embargo, hasta la fecha no existe ninguna vacuna contra el cáncer para humanos aprobada en EE .U U .. Lo que se necesita son composiciones vacunales inmunogénicas y procedimientos de uso para prevenir y tratar el cáncer causado por neoplasias.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento son útiles para generar una respuesta inmunitaria frente a un antígeno asociado a un tumor (TAA) en un sujeto que lo necesite. Ventajosamente, las composiciones y procedimientos pueden usarse profilácticamente para inmunizar a un sujeto contra antígenos asociados al cáncer, o usarse terapéuticamente para tratar o mejorar la aparición y gravedad de la enfermedad en un sujeto que lo necesite.
En una primera realización, la presente invención es un vector viral recombinante de vaccinia ankara modificada (MVA) que comprende (i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica en una orientación de 5' a 3' una secuencia quimérica de aminoácidos que comprende (a) un fragmento extracelular de un antígeno asociado a tumor (TAA), (b) un dominio transmembrana de una glicoproteína (GP) del virus de Marburgo, y (c) un fragmento intracelular del TAA; y
(ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína matriz VP40 del virus de Marburgo; en la que tanto la primera secuencia de ácido nucleico como la segunda secuencia de ácido nucleico están bajo el control de promotores compatibles con los sistemas de expresión de poxvirus.
En una realización, la secuencia TAA y la secuencia de proteína matriz se insertan en uno o más sitios de deleción del vector MVA.
En un aspecto, el TAA se selecciona del grupo que consiste en Antígeno Oncofetal/Proteína Receptora de Laminina Inmadura (OFA/iLRP), Alfafetoproteína (AfP), Antígeno Carcinoembrionario (CEA), CA-125, MUC-1, antígeno de tumor epitelial (ETA), Tirosinasa, antígeno asociado a melanoma (MAGE), productos anormales de ras, productos anormales de p53, o fragmentos inmunogénicos de los mismos.
En una realización, el TAA es MUC-1.
En un aspecto, el TAA es OFNiLRP.
En un aspecto, el TAA es CEA.
En una realización, la secuencia TAA y la secuencia de proteína de matriz se insertan en el vector MVA en un sitio de deleción natural, un sitio de deleción natural modificado, o entre genes MVA esenciales o no esenciales.
En otra realización, la secuencia TAA y la secuencia de proteína de matriz se insertan en el mismo sitio de deleción natural, un sitio de deleción natural modificado, o entre los mismos genes MVA esenciales o no esenciales
En otra realización, la secuencia TAA se inserta en un sitio de deleción seleccionado de I, II, III, IV, V o VI y la secuencia de proteína matriz se inserta en un sitio de deleción seleccionado de I, II, III, IV, V o Vl.
En otra realización, la secuencia TAA y la secuencia de proteína matriz se insertan en diferentes sitios de deleción naturales, diferentes sitios de deleción modificados, o entre diferentes genes MVA esenciales o no esenciales. En otra realización, la secuencia TAA se inserta en un primer sitio de deleción y la secuencia de proteína matriz se inserta en un segundo sitio de deleción.
En una realización particular, la secuencia TAA se inserta entre dos genes MVA esenciales y altamente conservados; y la secuencia de proteína de matriz se inserta en una deleción III reestructurada y modificada.
En una realización, la deleción III se modifica para eliminar secuencias no esenciales e insertar la secuencia de proteína matriz entre genes esenciales.
En una realización particular, la secuencia de proteína de matriz se inserta entre los genes MVA, I8R y G1L.
En una realización particular, la secuencia TAA se inserta entre dos genes MVA esenciales y altamente conservados para limitar la formación de mutantes de deleción viables.
En una realización particular, la secuencia de proteína TAA se inserta entre los genes MVA, I8R y G1L.
En una realización, el promotor se selecciona del grupo que consiste en los promotores Pm2H5, Psyn II y mH5 o combinaciones de los mismos.
En una realización, se optimiza la secuencia TAA. En una realización particular, la secuencia TAA se optimiza cambiando codones seleccionados por otros codones sinónimos que sean óptimos para la expresión de la proteína por MVA, interrumpiendo tramos homopolímeros mediante mutaciones silenciosas, interrumpiendo motivos de terminación de la transcripción mediante mutaciones silenciosas, o conduciendo a la expresión de la forma transmembrana (en lugar de secretada) de TAA, y combinaciones de las mismas.
En una realización, el vector viral MVA recombinante expresa TAA y proteínas de matriz que se ensamblan en las VLP.
En otra realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el vector MVA recombinante de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
En una realización, el vector MVA recombinante está formulado para administración intraperitoneal, intramuscular, intradérmica, epidérmica, mucosa o intravenosa.
En un tercer aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende dos vectores MVA recombinantes de la presente invención, en la que cada vector MVA de recombinación comprende una secuencia TAA, en la que (i) la secuencia TAA del primer vector MVA recombinante es diferente de la secuencia TAA del segundo vector MVA recombinante.
En un aspecto, la secuencia TAA y la secuencia de proteína de matriz se insertan en uno o más sitios de deleción del vector m Va .
En un aspecto, el TAA se selecciona del grupo que consiste en Antígeno Oncofetal/Proteína Receptora de Laminina inmadura (OFNiLRP), Alfafetoproteína (AFP), antígeno Carcinoembrionario (CEA), CA-125, MUC-1, antígeno de tumor Epitelial (ETA), tirosinasa, antígeno asociado a melanoma (MAGE) y productos anormales de ras y p53 o fragmentos inmunogénicos de los mismos.
En un aspecto, el TAA es MUC-1.
En un aspecto, el TAA es el Antígeno Oncofetal/Proteína Receptora de Laminina Inmadura (OFNiLRP).
En un aspecto, el TAA es el Antígeno Carcinoembrionario (CEA).
En un aspecto, el TAA del primer vector MVA recombinante es MUC-1 y el TAA del segundo vector MVA recombinante es Antígeno Oncofetal/Proteína Receptora de Laminina Inmadura (OFNiLRP).
En un aspecto, el TAA del primer vector MVA recombinante es MUC-1 y el TAA del segundo vector MVA recombinante es el antígeno carcinoembrionario (CEA).
En un aspecto, el TAA del primer vector MVA recombinante es Antígeno Oncofetal/Proteína Receptora de Laminina Inmadura (OFNiLRP) y el TAA del segundo vector MVA recombinante es Antígeno Carcinoembrionario (CEA). En un aspecto, la secuencia TAA y la secuencia de proteína de matriz se insertan en el vector MVA en un sitio de deleción natural, un sitio de deleción natural modificado, o entre genes MVA esenciales o no esenciales.
En otro aspecto, la secuencia TAA y la secuencia de proteína de matriz se insertan en el mismo sitio de deleción natural, el mismo sitio de deleción natural modificado, o entre los mismos genes MVA esenciales o no esenciales En otro aspecto, la secuencia TAA se inserta en un sitio de deleción seleccionado de I, II, III, IV, V o VI y la secuencia de proteína matriz se inserta en un sitio de deleción seleccionado de I, II, III, IV, V o Vl.
En otro aspecto, la secuencia TAA y la secuencia de proteína de matriz se insertan en diferentes sitios de deleción naturales, diferentes sitios de deleción modificados, o entre diferentes genes MVA esenciales o no esenciales. En otro aspecto, la secuencia TAA se inserta en un primer sitio de deleción y la secuencia de proteína matriz se inserta en un segundo sitio de deleción.
En un aspecto particular, la secuencia TAA se inserta entre dos genes MVA esenciales y altamente conservados; y la secuencia de proteína de matriz se inserta en una deleción III reestructurada y modificada.
En un aspecto, la deleción III se modifica para eliminar secuencias no esenciales e insertar la secuencia de proteína matriz entre genes esenciales.
En una realización particular, la secuencia de proteína de matriz se inserta entre los genes MVA, I8R y G1L.
En un aspecto particular, la secuencia TAA se inserta entre dos genes MVA esenciales y altamente conservados para limitar la formación de mutantes de deleción viables.
En un aspecto particular, la secuencia de proteína TAA se inserta entre los genes MVA, I8R y G1L.
En un aspecto, el promotor se selecciona del grupo que consiste en los promotores Pm2H5, Psyn II y mH5 o combinaciones de los mismos.
En un aspecto, se optimiza la secuencia TAA. En una realización particular, la secuencia TAA se optimiza cambiando codones seleccionados por otros codones sinónimos que sean óptimos para la expresión de la proteína por MVA, interrumpiendo tramos homopolímeros mediante mutaciones silenciosas, interrumpiendo motivos de terminación de la transcripción mediante mutaciones silenciosas, o conduciendo a la expresión de la forma transmembrana (en lugar de secretada) de TAA, y combinaciones de las mismas.
En un aspecto, el vector viral MVA recombinante expresa TAA y proteínas de matriz que se ensamblan en las VLP.
En un aspecto particular, la secuencia TAA del primer vector MVA recombinante es de una especie diferente a la secuencia TAA del segundo vector MVA recombinante.
En un cuarto aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende tres o más vectores MVA recombinantes de la presente invención, en la que cada vector MVA recombinante comprende una secuencia TAA, en la que (i) los tres o más vectores MVA recombinantes contienen diferentes secuencias TAA.
En un aspecto, las secuencias TAA son MUC-1, Antígeno Oncofetal/Proteína Receptora de Laminina inmadura (OFNiLRP) y antígeno Carcinoembrionario (CEA).
En un aspecto particular, las secuencias TAA proceden de la misma especie.
En un aspecto particular, las secuencias TAA son de especies diferentes.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos un vector MVA recombinante de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención del cáncer causado por neoplasias en un sujeto, en el que el al menos un vector MVA recombinante se administra al sujeto en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunitaria.
En una realización, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria humoral, una respuesta inmunitaria celular o una combinación de las mismas.
En una realización particular, la respuesta inmunitaria comprende la producción de anticuerpos de unión contra el TAA.
En una realización particular, la respuesta inmunitaria comprende la producción de anticuerpos neutralizantes contra el TAA.
En una realización particular, la respuesta inmunitaria comprende la producción de anticuerpos no neutralizantes contra el TAA.
En una realización particular, la respuesta inmunitaria comprende la producción de una respuesta inmunitaria mediada por células contra el TAA.
En una realización particular, la respuesta inmunitaria comprende la producción de anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes contra el TAA.
En una realización particular, la respuesta inmunitaria comprende la producción de anticuerpos neutralizantes e inmunidad mediada por células contra el TAA.
En una realización particular, la respuesta inmunitaria comprende la producción de anticuerpos no neutralizantes e inmunidad mediada por células contra el TAA.
En una realización particular, la respuesta inmunitaria comprende la producción de anticuerpos neutralizantes, anticuerpos no neutralizantes e inmunidad mediada por células contra el TAA.
En una realización, la neoplasia se selecciona de leucemia (por ejemplo, mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, eritroleucemia, leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica), linfoma (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin y enfermedad no Hodgkin), fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, tumor de Ewing, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de células renales, hepatoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, tumor testicular , carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, oligodendroglioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, displasia e hiperplasia.
En otra realización, el TAA es MUC-1 y la neoplasia se selecciona de Adenocarcinomas (mama, colorrectal, pancreático, otros), Tumor carcinoide, Cordoma, Coriocarcinoma, Tumor desmoplásico de células pequeñas redondas (DSRCT), Sarcoma epitelioide, Sarcoma folicular de células dendríticas, Sarcoma interdigitante de células dendríticas / células reticuladas, Pulmón: lesiones neumocíticas de tipo II (hiperplasia de células de tipo II, células de tipo II displásicas, hiperplasia alveolar apical), linfoma anaplásico de células grandes, linfoma difuso de células B grandes (variable), linfoma plasmablástico, linfoma de efusión primaria, mesoteliomas epitelioides, mieloma, plasmacitomas, perineurioma, carcinoma de células renales, sarcoma sinovial (zonas epiteliales), carcinoma tímico (a menudo), meningioma o enfermedad de Paget.
En un sexto aspecto, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos un vector MVA recombinante de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento del cáncer, en el que el al menos un vector MVA recombinante se administra a un sujeto que lo necesita en una cantidad eficaz para tratar el cáncer.
En un aspecto, el sujeto expresa marcadores de células tumorales, pero aún no es sintomático. En un aspecto particular, el tratamiento tiene como resultado la prevención de una enfermedad sintomática.
En otro aspecto, el sujeto expresa marcadores de células tumorales, pero presenta síntomas mínimos de cáncer. En otro aspecto, el procedimiento resulta en la mejora de al menos un síntoma de cáncer.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 es un esquema del vector lanzadera para MUC1 (pGeo-Muc1).
La FIG. 2 es un simple dibujo lineal que ilustra el diseño de los vectores MVA.
La FIG. 3 es un western blot que demuestra que las células infectadas con la vacuna MVA-Muc1VP40 (1) expresan la proteína Muc1, y (2) expresan Muc1 hipoglicosilada.
La FIG. 4 es una imagen de células que han sido inmunoteñidas para detectar la presencia de (1) proteína Muc1, y (2) proteína Muc1 hipoglicosilada. Las muestras celulares teñidas incluyen células de control negativo (MCF10A), células de control positivo (MCF7), células HEK-293T infectadas con la vacuna MVA-Muc1VP40 y células HEK-293T no infectadas con la vacuna MVA-Muc1VP40.
La FIG. 5 es una micrografía electrónica que muestra la producción de partículas similares a virus (VLP) por células infectadas con MVA-Muc1VP40, una vacuna MVA que codifica la proteína Muc1 TAA.
La FIG. 6 proporciona un esquema de una vía de modificación inicial para la disminución dirigida de la glicosilación ligada a O de Muc1.
La FIG. 7 proporciona un esquema de otra vía de modificación inicial para la disminución dirigida de la glicosilación ligada a O de Muc1.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
Se proporcionan composiciones y composiciones para su uso para producir una respuesta inmunitaria frente a un antígeno asociado a un tumor (TAA), en un sujeto que lo necesite. Las composiciones y usos de la presente invención pueden utilizarse para prevenir o retrasar la formación de neoplasias o para tratar neoplasias o enfermedades asociadas a las mismas (tal como el cáncer) en un sujeto que las necesite. En una realización, el tratamiento limita el desarrollo de la neoplasia, el crecimiento y/o la gravedad de la enfermedad asociada a la neoplasia, tal como el cáncer. Las composiciones o vacunas inmunogénicas ideales tienen las características de seguridad, eficacia, alcance de la protección y longevidad, sin embargo, las composiciones que tienen menos de todas estas características aún pueden ser útiles para prevenir el crecimiento de la neoplasia o limitar los síntomas o la progresión de la enfermedad en un sujeto expuesto tratado antes del desarrollo de los síntomas. La presente invención proporciona una composición farmacéutica que permite una protección al menos parcial, si no completa, tras una única inmunización.
La composición puede ser una vacuna recombinante o un vector inmunogénico que comprende una o más secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos asociados a tumores (TAA) o fragmentos inmunogénicos de los mismos. La composición puede ser una vacuna recombinante o un vector inmunogénico que comprenda un fragmento extracelular de MUC-1.
La composición puede ser una vacuna recombinante o un vector inmunogénico que comprenda un fragmento intracelular de m Uc -1.
La composición puede ser una vacuna recombinante o un vector inmunogénico que comprenda un fragmento extracelular y otro fragmento intracelular de MUC-1.
La composición puede ser una vacuna recombinante o un vector inmunogénico que comprenda un fragmento extracelular de MUC-1, un fragmento intracelular de MUC-1 y un dominio transmembrana de una glicoproteína (GP) del virus de Marburgo.
La composición puede ser una vacuna recombinante o un vector inmunogénico que comprenda un fragmento extracelular de un TAA, un fragmento intracelular de un TAA y un dominio transmembrana de una GP de un virus de la familia de los virus Filoviridae.
El vector expresa proteínas que forman las VLP y generan una respuesta inmunitaria a un TAA o fragmento inmunogénico del mismo.
En algunos aspectos, las respuestas inmunitarias son duraderas y duraderas de modo que no se requieren refuerzos repetidos, pero en otro aspecto, se proporcionan una o más administraciones de las composiciones proporcionadas en el presente documento para reforzar la respuesta inmunitaria cebada inicial.
I. Definiciones
Cuando un término se proporciona en singular, los inventores también contemplan aspectos de la invención descritos por el plural de dicho término. Tal como se utilizan en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, por ejemplo, "un péptido" incluye una pluralidad de péptidos. Así, por ejemplo, una referencia a "un procedimiento" incluye uno o más procedimientos y/o pasos del tipo descrito en el presente documento y/o que resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras la lectura de la presente divulgación.
El término "antígeno" se refiere a una sustancia o molécula, tal como una proteína, o fragmento de la misma, que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria.
El término "anticuerpo de unión" o "bAb" se refiere a un anticuerpo que se purifica a partir de un fluido corporal (por ejemplo, suero o una secreción mucosa) o está presente en él y que reconoce un antígeno específico. Tal como se utiliza en el presente documento, el anticuerpo puede ser un anticuerpo único o una pluralidad de anticuerpos. Los anticuerpos de unión comprenden anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes.
El término "cáncer" se refiere a una neoplasia maligna que ha sufrido una anaplasia característica con pérdida de diferenciación, aumento de la tasa de crecimiento, invasión del tejido circundante y es capaz de producir metástasis.
El término "respuesta inmune mediada por células" se refiere a la defensa inmunológica proporcionada por linfocitos, tal como la defensa proporcionada por linfocitos de células T sensibilizadas cuando lisan directamente células que expresan antígenos extraños y secretan citoquinas (por ejemplo, IFN-gamma.), que pueden modular las funciones efectoras de macrófagos y células asesinas naturales (NK) y aumentar la expansión y diferenciación de células T. La respuesta inmunitaria celular es la 2' rama de la respuesta inmunitaria adaptativa.
El término "sustitución conservadora de aminoácidos" se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido nativo por un residuo no nativo de manera que haya poco o ningún efecto sobre el tamaño, la polaridad, la carga, la hidrofobicidad o la hidrofilicidad del residuo de aminoácido en esa posición, y sin dar lugar a una inmunogenicidad sustancialmente alterada. Por ejemplo, pueden ser sustituciones dentro de los siguientes grupos: valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Las modificaciones conservadoras de aminoácidos en la secuencia de un polipéptido (y las modificaciones correspondientes en los nucleótidos codificantes) pueden producir polipéptidos con características funcionales y químicas similares a las de un polipéptido parental.
El término "deleción" en el contexto de un polipéptido o proteína se refiere a la eliminación de codones para uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia del polipéptido o proteína, en la que las regiones de ambos lados se unen. El término deleción en el contexto de un ácido nucleico se refiere a la eliminación de una o más bases de una secuencia de ácido nucleico, en la que las regiones a ambos lados se unen.
El término "virus Ébola" se refiere a un virus de la especie Zaire ebolavirus y tiene el significado que le da el International Committee on Taxonomy of Viruses documentado en (Kuhn, J.H . et al. 2010 Arch Virol 155:2083-2103).
El término "fragmento" en el contexto de un agente proteínico se refiere a un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 2 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 60 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 70 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 80 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 125 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 150 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 175 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 200 residuos de aminoácidos contiguos, o al menos 250 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de un péptido, polipéptido o proteína. En una realización, el fragmento constituye al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de la longitud total del polipéptido de referencia. En una realización, un fragmento de una proteína de longitud completa conserva la actividad de la proteína de longitud completa. En otra realización, el fragmento de la proteína de longitud completa no conserva la actividad de la proteína de longitud completa.
El término "fragmento" en el contexto de un ácido nucleico se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos 2 nucleótidos contiguos, al menos 5 nucleótidos contiguos, al menos 10 nucleótidos contiguos, al menos 15 nucleótidos contiguos, al menos 20 nucleótidos contiguos, al menos 25 nucleótidos contiguos, al menos 30 nucleótidos contiguos, al menos 35 nucleótidos contiguos, al menos 40 nucleótidos contiguos, al menos 50 nucleótidos contiguos, al menos 60 nucleótidos contiguos, al menos 70 nucleótidos contiguos, al menos 80 nucleótidos contiguos, al menos 90 nucleótidos contiguos, al menos 100 nucleótidos contiguos, al menos 125 nucleótidos contiguos, al menos 150 nucleótidos contiguos, al menos 175 nucleótidos contiguos, al menos 200 nucleótidos contiguos, al menos 250 nucleótidos contiguos, al menos 300 nucleótidos contiguos, al menos 350 nucleótidos contiguos, o al menos 380 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína. En una realización, el fragmento constituye al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de la longitud total de la secuencia de ácido nucleico de referencia. En una realización preferida, un fragmento de un ácido nucleico codifica un péptido o polipéptido que conserva la actividad de la proteína de longitud completa. En otra realización, el fragmento codifica un péptido o polipéptido que de la proteína de longitud completa no retiene la actividad de la proteína de longitud completa.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cantidad inhibidora del crecimiento" se refiere a una cantidad que inhibe el crecimiento o la proliferación de una célula objetivo, tal como una célula tumoral, ya sea in vitro o in vivo, independientemente del mecanismo por el que se inhibe el crecimiento celular (por ejemplo, por propiedades citostáticas, propiedades citotóxicas, etc.). En una realización preferida, la cantidad inhibidora del crecimiento inhibe (es decir, ralentiza hasta cierto punto y preferentemente detiene) la proliferación o el crecimiento de la célula objetivo in vivo o en cultivo celular en más de aproximadamente 20 %, preferentemente más de aproximadamente 50 %, más preferentemente más de aproximadamente 75 % (por ejemplo, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 100 %).
Tal como se utiliza aquí, la frase "secuencia heteróloga" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico, proteína, polipéptido o péptido que no está normalmente asociada en la naturaleza con otra secuencia de ácido nucleico o proteína, polipéptido o péptido de interés.
Tal como se utiliza en el presente documento, la frase "inserto génico heterólogo" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que haya sido o vaya a insertarse en los vectores recombinantes descritos en el presente documento. El inserto génico heterólogo puede referirse únicamente a la secuencia codificante del producto génico o puede referirse a una secuencia que comprenda un promotor, una secuencia codificante del producto génico (como GP, VP o Z) y cualquier secuencia reguladora asociada o vinculada de forma operativa a la misma.
El término "tramo homopolímero" se refiere a una secuencia que comprende al menos cuatro de los mismos nucleótidos no interrumpidos por ningún otro nucleótido, por ejemplo, GGGG o TTTTTTT.
El término "respuesta inmunitaria humoral" se refiere a la estimulación de la producción de Ab . La respuesta inmunitaria humoral también hace referencia a las proteínas accesorias y a los acontecimientos que acompañan a la producción de anticuerpos, incluyendo la activación de las células T auxiliares y la producción de citocinas, la maduración de la afinidad y la generación de células de memoria. La respuesta inmunitaria humoral es una de las dos ramas de la respuesta inmunitaria adaptativa.
El término "inmunidad humoral" se refiere a la defensa inmunológica proporcionada por anticuerpos, tales como Ab neutralizantes que pueden unirse directamente a una neoplasia; o, Ab vinculantes que identifican una célula neoplásica para su destrucción por respuestas inmunitarias innatas tal como la lisis mediada por complemento (C'), la fagocitosis y las células asesinas naturales.
El término "composición inmunogénica" es una composición que comprende una molécula antigénica en la que la administración de la composición a un sujeto da lugar al desarrollo en el sujeto de una respuesta inmunitaria humoral y/o celular a la molécula antigénica de interés.
El término "respuesta inmunitaria" se refiere a cualquier respuesta a un antígeno o determinante antigénico por parte del sistema inmunitario de un sujeto (por ejemplo, un ser humano). Las respuestas inmunitarias ejemplares incluyen respuestas inmunitarias humorales (por ejemplo, producción de anticuerpos específicos de antígeno) y respuestas inmunitarias mediadas por células (por ejemplo, producción de células T específicas de antígeno). Los ensayos para evaluar una respuesta inmunitaria son conocidos en la técnica y pueden comprender ensayos in vivo, tal como los ensayos para medir las respuestas de anticuerpos y las respuestas de hipersensibilidad de tipo retardada. En una realización, el ensayo para medir las respuestas de anticuerpos puede medir principalmente la función de las células B, así como las interacciones entre células B y células T. Para el ensayo de respuesta de anticuerpos, se pueden comparar los títulos de anticuerpos en sangre tras una provocación antigénica. Tal como se utiliza en el presente documento, los "títulos de anticuerpos" pueden definirse como la dilución más alta en sueros posinmunes que dio lugar a un valor superior al de las muestras preinmunes para cada sujeto. Los ensayos in vitro pueden comprender la determinación de la capacidad de las células para dividirse, o para ayudar a otras células a dividirse, o para liberar linfoquinas y otros factores, expresar marcadores de activación y generar lisis de células objetivo. Los linfocitos de los ratones y del hombre pueden compararse en ensayos in vitro. En una realización, se comparan linfocitos de fuentes similares, tal como células de sangre periférica, esplenocitos o células de ganglios linfáticos. Sin embargo, es posible comparar linfocitos de distintas fuentes, como en el ejemplo no limitativo de las células de sangre periférica en humanos y los esplenocitos en ratones. Para el ensayo in vitro, las células pueden purificarse (por ejemplo, células B, células T y macrófagos) o dejarse en su estado natural (por ejemplo, esplenocitos o células de ganglios linfáticos). La purificación puede realizarse por cualquier procedimiento que ofrezca los resultados deseados. Se puede comprobar in vitro la capacidad de proliferación de las células mediante mitógenos o antígenos específicos. La capacidad de las células para dividirse en presencia de antígenos específicos puede determinarse mediante un ensayo de reacción linfocitaria mixta (MLR). El sobrenadante de las células cultivadas puede analizarse para cuantificar la capacidad de las células para secretar linfoquinas específicas. Las células se pueden extraer del cultivo y comprobar su capacidad para expresar antígenos de activación. Esto puede hacerse por cualquier procedimiento que sea adecuado, como en el ejemplo no limitativo de utilizar anticuerpos o ligandos que se unen al antígeno de activación, así como sondas que se unen al ARN que codifica el antígeno de activación.
El término "resultado terapéutico mejorado" relativo a un sujeto diagnosticado con una neoplasia o cáncer se refiere a una ralentización o disminución del crecimiento de un tumor, o síntomas detectables asociados con el crecimiento tumoral.
El término "inducir una respuesta inmunitaria" significa provocar una respuesta humoral (por ejemplo, la producción de anticuerpos) o una respuesta celular (por ejemplo, la activación de células T) dirigida contra un TAA en un sujeto al que se ha administrado la composición (por ejemplo, una vacuna).
El término "inserción" en el contexto de un polipéptido o proteína se refiere a la adición de uno o más residuos de aminoácidos no nativos en la secuencia del polipéptido o proteína. Típicamente, no se insertan más de 1 a 6 residuos (por ejemplo, 1 a 4 residuos) en cualquier sitio dentro de la molécula polipeptídica o proteica.
El término "virus de Marburgo" se refiere a un virus de la especie Marburg marburgvirus y tiene el significado que le da el International Committee on Taxonomy of Viruses de Virus documentado en (Kuhn, J.H . et al. 2010 Arch Virol 155:2083-2103). Otras características estructurales del virus de Marburgo se describen en Mittler et al, 2007.
El término "marcador" se refiere a cualquier proteína o polinucleótido con una alteración en el nivel de expresión o actividad que se asocia con una enfermedad o trastorno.
El término "vaccinia Ankara modificada", "vaccinia ankara modificada", "Vaccinia Ankara modificada" o "MVA" se refiere a una cepa altamente atenuada del virus vaccinia desarrollada por el Dr. Anton Mayr mediante pases seriados en células de fibroblastos de embrión de pollo; o variantes o derivados de la misma. La m Va se revisa en (Mayr, A. et al. 1975 Infección 3:6-14; Patente suiza No. 568.392).
El término "neoplasia", tal como se utiliza en el presente documento, significa un crecimiento nuevo o anormal de tejido en alguna parte del cuerpo, especialmente como característica del cáncer.
El término "anticuerpo neutralizante" o "NAb" se refiere a un anticuerpo purificado o presente en un fluido corporal (por ejemplo, suero o secreción mucosa) que reconoce un antígeno específico e inhibe los efectos del antígeno en el sujeto (por ejemplo, un ser humano). Tal como se utiliza en el presente documento, el anticuerpo puede ser un anticuerpo único o una pluralidad de anticuerpos.
El término "anticuerpo no neutralizante" o "nnAb" se refiere a un anticuerpo de unión que no es un anticuerpo neutralizante.
"Operablemente vinculado" Una primera secuencia de ácido nucleico está enlazada operablemente con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está vinculado operablemente a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Por lo general, las secuencias de a Dn enlazadas operablemente son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificadoras de proteínas, se encuentran en el mismo marco de lectura.
Los términos "evitar", "prevenir" y "prevención" se refieren a la inhibición del desarrollo o aparición de una afección (por ejemplo, un tumor o una afección asociada al mismo), o a la prevención de la recurrencia, aparición o desarrollo de uno o más síntomas de una afección en un sujeto como resultado de la administración de una terapia o de la administración de una combinación de terapias.
El término "promotor" se refiere a un polinucleótido suficiente para dirigir la transcripción.
El término "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a la cantidad de una composición (por ejemplo, el vector MVA recombinante o la composición farmacéutica) que es suficiente para dar lugar a la prevención del desarrollo, recurrencia o aparición de una afección o un síntoma de la misma (por ejemplo, un tumor o una afección o síntoma asociado con el mismo o para potenciar o mejorar los efectos profilácticos de otra terapia.
El término "recombinante" significa un polinucleótido de origen semisintético o sintético que no se encuentra en la naturaleza o que está unido a otro polinucleótido en una disposición que no se encuentra en la naturaleza.
El término "recombinante", con respecto a un vector viral, significa un vector (por ejemplo, un genoma viral que ha sido manipulado in vitro, por ejemplo, utilizando técnicas de ácido nucleico recombinante para expresar secuencias de ácido nucleico viral heterólogas.
El término "secuencia reguladora" "secuencias reguladoras" se refiere colectivamente a secuencias promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores corriente arriba, orígenes de replicación, sitios de entrada de ribosomas internos ("IRES"), potenciadores, y similares, que colectivamente proporcionan la transcripción y traducción de una secuencia codificante. No es necesario que todas estas secuencias de control estén siempre presentes, siempre que el gen seleccionado pueda transcribirse y traducirse.
El término "vector lanzadera" se refiere a un vector genético (por ejemplo, un plásmido de ADN) que es útil para transferir material genético de un sistema huésped a otro. Un vector lanzadera puede replicarse solo (sin la presencia de ningún otro vector) en al menos un hospedador (por ejemplo, E. coli). En el contexto de la construcción de vectores MVA, los vectores lanzadera suelen ser plásmidos de a Dn que pueden manipularse en E. coli e introducirse después en células cultivadas infectadas con vectores MVA, lo que da lugar a la generación de nuevos vectores MVA recombinantes.
El término "mutación silenciosa" significa un cambio en una secuencia de nucleótidos que no causa un cambio en la estructura primaria de la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos, por ejemplo, un cambio de AAA (que codifica lisina) a AAG (que también codifica lisina).
El término "sujeto" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo, pero no se limitan a, los seres humanos, los animales domésticos y de granja, y los animales de zoológico, deportivos o de compañía, tales como perros, caballos, gatos, vacas, ratas, ratones, cobayas y similares. La determinación de aquellos sujetos "en riesgo" puede realizarse mediante cualquier determinación objetiva o subjetiva mediante una prueba diagnóstica u opinión de un sujeto o proveedor de atención sanitaria (por ejemplo, prueba genética, marcador enzimático o proteico, historial de marcadores y similares).
El término "virus Sudán" se refiere a un virus de la especie Sudan ebolavirus y tiene el significado que le da el International Committee on Taxonomy of Viruses documentado en (Kuhn, J.H . et al. 2010 Arch Virol 155:2083-2103).
El término "criterio de valoración sustitutivo" se refiere a una medición clínica distinta de una medición del beneficio clínico que se utiliza como sustituto de una medición del beneficio clínico.
El término "marcador sustituto" se refiere a una medición de laboratorio o signo físico que se utiliza en un ensayo clínico o animal como sustituto de un criterio de valoración clínicamente significativo que es una medida directa de cómo se siente, funciona o sobrevive un sujeto y se espera que prediga el efecto de la terapia (Katz, R., NeuroRx 1:189-195 (2004); New drug, antibiotic, and biological drug product regulations; accelerated approval-FDA. Final rule. Fed Regist 57: 58942-58960, 1992.)
El término "marcador sustitutivo de protección" se refiere a un marcador sustitutivo que se utiliza en un ensayo clínico o animal como sustituto del criterio de valoración clínicamente significativo de reducción o prevención del crecimiento de la neoplasia.
El término "codón sinónimo" se refiere al uso de un codón con una secuencia de ácido nucleico diferente para codificar el mismo aminoácido, por ejemplo, AAA y AAG (ambos codifican lisina). La optimización de codones cambia los codones de una proteína por los codones sinónimos más utilizados por un vector o una célula huésped.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de la composición (por ejemplo, el vector MVA recombinante o la composición farmacéutica) que, cuando se administra a un mamífero para tratar una neoplasia, es suficiente para efectuar dicho tratamiento de la neoplasia.
Los términos "que trata" o "tratar" se refieren a la erradicación o control de una neoplasia, la reducción o mejora de la progresión, gravedad y/o duración de una afección o uno o más síntomas causados por la neoplasia como resultado de la administración de una o más terapias.
El término "vacuna" designa el material utilizado para provocar una respuesta inmunitaria y conferir inmunidad tras la administración del material a un sujeto. Dicha inmunidad puede incluir una respuesta inmunitaria celular o humoral que se produce cuando el sujeto se expone al inmunógeno tras la administración de la vacuna.
El término "inserto vacunal" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia heteróloga que está operablemente unida a un promotor para su expresión cuando se inserta en un vector recombinante. La secuencia heteróloga puede codificar una glicoproteína o una proteína de matriz descrita aquí.
El término "partículas similares a virus" o "VLP" se refiere a una estructura que se asemeja antigénica y morfológicamente al virus nativo.
II. Antígenos asociados a tumores
Las composiciones de la presente invención son útiles para inducir una respuesta inmunitaria a un antígeno asociado a un tumor.
En una realización particular, los vectores expresan MUC-1. En una realización, los vectores expresan una forma hipoglicosilada de MUC-1. La MUC1 se encuentra en casi todas las células epiteliales, pero se sobreexpresa en las células cancerosas, y sus glicanos asociados son más cortos que los de la MUC1 no asociada a tumores (Gaidzik N et al. 2013, Chem Soc Rev. 42 (10): 4421-42).
La glicoproteína transmembrana Mucina 1 (MUC1) está aberrantemente glicosilada y sobreexpresada en una variedad de cánceres epiteliales, y desempeña un papel crucial en la progresión de la enfermedad. La MUC1 asociada a tumores difiere de la MUC1 expresada en células normales en cuanto a sus características bioquímicas, distribución celular y función. En las células cancerosas, MUC1 participa en vías de transducción de señales intracelulares y regula la expresión de sus genes objetivo tanto a nivel transcripcional como postranscripcional (Nath, S ., Trends in Mol Med., volumen 20, número 6, p332-342, junio de 2014)
A. Fragmentos inmunogénicos de TAA
En diversos aspectos, los fragmentos inmunogénicos de TAAs pueden ser expresados por los vectores MVA descritos en el presente documento.
En ciertos aspectos, los fragmentos inmunogénicos tal como los recitados en la Tabla 1 pueden expresarse mediante los vectores MVA descritos en el presente documento.
T l 1 Fr m n inm n ni n í n i m r
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En una realización, los vectores expresan un fragmento de dominio extracelular inmunogénico de MUC1.
En una realización, los vectores expresan un fragmento de dominio extracelular de MUC1 que consiste en la secuencia AHG VTSAPDTRPAPGSTAPP (SEQ ID NO:1).
En una realización, los vectores expresan un fragmento de dominio extracelular de MUC1 que consiste en la secuencia AHGVTSAPDNRPALGSTAPP (SEQ ID NO:2).
En una realización, los vectores expresan un fragmento de dominio extracelular de MUC1 que consiste en la secuencia AHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDN RPALGSTAPP (SEQ ID NO:3).
En una realización, los vectores expresan un fragmento de dominio extracelular de MUC1 que consiste en la secuencia
AHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGST
APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDNRPALGSTAPP (SEQ ID NO:4).
En una realización, los vectores expresan un fragmento de dominio intracelular de MUC1.
En una realización, los vectores expresan un fragmento extracelular de MUC-1, un fragmento intracelular de MUC-1 y un dominio transmembrana de una glicoproteína (GP) del virus de Marburgo.
En una realización, los vectores expresan un fragmento extracelular de un TAA, un fragmento intracelular de un TAA y un dominio transmembrana de una glicoproteína (GP) del virus de Marburgo.
III. Vectores virales recombinantes
En un aspecto, la presente invención es un vector viral MVA recombinante que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica en una orientación de 5' a 3' una secuencia quimérica de aminoácidos que comprende un fragmento extracelular de una TAA, un dominio transmembrana de una glicoproteína del virus de Marburgo, y un fragmento intracelular de la TAA; y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína matriz VP40 del virus de Marburgo, en la que tanto la primera secuencia de ácido nucleico como la segunda secuencia de ácido nucleico están bajo el control de promotores compatibles con sistemas de expresión de poxvirus.
Los virus Vaccinia también se han utilizado para modificar vectores virales para la expresión de genes recombinantes y para el uso potencial como vacunas vivas recombinantes (Mackett, M. et al 1982 PNAS USA 79:7415-7419; Smith, G. L. et al. 1984 Biotech Genet Engin Rev 2:383-407). Se trata de introducir secuencias de ADN (genes) que codifican antígenos extraños, con ayuda de técnicas de recombinación de ADN, en el genoma de los virus vaccinia. Si el gen se integra en un lugar del ADN vírico que no es esencial para el ciclo vital del virus, es posible que el virus vaccinia recombinante recién producido sea infeccioso, es decir, capaz de infectar células extrañas y, por tanto, de expresar la secuencia de ADN integrada (Solicitudes de Patente EP No. 83,286 y No. 110,385). Los virus vaccinia recombinantes así preparados pueden utilizarse, por un lado, como vacunas vivas para la profilaxis de enfermedades infecciosas y, por otro, para la preparación de proteínas heterólogas en células eucariotas.
Se han desarrollado varias de estas cepas de virus vaccinia para evitar los efectos secundarios no deseados de la vacunación contra la viruela. Así, se ha generado una vaccinia Ankara modificada (MVA) mediante pases seriados a largo plazo de la cepa Ankara del virus vaccinia (CVA) en fibroblastos de embrión de pollo (para una revisión, véase Mayr, A. et al. 1975 Infection 3:6-14; Patente suiza No. 568.392). El virus MVA está disponible públicamente en la American Type Culture Collection como ATCC No: VR-1508. La MVA se distingue por su gran atenuación, demostrada por la disminución de la virulencia y la reducción de la capacidad de replicación en células de primates, al tiempo que mantiene una buena inmunogenicidad. Se ha analizado el virus MVA para determinar las alteraciones del genoma en relación con la cepa parental CVA. Se han identificado seis deleciones principales de ADN genómico (deleción I, II, III, IV, V y VI) que suman 31.000 pares de bases (Meyer, H. et al. 1991 J Gen Virol 72:1031-1038). El virus MVA resultante se convirtió en un huésped severamente restringido a las células aviares.
Además, la MVA se caracteriza por su atenuación extrema. Cuando se probó en diversos modelos animales, la MVA demostró ser avirulento incluso en animales inmunodeprimidos. Y lo que es más importante, las excelentes propiedades de la cepa MVA han quedado demostradas en amplios ensayos clínicos (Mayr A. et al. 1978 Zentralbl Bakteriol [B] 167:375-390; Stickl et al. 1974 Dtsch Med Wschr 99:2386-2392). Durante estos estudios en más de 120.000 seres humanos, incluyendo pacientes de alto riesgo, no se asoció ningún efecto secundario al uso de la vacuna MVA.
Se descubrió que la replicación de la MVA en células humanas se bloqueaba en una fase tardía de la infección, impidiendo el ensamblaje en viriones infecciosos maduros. Sin embargo, la MVA fue capaz de expresar genes virales y recombinantes a altos niveles incluso en células no permisivas y se propuso que sirviera como vector de expresión génica eficiente y excepcionalmente seguro (Sutter, G. y Moss, B. 1992 PNAS USA 89:10847-10851). Además, se establecieron nuevas vacunas de vector vaccinia sobre la base de MVA con secuencias de ADN extrañas insertadas en el sitio de deleción III dentro del genoma de MVA (Sutter, G. et al. 1994 Vaccine 12:1032-1040).
Los virus vaccinia MVA recombinantes pueden prepararse como se expone a continuación. Una estructura de ADN que contiene una secuencia de ADN que codifica un polipéptido extraño flanqueado por secuencias de MVA ADN adyacentes a un sitio de inserción predeterminado (por ejemplo, entre dos genes MVA esenciales conservados como I8R/G1L; en la deleción III reestructurada y modificada; o en otros sitios no esenciales dentro del genoma MVA) se introduce en células infectadas con MVA, para permitir la recombinación homóloga. Una vez que la estructura de ADN se ha introducido en la célula eucariota y el ADN extraño se ha recombinado con el ADN viral, es posible aislar el virus vaccinia recombinante deseado de una manera conocida per se, preferentemente con la ayuda de un marcador. La estructura de ADN que se inserta puede ser lineal o circular. Se prefiere un plásmido o un producto de la reacción en cadena de la polimerasa. Tales procedimientos de fabricación de vectores recombinantes MVA se describen en Publicación PCT WO/2006/026667. La estructura de ADN contiene secuencias que flanquean los lados izquierdo y derecho de una deleción natural. La secuencia de ADN extraña se inserta entre las secuencias que flanquean la deleción natural. Para la expresión de una secuencia de ADN o de un gen, es necesario que las secuencias reguladoras, necesarias para la transcripción del gen, estén presentes en el ADN. Tales secuencias reguladoras (denominadas promotores) son conocidas por los expertos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, las del gen vaccinia 11 kDa descritas en el documento EP-A-198,328y las del gen de 7,5 kDa (EP-A-110,385). El ADN-constructo puede introducirse en las células infectadas por MVA mediante transfección, por ejemplo mediante precipitación con fosfato cálcico (Graham et al. 1973 Virol 52:456-467; Wigler et al. 1979 Cell 16:777-785), mediante electroporación (Neumann et al. 1982 EMBO J. 1:841-845), por microinyección (Graessmann et al. 1983 Meth Enzymol 101:482-492), mediante liposomas (Straubinger et al. 1983 Meth Enzymol 101:512-527), mediante esferoplastos (Schaffher 1980 PnAS USA 77:2163-2167) o por otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.
Los vectores MVA descritos y probados en el presente documento resultaron ser inesperadamente eficaces tras un único cebado o un régimen homólogo de cebado/reforzamiento. Otros diseños de vectores MVA requieren un régimen heterólogo de cebado/reforzamiento, mientras que otros estudios publicados han sido incapaces de inducir respuestas inmunitarias eficaces con vectores MVA. A la inversa, el presente diseño de vector MVA y los procedimientos de fabricación son útiles para producir vectores vacunales MVA eficaces para provocar respuestas inmunitarias eficaces de células T y anticuerpos. Además, la utilidad de un vector de vacuna MVA capaz de suscitar respuestas inmunitarias eficaces y la producción de anticuerpos tras un único refuerzo de cebado homólogo es significativa para consideraciones tales como el uso, la comercialización y el transporte de materiales, especialmente a lugares del tercer mundo afectados.
En una realización, la presente invención es un vector viral MVA recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un fragmento extracelular de un TAA, un dominio transmembrana de GP del virus de Marburgo y una comina intarcelular del TAA y un ácido nucleico que codifica una proteína de matriz VP40 del virus de Marburgo, en el que ambas secuencias de ácido nucleico están bajo el control de promotores compatibles con sistemas de expresión de poxvirus. El vector viral puede construirse mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica. El uno o más insertos génicos heterólogos codifican un polipéptido que tiene la inmunogenicidad deseada, es decir, un polipéptido que puede inducir una reacción inmunitaria, inmunidad celular y/o inmunidad humoral, in vivo mediante su administración. La región génica del vector viral (por ejemplo, un vector MVA) donde se introduce el gen que codifica un polipéptido que tiene inmunogenicidad está flanqueada por regiones que son indispensables. En la introducción de un gen que codifica un polipéptido que tiene inmunogenicidad, un promotor apropiado puede estar unido operativamente aguas arriba del gen que codifica un polipéptido que tiene inmunogenicidad deseada.
La una o más secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos asociados a tumores o fragmentos inmunogénicos de los mismos pueden seleccionarse de cualquier TAA. En un aspecto, el uno más TAA o fragmentos inmunogénicos del mismo se seleccionan del grupo que consiste en MUC1, un fragmento extracelular de MUC1, un fragmento intracelular de MUC1, Antígeno Oncofetal/Proteína Receptora de Laminina Inmadura (OFNiLRP), un fragmento extracelular de OFNiLRP, un fragmento intracelular de OFNiLRP, antígeno carcinoembrionario (CEA), un fragmento extracelular de CEA, un fragmento intracelular de CEA , o una combinación de los mismos. En realizaciones ejemplares, el gen codifica un polipéptido o proteína capaz de inducir una respuesta inmunitaria en el sujeto al que se administra, y más particularmente, una respuesta inmunitaria capaz de proporcionar un beneficio protector y/o terapéutico al sujeto.
En una realización, la secuencia de ácido nucleico codifica MUC1. Los insertos de genes heterólogos se insertan en uno o más sitios de deleción del vector bajo el control de promotores compatibles con los sistemas de expresión de poxvirus.
En otra realización, la secuencia de ácido nucleico codifica un fragmento inmunogénico de MUC1.
En una realización, los vectores expresan un fragmento de dominio extracelular inmunogénico de MUC1.
En una realización, los vectores expresan un fragmento de dominio extracelular de MUC1 que consiste en la secuencia AHG VTSAPDTRPAPGSTAPP (SEQ ID NO:1).
En una realización, los vectores expresan un fragmento de dominio extracelular de MUC1 que consiste en la secuencia AHGVTSAPDNRPALGSTAPP (SEQ ID NO:2).
En una realización, los vectores expresan un fragmento de dominio extracelular de MUC1 que consiste en la secuencia AHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDN RPALGSTAPP (SEQ ID NO:3).
En una realización, los vectores expresan un fragmento de dominio extracelular de MUC1 que consiste en la secuencia
AHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGST
APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDNRPALGSTAPP (SEQ ID NO:4).
En una realización, los vectores expresan un fragmento de dominio intracelular de MUC1.
En una realización, la secuencia de ácido nucleico codifica un fragmento extracelular de MUC1 y un fragmento intracelular de MUC1.
En una realización, la secuencia de ácido nucleico codifica un dominio transmembrana de la glicoproteína (GP) del virus de Marburgo.
En una realización, la secuencia de ácido nucleico codifica una secuencia de dominio extracelular inmunogénico de MUC1 y un dominio transmembrana de la glicoproteína (GP) del virus de Marburgo.
En una realización, la secuencia de ácido nucleico codifica una secuencia de dominio extracelular inmunogénico de MUC1 y un dominio transmembrana de la glicoproteína (GP) del virus de Marburgo y una secuencia de dominio intracelular de MUC1.
En una realización, la secuencia de ácido nucleico codifica una secuencia de dominio extracelular inmunogénica de MUC1 que comprende un fragmento de MUC1 que tiene la secuencia AHG VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG VTSAPDTRPAPGST APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDN RPALGSTAPPP (SEQ ID NO:4) y un dominio transmembrana de la glicoproteína (GP) del virus de Marburgo y una secuencia de dominio intracelular de MUC1.
En una realización, el sitio de deleción III es reestructurado y modificado para eliminar secuencias flanqueantes no esenciales.
En realizaciones ejemplares, la vacuna se construye para expresar un TAA, por ejemplo, MUC1, que se inserta entre dos genes MVA esenciales conservados (I8R y G1L) utilizando el vector lanzadera pGeo-MUC1; y para expresar MUC1, que se inserta en la deleción III utilizando el vector lanzadera pGeo-MUC1. pGeo-MUC1 está construido con un marcador de resistencia a la ampicilina, que permite que el vector se replique en bacterias; con dos secuencias flanqueantes, que permiten que el vector se recombine con una localización específica en el genoma del MVA; con un marcador de selección de proteína verde fluorescente (G FP), que permite la selección de MVA recombinantes; con una secuencia homóloga a parte del Flanco 1 de la secuencia MVA, que permite eliminar la secuencia G FP del vector MVA tras la inserción de MUC1 en el genoma MVA; con un promotor H5 modificado (mH5), que permite la transcripción del inserto génico heterólogo insertado; y con una secuencia TAA.
En ciertos aspectos, el polipéptido, o la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido, puede tener una mutación o deleción (por ejemplo, una deleción interna, truncamiento del amino o carboxi-terminal, o una mutación puntual).
El uno o más genes introducidos en el vector viral recombinante están bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula.
El material de ácido nucleico del vector viral puede estar encapsulado, por ejemplo, en una membrana lipídica o por proteínas estructurales (por ejemplo, proteínas de la cápside), que pueden incluir uno o más polipéptidos virales.
En realizaciones ejemplares, la presente invención es un vector viral recombinante, es decir, un vector MVA recombinante que comprende uno o más genes, o uno o más polipéptidos codificados por el gen o genes, de un TAA.
Las secuencias de ácido nucleico de muchos AAT se publican y están disponibles en diversas fuentes, incluyendo, por ejemplo, GenBank y PubMed. Las referencias ejemplares de GenBank que incluyen MUC1 incluyen las correspondientes a los números de acceso NM_001204285,
En ciertos aspectos, el uno o más genes codifican un polipéptido, o fragmento del mismo, que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o incluso 100 % idéntico) al TAA seleccionado en al menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, o 70 residuos contiguos del TAA seleccionado o fragmento inmunogénico del mismo que retienen actividad inmunogénica.
En una realización, la secuencia que codifica un TAA o fragmento inmunogénico del mismo se inserta en el sitio de deleción I, II, III, IV, V o VI del vector MVA.
En una realización, la secuencia que codifica un TAA o fragmento inmunogénico del mismo se inserta entre I8R y G1L del vector MVA, o en el sitio de deleción III reestructurado y modificado del vector MVA; y una segunda secuencia que codifica un TAA o fragmento inmunogénico del mismo se inserta entre I8R y G1L del vector MVA, o en el sitio de deleción III reestructurado y modificado del vector MVA.
El vector recombinante puede comprender en un primer sitio de deleción, una secuencia de ácido nucleico que codifica un TAA o fragmento inmunogénico del mismo unido de forma operable a un promotor compatible con sistemas de expresión de poxvirus, y en un segundo sitio de deleción, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína formadora de VLP unida de forma operable a un promotor compatible con sistemas de expresión de poxvirus.
En divulgaciones ejemplares, un vector MVA recombinante que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga (por ejemplo, una o más secuencias) codifica un TAA o fragmento inmunogénico del mismo que está bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula. La secuencia puede estar, por ejemplo, bajo el control de un promotor seleccionado del grupo que consiste en los promotores Pm2H5, Psyn II o mH5.
El vector viral recombinante de la presente invención puede utilizarse para infectar células de un sujeto, lo que, a su vez, promueve la traducción a un producto proteico de la una o más secuencias heterólogas del vector viral (por ejemplo, un TAA o fragmento inmunogénico del mismo). Como se explica más adelante, el vector viral recombinante puede administrarse a un sujeto para que infecte una o más células del sujeto, lo que promueve la expresión de uno o más genes virales del vector viral y estimula una respuesta inmunitaria terapéutica o protectora contra una neoplasia.
La vacuna MVA recombinante expresa proteínas que se ensamblan en partículas similares a virus (VLP) que comprenden el TAA o un fragmento inmunogénico del mismo. Sin querer ceñirse a ninguna teoría en particular, se cree que el TAA se proporciona para provocar una respuesta inmunitaria protectora y la proteína de matriz se proporciona para permitir el ensamblaje de las VLP y como objetivo para las respuestas inmunitarias de las células T, potenciando así la respuesta inmunitaria protectora y proporcionando protección cruzada.
En la invención, la proteína de matriz es una proteína de matriz VP40 del virus de Marburgo.
La proteína matriz también puede ser una proteína matriz del virus Ébola.
La proteína matriz también puede ser una proteína matriz del virus Sudán.
La proteína matriz también puede ser una proteína matriz del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). La proteína matriz también puede ser una proteína matriz del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) codificada por el gen gag.
La proteína matriz puede ser además una proteína matriz del virus de Lassa.
La proteína matriz puede ser además una proteína Z del virus de Lassa.
La proteína matriz puede ser además un fragmento de una proteína Z del virus de Lassa.
La proteína de matriz puede ser además una proteína de matriz de un virus de la familia de los virus Filoviridae .
La proteína de matriz puede ser además una proteína de matriz de un virus de la familia de los virus Retroviridae . La proteína de matriz puede ser además una proteína de matriz de un virus de la familia de los virus Arenaviridae . La proteína de matriz puede ser además una proteína de matriz de un virus de la familia de los virus Flaviviridae . Una o más secuencias de ácido nucleico pueden optimizarse para su uso en un vector MVA. La optimización incluye la optimización de codones, que emplea mutaciones silenciosas para cambiar codones seleccionados de las secuencias nativas por codones sinónimos que se expresan de forma óptima en el sistema huésped-vector. Otros tipos de optimización incluyen el uso de mutaciones silenciosas para interrumpir tramos homopolímeros o motivos de terminación de transcripción. Cada una de estas estrategias de optimización puede mejorar la estabilidad del gen, mejorar la estabilidad del transcrito o mejorar el nivel de expresión de proteínas a partir de la secuencia. En realizaciones ejemplares, el número de tramos homopolímeros en la secuencia TAA se reducirá para estabilizar el constructo. Se puede proporcionar una mutación silenciosa para cualquier cosa similar a una señal de terminación de vaccinia. Se puede añadir un nucleótido adicional para expresar la forma transmembrana, en lugar de la forma secretada, de cualquier TAA.
En realizaciones ejemplares, las secuencias están optimizadas en codón para la expresión en MVA; las secuencias con series de > 5 desoxiguanosinas, > 5 desoxicitidinas, > 5 desoxiadenosinas y > 5 desoxitimidinas se interrumpen mediante mutación silenciosa para minimizar la pérdida de expresión debida a mutaciones de desplazamiento de marco; y la secuencia GP se modifica mediante la adición de un nucleótido adicional para expresar la forma transmembrana, en lugar de la forma secretada, de la proteína.
En una realización, la presente invención proporciona una composición de vector de vacuna que es monovalente. Tal como se utiliza en el presente documento, el término monovalente se refiere a una composición de vector vacunal que contiene secuencias de un TAA.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una vacuna que es bivalente. En el presente documento, el término bivalente se refiere a una composición de vector vacunal que contiene dos vectores con secuencias de diferentes TAA.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una vacuna que es trivalente. Como se utiliza en el presente documento, el término trivalente se refiere a una composición de vector vacunal que contiene tres vectores con secuencias de diferentes TAA.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una vacuna que es tetravalente. Como se utiliza en el presente documento, el término tetravalente se refiere a una composición de vector de vacuna que contiene cuatro vectores con secuencias de diferentes TAA. En el presente documento, los términos tetravalente y tetravalente son sinónimos.
La presente divulgación también se extiende a células huésped que comprenden el vector viral recombinante descrito anteriormente, así como a viriones aislados preparados a partir de células huésped infectadas con el vector viral recombinante.
En un aspecto, la TAA se sobreexpresa con un ARNsi dirigido a la Core 1 p3galactosiltransferasa (T Sintasa) o COSMC. COSMC es una chaperona molecular que se cree que es necesaria para la expresión de la T-sintasa activa, la única enzima que galactosila el antígeno Tn (GalNAca1-Ser/Thr-R) para formar el núcleo 1 Galp1-3GalNAca1-Ser/Thr (antígeno T) durante la biosíntesis del O-glicano tipo mucina (Wang et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 mayo 18; 107(20): 9228-9233).
En otro aspecto, la TAA se sobreexpresa con sialiil transerasa 1. Las sialiltransferasas son enzimas clave que regulan los niveles celulares de moléculas que contienen ácido siálico.
En un aspecto particular, la sialiltransferasa es ST6GALNAC1.
En otra realización, la TAA se sobreexpresa con sialiil transerasa 1 y un ARNsi dirigido a la Core 1 p3galactosiltransferasa (T sintasa) o COSMC (chaperona específica de la T sintasa; C1GALT1C1)
IV. Composición farmacéutica
Los vectores virales recombinantes de la presente invención se formulan fácilmente como composiciones farmacéuticas para uso veterinario o humano, ya sea solos o en combinación. La composición farmacéutica comprende un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, un diluyente, excipiente o adyuvante.
En una realización, la presente invención es una vacuna eficaz para proteger y/o tratar una neoplasia que comprende un vector MVA recombinante de la presente invención. La composición de la vacuna puede comprender uno o más agentes terapéuticos adicionales.
La composición farmacéutica puede comprender 1, 2, 3, 4 o más de 4 vectores MVA recombinantes diferentes.
En una realización, la presente invención proporciona una composición de vector de vacuna que es monovalente. Tal como se utiliza aquí, el término monovalente se refiere a una composición de vector vacunal que contiene una secuencia TAA.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una vacuna que es bivalente. En el presente documento, el término bivalente se refiere a una composición de vector vacunal que contiene dos vectores con secuencias de diferentes TAA.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una vacuna que es trivalente. Como se utiliza en el presente documento, el término trivalente se refiere a una composición de vector vacunal que contiene tres vectores con secuencias de diferentes TAA.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una vacuna que es tetravalente. Como se utiliza en el presente documento, el término tetravalente se refiere a una composición de vector de vacuna que contiene cuatro vectores con secuencias de diferentes TAA. En el presente documento, los términos tetravalente y tetravalente son sinónimos.
Tal como se utiliza en el presente documento, la frase "portador farmacéuticamente aceptable" abarca cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar, tal como los adecuados para la administración parenteral, tal como, por ejemplo, por vía intramuscular, intraarticular (en las articulaciones), intravenosa, intradérmica, intraperitoneal y subcutánea. Ejemplos de tales formulaciones incluyen soluciones acuosas y no acuosas estériles isotónicas para inyección, que contienen antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, espesantes, estabilizantes y conservantes. Un portador farmacéuticamente aceptable ejemplar es la solución salina fisiológica.
Los expertos en la materia conocen otros diluyentes, excipientes, portadores o adyuvantes fisiológicamente aceptables y sus formulaciones.
En algunos aspectos, los adyuvantes se utilizan como potenciadores de la respuesta inmunitaria. En diversos aspectos, el potenciador de la respuesta inmunitaria se selecciona del grupo que consiste en adyuvantes basados en alumbre, adyuvantes basados en aceite, Specol, RIBI, TiterMax, Montanide ISA50 o Montanide ISA 720, GM-CSF, adyuvantes basados en copolímeros en bloque no iónicos, adyuvantes basados en bromuro de dimetil dioctadecil amonio (DDA) AS-1, AS-2, adyuvantes basados en el sistema Ribi Adjuvant, QS21, Quil A, SAF (adyuvante Syntex en su forma microfluidizada (SAF-m), bromuro de dimetil dioctadecil amonio (DDA), adyuvantes basados en complemento humano m. vaccae, ISCOMS, MF-59, SBAS-2, SBAS-4, Enhanzyn®, RC-529, AGPs, MPL-SE, QS7, Escin; Digitonina; y Gypsophila, saponinas de quinoa de Chenopodium
Las composiciones utilizadas en los procedimientos descritos en el presente documento pueden administrarse por una vía seleccionada de, por ejemplo, parenteral, intramuscular, intraarterial, intravascular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, dérmica, transdérmica, ocular, inhalatoria, bucal, sublingual, perilingual, nasal, administración tópica y administración oral. El procedimiento de administración preferido puede variar en función de diversos factores (por ejemplo, los componentes de la composición que se administran y la gravedad de la afección que se trata). Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden consistir en soluciones líquidas, tal como una cantidad eficaz de la composición disuelta en un diluyente (por ejemplo, agua, solución salina o PEG-400), cápsulas, sobres o comprimidos, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada de la vacuna. La composición farmacéutica también puede ser una formulación en aerosol para inhalación, por ejemplo, a los bronquios. Las formulaciones en aerosol pueden mezclarse con propelentes presurizados farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, diclorodifluorometano, propano o nitrógeno).
A efectos de la presente invención, las composiciones farmacéuticas adecuadas para administrar un agente terapéutico o biológicamente activo pueden incluir, por ejemplo, comprimidos, cápsulas de gel, cápsulas, píldoras, polvos, granulados, suspensiones, emulsiones, soluciones, geles, hidrogeles, geles orales, pastas, colirios, pomadas, cremas, emplastos, empapadores, dispositivos de administración, supositorios, enemas, inyectables, implantes, aerosoles o pulverizadores. Cualquiera de estas formulaciones puede prepararse mediante procedimientos conocidos y aceptados en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21va ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2005, y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, ed. J . Swarbrick, Informa Healthcare, 2006.
La inmunogenicidad de la composición (por ejemplo, vacuna) puede mejorarse significativamente si la composición de la presente invención se coadministra con un agente inmunoestimulador o adyuvante. Los adyuvantes adecuados bien conocidos por los expertos en la técnica incluyen, por ejemplo, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, QS21, Quil A (y derivados y componentes de los mismos), fosfato de calcio, hidróxido de calcio, hidróxido de zinc, análogos de glicolípidos, ésteres octodecílicos de un aminoácido, dipéptidos de muramilo, polifosfazeno, lipoproteínas, ISCOM-Matrix, DC-Chol, DDA, citoquinas y otros adyuvantes y derivados de los mismos.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención descrita en el presente documento pueden formularse para liberar la composición inmediatamente tras la administración (por ejemplo, administración dirigida) o en cualquier periodo de tiempo predeterminado tras la administración utilizando formulaciones de liberación controlada o prolongada. La administración de la composición farmacéutica en formulaciones de liberación controlada o prolongada es útil cuando la composición, sola o en combinación, tiene (i) un índice terapéutico estrecho (por ejemplo, la diferencia entre la concentración plasmática que provoca efectos secundarios nocivos o reacciones tóxicas y la concentración plasmática que provoca un efecto terapéutico es pequeña; por lo general, el índice terapéutico, Tl, se define como la relación entre la dosis letal media (DL50) y la dosis efectiva media (D E50)); (ii) una ventana de absorción estrecha en el tracto gastrointestinal; o (iii) una semivida biológica corta, de modo que se requieren dosis frecuentes durante un día para mantener un nivel terapéutico.
Se pueden seguir muchas estrategias para obtener una liberación controlada o prolongada en la que la tasa de liberación supere la tasa de metabolismo de la composición farmacéutica. Por ejemplo, la liberación controlada puede obtenerse mediante la selección adecuada de los parámetros e ingredientes de la formulación, incluyendo, por ejemplo, composiciones y recubrimientos adecuados de liberación controlada. Las formulaciones adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica. Algunos ejemplos son las composiciones de comprimidos o cápsulas de una o varias unidades, las soluciones oleosas, las suspensiones, las emulsiones, las microcápsulas, las microesferas, las nanopartículas, los parches y los liposomas.
Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden consistir en (a) soluciones líquidas, tal como una cantidad eficaz de la vacuna disuelta en diluyentes, tal como agua, solución salina o PEG 400; (b) cápsulas, sobres o comprimidos, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada de la vacuna, como líquidos, sólidos, gránulos o gelatina; (c) suspensiones en un líquido adecuado; (d) emulsiones adecuadas; y (e) polímeros polisacáridos, tal como quitinas. La vacuna, sola o en combinación con otros componentes adecuados, también puede elaborarse en formulaciones de aerosol para administrarse por inhalación, por ejemplo, en los bronquios. Las formulaciones en aerosol pueden colocarse en propulsores presurizados aceptables, tal como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.
Las formulaciones adecuadas para la administración rectal incluyen, por ejemplo, supositorios, que consisten en la vacuna con una base de supositorio. Las bases de supositorio adecuadas incluyen triglicéridos naturales o sintéticos o hidrocarburos parafínicos. Además, también es posible utilizar cápsulas rectales de gelatina que consisten en una combinación de la vacuna con una base, incluyendo, por ejemplo, triglicéridos líquidos, polietilenglicoles e hidrocarburos parafínicos.
Las vacunas de la presente invención también pueden coadministrarse con citocinas para mejorar aún más la inmunogenicidad. Las citocinas pueden administrarse por procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, tal como una molécula de ácido nucleico en forma de plásmido o como una proteína o proteína de fusión.
También se proporcionan kits que comprenden las vacunas de la presente invención. Por ejemplo, en el presente documento se divulgan kits que contienen una vacuna e instrucciones de uso.
V. Combinación con inhibidores de puntos de control y quimioterapia
Lo anterior puede implicar además la administración de una terapia estándar al sujeto. En algunos aspectos, la terapia estándar es la cirugía, la radiación, la radiofrecuencia, la ablación criogénica o ultranoica, la quimioterapia sistémica o una combinación de las mismas.
Las composiciones vectoriales descritas en el presente documento pueden suministrarse como composición farmacéutica en combinación con otros principios activos. El agente activo puede ser, sin limitación, incluyendo, pero sin estar limitado a radionucleidos, inmunomoduladores, agentes antiangiogénicos, citoquinas, quimiocinas, factores de crecimiento, hormonas, fármacos, profármacos, enzimas, oligonucleótidos, ARNsi, agentes proapoptóticos, agentes terapéuticos fotoactivos, agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, toxinas, otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
En otro aspecto, la composición farmacéutica incluye un vector que expresa TAA descrito en el presente documento y un inhibidor del punto de control para activar las células T efectoras CD4+, CD8+ para aumentar la eliminación del tumor.
En diversos aspectos, el inhibidor del punto de control es un anticuerpo.
Los anticuerpos son un componente clave de la respuesta inmune adaptativa, desempeñando un papel central tanto en el reconocimiento de antígenos extraños como en la estimulación de una respuesta inmune. Muchos regímenes inmunoterapéuticos incluyen anticuerpos. Existen varios anticuerpos aprobados por la FDA útiles como terapias combinadas. Estos anticuerpos pueden seleccionarse de Alemtuzumab, Atezolizumab, Ipilimumab, Nivolumab, Ofatumumab, Pembrolizumab o Rituximab.
Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra PD-1 o PD-L1 pueden potenciar la respuesta inmunitaria contra las células cancerosas y han demostrado ser muy prometedores en el tratamiento de ciertos tipos de cáncer. Algunos ejemplos de anticuerpos dirigidos contra PD-1 son Pembrolizumab y Nivolumab. Un ejemplo de anticuerpo dirigido contra PD-L1 es el Atezolizumab.
CTLA-4 es otra proteína en algunas células T que actúa como un tipo de "interruptor de apagado" para mantener el sistema inmune bajo control. El ipilimumab es un anticuerpo monoclonal que se une al CTLA-4 para bloquear su actividad y potenciar la respuesta inmunitaria contra una neoplasia.
En otro aspecto, las composiciones vectoriales inmunogénicas se administran con quimioterapia adyuvante para aumentar la capacidad de las células dendríticas de inducir la proliferación de células T.
En diversos aspectos, las composiciones vectoriales se administran antes, después o al mismo tiempo que la quimioterapia.
En ciertos aspectos, la composición de la presente invención es capaz de reducir la necesidad de un sujeto que tiene un tumor o un cáncer de recibir tratamiento quimioterapéutico o de radiación. En otros aspectos, la composición es capaz de reducir la gravedad de los efectos secundarios asociados con la radiación o la quimioterapia en un sujeto que tiene un tumor o cáncer.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse solas o en combinación con otros tipos de estrategias de tratamiento del cáncer (por ejemplo, radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia y agentes antitumorales como se describe en el presente documento.
Los agentes quimioterapéuticos adecuados útiles con estos procedimientos incluyen sorafenb, regorafenib, imatinib, eribulina, gemcitabina, capecitabina, pazopani, lapatinib, dabrafenib, sutinib malato, crizotinib, everolimus, torisirolimus, sirolimus, axitinib, gefitinib, anastrole, bicalutamida, fulvestrant, ralitrexed, pemetrexed, acetato de goserilina, erlotininb, vemurafenib, visiodegib, citrato de tamoxifeno , paclitaxel, docetaxel, cabazitaxel, oxaliplatino, ziv-aflibercept, bevacizumab, trastuzumab, pertuzumab, pantiumumab, taxano, bleomicina, melfaleno, plumbagina, camptosar, mitomicina-C, mitoxantrona, SMANCS, doxorrubicina, doxorrubicina pegilada, Folfori, 5-fluorouracilo, temozolomida, pasireotida, tegafur, gimeracilo, oteraci, itraconazol, bortezomib, lenalidomida, irintotecán, epirrubicina y romidepsina. Los agentes quimioterapéuticos preferidos son Carboplatino, Fluorouracilo, Vinblastina, Gemcitabina, Ciclofosfamida, Doxorrubicina, Metotrexato, Paclitaxel, Topotecán, Etopósido, Metotrexato, Sorafenib, Irinotecán y Tarceva.
Los nombres genéricos de los fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer que se han utilizado habitualmente en pacientes con cáncer incluyen: doxorrubicina, epirrubicina; 5-fluorouracilo, paclitaxel, docetaxel, cisplatino, bleomicina, melfaleno, plumbagina, irinotecán, mitomicina-C y mitoxantrona. A modo de ejemplo, algunos otros fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer que pueden utilizarse y pueden estar en fases de ensayo clínico incluyen: resminostat, tasquinimod, refametinib, lapatinib, Tyverb, Arenegyr, pasireotide, Signifor, ticilimumab, tremelimumab, lansoprazol, PrevOnco, ABT-869, linifanib, tivantinib, Tarceva, erlotinib, Stivarga, regorafenib, fluoro-sorafenib, brivanib, doxorrubicina liposomal, lenvatinib,ramucirumab, peretinoína, Ruchiko, muparfostat, Teysuno, tegafur, gimeracil, oteracil y orantinib.
Las marcas de fabricante de algunos medicamentos contra el cáncer que pueden utilizarse en la presente invención incluyen: NEXAVAR (sorafenb), STIVARGA (regorafenib), AFFINITOR (everolimus), G LEEV EC (imatinib), HALAVEN (eribulina), ALIMTA (pemetrexed), GEMZAR (gemcitabina), VOTRIENT (pazopanib),TYKERB (lapatinib), TAFINIAR (dabrafenib), SUTEN T (sutinib malato), XALKORI (crizotinib), TO R ISEL (torisirolimus), INLYTA (axitinib), IRESSA (gefitinib), ARIM EDEX (anastrole), CASODEX (bicalutamida), FASLO DEX (fulvestrant), TOMUDEX (ralitrexed), Zo LADEX (acetato de goserilina), TARCEVA (erlotininb), XELODA (capecitabina), ZELBRO F (vemurafenib), ER IV ED G E (visiodegib), P E R JE T A (pertuzumab), HERCEPTIN (trastuzumab), TAXO TERE (docetaxel), JEVTANA (cabazitaxel), ELOXATIN (oxaliplatino), ZALTRAP (ziv-aflibercept), AVASTIN (bevacizumab) Nolvadex, Istubal y Va LODEX (citrato de tamoxifeno), T e Mo DAR (temozolomida), S iG n IFOR (pasireotida), V E c T iBIX (pantiumumab), ADRIAMICINA (doxorrubicina), DOXIL (doxorrubicina pegilada), ABRa Xa NE (paclitaxel), TEYSUNO (tegafur, gimeracil, oteracil), BORTEZOMIB (Velcade) y con lenalidomida, ISTODAX (romidepsina).
Se cree que una forma en que la Doxorrubicina (ADRIAMICINA) y DOXIL (doxorrubicina pegilada en liposomas) pueden actuar para matar las células cancerosas es intercalando el ADN. También se cree que la doxorrubicina puede convertirse en un radical libre nitróxido y/o aumentar así los niveles celulares de radicales libres en las células cancerosas y desencadenar así el daño celular y la muerte programada. Existen efectos sistémicos adversos potencialmente graves de la doxorrubicina, tal como el daño cardiaco, que limitan su uso.
El 5-Fluorouracilo (5-FU, Efudex) es un análogo de la pirimidina que se utiliza en el tratamiento del cáncer. Es un inhibidor suicida y actúa mediante la inhibición irreversible de la timidilato sintasa. Al igual que muchos fármacos anticancerígenos, los efectos del 5-FU se dejan sentir en todo el sistema, pero recaen sobre todo en las células que se dividen rápidamente y que utilizan con más frecuencia su maquinaria de síntesis de nucleótidos, tal como las células cancerosas. El 5-FU mata las células no cancerosas de partes del cuerpo que se dividen rápidamente, por ejemplo, las células que recubren el tracto digestivo. Folfori es un tratamiento con 5-FU, Camptosar e Irinotecan (leucovorin). El 5-FU se incorpora a la molécula de ADN y detiene la síntesis, y el Camptosar es un inhibidor de la topoisomerasa, que impide que el ADN se desenrolle y duplique. La irinotecán (ácido folínico, leucovorina) es un derivado de la vitamina B que se utiliza como fármaco de "rescate" para dosis elevadas del medicamento metotrexato y que modula/potencia/reduce los efectos secundarios del 5-FU (fluorouracilo). La mitomicina C es un potente reticulante del ADN. El uso prolongado puede provocar daños permanentes en la médula ósea. También puede causar fibrosis pulmonar y daño renal.
Los agentes taxanos incluyen paclitaxel (Taxol) y docetaxel (Taxotere). Los taxanos alteran la función de los microtúbulos celulares. Los microtúbulos son esenciales para la división celular. Los taxanos estabilizan la tubulina unida a GDP en el microtúbulo, inhibiendo así el procedimiento de división celular. Las células cancerosas ya no pueden dividirse. Sin embargo, los taxanos también pueden inhibir la división celular de las células no cancerosas.
Los Cisplatinos que incluyen carboplatino y oxaliplatino son complejos orgánicos de platino que reaccionan in vivo, uniéndose y causando reticulación del ADN. El ADN reticulado desencadena la apoptosis (muerte celular programada) de las células cancerosas. Sin embargo, las cisplatinas también pueden desencadenar la apoptosis de células no cancerosas.
La bleomicina induce roturas de la cadena de ADN. Algunos estudios sugieren que la bleomicina también inhibe la incorporación de timidina a las cadenas de ADN. La bleomicina también mata las células no cancerosas. El melfaleno (Alkeran) es un agente alquilante de mostaza nitrogenada que añade un grupo alquilo a la base de guanina del ADN. Los principales efectos adversos del mephalen incluyen vómitos, ulceración oral y supresión de la médula ósea.
Se ha demostrado que la plumbagina induce la detención del ciclo celular y la apoptosis en numerosas líneas celulares cancerosas. Activa la autofagia mediante la inhibición de la vía Akt/mTOR. Induce la detención del ciclo celular G2/M y la apoptosis a través de la fosforilación Ser15 de p53 dependiente de JNK. Promueve la muerte celular autofágica. Inhibe la señalización Akt/mTOR. Induce la generación intracelular de ROS de forma dependiente de la PI 5-cinasa. Para las células no cancerosas, la plumbagina es una toxina, una genotoxina y un mutágeno.
Un agente quimioterapéutico puede seleccionarse basándose en su especificidad y potencia de inhibición de una vía celular objetivo a la que las células cancerosas del paciente puedan ser susceptibles. En la práctica de la invención, el agente quimioterapéutico puede seleccionarse por su capacidad de inhibir un objetivo de vía celular seleccionada del grupo que consiste en mTORC, quinasa r A f , quinasa MEK, fosfoinositol quinasa 3, receptor del factor de crecimiento de fibroblastos, tirosina quinasa múltiple, receptor del factor de crecimiento epidérmico humano, factor de crecimiento endotelial vascular, otras angiogénesis, proteína de choque térmico; Receptor Smo (liso), receptor tirosina quinasa 3 similar al FMS, inhibidor de la proteína de la apoptosis, quinasas dependientes de ciclinas, desacetilasa, receptor tirosina quinasa ALK, serina/treonina-proteína cinasa Pim-1, aciltransferasa de puercoespín, vía del erizo , proteína quinasa C, mDM2, Glypciin3, ChK1, receptor MET del factor de crecimiento de los hepatocitos, dominio similar al factor de crecimiento epidérmico 7, vía Notch, quinasa de la familia Src, ADN metiltransferasa, intercaladores del ADN, timidina sintasa, disruptores de la función microtubular, reticuladores del ADN, disruptores de la cadena del ADN, alquiladores del ADN, inductores de la fosforilación Ser15 de p53 dependiente de JNK, inhibidores de la topoisomerasa del ADN, Bcl-2 y generadores de radicales libres.
En un aspecto, las composiciones vectoriales se administran, antes, después o al mismo tiempo que los moduladores epigenéticos.
En un aspecto, las composiciones vectoriales se administran, antes, después o al mismo tiempo que un modulador epigenético seleccionado del grupo que consiste en inhibidores de metiltransferasas de ADN, inhibidores de histona metiltransferasas, inhibidores de histona acetiltransferasas, inhibidores de histona desacetilasas e inhibidores de lisina desmetilasas.
En un aspecto, las composiciones vectoriales se administran, antes, después o al mismo tiempo que un inhibidor de las ADN metiltransferasas.
En un aspecto, las composiciones vectoriales se administran, antes, después o al mismo tiempo que un inhibidor de las histonas deacetilasas.
VI. Composiciones de uso
Las composiciones de la invención pueden utilizarse como vacunas para inducir una respuesta inmunitaria a un TAA.
En realizaciones ejemplares, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos un MVA recombinante de acuerdo con la invención y un portador farmacéutico para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención del cáncer causado por neoplasias en un sujeto en el que el al menos un vector MVA recombinante debe administrarse al sujeto en una cantidad eficaz para generar una respuesta inmunitaria. El resultado del uso es que el sujeto queda parcial o totalmente inmunizado contra el TAA.
En el presente documento se proporciona la activación de una respuesta inmunitaria en un sujeto utilizando las composiciones descritas. En algunos aspectos, la invención proporciona la promoción de una respuesta inmune en un sujeto utilizando una composición descrita en el presente documento. En algunos aspectos, la invención proporciona el aumento de una respuesta inmune en un sujeto utilizando una composición descrita en el presente documento. En algunos aspectos, la invención proporciona la mejora de una respuesta inmune en un sujeto utilizando una composición descrita en el presente documento.
En divulgaciones ejemplares, la composición farmacéutica se proporciona para tratar, reducir, prevenir o retrasar el crecimiento de una neoplasia en un sujeto que la necesita, comprendiendo la administración de la composición de la presente invención al sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. El resultado es un sujeto con un perfil terapéutico mejorado para una enfermedad asociada a la neoplasia.
En realizaciones ejemplares, la presente invención proporciona la composición farmacéutica para tratar el cáncer causado por neoplasias en un sujeto que la necesita, que comprende administrar la composición de la presente invención al sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. El resultado es un sujeto con un perfil terapéutico mejorado para un cáncer.
En un aspecto, las composiciones pueden reducir el crecimiento de uno o más tumores, reducir el tamaño de uno o más tumores o erradicar uno o más tumores. Por ejemplo, la masa tumoral no aumenta. En ciertos aspectos, el tumor se reduce en 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % o más (o cualquier número intermedio) en comparación con su masa original. En ciertos aspectos, el encogimiento es tal que un tumor inoperable es suficiente para permitir la resección si se desea. El concepto de reducción sustancial también puede denominarse "regresión", que se refiere a la disminución de un crecimiento corporal, tal como un tumor. Dicha disminución puede determinarse por una reducción de los parámetros medidos tal como, por ejemplo, el diámetro, la masa (es decir, el peso) o el volumen. Esta disminución no indica en absoluto que el tamaño se haya reducido por completo, sólo que un parámetro medido es cuantitativamente menor que una determinación anterior.
En un aspecto, las composiciones pueden prevenir la metástasis tumoral.
En divulgaciones ejemplares, también se proporcionan composiciones para su uso en el tratamiento de un trastorno proliferativo en un sujeto que lo necesita, que comprenden la administración de la composición de la presente invención al sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. En el presente documento, el término "trastorno proliferativo" hace referencia a un trastorno en el que el crecimiento de una población de células supera al de las células circundantes y no está coordinado con éste. En algunos casos, un trastorno proliferativo conduce a la formación de un tumor. En algunos aspectos, el tumor es benigno, premaligno o maligno. En otras realizaciones, el trastorno proliferativo es una enfermedad autoinmune, oclusión vascular, reestenosis, aterosclerosis o enfermedad inflamatoria intestinal. Las enfermedades autoinmunes pueden seleccionarse del grupo que consiste en enfermedades autoinmunes de tipo I o enfermedades autoinmunes de tipo II o enfermedades autoinmunes de tipo III o enfermedades autoinmunes de tipo IV, tal como, por ejemplo, esclerosis múltiple (EM), artritis reumatoide, diabetes, diabetes de tipo I (Diabetes mellitus), lupus eritematoso sistémico (LES ), poliartritis crónica, enfermedad de Basedow, formas autoinmunes de hepatitis crónica, colitis ulcerosa, enfermedades alérgicas de tipo I, enfermedades alérgicas de tipo II, enfermedades alérgicas de tipo III, enfermedades alérgicas de tipo IV, fibromialgia, caída del cabello, enfermedad de Bechterew, enfermedad de Crohn, miastenia gravis, neuroclermitis, polimialgia reumática, esclerosis sistémica progresiva (ESP ), psoriasis, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, psoriasis, vasculitis, etc., o diabetes de tipo II.
En una realización, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria humoral, una respuesta inmunitaria celular o una combinación de las mismas.
En una realización particular, la respuesta inmunitaria comprende la producción de anticuerpos de unión contra el TAA.
En una realización particular, la respuesta inmunitaria comprende la producción de anticuerpos neutralizantes contra el TAA.
En una realización particular, la respuesta inmunitaria comprende la producción de anticuerpos no neutralizantes contra el TAA.
En una realización particular, la respuesta inmunitaria comprende la producción de una respuesta inmunitaria mediada por células contra el TAA.
En un aspecto particular, la respuesta inmunitaria comprende la producción de anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes contra el TAA.
En un aspecto particular, la respuesta inmune comprende la producción de anticuerpos neutralizantes e inmunidad mediada por células contra el TAA.
En un aspecto particular, la respuesta inmune comprende la producción de anticuerpos no neutralizantes e inmunidad mediada por células contra el TAA.
En un aspecto particular, la respuesta inmunitaria comprende la producción de anticuerpos neutralizantes, anticuerpos no neutralizantes e inmunidad mediada por células contra el TAA.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden usarse como vacunas para tratar a un sujeto en riesgo de desarrollar una neoplasia, o a un sujeto que ya tiene una neoplasia. El vector viral recombinante comprende genes o secuencias que codifican TAAs, proteínas virales para promover el ensamblaje de partículas similares a virus (VLP) o enzimas adicionales para facilitar la expresión y glicosilación del TAA.
Típicamente las vacunas estarán en una mezcla y se administrarán simultáneamente, pero también pueden administrarse separadamente.
Un sujeto que va a ser tratado como se describe en el presente documento puede ser uno que ha sido diagnosticado por un médico como teniendo tal condición. (por ejemplo, un sujeto con una neoplasia). El diagnóstico puede realizarse por cualquier medio adecuado. Un experto en la técnica entenderá que un sujeto que se va a tratar de acuerdo con la presente invención puede haber sido identificado mediante pruebas estándar o puede haber sido identificado, sin examen, como un sujeto de alto riesgo debido a la presencia de uno o más factores de riesgo.
El tratamiento profiláctico puede administrarse, por ejemplo, a un sujeto que aún no tiene una neoplasia pero que es susceptible de desarrollar una neoplasia o está en riesgo de desarrollarla.
El tratamiento terapéutico puede administrarse, por ejemplo, a un sujeto que ya tiene una neoplasia con el fin de mejorar o estabilizar el estado del sujeto. El resultado es un perfil terapéutico mejorado. En algunos casos, en comparación con un control equivalente no tratado, el tratamiento puede mejorar un trastorno o un síntoma del mismo en, por ejemplo, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 %, medido mediante cualquier técnica estándar.
Por ejemplo, dependiendo del tipo de cáncer, un perfil terapéutico mejorado puede seleccionarse entre alivio de uno o más síntomas del cáncer, disminución de la extensión de la enfermedad, estabilización (es decir, no empeoramiento) del estado de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, remisión (parcial o total), detectable o indetectable, regresión tumoral, inhibición del crecimiento tumoral, inhibición de la metástasis tumoral, reducción del número de células cancerosas, inhibición de la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos, mejora del tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP), mejora de la tasa de respuesta (RR), prolongación de la supervivencia global (SG), prolongación del tiempo hasta el siguiente tratamiento (TNTT), o prolongación del tiempo desde la primera progresión hasta el siguiente tratamiento, o una combinación de dos o más de las anteriores.
El tratamiento puede dar lugar a la mejora de uno o más síntomas de una enfermedad asociada con una neoplasia (por ejemplo, cáncer). De acuerdo con este aspecto, la confirmación del tratamiento puede evaluarse detectando una mejora o la ausencia de síntomas.
En una divulgación, también se divulga la inducción de una respuesta inmune en un sujeto (por ejemplo, un humano) administrando al sujeto un vector viral recombinante que codifica al menos un TAA o fragmento inmunogénico del mismo. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria celular o una respuesta inmunitaria humoral, o una combinación de las mismas.
La composición puede administrarse, por ejemplo, mediante inyección (por ejemplo, intramuscular, intraarterial, intravascular, intravenosa, intraperitoneal o subcutánea).
Se apreciará que puede emplearse más de una vía de administración de las vacunas de la presente invención, ya sea simultánea o secuencialmente (por ejemplo, reforzamiento). Además, las vacunas de la presente invención pueden emplearse en combinación con enfoques de inmunización tradicionales, tal como el empleo de antígenos proteicos, virus vaccinia y virus inactivados, como vacunas. Así, en un aspecto, las vacunas de la presente invención se administran a un sujeto (el sujeto se "ceba" con una vacuna de la presente invención) y luego se administra una vacuna tradicional (el sujeto se "refuerza" con una vacuna tradicional). En otro aspecto, primero se administra al sujeto una vacuna tradicional seguida de la administración de una vacuna de la presente invención. En otro aspecto, se coadministran una vacuna tradicional y una vacuna de la presente invención.
Si bien no hay que limitarse a ningún mecanismo específico, se cree que tras la inoculación con una composición farmacéutica como la descrita en el presente documento, el sistema inmunitario del huésped responde a la vacuna produciendo anticuerpos, tanto secretores como séricos, específicos para uno o más TAA o fragmentos inmunogénicos de los mismos; y produciendo una respuesta inmunitaria mediada por células específica para uno o más TAA o fragmentos inmunogénicos de los mismos. Como resultado de la vacunación, el huésped se vuelve al menos parcial o completamente inmune a uno o más TAA o fragmentos inmunogénicos de los mismos, o resistente a desarrollar enfermedades moderadas o graves causadas por la neoplasia.
En un aspecto, se proporcionan composiciones de uso para aliviar, reducir la gravedad o reducir la aparición de uno o más de los síntomas asociados con una neoplasia que comprende la administración de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un vector viral MVA recombinante que comprende TAA y secuencias de proteína de matriz que opcionalmente coexpresan secuencias que facilitan la expresión y la glicosilación deseada de la TAA.
En otro aspecto, se proporcionan composiciones para proporcionar inmunidad anti-TAA que comprenden la administración de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende una vacuna MVA recombinante que expresa TAA y una proteína de matriz viral para permitir la formación de las VLP.
También se apreciará que pueden llevarse a cabo administraciones únicas o múltiples de las composiciones vacunales de la presente invención. Por ejemplo, los sujetos que tienen un riesgo particularmente alto de desarrollar una neoplasia pueden requerir múltiples inmunizaciones para establecer y/o mantener respuestas inmunitarias protectoras. Los niveles de inmunidad inducida pueden controlarse midiendo las cantidades de anticuerpos secretores y séricos de unión y neutralizantes, así como los niveles de células T, y ajustando las dosificaciones o repitiendo las vacunaciones según sea necesario para mantener los niveles deseados de protección.
En un aspecto, la administración se repite al menos dos veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces o más de 8 veces.
En un aspecto, la administración se repite dos veces.
En un aspecto, se proporcionan aproximadamente 2-8, aproximadamente 4-8, o aproximadamente 6-8 administraciones.
En un aspecto, se proporcionan intervalos de aproximadamente 1-4 semanas, 2-4 semanas, 3-4 semanas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas o más de 4 semanas entre administraciones.
En un aspecto específico, se utiliza un intervalo de 4 semanas entre 2 administraciones.
La divulgación también proporciona un procedimiento para monitorizar el progreso del tratamiento. En aspectos ejemplares, la monitorización se centra en la actividad biológica, la respuesta inmunitaria y/o la respuesta clínica. En un aspecto, la actividad biológica es una respuesta inmunitaria de células T, actividad de células T reguladoras, respuesta de moléculas (MRD), respuesta citogénica o respuesta tumoral convencional, por ejemplo, en el entorno adyuvante o de enfermedad avanzada.
En un aspecto, la respuesta inmunitaria se monitoriza, por ejemplo, mediante un ensayo inmunológico tal como un ensayo de citotoxicidad, un ensayo de citoquinas intracelulares, un ensayo de tetrámeros o un ensayo ELISPO T.
En un aspecto, la respuesta clínica se monitoriza por ejemplo por el resultado usando definiciones establecidas como respuesta (regresión tumoral), libre de progresión, libre de recurrencia, o supervivencia global.
En un aspecto, el procedimiento incluye el paso de determinar un nivel de marcador de diagnóstico (por ejemplo, cualquier objetivo delineado en el presente documento modulado por un compuesto del presente documento, una proteína o indicador del mismo, etc.) o medida de diagnóstico (por ejemplo, cribado, ensayo) en un sujeto que ha recibido una cantidad terapéutica de un compuesto del presente documento suficiente para tratar la enfermedad o los síntomas de la misma. El nivel de marcador determinado en el procedimiento puede compararse con niveles conocidos de marcador en controles normales sanos o en otros pacientes afectados para establecer el estado de la enfermedad del sujeto. En aspectos preferidos, un segundo nivel de marcador en el sujeto se determina en un momento posterior a la determinación del primer nivel, y los dos niveles se comparan para monitorizar el curso de la enfermedad o la eficacia de la terapia. En ciertos aspectos preferidos, se determina un nivel de marcador previo al tratamiento en el sujeto antes de comenzar el tratamiento de acuerdo con esta invención; este nivel de marcador previo al tratamiento puede entonces compararse con el nivel de marcador en el sujeto después de comenzar el tratamiento, para determinar la eficacia del tratamiento.
Tras la mejora de la condición de un sujeto (por ejemplo, un cambio (por ejemplo, disminución) en el nivel de la enfermedad en el sujeto), se puede administrar una dosis de mantenimiento de un compuesto, composición o combinación de esta invención, si es necesario. Posteriormente, la dosis o la frecuencia de administración, o ambas, pueden reducirse, en función de los síntomas, hasta un nivel en el que se mantenga el estado mejorado. No obstante, los pacientes pueden necesitar tratamiento intermitente a largo plazo en caso de reaparición de los síntomas de la enfermedad.
A. Dosificación
Las vacunas se administran de manera compatible con la formulación de dosificación, y en la cantidad que sea terapéuticamente eficaz, inmunogénica y protectora. La cantidad que se va a administrar depende del sujeto, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos y, si es necesario, para producir una respuesta inmunitaria mediada por células. Las cantidades precisas de principio activo que deben administrarse dependen del criterio del facultativo y pueden monitorearse paciente por paciente. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados son fácilmente determinables por un experto en la técnica y generalmente oscilan de aproximadamente5,0 * 106 TCID 5 o a aproximadamente 5,0 * 109 TCID 50. La dosis también puede depender, sin limitación, de la vía de administración, el estado de salud y el peso del paciente, y la naturaleza de la formulación.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se administran en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz, inmunogénica y/o protectora contra una neoplasia que exprese un TAA. La dosis administrada depende del sujeto que se va a tratar (por ejemplo, la forma de administración y la edad, el peso corporal, la capacidad del sistema inmunitario y el estado general de salud del sujeto que se va a tratar). La composición se administra en una cantidad que proporcione un nivel suficiente de expresión que provoque una respuesta inmunitaria sin efectos fisiológicos adversos indebidos. Preferentemente, la composición es un vector viral heterólogo que incluye uno o más TAA o fragmentos inmunogénicos de los mismos y proteína de matriz grande y se administra a una dosificación de, por ejemplo, entre 1.0 * 104 y 9,9 * 1012 TCID 50 del vector viral, preferentemente entre 1,0 * 105 TCID 5 o y 1,0 * 1011 TCID 50 ufp, más preferentemente entre 1,0 * 106 y 1,0 * 1010 TCID 50 ufp, o más preferentemente entre 5,0 * 106 y 5,0 * 109 TCID 50. La composición puede incluir, por ejemplo, al menos 5,0 * 106 TCID 5 0 del vector viral (por ejemplo, 1,0 *108 TCID 50 del vector viral). Un médico o investigador puede decidir la cantidad adecuada y el régimen de dosificación.
La composición puede incluir, por ejemplo, entre 1,0 * 104 y 9,9 * 1012 TCID 50 del vector viral, preferentemente entre 1.0 * 105 TCID 50 y 1,0 * 1011 TCID 50 upf, más preferentemente entre 11,0 * 106 y 1,0 * 1010 TCID 50 upf, o más preferentemente entre 1,0 * 106 y 1,0 * 1010 TClD 50 La composición puede incluir, por ejemplo, al menos 5,0 * 106 TCID 50 del vector viral (por ejemplo, 1,0 * 108 TCID 50 del vector viral). El procedimiento puede incluir, por ejemplo, la administración de la composición al sujeto dos o más veces.
El término "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de una composición administrada para mejorar, inhibir o mejorar una condición de un sujeto, o un síntoma de un trastorno, de una manera clínicamente relevante (por ejemplo, mejorar, inhibir o mejorar la enfermedad asociada con una neoplasia (por ejemplo, cáncer) o proporcionar una respuesta inmune eficaz a una neoplasia). Cualquier mejoría del sujeto se considera suficiente para lograr el tratamiento. Preferentemente, una cantidad suficiente para tratar es una cantidad que previene la aparición de uno o más síntomas de la enfermedad asociada con una neoplasia o es una cantidad que reduce la gravedad de, o la duración del tiempo durante el cual un sujeto sufre de, uno o más síntomas de la enfermedad asociada con una neoplasia (por ejemplo, en al menos 10 %, 20 % o 30 %, más preferentemente en al menos 50 %, 60 % o 70 %, y más preferentemente en al menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más, en relación con un sujeto de control no tratado con una composición de la invención). Una cantidad suficiente de la composición farmacéutica utilizada para practicar los procedimientos descritos en el presente documento (por ejemplo, el tratamiento de la enfermedad asociada a una neoplasia) varía en función de la forma de administración y de la edad, el peso corporal y el estado general de salud del sujeto tratado.
Es importante señalar que el valor de la presente invención puede no demostrarse nunca en términos de beneficio clínico real. En su lugar, es probable que el valor de la invención se demuestre en términos de éxito frente a un marcador sustitutivo de la protección. Para una indicación tal como la enfermedad asociada a una neoplasia, en la que es poco práctico o ético intentar medir el beneficio clínico de una intervención, el procedimiento de Aprobación Acelerada de la FDA permite aprobar una nueva vacuna basándose en la eficacia frente a un criterio de valoración sustitutivo. Por lo tanto, el valor de la invención puede residir en su capacidad para inducir una respuesta inmunitaria que constituya un marcador sustitutivo de protección.
Del mismo modo, la FDA puede permitir la aprobación de vacunas contra los AAT basándose en su Regla Animal. En este caso, la aprobación se consigue basándose en la eficacia en animales.
La composición puede incluir, por ejemplo, entre 1,0 * 104 y 9,9 * 1012 TCID 50 del vector viral, preferentemente entre 105 TCID 50 y 1,0 * 1011 TCID 50 upf, más preferentemente entre 1,0 * 106 y 1,0 * 1010 TCID 50 upf, o más preferentemente entre 5,0 * 106 y 5,0 * 109 TCID 50. La composición puede incluir, por ejemplo, al menos 5,0 * 106 TCID 50 del vector viral (por ejemplo, 1,0 *108 TCID 50 del vector viral). El procedimiento puede incluir, por ejemplo, la administración de la composición dos o más veces.
En algunos casos puede ser deseable combinar las vacunas TAA de la presente invención con vacunas que inducen respuestas protectoras a otros agentes, particularmente otros TAAs. Por ejemplo, las composiciones vacunales de la presente invención pueden administrarse simultáneamente, por separado o secuencialmente con otras vacunas de inmunización genética como las de la gripe (Ulmer, J . B. et al., Science 259:1745-1749 (1993); Raz, E. et al., PNAS (EE . UU.) 91:9519-9523 (1994)), la malaria (Doolan, D. L. et al., J . Exp. Med. 183:1739-1746 (1996); Sedegah, M. et al., PNAS (EE . UU.) 91:9866-9870 (1994)), y la tuberculosis (Tascon, R. C. et al., Nat. Med. 2:888-892 (1996)).
B. Indicaciones
Los vectores inmunogénicos pueden administrarse a un sujeto con una neoplasia o a un sujeto diagnosticado de carcinoma de próstata, mama, pulmón, hígado, endometrio, vejiga, colon o cuello uterino; adenocarcinoma; melanoma; linfoma; glioma; o sarcomas tales como sarcomas de tejidos blandos y óseos
Los vectores de la invención pueden usarse para el tratamiento o prevención del cáncer, incluyendo, pero no limitado a, tumores neoplasias, metástasis, o cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por un crecimiento celular incontrolado, y particularmente formas resistentes a múltiples fármacos de los mismos. El cáncer puede ser un tumor multifocal. Ejemplos de tipos de cáncer y trastornos proliferativos a tratar con la terapéutica de la invención incluyen, pero no se limitan a, leucemia (por ejemplo, mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, eritroleucemia, leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica), linfoma (por ejemplo. Enfermedad de Hodgkin y enfermedad no Hodgkin), fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, angiosarcoma, endoteliosarcoma, tumor de Ewing, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de células renales, hepatoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, oligodendroglioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, displasia e hiperplasia. En una realización particular, los compuestos terapéuticos de la invención se administran a pacientes que padecen cáncer de próstata (por ejemplo, prostatitis, hipertrofia prostática benigna, hiperplasia prostática benigna (HPB), paraganglioma prostático, adenocarcinoma prostático, neoplasia intraepitelial prostática, fístulas prostático-rectales y lesiones atípicas del estroma prostático). En un aspecto especialmente preferido, los medicamentos de la presente invención se utilizan para el tratamiento del cáncer, glioma, carcinoma hepático y/o carcinoma de colon. El tratamiento y/o la prevención del cáncer incluyen, pero no se limitan a, el alivio de los síntomas asociados al cáncer, la inhibición de la progresión del cáncer, la promoción de la regresión del cáncer y la promoción de la respuesta inmunitaria.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término neoplasia se refiere a un crecimiento anormal de tejido. Una neoplasia puede ser benigna o maligna. Generalmente, una neoplasia maligna se denomina cáncer. Los cánceres se diferencian de las neoplasias benignas en la capacidad de las células malignas para invadir otros tejidos, ya sea por crecimiento directo en el tejido adyacente mediante invasión o por implantación en lugares distantes mediante metástasis (es decir, transporte a través de la sangre o el sistema linfático). Las composiciones de uso descritas en el presente documento son adecuadas para el tratamiento de neoplasias benignas y malignas (cáncer).
Tal y como se define en el presente documento, una neoplasia superficial es aquella localizada en la superficie externa del cuerpo que se ha confinado y no se ha extendido a los tejidos circundantes o a otras partes del cuerpo. Neoplasia interna localizada en un órgano interno u otra parte interna del cuerpo. Una neoplasia invasiva es una neoplasia que ha empezado a atravesar las barreras del tejido normal e invadir las zonas circundantes, por ejemplo, un cáncer de mama invasivo que se ha extendido más allá de los conductos y lobulillos
Una lista no exclusiva de los tipos de neoplasias contempladas para el tratamiento mediante el uso de las composiciones divulgadas en el presente documento incluye las siguientes categorías: (a) neoplasias abdominales, incluyendo las neoplasias peritoneales y las neoplasias retroperitoneales; b) neoplasias óseas, incluyendo las neoplasias femorales, las neoplasias craneales, las neoplasias mandibulares, las neoplasias manibulares, las neoplasias maxilares, las neoplasias palatinas, las neoplasias nasales, las neoplasias orbitarias, las neoplasias de la base del cráneo y las neoplasias espinales; c) neoplasias de mama, incluyendo las neoplasias de mama masculina, el carcinoma ductal de mama y el tumor filodes; (d) neoplasias del aparato digestivo, incluyendo las neoplasias del tracto biliar, las neoplasias del conducto biliar, las neoplasias del conducto biliar común, las neoplasias de la vesícula biliar, las neoplasias gastrointestinales, las neoplasias esofágicas, las neoplasias intestinales, las neoplasias cecales, las neoplasias apendiculares, las neoplasias colorrectales, la poliposis adenomatosa coli colorrectal, el síndrome de Gardner colorrectal, las neoplasias colónicas, la poliposis adenomatosa coli colónica, el síndrome de Gardner colónico, las neoplasias sigmoideas, las neoplasias colorrectales hereditarias no polipósicas, las neoplasias rectales, las neoplasias de ano, las neoplasias duodenales, las neoplasias ileales, las neoplasias yeyunales, las neoplasias de estómago, las neoplasias hepáticas, el adenoma hepatocelular, carcinoma hepatocelular, las neoplasias pancreáticas, el adenoma de células de los islotes, la insulinoma, el carcinoma de células de los islotes, el gastrinoma, la glucagonoma, la somatostatinoma, el vipoma, el carcinoma ductal pancreático y las neoplasias peritoneales; (e) neoplasias de las glándulas endocrinas, incluyendo las neoplasias de las glándulas suprarrenales, las neoplasias de la corteza suprarrenal, el adenoma corticosuprarrenal, el carcinoma corticosuprarrenal, la neoplasia endocrina múltiple, la neoplasia endocrina múltiple de tipo 1, la neoplasia endocrina múltiple tipo 2a, la neoplasia endocrina múltiple tipo 2b, las neoplasias ováricas, el tumor de células de la granulosa, la luteoma, el síndrome de Meigs, el tumor ovárico de células de Sertoli-Leydig, el tecoma, las neoplasias pancreáticas, los síndromes endocrinos paraneoplásicos, las neoplasias paratiroideas, las neoplasias hipofisarias, el síndrome de Nelson, las neoplasias testiculares, el tumor testicular de células de Sertoli-Leydig, y las neoplasias tiroideas (f) las neoplasias oculares, incluyendo las neoplasias conjuntivales, las neoplasias orbitarias, las neoplasias retinianas, retinoblastoma, las neoplasias uveales, las neoplasias coroideas y las neoplasias del iris (g) las neoplasias cerebrales, de cabeza y cuello, incluyendo las neoplasias esofágicas, las neoplasias faciales, las neoplasias de párpados, las neoplasias bucales, las neoplasias gingivales, la leucoplasia oral, la leucoplasia vellosa, las neoplasias labiales, las neoplasias palatinas, las neoplasias de glándulas salivales, las neoplasias parotídeas, las neoplasias de glándulas sublinguales, las neoplasias de glándulas submandibulares, las neoplasias linguales, las neoplasias otorrinolaringológicas, las neoplasias de oído, las neoplasias laríngeas, las neoplasias de nariz, las neoplasias de seno paranasal, las neoplasias de seno maxilar, las neoplasias faríngeas, las neoplasias hipofaríngeas, las neoplasias nasofaríngeas, las neoplasias nasofaríngeas, las neoplasias orofaríngeas, las neoplasias amigdalares, las neoplasias paratiroideas, las neoplasias tiroideas y las neoplasias traqueales; (h) las neoplasias hematológicas, incluyendo las neoplasias de médula ósea; (i) las neoplasias del sistema nervioso, incluyendo las neoplasias del sistema nervioso central, las neoplasias cerebrales, las neoplasias del ventrículo cerebral, las neoplasias del plexo coroideo, el papiloma del plexo coroideo, las neoplasias infratentoriales, las neoplasias del tronco encefálico, las neoplasias cerebelosas, neurocitoma, pinealoma, las neoplasias supratentoriales, las neoplasias hipotalámicas, las neoplasias hipofisarias, síndrome de Nelson, las neoplasias del nervio craneal, las neoplasias del nervio óptico, glioma del nervio óptico, neuroma acústico, neurofibromatosis 2, síndromes paraneoplásicos del sistema nervioso, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, encaphalitis límbica, mielitis transversa, degeneración cerebelosa paraneoplásica, polineuropatía paraneoplásica, las neoplasias del sistema nervioso periférico, las neoplasias del nervio craneal, neuroma acústico y neoplasias del nervio óptico; (j) las neoplasias pélvicas; (k) las neoplasias cutáneas, incluidos el acantoma, las neoplasias de las glándulas sebáceas, las neoplasias de las glándulas sudoríparas y el carcinoma basocelular; (l) las neoplasias de tejidos blandos, incluyendo las neoplasias musculares y las neoplasias vasculares; (m) las neoplasias esplénicas; (n) las neoplasias torácicas, incluyendo las neoplasias cardíacas, las neoplasias mediastínicas, las neoplasias de las vías respiratorias, las neoplasias bronquiales, las neoplasias pulmonares, el carcinoma broncogénico y el carcinoma pulmonar no microcítico, la lesión pulmonar en moneda, el síndrome de Pancoasts, blastoma pulmonar, el hemangioma esclerosante pulmonar, las neoplasias pleurales, derrame pleural maligno, las neoplasias traqueales, las neoplasias del timo y timoma; (o) las neoplasias urogenitales, incluyendo las neoplasias genitales femeninas, las neoplasias de las trompas de Falopio, las neoplasias uterinas, las neoplasias del cuello uterino, las neoplasias endometriales, el carcinoma endometrioide, los tumores del estroma endometrial, el sarcoma del estroma endometrial, las neoplasias vaginales, las neoplasias vulvares, las neoplasias genitales masculinas, las neoplasias peneanas, las neoplasias prostáticas, las neoplasias testiculares, las neoplasias urológicas, las neoplasias vesicales, las neoplasias renales, el carcinoma de células renales, el nefroblastoma, e; síndrome de Denys-Drash, síndrome de WAGR, el nefroma mesoblástico, las neoplasias ureterales y las neoplasias uretrales; (p) y los cánceres adicionales, incluyendo el carcinoma renal, el cáncer de pulmón, el melanoma, la leucemia, el esófago de Barrett y las células precancerosas metaplásicas.
En un aspecto, los vectores estimuladores de la respuesta inmune descritos en el presente documento expresan MUC1 o un fragmento inmunogénico del mismo y son particularmente útiles para tratar Adenocarcinomas (mama, colorrectal, pancreático, otros), tumor carcinoide, cordoma, coriocarcinoma, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas (DSRCT), sarcoma epitelioide, sarcoma de células dendríticas foliculares, sarcoma de células dendríticas interdigitantes / células reticuladas, Pulmón: lesiones neumocíticas de tipo II (hiperplasia de células de tipo II, células de tipo II displásicas, hiperplasia alveolar apical), linterna anaplásico de células grandes, linterna difuso de células B grandes (variable), linterna plasmablástico, linterna de efusión primaria, mesoteliomas epitelioides, mieloma, plasmacitomas, perineurioma, carcinoma de células renales, sarcoma sinovial (zonas epiteliales), carcinoma tímico (a menudo), meningioma o enfermedad de Paget.
C. Administración
Como se usa en el presente documento, el término "administrar" se refiere a dar una dosificación de una composición farmacéutica de la invención a un sujeto. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse por una vía seleccionada entre, por ejemplo, parenteral, dérmica, transdérmica, ocular, inhalatoria, bucal, sublingual, perilingual, nasal, rectal, administración tópica y administración oral. La administración parenteral incluye la administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intraarterial, intravascular e intramuscular. La vía de administración preferida puede variar en función de diversos factores (por ejemplo, los componentes de la composición que se administran y la gravedad de la afección que se trata).
La administración de las composiciones farmacéuticas (por ejemplo, vacunas) de la presente invención puede realizarse por cualquiera de las vías conocidas por un experto en la técnica. La administración puede realizarse, por ejemplo, mediante inyección intramuscular. Las composiciones descritas en el presente documento también pueden administrarse por una vía seleccionada entre, por ejemplo, parenteral, dérmica, transdérmica, ocular, inhalatoria, bucal, sublingual, perilingual, nasal, rectal, administración tópica y administración oral. La administración parenteral incluye la administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea e intramuscular. La vía de administración preferida puede variar en función de diversos factores, por ejemplo, los componentes de la composición administrada y la gravedad de la afección tratada.
Además, pueden administrarse a un sujeto administraciones únicas o múltiples de las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los sujetos que son particularmente susceptibles a desarrollar una neoplasia pueden requerir múltiples tratamientos para establecer y/o mantener la protección contra la neoplasia. Los niveles de inmunidad inducida proporcionados por las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden monitorizarse, por ejemplo, midiendo las cantidades de anticuerpos neutralizantes secretores y séricos. Las dosificaciones pueden entonces ajustarse o repetirse según sea necesario para mantener los niveles deseados de protección contra el desarrollo de una neoplasia o para reducir el crecimiento de una neoplasia.
Se puede obtener una mayor eficacia de la vacunación sincronizando la administración del vector. Cualquiera de las composiciones de cebado y refuerzo descritas anteriormente son adecuadas para su uso con los procedimientos descritos en el presente documento.
En un aspecto, los vectores MVA se utilizan tanto para fines de cebado como de refuerzo. Dichos protocolos incluyen, pero no se limitan a, MM, MMM y MMMM.
En algún aspecto, se administran uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez refuerzos MVA.
Los vectores pueden administrarse solos (es decir, un plásmido puede administrarse en una o varias ocasiones con o sin un tipo alternativo de formulación de vacuna (por ejemplo, con o sin administración de proteína u otro tipo de vector, tal como un vector viral)) y, opcionalmente, con un adyuvante o junto con (por ejemplo, antes de) una inmunización de refuerzo alternativa (por ejemplo, una vacuna vectorizada viva, tal como un vector recombinante modificado de vaccinia Ankara (MVA)) que comprenda un inserto que puede ser distinto del de la porción "principal" de la inmunización o puede ser un inserto(s) de vacuna relacionado(s). Por ejemplo, GM-CSF u otros adyuvantes conocidos por los expertos en la técnica. El adyuvante puede ser un "adyuvante genético" (es decir, una proteína administrada mediante una secuencia de ADN).
En divulgaciones ejemplares, se divulga una composición para uso en un procedimiento de inmunización que comprende (i) administrar una composición de cebado que comprende un plásmido de ADN que comprende una o más secuencias que codifican un t Aa o fragmento inmunogénico del mismo; (ii) administrar una primera dosis de una composición de refuerzo que comprende un vector viral de vaccinia Ankara modificado que comprende uno o más genes que codifican un TAA o fragmento inmunogénico del mismo; y (iii) administrar una segunda dosis de una composición de refuerzo entre aproximadamente 12 y 20 semanas después de la primera dosis, más particularmente entre aproximadamente 14 y aproximadamente 18 semanas después de la primera dosis, incluso más particularmente, aproximadamente 16 semanas después de la primera dosis.
[0313 ] El TAA puede ser el mismo en el paso (i)-(iii). Opcionalmente, el procedimiento comprende además uno o más pasos adicionales, incluyendo, por ejemplo, la administración de una o más dosis adicionales de la composición de cebado o de una composición de cebado diferente (es decir, una segunda composición de cebado) y/o una o más dosis adicionales de la composición de refuerzo o de una composición de refuerzo diferente (es decir, una segunda composición de refuerzo).
EJEM PLOS
EJEMPLO 1. Vectores vacunales MVA
Este Ejemplo proporciona información sobre vectores vacunales MVA ejemplares. Se construye una vacuna MVA utilizando la cepa MVA 1974/NIH que ha sido modificada genéticamente para expresar otros dos genes: la proteína VP40 del virus de Marburgo y una proteína quimérica formada por porciones de la proteína humana MUC1 y de la glicoproteína (GP) del virus de Marburgo. El gen quimérico MUC1/GP tiene más una construcción particular de codificación de proteína transmembrana con un dominio extracelular derivado del gen MUC1 humano, un dominio transmembrana derivado de la glicoproteína del virus de Marburgo y el dominio intracelular del gen MUC1 humano. Los procedimientos para crear la proteína quimérica MUC1/GP se detallan en el EJEM PLO 2 que figura a continuación. Los procedimientos para generar una vacuna MVA modificada genéticamente para expresar las proteínas MUC1/GP y VP40 y la caracterización del estado de hipoglicosilación de la MUC1 así codificada se detallan en el EJEM PLO 3 a continuación.
La Tabla 2 enumera los números de acceso a las secuencias del GenBank utilizadas para el diseño de los vectores n l M A l r n in n i n
Figure imgf000027_0002
EJEMPLO 2. Optimización de secuencias
El Ejemplo 2 ilustra el procedimiento de optimización de secuencias MUC1 para su uso en un vector de vacuna MVA. Este ejemplo muestra la optimización de la secuencia MUC1 incluida en GEO-MUC1. El procedimiento seguido para las vacunas contra otras cepas es muy similar e implica el mismo conjunto de operaciones.
Optimización del gen Muc1/4TR
1. Empezar con la secuencia natural
• Mucina 1 de Homo sapiens: Secuencia de referencia NCBI: NM_001204285.1
• Copiar/pegar la secuencia desde GenBank y guárdela como archivo SeqBuiler: Muc1-1TR_001204285
Secuencia Muc1 que contiene sólo 1 repetición en tándem (1428 nt) (SEQ ID NO:5)
Figure imgf000027_0001
Proteína Muc1/1TR (475 aa) (SEQ ID NO:6)
Figure imgf000028_0001
Clave de secuencia:
CAJA: Péptido señal
CAJA EN CURSIVA: Repeticiones en tándem
NEGRILLA : Dominio transmembrana
SUBRAYADO: Cola citoplasmática
2. GeoVax se decidió por un gen Muc1 que contiene 4 repeticiones en tándem
• Añadir para repeticiones en tándem adicionales en el Muc1-1TR_001204285.
• Nombrar la nueva secuencia como: GVX-Muc1/4TR.01
Secuencia GeoVax Muc1/4TR (1608 nt) (SEQ ID NO:7)
Figure imgf000028_0002
Proteína Muc1/4TR (535 aa) (SEQ ID NO:8)
Figure imgf000028_0003
Clave de secuencia:
CAJA : Péptido señal
CAJA CURSIVA caja negrilla ; Repeticiones en tándem secuendal NEGRILLA: Dominio de transmembrana
SUBRAYADO: Cola citoplásmica
Alinear secuencia Muc1-1TR_001204285 con GVX-Muc1/4TR.01
Figure imgf000029_0001
(continuación)
Figure imgf000030_0001
(continuación)
Figure imgf000031_0001
CLUSTAL 2.1 Alineaciones de secuencias múltiples
El formato de la secuencia es Pearson
Secuencia: Muc1/1TR 475 aa (Muc1-1TR_001204285) (SEQ ID NO:6)
Secuencia: Muc1/4TR 535 aa (GVX-Muc1/4TR.01) (SEQ ID NO:8)
Puntuación de alineación 2859
Figure imgf000031_0002
(continuación)
Figure imgf000032_0001
Para aumentar la eficiencia de la incorporación de Muc1 en las VLP basadas en VP40 de Marburg, el dominio transmembrana de Muc1 fue reemplazado por el dominio transmembrana de la glicoproteína del virus de Marburg.
Secuencia de la glicoproteína de Marburg (posición de la secuencia TM 1930-2019 en la GP de Marburg) (SEQ ID NO:9)
Figure imgf000032_0002
Glicoproteína de Marburg (posición de la secuencia TM 644-673 en la GP de Marburg) (SEQ ID NO:10)
Figure imgf000032_0003
Secuencia GeoVax Muc1/4TR (secuencia del dominio transmembrana: posición 1129-1218 en Muc1/1TR) (SEQ ID NO:11)
Figure imgf000032_0004
Figure imgf000033_0001
(Secuencia del dominio transmembrana: posición 157-186 en Muc1/1TR) (SEQ ID NO:12)
Figure imgf000033_0002
• Sustituya la secuencia TM del GVX-Muc1/4TR.01 por la secuencia TM del Marburg GP:
W W TSDW GVLTNLGILLLLSIAVLIALSCIC (SEQ ID NO:13)
• Nombrar la nueva secuencia como: GVX-Muc1_4TRMTm.02 (SEQ ID NO:14)
Figure imgf000033_0003
Secuencia de proteína correspondiente (SEQ ID NO:15)
Figure imgf000033_0004
Clave de secuencia:
CAJA: Péptido señal
CAJA EN CURSIVA CAJA NEGRLLA: Repeticiones secuenciales en tándem
NEGRILLA: Dominio transmembrana
SUBRAYADO: Cola citoplasmática
• Alineación de la secuencia Muc1-1TR_001204285 con GVX-Muc1/4TR.01 y GVX-Muc1_4TRMTm.02
CLUSTAL 2.1 Alineaciones de secuencias múltiples
El formato de la secuencia es Pearson
Secuencia: 1TR 475 aa (SEQ ID NO:10)
Secuencia: 4TR 535 aa (SEQ ID NO:12)
Secuencia: 4TRMtm 535 aa (SEQ ID NO:14)
Figure imgf000034_0001
(continuación)
CLUSTAL 2.1 Alineaciones de
secuencias múltiples
El formato de la secuencia es
Pearson
Figure imgf000035_0001
3. Codón optimiza la secuencia de ADN del virus vaccinia
• 2,1. Vaya a la herramienta GeneArt Gene Synthesis en el sitio web de LifeTechnolgy,
• Introducir la secuencia GO y siga las instrucciones.
• Optimizar la secuencia para el virus vaccinia.
• Copiar la secuencia optimizada y pegarla en un nuevo archivo SeqBuilber.
2,2. Guardar la secuencia optimizada, así como el informe.
• Nombrar la secuencia optimizada como: GVX-Muc1_4TRMTmVVop.03 (SEQ ID NO:16)
Figure imgf000035_0002
2.3. Traducir la secuencia optimizada
(SEQ ID NO:17)
Figure imgf000035_0003
4. Interrumpir secuencias homopoliméricas (zonas ricas en G/C o T/A) mediante mutaciones silenciosas • Secuencia de búsqueda de zonas >4 G/C:
o No se han encontrado Gs o Cs múltiples.
• Secuencia de búsqueda de zonas >5 NT:
o Se han encontrado siete zonas ricas en NT:
o Todos han sido interrumpidos por una única mutación silenciosa.
o La Tabla 2 resume todas las mutaciones realizadas en Muc1.
Tabla 2: Mutaciones de Muc1
Figure imgf000036_0002
Guarde la secuencia como GVX-Muc1_4TRMTmVVop.04 (archivo SeqBuilber).
(SEQ ID NO:18)
Figure imgf000036_0001
• Traducir GVX-Muc1_4TRMTmVVop.04:
(SEQ ID NO:19)
Figure imgf000037_0001
5. Buscar secuencia GP para el terminador de transcripción del virus vaccinia
• No se ha encontrado el motivo T5NT .
6. Añade un segundo codón de parada.
• Nombrar la secuencia optimizada como: GVX-Muc1_4TRMTmVVop.05
Modificar las secuencias de las Repeticiones en Tándem por mutación silenciosa (cuando sea posible), para reducir la recombinación y aumentar la estabilidad del inserto.
Primera repetición en tándem
(SEQ ID NO:20)
G CT CAT GGT GTT ACT TCA GCG CCT GAT ACA AGA CCT GCA CCT GGA TCT ACA G CT CCT CCT
(SEQ ID NO:21)
A H G V T S A P D T R P A P G S T A P P
Segunda repetición en tándem
(SEQ ID NO:22)
GCA CAT GGT GTA ACA TCT GCT CCA GAT ACA AGA CCA GCT CCA GGT TCA ACA GCA CCT CCA
Tercera repetición en tándem
(SEQ ID NO:23)
GCG CAT GGT G TT ACT AGT GCT CCA GAT ACA AGA CCT GCG CCT GGA AGT ACT GCA CCA CCA
Cuarta repetición en tándem
(SEQ ID NO:24)
GCA CAT GGT GTA ACT AGT GCG CCT GAT ACA AGA CCA GCG CCA GGA TCA ACT GCT CCT CCT
(SEQ ID NO:25)
G CT CAT GGT GTT ACT TCA GCG CCT GAT ACA AGA CCc GCA CCc GGA TCT ACc G CT CCg CCT (SEQ ID NO:26)
GCA CAc GGc G Tc ACA TCT G CT CCc GAc ACt cgt CCA G CT CCt GGT age ACA GCA CCT CCA (SEQ ID NO:27)
GCG CAT GGa GTa ACc AGT GCa CCA GAT ACc ega CCt GCG CCg GGc AGT ACT G Cc CCA CCg (SEQ ID NO:28)
G Cc CAc GGg GTg ACg AGc GCc CCg GAc ACg ege CCA GCt CCA GGg TCA ACg GCg CCc CCT (SEQ ID NO:21)
A H G V T S A P D T R P A P G S T A P P
• Nombrar la secuencia optimizada como: GVX-Muc1_4TRMTmVVop.06
7. Añada sitios de restricción para la clonación del Muc1 en plásmidos de lanzaderas MVA μLW-73.
• Búsqueda de sitios Smal, Sall y Pstl en la secuencia GVX-Muc1_4TRMTmVVop.06
o Ninguno de los sitios está presente en el gen Muc, por lo que cualquiera puede utilizarse para la clonación.
• Añadir los sitios de restricción Sma I y Sal I a 3' y 5' del gen Muc1 respectivamente.
o Secuencia Sma I: cccggg
o Secuencia Sal I: gtcgac
o Añadir 5 nucleótidos corriente arriba Smal y 5 nucleótidos corriente abajo Sall para facilitar la digestión y la clonación: gcgct
• Guardar la secuencia con los sitios de clonación como GVX-Muc1_4TRMTmVVop.05 (archivo SeqBuilber). • Secuencia final (archivo SeqBuiler) para Genscript: GVX-Muc4TRMTM
(SEQ ID NO:29)
Figure imgf000038_0001
Secuencia proteica correspondiente
(SEQ ID NO:30)
Figure imgf000038_0002
• Alinear la secuencia final GVX-Muc4TRMTM con Muc1-1TR 001204285
CLUSTAL 2.1 Alineaciones de secuencias múltiples
El formato de la secuencia es Pearson
Secuencia: GVX-Muc4TRMTM 535 aa (SEQ ID NO:30)
Secuencia: Muc1-1TR_001204285 475 aa (SEQ ID NO:10)
(co n tin u ac ió n )
CLUSTAL 2.1 Alineaciones de secuencias múltiples
El formato de la secuencia es Pearson
GVX-Muc4TRMTM
Figure imgf000039_0001
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTWTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPS STEKNAVSMTSSV
Alinear la secuencia final GVX-Muc4TRMTM con GVX-Muc1 4TRMTm.01
CLUSTAL 2.1 Alineaciones de secuencias múltiples
El formato de la secuencia es Pearson
Secuencia: GVX- 535 aa (SEQ ID NO:30)
Muc4TRMTM
Secuencia: GVX- 535 aa(SEQ ID NO:12)
Muc1/4TR.01
Figure imgf000039_0002
(co n tin u ac ió n )
Figure imgf000040_0001
Alinear la secuencia final GVX-Muc4TRMTM con GVX-Muc1 4TRMTm.02
Figure imgf000040_0002
(co n tin u ac ió n )
Figure imgf000041_0001
Simplificar el nombre de GVX-Muc4TRMTM a "GVX-Muc1".
• Ordenar gen sintetizado con la secuencia de ADN GVX-Muc4TRMTM.
• Clonar la secuencia de ADN GVX-Muc4TRMTM en el plásmido lanzadera μLW-73 y renombrar el nuevo plásmido como pGeo-Muc1 (ver FIG. 1).
EJEMPLO 3: Construcción de la vacuna MVA y evaluación in vitro de las formas hipoglicosiladas de MUC1.
La vacuna MVA recombinante consiste en un vector MVA con dos casetes de expresión de antígeno (MVA-Muc1VP40). Un casete de expresión codifica una forma quimérica de Muc1 humana, cuya construcción se describe en el Ejemplo 2 anterior (en lo sucesivo, esta construcción se denominará GVX-Muc1) y cuya secuencia de ADN se ha clonado en un plásmido lanzadera denominado pGeo-Muc1 (arriba se muestra una imagen del plásmido) para la construcción de la vacuna MVA. Un casete de expresión codifica la proteína VP40 del virus de Marburgo. La expresión de GVX-Muc1 y VP40 es suficiente para generar partículas secretoras similares a virus (VLPs). La proteína GVX-Muc1 se expresa como una proteína quimérica formada por el dominio extracelular de Muc1 humana, el dominio transmembrana de Marburgvirus GP y el dominio intracelular de Muc1 humana. La proteína VP40 de Marburg se expresa en el citoplasma de las células, donde se asocia con el dominio intracelular y el dominio transmembrana de la GVX-Muc1, provocando el brote en la superficie celular de VLPs que tienen la GVX-Muc1 en su superficie y la VP40 encerrada en su espacio interior (luminal). Esta novedosa combinación de plataforma vectorial y conformación nativa del antígeno da lugar a una vacuna que se espera provoque una respuesta inmunitaria fuerte, amplia y duradera. La vacuna candidata MVA-Muc1VP40 se construyó utilizando vectores lanzadera desarrollados en el laboratorio del Dr. Bernard Moss y están siendo licenciados por el NIAID a GeoVax para su uso en el desarrollo de vacunas. En nuestro trabajo con vacunas contra el VIH y el virus de la fiebre hemorrágica, estos vectores lanzadera han demostrado producir insertos vacunales estables con niveles de expresión elevados, pero no tóxicos. La secuencia Muc1 se colocó entre dos genes esenciales de MVA (I8R y G1L) y VP40 se insertó en una deleción III reestructurada y modificada entre los genes A50R y B1R, ilustrada en el siguiente esquema (FIG. 2), en donde los números se refieren a coordenadas en el genoma MVA:
Los genes GVX-Muc1 y VP40 se optimizaron con codones para MVA. Se han introducido mutaciones silenciosas para interrumpir las secuencias homopoliméricas (>4G/C y >4NT) con el fin de reducir los errores de la ARN polimerasa que podrían dar lugar a cambios de marco. Las secuencias insertadas se han editado para los terminadores específicos de vaccinia con el fin de eliminar los motivos que podrían conducir a una terminación prematura. Todos los insertos vacunales se colocan bajo el promotor H5 temprano/tardío de vaccinia modificado, tal y como se ha descrito anteriormente. Los vectores se preparaban en una sala específica de GeoVax en "condiciones similares a las BPL", con trazabilidad total y documentación completa de todos los pasos, utilizando materias primas libres de encefalopatía espongiforme bovina/encefalopatía espongiforme transmisible (EEB/ETT).
La expresión de la longitud completa y la conformación nativa de la proteína GVX-Muc1 expresada en células se evaluó mediante western blot utilizando anticuerpos específicos de Muc1. La vacuna MVA-Muc1VP40 se utilizó para infectar células DF1 a una multiplicidad de infección de 1,0 durante 1 hora a 37°C, tras lo cual se cambió el medio por medio fresco precalentado. Tras 48 horas de incubación a 37°C, se recogió el sobrenadante de las células y se clarificó centrifugándolo a 500xg durante 10 minutos. Una vez eliminado el sobrenadante de las células, éstas se recogieron de la placa, se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría y, a continuación, se les aplicó lisis en hielo durante 15 minutos en una solución de PBS detergente Triton X-100 al 1 %. Tras esta incubación, se preparó un sobrenadante postnuclear centrifugando el lisado a 1000xg durante 10 minutos y recogiendo la capa líquida superior, que en lo sucesivo se denominará "lisado celular". Los lisados celulares se aplicaron a geles de s DS-PAGE al 10 % y se separaron por electroforesis, transfiriéndose a continuación a membranas de nitrocelulosa, bloqueándose con tampón de bloqueo Odyssey e incubándose con un anticuerpo primario que reconoce (1) la cantidad total de Muc1 presente en la muestra, o (2) la cantidad total de Muc1 hipoglicosilada en la muestra. Como control, sobrenadante y lisado celular de células DF1 infectadas con MVA parental (un control de vector que no contiene ninguno de los casetes de expresión de antígeno). Los resultados de este análisis se observan en la siguiente imagen del western blot (FIG.
3):
Esto demuestra que la vacuna MVA-Muc1VP40 infecta las células DF1 y expresa la proteína Muc1 y además demuestra que alguna proporción de la Muc1 expresada está en forma hipoglicosilada.
La evidencia de la forma hipoglicosilada de Muc1 codificada por la vacuna MVA-Muc1VP40 se observa mediante la inmunotinción de células infectadas con la vacuna o la tinción simultánea de células de control que se sabe que expresan Muc1 normalmente glicosilada o hipoglicosilada, como se describe aquí:
- Las líneas celulares de control MCF7 y MCF10A expresan ambas Muc1. las células 293T no.
- Las células MCF7 expresan Muc1 hipoglicosilada, reconocida por un Ab hipoglicosilado específico de Muc1 (4H5). - MCF10A expresa Muc1 normal. Para detectar Muc1 total se utiliza un Ac pan-Muc1 (Hm Pv ).
- Las células 293T se infectaron con MVA-Muc1VP40 o con el virus de control MVA (Mv A parental).
- Todas las muestras se tiñeron con los Abs indicados.
- Observe en la siguiente imagen (FIG. 4) la señal negativa (fondo amarillo) en el control negativo de tinción y en las condiciones de control MVA; la señal positiva es marrón rojizo por encima del fondo amarillo:
La formación de VLP se demostró mediante microscopía electrónica inmune (EM) utilizando células DF1 infectadas con la vacuna MVA-Muc1VP40 y teñidas con un anticuerpo monoclonal que reconoce Muc1 (HMPV). En la siguiente imagen EM (FIG . 5) se ilustran claramente dos cosas: (1) que las VLP son filamentosas, un fenómeno derivado del hecho de que la proteína VP40 se utiliza como proteína matriz que impulsa el brote de las VLP desde la superficie de las células; y (2) que las VLP se tiñen positivamente con el anticuerpo dirigido contra Muc1, lo que demuestra que esta proteína se incorpora a las VLP en ciernes.
EJEMPLO 4: Disminución selectiva de la glicosilación ligada a O de Muc1
Introducción
La O-glicosilación de tipo mucina comienza con la modificación de proteínas por adición del núcleo 1 O-glicano Galp3-GalNAca1-Ser/Thr. Esto ocurre en dos pasos: (1) se une covalentemente un GalNAc a una Serina o Treonina de la columna vertebral del aminoácido; (2) a continuación se añade una Gal al GalNAc. A partir de esta estructura central se crea una enorme variedad de otras glicoformas mediante la adición de otros azúcares a la estructura central 1. Un esquema de esta vía de modificación inicial se muestra en la FIG. 6:
Esto resulta en la formación del carbohidrato del antígeno T en los residuos Ser o Thr de la columna vertebral de la proteína. Es importante destacar que la T sintasa funcional (también conocida como núcleo 1 p3-galactosil transferasa, símbolo genético C1GALT1) es la única enzima conocida responsable de la formación del antígeno T a partir del antígeno Tn. Las modificaciones posteriores de la estructura de carbohidratos del núcleo 1 dependen completamente de la formación del antígeno T. Por lo tanto, en ausencia de T sintasa, la glucosilación ligada a O que depende de la estructura del núcleo 1 cesa con la formación del antígeno Tn (véase Aryal, R. P., Ju, T. & Cummings, R. D., J Biol Chem 289, 11630-11641 (2014)). Como advertencia, un mecanismo adicional para la hipoglicosilación implica la adición de un ácido siálico a la Tn por la a-2,6-sialil transferasa I (símbolo genético ST6GALNAC1), dando lugar a una estructura sialil-Tn terminal (no extensible) (Siaa2-6GalNAca1-Ser/Thr), ilustrada como se muestra en la FIG. 7. El objetivo es asegurar la producción endógena in vivo de Muc1 hipoglicosilado. Aunque es probable que la sobreexpresión de Muc1 en las células desborde la maquinaria de glicosilación de muchas células, puede ser adecuado para nuestros propósitos empujar adicionalmente la vía biosintética hacia la hipoglicosilación de Muc1 manipulando la maquinaria de glicosilación. Las estructuras de Muc1 que terminan la glicosilación ligada a O con el antígeno Tn y sialil-Tn son especies predominantes entre las formas hipoglicosiladas conocidas que se asocian a varios carcinomas. Teniendo en cuenta lo que se sabe sobre la vía de síntesis de la glicosilación ligada a O, se pueden prever dos mecanismos fácilmente reconocibles para impulsar la hipoglicosilación endógena de Muc1:
(1) Prevenir la formación de antígeno T y promover la abundancia de antígeno Tn anulando la expresión de T sintasa funcional. Esto puede hacerse ya sea por:
a. Dirigirse directamente a los transcritos del gen de la T sintasa mediante procedimientos de ARNsi; o
Dirigirse a las transcripciones de COSMC (símbolo del gen C1GALT1C1) mediante procedimientos de ARNsi, ya que se sabe que COSMC es esencial y específico para el plegamiento y la función de la T sintasa en la sala de emergencias, y las mutaciones en este gen ligado al X se han asociado en humanos con el síndrome Tn .
(2) Sobreexpresar la a-2,6-sialil transferasa I (símbolo genético ST6GALNAC1, abreviado en el presente documento como "ST1") para terminar la glicosilación ligada a O con sialil-Tn.
Procedimientos
Los datos resumidos de los tres genes de interés son los siguientes:
T sintasa (C1GALT1)
El gen C1GALT1 tiene una longitud de 66.104nt, está compuesto por 6 exones y se localiza en el cromosoma humano 7p21.3. Se transcribe y empalma para producir un ARNm de 6244 nt de longitud (NM_020156). El codón de inicio está situado en el nt 224 del ARNm y el CDS abarca 1092nt desde 224..1315, dando lugar a una proteína de 363 aminoácidos (NP_064541) con un peso molecular calculado de 42kD. Se predice que los residuos de aminoácidos 7.. 29 codifican un dominio transmembrana y se sabe que el ectodominio de la proteína reside en el lumen del ER , lo que indica que la T sintasa es una proteína de membrana de tipo II de paso único.
COSMC (chaperona específica de la sintasa T; C1GALT1C1)
El gen C1GALT1C1 tiene una longitud de 4476nt, está compuesto por 3 exones y se localiza en el cromosoma X humano en Xq24. Este se transcribe y empalma para producir un ARNm de 1915nt de longitud (NM_152692). El codón de inicio está situado en el nt 412 del ARNm y el CDS abarca 957nt desde 412..1368, dando lugar a una proteína de 318 aminoácidos (NP_689905) con un peso molecular calculado de 36kD. Se predice que los residuos de aminoácidos 7.. 26 codifican un dominio transmembrana y se sabe que el ectodominio de la proteína reside en el lumen del ER , lo que indica que la COSMC es una proteína de membrana de tipo II de paso único.
ST1 (a -2,6-sialil transferasa I; ST6GALNAC1)
El gen ST6GALNAC1 tiene una longitud de 26.064nt, está compuesto por 12 exones y se localiza en el cromosoma humano 17q25.1. Este se transcribe y empalma para producir un ARNm de 2593nt de longitud (NM_018414). El codón de inicio está situado en el nt 201 del ARNm y el CDS abarca 1803nt desde 201..2003, dando lugar a una proteína de 600 aminoácidos (NP_060884) con un peso molecular calculado de 68kD. Se predice que los residuos de aminoácidos 15.. 35 codifican un dominio transmembrana y se sabe que el ectodominio de la proteína queda expuesto al lumen del RE tras la translocación, lo que indica que la ST1 es una proteína de membrana de tipo II de paso único.
Los procedimientos establecidos para el diseño de ARNsi, para aplicarse a los genes T sintasa y COSMC humanos, son los siguientes:
1. Encontrar secuencias de 21 nt en el ARNm objetivo que comiencen con un dinucleótido AA.
2. Seleccione 2-4 secuencias objetivo, con los siguientes parámetros: los ARNsi con un contenido de GC del 30­ 50 % son más activos que los que tienen un contenido de G/C más alto.
Dado que un tracto poli(T) de 4-6 nucleótidos actúa como señal de terminación para el ARN pol III, evite tramos de > 4 T o A en la secuencia objetivo cuando diseñe secuencias que se expresarán a partir de un promotor de ARN pol III.
Dado que algunas regiones del ARNm pueden estar altamente estructuradas o unidas por proteínas reguladoras, seleccione los sitios objetivo del ARNsi en diferentes posiciones a lo largo de la secuencia del gen. No se ha observado ninguna correlación entre la posición de los sitios objetivo en el ARNm y la potencia del ARNsi.
Comparar los sitios objetivo potenciales con la base de datos genómica apropiada (humano, ratón, rata, etc.) y eliminar de la consideración cualquier secuencia objetivo con más de 16-17 pares de bases contiguas de homología con otras secuencias codificantes.
3. Diseñar controles adecuados.
Un ARNsi de control negativo con la misma composición nucleotídica que el ARNsi pero que carece de homología de secuencia significativa con el genoma. Codificar la secuencia de nucleótidos del ARNsi específico del gen y realizar una búsqueda para asegurarse de que carece de homología con cualquier otro gen.
Secuencias adicionales de ARNsi dirigidas al mismo ARNm. Realizar experimentos, utilizando un único ARNsi cada vez, con dos o más ARNsi diferentes dirigidos al mismo gen.
La expresión impulsada por MVA del ST1 debería ser sencilla, ya que el CDS para este producto génico tiene sólo ~1800nt de longitud.
Líneas celulares
Se sabe que las células HEK-293T son negativas para la expresión de Muc1 (véase Mehanta, et al, PLoS ONE, 2008). Las células T47D (derivadas del carcinoma de glándula mamaria humana) expresan endógenamente Muc1, se cultivan en medio estándar (RPMI) y son transfectables. Estas células se han utilizado para estudios de inactivación (KD) de Muc1 en la publicación antes mencionada y pueden ser aptas para nuestros estudios de investigación/caracterización temprana de la hipoglicosilación de Muc1. Las células T47D están disponibles en ATCC (Cat. No. HTB-133) por 431 dólares. Olja Finn mencionó que hay una serie de líneas celulares basadas en la línea MCF-7 que son útiles para estudios de carcinoma. En particular, recomendó MCF-10A en esta serie, ya que se sabe que expresa altos niveles de Muc1 totalmente glicosilada (véase también el artículo de Olja: Cascio, et al, J Biol Chem, 2011). MCF-10A es una línea celular epitelial adherente transformada, no tumorigénica, derivada de la glándula mamaria de una mujer caucásica de 36 años con enfermedad fibroquística. La línea celular es adecuada como huésped de transfección, de acuerdo con ATCC, donde la línea celular está disponible por $431 (Cat. No. CRL-10317). Esta línea celular utiliza el Medio de Crecimiento de Células Epiteliales de Mamífero (MEGM) de Lonza, suplementado con el Kit Lonza MEGM Bullet (sin el suplemento de gentamicina/anfotericina-B) y 100 ng/ml de toxina del cólera (Sigma).
Constructos de expresión transitoria
Al examinar los productos disponibles para la manipulación genética de Origene (www.origene.com), se encontró que proporcionan tanto reactivos de ARNi examinados en formatos listos para usar, como ORF examinados en plásmidos listos para usar. Para los procedimientos de ARNi, los dos reactivos más apropiados para nuestros fines serían los dúplex de ARNsi sintéticos o los constructos de ARNhc que pueden expresarse a partir de un plásmido. Dado que, con cualquier éxito, nuestro objetivo sería expresar los productos de ARNi a partir del propio vector MVA, lo más adecuado para estos fines sería trabajar con ARNhc, que debería transferirse fácilmente a un sistema de expresión MVA. Origen ofrece productos de ARNhc en diferentes formatos, pero nosotros querríamos un vector de expresión simple que sea seleccionable para preparar plásmidos (se ofrecen Kan(r) y Cam(r)) y notificable (se ofrecen G FP y RFP). Por lo tanto, pediremos constructos de ARNhc dirigidas a C1GALT1 (en el plásmido pGFP-V-RS, con reportero GFP: Cat. No. TG306064) y C1GALT1C1 (en el plásmido pRFP-C-RS, con reportero RFP: Cat. No. TF317130). Ambos plásmidos dirigen la transcripción del ARNhc con un promotor U6. A continuación se muestran los mapas de estos plásmidos.
Los productos de ARNhc antes mencionados se suministran con 4 ARNhc cada uno. Cada ARNhc se probará de forma independiente para KD. Tienen las siguientes secuencias objetivo y coordenadas de ARNm.
Productos de ARNhc de Origene dirigidos a C1GALT1 (T sintasa), con coordenadas de ARNm (NM_020156):
Figure imgf000044_0002
Produ AR h ri n iri i 1 ALT1 1 M n r n AR m M 1 2 2 :
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
La KD de estos productos génicos puede evaluarse mediante RT-PCR o WB.
Para impulsar la expresión de ST1, un constructo está fácilmente disponible de Origene. El producto de interés (Cat. No. RC216697) contiene el gen ST6GALNAC1 de longitud completa, dirigido por el promotor CMV, y marcado en el C-terminal con etiquetas Myc y DDK (FLAG), todo ello en el vector Origene pCMV6-Entry (véase RC216687 más abajo).
Plan experimental
1. Experimentos preliminares
Hacer lisados de células enteras (W CL) de células HEK293T o HeLa. Utilizar W CL para optimizar los procedimientos de WB para la detección de T-sintasa (con rb pAb) y COSMC (con ms mAb). Utilizar colorante anti-ms IR700 y colorante anti-rb IR800 como secundarios, para permitir la posterior detección simultánea de los dos antígenos en el mismo WB y dicha detección simultánea será importante cuando se ensayen los efectos del ARNhc KD de los transcritos.
Preparar y almacenar células MCF10A.
Transfectar células MCF10A con plásmido inocuo codificador de G FP para determinar el nivel basal de eficiencia de transfección.
Hacer MCF10A W CL. Análisis de los niveles de expresión de T-sintasa y COSMC por WB.
Prueba de Abs anti-Muc1 por WB y citometría de flujo utilizando células MCF10A.
2. Experimentos de pivote
ARNsh KD de la T-sintasa en células MCF10A
Transfectar las células MCF10A individualmente con cada uno de los 4 plásmidos de ARNsh dirigidos a la T-sintasa Hacer W CL de cada población transfectada en los puntos de control prescritos. Analizar W CL para la expresión de T-sintasa, COSMC, Muc1 y Muc1 hipoglicosilada (hgMuc1).
Seleccionar el ARNhc que produzca la mejor respuesta KD.
Transfectar células MCF10A con ARNhc óptimo. Utilizar la citometría de flujo para analizar las células en busca de la expresión superficial de Muc1 y hgMuc1.
ARNsh KD de COSMC en células MCF10A
Transfectar células MCF10A individualmente con cada uno de los 4 plásmidos de ARNSH dirigidos a COSMC Hacer W CL de cada población transfectada en los puntos de control prescritos. Analizar W CL para la expresión de T-sintasa, COSMC, Muc1 y Muc1 hipoglicosilada (hgMuc1).
Seleccionar el ARNhc que produzca la mejor respuesta KD.
Transfectar células MCF10A con ARNhc óptimo. Utilizar la citometría de flujo para analizar las células en busca de la expresión superficial de Muc1 y hgMuc1.
2. Experimentos de pivote (continuación)
Expresión ectópica de ST1 (sialil transferasa ST6GALNAC1) en células MCF10A
Transfectar células MCF10A con el plásmido RC216697 que codifica ST1 detrás de un promotor CMV
Evaluar la viabilidad y hacer W CL de las células transfectadas en los puntos de control prescritos. Analizar el WCL para la expresión de ST1 (detectado por el anticuerpo anti-DDK), Muc1, y Muc1 hipoglicosilado (hgMuc1).
Transfectar células MCF10A con el plásmido RC216697. Utilizar la citometría de flujo para analizar las células en busca de la expresión superficial de Muc1 y hgMuc1.
A la luz de los resultados de los experimentos pivotales anteriores, determinar si se procede con uno de los enfoques individuales investigados, o se intenta combinar enfoques. Se podría pensar, por ejemplo, en intentar un doble-KD tanto de la T-sintasa como de la COSMC mediante ARNhc si ninguno de los dos por separado diera resultados suficientes, o en co-transfectar cualquiera de los ARNhc junto con el plásmido RC216697 que impulsa la expresión de ST1.
Si se va a utilizar ST1, proceder a sintetizar este gen en forma optimizada para vaccinia.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un vector viral recombinante de vaccinia ankara modificada (MVA) que comprende
(i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica en una orientación de 5' a 3' una secuencia quimérica de aminoácidos que comprende (a) un fragmento extracelular de un antígeno asociado a tumor (TAA), (b) un dominio transmembrana de una glicoproteína (GP) del virus de Marburgo, y (c) un fragmento intracelular del TAA; y
(ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína matriz VP40 del virus de Marburgo; en la que tanto la primera secuencia de ácido nucleico como la segunda secuencia de ácido nucleico están bajo el control de promotores compatibles con los sistemas de expresión de poxvirus.
2. El vector MVA recombinante de la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se insertan en uno o más sitios de deleción del MVA seleccionados entre I, II, III, IV, V o VI.
3. El vector MVA recombinante de la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se insertan en el MVA en un sitio de deleción natural, un sitio de deleción natural modificado, o entre genes MVA esenciales o no esenciales.
4. El vector MVA recombinante de la reivindicación 1, en el que el promotor se selecciona del grupo que consiste en los promotores Pm2H5, Psyn II y mH5 o combinaciones de los mismos.
5. El vector recombinante MVA de la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se optimizan mediante uno o más procedimientos seleccionados de entre: cambiar codones seleccionados por otros codones sinónimos que sean óptimos para la expresión de proteínas por MVA, interrumpir tramos homopolímeros utilizando mutaciones silenciosas, o interrumpir motivos de terminación de transcripción utilizando mutaciones silenciosas.
6. El vector MVA recombinante de la reivindicación 1, en el que el fragmento extracelular se selecciona de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO:4, o una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 95 %.
7. El vector MVA recombinante de la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de ácido nucleico codifica una secuencia quimérica de aminoácidos que comprende un fragmento extracelular de MUC-1 y un fragmento intracelular de MUC-1.
8. Una composición farmacéutica que comprende al menos un vector MVA recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un portador farmacéuticamente aceptable.
9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención del cáncer causado por neoplasias en un sujeto, en el que al menos un vector MVA recombinante debe administrarse al sujeto en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunitaria.
10. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria humoral, una respuesta inmunitaria celular o una combinación de las mismas.
11. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la respuesta inmunitaria comprende la producción de anticuerpos de unión, anticuerpos neutralizantes, anticuerpos no neutralizantes o una respuesta inmunitaria mediada por células contra la secuencia aminoácida quimérica.
12. El vector MVA recombinante de la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se insertan en el mismo sitio de deleción natural, un sitio de deleción natural modificado, o entre los mismos genes MVA esenciales o no esenciales.
13. El vector MVA recombinante de la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se insertan en diferentes sitios de deleción naturales, diferentes sitios de deleción modificados, o entre diferentes genes MVA esenciales o no esenciales.
14. El vector MVA recombinante de la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de ácido nucleico se inserta entre dos genes MVA esenciales y altamente conservados; y esta segunda secuencia de ácido nucleico se inserta en una deleción III reestructurada y modificada.
15. El vector MVA recombinante de la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de ácido nucleico se inserta entre los genes MVA, I8R y G1L.
16. El vector viral MVA recombinante de la reivindicación 1, en el que el fragmento intracelular de MUC-1 comprende los aminoácidos 407-475 de SEQ ID NO:6, o un aminoácido al menos 95 % idéntico a los mismos.
17. El vector viral MVA recombinante de la reivindicación 1, en el que el dominio transmembrana de la GP del virus de Marburgo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:13.
18. El vector viral recombinante MVA de la reivindicación 1, en el que el primer ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:15, o un aminoácido al menos 95 % idéntico a la misma.
19. El vector viral recombinante MVA de la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, SEQ iD NO: 18, o SEQ ID NO: 29.
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